Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термостабильные антигены грибов рода Candida, используемых в биотехнологических производствах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термостабильные антигены грибов рода Candida, используемых в биотехнологических производствах"

р 11 9 ^

"5:7* ^ Московская медицинская академия

им. И.М.Сеченова

На правах рукописи У Д ¡С'579.341,4.083.334

ПАРФЕНОВА ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ ГРИБОВ ГОДАСАЮЮД ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ

□3.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Мосхва - 1992

Работа выполнена в Московской медицинской ■ академии им. И.М. Сеченова.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Далин М.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук, профессор Станиславский Е.С.

доктор медицинских наук Погорельская O.A.

Ведущая организация - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи РАМН, Москва

Зашита состоится "1992 г. в часов на

заседании специализированного совета Д.074.05.10 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: II988I, Москва, ул. Б.Пироговская, 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке MockobckoI медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: Зубовская пл., д.]

Автореферат разослан " Jf " WJ^/bcZ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А.Ю.Миронов

sw*. «лгл* £—. ,,

ПК-г : ни ЛИ "

здбяжпека общая?Ър1кх$Ристши. работы

Актуальность проблемы. Развитие микробиологических производств ставит вопрос о разработке надежных методов контроля за возможными выбросами биологических компонентов в рабочей зове и регионе, расположения предприятий, а также за иммунным статусом рабочих микробиологических предприятий. В настоящее время для. контроля за загрязнением воздушного бассейна используются микробиологические метода (просаснвание воздуха через импакторы и жидкие поглотители с последующим высевом проб на питательные среда), химические метода определения общего белка в воздухе рабочей и селитебных зон и иммунохи-мические метода, направленные на выявление специфических антигенов продуцентов, доминирующих в микробиологическом синтезе (системы РИГА на паприн, РИЗГА на гаприн). На заводах, где источниками углерода при биоконверсш служат гидролизаты растительного сырья (гид-ролизно-дрокхевые заводы), проблема доминирования одного штата решается не столь однозначно; обычно в этих условиях развиваются ассоциации дроккеподобшх грибов (ДПГ). В связи с этим возникает задача изучения антигенного состава прошшенно ценных штаммов различных видов ДПГ p.Candida с целью' выявления тарекрестно-реагирущиг (общих) тармостабильных антигенов. Особое внимание к термостабильным антигенам связано с тем, что в процессе производства предусмотрена термообработка биомассы микроорганизмов. В то ке время именно эти антигены предполагается использовать для конструирования эритроцитарных твст-систем и тест-систем на полимерных частицах латекса, предназначенных для контроля за возможной загрязненностью воздушного бассейна компонентами микробиологического синтеза при использовании в процессе ферментации ассоциаций нескольких видов ДПГ p.Candida.

Цель исследования - изучить состав поверхностных антигенов-промышенно ценных непатогенных ДПГ p. Candida различных видов с целью выявления перекрестно-реагирующих тврмостабильвых антигено! а также для подбора оптимальных компонентов при конструировании диагностических систем зколого-гигиеничвского контроля за деятель ностью предприятий микробиологического синтеза, использующих в ка честве продуцентов нэпатогеннне ДПГ p.Candida (в частности, при производстве биомасс кормового назначения), и тест-систем для оце: ки иммунного статуса рабочих микробиологических производств при проведении профилактических диспансерных обследований.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые де-. тально изучен состав поверхностных антигенов промышленно ценных штаммов разных видов ДПГ p.Candida, используемых для биоконварсии н-пара$ншов, гидролизатов возобновляемого растительного.сырья, сие тетического этанола и других непищевых продуктов при производстве биомасс кормового назначения, незаменимых аминокислот, витаминов и т.д.

На основе проведенных исследований выделены группы промышленных штаммов разных видов ДПГ p.Candida,, различающиеся по степени антигенного сходства.

Впервые показано, что высокомолекулярный компонент поверхностных антигенов, выделенных из биомассы живых клеток, обладающий достаточно высокой иммуногенностыо и сенситивной активностью и отсут-ствушций в комплексе антигенов, экстрагированных из готового продукта, серологически не идентичен антигенам средней молекулярной массы (70-50 кД). На основании этого наблюдения охарактеризованы фракции антигенов, наиболее пригодные в качестве сенситинов. Впервые показано, что для конструирования тест-систем, предназначенных

для выявления антигенов ДПГ, предпочтительнее использовать молеку-лярно-однородные компоненты.

Высокомолекулярные компоненты предложены для конструирования иммунохимических тест-систем (антигенных эритроцитарных и латексных диагностикумов), позволяющих контролировать уровень загрязнения клетками штамма-продуцента воздуха рабочей зони, а также оценивать иммунный статус рабочих микробиологических производств при проведении профилактических диспансерных обследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Яри исследовании состава поверхностных антигенов ДПГ G.tropicalis и C.maltosa, штаммов-продуцентов микробных биомасс кормового назначения, в сравнении с антигенными составляющими экстрактов готового продукта установлено, что основные антигенные детерминанты у препаратов поверхностных: антигенов- (ПИА) приходятся на компоненты с молекулярной массой 2СОО кД, тогда как у экстрактов готового продукта - на компоненты массой 67-50 кД. Установлена антигенная неидентичность компонентов молекулярной массы 2000 кД с компонентами средней молекулярной массы 67 кД.

2. При сравнительном анализе нативных и термостойких ППА выявлена антигенная разнородность содовых и тиоловых экстрактов, связанная с вероятным наличием у первых термолабильных участков, блокирующих или экранирующих антигенные детерминанты, ответственные за специфичность термостабильных компонентов.

3. На основе изучения перекрестно-реагирующих поверхностных антигенов у промышленно ценных штаммов ДПГ р.Candida разных видов выделены группы, различающиеся по степени антигенного сходства. К первой группе относятся С.tropicalis, C.maltosa и C.rugosa, обладающие перекрестно-реагирующими поверхностными антигенами, ко вто-

рой - С.уallda и C.scottl, не обладающие общими поверхностными антигенами с видами первой группы и проявляющие выраженную видоспеци-фичность. Показано, что термостабильные антигены несут на себе общие антигенные' детерминанты. Установлено, что перекрестно-реаги-рунцие компоненты присутствуют в каждой выделенной фракции независимо от ее молекулярной массы.

4. Термостабильные ППА 0.tropicalis и молекулярно-однородный его компонент массой 2000 кД могут быть использованы в качестве иммунохимичэских реагентов при конструировании эритроцитарных тест-систем и тест-систем на основе окрашенных полистирольных латексных частиц с активированными аминогруппами для контроля воздуха рабочей и санитарно-защитной зон, а также для оценки иммунного статуса рабочих заводов при проведении диспансеризаций и профэсмотров.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Всесоюзной научно-технической конференции "Охрана окружаыцей среда на предприятиях Ыинмедпрома СССР", Ташкент, 1990 гОтраслевом совещании по охране окружающей среды на предприятиях медицинской и микробиологической промышленности, Таллин, 1991 г., на биологической секции Ученого совета ВНИИ биосинтеза белковых веществ, Москва, 1991 г., на научно-практических конференциях лаборатории экологической иммунологии и аллергологии ММА им. И.М.Сеченова, Москва, 1991 г., 1992 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 печатник работ.

«ь.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 132 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и¿8 рисун-

ками. Список литературы содержит I55 названий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования. В работе исследовали штаммы С.tropicalla ВСБ 928, С.maltosa ВСБ 899, С.rugosa ВСБ 925, способные к биоконвэрсии н-парафинов при производстве паприна, С.valida ВСБ 825, используемый для биокснверсии этанола при производстве эприна, C.scotti КС-2, широко используемый при производстве гидролизных дрожжей (гиприна), а также Methylococcus capsulatus ВСБ 874 утилизирупций метан из природного газа. Все используемые штаммы получены из коллекции ВНИИсинтезбелок.

Для получения высокоактивных иммунных сывороток схемы иммунизации отрабатывали на беспородных мышах и кроликах (всего использо вано 2000 мышей и 50 кроликов). Была подобрана следующая схема: кроликов иммунизировали живой культурой ДПГ 2 раза в неделю возрас

с 7

тащими дозами от 5x10 до 5x10 клеток на животное в течение 21 дня, титры в РИГА составляли 1:1024-1:4096. Использовано по 7-8 кроликов на каждый штамм.

Выделение антигенно-активных компонентов проводили из натив-ной биомассы, выращенной в стерильных условиях в циклическом режим культивирования на установках Biolaíltte (Франция) и Фермус-1 (НЩбиоавтоматика, г. Нижний Новгород), а также из высушенной биомассы - паприна производства Свеглоярского завода. ППА получали бездеструиционными методами: экстракцией с использованием ß-меркаптоэтанола по методике, описанной в работе Ермолаева A.B. с соавт. (1987) и двум ее модификациям, экстракцией бикарбонатом нат рия и экстракцией с использованием тритона Х-100 по методике, реке мендованной к использованию на заводах. Всего проведено 12 опытов циклического культивирования по 5-7 циклов в каждом. Исследовано

67 серий ППА (по 4-6 препаратов на каждый штамм и на каждый способ выделения) и Э препаратов экстрактов из паприна.

Термостойкие дериваты получали кипячением ППА в течение 30 мин на водяной бане.

Общий белок в препаратах определяли методом Лоури, полисахарид - фенол-серным методом. При постановке реакций сравниваемые препараты уравнивались по содержанию в них белка.

Анализ фракционного состава проводили методом гельпроникащей хроматографии на колонках с гелями Sephacryl S-200 и Sephacryl S-500. Элюаты концентрировали ультрафильтрацией в ячейках Amicon через мембраны Diailo UM-2 и РМ-10. В концентратах фракций определяли содержание белка и полисахарида.

Сенсибилизирувдую активность препаратов оценивали в опытах определения оптимальной сенсибилизирующей дозы, используя таннизи-рованные формалинизированные эритроциты барана.

Антигенные свойства оценивали в реакции двойной диффузии (РДЦ) по Оухтерлони, методом иммуноэлекгрофореза по Грабарю в 1,2%-ном агаровом геле, содержащем 0,1% SDS, в стандартных условиях на бо-ратном буфере (рН=8,6, ионная сила 0,12), а также в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для РТПГА использовали антигенные даагностикумы как на основе комплексных ППА, выделенных из ДПГ разных видов p.Candida, так и на основе молекулярно-одно-родных фракций, а также гомологичные и гетерологичные антисыворотки.

При конструировании тест-систем на полимерных носителях использованы окрашенные синим антрахиноновым жирорастворимым красителем полистирольные латексы с активированными аминогруппами, размер частиц которых в среднем составлял 1,12 мкм с коэффициентом вариа-

ции 4,IS и коэффициентом дисперсии 1,003; концентрация аминогрупп составляла 2,5x1О4 моль/г. Латексы были получены в МИТХТ им.М.В.Ломоносова и любезно предоставлены Н.И.Прокоповым и З.Р.Черкасовым. Автор выражает им искреннюю благодарность.

Реакцию латекс-агглютинации ставили в двух вариантах - на стекле и в полистирольных микропланшетах для им&!унологических реакций.

Результаты экспериментов обрабатывали статистичеарг с использованием t-кригерия Сгыодента.

Анализ комплексных ППА. Известно, что среди антигенов ДПГ р.Candida ведущая роль в индукции кандидасенсибилизации принадлекиа именно поверхностным антигенам. Поэтому на первом этдре исследования были проанализированы разные схемы их выделения, причем в качестве источника этих антигенов использовали как нативную биомассу ДПГ, гак и высушенную биомассу готового продукта паприна. Для анализа различных схем выделения антигенно-активных компонентов из живой культуры-использовали биомассу С.tropicalis. В качестве исходной схемы выделения была использована методика бездеструкцион-ного получения поверхностных препаратов, описанная в работе Ермолаева A.B. с соавт.(1987), основанная на экстракции ППА с применение» двух реагентов - бикарбоната натрия и ß-меркаптоэтанола. Была предпринята попытка дифференцировать эти два воздействия, для чего наряду с отправной методикой и ее модификациями была использована экстракция только содовым компонентом.

Экстракта готового продукта паприна, полученные содовой экстракцией и экстракцией с ß-меркаптоэтанолом, не различались по рас-счетному выходу препарата из I г нативной биомассы, который составлял 3,43-3,47 мг по белку. Выход препарата при экстракции готового

продукта тритоном Х-100 по методике, используемой для экстракции антигенно-активных компонентов с фильтров Бри проведении медико-гигиенических исследований загрязненности воздуха, был в три раза больше и составил 9,16 мг белка из I г нативной биомассы. Выход ППА, экстрагированных из биомассы живых клеток, составил для экстрактов, полученных с использованием ß-меркаптоэтанола, 0,41-0,52 мг белка из I г нативной биомассы, а для содовых экстрактов - 0,080,09 мг белка из I г нативной биомассы. Коэффициент соотношения белкового и полисахаридного компонентов в экстрактах из готоеого продукта составлял 0,38-0,50, что приблизительно в два раза меньше по сравнению с таковым для ППА., выделенных из нативной биомассы; для них этот коэффициент был равен 0,72-1,21.

Анализ полученных препаратов гельпроникавдей зроматографией на колонке с гелем Sephacryl S-200 выявил у экстрактов из готового продукта, полученных содовой экстракцией и экстракцией с использованием тиолового реагента, наличие трех фракций с молекулярной массой 50 кД, 67 кД и более 250 кД. Гритоновые экстракты из паприна несколько отличались по хроматографическому составу от цредедуших экстрактов; у них значительное количество материала элщровалось в объемах, соответствующих 12 кД. Следует отметить незначительное количество высокомолекулярной фракции во всех экстрактах из готового продукта.

Анализ ППА, выделенных из нативной биомассы, тем же методом выявил наличие у них высокомолекулярного компонента массой более 250 кД, компонента массой 67 кД и по 2-3 компонента массой менее 12 кД.

- Сравнение препаратов, полученных из готового продукта и из живой культуры, выявило, что они резко отличаются по выходу из I г

нативной биомассы (у экстрактов из паприна последний был значитель но выше), по соотношению белкового и полисахаридного компонентов (сниженное количество белкового компонента в экстрактах из готового продукта), а также по практическому отсутствию высокомолекулярной фракции в экстрактах из паприна.

В процессе производства биомасс кормового назначения предусмотрена термообработка полупродукта. Исходя из предположения, что высокомолекулярные компоненты могут разрушаться при такой обработке, были получены термостойкие дериваты ППА, выделенных из нативно биомассы. Данные хроматографического анализа показали, что для тер мостойких ППА сохраняется такое же распределение по фракциям. Очевидно, что плазмолиз и распылительная сушка биомассы, предусмотрен ные технологией-получения кормового продукта, приводят к деструкци клеток и экстракты готового продукта помимо поверхностных антигено содержат также и цитошгазматичэские. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение ППА, выделенных из нативной биомас сы.

Анализ высокомолекулярных компонентов ППА на колонке с гелем Sephacryl S-500 выявил у всех исследуемых образцов наличие фракции массой 2000 кД и еще более крупные биополимеры, причем у содовых экстрактов, а также у термостойких их дериватов доля компонентов массой 2000 кД была значительно больше, чем у препаратов, выделенных экстракцией ß-меркаптоэтанолом.

Исследование препаратов из биомассы C.maltosa, полученных одним из способов экстракции с использованием тиолового реагента, выбранным в качестве референс, гельпроникакхцей хроматографией на колонках с гелями Sephacryl S-200 и Sephacryl S-500 показало, что они имеют такой же фракционный состав, как и ППА С.tropicalis соот-

- 12 -

ветствущвго способа получения.

Иммунохимичвская характеристика Ш1А. При иммунохимическом исследовании в РДЦ с антисывороткой к кнвой культуре гомологичного штамма нативные ППА формировали по 2-3 полосы преципитации. По минимальной преципитирущей активности в РДЦ все варианты ППА С.tropicalis не различались, и она составляла 0,03 мг/мл по белку, или 0,04-0,05 мг/мл по полисахариду. Минимальная преципитирунцая концентрация ППА C.maltosa составляла 0,04 мг/мл по белку, или 0,04 мг/мл по полисахариду. Термообработанные препараты практически не отличались от нативных по характеру формирования полос преципитации и минимальной преципитирущей активности.

Сравнительный анализ нативных и термостойких ППА методом им-муноэлектрофореза в агаровом геле также не выявил существенных различий между исследуемыми препаратами. Все они формировали , по крайней маре, три дуги преципитации, причем два компонента у всех ППА оставались на старте, тогда как третий был более подвижным.

При исследовании сенситивных свойств ППА оказалось, что все они могут быть использованы для иммобилизации на таннизированных формалинизированных эритроцитах барана с оптимальной сенсибилизирующей дозой 50 мкг белка на I мл 5%-ной суспензии эритроцитов.

Исследование нативных и термостойких антигенов G.tropicalis, полученных разными способами экстракции, в РТПГА в системе с диаг-ностикумом на основе гомологичного нативного препарата не выявило различий по тормозящей активности препаратов, которая составляла 0,17-0,40 мкг/мл по белку, шш 0,15-0,65 мкг/мл по полисахариду. Исследование этих же препаратов в РТПГА в гетерологичной системе с диагностикумом на ППА, выделенным экстракцией с ß-меркаптоэтанолом (способом, выбранным в качестве референс), выявило, что тормозящая

активность нативных ППА, полученных садовой экстракцией, составляет 1,41-2,12 мкг/мл по белку, или 1,41-5,31 мкг/мл по полисахариду, что на порядок ниже по сравнению с препаратами, извлеченными с помощью тиолового реагента; для них эта величина составляла 0,180,38 мкг/мл по белку, или 0,36-0,60 мкг/мл по ^полисахариду. Прогревание содовых ППА приводило к уменьшению тормозящей дозы на один порядок, что, вероятно, вызвано наличием у этих препаратов термолабильных участков, блокирующих или экранирующих антигенные детерминанты, ответственные за специфичность термостабильных компонентов.

При исследовании ППА 0.tropicalis в РГПГА в системах с разными видами промышленных штаммов ДПГ р.Candida (табл.Г) выяснилось, что эти препараты обладают приблизительно одинаковой тормозящей активностью-в-гомологичной-системе и в системах на-основе ППА C.maltosa" -и C.rugosa. Это свидетельствует о наличии перекрестно-рэагирувдих (общих) поверхностных антигенов у этих видов ДПГ. В системах на -основе ППА C.yallda и C.scotti реакция нейтрализации антител ППА С.tropicalis фактически не регистрировалась. Для термостойких ППА С.tropicalis сохраняется такое же распределение по перекрестно-реагирующей активности внутри обозначившихся грушг. Очевидно, именно эти антигены и ответственны за перекрестные реакции отдельных видов ДПГ.

Аналогичное распределение по группам перекрестного реагирования было показано для нативных и термостойких ППА C.maltosa.

Поскольку на одних и тех же предприятиях используются различные источники углерода и штаммы-продуценты других груш микроорганизмов, было исследовано наличие перекрестно-реагирующих антигенов у 0.tropicalis и Uethylocoocua capsulatum - штамма, используемого для производства микробных биомасс на природном газе. Исследование

Таблица I

Исследование ППА G.tropicalis в РТПГА в системах с разнами видами ДПГ р. Candida промышлешо-ценшх штаммов

Минимальная тормозящая доза препарата,

ГТпйттяпяти мкг/мл белка

liUoiiaLJa xu

С.tropi- C.maltosa C.rugosa C.valida C.scottJ

calis

ППА, экстракция

с ß-меркапто-

этанолом

нативный 0,08 0,19 0,04 " 6,0 >984,0

. термостабильн. 0,03 0,16 0,26 21,0 84,0

ППА, содовая

экстракция

нативный 2,12 0,13 0,21 4,0 34,0

термостабильн. 0,33 0,08 0,13 21,0 42,0

Фракция I 0,78 1,56 1,56 >25,0 >25,0

Фракция II 0,17 0,17 0,34 >430,0 >430,0

Фракция III 18,0 9,0 0 >156,0 >156,0

ППА С.tropicalis в системе с антисывороткой на культуру Methylococ-сиз capsulatus и эритроцит арными даагностинумами на основе термостабильного антигена, выделенного из нативной биомассы этого штамма или из готового продукта (гаприна), не выявило перекрестных реакций меясцу ниш. ^

Иммунохимическое изучение молекулярно-однородных компонентов ППА. Из термообработанных ППА С.tropicalis и C.maltosa, экстрагированных с использованием тиолового реагента, были выделены высокомолекулярные фракции массой более 2000 кД (I), массой 2000 кД (II) и массой 67 кД (III).

Иммунохимическое исследование выделенных молекулярно-однород-ных препаратов в РДД с гомологичной референс-сывороткой выявило, что-наибольшей цреципитирущей активностью обладает фракция II; минимальная доза препарата, выявляемая в РДД, для нее составляла 0,22-0,8 мкг/мл по белку. Для фракций I и III минимальная преципи-тируадая доза была в 7-200 раз выше.

• При исследовании сенситивных свойств выделенных молекулярно-од-нородных препаратов оказалось, что лишь фракция II иммобилизирова-лась на таннизированных формалинизированных эритроцитах барана с оптимальной сенсибилизирущей дозой I0D-50 мкг белка на I мл 5%-ной суспензии эритроцитов. Остальные исследуемые фракции практически не обладали сенситивными свойствами.

Исследование активности полученных фракций в РТПГА в системе с диагностикумом на основе комплексного ППА гомологичного штамма (табл.2) показало, что фракция II среди изучаемых обладает наибольшей активностью; ее минимальная тормозящая доза в 10 раз ниже по сравнению с фракцией I и в 45 раз ниже по сравнению с фракцией III. Анализ мономолвкулярных препаратов в РТПГА в системе с диагностику-

Таблица 2

Исследование фракций ППА С.tropicalis в РТПГА в системах с диагностикумами на комплексный ППА и на фракцию II того же штамм

Минимальная тормозящая доза, мкг/мл белка

комплекс- Фракции

ный ППА Г II III

Диагнос-тикум на основе ППА 0,039 0,19 0,020 0,89

Диагнос-тикум на . основе фракции ' II 0,078 0,37 0,020 3,55

мом на основе фракции II выявил слабую идентичность фракций I и II и полную нвидентичность фракций I и III.

Исследование вышеописанных препаратов в РТПГА с диагностикумами на основе комплексных ППА набора промышленных штаммов ДПГ р.Candida (табл.1) подтвердило наличие двух групп по признаку перекрестного реагирования. Следует отметить, что перекрестно-реагирующие компоненты присутствовали а каждой фракции независимо от ее " молекулярной массы. Степень перекрестного реагирования определялась активностью данной фракции.

Использование диагносгикумов на основе ППА при оценке иммунного статуса рабочих, занятых в производстве пащжна. Зритроцитарный диагностикум на основе ППА С.tropicalis был использован при оценке иммунного статуса рабочих Свэтлоярского завода. Было исследовано 163 сыворотки рабочих завода и 86 сывороток контрольных доноров. Анализ иммунного статуса рабочих, занятых б производстве паприна, осуществляли в отделении ферментации, отделении сепарации, заводской лаборатории (ЦЗЛ) и во вспомогательных цехах, т.е. на участках,, где возможен наибольший контакт с живой культурой микроорганизмов. В качестве контрольных были взяты две группы людей, проживающих в г.Красногорске и в г.Волгограда.

При анализе иммунного статуса практически здоровых людей без каких-либо клинических симптомов было выявлено, что число лиц, занятых в микробиологическом производстве, с уровнем гуморальных антител, превышающих диагностический титр, составляет 61,2-68,6% (в отделении ферментации 43,9%), тогда как в контрольных грушах этот показатель составляет 15,6-29,6%. Таким образом прослеживается тенденция к повышению уровня специфических антител в крови рабочих, занятых на производстве паприна.

Использование диагностикумов на основе ППА. при оценке загря: нений окружающей среды. Эритроцитарные диагностикуда на основе ГП и фракции II С.tropicalis были использованы в модельных опытах д. выявления уровня клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны Для этой цели на фильтры АФА, используемые на микробиологических предприятиях, наносили определенное количество клеток С.tropical, фильтры обрабатывали по стандартной методике экстракцией в раств1 тритона. Полученные экстракты анализировали в РГПГА. Установлено

к

что диагностикум на основе ППА выявляет 1,28x10 клеток/мл, что соответствует уровню чувствительности диагностикума 0,002 мкг/мл специфического белка; диагностикум на основе фракции II способен выявлять 6,4x104 клеток/мл, что соответствует уровню чувствитель ности диагностикума 0,001 мкг/мл специфического белка.

Латексные диагностикумы на основе ППА. В последнее время ши ко обсувдаегся вопрос о замене в иммунных осадочных реакциях при родных носителей синтетическими. Одним из таких носителей являют полистирольные частицы латекса.

Была исследована возможность нагрузки окрашенных полистирол ных латексных частиц с активированными аминогруппами поверхностг антигенами ДПГ 0. tropicalis. Антигенные латексные. диагностик) были получены на комплексный термообработанный ША, а также г фракции I и II. Оптимальная сенситивная доза для всех исследуема препаратов соответствовала 50 мкг белка на I мл 1&-ной суспензш латекса. Устанввлено, что сенситивная доза препарата не зависит молекулярной массы антигена и определяется концентрацией аминог] на поверхности частиц латекса, а также наличием активных аминог] у сенситина. Титр полученных латексных диагностикумов в реакции латекс-агглютинации в планшетах с гомологичной референс-сыворот;

составлял 1:512-1:2048.

Фракция III иммобилизировалась на частицах латекса, что определяли по остаточному количеству антигена в РТПГА, однако латексные диагностикумы с посаженной фракцией III не работали в реакции ла-текс-агглвтинации, что объясняется либо отсутствием достаточного количества антител на данную фракцию в антисывотке, либо стереометрическими несоответствиями Fab-фрагментов антител.

Анализ чувствительности полученных латексных систем в реакции нейтрализации антител в сравнении с эритроцитарными системами показал, что первые не менее эффективны, чем последние. Чувствительность латексного диагностикума на основе термостойкого 1ША - 0,0200,010 мкг/мл выявляемого специфического белка (для эритроцитарной системы - 0,020-0,002 мкг/мл белка), на основе фракции II - 0,0280,008 мкг/мл белка ( для эритроцитарного диагностикума - 0,0170,001 мкг/мл белка).

ВЫВОДЫ

1. Исследован состав поверхностных антигенов ДПГ G.tropicalis и C.maltosa, штаммов-продуцентов микробных биомасс кормового назначения на предприятиях микробиологического синтеза, в сравнении с антигенными составляющими экстрактов готового продукта. Установлено, что основные антигенные детерминанты у ППА приходятся на компоненты с относительной молекулярной массой 2000 кД, тогда как у экстрактов из готового продукта - на компоненты массой 67-50 кД. Установлена антигенная нэидентичность компонентов молекулярной массы 2000 кД с компонентами средней молекулярной массы 67 кД.

2. Сравнительный анализ нативных и термостойких ППА выявил антигенную разнородность содовых и тиоловых экстрактов, связанную с

вероятным наличием у первых термолабильных участков, блокируицш или экранирующих антигенные детерминанты, ответственные за спет фичность термостабильных компонентов.

3. Среда исследуемого набора промышленно ценных штаммов ДГО р.Candida разных видов выделены группы штаммов, различающиеся пс степени антигенного сходства. К первой группе относятся C.tropic Iis, C.maltosa и C.rugosa, обладающие перекрестно-реагирующими т мостабильными поверхностными антигенами. К второй группе относя! C.valida и C.scotti, не обладающие общими поверхностными антиген со штаммами первой группы.

4. Установлено, что перекрестно-реагирующие детерминанты щ сутствуют в каждой выделенной фракщшгёюзависимо от ее молекуля] массы.

5. На основе термостабйльного ППА С.tropicalis и молекулярг однородного его компонента массой 2000 кД получены: а) антигеннъ эритроцитарные диагностикумы; б) антигенные латексные диагност мы, окрашенные синим антрахиноновым жирорастворимым красителем. Перечисленные диагностикумы могут найти применение при оценке ш мунного статуса рабочих заводов по.ходу диспансеризации и профос мотрах, а также для контроля за воздушной средой промышленной и санитарно-защитной зоны.

6. На основе высокомолекулярной фракции ППА, экстрагирован! из живой культуры, предложен иммунохимический реагент для экспре оценки количества клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зо?