Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммунохимических реагентов для медико-гигиенического контроля производства Гаприна

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунохимических реагентов для медико-гигиенического контроля производства Гаприна"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 57.083.3:579.63:614.75

КАЧАРМИНА Валентина Александровна РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ

для медико-гигиенического конТюля

ПРОИЗВОДСТВА ГАПРИНА 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Дшган М.В.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Басова H.H.

доктор медицинских наук, профессор Дюно U.M.

Ведущая организация - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Защита состоится */6 " ^¿(уМЛА^- 1993 г. в /4 часов на заседании спецдализироганного совета Д.074.05.10 в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, ул.Б.Пироговская, д.2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЫМА им. Ч.Ы.Сеченова ш адресу: Зубовская пл., д.1.

Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандвдаг медицинских наук А.Ю.Миронов

Микробиологическое производство кормовых добавок путем биокон-вэрсия природного газа мэтанотрофами - весьма перспективное направление современной биотехнологии. К достоинствам такого' производства этносятся большие запасы природного газа, низкая стоимость углеводородного сырья, высокий выход биомассы, а также возможность получения готового продукта без дополнительной очистки. На Всесоюзном зимлозиуме по продуктам микробиологического синтеза (1989 г.) отмечалось, что в Российской Федерации создано опытно-промыш.г"знное производство гаприна мощностью 10000 т/год. Неоднократно подчеркиваюсь, что микробиологический синтез биомасс кормового назначения, эснованный на использовании нетрадиционных источников сырья, в том числе и метана, сопряжен с рядом трудностей и, в частности, со сло-хностыо создания полностью гермотичных, безотходных технологических 1роцессов, что влечет за собой возможность специфического загрязне-шя воздушной среда. Являясь полютантами последней, эти продукты логут попадать в организм человека через дыхательные пути, жолудоч-ю-кишечный тракт, кокнне и слизистые покровы [Воробьев А.А.,19341, жазывая при этом сенсибилизирующее действие. Поэтому одной из важнейших эколого-гигиенических задач становится обеспечение мер защиты здоровья людей, производственных помещений и окружающей среда от названных аллергнзирующих агентов. Указанной цели подчинена разработка эффективных методов санитарно-гигиенического контроля зоздуха производственной среда и селитебной зоны в районах расположения опытно-прошшюшшх. установок (ОГО-). Особую актуальность этот зопрос приобретает при сочетанном производстве разных кормовых С;ю-шсс, например, путем биоконверсии природного газа и параллельно 1-парафинов нефти на Светлопрском завода Волгоградской области. Гриме нящийся до настоящего времени химический- метод о'предения бел-

-------

специфической индикации гаприна в исследуемых образцах. Поэтом! представляется необходимой разработка, испытание и внедрение более -результативного способа специфического выявления гаприна в пробах атмосферного воздуха.

Данная работа выполнялась в рамках там НИР НПО "Биотехнология" (тема N 528, 1989 г) и ММА им. И.М.Сеченова ( тема N 56/00, 19Э0 г. и 45/91, 1991 г.).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ состояла в разработке комплекта иммунохими-ческих реагентов, предназначенного для гигиенического контроля атмосферного воздуха в районе расположения опытно-промышленных производств гаприна.

Для достижения намеченной цели потребовалось последовательное решение следующих задач :

1. Получение в качестве одного из иммунохимичэскшс реагентов специфической иммунной антисыворогки к НеЙ1у1ососоиа оареиХа-кив штамма ВОБ- 874 - продуцента гаприна.

2. Выделение специфических антигенно-активпнх компонентов (ААК) из биомассы штамма ВСБ-874 в качестве сопряженного шмунохи-мического реагента. ..

3. Разработка технологического режима и документации на приготовление антигенного суспензионного эритроцитарного диагностикума для серологических реакций.

4. Испытание полученных ищудахшичесних реагентов на'чувствительность, специфичность, стабильность в эксперименте.

5. Испытание способа. специфической индикации ААК гаприна в' нат^лных у - ловиях. л

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

I. Предложен способ получения специфической анткенворотки к

комплексу антигенов ^т.ВСБ-874, предназначенной для использования в серологических реакциях в качестве иммунохимического реагента при гигиеническом и микробиологическом контроле производства гаприна.

2. Определен антигенный состав.биомассы шт.ВСБ-874 - продуцента гаприна, выделены из нее термостабильные и термолэбилъные биополимеры и охарактеризованы их иммунохимические и сенситивные свойства.

3. Разработан способ изготовления антигенного суспензионного эритроцитэрного диагностику^ для серологического выявлеьля гаприна в реакции нейтрализации антител (РНАт).

4. На основе специфической индикации ААК гаприна утвержден гигиенический норматив - ПДК шли гаприна в атмосферном воздухе. ■

5. Подготовлена и утверждена научно-техническ-.я документация (НТД) на эритроцитарный диагностику для выявления гаприна в РНАт ( Инструкция по применению, Временная фармакопейная статья' (ВФС), экспериментально-производственный регламент (ЭПР).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ.

Способ индикации гаприна в атмосферном воздухе ' с помощью комплекта кммукохимичесгапс реагентов (антигенный зрктроцитаршй диагкостикум, специфические антитела) использоппн для специфического контроля за эффективностью газо-очкстшх систем на предприятии по производству биомассы кормового назначения путем бкоконзерскк природного газа.

Внедрение способа обеспечено'утверкдэшюй НТД:

1. Экспериментально-производственным регламентом на диагностику«» эритроцитаримй антигешшй для выявления гаприна в ГхИт (N382-92) '

2. Временной фармакопейной статьей на даагксстякум эритроик??.-рный антигенный для выявления гаприна з РНАт ( Н ВФО 42-344 дО-$к),

3. Инструкцией по применешпо диагностикума эритроцитарного антигенного для выявления гаприна в РНАт. Утверждена МЗ СССР

18 октября 1991 г.

. Приказом МЗ РФ Л 203 от 14.07.92 г. препарат разрешен к применению в практике здравоохранения.

Способ индикации гаприна использован при обосног.ании гигиенического норматива - ПДК шли гаприна в атмосферном воздухе по специфическому антигену, определяемому в РНАт. Утвержден МЗ СССР

19 ноября 1991 г., (К 605« - 91).

ОСНОВНЫЕ ПОДОКЕНШ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Набор иммунохимических реагентов для специфического выявления . ААК гаприна должен включать:

1) антитела к комплексу антигенов шт. ВСБ-874,

2) термостабильнне антигены из биомассы того ке штамма, иммобилизованные на эритроцитах.

Антитела представлены преимущественно иммуноглобулинами класса й и характеризуются штаымовой специфичностью, стабильностью титров при длительном гранении при -20 °С или в лиофилиз1тованном виде в течение 3-х лет (срок наблюдения). .

Комплекс термостабильных антигенов шт. ВСБ-874 содержит три

(

дискретных компонента, отличающихся по молекулярной м^ссо, выявляемых высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), но не различающихся существенно по электрофоретической подвижности, установленной иммуноэлектрофорезом (ИЭФ).

Диагн.стикум, полученный путем иммобилизации термостабильных анта._ енов );а поверхности формашшизированных танизированных эритроцитов, обладает высокой чувствительностью, специфичностью, стабильностью при щг^льиоы хравзшш во холоду (4 °С) и может быть не-

пользован для анализа проб воздуха и биосубстратов при эколого-гигиеническом контроле производства гаприна.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования доложены и обсуждены

на:

- Всесоюзной научно-технической конференции "Охрана окружающей среда на предприятиях Минмедарома СССР". Ташкент, М., 1990;

- совещании "Применение методов определения балка в гззоеоз-душных выбросах производств? БВК, в воздухе рабочей и оелитейной зон". Москва, 1991 г;

- заседании биологической секции Ученого совета Всесоюзного научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ "ВНШсинтезбелок". Москва, 1991 г;

- Отраслевом совещании по охране окружающей среда на предприятиях медицинской и микробиологической'промышленности. Таллин, 1991 г.;

- заседании Ученого совета НИИ общей и коммунальной гигиены им. А.Н.Сысгаа РАМН. Москва, 1991.;

- заседаниях Комитета медицинских иммунобиологических препаратов. Москва, 1991, 1992 гг.;

- научно-практических конференциях научно-исследовательской' лаборатории экологической иммунологии и аллергологии ША им .и. М.'Сеченова. Москва, 1991г., 1992г.

ПУБЛЬСАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 3 научные статьи.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на /30 стр. машинописного текста, который включает 16 таблиц, 13 рисунков и содерзшт следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы.

Список использованной литературы содержит 179 источников отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ.

В работе исследовали штамм ВСБ-874 Methylococcus capsulatua, используемый в качестве продуцента гаприна в условиях ОПУ на Свет-лоярском заводе. В качестве штаммов сравнения для определения специфичности иммунных сывороток в реакции непрямой иммунофлюоресцен--ции (РШФ) слушш культуры: Methylococcus capsulatus штаммов 113, II4, 119; Methyloooocus t: srmopliylus штаммов 111-5 и 111-6; Methy-loslnus sporlrn штамма YM-4; Methylosinus ourvatus штамма GB-25, Methylornonaa metanica штамма 12, а также изоляты из рода Багасосоиа, которые являются гетеротрофными контаминантами промышленных ферментеров и морфологически сходны со штаммом - продуцентом гаприна. Перечисленные микроорганизмы получены из коллекции ВНШсинтезбелок.

В качестве специфических антител использовали сыворотки кроликов, иммунизированных лиофилизированной биомассой шг.ВСБ-8-'4.

Источнике-1 антигенов служили: I) нагивная и' лиофилизированная биомасса Methylooooous capsulatus шг.ВСБ-874, выращенного при стерильном непрерывном. культивировании в лабораторных условиях;

2) образцы биомасс метанотрсфщх микроорганизмов, полученных в

1

опытно-промышленных условиях на Нарткалинском химкомб: зате - Uethy-lococcus thermophyluB штамма 111-5, Uethylomonas methanioa штамма 12, MethylosinuB ourvatus штамма GB-25; 3) партии готового продукта гаприна и паприна - по 10 образцов кавдого, полученные на Светлоярским заводе.

Для серологического исследования использовали 150 сывороток крови рабочих Светлоярского завода, собранных сотрудниками Сани--зрно-гигионического медицинского ж-гатитута г. Санкт-Петербурга г

клинически здоровых доноров г. Волгограда (той же климатической зоны) и Московской области.

Материалом для гигиенического исследования служили 630 проб воздуха, 370 из которых были отобрзны в натурных условиях на Свет-лоярском заводе, а 260 - в условиях эксперимента (опытные и контрольные образцы).

Опытные пробы различались по содержанию гаприна на фильтрах в мг по сухому ьесу: от 0,2 до 0,95 - 40 образцов; от 1,0 до 1.99 -86 образцов; от 2,0 до 3,0 - 15 образцов; от 3,5 до 6,0 - 18 образт цов.

Эталоном служили образцы с фиксированным количеством гаприна из разных партий готового продукта (положительный клггроль) и пап-рина (отрицательный контроль).

В работе использовали кроликов (60 животных) порода • Шиншилла, самцов, массой я,0-3,5-кг и беспородных морских свинок (альбиносов или СЕвглой масти) массой 220-25Ог - в количестве 200 голов.

методы.

Биомассу Ме1;Ьу1ос!оооив.сарзиШиэ шт.ВСБ-874 получали при стерильном непрерывном культивировании в ИБФМ РАН (г.Пущино) на установке "иКгаГегт 1601"(ШВ, Швеция). Культуру выращивали на минеральной среде М-10 в атмосфере природного газа и воздуха''в 'соотношении 1:'4 при скорости протока 0,2 ч-Г.

Биомъссу высушивали в специально подобранных щадящих условиях, выбранных после сравнительной оценки трех рекимов лиофилизацш.

Иммунизацию кроликов проводили лиофилизированной биомассой шт.ВСБ-874, выращенного в'стерильных .условиях. В предварительных опытах было установлено, что оптимальной является двухцикличная схема иммунизации, при которой на 1-ый и 14-ый дни суспензии био-

массы с концентрацией 20 мг сухого веса в I мл вводили кроликам подкожно (п/к) в область лимфоузла в объеме 1,5 мл и 2,0 мл соответственно, а на 22-ой и 33-ий дни - внутривенно ( в/в) в объеме 1,5 мл и 2,0 мл. Интервал между циклами составлял 30 дней. Через 7 дней после окончания иммунизации забирали кровь для получения сыворотки. Иммунные сыворотки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -20 °С или в лиофшшзированном виде. Динамику образования антител в сыворотках и их принадлежность к классам и 1§0 оценивали в реакции пассивной гемагглютинации (РИГА), обрабатывая сыворотку р-меркаптоэтанолом. Интенсивность реакции учитывали по четы-рехкрестовой системе, за титр принимали предельное разведение сыворотки, агглютинирующее сенсибилизированные эритроциты на 2+, и выражали как разведения. Для получения дополнительной информации о составе антител в исследуемой сыворотке использовали реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). По характеру снижения титра антител •под влиянием разных доз антигена судили о преобладании антител класса в (эквивалентное торможение) или о наличии антител класса М (неэквивалентное тормокениэ) (Ивченко О.И., 1986).

Специфичность сывороток оценивали в РНИФ с разными метанотроф-нкми микроорганизмами и с микроорганизмами из рода Рагасоссиз.

Комплексные антагете препараты из шт.ВСБ-874 получали методом ультразвуковой дезинтеграции (АЦуз) и обработкой биомассы детергентами (АГд). Отдельные компоненты комплексного препарата -термостабильные антигены (АГтс) и термолабильные антигены (АГтл) -получали обработкой биомассы 0,2 % раствором тритона Х-100 или же додецилсу.г фата натрия (ДСН) с фракционированием путем ступенчатого высгтшани,, в разных зонах насыщения сульфатом аммония (от 10 % до 80 %) и паследувдгм осаждением антигенно-активного материала этиловым спиртом или ацетоном. Процесс фракционирования контролировали

прогревании их в течение 15 мин. на кипящей водяной бане.

Термостабильные антигены из готового продукта получали экстракцией при кипячении гаприна (АГг) в 0,2 % растворе тритона Х-100 и осаадением этиловым спиртом.

В конечных препаратах определяли общий белок методом Лоури и полисахарида - фенол-серным методом.

Анализ фракционного состава антигенных препаратов проводили методом БЭЖХ на хроматографе Spectraphysics марки 350иВ (США), укомплектованном колонками UltroPACK TSKG 3000 (голубые) фирмы "LKB" (Швеция).

Иммунохимические свойства полученных антигенов и иммунных сывороток изучали в реакции дамунодаффузии по Оухтерлс.ш (РИД) и с помощью ИЭФ. Методом гашения непрямой иммунофлуоресценции устанавливали локализацию АГтс и АГтл в бактериальной клетке.

Для определения иммуногенных свойств АГтс и АГтл кроликов иммунизировали по следующей схеме: на 1-ый и 7-й день дробно (4-5 точек) вводили внутрикокно (в/к ) 200 мкг/0,5 мл (по белку) соответствующего антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в область шеи. На 14-й день повторяли иммунизацию при внутримышечном (в/м) введении 400 мкг/0,5 мл в 2 точки в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. На 7-й день после окончания иммунизации определяли титр антител по разведению сыворотки в РИД со стандартным количеством гомологичных антигенов (I мг/мл по белку).

Для оценки аллергенных свойств АГтс и АГтл определяли их реак-тогенность и разрешающую активность. Реактогенность препаратов оценивали путем в/к введения их'интактным морским свинкам. Разрешающую активность антигенов определяли.в кокно-аллергическом тесте на морских свинках, сенсибилизированных за 12 дней до начала опыта живыми

клетками шт. ьиь-У74 в смеси с НАФ. Доза суспензии культуры состав-

о

ляла 6,4*10 кл/мл. Разрешающие количества антигенов варьировали от 100,0 до 1,3 мкг белка. Кожную реакцию учитывали через 30 и 90 минут, а также спустя 24 и 48 часов. Рассчитывали среднеразрешавдук дозу (ЕБ50) препаратов.

Для получения эритроцнтарных диагностикумов (ЭД) использовали формалинизированные эритроциты барана, которые обработы~али танином в течение 30 мин. при температуре 37 °С и сенсибилизировали антигенами при рН 6,4 в течение 2-х часов при температуре 37 °С и 18 часов при температуре 4 °0 п, последующей дополнительной фиксацией сенситина на эритроцитах формальдегидом. В качестве сенситинов использовали антигенные препараты: АГуз, АГд, АГтс, АРг, АГтл. Готовая форма ЭД представляла собой 3 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов в водно-солевом растворе с 0,5 % содержанием формальдегида. Чувствительность и специфичность ЭД определяли й РПГА и РНАт с двумя "гемагглютинирующими (2ГЕ) адшшцами специфических антител микрометодом (в объеме 25 шел каздого ингредиента), используя 0,3 55 взвесь сенсибилизированных эритроцитов.

Для апробации ЭД в натурных и экспериментальных условиях пробы

воздуха отбирали асшрационным способом со скоростью 25 л/мин на

фильтры АФА или в жидки;: поглотитель. Антигенно-активный материал 1

экстрагировали 0,01 % раствором тритона Х-100 при кипячении в течение 10 мин. В экстрактах определяли серологическую активность в РНАт и количество белка по Лоури (в экспериментальных пробах).

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя метода вариационной статистики с расчетом t критерия Ст1„щента.; а такие методом' пробит-преобразования,» по Литчфилду и Уялкокоону в модификации Рота (Беленький , 1963).'

г

Характеристика иммунной сыворотки к штамму ВСБ-874 По разработанной схеме путем иммунизации кроликоз лиофилизиро-занной биомассой штамма ВСБ-874 была получена гипериммунная сыворотка, которая взаимодействовала в РШФ только с мэтанотрофкыми бактериями, относящимися к виду Mc.capsulatus. Иммунизация приводила к образованию антител как к видоспецифическим ,. так и к штаммо-специфическим антигенам бактерий. Уровень антител к штаммоспецифи-ческим антигенам превышал уровень видоспецифических антител. Разведения сыворотки с 1:64 до 1:2048 обнаруживали лишь штаммоспецифи-ческие антигены в РКИФ, тогда как в разведении до 1:32 сыворотка проявляла видовую.специфичность, поскольку взаимодействовала с другими штаммами того же вида. •

В РПГА с антигенами гомологичного штамма сыворотка давала положительные результаты в титре (1о^ разведения) 14 - 16 и не взаимодействовала с антигенами дрокжеподобных грибов рода Candida -• продуцентов паприна. В РГПГА наблюдали снижение титра сыворотки под ' влиянием разных доз специфического антигена (эквивалентное торможение ). После обработки p-меркаптоэтанолом гшгериммуг хая сыворотка сохраняла исходный уровень активности в РПГА, что указывало на присутствие специфических антител, представленных преимущественно иммуноглобулинами класса Ig G.

Экспериментальные серии препарата антител отличались стабильностью титров в процессе длительного хранения при температуре--20 °С или в лиофилизированном виде в течение 3-х лет (срок наблюдения). .

Таким образом,- гшгериммунная сыворотка к биомассе шт.ВСБ-874 оказалась пригодной к: : для контроля за ' доминированием продуцента методом РШФ в процессе производства кормо-ых биомасс путем бш.. .он-

________»..»цш^^дшши риагоита^

для .серологических реакций.

Анализ антигенного состава лпамма ВС5-874.

I. Секционирование антигенов. В результате дезинтеграции клеток ультразвуком или обработки их химическими детергентами установили, что каждый комплексный препарат - АГуз и АГд - содержит 6-8 дискретных компонентов, различающихся. в РИД и ИЭФ по специфичности и эле-ктрофоретической подвижности. Изучение сенситивных свойств у этих кошексов выявляло значительные отличия. Более выраженной сенситивной активностью обладал АГд - минимальная доза для I мл 3 % взвеси эритроцитов составляла 150 мкг/мл для АГуз (ЭДАГуз) и 6 мкг/мл для АГд (ЭДАГд). Чувствительность в РИГА ЭДАГд была Ъыше чувствительности ЗДАГуз - титр сыворотки составлял соответственно 16 и 14. Для дальнейших исследований предпочтительнее оказалось пользоваться комплексными ААК, полученными с помощью детергентов.

Поскольку технология производства гаприна предусматривает термообработку биомассы, представлялось более корректным для обнаружения аь.игенов в готовом продукте использое ть термостабильные компоненты, выделенные как из нативной биомассы, так и из гаприна.

Сравнительный иммуноэлектрофоретический анализ иативных и прогретых в течение 15 мин. при 100 °С комплексных препаратов ит. ВСБ-874 позволил дифференцировать в их составе АГтс и АГтл. При обработке исходной биомассы шт.ВСБ-874 тритоном Х-100 или ДСН извлекались как АГтс, так и АГтл. Осаждение сульфатом аммония в зоне 40 % насыщения позволило выделить фракцию, содержащую, главным образом, АГтс, тогда как в зоне от 50 % до 80 %■насыщения осаждались преимущественно АГтл.

Исследование препаратов методом ВЭЖХ показало, что АГтс и АГтл гетерогеннн. Наряду с идентичностью низкомолекулярных компонентов с

М.. кД и <1 кД, выявлено различие по основному компоненту: з АГтс высокомолекулярная фракция имела массу >500 кД, а з АГтл - 95 кД.

2.Характеристика термостабильшх и термолабплькых антигенов штамма ВСВ-874. Сравнение иммунохимнческих свойств АГтс, АГг г. АГтл методами РИД и ИЭФ показало серологическое родство АГтс и АГг и серологическую неидентичность АГтс и АГтл, различающихся по глект-рофоретической подвижности. Преципитирующие комплексы АГтс и АГг малоподвижны, поэтому в ИЭФ оставались на уровне старта, тогда как АГтл быстро перемещались к аноду.

При определении белково-полисахаридного состава было показано, что АГтс и АГг содержали полисахарида и белок, а АГтл - компонента белковой природы, и лишь в отдельных случаях в них обнаруживали следы полисахаридов.

Анализ сенситивных свойств АГтс, АГг и АГтл при изготовлении

ЭД обнаружил явное преимущество термостабильных компонентов. ;пти-" /

малыше дозы (я мкг/мл по белку) при сенсибилизации I мл 3 " взвеси эритроцитов составили для: АГтс - 20,0 (ЭДАГтс), АГг - 50,0 (ЭДАГг) И АГтл - 140,0 (ЭДАГтл).

Методом гашения непрямой иммунофлуоросценции обнаружили разную локализацию АГтс и АГтл. Так, сыворотка к шт.ВСБ-874 в РНИФ взаимодействовала с гомологичной культурой до вазведения 1:2048, а после сорбции ее АГтс отмечалось гашение свечения. По-видимому, это обусловлено поверхностной локализацией антигена, использованного для сорбции сыворотки. Двукратная обработка сыворотки АГтс привела к сникешга ее активности в РНИФ с целыми клетками в 64 раза. Поскольку сыворотка в разведении до 1:32 реагирует как видоспецифическая, а в разведениях 1:64 - 1:2048 как штеммосгоцифичэская, мокно предположить, что АГтс элиминировал из сыворотки штаммоспецифические

<

антитела и не взаимодействовал • с антите.пзми к видоспецифич^ским

антигенным детерминантам. В то ке время, сорбция сыворотки АГтл не привела к потере ее активности в РШФ, что подтверждено результатами титрования сыворотки, сорбированной культурой шт. БСБ-874, в РПГА с ЭДЛГтс и ЭДАГтл. Титр сыворотки в реакции с ЭДАГтс после сорбции культурой снижался с 14 до 3, тогда как в реакции с ЭДАГтл изменения титра сыворотки не наблюдали. Полученные результаты позволили предположить, что удаление из сыворотки антител после сорбции целыми клетками происходило преимущественно за счет поверхностных тормостабильных антигенов.

Сыворотки кроликов, иммунизированных АГтс и АГтл, различались по иммунохикическим свойствам в РИД. Сыворотка к АГтс прецютитиро-вала антиген в разведении ее 1:8, а сыворотка против АГтл - в разве денш 1:128. Согласно современным представлениям о большей имму-ногенности белковых компонентов в образовании преципитинов можно предположить, что АГтл, содержащий с своем составе преимущественно, белок, обладает в этой ситуации преимуществом перед АГтс, имеющим гликоконъюгатную природу. .

В опытах в/к титрования на интактных морских свинках установили» что АГтс и АГтл не проявляют' рэактогеншх свойств (даже при введении таких концентраций, как 100 мкг в 0,1мл). В то ко время, указанная доза.вызывала кокную реакцию у 100 % кивотных, сенсибилизированных культурой шт. ВСБ-874 , что послужило основанием для ее использования в качестве исходной при аллерготестировании. Результаты в/к титрования АГтс и АГтл на сенсибилизированных морских свинках показали, что они в равной мере выявляют у подопытных животных гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) . Средние разрешающие дозы {ED5q в мкг белка/О,1мл) исследуемых препаратов составили для АГтс - 12,5(6,75*23,1), а для АГтл - 8,8(5,3*14,5). Из этого следует, что оба антигена пригодны для аллерготестирования. АГтс может

быть использован для выявления сенсибилизации к готовому продукту, который на производстве проходит термообработку, а '.Гтл, присутствующий только в кивой клетке, по-видимому, более пригоден для определения гиперэргии, обусловленной антигенами зхивого микроорганизма. Таким образом, наличие двух активных препаратов мокет стать предпосылкой для дифференциальной диагностики аллергических состояний как у рабочих, занятых в производстве гаприна, так и у-кителей селитебных зон.

Апробация эритроцитарннх антигенных диагностикумов.

I.Использование ЭД для обнаружения специфических антител у рабочих Светлоярского завода БВК. Серологические исследования с использованием ЭДАГтс и ЭДАГтл в РПГА показали, что все донорские сыворотки (контрольная груша) в разведении 1:8 не содержали специфических антител при титровании с обоими диагностикумами. У оабо-чих, связанных с производством гаприна, положительные реакции на АГтс отмечали в 87+2,7 % случаев. Частота положительных реакций с АГтл у этих ке лиц была существенно (Р <0,05) ниже и составляла 54+4 %. Средние (log2 ы+m) титры антител к АГтс и АГтл быль равны соответственно.4,13±1,01 и 3,97+0,88 (Р >0,05). Таким образом, у рабочих выявлены антитела к разным антигенам ме: знотрофов, используемых в производстве. У людей обнаружении антител чаще регистрировалось к термообработсиному продукту, чем к живой культуре Но. Capsula tuß. Вероятно, это различие обусловлено условиями производства гаприна, в частности, особенностями герметизации аппаратуры на основных стадиях технологического процесса.

■2.Использование ЭД для выявления антигенов гаприна в пробах воздуха. При изготовлении ЭД для выявления гаприна сенсибилизацию эритроцитов проводили термостабильннми антигенами из био"ассы шт. ВСБ-874 или готового продукта. Активность ЭД в РПГА (микроме-

тиа/ соответствовала татру сыворотки 14 - 16. Контрольные испытания образцов гаприна позволили определить высокую корреляцию мевду результатами РНАт и содержанием оелка по Лоури в экстрактах, а также значительно Солее высокую чувствительность серологического метода по сравнению с химическим. Чувствительность ЭД в РНАт обеспечивала обнаружение термостЕбильных компонентов метанотрофов в минимальной концентрации 5-10 нг/мл.

Специфичность ЭД оценивали в РНАт, используя образцы антигенов , полученных в опытно-промышленных условиях из биомасс других метанотрофных микроорганизмов: Ме1.Ьу1ососсиз 1.Ьетаор1гу1из штамма Ш-5, Methylomor.ES с.еШ1П1са штамма 12, Ме41гу1оз1пиз сштагиа штамма СВ-25 и с экстрактами паприна. Во всох этих оштах нейтрализация иммунной сыворотки отсутствовала, что указывало на высокую специфичность системы.

Диагкостккумц сокранг щ к-чизмешой активность при температуре' 4 °С не менее 2-х лет (срок наблюдения).

Способ индикации гаприна с помощью комплекта шмунохимических реагентов был апробирован в натурных условиях на Светлоярском заводе .

Исслед: затэ 370 проб Еоздуха, отобрагашх п розшх точках региона расположения ОПУ по производству гаприна - в рабочей, сани-тарно-за!дитной и селитебной зонах, показали, что ААК гаприна выявляются не только в организованных газо-воздушшх выбросах (до и после системы мокрой очистки) в концентрациях от 2,0480 мг/м^ до 0,0002 мг/м , но и в селитебной зоне, где из 98 проб, однократно

о

отобранных в объема I м , было выявлено 5 положительных с содержанием специфического антигена от 0,0075 мг/м3 до 0,0001 мг/м3.

Результаты лабораторных и натурных исследований ЭД явились основанием для-проведения Государственных испытаний по программе,

утвержденной Государственным Комитетом сзгатарно-эпидемкологическо-го надзора Р5 с целью обоснования производственного выпуска препарата и внедрения его в практику здравоохранения.

Проведенная экспертиза испытуемого препарата подтвердила чувствительность метода,условно соответствующего 5-10 нг/мл (по белку) и его селективность. Подтверждена такке Еысокая корреляция между содержанием общего Сежа на единицу сухого веса готового продукта, и специфической активностью - числом минимальных нейтрализующих доз (МВД) как в экспериментальных пробах (навесках гаприна), так и з испытуемых образцах (в пробах воздуха, отобранных из камер при за-пыленш гаприном). Содержание специфического антигена в "звзсках гаприна разных производственных партий находилось в пределах 1,0 -2,0 % «тноситэлыю веса. Испытуемые образцы, нейтрализовавшие специфическую сыворотку, показали титры в РНАт, корреспондирующие с расчетным уровнем гаприна в них. Отмечена высокая воспроизводимость метода - совпадение результатов параллельного испытания в 10-ти

о

повторностях проб, содержащих разные концентрции гаприна, и контрольных образцов, не содержащих гаприн, было полным. Метод "тлича-этся простотой постановки, объективностью учета, быстротой получения ответа. Специфичность полученного результата,гарантирует использование антисыворотки высокого титра с .минимальной концентрацией антител доминирующей специфичности в опыте. В РНАт определяется суммарная активность полных и■ неполных антител и обнаруживаются разные фрагменты (мелкие и крупные) антигена данной специфичности (Каральшк Б.В. ,1976).

На основании проведенных испытаний диагностической эффективности системы по индикации гаприна утверздена КГД на препарат, (ВФС, ЭПР, Инструкция по применению). Это позволило рекомендовать метод с использованием антигенного эритроц«тарного дипгаостикумз в

РНАт в качестве способа контроля экологической безопасности микробиологического производства гаприна, а препарат ЭД - к производству к ¡1:-:одрению в практику.

Разработашшй метод ког^роля использовали при обосновании гигиенического норматива - ПДК гшли гаприна в атмосферном воздухе на уровне 0,0002 мг/м3 (среднесуточная концентрация). В соответствии с руководством по контролю загрязнения атмосферы (РД 52.04.186-89.М.1991г.) для определения среднесуточной концентрации необходимо

о

производить 4-х кратный отбор воздуха на один фильтр в объеме I ми через равные промежутки времени. При током объеме отобранного воздуха ( 4 м ) расчетная величина чувствительности метода составляет 0,00002 мг/м3, что на порядок превышает установленную ЩК.

Таким образом, разработан и апробирован способ специфической индикации гаприна, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимость« в обнаружении ААК, как на производства, так и в объектах внешней среды. Способ мокет служи.ь основанием для объективного контроля за эффективностью газо-очистных установок на всех этапах технологического процесса производства гаприна и для контроля за соблюдением гигиенических нормативов в обеспечении мер защиты здоровья людей и воздушной среда.

ВЫВОДЫ

1.Предложена схема иммунизации кроликов лиофилизированной биомассой штамма ВСБ-874, выращенного в условиях асептического непра-рызлого культивирования, позволяющая получать преимущественно иммуноглобулины класса о со штамшвой специфичностью в разведениях 1:64 - 1:2048 в РШФ. Данный иммунохимический реагент пригоден в качестве стандарта антител при микробиологическом и гигиеническом контроле производства гаприна.

Ktm iip^/ii.tUjja lot jno u»* <_i i ^ 'чу'-/^.^;^.:.^ i

6-8 дискретных компонентов, выявляемых в йэф. Обр-Сотка <5::омзссы 0,2 й ДСН или тритоном Х-100, с последующим ступенчатым зисаливэни-ем сернокислым аммонием в зоне до 40 % и во % иаскщэкия осаждением антигенно-активного материала этиловым спиртом, позволяет выделить препараты, содержащие преимущественно термостабильные и термолабильные компоненты, соответственно различающиеся по молекулярной массе (М.м. >500 кД и М.м. 95 кД), белково-полисахаридному составу, локализации в бактериальной клетке, электрофоретической подвижности, специфичности в РИД и ИЭФ, сенситивной активности (40 мкг/мл и 150 мкг/мл).

3. Термостабильные и термолабильные антигены штамма ВСБ-874 могут Зыть использованы при изучении иммунного статуса у рабочих, связанных с производством гаприна, а гакке для выявления специфической сенсибилизации путем аллерготестирования. При конструировании даагностикумов для экодого-гигиенического контроля производства гаприна следует использовать термостабильные компоненты комплексного препарата.

4. Разработана технология приготовления суспензионного антигенного зритроцитарного диагностикума для выявления гаприна в РНАт. Препарат представляет собой 3 % взвесь форлалинизированных эритроцитов барана, обработанных танином и сенсибилизированных торг/оста-

с

Сильными антигенами с последующей фиксацией формальдегидом до 0,5 % концентрации. ЭД обладают высокой чувствительностью, специфичностью и стабильны при хранении в условиях рефрижератора в. течение двух лет (срок наблюдения).

5. Способ выявления гаприна с помощью комплекта иммунохкми-ческих реагентов апробирован в эксперименте и в натурных условиях на ОПУ Светлоярского завода. Высокая . специфичность, чувствитель-

. иишзхшш основанием 1,53 РФ рекомендовать его в качестве способа контроля экологической безопасности микробиологического производства гаприна.'

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ, составленная по результатам исследования.

1. Экспериментально-производственный регламент на диагностикум эритроцитарний антигенный для выявления гаприна в РНАт (Л 382-92).

2. Временная фармакопейная статья на диагностикум эритроцитарний антигенный для выявления гаприна в РНАт (# ВФС 42-344 ВС-92). Утворздена МЗ РФ 27 мая 1992 г.

3. Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного антигенного для выявления гаприна в РНАт. Утверздена МЗ СССР 18 октября 1991 г. .

СПИСОК РАВОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Качармина В.А., Чечура А.Н. Использование иммуждаммескнх реагентов при оценке иммунного статуса рабочих, занятых в производстве гаприна // Тезисы докл. Всесоюзной ваучно-техкич. конф. "Охрана окружающей среды на предприятиях, Минмвдорома СССР". - Ташкент, М.,1990. - 4.2. - С.193-194.

2. Качармина В.А., Пельц Г.Л. Получение шгаммоспецифичвских сывороток /У Передовой производственный опыт в медицинской ■ прокшд- ' лвкности, рекомендуемый для внедрения. - М.- 1991.- вш.6. С.23-26.

3. Качармина В.Д., Абакумова Д.Д., Домникова Г.И. Иммунохими-ческая тест-система для определения гаприна в воздухе // Сб.трудов: "Эколого-гигиеничэская оценка крупнотоннажных микробиологических производств". - И.- 1992.- С.73-80.'

Качармина В.А., Абакумова Д.Д., Кравцов Э.Г. "Способ опре-