Тейхоевые кислоты актиномицетов

Потехина, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тейхоевые кислоты актиномицетов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Тейхоевые кислоты актиномицетов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ПОТЕХИНА Наталья Викторовна

ТЕЙХОЕВЫЕ КИСЛОТЫ АКТИНОМИЦЕТОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

| Наумова И.Б. (биохимия) доктор биологических наук, профессор Нетрусов А.И. (микробиология)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Калебина Т.С.

доктор биологических наук, профессор Крицкий М.С. доктор биологических наук, профессор Зенова Г.М.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Гаузе Г.Ф. РАМН

Защита состоится « 9 » июня 2005 г. в 1530 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу г. Москва, Ленинские юры, д. 1, корпус 12, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан « О » мая 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного

совета, кандидат биологических наук V/ Пискункова Н.Ф.

ZMfZoo

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тейхоевые кислоты - анионные полимеры клеточных стенок, обязательным структурным элементом которых являются полиолфосфаты. Тейхоевые кислоты (ТК) широко распространены среди грамположительных бактерий и составляют до 60% от веса клеточной стенки содержащих их бактерий. Ковалентно связанные с пептидогликаном (ПГ), ТК представляют неотъемлемую часть клеточной стенки и, таким образом, находятся в тесной связи со всеми процессами, происходящими при ее участии. Среди них -рост и деление, связывание и резервирование катионов, необходимых для функционирования мембранных ферментов, процессы межклеточного узнавания, рецепция фагов и патогенность.

Тейхоевые кислоты и другие анионные соединения, связанные с ПГ по всей толще клеточной стенки, вносят существенный вклад в формирование структуры полиэлектролитного геля и определяют механические свойства стенки. Отталкивание одноименных зарядов поддерживает ПГ в растянутом состоянии, способствует его пористости [Archibald et al., 1990].

Проблема изучения ТК имеет несколько аспектов. Фундаментальный аспект включает изучение структурного разнообразия биополимеров. Полученная информация о строении полимеров важна для понимания их свойств, функций в микробной клетке, выяснения механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой. Изучение ТК в значительной степени расширяет наши представления о биоразнообразии природных соединений.

ТК в последние десятилетия являются объектами медицинских исследований Исследование клеточных стенок патогенных микроорганизмов привело к пониманию таких важных явлений как адгезия, вирулентность, образование биопленок на имплантированных материалах [Rijnaarts et al., 1995; Hussain et al., 2001], а также природы некоторых аутоимунных заболеваний человека [Дерябин и Каральник, 1983]. Тейхоевые кислоты наряду с другими компонентами клеточных стенок ответственны за чувствительность клетки к ряду антибиотиков и

1ч>с. национальна* . библиотека i

иммуномодуляторные свойства бактерий [Wicken and Knox, 1975; Archibald, 1980; Gl ark et al , 2000].

Исследование анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий представляет интерес также с точки зрения таксономии микроорганизмов Возможность использования тейхоевых кислот в таксономии обсуждается с момента их открытия. Для ряда таксонов порядка Actinomycetales была продемонстрирована возможность использования тейхоевых кислот в качестве хемотаксономических признаков Признак "наличие ТК" дифференцирует таксоны высших порядков, таких как подпорядок и семейство [Евтушенко, 2003], в то время как структура ТК может служить маркером для дифференциации актиномицетов на уровне вида [Naumova et al, 2001]. В связи со всем вышесказанным представляется актуальным изучение структур тейхоевых кислот - представителей как можно большего числа родов порядка Actinomycetales.

Состояние вопроса. Проблеме изучения стеночных тейхоевых кислот около пятидесяти лет ТК, открытые впервые в клеточных стенках лактобацил и стафилококков, представляли собой глицерин- и рибитфосфатные полимеры, несущие в качестве гликозильных заместителей глюкозу или аминосахар [Armstrong et al., 1958]. Почти в это же время ТК были обнаружены проф. Наумовой И.Б. и акад. Белозерским А.Н. [Наумова и др., 1962] в клеточных стенках актиномицетов. С тех пор эти полимеры успешно изучают на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ. За прошедшее время были исследованы около 250 штаммов, принадлежащих различным семействам и родам порядка Actinomycetales, в том числе и выделенным и описанным недавно. Изучение актиномицетов позволило открыть принципиально новые структуры, структурные типы и структурные элементы ТК.

Со временем представления о составе ТК расширялись: были открыты маннит-и арабитсодержащие полимеры, рибиттейхоевые кислоты с 3,5-типом фосфодиэфирной связи и тейхоевые кислоты, содержащие в интегральной цепи углеводный компонент. Во многом эти достижения стали возможными благодаря применению новьре методой изучения' углеродсодержащих биополимеров- с конца

1970-х годов структуры ТК начали исследовать методами ЯМР-спектроскопии [De Boer et al, 1976, 1978; Shashkov et al., 1979].

Анализ экспериментальных данных по структурам тейхоевых кислот, описанных в литературе, позволил выделить 4 структурных типа этих полимеров на основании природы фосфодиэфирных связей в интегральной цепи: поли(полиолфосфаты) (I тип), поли(гликозилполиолфосфаты) (И тип) и полимеры смешанной структуры (III и IV типы) [Наумова и Шашков, 1997]. В зависимости от природы потаола и положения фосфоэфирной связи, объединяющей элементы интегральной цепи, выделяют подтипы тейхоевых кислот [Naumova et al , 2001].

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучение структурного разнообразия тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов (не исследованных ранее или перспективных в плане поиска новых структур), а также сравнительный анализ структур ТК для решения ряда таксономических задач.

В задачи исследования входило:

- изучение распространения ТК клеточных стенок представителей родов Actinomadura (24 штамма), Nonomuraea (12 штаммов), Brevibacterium (12 штаммов) и некоторых других организмов (4 штамма, 3 вида);

- установление структур ТК ряда актиномицетов, представляющих интерес, как в структурном, так и в таксономическом отношении;

- анализ возможностей использования данных по структуре тейхоевых кислот в целях классификации и идентификации представителей родов Actinomadura, Nonomuraea и Brevibacterium.

Научная новизна и значимость работы. Впервые в клеточных стенках представителей родов Actinomadura, Nonomuraea и Glycomyces обнаружены ТК и установлены их структуры.

Установлено 11 новых структур тейхоевых кислот, в том числе уникальная структ>ра тейхоевой кислоты, содержащей в качестве полиола эритрит. Впервые обнаружены ТК, несущие остатки а-галактозамина, З-О-метилгалактозы

(мадурозы), З-О-метилрамнозы, глутаминовой и ортофосфорной кислот. На основании данных этой работы выделены два новых подтипа ТК.

Впервые проведено широкое сравнительное исследование структур и состава анионных полимеров клеточных стенок штаммов p. Brevibacterium, в том числе и гетерогенной группы организмов, причисляемых к виду Brevibacterium linens в соответствии с фенотипическими характеристиками. С использованием полифазного подхода и, в значительной степени, на основании различий в составе дифференцирующих Сахаров и полиолов ТК были описаны три новых вида. Установлено, что клеточные стенки бревибактерий наряду с ТК могут содержать анионные полимеры другой природы, сахар-1-фосфатной, мало исследованные в настоящее время, а также тейхуроновые кислоты.

Результаты работы, которая является первым исследованием тейхоевых кислот актиномадур, нономурий и гликомицетов углубляют наши представления о распространении ТК в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales, а исследованные ТК, сахар-1-фосфатные полимеры и тейхуроновая кислота - о строении бактериальной клетки.

Практическая ценность. С использованием полученных данных о составе Сахаров и полиолов ТК разработана система идентификации бактерий рода Brevibacterium, представители которой используются в сыроделии. Результаты о распространении и структуре ТК могут служить для усовершенствования системы идентификации актиномицетов родов Actinomadura и Nonomuraea, продуцентов антибиотиков и других биологически активных веществ, а также - в практике идентификации других возможных продуцентов новых антибиотиков или иных организмов, представляющих интерес при решении биотехнологических задач.

Данные ЯМР-спектроскопии по химическим сдвигам ,3С атомов ряда ТК пополнили базу данных по спектрам ЯМР и могут быть полезны при анализе структур близких полимеров другими исследователями.

Данные работы о строении и распространении ТК входят в магистерский курс "Полифазная таксономия и идентификация микроорганизмов" в ПущГУ и могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии и микробиологии на

биологических факультетах университетов или институтов. Ряд результатов, представленных в работе, вошел в современные обзоры, монографии и главу международного руководства по микробиологии (Neuhaus and Baddiley, Microbiol. Mol.Biol.Rev. 2003. 67(4):686-72; "The Bacterial Cell wall" [Seltmann and Hoist, 2002], The Family Nocardiopsaceae. In: "Prokaryotes" [Kropenstedt and Evtushenko, 2002, (www. prokaryotes.com)] и др.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 работы, из них 21 экспериментальных статей, 1 обзор и тезисы 12 докладов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" (Ленинград, 1984); 8-ой Всесоюзной конференции «Химия и биохимия углеводов» (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); Конференция «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 1995); 2-ом Съезде биохимического общества РАН «Хемотаксономические перспективы» (Пущино, 1997); Симпозиуме ИНТАС «Микробные и клеточные системы в фармакологии, биотехнологии, медицине и окружающей среде» (Москва, 1999); Международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000); 10-ом Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002); 2-ой Германо-Польско-Российской углеводной конференции (Москва, 2002), 1-ом конгрессе FEMS европейских микробиологов (Любляна, 2003); 2-ом Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме, посвященном 120-летию со дня рождения академика В.Н. Шапошникова «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (6 глав), материалов и методов, их обсуждения, результатов исследования (3 главы), обсуждения результатов, заключения, семи выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертации содержитстраниц, включающих 36 рисунков, 42 таблицы. Список цитируемой литературы составляет 531 наименование, из них 70 — на русском языке.

Основные защищаемые положения диссертации.

- ТК широко распространены в клеточных стенках актиномицетов;

- ТК проявляют большое структурное разнообразие как в природе полиола, так и в

природе фосфодиэфирных связей и гликозильных заместителей;

- в составе ТК актиномицетов распространены О-ацетильные остатки или остатки других органических кислот и не встречаются (9-эфиросвязанные остатки О-аланина, характерные для ТК других групп грамположительных бактерий;

- клеточные стенки актиномицетов могут содержать две и более ТК, различной структуры (гетерогенность ТК);

- структуры ТК могут служить маркерами видов родов АсНпотайига, Мопотигаеа., Вгеу&аШпит и аусотусеь.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Биомассу актиномицетов получали из ИБФМ г. Пущино (Всероссийская Коллекция Микроорганизмов - ВКМ) и Института по изысканию новых антибиотиков им. Гаузе Г.Ф. РАМН (коллекция микроорганизмов - ИНА) и использовали для получения клеточных стенок [Стрешинская и др., 1979]. Тейхоевые кислоты экстагировали 10% ТХУ из клеточных стенок и мицелия, очищали ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (СГ- форма) или ОЕАЕ-Тоуореаг1 650М в линейном градиенте ИаС1 (1 —»0,5 М), а также фракционировали с помощью дробного осаждения этанолом [Ро1есЫпа а!., 2003] и исследовали их первичную структуру различными методами [РогесЫпа ег а1., 19В6].

Установление полной структуры тейхоевой кислоты включает определение природы полнола, типа фосфодиэфирных связей в коре полимера, природу заместителей, присоединённых сложноэфирными и гликозидными связями, конфигурацию гликозидных связей и абсолютную конфигурацию нейтральных Сахаров, маннита и пирувата, что достигается сочетанием химических, ферментативных и инструментальных физико-химических методов. Химические методы основаны на изучении продуктов деградации, получаемых при расщеплении полимера на фрагменты при кислотной (2М НС1, 3 ч, 100°С; 40% НИ, 24 ч, 4° С) и щелочной (1М ЫаОН, 3 ч, 100° С) обработках. Главными изучаемыми фрагментами химической деградации тейхоевых кислот являются фосфорные эфиры полиолов (ФЭ) и гликозиды (Г)- Исследование ФЭ и Г включает изучение их электрофоретической и хроматографической подвижностей, реакций с различными проявителями, продуктов кислотной и ферментативной (в случае ФЭ) деградаций и периодатного окисления. Изучается также их качественный и количественный состав. Данные о строении этих фрагментов сопоставляют, анализируют, что позволяет реконструировать структуру тейхоевой кислоты [Ке1ешеп е1 а!, 1961]. Результаты химического исследования ТК всегда подтверждали методом спектроскопии ЯМР |3С.

Молекулярные массы ТК определяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе С-50 [ТиГБкауа е1 а1., 1991].

Результаты исследования Глава 1. Тейхоевые кислоты актиномадур и нономурий 1.1. Распространение тейхоевых кислоту представителей рода АсИпота(1ига и Нопотигаеа.

Изучение актиномадур представлялось перспективным в связи с поиском продуцентов новых антибиотиков. Не менее актуальным являлось также всестороннее таксономическое изучение гетерогенного по составу рода АсПпотас1ига. В связи с этим сведения о распространении и составе тейхоевых

Таблица 1. Распространение тейхоевых кислот у представителей рода АсппотаЛига и Nопотигаеа. Некоторые систематические аспекты видов.

i р Acimomaduru (по данным на 1980 г.) № кластера [Fischer et al, 1983] № кластера [Alchalye et al . 1985] p Actinomadura, p Nonomuraea [Zhang et al, 1998, 2001, Gyobu and Miyadoh 2001] Тип TK Фосфорные эфиры кислотного гидролиза TK

1 A carmínala j A fastidiosa ИНА 428 Г - - N roseoviolacea subsp carmmata I GroP, Gro/S

ВКМ Ас-804 - - Nfastidiosa I -" -

i A Jen ufinea IMET 9567' 2 2 N ferrufinea I - -

A polychroma ИНА 27551 - - N polychroma I

A pusilla АТСС 27296' 2 2 N pusilla' I ." _

A reclicatena ИНА 308' - - N recticatena I „ " _

A roseóla ИНА 1671' 2 2 N roséola I _".

A roseoviolace АТСС 272971 2 2 N roseoviolace I

A rubra ИНА 325' - 2 N rubra I

A sulmunea ИНА 24881 - 2 A salmonea I - " -

A spirahs IMET 9621' Н Н N spiralis I

A turcmeniaca ИНА 3344' N turcmeniaca I

A citrea ИНА 18491 ИНА 18045 ИНА 18703 1 1 A ettrea I Rib-olP, Rib-ol/^

A coerulea ИНА 765' - 1 A coerulea I Rib-olP, Rib-olP2

A coeruleoviolacea ИНА35641 - 1 A coeruleoviolacea II Gro P

A iremea ИНА 292' ИНА 17721 ИНА 17863 1 A cremea 11 Gro P

A cremea subsp. rifamycmi ИНА 1349т - - A cremea subsp rtfamycini II GmP

A formosensis ВКМ Ас-1954 ' - - A formosensis И GroY

A fulvescens ИНА 3321' - - A fulvescens II GroP

A ki/amaía ВКМ Ас-874 ' 1 1 A kijaniata II . " .

A libanotica IMET 9616' 2 н Actinocoralha libanotica I GroP, Gro/>2

A lívida ИНА 1678' - 1 A lívida и Gr oP

A luleofluorescens IFO 130571 - н A luteofluorescens I Rib-ol/", Rib-ol/5?

А тасга АТСС 31286' - - A macra II Gro P

A madurae ВКМ Ас-809 1 1/Н 1 A madura1 I -" -

A malachilica ВКМ Ас-13151 ВКМ Ас-631 1 1 A viridis II II Gro/' Gro P

A pelletiert IMET 7141' 1 1 A pelletiert I Rib-olP, Rib-olP?

A rubrobrunea ВКМ Ас-775 1 - - Arubrobrunea II _" _

A spadix АТСС 27298' Н н A spadix I GroP, GtoPi

A umbhrina ИНА 2309' - - A umbbrtna I

A verrucosospora ВКМ Ас-668 - I A verrucosospora I Rib-ol/", Ribol/S

А \tnacea ИНА 1682' - A vinacea 1

Н - вил не входил ни в 1-й, ни во 2-й кластер, I - поли(полиолфосфатные) тейхоевые кислоты, II -но ш(1 1ико!илпопиопфосфатные) техоевые кистоты, Ого - глицерин. Rib-ol - рибит, GtoP и Gro/N -моно и дифосфат глицерина, Rib-ol/\ Rib-ol/1- - moho и дифосфат рибита

кислот у представителей рода Ас(гпотас/ига могли бы дать дополнительную л^с&йк

информацию для усовершенствования классификации этой группы актиномицетов, что позволило бы увеличить эффективность селектирования продуцентов.

Целью данного раздела работы было обнаружение, изучение распространения и структурных особенностей тейхоевых кислот у представителей рода АсШотаЛига В работе исследованы 37 штаммов актиномадур (в настоящее время штаммы относятся к родам Аа1потас1ига, Мопотигаеа и АсНпосогаИш, см. табл. 1). О наличие

лущили по

в клеточных стенках тейхоевых кислот/продуктам (свободным полиолам и их фосфорным эфирам), которые образуются при кислотной и щелочной деградациях ТК.

Первичный анализ показал, что все штаммы содержат в клеточных стенках тейхоевые кислоты поли(глицерофосфатной), поли(рибитфосфатной) и поли(гликозилглицерофосфатной) природы (табл. 1) [Потехина и др., 1985, Ыаитоуа е1а]., 1985].

1.2. Структуры тейхоевых кислот представителей рода АсйпотаДига.

Структуры тейхоевых кислот актиномадур имеют общие детали строения Они относятся к тейхоевым кислотам II типа, т.е. поли(гликозилглицерофосфатам). В составе кора полимеров всех изученных видов была идентифицирована галактоза, а гликозидные связи, в том числе и боковых гликозильных заместителей, имели Р-конфигурацию В то же время структура каждого полимера была уникальной, ранее не описанной и имела свои структурные особенности.

А. сгетеа ИНА 292т. Кислотный гидролиз ТК приводил к образованию монофосфата глицерина, неорганического фосфата и набора моносахаридов с преобладающим содержанием галактозы, а щелочной гидролиз - к образованию трёх фосфорных эфиров.

Фосфорный эфир 1 (ФЭ1) имеет два изомера и был идентифицирован как -

Р-0-Са1/»-(1 —> 1 )-8П-СГО-(2-/' И р-0-Са1р-(1^1)-5п-Сго-(3-Р

Фосфорный эфир 2 (ФЭ2) мог иметь несколько изомеров и представляет собой ФЭI, несущий дополнительный фосфатный остаток по одному из остатков галактозы: С-2. С-3 или С-4, что было доказано изучением продуктов его кислотной деградации и, в частности, ФЭ2а - монофосфата галактозы.

В продуктах щелочного гидролиза обнаружен также монофосфат глицерина. Кроме того, соотношение компонентов в цепи ТК свидетельствовало об её необычной структуре: на два моля галактозы приходилось три моля глицерофосфата. В работе рассматриваются возможные варианты структур ТК, воспроизведенные на основании изучения фосфорных эфиров и продуктов их деградации и сделан вывод о том, что отдельные глицерофосфатные мономеры локализуются на галактозе и образ} ют боковые ответвления поли(галактозилглицерофосфатного) кора полимера.

Структура ТК была подтверждена методом 13С ЯМР-спектроскопии: установлена локализация боковых глицерофосфатных единиц и фосфодиэфирной связи в интегральной цепи полимера [Потехина и др, 1989; Potekhina et al., 1991].

Таким образом, тейхоевая кислота клеточной стенки А сгетеа ИНА 292 является поли(галактозилглицерофосфатом). Мономерные единицы - P-D-галактопиранозил-(1—>1)-глицерин - объединяются фосфодиэфирными связями при участии С-3 глицерина и С-6 галактозы. Около половины галактозильных единиц замещены по С-3 - остатками монофосфата глицерина, которые образуют боковые ответвления от основного кора полимера-

l)-sn-Gro-(3-/»-

-6)-p-D-GaI/>-(l 3)

sn-Gro-(3-P

A. madura ВКМ Ас-809т. В кислотном гидролизате ТК были идентифицированы глицерофосфат, неорганический фосфат, галактоза, мадуроза (3-0-метилгалактоза) и глицерин. Отсутствие дифосфата глицерина в продуктах кислотного гидролизата позволяло предположить наличие в полимере сахарфосфатной связи Известно, что такие полимеры, поли[гликозил-(1->1 )-глицерофосфаты], гидролизуются щелочью с образованием изомеров

повторяющейся единицы цепи - гликозилглицерофосфата [Наумова и др., 1978; Naumova et al., 1990; Potekhina et al., 1991]. Однако щелочная деградация исследуемого полимера не приводила к гидролизу тейхоевой кислоты, что указывало на необычность ее строения.

Из дефосфорилированных продуктов гидролиза (40% HF, 24 ч, 5°С) ТК был выделен и изучен гликозид следующей структуры: p-D-GaJ/>-(l—>2)-Gro.

Сравнительный анализ известных структур ТК разного типа (описанный в работе) со структурными особенностями исследованного полимера, а также данные |3С ЯМР-спектроскопии привели нас к заключению, что тейхоевая кислота относится к поли[гликозил-(1->2)-глицерофосфатам].

В составе клеточной стенки A madura была обнаружена также 3-О-метилгалактоза (мадуроза), количество которой варьировало в разных партиях мицелия. Из мицелия, содержащего значительное количество мадурозы, был выделен препарат тейхоевых кислот, в составе которого обнаружены мономерные звенья двух типов- р-галактопиранозил-( 1 —>2)-глицерофосфат, и 3-0-метил-р-галактопиранозил-( 1 ->2)-глицерофосфат:

Поскольку разделить полимеры доступными методами не удалось, вопрос о присутствии в клеточной стенке одного полимера, содержащего остатки, как галактозы, так и мадурозы или двух полимеров, различающихся природой гликозильных остатков, остался не выясненным [Потехина и др., 1996].

Actinomadura viridis ВКМ Ас-1315т и Ас-631. В кислотных гидролизатах тейхоевых кислот обоих штаммов были обнаружены идентичные продукты -монофосфат глицерина, неорганический фосфат, глюкоза, галактоза, мадуроза, глицерин и незначительное количество дифосфата глицерина. Из препарата тейхоевой кислоты (HF-гидролиз) были выделены пять фракций гликозидов (дефосфорилированные повторяющиеся единицы цепи): Фр1 (Rc,\l= 0,27), Фр 2 (RUc

2)-sn-Gro-(3-Р-,

-6)-ß-D-Galp3Me-(l

2)-sn-Gro-(3-P-

-6)-ß-D-Galp-(l

= 0,38); Фр 2а (ÄG,C = 0,66); Фр 3 (ÄGlc = 0,79); Фр 5 (RGlc = 1,07). Фракция 1 содержала два гликозида - Г1 и Г4. Все фракции были спектрально охарактеризованы.

Спектр 13С ЯМР тейхоевой кислоты отвечал полимеру с нерегулярной структурой или смеси полимеров поли(галактозилглицерофосфатной) природы. Повторяющиеся единицы (гликозиды) связаны фосфодиэфирными связями, включающими гидроксильные группы при С-3 глицерина и С-3 ß-галактопиранозильного остатка. Эта структурная основа, галактопиранозил-П —> 1 )-глицерофосфат -

l)-sn-Gro-(3-P-t

-3)-ß-D-Gal/>-(l 4) (6 t t R1 R2,

имеет характерную особенность в виде боковых ответвлений (R1 и R2): галактозу или 3-0-метилгалактозу в положении 4 и/или глюкозу в положении С-6 галактопиранозильного остатка кора полимера. Новой структурной особенностью тейхоевой кислоты А viridis является наличие мономеров, содержащих два галактопиранозильных остатка на одном остатке глицерина, по С-1 и С-2:

l)-sn-Gro-(3-J»-

Т (2

-3)-ß-D-Galp-(l t

l)-ß-D-Galp

Этот минорный структурный фрагмент мог быть терминальным звеном вышеупомянутой тейхоевой кислоты, но нельзя исключать и возможности существования нового типа тейхоевых кислот с данным мономером в качестве компонента повторяющейся единицы цепи.

Поскольку полимеры не удалось разделить, вопрос о присутствии одного

гетерогенного полимера или нескольких, различных по структуре, остается

открытым. Разделение полимеров с помощью электорофореза позволило

обнаружить присутствие незамещенной поли(глицерофосфатной) ТК, и её

структура была подтверждена при анализе |3С ЯМР-спектра' обнаружен сигнал 67,5 м.д. от С-1 и С-3 1,3-поли(глицерофосфатной) цепи без гликозильных заместителей [ЗЬаэЫсоу ег а!., 1999].

1.3. Структуры тейхоевых кислот представителей рода Nonomuraea.

Тейхоевые кислоты представителей двух видов рода Nonomuraea относятся к 1,3-поли(глицерофосфатам) и содержат в качестве гликозильных заместителей остатки a-D-N-ацетилгалактозамина.

Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata ИНА 4281 Кислотная деградация ТК приводила к образованию фосфорных эфиров глицерина, неорганического фосфата, галактозамина и 3-0-метилгалактозы. В щелочном гидролизате обнаружены изомеры моно- и дифосфата глицерина, неорганический фосфат, глицерин, два гликозида, а также несколько фосфодиэфиров глицерина, среди которых преобладали ФЭ1 и ФЭ2.

Гликозид 1 (Г1) является а-0-Ы-ацетилгалактозамин-(1—>2)-глицерином, Г2 -3-<9-метил-(3-Б-галактопиранозил-( 1 —>2)-а-0-М-ацетилгалактозамин-( 1 —>3 )-глицерином, а ФЭ1 и ФЭ2 их фосфодиэфирами.

ФЭ1 Фосфомоноэстераза отщепляла 50% общего фосфора, что свидетельствовало о присоединении половины фосфатных остатков в ФЭ1 моноэфирными связями, а половины - фосфодиэфирными. Результаты анализа строения эфира, присутствие Г1 среди продуктов щелочного гидролиза полимера, а также данные о механизме гидролиза тейхоевых кислот этого типа [Дмитриева и др., 1976] позволили приписать ФЭ1, имеющему два изомера, следующую структуру:

/•-l)-Gro-(3-P-l)-Gro 2)

P-2)-Gro-(3-.P-l)-Gro 2)

a-D-GaINAc-(l

ФЭ2 также является фосфодиэфиром (аналогичным ФЭ1), но содержит в качестве гликозильного заместителя дисахарид, состоящий из а-Ы-ацетилгалактозамина и Р-3-0-метилгалактозы.

Факт образования при щелочном гидролизе тейхоевой кислоты изомеров моно-и дифосфатов глицерина указывал на присутствие свободных глицерофосфатных единиц без гликозильных заместителей, а наличие среди продуктов щелочного гидролиза фосфодиэфиров глицерина свидетельствовало в пользу 1,3-поли(глицерофосфатной) цепи.

Конфигурация гликозидных центров заместителей и положение З-О-метилгалактозильного остатка в дисахариде были установлены методом ЯМР-спектроскопии.

Мольное отношение компонентов в цепи - Р : Оа1М : Оа13Ме, с учетом определения средней длины цепи, равной 8 единицам, составляло 1,00 : 0,38 : 0,13 (8:3:1).

Таким образом, тейхоевая кислота клеточной стенки N гозеоуЫасеа эиЬзр. сагттма является 1,3-поли(глицерофосфатом), состоящим из 8 глицерофосфатных звеньев. Три глицерофосфатные единицы замещены по С-2 глицерина остатками а-\т-ацетилгалактозамина, а одна - 3-С>-метил-Р-галактопиранозил-(1-»3)-а-М-ацетилгалактозамина [№итоуа е1 а1., 1986, Наумова и др., 1986; Потехина и др, 1987].

Мопотигаеа гесНсШепа ВКМ Ас-940. В кислотном гидролизате тейхоевой кислоты были идентифицированы моно- и дифосфат глицерина, неорганический фосфат, галактозамин и глицерин. В продуктах щелочной деградации были обнаружены моно- и дифосфаты глицерина, фосфодиэфир, аналогичный по структуре ФЭ1 N гоБеоуЫасеа эиБэр. сагттМа, диглицеринтрифосфат и гликозид -

а-0-Са1/^Ас-(1 —>2)-в го.

На основании рассуждений, приведенных выше, был сделан вывод о поли(глицерофосфатной) природе тейхоевой кислоты и невысокой степени замещения интегральной цепи полимера гликозильными остатками.

Молекулярная масса тейхоевой кислоты составляет около 7,0 KDa, что соответствует 35 мономерным единицам.

Тейхоевая кислота была исследована методом ЯМР-спектроскопии. Соотношение интегральных интенсивностей сигналов от замещенных и незамещенных остатков глицерина позволило определить, что каждый пятый остаток глицерофосфата цепи несет гликозильный заместитель.

Таким образом, клеточная стенка N recticatena ВКМ Ас-940 содержит в своем составе тейхоевую кислоту 1,3-поли(глицерофосфатной) природы, состоящую примерно из 35 мономеров. Каждый пятый мономерный остаток замещен по С-2 глицерина остатками -a-N-ацетилгалактозамина (ТК аналогичной структуры описана в статье [Потехиной и др., 2004]).

Глава 2. Тейхоевые кислоты бревибактерий

Первые данные о составе клеточных стенок и тейхоевых кислот некоторых представителей рода Brevibacterium были получены Fiedler et al. [1981]. Было показано (на качественном уровне), что в клеточных стенках бревибактерий присутствуют гетерогенные по составу ТК и что этот признак может быть использован в качестве хематоксономического признака для штаммов рода. У нескольких штаммов бревибактерий были обнаружены манниттейхоевые кислоты, в то время как за пределами рода они были найдены лишь в одном организме -Bifidobacterium bifidum ssp. pensylvanicum [Veerkamp et al., 1985] В связи с вышесказанным изучение клеточных стенок представителей рода представляло особый интерес, как в плане обнаружения новых структур, так и в плане изучения возможностей использования ТК для дифференциации видов бревибактерий.

К началу наших исследований род Brevibacterium включал 8 видов, в том числе гетерогенный вид Brevibacterium linens

2.1. Выделение трех новых видов рода Brevibacterium: В. permease sp. nov., В. antiquum sp. nov., В. aurantiacum sp. nov.

В таксономическое изучение были включены 15 оранжево окрашенных штаммов рода, выделенные из осадков вечной мерзлоты, рисовых чеков и почвенных образцов, загрязненных отходами химических и соледобывающих производств. Все штаммы были предварительно отнесены к В. linens в соответствии с фенотипическими характеристиками, данными в описании вида [Breed, 1953], и могли расти в условиях повышенной концентрации NaCl

Проводили сравнительное изучение типа пептидогликана, менахинонов, жирных кислот, наличия миколовых кислот, содержания ГЦ в ДНК, а также ряда биохимических признаков. Для выявления геномовидов использовали метод ДНК-

Таблица 2. Дифференцирующие сахара и полиолы в продуктах кислотной деградации тейхоевых кислот клеточных стенок представителей рода Brevibacterium

Организмы Продукты кислотной деградации ТК

Gal Glc Rha GalN или GlcN Gro Man -ol Фосфорные эфиры

В casei ВКМ Ас-21141 - + - + + - GroP, OroP2

В epidermidis ВКМ Ас-2108г + + - + + + GroP, Gro/>2, Man-olP, Man-olPi

В loclimtm ВКМ Ас-21061 - + - + + + GroP, Gro/>2, Man-olP, Man-ol^

В linens ВКМ Ас-21121 + + - + + - GroP, GгоРг,

В linens ВКМ Ас-2159 - + - + + - GroP, GroP2

В linens ВКМ Ас-2119 + + - + + - GroP, GtoP2

В linens GK-3 + + - + + -

В. аигапйасит ВКМ Ас-2111т + + - + + - GroP, GroP2

В. aurantiacum ВКМ Ас-2110 + + - + + - GroP, GroP2

В. antiquum ВКМ Ас-2118т - + - + + + GroP, GroP2 Man-olP, Мап-о1Рг, Мап-о1Рз

В. antiquum ВКМ Ас-2281 - + - + + +

В. permense ВКМ Ас-2280т + + + + + + GroP, GroP2 Man-olP, Man-olP2

Man-olP Man-olPi. Man-olP;; - моно-, ди- и трифосфат маннита

ДНК гибридизации и определения нуклеотидных последовательностей 16S рДНК [Гавриш и др., 2004].

В гидролизатах клеточных стенок и углеводсодержащих фракций исследованных организмов определяли состав Сахаров и полиолов: обязательными являлись глюкоза, аминосахара и глицерин. В клеточных стенках 6 штаммов идентифицирована галактоза, а рамноза - только в штамме ВКМ Ас-2280т Обнаружены тейхоевые кислоты поли(глицерофосфатной) природы в то время как четыре вида (5 штаммов) содержали еще и маннитфосфатные полимеры (табл. 2).

На основании фенотипических, филогенетических и, в значительной степени, -различий в составе дифференцирующих Сахаров, полиолов и их сочетания в клеточных стенках и тейхоевых кислотах было предложено описание трех новых видов: Brevibacterium permense с типовым штаммом ВКМ Ас-2280т, Brevibacterium antiquum с типовым штаммом ВКМ Ас-2118Т и Brevibacterium aurantiacum с типовым штаммом ВКМ Ас-2111r [Gavrish et al., 2002; Гавриш и др., 2004].

2.2. Структуры тейхоевых кислот и других анионных полимеров представителей рода Brevibacterium

Целью следующего этапа исследований являлось подробное изучение структур тейхоевых кислот трех новых видов бревибактерий - В permense ВКМ Ас-22801, В antiquum ВКМ Ас-2118т и ВКМ Ас-2281, В. aurantiacum ВКМ Ас-2111т, трех штаммов В. linens - ВКМ Ас-2119 и Gk-З и Ас-2159 и В iodinum ВКМ Ас-2106т (всего 8 штаммов, 5 видов).

Тейхоевые кислоты бревибактерий представляли большое структурное разнообразие и относились к поли(глицерофосфатам), поли(маннитфосфатам) и поли(гликозилглицерофосфатам). Обнаружены также два полимера сахар-1-фосфатной природы и тейхуроновая кислота. В составе исследованных полимеров идентифицированы остатки ортофосфорной, янтарной и пировиноградной кислот. Кроме того, клеточные стенки всех изученных организмов одновременно содержали несколько различных по структуре тейхоевых кислот, с обязательным присутствием поли(глицерофосфата). Пять структур тейхоевых кислот и два сахар-1 -фосфатных полимера описаны в клеточной стенке грамположительных бактерий впервые.

ТК трех видов бревибактерий - В permense ВКМ Ас-2280т, В antiquum ВКМ Ас-21181 и ВКМ Ас-2281 и В iodinum ВКМ Ас-2106т являлись 1,617

поли(маннитфосфатами). С целью дополнительной идентификации маннита ТК дефосфорилировали, образовавшийся маннит накапливали и исследовали химическими и ЯМР-спектроскопическими методами. Маннит идентифицировали по полному совпадению химических сдвигов 'Н и 13С ЯМР с таковыми для стандартного образца маннита [Bock and Pedersen, 1983]. Абсолютная конфигурация маннита была D, как следовало из определения его оптического вращения.

В. iodinum ВКМ Ас-2106т. Анализ кислотных гидролизатов ТК выявил моно- и дифосфаты маннита и минорные количества фосфорных эфиров глицерина, а также неорганический фосфат, глюкозу, маннит, глицерин, незначительное количество галактозамина и пировиноградную кислоту.

ТК 1. Хроматографией на колонке дефосфорилированных продуктов гидролиза тейхоевой кислоты были получены четыре фракции. По данным ЯМР в первой фракции содержался гликозид следующей структуры: P-D-Glc,p-(1—>2)-Мап-о1(4,5 Руг) (мономер I), а во второй - Man-ol(4,5 Руг) (мономер И). Эти мономеры были спектрально охарактеризованы. Две оставшиеся фракции представляли собой не полностью деградированный полисахарид и нами не исследованы.

На основании изучения мономеров I и II и данных ЯМР-спектроскопии интактного полимера в составе ТК В iodinum были идентифицированы четыре типа мономерных остатков:

p-D-GIc-(l p-D-Glc/;-(l

I I

2) 2) -1)-D-Man-ol-(6-,P-, -1 )-D-Ma n-ol-(6-P-, -l)-D-Man-ol-(6-P-, -l)-D-Man-ol-(6-P-

4 5 4 5

\ / \ /

0S)-Pyr (5)-Pyr

Вероятно, все мономерные остатки составляют одну цепь тейхоевой кислоты, поскольку разделить полимеры доступными методами не удалось. Данные, полученные ранее Anderton et al. [1985] свидетельствуют в поддержку этого предположения.

Таким образом, манниттейхоевая кислота является полимером с 1,6-типом фосфодиэфирных связей. Мономерные единицы замещены (3-глюкопиранозой по С-2 и/или остатками 5-пировиноградной кислоты по С-4 и С-5 маннита.

ТК 2. В клеточной стенке изучаемого организма также была обнаружена глицеринтейхоевая кислота, присутствующая в качестве минорного (~7% от общего количества ТК) компонента. Ее структура, ранее не описанная, была идентифицирована как 1,3-поли(глицерофосфат), замещенный по С-2 глицерина остатками a-N-ацетилгалактозамина, несущими, в свою очередь, по С-4 и С-6 остатки Л-пировиноградной кислоты.

-l)-Gro-(3-P-2)

a-D-GalpNAc-(l 4 6

\ / (Я)-Руг

Таким образом, в клеточной стенке В iodinum обнаружены две различные по природе полиола и гликозильных заместителей пируватсодержащие тейхоевые кислоты, что установлено впервые [Потехина и др., 2005].

В. permease ВКМ Ас-2280т. Кислотная деградация теихоевых кислот приводила к образованию маннита, рамнозы и глицерина. Среди фосфорных соединений преобладали моно- и дифосфат маннита, а также моно- и дифосфаты глицерина. [Potekhina et al., 2003].

Предварительный анализ клеточной стенки показал возможное присутствие в ней не менее двух тейхоевых кислот с различной природой полиола или одного полимера сложной структуры. Анализ фракций ТК (препараты I-IV, дробное осаждение этанолом) показал, что препарат I преимущественно состоит из манниттейхоевой кислоты.

ТК 1. Щелочной гидролиз манниттейхоевой кислоты приводил к образованию гликозида- a-L-Rhap-(l—>3)-Man-ol и доминирующего ФЭ1, являющегося его монофосфатом.

Кислотный гидролиз приводил к образованию двух фосфорных эфиров - моно-и дифосфата маннита, неорганического фосфата, а также рамнозы, маннита и пировиноградной кислоты.

Локализация остатков пировиноградной кислоты, ее конфигурация, а также степень замещения маннитфосфатных остатков рамнозой и пируватом установлена методом ЯМР-спектроскопии.

Тейхоевая кислота является 1,6-поли(маннитфосфатом). 70% Маннитфосфатных звеньев замещены по С-3 остатками а-Ь-рамнопиранозы и 30% по С-4,5 - ¿¡'-пировиноградной кислоты.

ТК 2. Незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) как минорный компонент был выделен из препарата II, и его природа была доказана рядом химических методов.

Таким образом, в клеточной стенке В permense обнаружены две ТК. Доминитующим полимером является поли(маннитфосфат).

В. antiquum ВКМ Ас-2118т и Ас-2281. В кислотном гидролизате тейхоевых кислот (препараты I-IV) двух штаммов были обнаружены идентичные продукты -маннит и его фосфорные эфиры, а также моно- и дифосфаты глицерина. Дальнейшая работа проводилась с препаратом I, который практически полностью состоял из манниттейхоевой кислоты и не содержал Сахаров, что свидетельствовало об отсутствии гликозильных заместителей в цепи.

ТК1. Щелочной и кислотный гидролиз манниттейхоевой кислоты приводил к образованию идентичных продуктов - трех основных фосфорных эфиров: moho-, ди- и трифосфата маннита, что установлено на основании их электрофоретической подвижности и определения мольных соотношений, фосфор : маннит, в каждом соединении.

Наличие моно- и дифосфатов маннита в продуктах деградации полимера свидетельствовало в пользу поли(маннитфосфатной) природы тейхоевой кислоты, а

-l)-D-Man-ol-(6-/>-

-l)-D-Man-ol-(6-P-

3) t

a-L-Rha/?-(l

4 5

\ / (S)-Pyr

образование идентичных фосфорных эфиров при ее щелочной и кислотной деградации - об отсутствии гликозильных заместителей в цепи [Kelemen and Baddiley, 1961]. Однако, обнаружение трифосфата маннита не укладывалось в обычную схему гидролиза поли(полиолфосфатных) полимеров и свидетельствовало о необычной структуре исследуемого полимера. В работе приводится схема гидролиза манниттейхоевой кислоты, объясняющей образование трифосфата маннита. Остаток ортофосфорной кислоты присоединяется моноэфирной связью к одному из углеродных атомов маннита.

Присутствие фосфатного остатка при метиновой группе маннита было доказано тремя независимыми методами:

1) обнаружен сигнал 75,3 м.д. в спектре ЯМР 13С. Спектр того же полимера, обработанного фосфомоноэстеразой, соответствовал незамещенной цепи 1,6-поли(маннитфосфата): в нем полностью отсутствовал сигнал 75,3 м.д.;

2) обнаружен трифосфат маннита при деградации тейхоевой кислоты, а при обработке полимера фосфомоноэстеразой получено соотношение .Р0бщ : »2:1.

3) с помощью MS MALDI-TOF была установлена молекулярная масса структурной единицы полимера, равная 324 Da и отвечающая присутствию фосфатного остатка при метиновой группе маннита.

ТК2. Исследование щелочного гидролизата ТК (препараты II, III и IV) показало присутствие небольшого количества моно-, дифосфата, а также фосфодиэфира глицерина, содержащего глюкозамин. Наличие в препаратах 1,3-поли(глицерофосфатной) ТК, частично замещенной по С-2 остатками a-D-N-ацетилглюкозамина, также подтверждается данными ЯМР.

Таким образом, представленные результаты убедительно доказывают, что клеточные стенки двух штаммов Brevibacterium antiquum содержат 1,6-поли(маннитфосфат) с боковыми фосфатными группами при С-4(3) остатков маннита. ТК подобной структуры является уникальной, т.к. боковые остатки ортофосфорной кислоты никогда ранее не находили в составе ТК [Potekhina et al., 2003]. В ТК некоторых актиномицетов через фосфодиэфирную связь присоединялись боковые полиолфосфатные мономеры или олигомеры [Наумова и Шашков, 1997].

Кроме того, в клеточных стенках содержится вторая ТК, поли(глицерофосфатной) природы, частично замещенная остатками a-N-адетилглюкозамина.

В. aurantiacum ВКМ Ас-2111т. Кислотная деградация ТК приводила к образованию галактозы, глюкозы, га*актозамина и глицерина, а также фосфорных эфиров глицерина, что могло свидетельствовать о наличии в клеточной стенке глицеринтейхоевой кислоты.

ТК1. Изучение различных фракций тейхоевых кислот показало, что горячая экстракция (5% ТХУ, 5 мин, 100° С) клеточной стенки этого организма приводит к получению фракции, содержащей ТК поли(гликозилглицерофосфатой) природы. Согласно данным ЯМР мономерные звенья - а-галактопиранозил-(1-»2)-глицерин -объединялись фосфодиэфирными связями по С-3 глицерина и С-6 сахарного остатка:

2)-sn-Gro-(3-P-t

-6)-a-D-Galp-(l

Другие фракции, содержали смесь ТК1, ТК2 и тейхуроновой кислоты (ТУК). Структура ТК2 и ТУК была установлена с помощью спектроскопии ЯМР [Потехина и др., 2004].

ТК2 представляет собой 1,3-поли(глицерофосфат), замещенный по С-2 глицерина остатками a-N-ацетилгалактозамина или L-глутаминовой кислоты, впервые идентифицированной в составе ТК. В ТК актиномицетов, как правило, находили (9-эфирносвязанный L-лизин, более распространенный в рибиттейхоевых кислотах [Naumova, 1988].

ТУК содержала остатки глюкуроновой кислоты и ацетилированной галактофуранозы. Структура ТУК была новой, ранее не описанной:

->3)-p-D-Ga!/2OAc-(l->3)-0-D-GlcpA-(l->

В. linens ВКМ Ас-2119 и GK-3. Кислотная деградация ТК В linens ВКМ Ас-

2119 и GK-3 приводила к образованию одинаковых соединений - галактозы,

глюкозамина, пировиноградной кислоты и глицерина, а также фосфорных эфиров -

moho- и дифосфата глицерина, что могло указывать на возможное присутствие в клеточной стенке поли(глицерофосфатной) тейхоевой кислоты. Были получены и исследованы два гликозида.

Г1 был химически и ЯМР-спектроскопически охарактеризован и являлся p-D-галактопиранозил-( 1 —»1 )-глицерином.

Г2 был получен в незначительном количестве и далее его не исследовали. Однако данные по хроматографической подвижности и качественному составу могли свидетельствовать о присутствии в его составе дисахарида, состоящего из галактозы и глюкозамина.

Интерпретация данных химического анализа могла быть двоякой. Одновременное присутствие значительного количества моно- и дифосфата глицерина среди продуктов кислотного гидролиза, а также небольшого количества Г1 с локализацией гликозидной связи по С-1 глицерина могло свидетельствовать о наличии ТК 2,3-поли(глицерофосфатной) природы, незначительно замещенной гликозильными остатками [Kelemen and Baddiley, 1961]. Другой вариант предполагал присутствие глицеринтейхоевых кислот разного типа. Вопрос был разрешен методом ЯМР-спектроскопии.

Было показано, что клеточные стенки В linens ВКМ Ас-2119 и GK-3 содержат тейхоевые кислоты двух типов: незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) (I тип) как преобладающий полимер и поли( гликозилглицерофосфат) (II тип). Повторяющиеся единицы последнего связаны фосфодиэфирными связями, которые объединяют С-3 глицерина и С-3 p-D-галактозы. Эта структурная основа - галактопиранозил-( 1 —Я)-глицерофосфат имеет боковые ответвления в положении С-4 галактозы: 2-ацетамидо-2-дезокси-а-0-глюкопиранозильные остатки, как свободные, так и несущие в положении С-4 и С-6 кетальносвязанную S-пировиноградную кислоту [Потехина и др., 2004]:

l)-sn-Gro-(3-P-

-3)-P-D-Galp-(l 4)

a-D-G!cNAcp(4,6 5-Руг)-(1

В. linens ВКМ Ас-2159. Из клеточной клетки были выделены две углеводсодержащих фракции. В кислотном гидролизате первой фракции были обнаружены моно- и дифосфаты глицерина, глюкоза и глюкозамин. Во второй фракции, наряду с продуктами гидролиза, характерными для первой фракции, присутствовала янтарная кислота, а глюкозамин был выявлен в значительно большем количестве.

Обе фракции были исследованы методом ЯМР-спектроскопии. Анализ первой фракции показал присутствие 1,3-поли(глицерофосфата) и сахар-1-фосфатного полимера 1 (СФП 1).

СФП 1 имел мономерное звено с дисахаридом разветвленной структуры:

-4)-a-D-Glçp-(l -Р-3) Î

P-D-GlçpNAc-(l

СФП 2. Во второй фракции обнаружен сахар-1-фосфатный полимер 2. Его повторяющаяся единица также представлена дисахаридом, но линейной структуры, состоящим из чередующихся остатков а- и p-N-ацетиглюкозамина. Часть P-N-ацетиглюкозаминильных остатков несла О-эфирносвязанную янтарную кислоту:

-4)-P-D-Glc/>NAc-(l->6)-a-D-GIcpNAc-(l-P-3

Suc

Таким образом, клеточная стенка В linens ВКМ Ас-2159 содержит три анионных полимера: незамещенную тейхоевую кислоту 1,3-поли(глицерофосфатной) природы и два ранее не описанных у бактерий сахар-1-фосфатных полимера [Потехина и др., 2005].

Глава 3. Тейхоевые кислоты представителей некоторых других родов актиномицетов.

Целью этого раздела работы являлось исследование клеточных стенок отдельных представителей актиномицетов, тейхоевые кислоты которых имели уникальные структуры - Glycomyces tenuis ВКМ Ас-1250т, Streptomyces roseolus ISP 5174 и Nocardiopsis dassonvillei subs, albirubida BKM Ac-1882T.

Glycomyces tenuis BKM Ас-1250т. Кислотный гидролиз тейхоевой кислоты приводил к образованию эритрита, его фосфорных эфиров - моно- и дифосфатов эритрита (ФЭ1 и ФЭ2), глюкозамина и ангидроэритрита.

Эритрит идентифицировали БХ сравнением со стандартным образцом и методом ЯМР-спектроскопии. Природа ангидроэритрита, исследованного нами впервые, доказывалась рядом химических методов, а также сравнением с ангидроэритритом, полученным из стандартного образца эритрита, обработанного кислотой (6М HCl, 20 ч, 100 °С).

Щелочной гидролиз тейхоевой кислоты приводил к образованию эритрита, его моно- и дифосфатов, Г1 и ФЭ1.

Г1 был идентифицирован как 2-ацетамидо-2-дезокси-а-0-глюкопиранозил-(1-» 2(3Уэритрит: a-D-GlcNAc/>-(l ->2(3)-Ery-ol, а ФЭ1, имеющий два изомера, как его монофосфат:

a-D-GlcNAc/>-(l и a-D-GIcNAc/>-(l

i 4

2) 2) Ery-ol-(3-P Ery-oI-(4-P

> Образование moho-, дифосфатов эритрита и гликозилэритритмонофосфата при

расщеплении полимера щелочью указывало на поли(эритритфосфатную) природу

тейхоевой кислоты и на неполное замещение цепи гликозильными остатками.

Отношение интегральных интенсивностей сигналов от замещенных и

незамещенных остатков эритрита при анализе ЯМР-спектра позволило заключить,

что на 4-5 мономерных единиц цепи приходится один гликозильный заместитель. С

помощью гидроксиламинолиза в тейхоевой кислоте обнаружены ацетильные остатки.

Длина цепи, вычисленная на основании молекулярной массы (5,7 KDa) и совместно с данными 13С ЯМР, составляет около 23 эритритфосфатных единиц.

Таким образом, тейхоевая кислота G tenuis имеет структуру, необычную для грамположительных бактерий: впервые в качестве полиола обнаружен эритрит. ТК является 1,4-поли(эритритфосфатом), состоящим из 23 мономерных единиц. Четыре или пять из них замещены по С-2(3) 2-ацетамидо-2-дезокси-а-0-глюкопиранозильными остатками. Полимер несет также (^-ацетильные группы [Potekhina et al., 1993].

Streptomyces roseolus ISP 5174. Выделенная из клеточной стенки тейхоевая кислота при кислотной деградации образовывала моно- и дифосфаты рибита, ангидрорибитфосфат, фосфор неорганический, рамнозу, 3-0-метилрамнозу, рибит, ангидрорибит, а также небольшое количество глюкозы и маннозы.

Щелочной гидролиз тейхоевой кислоты приводил к образованию моно- и дифосфата рибита, ангидрорибитфосфата, двух фосфорных эфиров (ФЭ1, ФЭ2), а также свободного рибита и двух гликозидов (Г1 и Г2).

ФЭ1 имел 2 изомера, при действии фосфомоноэстеразы образовывал Г1 и являлся монофосфатом а-Ь-рамнопиранозил-(1—>4(2)-рибита. ФЭ2 имел аналогичную ФЭ1 структуру, но содержал в качестве гликозильного заместителя 3-Ометилрамнозу и образовывал, соответственно, Г2.

Определено соотношение остатков рамнозы и З-Ометилрамнозы в полимере. Оно составляет 3,54 : 1.

Наличие в кислотном и щелочном гидролизате полимера моно- и дифосфата рибита свидетельствовало о поли(рибитфосфатной) природе тейхоевой кислоты, а образование монофосфатов гликозилрибита, как основных компонентов щелочного гидролиза, - о высокой степени гликозилированности полимерной цепи.

В составе тейхоевой кислоты был обнаружен лизин, связанный с полимером сложноэфирной связью. Соотношение Lys : Ртк составляло 1 : 9. На основании молекулярной массы вычислена длина цепи ТК, соответствующая 20 единицам.

Локализация гликозидных и фосфодиэфирных связей установлена методом ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, тейхоевая кислота Streptomyces roseolus ISP 5174 является 1,5-поли(рибитфосфатом), состоящим из 20 единиц, почти полностью замещенными а-L-рамнозильными и a-L-3-Ометилрамнозильными остатками в отношении 4:1. Каждая молекула также несет 1-2 О-лизильные группы. Мономерные звенья имеют следующую структуру:

Структура ТК Streptomyces roseolus ISP 5174 описана впервые [Потехина и др., 1992].

Nocardiopsis dassonvillei subs, albirubida (BKM Ас-1882т и Ac-1454). При

кислотном гидролизе ТК двух штаммов образуются идентичные продукты - моно- и дифосфаты глицерина и галактозамин, его монофосфат и янтарная кислота. Наличие янтарной кислоты, связанной сложноэфирной связью, было подтверждено получением и исследованием ее гидроксаматов.

Структуру тейхоевой кислоты изучали с помощью ЯМР-спектроскопии.

Определение молекулярной массы полимера показало, что она близка 10 KDa, что соответствовало цепи с 14-15 повторяющимся звеньями.

Тейхоевая кислота двух штаммов N. dassonvillei subs, albirubida - это полимер ' смешанной структуры (IV тип), состоящий из чередующихся элементов поли(глицерофосфата) и поли(М-ацетилгалактозаминглицерофосфата). V Фосфодиэфирная связь объединяет С-3 глицерина и С-4 гликозильного заместителя, в то время как гликозидная связь осуществляется по С-2 глицерина:

-l)-Rib-oI-(5-P

-l)-Rib-ol-(5-/>-

a-L-Rha/»-(I

cc-L-Rha/>3Me-(l

2)-sn-Gro-(3-P-t

4)-p-D-GalNAc/J-(l t 3 -l)-sn-Gro-(3-P I Sue

Положение C-3 большинства гликозильных остатков занято моноэфиром янтарной кислоты [Шашков и др., 1997, Naumova et al., 2001].

Таким образом, в работе исследовано 53 организма, принадлежащих к родам Actinomadura, Nonomureae, Brevibacterium, Glycomyces, Streptomyces и Nocardiopsis В клеточных стенках всех исследованных штаммов обнаружены тейхоевые кислоты, содержащие в качестве полиолов глицерин, эритрит, рибит или маннит.

У 18 штаммов полностью установлены структуры тейхоевых кислот (табл. 3), большинство из которых описаны впервые. Полимеры принадлежат к трем основным структурным типам - поли(полиолфосфатам) (I тип), поли(гликозилполиолфосфатам) (II тип) и ТК смешанной структуры (IV тип). Каждый тип представлен несколькими подтипами, а тип IV - единственным подтипом, выделенным на основании структуры ТК Nocardiopsis dassonvillei subs. albirubida (штаммы - BKM Ас-1882т и Ас-1454).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение структурного разнообразия биополимеров, в том числе, ТК, широко распространенных в клеточных стенках грамположительных бактерий, можно рассматривать как аспект биохимической микробиологии, изучающий структуру и состав бактериальной клетки.

Получены данные о строении анионных полимеров клеточных стенок представителей видов ряда родов порядка Actinomycetales. Эти исследования видятся весьма актуальными, как в свете решения одной из главных проблем современной систематики микроорганизмов - выявление новых относительно стабильных таксономических маркеров родов и видов и уточнения границ ранее описанных таксонов, так и для расширения представлений о биоразнообразии,

Таблица 3. Типы и структурные вариации тейхоевых кислот клеточных стенок исследованных актиномицетов

Тип и подтип ТК Полиол Локализация фосфодиэфирной связи, мономеры ТК Боковые элементы ТК* Виды актиномицетов

гликозильные заместители неуглеводные заместители

Тип I, п о л и (н о л и о л ф о с ф а т ы)

1-Г 1,3 Глицерин -l)-Gro-(3-P- нет нет В permense ВКМ Ас-2280', В antiquum ВКМ Ас-2118Т и Ас-2281, В linens (3 штамма), A viridis ВКМ (2 штамма)

a-GalNAc, нет N recticatena ВКМ Ас-940

a-GalN, GaBMe нет N roseovtolacea subsp carminata ИНА4281

a-GalNAc L-Glu В aurantiacum ВКМ Ас-21111

a-GalNAc-(4,6 Pyr) нет В lodinum ВКМ Ас-2106'

1-Э 1,4 Эритрит -l)-Ery-ol-(4-/>- a-GlcNAc АсОН Glycomyces tenuis ВКМ Ас-12501

I-P 1,5 Рибит -l)-Rib-ol-(5-P- a-Rha, a-Rha3Me L-лизин Streptomyces roseolus ISP 5174

1-М 1,6 Маннит -l)-Man-ol-(6-P- a-Rha; Руг В permense ВКМ Ас-2280'

нет Н3Р04 В antiquum ВКМ Ас-2118' и Ас-2281

Glc Руг В iodinum ВКМ Ас-2106'

Тип И, поли(гликозилполиолфосфаты)

П-ГС 3,3 Глицерин -3)-Gal-( 1 —> 1 )-Gro-(3-/>- P-Gal, P-Gal3Me, Gic нет A viridis ВКМ Ас-1315 ' и Ас-631

a-GlcNAc-(4,6 Pyr) нет В linens ВКМ Ас-2119 и GK-3

П-ГС 3,6 Глицерин -6)-Gal-( 1 ->2)-Gro-(3 -P-\ -6)-Gal3Me-(l—>2)-Gro-(3-.P- нет нет A madura ВКМ Ас-809'

-6)-Gal-(l ->2)-Gro-(3-.P- нет нет Brevibacterium aurantiacum ВКМ Ас-2111 '

Тип IV, поли(полиол) юсфат-гликозилполиолфосфаты), смешанная структура

IV-ГС 3,4 Глицерин -l)-Gro-(3-P--4)-GalNAc-( 1 -»2)-Gro-(3 -P- нет Suc Nocardiopsis dassonvillei subsp. albirubida ВКМ Ас-1882т и Ac-1454

L-Glu-глутаминовая, Руг - пировиноградная, Suc - янтарная кислоты. * Структурные элементы, составляющие боковые ответвления интегральной цепи ТК (у ТКI типа - на полиоле, у ТКII типа - на сахаре). ** Названия родов актиномицетов Actinomadura, Brevibacterium и Nonomuraea даны в сокращении.

физиологических и экологических функциях этих уникальных природных соединений.

ТК демонстрируют большое разнообразие в строении, что, безусловно, связано с особенностями их биосинтеза и метаболитических процессов, происходящих в клетках, и, в определенной степени, отражает различия между разными группами микроорганизмов в целом.

С другой стороны, идентичность строения анионных полимеров, в том числе и ТК, может свидетельствовать о близкородственных связях содержащих их бактерий, например, на уровне вида.

Структурное разнообразие тейхоевых кислот и его биологическая роль.

Изучение структур ТК является первым и необходимым этапом, дающим ключ к пониманию свойств и функций этих биополимеров в клетке. Известно, что анионная природа ТК определяет их роль в коагрегации катионов, связывании автолизинов, в вирулентности и процессах адгезии, а отдельные элементы структуры определяют функциональную активность и некоторые биологические свойства этих полимеров.

Функциональная роль ацильных остатков ТК. Однозначно показана роль остатков D-аланина в регуляции общего отрицательного заряда как самой ТК, так и клеточной поверхности в целом [Neuhaus and Baddiley, 2003] и холиновых остатков ТК пневмококков - лигандов связывания с автолизинами [Holtje and Tomasz, 1975в].

Для ТК актиномицетов характерно наличие остатков L-лизина и органических кислот. L-лизин, имеющий свободные аминогруппы, вероятно, выполняет аналогичные D-аланину функции [Naumova, 1988]. В отношении О-ацетильных остатков было высказано предположение об их роли как консервантов энергии в силу высокой энергетики О-эфирной связи [Naumova, 1988].

С точки зрения физиологии бревибактерий, проявляющих галотолерантные свойства [Смирнов и др., 2002; Гавриш и др., 2003], можно объяснить наличие остатков пировиноградной, янтарной, глутаминовой и ортофосфорной кислот в ТК

и сахар-1 -фосфатных полимерах их клеточных стенок. Возможно, дополнительные анионные группы стеночных полимеров позволяют клетке компенсировать потери в способности "захватывать ионы магния" из окружающей среды, связанные с конформацией молекулы или - минимизировать воздействие на клетку ионов СГ.

Функциональная роль гликозильных заместителей ТК. ТК актиномицетов проявляют бесконечно большое разнообразие, как в природе фосфодиэфирных связей, так и в природе гликозильных заместителей (см. табл. 3). Наблюдаемое структурное разнообразие ТК трудно объяснить только с точки зрения их физиологических функций, которые, главным образом, основаны на анионных свойствах этих полимеров. Бесспорно, что уникальность каждой структуры имеет свой биологический смысл, к сожалению, мало изученный на современном этапе. Так, для некоторых бактерий показана роль гликозильных заместителей ТК в межклеточной коагрегации и связывании с фагами [Abeygunawardana et al., 19916; Archibald, 1980]. Известна также иммунологическая активность углеводных компонентов цепи [Baddiley and Davidson, 1961; Wicken and Knox, 1975a; Clark et al., 2000].

О важности гликозильных остатков свидетельствует тот факт, что свободные поли(полиолфосфатные) цепи ТК встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий достаточно редко. В то же время отсутствие гликозильных заместителей на ТК у мутантов не влечет за собой заметных нарушений в морфологии и физиологии клетки, в то время как потеря способности синтезировать ТК является для бактерии летальной [Karamata et al., 1987]. Возможно, гликозильные остатки ТК не являются жизненно необходимыми для клетки элементами структуры, но выполняют какие-то иные функции, роль которых еще до конца не ясна.

Известно, что природа и соотношение структурных элементов молекулы влияют на ее конформацию, что, в свою очередь, отражается на ее физико-химических свойствах. Так, в состав ТК ряда актиномицетов - A madura ВКМ Ас-809т, A viridis ВКМ Ас-1315Т и Ас-631 и 5 roseolus ISP 5174 входят остатки метилированных Сахаров. В A madura количество мадурозы в ТК, полученной из

разных партий мицелия, варьировало [Потехина и др., 1995]. В связи с этим возникает вопрос, включается ли метилированный сахар в ТК при биосинтезе полимера или происходит постсинтетическое метилирование гликозильных остатков. С одной стороны, известно, что в клеточную стенку включается уже полностью собранная цепь ТК. С другой -наличие в клеточной стенке некоторых ферментов, например, ацилирующих и дезацелирующих аминосахарные остатки в ПГ [Archibald et al., 1993], позволяет допустить и наличие фермента, метилирующего остатки Сахаров. Последнее предположение кажется наиболее вероятным, т.к. в составе тейхоевых кислот трех изученных организмов одновременно присутствовали как моносахарид, так и его метилированное производное. Метилирование сахарных остатков приводит к изменению физико-химических свойств ТК: метальная группа на галактозе или рамнозе должна усиливать гидрофобные свойства молекулы и тех участков клеточной поверхности, где происходит локализация полимера.

Гетерогенность ТК. Особенностью клеточных стенок актиномицетов является одновременное присутствие в их составе нескольких различных по структуре тейхоевых кислот. Гетерогенность ТК, по-видимому, связана с разграничением их функциональной активности, основанной на разной плотности отрицательного заряда полимеров и их локализации в различных участках клеточной стенки [Seltmann and Hoist, 2002].

При рассмотрении случаев гетерогенного состава тейхоевых кислот в исследованных организмах (и с учетом литературных данных) было замечено, что клеточная стенка всегда содержит 1,3-поли(глицерофосфаты). Анализ структур ТК, описанных в мировой литературе, показал, что эти полимеры наиболее распространены в клеточных стенках и встречаются практически во всех группах грамположительных бактерий, как родственных, так и филогенетически отдаленных. Возможно, пути их биосинтеза являются наиболее древними, и первыми ТК могли быть незамещенные поли(глицерофосфаты). Эволюция ТК могла идти по пути как изменения полиольного остатка (глицерин, эритрит, рибит, маннит), так и усложнения полимерой цепи с включением различных по природе

гликозильных и ацильных остатков. Принимая во внимание это предположение, можно объяснить тот факт, что наиболее сложные в плане клеточной организации актиномицеты имеют и наиболее сложные по структуре ТК.

В клетках одних бактерий сохранился весь процесс сборки 1,3-поли(глицерофосфата) как основной ТК, в клетках других -в качестве рудимента, для минорной ТК. Те же ферменты и нуклеотидные предшественники, участвующие в биосинтезе поли(глицерофосфата), используются и в синтезе глицерофосфатных единиц или глицерофосфатных олигомеров "области связи" независимо от природы основной ТК, которая (в известных случаях) может быть глицерин-, рибит- или гликозилглицерофосфатом [Archibald et al., 1993]. Глицерофосфатные элементы также входят в состав "области связи" тейхуроновых кислот и сахар-1-фосфатных полимеров [Наумова и Шашков, 1997].

Таксономический аспект проблемы изучения тейхоевых кислот.

Вовлечение ТК в жизненно важные функции клетки, огромное структурное разнообразие, а также широкое распространение среди грамположительных бактерий и, в частности, в актиномицетах, предопределяло их значимость как потенциальных хемотаксономических признаков. Ранее было замечено, что виды внутри рода содержат различные по структуре ТК [Davison and Baddiley, 1963]. Эти данные легли в основу гипотезы о видоспецифичности ТК, предложенной И.Б. Наумовой и др. [Naumova et al., 2001].

Выявленное разнообразие в структурах тейхоевых кислот представителей видов родов Actinomadura, Nonomurae Brevibacterium и Glycomyces при едином плане строения этих полимеров позволило оценить полученные результаты с точки зрения таксономии.

Роды Actinomadura и Nonomuraea. С момента описания Lechevalier et al. [1970] рода Actinomadura он служит объектом для обширных таксономических исследований, в результате которых состав входящих в него видов постоянно меняется, из 29 видов, известных в начале восьмид«

¡^й^^^^^^стиМмадуры

С-Петервург I 09 900 m I

(и взятые нами для исследования), в роде Actinomadura осталось только 13. Остальные виды были отнесены к родам Nonomuraea и Actinocorallia [Zhang et al., 1998; 2001]. В таблице 1 представлены данные о распространении и типе тейхоевых кислот у представителей этих трех родов.

Все виды, выделенные в род Nonomuraea, содержали глицеринтейхоевые кислоты I типа и входили во второй кластер. Химические структуры ТК трех изученных нономурий (с учетом данных по ТК N polychroma ИНА 2755т [Стрешинская и др., 1991]) могут свидетельствовать в поддержку этого предположения.

Виды актиномадур, составляющие первый кластер, полностью вошли в род Actinomadura, но по природе полиола (глицерин, рибит) и типу тейхоевой кислоты (I, II) проявляли гетерогенность, как это характерно и для представителей видов других родов актиномицетов [Naumova et al., 1980].

Сравнительный анализ данных по химическим структурам ТК представителей трех видов рода Nonomuraea (N roseoviolacea subsp. carminata ИНА 4281, N recticatena BKM Ac-940 и N polychroma ИНА 2755т [Стрешинская и др., 1991]) и трех видов рода Actinomadura (А сгетеа ИНА 292т, A madura BKM Ас-809т, Actinomadura viridis BKM Ас-1315т и Ac-631) показал существенные различия в деталях строения полимеров. Таким образом, структура ТК может быть маркером для этих видов.

Род Brevibacíerium. Большое хемотаксономическое значение придавалось тейхоевым кислотам с момента их обнаружения в клеточных стенках бревибактерий [Fiedler et al., 1981]. Однако манниттейхоевые кислоты, найденные у некоторых штаммов В linens, в этой связи не рассматривались, так как наличие их у разных представителей данного вида варьировало.

Этот факт наряду с различиями по белковым спектрам, ДНК-ДНК-сходству и др. мог свидетельствовать о гетерогенности вида.

Генетическая и фенотипическая гетерогенность вида В. linens также неоднократно отмечалась в литературе [Fiedler et al., 1981; Kampfer, 1994; Brennan et al., 2002]. Более того, ранее было показано, что вид содержит минимум два

геномовида [Steigerwalt et al., 1975], однако реклассификация штаммов геномовидов до сих пор не проводилась.

В плане таксономического изучения нами было проведено исследование большой группы оранжевоокрашенных штаммов, традиционно причисляемых к В linens, результатом которого явилось выделение и описание трех новых видов: В. permense ВКМ Ас-2280т, В antiquum ВКМ Ас-2118т и В aurantiacum ВКМ Ас-2111т. Различия в составе Сахаров и полиолов ТК явились одним из основных признаков для дифференциации этих видов на фенотипическом уровне.

При сравнительном анализе данных по структурам ТК новых видов (табл. 4) было очевидно, что структуры и набор анионных полимеров в клеточной стенке каждого организма - уникальны. Это обстоятельство хорошо согласовывалось с их выделением в отдельные, самостоятельные виды. Характерным также оказался набор ТК в клеточной стенке В. iodinum.

Два штамма В linens Ас-2119 и Gk-З и типовой штамм В linens ВКМ Ас-2112т (в таблице не представлен) входили в один геномовид по ДНК-ДНК-сходству, но отличались по структуре ТК (на основании структуры гликозидов ТК типового штамма [Fiedler et al., 1981]) и некоторым фенотипическим признакам [Гавриш и др., 2003]. Согласно современной концепции вида [Wayne et al., 1987] такие организмы могут относиться к разным подвидам. Существенные отличия штамма В linens ВКМ Ас-2159 от вышеупомянутых штаммов вида, связанные с идентификацией сахарфосфатных полимеров, могут указывать на то, что этот штамм, скорее всего, относится к другому виду рода Brevibacterium. Уточнение видовой принадлежности штамма ВКМ Ас-2159 - предмет дальнейших таксономических исследований.

Видоспецифичность ТК и их комбинации в клеточных стенках бревибактерий отражена в таблице 4.

Таким образом, высказанное ранее предположение о возможном использовании наличия ТК и их гетерогенного состава в качестве таксономического признака бревибактерий получило подтверждение при исследовании химических структур ТК и их комбинаций в клеточных стенках представителей пяти видов рода Brevibacterium. Структуры манниттейхоевых кислот В permense ВКМ Ас-2280т,

Таблица 4. Состав и основные структурные компоненты тейхоевых кислот и других полимеров клеточных стенок изученных видов рода ВгеугЬаМегшт

Структурный Характеристика полимера и его структурных компонентов (состав основной цепи / заместитель) н &э о <и оо a <ч § к о |< 05 Ьй ш is ^ cs ■5 (n а < 52 а « 1® § 22 cq ™ н чо S 2 g (n ">1 ш rn о й — о «V £2 - и 05 СО оч *п (s и < g s; »с? t- е " с о 1« о «

i-M 1,6-поли(маннитфосфат)/ а-Ь-рамноза / пируват *

1-М 1,6-поли(маннитфосфат)/ монофосфаты *

1-М 1,6-поли(маннитфосфат)/ р-глюкоза / пируват *

П-Г поли(галактозил-( 1 —»1 )-глицерофосфат) /а-глюкозамин/пируват *

1-Г 1,3-поли(глицерофосфат)/ а-галактозамин / пируват *

СФП -4)-Р-0-01срЫАс-( 1 ->6)-а-В-Ок/?ЫАс-(1 -/"-/сукцинат *

СФП -4НР-0-01срЫАс-(1->3)]-аТ)-01ср-( 1 -Р- *

ТУК -3 )-Р-0-Са1/20Ас-( 1 -^3)-(3-0-С1срА-( 1 -> *

П-Г поли(галактозил-(1—>2)-глицерофосфат) *

1-Г 1,3-поли(глицерофосфат)/ а-галактозамин/глутамат *

1-Г 1,3-поли(глицерофосфат) * * * * * *

СФП - сахар-1-фосфатные полимеры, ТУК - тейхуроновые кислоты.

В antiquum ВКМ Ас-2118т и В iodinum ВКМ Ас-2206т также можно рассматривать в качестве маркеров этих видов.

Род Glycomyces. Три вида, составляющих род Glycomyces - G harbinensis ВКМ Ас-1247т, G rutgersensis ВКМ Ас-1248т и G tenuis ВКМ Ас-1250т (в работе представлена только структура ТК Glycomyces tenuis), содержали в клеточной стенке различающиеся по структуре и композиции тейхоевые кислоты [Тульская и др., 1993; Потехина и др., 1998].Следовательно, структуры ТК являются видоспецифическими маркерами в роде Glycomyces.

Таким образом, сравнительный анализ структур ТК у представителей нескольких групп актиномицетов (с учетом известных литературных данных),

позволяет нам констатировать, что структуры ТК могут служить химическими маркерами видов родов АсИпотаЫига, Иопотигае Вгем&аМегшт и С1усотусе$.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из клеточных стенок представителей нескольких родов актиномицетов выделены тейхоевые кислоты и установлены их структуры, большая часть которых описана впервые. Клеточные стенки некоторых организмов одновременно содержат несколько ТК или других анионных полимеров. Несмотря на то, что все изученные ТК построены по единому плану, наблюдалось поразительное разнообразие их структур. Однако это разнообразие не хаотично, а подчиняется определенным закономерностям, что позволило отнести эти структуры к нескольким типам и подтипам, некоторые из которых предложены нами.

Штаммы одного вида содержат идентичные, в то время как виды внутри рода -различные по структуре ТК, что, вероятно, отражает особенности метаболизма каждого вида.

Результаты, полученные на достаточно большом материале, позволяют констатировать видовую специфичность ТК актиномицетов и предложить использовать их в качестве важного видового таксономического признака.

Информация о структуре тейхоевых кислот расширяет рамки возможностей изучения метаболических процессов, связанных с биосинтезом тейхоевых кислот, физиологической роли структурных элементов этих полимеров, причин и роли гетерогенности ТК в жизнедеятельности бактериальной клетки и многое другое. Возможность использования ТК в качестве видоспецифических маркеров для некоторых родов п. Асипотусе1а1ез уже продемонстрирована в настоящей работе.

ВЫВОДЫ

1 У представителей родов АсНпотас1ига, Иопотигеае и ВгеуАаМегшт, С1усотусеи, БкерЮтусез и NосагсИорзгв (всего 53 организма) обнаружены тейхоевые кислоты и исследован их состав. Полимеры проявляют большое структурное

разнообразие и относятся к трем основным структурным типам -поли(полиолфосфатам) (I тип, 4 подтипа), поли(гликозилполиолфосфатам) (II тип, 3 подтипа) и ТК смешанной структуры (IV тип, 1 подтип). Два подтипа ТК выделены на основании данной работы.

2. Установлены 11 новых структур тейхоевых кислот, в том числе уникальная тейхоевая кислота, содержащая в качестве полиола эритрит. Впервые обнаружены ТК, несущие остатки а-галактозамина, 3-О-мети л галактозы (мадурозы), 3-0-метилрамнозы, глутаминовой и ортофосфорной кислот.

3. Клеточные стенки представителей рода Actinomadura содержат ТК поли(рибит-), поли(глицерин-) и поли(гликозилглицерофосфатной) природы. Последние широко распространены в клеточных стенках представителей рода. Полностью установлены структуры ТК трех видов актиномадур. Полимеры принадлежат к поли(гликозилглицерофосфатам) и имеют общие детали строения -галактопиранозу в интегральной цепи и Р-конфигурацию всех гликозидных связей. Отличия в структуре связаны с локализацией фосфодиэфирных и гликозидных связей, а также наличием и природой боковых остатков в интегральной цепи.

4. Клеточные стенки всех представителей рода Nonomuraea содержат глицеринтейхоевые кислоты. Полностью установлены структуры ТК двух видов нономурий. Полимеры принадлежат к 1,3-поли(глицерофосфатам) и отличаются комбинацией гликозильных заместителей.

5. Клеточные стенки всех представителей рода Brevibacterium содержат гетерогенный состав ТК. Обязательным полимером каждого вида является 1,3-поли(глицерофосфат). Обнаружены ТК поли(маннитфосфатной) природы, а также сахар-1 -фосфатные полимеры и тейхуроновая кислота.

Полностью установлены химические структуры анионных полимеров клеточных стенок пяти видов бревибактерий. Полимеры имеют ярко выраженные анионные свойства за счет наличия остатков ортофосфорной, пировиноградной, янтарной и глутаминовой кислот.

6. Описаны три новых вида рода Brevibacterium'. В permense ВКМ Ас-2280т, В antiquum ВКМ Ас-2118т и В aurantiacum ВКМ Ас-2111т, выделенные из В linens на

основании филогенетических, фенетических и хемотаксономических данных, включая данные по составу ТК.

7. Изучение распространения и особенностей строения ТК представителей родов Actinomadura, Nonomuraea, Brevibacterium и Glycomyces показало:

- признак "наличие ТК" является характерным для исследованных родов;

- структура и набор стеночных анионных полимеров клеточных стенок, могут служить химическими маркерами видов;

- на примере Brevibacterium показано, что структурные компоненты ТК (сахара и полиолы и их сочетание) могут служить для дифференциации и идентификации видов рода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потехина Н.В., Наумова И.Б., Терехова Л.П., Преображенская Т.П.

Тейхоевые кислоты актиномадур // Всесоюзн. конф. «Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов». Ленинград. 1984. с. 40.

2. INaumova I.B., Potekhina N.V., Terekhova L.P., Preobrazhenskaya T.P., Duigimbaye К. Cell wall polyol phosphate polymers of bacteria belonging to the genus Actinomadura In: Biological, Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes, (Szabo et al., eds.), Part B. Academic Press. 1985. c. 561 -566.

3. Потехина H.B., Терехова Л.П., Преображенская Т.П., Наумова И.Б. Распространение тейхоевых кислот в представителях рода Actinomadura II Микробиология 1985. Т. 54. № 4. с. 545-548.

4. Наумова И.Б., Дигимбай К., Потехина Н.В., Шашков А.С.,Терехова Л.П., Преображенская Т.П. Тейхоевая кислота клеточной стенки Actinomadura carminata - продуцента антибиотика карминомицина // Биоорган, химия 1986. Т. 12. с. 670-678.

5. Naumova I.B., Duigimbaye С., Shashkov A.S., Terekhova L.P., Preobrazhenskaya T.P Cell wall polymers of Actinomadura carminata ИНА 4281 // Arch. Microbiol. 1986. V. 146. p. 256-262.

6. Потехина Н.В., Наумова И.Б, Шашков A.C., Терехова Л.П. Особенности строения клеточной стенки Actinomadura caminata - продуцента карминомицина. 8 Всесоюзн. конф. // «Химия и биохимия углеводов». Тбилиси. 1987. с. 168-169.

7. Потехина Н.В., Наумова И.Б., Шашков A.C., Терехова Л.П. Полимеры клеточной стенки Actinomadura cremea INA 292II Микробиология 1989a. Т. 58. № 3. с. 452-456.

8. Потехина Н.В., Наумова И.Б., Шашков A.C., Терехова Л.П.

Поли(галактозилглицерофосфат) с боковыми глицерофосфатными единицами в клеточной стенке Actinomadura cremea ИНА 292 // Биоорган, химия 19896. Т. 15. №3. с. 399-404.

9. Потехина Н.В., Наумова И.Б., Шашков A.C., Терехова Л.П. Тейхоевая кислота клеточной стенки Actinomadura cremea ИНА 292 // Всесоюзн. конф. "Регуляция микробного метаболизма". Пущино. 1989. с. 17.

10. Потехина Н.В., Шашков A.C., Кузнецов В.Д., Наумова И.Б. З-О-метилрамноза в составе тейхоевой кислоты клеточной стенки Streptomyces roseolus // Биохимия 1992. Т. 57. с. 1206-1214.

11. Potekhina N.V., Naumova I.B., Shashkov A.S. and Terekhova L.P. Structural features of cell wall teichoic acid and peptidoglycan of Actinomadura cremea INA 292 //Eur. J. Biochem. 1991. V. 199. c. 313-316.

12. Тульская E.M., Потехина H.B., Наумова И.Б., Шашков A.C., Евтушенко Л.И. Сравнительное изучение тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов Glycomyces rutgersensis и Glycomyces harbinensis II Микробиология 1993. Т. 62. № 5. с. 932-937.

13. Potekhina N.V., Tul'skaya Е.М., Naumova LB., Shashkov A.S., Evtushenko L.I. Erythritolteichoic acid in cell wall of Glycomyces tenuis VKM Ac-1250 II Eur. J. Biochem. 1993. V. 218. p. 371-375.

14. Потехина H.B., Шашков A.C. Терехова Л.П Наумова И.Б. Поли(галактозил-1-»2-глицерофосфат) и поли(3-0-метилгалактозил-1->2-глицерофосфат) в клеточной стенке Actinomadura madura II Конф. «Биосинтез и деградация

микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты». Пущино. 1995. с. 42.

15. Потехина Н.В., Шашков А.С., Наумова И.Б. Поли(галактозил-1-2-глицерофосфат) и поли(3-0-метилгалактозил-1-2-глицерофосфат) в клеточной стенке Actinomachira madura П Микробиология 1996. Т. 65. с. 522-526.

16. Шашков А.С., Стрешинская Г.М., Козлова Ю.И., Потехина Н.В., Таран В.В., Евтушенко Л.И., Наумова И.Б. Структура тейхоевой кислоты клеточной стенки Nocardiopsis alborubida // Биохимия 1997. Т. 62. № 10.

с. 1327-1331.

17. Шашков А.С., Стрешинская Г.М., Тульская, Козлова Ю.И., Евтушенко Л.И., Наумова И.Б. Новые типы структур тейхоевых кислот актиномицетов. Хемотаксономические перспективы // 2-ой Съезд биохимического общества РАН. Пущино. 1997, ч. 2. VII. 44. с. 340.

18. Потехина Н.В., Тульская Е.М., Шашков А.С., Таран В.В., Евтушенко Л.И., Наумова И.Б. Таксономическая специфичность тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицтов рода Glycomyces II Микробиология 1998. Т. 67. № 3. с. 399403.

19. Naumova I.B., Shashkov A.S., Tul'skaya Е.М., Streshinskaya G.M., Kozlova Yu.I., Potekhina N.V., Evtushenko L.I., Widmalm G., Stackebrandt E. Cell wall teichoic acids are chemical markers of some actinomycete taxa. In: Microbial and cellular systema for pharmocology, biotechnology, medicine and environment. INTAS Symposium, Moscow. Dialogue-MSU, 1999. p. 34-36.

20. Shashkov A.S, Potekhina N.V., Naumova I.B., Evtushenko L.I., Widmalm G. Cell wall teichoic acids of Actinomadura viridis VKM Ac-1315T // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. №3. p. 688-695.

21. Potekhina N.V., Naumova I.B., Shashkov A.S., Evtushenko L.I, Widmalm G., (2000). Novel structures of teichoic acid in actinomycetes of the genus Actinomadura. In: Int. Symp. "Modern Problems of Microbial Biochemistry and Biotechnology". Puschino. 2000. p. 73.

22. Naumova I.B., Shashkov A.S., Tul'skaya E.V., Streshinskaya G.M., Kozlova Y.I., Potekhina N.V., Evtushenko L.I., Stackebrandt E. // Cell wall teichoic acid:

structural diversity, species specifity in the genus Nocardiopsis, and chemotaxonomic perspective. FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. № 3. p. 269-284.

23. Gavrish E.Yu., Krausova V.I., Plotnikova E.G., Potekhina N.V., Evtushenko L.I. Three new species among Brevibacterium linens-like stains. The world of microbes // Paris, 27th of July to 1я August 2002. Le Palais des Congres de Paris. Xlh International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, p. 297.

24. Potekhina N. V., Shashkov A. S., Evtushenko L. I., Gavrish E. Y., Senchenkova S. N., Usov A. I., Naumova I. В., Stackebrandt E. A novel mannitol teichoic acid with side phosphate group of Brevibacterium sp VKM Ac-2118 // Eur. J. Biochem. 2003a. V. 270. p. 4420-4425.

25. Potekhina N.V., Shashkov A.S., Evtushenko L.I., Senchenkova S.N., and Naumova I.B. The mannitol teichoic acid from the cell wall of Brevibacterium permense BKM Ac-2280 // Carbohydr. Res. 20036. V. 338. p. 2745-2749.

26. Potekhina N.V., Shashkov A S., Evtushenko L. I., Naumova I. B. Two novel cell wall teichoic acids in two novel of Brevibacterium species // 1st FEMS Congress of European Microbiologists. Slovenia, Ljubljana, June 29 - July 3. 2003c, p. 10 - 66, 346.

27. Потехина H.B., Шашков A.C., Евтушенко Л.И., Наумова И.Б. Тейхоевые кислоты клеточных стенок Microbispora mesophila Ас-1953т и Thermobifida fusca Ас-1952т // Микробиология 2003. Т. 72. № 2. с. 189-193.

28. Naumova I.B., Shashkov A.S., Kozlova Yu.I., Potekhina N.V., Streshinskaya G.M., Tul'skaya T.M., Evtushenko L.I.. Novel structures of actinomycetes cell wall polymers. II Moscow International Congress of Biotechnology: state of the art and prospects of development. Moscow, Russia, 10 - 14 ofNovember. 2003. Part I. p. 24.

29. Гавриш Е.Ю., Краузова В.И., Потехина H.B., Карасев С.Г., Плотникова Е.Г., Коростелева Л.А., Евтушенко Л.И. Три новых вида Brevibacterium: Brevibacterium permense sp. nov., Brevibacterium antiquum sp. nov. и Brevibacterium aurantiacum sp. nov. // Микробиология 2004. Т. 73. № 3.

с. 211-217.

30. Потехина Н.В., Шашков A.C., Евтушенко Л.И., Гавриш Е.Ю. Тейхоевые кислоты и другие анионные полимеры клеточных стенок бревибактерий // «Химия и биохимия углеводов». Материалы III Всероссийской школы-конференции. Саратов, 9-11 сентября, 2004. с. 53.

31. Потехина Н.В., Тульская Е.М., Козлова Ю.И., Стрешинская Г.М., Шашков A.C., Евтушенко Л.И. Новые структуры анионных полимеров клеточных стенок актиномицетов «Биотехнология микробов» // Всероссийский симпозиум, посвященный 120-летию со дня рождения академика В.Н. Шапошникова. Москва, 20-23 октября. 2004. с. 74.

32. Шашков A.C., Потехина Н.В., Евтушенко Л.И., Наумова И.Б. Тейхоевые кислоты двух штаммов бревибактерий //Биохимия 2004. Т. 69. № 3. с. 609-616.

33. Потехина Н.В., Евтушенко Л.И., Сенченкова С.Н., Шашков A.C., Наумова И.Б. Структуры тейхоевые кислоты клеточной стенки Brevibacterium iodinum ВКМ Ас-2106т//Биохимия 2004. Т. 69. с. 1659-1666.

34. Потехина Н.В., Шашков A.C., Стрешинская Г.М., Сенченкова С.Н., Евтушенко Л.И. Анионные полимеры клеточной стенки Brevibacterium linens ВКМ Ас-2159 // Биохимия 2005. Т. 70. в печати.

g3 s в

РНБ Русский фонд

2006-4 7302

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Потехина, Наталья Викторовна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы. Тейхоевые кислоты и другие анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий.

Глава 1. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий.

1.1. Тейхоевые кислоты клеточных стенок.

1.1.1. Тейхоевые кислоты I ипа.

1.1.2. Тейхоевые кислоты II типа.

1.1.3. Тейхоевые кислоты III типа.

1.1.4. Тейхоевые кислоты IV типа.

1.1.5. ТК актиномицето в.

1.1.6. Область связи ТК и пептидогликана.

1.2. Липотейхоевые кислоты.

1.2.1. ЛТК I типа.

1.2.2. ЛТК II типа.

1.2.3. Способность ЛТК образовывать в растворе мицеллы.

1.2.4. Локализация ЛТК.

Глава 2. Биосинтез тейхоевых кислот.

Глава 3. Локализация тейхоевых кислот.

Глава 4. Другие анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий.

4.1. Тейхуроновые кислоты.

4.2. Сахар-1-фосфатные полимеры.

4.3. Анионные полисахариды.

Глава 5. Свойства и функции тейхоевых кислот.

5.1. Участие ТК в катионном обмене.•.

5.2. Участие ТК в регуляции активтости автолитических ферментов.

5.2.1. Регуляция активности L-амидазы у пневмококков.

5.2.2. Регуляция активности автолизинов у Bacillus subtils.

5.3. Участие ТК в создании и регуляции плотности отрицательного заряда клеточной поверхности.

5.3.1. Поверхностный заряд микроорганизмов.

5.3.2. Роль отрицательного заряда в функциях тейхоевых кислот.

5.3.3. D-аланин - регулятор общего заряда клеточной поверхности.

5.4. Роль тейхоевых кислот в адгезии и вирулентности бактерий.

5.4.1. Связывание положительно заряженных пептидов.

5.4.2. Образование биопленок.

5.5. Иммунологические свойства ТК и ЛТК.

5.6. Рецепция фагов.

Глава 6. Тейхоевые кислоты как хемотаксономический признак в порядке Actinomycetales

6.1. Использование признака "наличие-отсутствие" тейхоевых кислот для дифференциации таксонов высших орядков.

6.2. Использование химической структуры и некоторых структурных элементов тейхоевых кислот для дифференциации актиномицетов на уровне вида.

6.2.1. Тейхоевые кислоты как маркер рода Nocardiopsis.

6.2.2. Тейхоевые кислоты в систематике рода Nocardioides.

6.2.3. Тейхоевые кислоты в систематике рода Streptomyces.

6.3. Гетерогенность рода Actinomadura. Необходимость поиска новых систематических подходов.

6.4. Род Brevibacterium. Первые попытки использования ТК в качестве хемотаксономических признаков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. Материалы и методы

Глава 1. Материалы.

Глава 2. Методы исследования.

2.1. Общие методы. Хроматография и электорофорез на бумаге.

2.2. Аналитические методы.

2.3. Получение клеточной стенки.

2.4. Экстракция тейхоевых кислот.

2.5. Очистка тейхоевых кислот:.

2.5.1. Ионообменная хроматография.

2.5.2 Электрофорез на бумаге.

2.5.3. Дробное осаждение этанолом.

2.5.4. Разделение олигомеров и гликозидов.

2.6. Методы определение первичной структуры тейхоевых кислот.

2.6.1. Кислотный гидролиз.

2.6.2. Щелочной гидролиз.121.

2.6.3. Ферментативный гидролиз.

2.6.4. Определение О-ацильных групп.

2.6.4.1. Аммонолиз тейхоевых кислот.

2.6.4.2. Гидроксиламинолиз тейхоевых кислот.

2.6.5. Определение соотношения Р-пс и Рфмэ в тейхоевых кислотах.

2.6.6. Определение молекулярной массы.

2.6.7. Определение абсолютной конфигурации рамнозы.

2.6.8. Определение абсолютной конфигурации маннита.

2.6.9. Масспектроскопия MALDI-TOF.

2.6.10. Масспектроскопия с бомбардированием тяжелыми атомами.

2.6.11. ЯМР спектроскопия.

Глава 3. Оценка выбора методов, использованных в работе.

3.1. Экстракция тейхоевых кислот.

3.2. Установление первичной структуры тейхоевой кислоты.

3.2.1. Механизмы кислотного, щелочного и ферментативного гидролизов.

3.2.2. Идентификация полиола.

3.2.3. Разделение и изучение фосфорных эфиров.

3.2.4. Исследование гликозидов.

3.2.5. ЯМР спектроскопия.

III. Результаты исследований

Глава 1. Тейхоевые кислоты представителей родов Actinomadura и Nonomuraea.

1.1. Распространение тейхоевых кислот у представитетелей рода Actinomadura и Nonomuraea.

1.1 Тейхоевые кислоты Actinomadura cremea ИНА 292т.

1.2. Тейхоевые кислоты Actinomadura madura ВКМ Ас-809т.

1.3. Тейхоевые кислоты Actinomadura viridis ВКМ Ас-1315Т и Ас-631.

1.4. Тейхоевые кислоты Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata

ИНА4281.

1.5. Тейхоевые кислоты Nonomuraea recticatena BKM Ac-940.

Глава 2. Тейхоевые кислоты и другие анионные полимеры представителей рода

Brevibacterium.

2.1. Выделение трех новых видов рода Brevibacterium: Brevibacterium permense sp. nov. Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov.

2.2. Распространение TK у представителей рода Brevibacterium.

2.3. Тейхоевые кислоты Brevibacterium iodinum BKM Ac-2106T.

2.4. Тейхоевые кислоты Brevibacterium permense BKM Ac-2280T.

2.5. Тейхоевые кислоты Brevibacterium antiquum BKM Ac-2118T и BKM Ac-2281.

2.6. Анионные полимеры Brevibacterium aurantiacum BKM Ac-2111T.

2.7. Тейхоевые кислоты Brevibacterium linens BKM Ac-2119 и Gk-3.

2.8. Анионные полимеры Brevibacterium linens BKM Ac-2159.

Глава 3. Тейхоевые кислоты актиномицетов родов Glycomyces, Streptomyces и Nocardiopsis.

3.1. Тейхоевые кислоты Glycomyces tenuis BKM Ас-1250т.

3.2. Тейхоевые кислоты Streptomyces roseolus ISP 5174.

3.3. Тейхоевые кислоты Nocardiopsis dassonvillei subs, albirubida

BKM Ас-1882т и Ac-1454.

IV. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тейхоевые кислоты актиномицетов"

Тейхоевые кислоты являются одними из основных полимеров клеточной стенки грам положительных бактерий. Значение их в жизнедеятельности клетки трудно переоценить. Ковалентно связанные с пептидогликаном, тейхоевые кислоты представляют неотъемлемую часть клеточной стенки и, таким образом, находятся в тесной связи со всеми процессами, происходящими при ее участии. Среди них - рост и деление, связывание и резервирование катионов, необходимых для функционирования мембранных ферментов, процессы межклеточного узнавания, рецепция фагов и патогенность.

Тейхоевые кислоты и другие анионные соединения, связанные с ПГ через толщу клеточной стенки, вносят значительный вклад в формирование структуры полиэлектролитного геля. Отталкивание сходных зарядов поддерживает ПГ в растянутом состоянии и способствует его пористости [Archibald et al., 1993].

Исследования тейхоевых кислот в последние десятилетия привели к открытию новых классов этих соединений - эритрит-, арабит- и 3-0-метилгалактит тейхоевых кислот, а также обнаружили различные вариации фосфодиэфирных связей в интегральной цепи, что позволило выделить четыре основных структурных типа тейхоевых кислот.

ТК в последние десятилетия являются объектами медицинских исследований. Исследование клеточных стенок патогенных микроорганизмов привело к пониманию таких важных явлений как адгезия, вирулентность, образование биопленок на имплантированных материалах [Rijnaarts et al., 1995; Hussain et al., 2001], а также природы некоторых аутоимунных заболеваний человека [Дерябин и Каральник, 1983]. Тейхоевые кислоты, наряду с другими компонентами клеточных стенок, ответственны за чувствительность клетки к ряду антибиотиков и иммуномодуляторные свойства бактерий [Wicken and Knox, 1975; Archibald, 1980; Glarketal., 2000].

Особое внимание во всем мире уделяется антигенным свойствам тейхоевых и липотейхоевых кислот, которые используют в серологической классификации стрептококков, лактобацилл, микрококков и стафилококков, а также для создания вакцин и средств, повышающих иммунитет человека.

Исследование анионных полимеров клеточных стенок представляет интерес также с точки зрения таксономии микроорганизмов. Возможность использования с этой целью тейхоевых кислот обсуждается с момента их открытия [Davison and Baddiley, 1963], и уже в настоящее время признак "наличие - отсутствие" тейхоевых кислот входит в обязательные характеристики при описании некоторых грамположительных кокков. В порядке Actinomycetales признак "наличие ТК" дифференцирует таксоны высших порядков, таких как подпорядок и семейство [Евтушенко, 2003], в то время как структура ТК может служить химическим маркером для дифференциации актиномицетов на уровне вида [Naumova et al., 2001].

В связи со всем вышесказанным изучение распространения и структур тейхоевых кислот являются весьма актуальными, как в свете решения одной из главных проблем современной систематики микроорганизмов - выявления новых относительно стабильных таксономических маркеров родов и видов и уточнения границ ранее описанных таксонов, - так и для расширения представлений о биоразнообразии, физиологических и экологических функциях этих уникальных природных соединений.

Состояние проблемы. Проблеме изучения стеночных тейхоевых кислот около пятидесяти лет. ТК, открытые впервые в клеточных стенках лактобацил и стафилококков, представляли собой глицерин- и рибитфосфатные полимеры, несущие в качестве гликозильных заместителей глюкозу или аминосахар [Armstrong et al., 1958]. Почти в это же время ТК были обнаружены проф. Наумовой И.Б. и акад. Белозерским А.Н. [Наумова и др., 1962] в клеточных стенках актиномицетов. С тех пор эти полимеры успешно изучают на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ. За прошедшее время были исследованы около 250 штаммов, принадлежащих различным семействам и родам порядка Actinomycetales, в том числе и выделенным и описанным недавно. Изучение актиномицетов позволило открыть принципиально новые структуры, структурные типы и структурные элементы ТК.

Со временем представления о составе ТК расширялись: были открыты маннит- и арабитсодержащие полимеры, рибиттейхоевые кислоты с 3,5 типом фосфодиэфирной связи и тейхоевые кислоты, содержащие в интегральной цепи углеводный компонент. Во многом эти достижения стали возможными, благодаря применению новых методов изучения углеродсодержащих биополимеров: с конца 1970-х годов структуры ТК начали исследовать методами ЯМР-спектроскопии [De Boer et al., 1976, 1978; Shashkov et al., 1979].

Анализ экспериментальных данных по структурам тейхоевых кислот, описанных в литературе, позволил выделить 4 структурных типа этих полимеров на основании природы фосфодиэфирных связей в интегральной цепи: поли(полиолфосфаты) (I тип), поли(гликозилполиолфосфаты) (II тип) и полимеры смешанной структуры (III и IV типы) [Наумова и Шашков, 1997]. В зависимости от природы полиола и положения фосфодиэфирной связи, объединяющей элементы интегральной цепи, выделяют подтипы тейхоевых кислот [Naumova et al., 2001].

В задачи исследования входило:

- изучение распространения ТК клеточных стенок представителей родов Actinomadura (24 штамма), Nonomuraeа (12 штаммов), Brevibacterium (12 штаммов) и некоторых других организмов (4 штамма, 3 вида);

- анализ возможностей использования данных по структуре тейхоевых кислот в целях классификации и идентификации представителей родов Actinomadura, Nonomuraea. и Brevibacterium.

Диссертационная работа построена по следующему плану. Обзор литературы состоит из 6 глав и охватывает работы, опубликованные в мировой литературе, до 2005 г. включительно. Он содержит главы по структурам ТК и других анионных полимеров клеточной стенки грамположительных бактерий, а также биосинтезу, функциям, локализации, иммунологическим свойствам ТК и их роли в процессах адгезии, фаговой рецепции и вирулентности. Структурам липотейхоевых кислот цитоплазмотической мембраны посвящена отдельная глава, а некоторые их свойства и функции обсуждаются совместно с таковыми тейхоевых кислот клеточной стенки.

Особое внимание уделено работам, связанным с изучением структур анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий: тейхоевым и тейхуроновым" кислотам, сахар-1-фосфатным полимерам, кислым полисахаридам. В соответствующих

главах описаны практически все известные полимеры, структуры которых были полностью установлены.

Структуры ТК рассматриваются согласно их подразделению на четыре структурных типа, каждый из которых охватывает все известные вариации, касающиеся природы ацильных групп и а- и Р-связанных гликозильных заместителей. Таблица 1 [Naumova et al., 2001] дополнена данными последних лет.

В разделе "Методы исследования и их обсуждение" представлены ключевые методы исследований и приведены обоснования и порядок их применения: получение клеточной стенки, экстракция и очистка ТК, исследование первичной структуры ТК. Объяснены механизмы кислотного и щелочного гидролизов 1,3-поли(глицерофосфата), пути образования фосфорных эфиров, являющиеся общими для ТК и других типов.

Раздел "Результаты исследований" включает три главы: установление структур ТК представителей родов Actinomadura и Nonomuraea, - ТК представителей p. Brevibacterium и - ТК некоторых других актиномицетов, имеющих уникальные структуры.

В разделе "Обсуждение результатов" обсуждаются особенности ТК актиномицетов: присутствие нескольких различных по структуре ТК в одной клеточной стенке (гетерогенный состав ТК), физиологическая значимость ацильных и гликозильных остатков, структурное разнообразие тейхоевых кислот и его биологический смысл. Приводятся обоснования возможного применения ТК в качестве видоспецифического маркера в родах Actinomadura, Nonomuraea, Brevibacterium и Glycomyces.

Заканчивается изложение семью выводами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Потехина, Наталья Викторовна

выводы

1. У представителей родов Actinomadura, Nonomureae и Brevibacterium, Glycomyces, Streptomyces и Nocardiopsis (всего 53 организма) обнаружены тейхоевые кислоты и исследован их состав. Полимеры проявляют большое структурное разнообразие и относятся к трем основным структурным типам - поли(полиолфосфатам) (I тип, 4 подтипа), поли(гликозилполиолфосфатам) (II тип, 3 подтипа) и ТК смешанной структуры (IV тип, 1 подтип). Два подтипа ТК выделены на основании данной работы.

2. Установлены И новых структур тейхоевых кислот, в том числе уникальная тейхоевая кислота, содержащая в качестве полиола эритрит. Впервые обнаружены ТК, несущие остатки а-галактозамина, 3-0-метилгалактозы (мадурозы), З-Ометилрамнозы, глутаминовой и ортофосфорной кислот.

3. Клеточные стенки представителей рода Actinomadura содержат ТК поли(рибит-), поли(глицерин-) и поли(гликозилглицерофосфатной) природы. Последние широко распространены в клеточных стенках представителей рода. Полностью установлены структуры ТК трех видов актиномадур. Полимеры принадлежат к поли(гликозилглицерофосфатам) и имеют общие детали строения - галактопиранозу в интегральной цепи и Р-конфигурацию всех гликозидных связей. Отличия в структуре связаны с локализацией фосфодиэфирных и гликозидных связей, а также наличием и природой боковых остатков в интегральной цепи.

5. Клеточные стенки всех представителей рода Brevibacterium содержат гетерогенный состав ТК. Обязательным полимером каждого вида является 1,3-поли(глицерофосфат). Обнаружены ТК поли(маннитфосфатной) природы, а также сахар-1-фосфатные полимеры и тейхуроновая кислота.

6. Описаны три новых вида рода Brevibacterium: В. permense BKM Ас-2280т, В. antiquum BKM Ac-2118т и В. aurantiacum BKM Ac-2111т, выделенные из В. linens на основании филогенетических, фенетических и хемотаксономических данных, включая данные по составу ТК.

- признак "наличие ТК" является характерным для исследованных родов;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Информация о структуре тейхоевых кислот расширяет рамки возможностей изучения метаболических процессов, связанных с биосинтезом тейхоевых кислот, физиологической роли структурных элементов этих полимеров, причин и роли гетерогенности ТК в жизнедеятельности бактериальной клетки и многое другое. Возможность использования ТК в качестве видоспецифических маркеров для некоторых родов порядке Actinomycetales уже продемонстрирована в настоящей работе.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Потехина, Наталья Викторовна, Москва

1. Лгрс Н.С., Ефимова Т.П., Грузева JI.H. О гетерогенности рода Actinomadura Lech. Л. Lech. // Микробиология 1975. Т. 44. В. 2. с. 253-257.

2. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова

3. Т.С. Определитнль актиномицетов. Роды Streptomyces, Slreptoverlicillum, Chainia. М.: Наука, 1983. с.8.

4. Гладышев Б.Н. Определение амииосахаров в гидролизатах животных, растительных и бактериальных объектов // Биохимия 1959. Т. 24. с.789-793.

5. Гнилозуб В.А. Тейхоевые и лнпотсйхосвые кислоты актиномицетов // дис. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Москва, 1994.

6. Гнилозуб В.А., Стрешинская Г.М., Евтушенко Л.И., Шашков А.С., Наумова И.Б. Липотейхоевые кислоты видов рода Agromyces II Микробиология 1994а. Т. 63. № 3. с. 495-502.

7. Гнилозуб В.А., Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Евтушенко Л.И., Шашков А.С.1,5-Поли(рибитфосфат) с тстрасахаридными заместителями в клеточной стенке Agromyces fucosus ssp. luppuratus II Биохимия 19946. Т. 59. № 12. с. 1892-1899.

8. Деревицкая В.А., Шашков А.С., Новиков О.С., Евстигнеев А.И. Синтез моно- и диметиловых эфиров метил-2-ацетамидо-2-дезокси-0-галактопирапозндов и их спектры 13С-ЯМР // Биооран. химия 1981. Т. 7. №3. с. 410-421.

9. Дерябин П.Н. и Каралышк В.В. Биологические свойства и использование тейхоевых кислот микроорганизмов // ЖМЭИ 1983. Т. 9. с. 26-29.

10. Дмитриева Н.Ф., Вылегжанина Е.С., Грабовская К.Б., Битко С.А., Наумова И.Б. Некоторые химические и биологические свойства ЛТК стрептококка группы А // Вестник АМН СССР 1986. № 7. с. 30-34

11. Дмитриева Н.Ф., Наумова И.Б., Стрешинская Г.М., Ланина Л.И. О клеточной стенке Actinomyces rimosus II Биоорган, химия 1976. Т. 2. № 6. с. 815-821.

12. Евтушенко Л.И. Актинобактерии: развитие систематики уа примере семейств порядка Actinomycetales//дис. на соиск. уч. степ. док. биол. наук. Пущино, 2003.

13. Евтушенко Л.И., Янушкене Н.А., Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Агре Н.С.

14. Распространение тейхоевых кислот в представителях порядка Actinomycetales // ДАН СССР 1984. Т. 278. с.237-240.17,18

Информация о работе

Потехина, Наталья Викторовна
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Тейхоевые кислоты актиномицетов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы