Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тейхоевые и липотейхоевые кислоты агромицетов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Тейхоевые и липотейхоевые кислоты агромицетов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. М.ВЛОМОНОСОВА _Биологический факультет _

Р Г 6 од

На правах рукописи УДК 579.87:579Л34:577.11

ГНИЛ ОЗУ Б Виктория Анатольевна

ТЕЙХОЕВЫЕ И ЛИПОТЕЙХОЕВЫЕ КИСЛОТЫ АГРОМИЦЕТОВ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

/ Г

Работа выполнена в лаборатории антибиотиков биологического факультета МГУ им. М.ВЛомокосова.

Научный руководитель: доктор биологических иаук, профессор' И.Б.НАУМОВА

Офиш1альные оппоненты: ДОКТОр биОВОГиЧвСНиХ Н&ук

В.МВАГАБ08

кандидат биопогич&ских, наук Н.Ф. ДМИТРИЕВА

Ведущее учреждение: НИИ ПО ИЗЫСНЗНШО НОВЫХ

антиб'нотмков РЛМН

Зашита состоится 1994т. в часов на заседании

спеш1ализированного совета Д 053.05.66. по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Н.Ф.Пискупкоаа

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем микробиологии являегса изучение поверхностных структур бактерий, участвующих в разнообразных биохимических процессах, протекающих на границ: клетки и окружающей срены. Они включают ионный обмен, бактериальную адгезию, рецепцию бактериофагов, связывание антибиотиков и тл. Значнтоп,ную роль в этих процессах играют полимеры - пептидогликан, нейтральные и кислые полисахариды, липополисахариды у грамотрнцатэгькых и тейхоевые, липотенхоевыс и тейхуроновые кислота у грампаяожительных шлроорганкзмов.

Исследования последних лет показали, что тенхоевы; шепоты ряда бактерий являются иммуномодуляторами, а иногда обладают противоопухолевой активностью. Липотейхоевые кислоты играют важную роль в первичных процессах взаимодействия патогенных микроорганизчов с организмом хозяина. Состав, а иногда и структура тейхоевых и липотейхоевых кислот может являться стабильным хсмотаксоиомичсским признаком некоторых багтерий и в настоящее время все чаще используется в систематике. Кроме этого, -исследование этих полимеров имеет теоретическое значение для биохимии микроорганизмов, расширяя наши знания о строения природных соединений.

Тейхоевые и липотейхоевые кислоты известны у многих групп трампешожительных бактерий [Наумова, 1979; Fischer, 1990]. но у ахтиномицетов они исследованы пока недостаточно, а липотейхосвая кислота изучена только у одного штамма сгрептомицетов [Потехина и др,1983].

Для рода Agromyces, представители которого распространены в различных типах почв и характеризуются наличием диаминомаашгой кислоты в клеточной стенке, сведения об этих полимерах отсутствовали. Первый вид рода, A ramosas, был описан в 1969 г. [Gledhill and Casida, 1969J, а недавно к агромипетам были отнесены еше 14 штаммов, образующее два новых вида [Zgurskaya et al., 1992]. Изучение тейхоевых и липотейхоевых кислот 31ромицегов должно было добавить недостающую для полного списания рода информацию, а таске могло послужить уточнению хемопаксвдомического статуса новых штаммов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение распространения тейхоевых кислот у штаммов рода Agromyces и более детальное исследование структур полимеров у типовых штаммов Acerinas и A.fucosus. В связи с этим предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить распространение полимеров у 12 выбранных штаммов рода.

2. Выделить и исследовать липотейхоевые кислоты типовых штаммов следующих подпилов рода. Agromyces: A cerinus ssp. cerinas, A cerinus ssp. nitratus. A fucosus ssp. Jucosus и A fucosus ssp. hippuraius.

3. Выделить и изучить структуры тейхоевых кислот типовых штаммов тех ж: подвидов агромицетов.

Научная мояичкз. Впервые показано присутствие тейхоевых и/или липотейхоевых кислот у 12 штаммов агромицетов. Установлена структура

липотсйхоевых кислот 4 типовых штаммов А. септа ир. сегмх, А. сегЪж ¡*р. питала. А. ркопа щ>. )исоаа и А. /исохи! ир. Ырригаш; в их составе впервые найдены 0-апсгилышс заместители. Изучено строение тейхоевых кислот типовых штаммов А. сеггта ар. пигапа, А. ]исояа ыр. /исозш и Л /исаш ар. Ырритапа. Структуры тейхоевых кислот штаммов В КМ Ас-1351* и ВКМ Ас-1352 1 шииш уникальными и ранее у прокариот'не обнаружены. Показано также, что два штамма подвида А /исози* пр. Ырригаш имеют одинаковые тейхоевые кислоты. ' ч .

Практическая чяачнмпеп.- Результаты работы, которая является первым исследованием тейхоевых и липотсйхоевых кислот агромиистов, имеют теоретическое значение для изучения актиномипепюн клетки. Кроме этого, полученная информация входит в описание рода А$ттуси и может иметь практическое значение как дополнительный критерий при определении таксономического статуса штаммов рода. Данные спектроскопии ЯМР впервые найденных структур - поли(рибофуранозилрибитфосфата), замешенного остатками галактозы, и поли(рибитфосфагга) с боковыми тетрасахаридными заместителями - могут быть полезными при анализе угаеводсодержащих -полимеров близкого строения. Результаты работы также можно использовать в лекционных курсах по биохимии микроорганизмов.

Апройзпия рпппты и пуйтгеачии. Диссертационная работа была апробирована на заседании кафедры микробиологии МТУ (1994г.), результаты исследований были представлены на Международном симпозиуме но биологии аклшомицетов (США, Машсон, 1991). По теме диссертации опубликованы 3 и находятся в печати 2 работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, собственного экспериментального материала (3 главы), общего обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (201 источник). Экспериментальный материал иллюстрирован 12 таблицами и 26 рисунками.

Материалы и методы исследования.

Материалом для исследования служили 12 штаммов рода А$готуси, полученных из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ). Строение тейхоевых и липотсйхоевых кислот изучали у 4 типовых штаммов рода: Асегиии ¡¡р. септа ВКМ Ас-1340т, А.сегиш ¡¡р. тяаш ВКМ Ас-1351т, Д/ноиш ир-рюяи! ВКМ Ас-1345т, А./исояа 51р. Ырригаш ВКМ Ас-1352т. Для получения биомассы культуры выращивали на качалке при 28° С в течение 16-18 часов на пептонно-дрожжевой среде [Евтушенко и др.,1991].

Препарата клеточной стенки получали из разрушенного ультразвуком мицелия с помощью дифференциального центрифугирования. Тейхоевые кислоты выделяла из мицелия или из клеточной стенки обработкой 10% ТХУ, 1н КаОН или ппшиновым буфером, очищали ионообменной хроматографией на ОЕАЕ-Тоуореаг1 650М. Лшютейхоевые кислоты получали из мицелия экстракцией 80% водным фенолом, очншалк нукл сазами и гель-хромато-

графией на Сефарозе 6В. Изучали первичную структур/ полимеров: строение мономерных единиц, тип фосфодиэфирной свази кехзу мши, наличие и природу заместителей, а у липотейхоевых кислот также состав пирофобной части. Определение первичной структуры.. пагпшерод проводилось как химическими методами, основанными на расшеплешт их молекул я изучении полученных фрагментов, так и различными видами спектроскопия ЯМР. Для деградации цепей полимеров применяли . кислотный, Iцепочной и ферментативный гидролиз. В работе использовали различные виды хроматографии, высоковольтный электрофорез на бумаге, а таске пепый ряд количественных и аналитических методов.

Результаты исследования и их обсуждение.

Глава 1. Распространение тейхоевых кислот у штаммов рпда

Адгсяусев,

О присутствии в клетках исследуемых культур агромипегов тейхоевых кислот судили по продуктам кислотного гидролиза материала, кшучепного экстракцией ТХУ. Во всех 12 штаммах четко идентифицируются моно- и дифосфага глицерина (см. табл. 1), что указывает на наличие у них полимеров глицерофосфатной природы; из возможных заместителей наиболее распространены галактоза, рамноза и глюкозамин. В гндролиззтах некоторых культур обнаружены сшс фосфорные эфиры рибита. что могло свидетельствовать о наличии у них либо нескольких тейхоевых гасгот разной структуры, либо одновременно тейхоевых и липотсахоеянх кислот. Использование в качестве экстрагирующего агента 80% вохвого фенола подтвердило второе предположение, поэтому следующей нашей задачей было изучить липотейхоевые кислота типовых штаммов.

Таблица 1. Основные продукты кислотного пиролиза тейхоевых кислот

штаммов рода Адготусеа.

Штамм РЬзупетаты КГ (2н НО. Зч. ЮСГО

А-септи ssp.eeптц ВКМАс-ШОТ &о, вгоР. вгоР,. Р;. Ис, СМ. М»

ВКМ Ас-1342 Ого, (ЗгоР, (ЗгоР». Р;, ашшосиэо

ВКМ Ас-1343 Сто. СЗгоР, (ЗгоР,. Р;

ВКМ Ас-1344 Сто. (ЗгоР, СЗгоР„ Р;, амявосахар

ВКМ Ас-1350 Сяо, СЗгоР. СЗгоР,, Р* аминосахар

Асеппш 55р.тггти5 ВКМ Ас-1351 Т Ого. СшР. Стар,. Р;. КЬо. Шх>Р, СЫ. ШЬ

ВКМ Ас-1345 Т Ого, СкоР. СЗгоР.. Р,. (311, гагды СТе

ВКМ Дс-1346 Ого. (ЗгоР, СЗгоР,. Р,

ВКМ Ас-1347 СЗго, СЗгоР. СЗгоР,. Р,

ВКМ Ас-1349 Ого. (ЗгоР. СЗгоР,. Р„ Ся1

А-рКОЯи 55рМрригаО! ВКМ Ас-1352 Т Ого. СЗгоР. ОгоР,. К ЯЬо. !*№, МюР, СЫ. Р-Ь*. ОсИАс

ВКМ Ас-1353 СЗго. СЗгоР. СЗгоР,. Р:. ЯЬо. ИЬоР. ИюР,. Юя, Мм. СТсИАс. СЫ

Глава 2. Лвпотейхоевые кислоты A.cerinus ssp.cerinus ВКМ Ас-1340т, A. cerinus ssp. nitratus В KM Ac-1351f, A. fucosus ssp. fucosus BKM Ac-t345T, A. fucos us ssp.hippuratus BKM Ac-1352T...

Липогсйхюыс тают были получены ю обезжиренного мицелия перекисленных штаммов экстракцией 80% водным фенолом, очшцены гель-хроматографиен. При этой максимальный выход наблюдался у A.fiicosus ssp.hipjiurants, а минимальный - у A.fitcosus ssp.fucosus (см.- табл. 2). В этой таблице привашея данные химического исследования полимеров. При их кислотном пиролизе во всех случаях были обнаружены моно- и дифосфаты глицерина, глицерин, P¡. галактоза, следы глюкозы, а у штаммов A.cerinus еще и маянозы. Щаючная обработка полимеров не приводила к полному гидролизу цепей, но во воех случаях было идентифицирована различное количество моно- и дифосфза ппшерииа. У липотейхоевой кислоты Acerinus ssp.cerinus после гадролна 2я НСЗ (5ч. 100°С) и щелочной фосфомоноэстсразой определили мольвое соотношение РобШ : глицерин : галактоза = 1,0: 0,9 : 0.5.

При фторогазе пели липотейхоевой кислоты A.cerinus ssp.cerinus среди образовавшихся продуктов с помощью хроматографии на бумаге в системе 1 (пиридин:бутаи-1-ол:6с!Осш:Н20=3:5:1:3) обнаружили галактозу, глицерин и глиттип ГГП- имевший в системе 1 подвижность R«£=0.96. При кислотном гидролизе (2н НО, 3 ч, 100°Q Г1 давая галактозу и глицерин в эквимолярном количестве. П ае окрашивался аншшн-фгалатом, при периодатном окислеиии не образовывал формальдегид. Эти данные свидетельствовали, что Г1 является 2-0-галактопиравозилпвщерином. Методы ЯМР-спестроскопии позволили определить, что галактоза находится в а-конфигуратш, следовательно, Г1 имеет следующую структуру:

ОН

Для выяеасаия наличия у изучаемых штаммов О-ашшьных заместителей был провеаси гадроксиламинолиз полимеров. В продуктах реакции путем бумажной хроматографии идентифицировали ацетилгиароксамат и не обнаружили пцрокешат аланииа, что свидетельствует о присутствии О-ацетильных гррш. Такие заместители в структуре липотейхоевых кислот обнаружены впервые. Полученные результаты позволили предположить, что гидрофильные -наш липотейхоевых кислот представляют собой 1,3-поли(глицсрофосфзты), частично замешенные а-галахтозой и О-аиетилышми группами. Это было подтверждено данными спектроскопии 13С-ЯМР.

б

Таблица 2. Анализ лниотейхоевых kiicjiot типовых штаммов рода Agromyces.

Штамм Робщ1 Рлаб Рнк Рлгк % от сухого веса иавсски Выход мкМ Рлтк на 1 г. сухого мииелня Пропусти кислотною пщролта (2п НС1 3 ч, 100°С) % замещения, данные ЯМР Gal О-Ас

A.ccrinus ssp.cerínus ВКМ Ас-1340 5,0 0.0 0,0 5.0 29,63 GroP,1 GroP2, Oro, P¡, Gal, слсдм Glc и Man 30,0 16,5

A.cerímis ssp.nitratus ВКМ Ас-1351т 5,0 0,21 0.0 4.79 26,69 GroP, GreP?., Oro, ' P¡, Gal, слсды G!c и Man 21.0 39.6

A.fucasus sif.f.icosus ВКМ Ас-1345* 4,67 0,12 0,02 4,53 22,29 GroP, GroP2. Oro, P¡, Gal, слсды Glc 27.6 9.9

A.fucosiis ssp.liippuraius ВКМ Ас-1352т 4,43 0,60 0,0 3,83 40,77 GroP, GroP?., Gro, P¡, Gal, слсды Gic 29,3 19.8

липот«й°ом»» wí^r Р/Ле' фосфв|'' ja 7 нин. 1н HCl| Pu», фосфор нуклвмновы« кислои Рлт* фосфор

'Gro, Глицерин- агор, монофосфл- ошздринк GroPj, мфосфлт глицерин« Р,. минеральный фосфор; Gal, галактоза,- Ole, глюкоз« мал, мздмоэд; О-Ас, О-дцвтльны« группы.

Таблица 3. Состав жирных кислот гидрофобной части липотейхоевых кислот типовых штаммов подвидов агромицетоо. __(% от общего содержания). _

Жирими кислоты А.сегЫи* «р. сеппиз А.сегЬш нр.пкгаш* А/итпм нр.Тисохш А./исош! мр.Ырригсиих

Н-Сил 0.47 0.56 0.70 0,73

ИЭО-СрЗ:» Э.Об 2.93 0.99 2.08

амтсизо-Сио 16,64 36,41 16.43 10.80

П-С»:0 0,73 1,44 0,75 0.58

|ГЮ-С|в:0 17,81 14,60 19,93 14.60

П-С|б:0 6,73 6,52 8,87 9.70

Ш0-С|7:0 1,36 0,61 0.57 1,68 .

аитсшо-Ср.о 38,43 21,68 22,56 33,21

И-С|7:0 ' 0,72 0.45 0,48 1.12

Н-СиЛ 7,60 5,97 15,69 16,70

Мс-Сщ:!)1 1,04 3,56 7,41 3,37

1 п-Сго-ч. ша-С]|,о. и-Сл;0, п-Си;о, аитето-С^о, и-С2Э:о. содержатся ■ мтшорном количссгае.

Степень замещения варьирует у разных штаммов, от 21 яо 30% лля галактозы и от 9.9 до 39,6% для О-ацетнльныг. групп. После определения молекулярной массы деашшированной липсггейхоевон кислоты одного in штаммов, исходя из • структуры полимера, опретелили дяпну иени, составляющую примерно 40 ппщерофосфатиых едшшц.

Было проведено также изучение гидрофобных частей молекул линотейхоевых кислот. Для их выделения использовали различные истоды, но несмотря на это, не удалось обнаружить в их составе каких-либо мокосг.гаридоЕ. Неоткозилированные липилиые части найденн у лино-тииосвыг. кислот некоторых штаммов бацилл [Fischer. 1988], одяако вопрос о-том. действительно ли моносахариды отсутствуют в гидрофобной части этих полимерен агромкцетев, или их просто не удалось ебнарухагть в ему кгклх-то причин, остается пока открытым. Качественный состав жирных ккгют сг.слен у ьсех 4 штагов (cit. табл.3). Зо зсех полимерах содержатся з основном зсирные кислоты с числом атомов углерода от 14 до 19. Кроме этого, было обнаружено слсдоюс количество более высокомолекулярных жирных кислот. Почти все кислош насыщенные, есть как развстпленые, так ч нсравствлспш::; обшес содержание ссстаслггт около 2*« от веса Л1Шотейхоевых кислот. У штаммов вида A.cerinus пресбпглают три жирные r-чслсты (антеизо-Сио, ¡¡зо-Скы) и гятеизо-С]7:о), а у штдммез влда AJjcosus -четыре, те же самые в еще ii-Cjm. Кроме -;гогэ отличия, иетду полимерами двух видов наблюдаемeg еще одно: линотейхосзые кислоты вша Axerbus отличаютег бользкй гетерогенностью испей, что выражается в рикяенип :ix на два пика при гель-хроматографии. Из литературы известна, что тигя полшшспсрсность характерна для этих г.олцкеров [Leopold and Fircher, 1992].

Проведенное .чсследование г.ока:ываст, что четыре типовых штамма рода A rjomyces имеют липогейхосвые кислоты, близкие по своей стдгтуре. Их гидрофильная часть представляет собой 1,3-поли(п:ш:срсфсефгт). часть гл'шертаоЕьп остатков которого несет по С-2 а-гздаггопиранозЕЯьный и О-ацстиль."ьш заместители, причем степень замещенчя ими варьирует у разных штаммов. В пшрофобкой части присутствует набор одинаковых жирных кислот с одинаковыми преобладающими кислотамя, ко у ппаммов чида A.fucosus их на одну больше. Липотейхоевце кислоты с гидрофильной цепью похожей структуры найдены у некоторых бацилл в ЯЕстгрпй. однако О-ацегильные группы в их составе обнаружены впервые, обычно присутствуют D-алчптьные. Наличие О-гцетилькых групп характерно для тейхоеаиг. кислот стрептомицетов.

Гласг 3. Стеночкие тейхоспые кислоты.

Следующая задача состояла ь изучении структур тейхостэт кислот типовых штг-мов рода Agromyce;. Предварительное химическое исследование клеточных стенок типовых штаммов показало (см. тгбп.4), что все они соаерг.эт различные наборы фосфорных эфироа глицерина, рибита и неидентифииироьаниого пока алъдита. Это позволило предположить, что структуры сгеночных полимеров огличаются друг от друга.

Таблица 4. Химическая характеристика препаратов клеточных стенок

типовых штаммов рода Agromyces.

Штамм Робш Рцк Рлаб Рщ % от сухого веса навески Продукта КГ (2н На Зч. 100*0

основные [моносахариды и éосф. эфир» алшпы

A.cerinus ssp.ccrinus ВКМ Ас. 1340Г 2.17 007 0.16 1.94 моно-и дн фосфат X альдита Gai. Glc, Rha. X-алышт \

A.cerinus <■ ssp.nitratus ВКМ Ас-1351т U29 ао8 0,05 1.15 RboP, GroP, GroPj, Rbo, Gai. Rïb. Gro, спелы: Glc. Rha

AJucosus sspjucosus ВКМ Ас-1345* 054 0.06 0.03 0.45 GroP. GroPj Gro, Gai, GIcNAc, следы: Rha, Glc

A.focosus ssp.hippurasui ВКМАс-1352Т МО 0.08 0,10 1.62 RboP. RboP2, GroP. GroP2 Rbo, Rha. Мал, Gai, GIcNAc, Gro

3.1. Тейхоевая кислота A. cerlnus ssp. nltratus ВКМ Ас-1351т.

Кислотиый гидролиз тейхоевой кислоты этого микроорганизма привел к образованию рада продуктов, идентифицированных с помощью бумажной хроматографви н электрофореза (см. рис.1): галактозы, рибозы, рибита, неорганическою фосфата, а также рибитфосфата. Отсутствие дифосфата рибита саааетстствонало о том, что полимер не является поли(рибитфосфатом), а, возможно, имеет гпикозилрибитфосфатную природу. В шелочном гадрешизате полимера с помощью электрофореза были найдены в основном неоргашпсский фосфат и эфир (ЭР feu, рис.1). Э1 шел злсгтрофорстичесгую подвижность EGmP=0.74 и образовывал изомеры RcroPp =0,55 и 0,65 • системе (iiponaH-l-on:NH»OH:H20=6J:l). Кислотиый гидролиз эфира приводил к образованию тех же продуктов, что и кислотный пшролиз целого полимера, что могло свидетельствовать о том, что Э1 является его мономерной единицей. Мольное соотношение общего фосфора и рибозы составляло 0,82:1.00. При ферментативном гидролизе Э1 образовались минеральный фосфор и глигтил ( Г?. V содержащий рибит, рибозу и галактозу и имеющий пра хромзтографировании в системе 1 Rqc=I,02. Г2 не окрашивала аншшнфталгтои. В НН-гидролизате полимера были найдены нсоргаяичссквн фосфат, рибит и дисаирид, имевший в системе 1 Roc=l,07 (см. рис.1). Прикислатнои гидролизе дисахарид образовал галактозу и рибозу в эквимопярвом количестве. Паролю гликозидной связи между рибитом и дисахарагом при обрабопсс HF мог указывал, на присутствие одного m моносахаридов в фурыюзнон форме [Schubert et aL, 1993]. Из полученных данных cxsjci, что

дисахарид, состоящий in рнбозы и галактозы, соединяется с рибитом и эта «расформированная сдншша я власти мономером тсйхосвой кислоты. Детальная структура полимера была установлена методами ЯМР-спектроскошш. Абсолютную конфигурацию мохюсихаридов . определили с помощью ГЖХ. Длина цепи, раечкгатая после определения молекулярной массы полимера, составляет 17-18 сяидац. Таким образом, по данным химического анализа и ЯМР, полимерная испь вытадат следующим образом:

Г

-*■ 3>-|3-D-Ribai 1 )-Rbo-(5-0-P-0" -»2 ¡I

' f О

U-D-Galp

Итак, тсГиоесая кислота A cerinus srp. nitrems ВКМ Ac-135iT прсдстаыист собой поли(ркбофургкозтркбатфосфзгнуэт) цыа> из I7-1S моиомерных единиц, в которой к каждом/ остатку ß-рибофуранозы присоединен no С-2 6охоеой а-галаггог.иранозильны": заместитель. Тахгд структура в прокариотыеской клетке обнаружена вперлые. Близкий по строению полимер, содержащий пши^риСофуранизипрг.битфосфапну.о) цепь, но без галаггозильных заместителей, обнаружен б кглсульвом материале 1рамогр:шотельиой бактерии Haemophilus influenzae, тип Ъ lCrise.1 el aL, 1375; Brancfors-Helandcr et aL. 1376].

S.Z. Тейхоеаая кислота A. fueosus ssp- fueosus SKM Ac-i045T.

Тейхоевая кислота данного мгариоргешела имеет наиболее прогтуюга иссямованиых структур. В ее кислотном гидращзате были иас;ьифииироваяы • моно- и дифосфаты глицерина, неорганический фосфат, глицерин к ппокозамин (см. рис. 2). Полчмср подвергался щелочному гидролизу с образованием тех see гфиров, а также фосфодиэфиров глицерина (см. рис.2). Это указывало на то, что полимер, вероятно, является тюли(гпицсрофосфатом), nie паокозамиц присутствует в качестве заместителя на некоторых гпииерофосфлншс единицах. Это предположение было поятверхдено данными ЯМР-спсктроскопинГ Тейхоевые кислоты похожи структуры найдена у Streptomyces reseofleuna var. roseofung'mi [Наумова к др.,1922] и Arshrobacter nicoiwnae [Садиков и гр.,1987].

3.3. Тейхоевые кислоты штаммоа A.fucosus вер. hippuraius.

Кислотный гидролиз тсйхосвой кислоты типового штамма BICM Ас-1352т г.ривел к образованию моно- и дифосфатоз рибита, ркОита, ргмнозы, глкжозашша, неорганического ■ фггфата и небольших холич'ств ангидро-ркбпта а его фосфага (см. рис.3). Образовали; моно- и жифосфатов рибита и гнгидрорибита свщегельстаогало о том, что пеликер является псли(рибит-фосфагаой) тсйхосвой кислотой, имжшей, очевидно, два заместителя -рамнззу и шокозамин. Было установлено также кольное соотгошьгшс фосфора, рамнозы и шокозгмина = 1,0 : 3,3 : 0,9. Это озиа.чг.ст, что иа сеян рибитфосфаткый мономер в цели полимера приходится три остатка рамнозы и один - пиокозамина.

/

-ССНг ОН /ОСНг ОН /ОСНг ОН /ОСНз ОН /ОСНг ОН , \ / • ■ ■

ЭН /Р' НСОН /?' 1» .. 1 /«

НСОН

ЭН /ОСНг ОН /ОСНг ОН /О?"* ОН /1/1 I / 1 I / 1 I /

НГ.Г» НГ.ПЯ .Л' НГ.ОН

НСОЛ /Р' НСС« уР' НСОН /Р'

/II I /а ..1-/1

I

НгСО' о НгСО о НгСО о НгСО

н со-1 НзССН

Н2СО 1 I

пн ' - Г?~ОН + "СО" +

ОН НСО J « |

0 НгСОН

НгСО

ОН НгСО") |

I -р-он +

НСО" и

I о

НгСОН

I I НО-Р—ОСНг

О

СНгОН

Н№с

ОН"

НгСО' I

НСО' I

НгСОН

и ^гт 0й НгСОН

I НгСО | ^ -Р-ОН + I -Р-ОН + нсои +

II * ОН НСО" II I

О I I О н.гпм

НО-Р-ОСНг о

О

ноенг он /ОСНг I 1/1

НСОЯ /Р' НСОЯ

I /В I НгСО О . НгСОН

Рис.2. Схема кислотной и щелочной деградации тейхоевой кислоты А.¡исохш ¡¡р./исо^из ВКМ Ас-1345т.

НаСО-

Рне. 3, Схема гислапюш и щелочною шаролта ТК А.[исозш мр.Ырригам ВКМ Ас-1332т

N

При обработке тсйхоевой кислоты 40% был получен гпиктил П (см. рис.3), имевший при хроматстрафировании в системе 1 Кас=0,34. В кислотном пшролизате гликозида были идентифицированы рибет, рамноза и глюкозами«. .

После химического анализа было проведено независимое ЯМР-спектроскопическое исследование тсйхоевой кислоты и гликозида ГЗ, и установлена последовательность соединения сахарных остатков, типы замещения в них к локализация фосфодиэфирной связи в полимере. Абсолютная конфигурация моносахаридов была определена с помощью ПЖХ.

Итак, по результатам химического и ЯМР-спектроскопического исследования тейхоевая кислота А ¿исоаш ар.' Ырригаш ВКМ Ас-1352т представляет собой 1,5-связанный поли(рибитфосфат), эквимолярно замещенный по С-4(2) рибита боковым тетрасахаридом следующего состава: а-Ь-ЯЬарЧ 1->3)-а-Ь-Юш/>-( 1 ->3)-Р-1>01срКАс-( 1 ч>2)-с£-ЫУ12£Ч I После определения молекулярной массы полимера рассчитали длину его цепи, которая составляет 12-13 рибитфосфзтных единиц. Второй штамм подвида, ВКМ Ас-1353, имеет идентичную тейхоевую кислоту. Полимеры

такой структуры обнаружены у микроорганизмов впервые.

* * *

Особо следует сказать о тсйхоевой кислоте А. сеппиз ¡яр. септа ВКМ Ас-1340т. В клеточной стенке этого микроорганизма четко идентифицируются мопо- и дифосфаты альдита, сходного по иодвижносга с рибитом, который, однако, не относится ви к одному из 4 полиолов, найденных в составе тейхоевых кислот ранее. Полимер не удается выделить ни из мииелия, ни из клеточной стенки известными методами. Возможно, это объясняется необычным типом связи между ним и пешидогоиканом. При фгоролизс клеточной стенки были получим два гликозида, ЯМР-спектроскопическое исследование которых дало следующие предварительные результаты:

а-б-дсзокси-Ь-Та]р (1->-3)-Р-01сКАс-( 1 ->2)-а-Юи-( 1 ->4(2))-алышт и Р-С1сЫАсЧ1-»2)-а-Ю1а-(1-»4(2))-альдит

В состав одного гликозида вводят остатки альдита, рамнозы, глюкозамина и б-дезоксигалозы, а второго - те же самые, за исключением талозы. Точная структура полимера пока.не установлена, но из имеющихся данных уже ясно, что она отличается от структур тейхоевых кислот других типовых штаммов, Тейхосвые кислоты, содержащие б-дезокситалозу, ранее найдены не были. Полученные данные указывают на то, что это - поли(альдитфосфатные) цепи с рамнозой, М-ацетилппокозамииом и дезокситалозой, которые образуют ди- и трисахаридные заместители при С-2(4) альдита.

Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружено, что липотейхосвыс кислоты, закрепленные гидрофобной частью в мембране, у всех типовых штаммов агромицетов имеют близкую структуру, а тейхоевые кислоты, расположенные в более поверхностных слоях клеточной стенки, значительно различаются между собой. Полученные результаты интересны с позиций видоспеаифичности стеночных тейхоевых кислот. Ранее работами

нашей лаборатории было показано, что все штаммы Nocardiopsis dassonvillei имеют одинаковые по структуре тейхоевые кислоты [Tul'skaya el al., 1993]. Та же закономерность отмечена и для Nocardiopsis albus ssp.albus [Тульская, неопубликованные данные], а также для видов родов Acrinoplanes [Янушкене, 1992], Streptomyces и Actinomadura [Naumova, 1988]. Наличие в двух штаммах Ajucosus ssp.hippurams одинаковых по структуре тейхоевых кислот является еще одним подтверждением видоспецифичности этих полимеров в агпшомииетах..

В связи с этим нам кажется возможным предположить, что исследованные подвиды двух видов рода Agromyces, содержащие в клеточных стенках структурно различные тейхоевые кислоты, могут являться самостоятельными видами. Полученные ранее данные пумсричсского анализа и ДНК-ДНК. гибридизации не противоречат этому, а скорее свидетельствуют о нахождении изучаемых штаммов на транше разделения подвида и вша [Zgurskaya et aL, 1992]. Этот вопрос, однако, должен решаться с учетом остальных результатов физиолого-биохимических и хсмотаксономических исследований.

Выводы

1. 12 исследованных штаммов рода Agromyces содержат тейхоевые и/или лишттейхоевые - кислоты поли(полиолфосфатной) и поли(гликозилполисш-фосфатной) природы.

2. Липотсйхоелые кислоты четырех типовых штаммов агромицегов сходны по структуре. Их гидрофильная цепь представляет собой 13-поли(ппшерофосфат), частично замешенный а-галахтопиранозшшшми и 0-аиетлльными остатками, причем степень замещения варьирует у разных штаммов. О-ацепшьные группы в составе липотейхос-зых кислот обнаружены впервые. Среди жирных кислот у этих полимеров вида А■ cerinus преобладают антеизо-Снл. изо-Сюя, антензо-Срл. а у вида A. fueosus, кроме них, еше н-Cito- ,

3. Тейхоевая кислота A. Jucosus ssp. fueosus представляет собой 13-поли(пшцерофосфат), частично замешенный ß-N-ацетилпнокозамином. _

4. Два штамма подвида A fueosus ssp. hippuratus. ВКМ Ас-13521 и ВКМ Ас-1353 содержат одинаковую тейхоевую кислоту, состоящую из 12-13 1,5-связанных рибитфосфатпых мономеров, каждый из которых замещен по С-2(4) тетрасахаридом следующего строения:

a-L-Rhaf>-( 1 ->3)-a-L-Rhap-( 1 ->3)-ß-D-GlcpN А с-( 1 ->2)-a-L-Rha^-( 1

Тейхоевая кислота такой структуры у прокариотов накдена впервые.

5. Acerinus ssp.nitratus ВКМ Ас-1351т содержит в клеточной стенке пали(рибофурапозилрибшфосфатную) тейхоевую кислоту из 17-18 мономероц, в которой к каждому остатку ß-D-рибофуранозы присоединен по С-2 a-D-галастопирансвильный заместитель. Такая структура ранее у микроорганизмов обнаружена не была.

6. В клеточной стенке Acerinus ssp.cerinus ВКМ Ас-13401 присутствует необычная пали(гльшпфосфатиая) тейхоевая кислота, нолиолфосфатны:

остатки которой нссуг по С-2(4) дисахаридные или трисахарндные заместители следующего строения:

а-б-дезокси-Ь-Та]/К 1 ->3)-Р-С1сКАс-( 1 ->2)-а-И1а-( 1 ->4(2))-альдит и

Р-ОШАсЧ1-»2)-а-К1>а-(1->4<2))-альдиг

Полная структура полимера не установлена.

7. Данные по структурам стсночных тейхоевых кислот четырех типовых штаммов рода Agromyces могут быть использованы как дополнительный критерий при определении таксономического статуса штаммов рода.

* * *

В заключение считаю своим долгом выразить благодарность д.х.н.

А.С.Шгткову, за снятие и интерпретацию спектров ЯМР, и к.х.н.

H.А.Парамонову, за помощь в определении абсолютной конфигурации

моносахаридов.

По тема диссертации опубликованы следующие работы:

I. Zgurskaya Н., V.Gnilozub, UEvtushenko and L.V.Kalakoutskii.v4gromycej cerinus sp.nov. and a proposal to emend the discription of the genus Agromyces (Gledhill and Casida,1969; Casida.1986). // Abstracts of Int.Sym.Biol.Act.-1991.- USA.- Madison.- P3-012.

2. Шашков A.C., Гнилозуб B.A., Наумова И.Б., Сгрешинсхая Г.М., Евтушенко Л.И. Поли(рибофуранозилрибитфосфат) в составе клеточной стенки Agromyces cerinus subsp. nitratus BKM Ac-1351. // Биоорган, химия.- 1993.-Т.19.- №4,- С433-438.

3. Гнилозуб В.А., Шашков А.С., Наумова И.Б., Сгрешинская Г.М., Евтушенко Л.И. Липотсйхоевые кислоты видов рода Agromyces. // Микробиология.-1994,- Т.бЗ,- BJ.- С.00-00.

4. Gnilozub V.A., Slrcshinskaya G.M., Naumova LB., Shashkov A.S., Evmshcnko L.L Unusual teichoic acids in Agromyces ccll walls, // ISBA'94.-Int.Symp.BioI.Actinomycetes.- 1994,- Moscow.- in press.

5. Гнилозуб B.A., Сгрешинская Г.М., Евтушенко ЛЛ., Наумова И.Б.. Шашков А.С 1,5- Поли(рибитфосфат) с теграсахаридными заместителями в клеточной стенке Agmmycis fucosus ssp. hippuratus. 1/ Биохимия.- 1994,в печати.