Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации

Марков, Денис Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации"

На правах рукописи

0046

МАРКОВ Денис Игоревич

Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации

Специальность 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕН 2010

Москва 2010

004616223

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. П. Ширинский

доктор физико-математических наук А. К. Цатурян

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 16 » декабря 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «15"» ноября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА ЮТЫ

Актуальность темы. Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высококонсервативного участка, который получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. Практически все sHsp формируют крупные олигомерные комплексы, различающиеся по своей структуре и количеству мономеров [Haslbeck, 2002]. Показано наличие зависимости шапероноподобной активности sHsp от их четвертичной структуры [Shashidharamurthy et al., 2005; Lelj-Garolla and Mauk, 2006]. Кроме того, эти белки могут подвегатъся фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что также отражается как на их олигомерной структуре, так и на шапероноподобной активности [Haslbeck, 2002; Gusev et al, 2002; Rogalla et al, 1999].

В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них наиболее подробно изучены аА- и аВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl). Как Hsp27, так и аВ-кристаллин экспрессируются в большом количестве в мышечной ткани, и их содержание увеличивается в ответ на различные повреждающие воздействия. Весьма вероятно, что одна из функций этих белков - это взаимодействие с актином и миозином (главными белками сократительного аппарата мышц) при неблагоприятных условиях. Изучению взаимодействия sHsp с актином было посвящено довольно много работ; в частности, было показано, что эти белки не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не влияют на процесс тепловой денатурации актина, но при этом эффективно предотвращают его тепловую агрегацию, образуя небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином [Pivovarova et al, 2005; Pivovarova el al, 2007]. Значительно меньше было известно о взаимодействии sHsp с миозином. К моменту начала наших исследований этому вопросу была посвящена всего одна работа [Melkani et al, 2006], в которой было показано, что в условиях, имитирующих тепловой шок (инкубация при 43"С), аВ-кристаллин не только предотвращает агрегацию скелетномышечного миозина, но также частично подавляет инактивацию его АТРазы. Исходя из полученных результатов, авторы указанной работы заключили, что в условиях теплового шока sHsp могут взаимодействовать с головками миозина и предотвращать их тепловую денатурацию (приводящую к агрегации и инактивации АТРазы) [Melkani et al, 2006]. Подобные заключения, однако, представлялись нам весьма странными, особенно в свете результатов исследований взаимодействия sHsp с актином. Вследствие этого, одной из целей данной

работы стало подробное исследование влияния вНвр на процессы тепловой денатурации и агрегации миозиновой головки. Важно отметить, что сам процесс тепловой агрегации миозиновой головки ранее почти не исследовался (особенно в условиях физиологической ионной силы), поэтому другой не менее важной целью настоящей работы было детальное исследование этого процесса.

Головки миозина могут быть изолированы путем ограниченного протеолиза молекул скелетномьппечного миозина. Изолированная головка (называемая субфрагментом 1 миозина (81)) состоит из двух главных структурных доменов - моторного (или каталитического, содержащего активный центр АТРазы и участки связывания с актином) и регуляторного. Последний (в случае 81, полученного путем химотрипсинолиза в отсутствие двухвалентных катионов) представляет собой длинную а-спираль, с которой нековалентно ассоциирована «существенная» (или «щелочная») легкая цепь. Эта легкая цепь существует в виде двух изоформ: А1 и А2. Основное отличие А1 от А2 - это наличие у нее дополнительной М-концевой последовательности из 41 остатка. Поэтому препарат Б1, получаемый из миозина скелетных мышц, представляет собой смесь двух изоформ, содержащих только одну из этих легких цепей: Б1(А1) или 51(А2).

Исследованию тепловой денатурации Б1 посвящено довольно много работ. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было установлено, что она полностью необратима; применение подхода «последовательного отжига» позволило выявить три тепловых перехода [Шныров и др., 1989; Ьеу^ку ег а1, 1990; 1991; 1992]. Были также сделаны попытки идентификации этих калориметрических переходов, т. е. выявления их соответствия определенным структурным доменам [ЬсуПэку, 1994]. Стоит, однако, отметить, что метод «последовательного отжига» недостаточно строг и дает лишь приблизительную информацию о механизме тепловой денатурации белка. Кроме того, большинство работ было выполнено на смешанном препарате Б1 (без его разделения на изоформы). В то же время детальное понимание процесса тепловой агрегации белка невозможно без знания детального механизма его денатурации. Стоит отметить, что относительно недавно в нашей лаборатории был предложен новый, физически более строгий метод анализа данных ДСК для необратимо денатурирующих белков. В результате еще одной целью данной работы было подробное исследование механизма тепловой денатурации изолированных изоформ и возможный пересмотр полученных ранее результатов.

Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало подробное изучение тепловой денатурации и агрегации и влияния вНвр на эти процессы в условиях, приближенных к условиям теплового шока. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Методом ДСК провести подробные исследования тепловой денатурации препаратов 81(А1) и 51(А2) при двух значениях ионной силы: -20 мМ и =120 мМ.

Провести математический анализ полученных данных с целью нахождения калориметрических доменов (т. е. участков молекулы, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга).

2). Исследовать тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценциии 81 и тепловую инактивацию его АТРазы. Сопоставляя полученные результаты с данными ДСК, попытаться провести идентификацию калориметрических доменов 81, т. е. выявить их соответствие определенным структурным доменам 81.

3). Методами турбидометрии и динамического лазерного светорассеяния (ОЬБ) исследовать механизм тепловой агрегации изоформ при двух значениях ионной силы: =20 мМ и =120 мМ.

4). Изучить влияние малого белка теплового шока №р27-30 (№р27 с тремя имитирующими фосфорилирование заменами: 8150, 87Ш, 8820) на тепловую денатурацию 81, инактивацию его АТРазы, а также на агрегацию 81 в условиях, имитирующих тепловой шок (43°С), при значениях ионной силы, близких к физиологическим (=120 мМ).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании результатов проведенных исследований пересмотрен механизм тепловой денатурации 81. Показано наличие двух калориметрических доменов в его молекуле, причем менее термостабильный калориметрический домен идентифицирован как регуляторный домен миозиновой головки, а более термостабильный - как моторный домен.

2. Показано, что при значениях ионной силы, близких к физиологическим, изоформы 81 не различаются по характеру тепловой агрегации. Процесс агрегации при этом лимитируется денатурацией моторного домена. При инкубации в условиях низкой ионной силы (=20 мМ) 81(А1) агрегирует значительно быстрее, чем 81(А2). Предполагается, что в этих условиях агрегация 81(А1) по крайней мере частично обусловлена межмолекулярными взаимодействиями И-концевого сегмента легкой цепи А1.

3. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния ни на тепловую денатурацию 81, ни на инактивацию его АТРазы. При этом БШр способны эффективно подавлять тепловую агрегацию за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами 81.

Научная новизна. Впервые детально исследован механизм тепловой денатурации и агрегации изоформ Э1 с применением методов химической кинетики. Установлено наличие в молекуле 81 двух калориметрических доменов, причем более термостабильный домен денатурирует в две стадии. Существенные различия между изоформами 81 в кинетических параметрах денатурации выявлены только для первого калориметрического домена независимо от условий ионной силы. Проведена идентификация

калориметрических доменов и установлено, что менее термостабильный домен соответствует регуляторному домену миозиновой головки, а более термостабильный -моторному домену.

Показано, что в условиях высокой ионной силы (120-130 мМ) тепловая агрегация протекает одинаково у обеих изоформ 81, не зависит от юнгцентрации белка и лимитируется необратимой денатурацией моторного домена. Более того, в этих условиях механизм тепловой агрегации Б1 коренным образом отличается от такового для всех ранее исследованных белков: рост агрегатов осуществляется не за счет слипания стартовых агрегатов, а за счет последовательного налипания на эти агрегаты отдельных молекул Б!, моторный домен которых частично денатурирован. Напротив, в условиях низкой ионной силы (20 мМ Нереэ) обнаружена существенная разница в агрегации между двумя изоформами 81. Необратимая агрегация 81(А2) является следствием тепловой денатурации этой изоформы 81 и мало зависит от концентрации белка, а в случае 81(А1) отсутствуют какие-либо корреляции между тепловой денатурацией и агрегацией этой изоформы 81 и наблюдается выраженная концентрационная зависимость агрегации. Кроме того, показано, что в условиях низкой ионной силы спонтанная агрегация БI (А I) происходит даже при +4°С. В последнем случае агрегация является полностью обратимой: образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора. На основании этих данных сделан вывод, что при низкой ионной силе агрегация 81(А1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка и по крайней мере отчасти обусловлена взаимодействиями дополнительного М-концевого сегмента легкой цепи А1 с другими молекулами 81.

Показано, что в условиях ионной силы, близких к физиологическим, вНвр не влияют ни на тепловую денатурацию 81, ни на инактивацию его АТРазы, однако эффективно защищают его от тепловой агрегации, образуя устойчивые комплексы с частично или полностью денатурированным молекулами 81. В зависимости от весового соотношения БНБр/ рост агрегатов либо замедляется, либо подавляется вовсе.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации и агрегации сложных мультидоменных белков и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Отсутствие концентрационной зависимости и разницы между изоформами в кинетике роста агрегатов в условиях высокой ионной силы делают 81 особенно удобным объектом для исследования шапероноподобной активности малых белков теплового шока и других агентов, подавляющих тепловую агрегацию белков. Во-первых, отпадает необходимость разделения препарата 81 на изоформы, а во-вторых, эффект шаперона будет зависеть только от молярного (или весового) соотношения шаперон/81.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XVII

Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов

2010» (г. Москва, 2010), на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2008; 2010) и на 35-м Международном конгрессе FEBS (г. Гетеборг, Швеция, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (2

главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (_ источников).

Диссертация изложена на_страницах, содержит: 29 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах S1 миозина и малых белков теплового шока (sHsp). Особое внимание уделено работам по исследованию тепловой денатурации S1 методом ДСК. Детально рассмотрен разработанный ранее в нашей лаборатории подход к анализу термограмм мультидоменных белков с необратимой тепловой денатурацией. Рассмотрены современные представления об аморфной тепловой агрегации белков и влиянии sHsp на этот процесс.

Материалы и методы исследования

S1 получали, переваривая филаменты миозина из скелетных мышц кролика а-химотрипсином, обработанным TLCK для подавления активности примесей трипсина, в буфере 20 мМ NaH2P04,0,12 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ (рН 7,0) при 25°С в течение 10 минут при весовом соотношении а-химотрипсин/миозин, равном 1/250. Реакцию останавливали добавлением PMSF. Миозин был получен ранее сотрудниками лаборатории и хранился при -20°С в 50% глицерине. S1 разделяли на изоформы S1(A1) и S1(A2) методом ионообменной хроматографии на колонке с SP-трисакрилом [Trayer et al., 1988]. Рекомбинантный малый белок теплового шока человека Hsp27-3D (мутант Hsp27 с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) был любезно предоставлен профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова).

Исследования денатурации и агрегации белков проводили в буфере 20 мМ Hepes-КОН (рН 7,3), содержащем 1 мМ MgCb (низкая ионная сила) или в том же буфере, содержащем ЮОмМКС! (высокая ионная сила). Все исследования влияния sHsp на

тепловую денатурацию и агрегацию S1 проводили на смешанном (не разделенном на изоформы) препарате S1 в буфере с высокой ионной силой.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Для получения кривых теплопоглощения препарат белка с концентрацией 1,5-1,9 мг/мл помещали в ячейку прибора и прогревали с постоянной со скоростью, равной 1 град/мин, от 10 до 80°С при постоянном давлении 2,2 атм. В эксперименте по исследованию влияния Hsp27-3D на тепловую денатурацию S1 конечная концентрация S1 была 1,5 мг/мл, a sHsp -1,2 мг/мл. Калориметрические измерения проводили двумя способами: стандартным, когда исследуемый белок помещен в опытную ячейку, а контрольный буфер - в ячейку сравнения, и модифицированным, когда тот же белок помещен в ячейку сравнения, а буфер - в опытную ячейку. В результате во втором случае белковый пик на термограмме оказывался перевернутым, а все артефакты инструментальной базовой линии располагались в тех же местах, что и при стандартных измерениях. Далее из кривой, полученной стандартным образом, вычитали кривую, полученную модифицированным способом. Это позволяло избежать артефактов, вызываемых вычитанием инструментальной базовой линии, и удвоить белковый сигнал. Затем результирующую кривую делили на два для получения реального значения этого сигнала. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до 10"С пробу подвергали повторному прогреву в тех же условиях. Тепловая денатурация S1 была полностью необратимой. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения использовались написанные нами скрипты, исполняемые в среде MatLab (The Math Works, Inc., США).

Исследования температурных зависимостей параметров триптофановой флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Vanan Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком. Исследования проводили при концентрации белка 0,05 мг/мл. Длина волны возбуждения была равна 297 нм (ширина щели 5 нм); записывали либо спектры флуоресценции в диапазоне от 310 до 395 нм (ширина щели 2.5 нм), либо изменения интенсивности флуоресценции при разных длинах волн (320 и 365 нм). Для характеристики формы спектра применяли т. н. параметр А (отношение интенсивности флуоресценции при 320 нм к интенсивности флуоресценции при 365 нм) [Turoverov et al., 1976].

Эксперименты по тепловой инактивации АТРазы S1 проводили, инкубируя раствор S1 с концентрацией 0,5 мг/мл при определенной постоянной температуре в течение различных промежутков времени, после чего пробы охлаждали до 25°С и измеряли К^-ЭДТА-АТРазную активность по высвобождению Р, [Panusz et al., 1970]. Эксперименты по инактивации АТРазы проводили при различных температурах в диапазоне 39-47°С.

Исследования влияния sHsp на инактивацию АТРазы проводились при 43°С при различных весовых соотношениях sHsp/Sl.

Процесс тепловой агрегации S1 регистрировали по приросту кажущейся оптической плотности при 350 им и по приросту среднего гидродинамического радиуса образующихся агрегатов (Ль). Измерения кажущейся оптической плотности проводили на спектрофотометре Сагу-100 (Varian Inc.), снабженном температурной приставкой Biomelt. Прирост А, регистрировали на DLS-спектрометре Photocor Complex (Photocor instruments, США) с гелий-неоиовым лазером 632,8 им и контролируемым нагревом ячейки; полученные результаты обрабатывали с помощью программы DynaLS v2.5.2 (Alango, Израиль). Агрегационные эксперименты проводили либо с постоянной скоростью прогрева ГС/мин, либо путем инкубации при определенной постоянной температуре (от 39"С до 47°С). В исследованиях влияния Hsp27-3D на агрегацию S1 конечная концентрация S1 составляла 0,5 мг/мл, а весовые соотношения sHsp/Sl составляли 1:4, 1:2, 1:1 и 2:1.

При центрифугировании на высоких скоростях крупные агрегаты S1 осаждаются. Если sHsp способны связываться с такими агрегатами, они будут переходить в осадок вместе с SI. Hsp27-3D очень удобен для таких экспериментов по соосаждению. поскольку он неспособен (в отличие от белка дикого типа) образовывать крупные олигомеры и потому не осаждается сам при высокоскоростном центрифугировании. Эти эксперименты проводили, используя ультрацеитрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18°. Растворы S1 с концентрацией 0,5 мг/мл в 30 мМ Hepes-NaOH (рН 7,3), содержащем I мМ MgCU и 100 мМ NaCl, инкубировали в течение различных промежутков времени при 43°С в отсутствие sHsp и в присутствии Hsp27-3D (0,5 мг/мл), после чего охлаждали до 25°С. Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 140000 g. Содержание белков в осадках и супернатантах анализировали методом вертикального SDS-электрофореза в ПААГ [Laemmli, 1970].

Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 и сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью написанных нами скриптов, исполняемых в среде MatLab (The MathWorks, Inc., США) и использующих функции из набора Image Processing Toolbox.

Основные результаты и их обсуждение

Тепловая денатурация изоформ S1

Ранее в нашей лаборатории был разработан новый методический подход для анализа термограмм необратимо денатурирующих мультидоменных белков, суть которого сводится к следующему. На первом шаге анализируется полная термограмма такого белка

и при помощи специальных математических процедур раскладывается на гипотетические одностадийные необратимые переходы (предполагается, что константа скорости для каждого из таких переходов подчиняется уравнению Аррениуса). Для каждого из найденных переходов производится оценка двух параметров уравнения Аррениуса и калориметрической энтальпии (площади под пиком избыточного теплопоглощения). После этого проводится калориметрическая съемка препаратов этого же белка, подвергнутых предварительной инкубации в течение определенных промежутков времени при определенной температуре. Времена и температуры этих инкубаций (отжигов) подбираются таким образом, чтобы полностью элиминировать все калориметрические домены, кроме самого термостабильного, затем - всех, кроме двух самых термостабильных, и т. д. После проведения всех необходимых инкубаций и получения всех термограмм определяются окончательные значения всех параметров каждого из калориметрических переходов данного белка методом многомерной нелинейной оптимизации в пространстве параметров. В качестве входных данных используются все полученные термограммы и условия всех инкубаций одновременно. Вычислительная мощность современных компьютеров это позволяет. Для подтверждения полученных результатов проводится контрольный отжиг, и полученная экспериментально термограмма сравнивается с термограммой, смоделированной на основе рассчитанных значений параметров калориметрических переходов и условий отжига.

Предварительный анализ данных ДСК для 31(А1) и Э1 (А2), полученных как в условиях низкой, так и высокой ионной силы (см. Материалы и Методы), в соответствии с описанным выше алгоритмом позволил предположить наличие трех необратимых тепловых переходов. Мы обозначили их как калориметрические переходы 1, 2 и 3 в порядке роста температуры максимума пика избыточного теплопоглощения. Однако последующий анализ термограмм препаратов, подвергнутых предварительной инкубации, заставил нас прийти к заключению, что переходы 2 и 3 не являются независимыми и должны соответствовать двум последовательным стадиям денатурации одного калориметрического домена. В результате мы предложили модель тепловой денатурации 81, включающую два калориметрических домена, причем более термостабильный домен (обозначенный как домен II) денатурирует в две стадии. Каждая из стадий денатурации (единствешгая для первого домена и две последовательные для второго домена) является полностью необратимой, и температурные зависимости соответствующих констант скорости описывается уравнением Аррениуса. В таблице 1 приведены окончательные оптимальные значения параметров калориметрических переходов для обеих изоформ 81, рассчитанные при двух разных значениях ионной силы: по два параметра уравнения Аррениуса и калориметрическая энтальпия. На Рис. 1А приведены результаты разложения термограммы препарата 81(А1), полученной в условиях высокой ионной силы, на тепловые переходы, рассчитанные исходя из предложенной модели тепловой денатурации

и найденных параметров. Аналогично выглядят результаты разложения термограмм других препаратов S1: как S1(A1) в условиях низкой ионной силы, так и препаратов S1(A2) в условиях низкой или высокой ионной силы.

Температура ("С)

Рис. 1. Тепловая денатурация 81(А1) при высоком значении ионной силы. Скорость сканирования 1 К/мин. (А) Разложение экспериментальной кривой избыточного теплопоглощения (серая пунктирная линия), полученной методом ДСК, на отдельные калориметрические переходы (сплошные линии, цифры соответствуют номеру перехода). Сплошной линией без цифры обозначена сумма трех калориметрических переходов. Видно хорошее совпадение экспериментальной кривой и кривой, полученной в результате оптимизации. (Б) Сопоставление температурной зависимости нормализованного параметра А (кружки) со степенями завершенное™ калориметрических переходов (сплошные линии, цифры соответствуют номеру перехода). Степень завершенности

калориметрического перехода 2 рассчитана как

1 — , перехода 3 - как хв (здесь хн и хв - мольные доли калориметрического домена И в полностью нативном и полиостью денатурированном состоянии).

Из таблицы 1 хорошо видно, что независимо от ионной силы заметные различия между двумя изоформами наблюдаются только в значении параметра I* для калориметрического домена I, которое для Э1 (А 1) на 1,5-2,0 К ниже такового для Б1(А2). Чтобы подтвердить указанную разницу, мы провели дополнительную оптимизационную процедуру. Значение параметра Т для домена I было установлено равным среднему арифметическому его значений для Б1(А1) и Б1(А2) и «заморожено»; все остальные параметры могли изменяться произвольно. Используя полученные в результате такой процедуры значения параметров, мы смоделировали термограммы для препаратов, подвергнутых контрольному отжигу. Смоделированные термограммы значительно отличались от полученных экспериментально, в то время как при использовании значений параметров, приведенных в таблице 1, модельные термограммы почти не отличаются от экспериментальных. В результате мы заключили, что указанное различие между изоформами 81 является достоверным. Учитывая, что структурно изоформы Б1 различаются лишь своими легкими цепями, ассоциированными с регуляторным доменом, можно предположить, что калориметрический домен I соответствует регуляторному домену миозиновой головки, а калориметрический домен II - моторному домену.

Таблица. 1. Значения параметров калориметрических доменов Калориметрическому домену I, денатурирующему в одну стадию, соответствует переход 1. Переходы 2 и 3 соответствуют 1-й и 2-й стадиям денатурации калориметрического домена II. Каждый переход характеризуется тремя независимыми параметрами: калориметрической энтальпией ДЯ и двумя параметрами уравнения Аррениуса ( к{Т) = ехр [(£„/Л) • (£//" - {/Т)\ , где Т - абсолютная температура, II -универсальная газовая постоянная) - энергией активации Е,иТ' (абсолютной температурой, при которой константа скорости к равна 1 мин'1).

Высокая ионная сила (100 мМ КС1)

Параметр Домен I (переход 1) Домен II (переход 2) Домен II (переход 3)

Б 1(А1> 51(А2) 51(А1) 81(А2) 51(А1) 51(А2)

7*, К 317.5±0.4 319.0±0.4 321.2±0.4 321.6±0.4 324.5±0.4 324.7±0.4

Еа, кДж/моль 290±40 265±40 400±40 400±40 340±40 380±40

\Н, кДж/моль 200±20 200±20 1030±100 97Ш00 500±50 300±30

Низкая ионная сила

Параметр Домен I (переход 1) Домен II (переход 2) Домен II (переход 3)

Б1(А1) 51(А2) 81(А1) 81(А2) 81(А1) 51(А2)

319.2±0.4 321.4±0.4 323.0±0.4 323.0±0.4 325.5±0.4 325.6±0.4

Еа, кДж/моль 23(ЬИ0 250±40 350±40 400±40 390±40 390±40

4Н, кДж/моль 370±40 380±40 1260±130 720±70 400±40 260±30

Для подтверждения этого предположения независимым методом мы провели исследование температурной зависимости собственной триптофановой флуоресценции изоформ 81. Хорошо известно, что все остатки Тгр сосредоточены в моторном домене, поэтому следует ожидать, что изменения флуоресцентных свойств Б1 будут происходить в области температур, соответствующих денатурации моторного домена. Необратимая тепловая денатурация (обеих его изоформ как при низкой, так и при высокой ионной силе), происходящая в результате прогрева препарата до 70°С с постоянной скоростью 1 К/мин, сопровождается сдвигом максимума спектра собственной флуоресценции в более коротковолновую область примерно на 3 нм. Во всех случаях такое изменение спектра соответствовало изменению параметра А = /з:о//зб5 (отношения интенсивностей флуоресценции на соответствующих длинах волн) от 1,05-1,07 до 1,30-1,35. Этот так называемый «синий сдвиге спектра флуоресценции был описан ранее [Шныров и др., 1989; Ьеу^ку е( а1, 1991] и до сих пор так и не получил однозначного объяснения. Единственная и очевидная интерпретация этого феномена заключается в том, что в результате необратимой денатурации Б1 остатки Тгр (по крайней мере некоторые из них) оказываются в более гидрофобном окружении, чем они находились в молекуле с нативной структурой. Иначе говоря, необратимая тепловая денатурация Б1 не сводится к тривиальному разворачиванию. Следует, однако, отметить, что детальное исследование феномена «синего сдвига» выходило за рамки нашей работы.

Используя данные, приведенные в таблице 1, мы рассчитали температурные зависимости степеней завершенности трех калориметрических переходов и

сопоставили их с температурной зависимостью нормализованного параметра А (степени завершенности перехода по параметру А). На Рис. 1Б приведены результаты такого сопоставления для препарата 81(А1) в условиях высокой ионной силы. Хорошо видно, что температурные изменения параметра А происходят в области калориметрических переходов 2 и 3, т. е. в области денатурации калориметрического домена II. При этом в области денатурации калориметрического домена I никаких изменений параметра А не наблюдается. Аналогичные результаты были получены и для всех других исследованных препаратов (как для Э1(А1) при низкой ионной силе, так и для 81(А2) независимо от ионной силы). Таким образом, полученные данные позволяют идентифицировать калориметрический домен II как моторный домен 81, а калориметрический домен I - как регуляторный домен.

В наших исследования мы установили, что в диапазоне 39-45°С инактивация АТРазы 81 является реакцией (псевдо-)первого порядка. Это позволяет определить соответствующие константы скорости. Мы рассчитали (используя данные из таблицы 1) константы скорости денатурации калориметрического домена I и первой стадии денатурации калориметрического домена II для температур в указанном диапазоне и сравнили их с рассчитанными по экспериментальным данным константами скоростей инактивации АТРазы. Для всех препаратов 81 при всех исследованных температурах константы скоростей инактивации АТРазы были, во-первых, в пределах погрешности одинаковы для двух изоформ (при условии одинакового значения иокной силы), а во-вторых, очень близки к таковым для первой стадии денатурации калориметрического омена II. Поскольку АТРазный центр локализован в моторном домене 81, полученные езультаты еще раз свидетельствуют в пользу соответствия калориметрического домена II готорному домену 81.

Тепловая агрегация изоформ Б1 в условиях высокой ионной силы

Необратимая тепловая денатурация 81 сопровождается его агрегацией. Для сследования тепловой агрегации 81 мы применили метод ОЬБ, позволяющий егистрировать средний размер частиц, образующихся в процессе агрегации.

В отличие от денатурации, агрегация белков всегда является реакцией заимодействия между 2 и более молекулами белка. Следовательно, хотя бы одна из ее гадай должна быть реакцией второго или более высокого порядка. Иными словами, в бщем случае агрегация белков должна зависеть от их концентрации в растворе. На ис. 2А в полулогарифмических координатах представлены зависимости среднего идродинамического радиуса агрегатов (/4), образующихся в процессе инкубации репаратов 31(А1) с различной концентрацией (0,25-1,0 мг/мл) при 44°С в буфере с ысоким значением ионной силы (100 мМ КС1). Хорошо видно, что в этих условиях грегация 81 (А1), регистрируемая по приросту среднего гидродинамического радиуса грегатов, не зависит от его начальной концентрации в растворе. Абсолютно аналогичное

Концентрация: А

• 0.25 мг/мл

о 0.5 мг/мл

г ■ 1.0 мг/мл

5Я**

аВ*** dp

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i i . i i .

Время инкубации (мин)

" —■ rm,DLS Б :

- ios, домен I

_ * домен Н

"..............

3.12 3.1« 3,16 3.1S 3.2 3.22

шчоЧк"1)

Рис. 2. Агрегация S1(A1) в условиях высокой ионной силы (100 мМ KCl). Распределение гидродинамических радиусов образующихся агрегатов было унимодальным в течение времени наблюдения во всех экспериментах. (А) Кинетика прироста Rh в процессе инкубации при 44°С препаратов S1(A1) с различной начальной концентрацией. (Б) Сопоставление температурных зависимостей величины параметра tm процесса роста Ли (серая пунктирная линия) и времен полураспада (/о 5 = 1п(2)/к, к - константа скорости) калориметрического домена I (черная пунктирная линия) и первой стадии денатурации калориметрического домена II (сплошная черная линия). Величины 6r приведены с 95% доверительным интервалом; погрешности величин io.s рассчитаны как косвенные погрешности, вызванные погрешностями в значениях параметров калориметрических доменов (см. таблицу 1) и погрешностью в температуре инкубации (принята равной 0,5"С). (В) Температурная зависимость роста Rh (окружности и пунктирная линия) в сравнении со степенями завершенности калориметрических переходов (сплошные линии, цифры соответствуют номеру перехода), которые рассчитаны так же, как на Рис. 1Б. Скорость нагрева 1°С/мин, концентрация белка в DLS эксперименте 0,5 мг/мл.

Температура ("О

поведение в этих условиях (100 мМ КС1) демонстрировала изоформа 81(А2), а также смешанный (не разделенный на изоформы) препарат Б1 (последний - даже в более широком диапазоне концентраций: 0,125-2,0 мг/мл). Кроме того, из Рис. 2А хорошо видно, что зависимости Ли от времени инкубации очень хорошо описываются возрастающими экспонентами (в полулогарифмических координатах экспонента выглядит как прямая). Такие экспоненты могут быть охарактеризованы параметром Ы, имеющим физический смысл времени удвоения Ль. Оптимальные значения этого параметра были рассчитаны и составили 4,5±0,4 мин (95%-й доверительный интервал, инкубация при 44°С) для обеих изоформ 81 при всех исследованных концентрациях белка. Отсутствие концентрационной зависимости, а также экспоненциальный характер процесса роста Ль свидетельствуют о том, что агрегация 81 в этих условиях (100 мМ КС1) лимитируется какой-то реакцией первого порядка.

Чтобы лучше понять механизм тепловой агрегации Б1, мы исследовали влияние ¡мпературы на величину параметра (-к. Важно отметить, что при всех исследованных ¡мпературах кривые прироста гидродинамического радиуса хорошо описываются хпонентами, что позволяет рассчитать значения этого параметра. На Рис. 2Б эедставлена зависимость значений /ж от температуры инкубации (серая пунктирная гния) для Б1 (А I) в условиях высокой ионной силы в сопоставлении с периодами элураспада калориметрических доменов этого же препарата, рассчитанными по данным [блицы 1. Хорошо видно, что значения времени удвоения гидродинамического радиуса регатов в пределах погрешности совпадают с временами полураспада первой стадии гнатурации калориметрического домена II (черная сплошная лшшя). Абсолютно «логичные результаты были получены и дня препарата 81(А2). Поскольку шориметрический домен II идентифицирован нами как моторный домен 51, мы можем ислючить, что в этих условиях (100 мМ КС1) именно первая стадия денатурации оторного домена лимитирует процесс его тепловой агрегации. Также необходимо эдчеркнуть, что в этих условиях как времена полураспада первой стадии денатурации оторного домена, так и времена удвоения Д, одинаковы (при одной и той же температуре) обеих изоформ 51, т. е. в смысле кинетики тепловой агрегации смешанный препарат Б1 :дет себя как гомогенный.

Известно, что агрегация белков характеризуется наличием некоторой лаг-фазы - фазы уклеации, необходимой для образования зародышей агрегации, т. н. «стартовых -регатов». Чтобы установить наличие этой стадии в процессе агрегации Б1 в условиях ысокон ионной силы (100 мМ КС1), мы исследовали температурные зависимости рироста Дь в процессе нагрева с постоянной скоростью 1 К/мин. Эти зависимости были динаковы для обеих изоформ 81 и не зависели от концентрации белка в диапазоне 0,25,0 мг/мл вплоть до значений Ли 3000 нм. На Рис. 2В приведено сопоставлешк :мпературной зависимости Ль (пунктирная линия и окружности) с температурными 1висимостями степеней завершенности трех калориметрических переходов Б1 (сплошные инии, цифры соответствуют номеру перехода) для 81(А1). Хорошо видно, что между ервой стадией денатурации калориметрического домена II (переход 2), лимитирующей роцесс агрегации Б1 в этих условиях, и процессом быстрого роста Ль имеется задержка в есколько градусов. Для 81(А2) наблюдалась абсолютно аналогичная картина. Исходя нз того, мы можем заключить, что в процессе тепловой агрегации 81 присутствует стадия уклеации. Формирование «стартовых агрегатов» требует некоторого времени, что и оуславливает наблюдаемую задержку.

Исходя из полученных данных, можно предложить следующий механизм тепловой грегации 81. Первая стадия этого процесса - это нуклеация, когда несколько частично ли полностью денатурированных молекул слипаются, образуя «стартовый агрегат» -фодыш для дальнейшей агрегации. Дальнейший рост этого зародыша осуществляется за

счет налипания отдельных молекул 81, моторный домен которых находится на стадии кинетического интермедиата. Причем скорость реакции налипания таких молекул на агрегат значительно превышает скорость первой стадии денатурации моторного домена, которая и лимитирует в итоге весь процесс роста агрегатов. Дальнейшая денатурация моторного домена (вторая стадия, калориметрический переход 3) происходит, по-видимому, после того, как молекула оказывается включенной в состав агрегата. Такой механизм агрегации 81 не укладывается в предложенную ранее схему [Магкоя$1ап е/ а\., 2009], в соответствии с которой рост радиуса агрегатов происходит в результате слипания «стартовых агрегатов», а не налипания денатурированных молекул белка на некий зародыш агрегации. Однако полученные нами данные позволяют однозначно отдать предпочтение именно предлагаемой нами схеме. Следует, однако, отметить, что схема, описанная в работе [Магко$51ап е/ а/., 2009], очень хорошо описывает тепловую агрегацию всех исследованных ранее белков. Тот факт, что агрегация 81 в условиях высокой ионной силы в нее не укладывается, свидетельствует о том, что нами впервые обнаружен альтернативный механизм тепловой агрегации, который не встречался у исследованных ранее белков.

Тепловая агрегация изоформ 81 в условиях низкой ионной силы

В ранних исследованиях [Ьеу^ку е? а!., 1991] было показано, что в условиях низкой ионной силы (20 мМ Нерев) изоформы 81 существенно различаются по характеру своей тепловой агрегации: в процессе нагрева с постоянной скоростью 81(А1) агрегирует при значительно более низкой температуре, чем 81(А2). В нашей работе мы воспроизвели эти результаты, а заодно проанализировали зависимость агрегации от начальной концентрации белка. На Рис. 3 приведены температурные зависимости агрегации (зарегистрированные по приросту кажущейся оптической плотности при 350 нм и затем нормализованные) 81(А1) (А) и 81(А2) (Б), полученные при двух концентрациях белка: 0,25 мг/мл (окружности и сплошные линии) и 2,0 мг/мл (перевернутые треугольники и сплошные линии). Хорошо видно, что в этих условиях (при низкой ионной силе) снижение концентрации белка оказывает сильное влияние на характер тепловой агрегации 81(А1), смещая кривую агрегации в сторону более высокой температуры, при этом влияние концентрации на тепловую агрегацию 81(А2) выражено намного слабее. Для сравнения на этом же рисунке представлены температурные зависимости степеней завершенности трех калориметрических переходов 81 (пунктирные линии, цифры соответствуют номеру перехода), рассчитанные с использованием данных таблицы 1. Сопоставляя эти кривые с температурными зависимостями агрегации изоформ Б1, можно сделать следующие выводы. Агрегация 81(А2) в этих условиях (Рис. ЗБ), как и при высокой ионной силе, является следствием тепловой денатурации этой изоформы 81, скорее всего - ее моторного домена (переходы 2 и 3), денатурация которого, по-видимому, в значительной степени лимитирует процесс агрегации этой изоформы и в условиях низкой ионной силы. Ничего

Рис. 3. Сопоставление нормализованных кривых прироста кажущейся оптической плотности при 350 нм, полученных в условиях низкой ионной силы при начальной концентрации белка 0,25 мг/мл (окружности и сплошные линии) и 2 мг/мл (перевернутые треугольники и сплошные линии), со степенями завершенности калориметрических переходов (пунктирные линии, цифры соответствуют номеру перехода), которые рассчитаны так же, как на Рис. 1Б. Скорость нагрева 10С/мин. (А) - Я1 (А1); (Б) - Я1 (А2).

25 30 35 40 45 50 55 60 Температура СО

одобного нельзя, однако, сказать о тепловой агрегации S1(A1) в этих условиях (Рис. ЗА). . этом случае отсутствует однозначная связь между тепловой денатурацией и агрегацией 1(А1). Более того, хорошо видно, что при относительно высокой концентрации белка > мг/мл) агрегация S1(A1) начинается при довольно низких температурах (ниже 35°С) и аже слегка опережает денатурацию самого термолабильного домена I (Рис. ЗА). Это озволяет предположить, что при низкой ионной силе агрегация S1(A1) не является рямым следствием тепловой денатурации белка, будучи по крайней мере отчасти бусловленной взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи AI другими молекулами S1. Представляется совершенно очевидным, что вероятность таких ежмолекулярных взаимодействий должна существенно возрастать при повышении онцентрации белка. Более того, можно ожидать, что при низкой ионной силе агрегация 1(А1), обусловленная межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента егкой цепи AI, может медленно происходить и при низкой температуре.

Рис. 4. Спектры поглощения препарата S1(A1) (1 мг/мл), хранившегося при 4°С в условиях низкой ионной силы (20 мМ Hepes, pH 7.3, 1 мМ MgCl2.), полученные до (1) и после (2) добавления KCl до конечной концентрации 100 мМ. Кривая 3, полученная путем экстраполяции длинноволнового отрезка спектра в коротковолновую область, отражает светорассеяние образца S1(A1) при низкой ионной силе во всем волновом диапазоне, а кривая 4 представляет собой результат вычитания кривой 3 из кривой 1.

Длина волны (нм)

Это предположение подтверждается экспериментально. На Рис. 4 представлен спектр поглощения препарата S1(A1), хранившегося в условиях низкой ионной силы в течение ночи при 4°С (кривая 1, сплошная черная линия). Видно, что такой препарат демонстрирует высокий уровень светорассеяния, проявляющегося в аномально высокой кажущейся оптической плотности в области 320-360 нм, где отсутствует поглощение белка (кривая 1). Такое светорассеяние полностью исчезает после добавления к препарату KCl до конечной концентрации 100 мМ (кривая 2, сплошная толстая серая линия). Путем экстраполяции длинноволнового отрезка спектра поглощения S1(A1), хранившегося при низкой ионной силе, в коротковолновую область мы рассчитали величину светорассеяния образца по всему волновому диапазону (255-360 нм) и вычли полученную кривую (кривая 3, короткий пунктир) из спектра поглощения S1(A1) при низкой ионной силе (кривая 1). Полученная кривая 4 (длинный пунктир), представляющая собой чистый спектр поглощения S1(A1) без вклада светорассеяния, ничем не отличалась от спектра поглощения S1(A1), полученного в присутствии 100 мМ KCl. Важно отметить, что при хранении препаратов S1(A2) в таких же условиях ничего подобного не наблюдается. Поскольку единственное отличие S1(A1) от S1(A2) - это наличие дополнительного N-концевого сегмента в легкой цепи AI, то представляется вполне очевидным, что агрегация S1(AI) в условиях низкой ионной силы, происходящая при низкой температуре, обусловлена взаимодействиями N-концевого сегмента легкой цепи AI либо с аналогичным сегментом легкой цепи, либо с моторным доменом другой молекулы S1. Такая агрегация является полностью обратимой, поскольку образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора; в этом отношении она коренным образом отличается от необратимой агрегации, вызываемой тепловой денатурацией белка, которая сопровождается слипанием денатурированных молекул.

Напоследок хотелось бы высказать несколько соображений о возможных механизмах влияния такого межмолекулярного взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи AI на процесс тепловой агрегации изоформы S1, содержащей эту легкую цепь. С одной стороны, мы можем ожидать усиления таких взаимодействий с ростом температуры, и тогда наблюдаемая тепловая агрегация (как, например, на Рис. ЗА) является комбинацией двух различных процессов: обратимой агрегации, обусловленной межмолекулярными взаимодействиями нативных молекул, и необратимой - вызванной слипанием денатурированных молекул. Нельзя также исключить влияния этого межмолекулярного взаимодействия непосредственно на процесс необратимой денатурационной агрегации - например, за счет облегчения нуклеации, которая в этом случае может происходить еще до денатурации. Межмолекулярные взаимодействия N-концевого сегмента AI, по-видимому, в значительной степени подавляются при повышении ионной силы. Этим и объясняется тот факт, что в условиях высокой ионной силы(100 мМ KCl) тепловая агрегация изоформ S1 протекает одинаково.

Влияние малых белков теплового шока (sHsp) на тепловую денатурацию S1 и инактивацию его А ТРазы

Перейдем теперь к рассмотрению вопросов о взаимодействии sHsp с S1. Наши сследования в этой области мы начали с того, что попытались воспроизвести результаты чериканских авторов [Melkani et aL, 2006] о влиянии sHsp на тепловую инактивацию ТРазного центра миозина, который, как известно, располагается в моторном домене иозиновой головки (S1). Поскольку инактивация АТРазы S1 обусловлена денатурацией го моторного домена и протекает одинаково у обеих изоформ S1, то такие исследования ожно проводить на смешанном (не разделенном на изоформы) препарате S1. Мы сследовали влияние Hsp27 (как дикого типа, так и Hsp27-3D) на тепловую инактивацию ,*-ЭДТА- и Са2+-АТРазы S1 при различных весовых соотношениях Sl/sHsp (2:1,4:1 и 8:1). о всех случаях мы не обнаружили никакого влияния sHsp на инактивацию АТРазы S1 в роцессе инкубации при 43°С. Характерный ход кривых инактивации представлен на ис. 5. Мы также исследовали влияшю Hsp27-3D на инактивацию Са2+-АТРазы целого иозина при тех же концентрациях белков (0,04 мг/мл) и при том же весовом соотношении tisp/миозин (1:1), что и в работе [Melkani et al., 2006] и опять не обнаружили никакого нцитного эффекта sHsp на АТРазную активность миозина. Исходя из этого, можно было ы предположить, что защита миозиновой АТРазы от тепловой инактивации является никальным свойством аВ-кристаллина, который использовался в работе американских второе. Чтобы проверить это предположение, мы исследовали влияние смешанного репарата аА- и аВ-кристаллина (3:1 w/w) (коммерческий препарат а-кристаллина (Sigma)) на инактивацию АТРазы миозина при концентрации последнего 0,04 мг/мл. Но аже в этом случае (при весовых соотношениях миозин/а-кристаллин, равных 1:1, 1:2 и аже 1:4) мы не обнаружили никакого защитного эффекта. Наконец, мы не обнаружили икакого влияния очищенного рекомбинантного аВ-кристаллина на инактивацию Са2+-АТРазы S1 при весовых соотношениях Sl/sHsp, равных 1:1 и 1:2. Таким образом, олучеиные нами данные свидетельствуют о том, что sHsp не влияют на тепловую инактивацию АТРазы как целого миозина, так и его субфрагмента 1, которая является следствием тепловой денатурации моторного домена головки миозина. Что касается

Рис. 5. Кинетика тепловой инактивации К*-ЭДТ А-АТРазы S1 (0,5 мг/мл) в процессе инкубации при 43°С в отсутствие sHsp и в присутствии Hsp27 wt либо Hsp27-3D (в обоих случаях весовое соотношение Hsp/Sl составляло 1:4). За 100% принята АТРазная активность 0,49 (± 10%) мкмоль Р в мин на 1 мг белка.

J_>_I-1-1_L-1-1-1-.-1-1-!-

0 5 10 15 20 25 30 Время инкубации (мин)

30 35 40 46 60 66 80 66 70 75 ВО Температура (°С)

».I - 81 + Н8р27-30

1/| — Нзр27-30

'Л

- в1

Рис. 6. Термограммы чистого (1,5 мг/мл), чистого Нзр27-30 (1,2 мг/мл) и смеси 81 (1,5 мг/мл) с №р27-30 (1,2 мг/мл), полученные методом ДСК. Скорость нагрева 1 К/мин. Температура максимума пика 81: 47,6°С в отсутствие вНвр и 47,70С в присутствии Нзр27-30; калориметрическая Э1ггальпия пика 81 составляла 1380 кДж/моль в обоих случаях. Температура максимума и калориметрическая энтальпия пика для свободного Няр27-30: 70,8"С и 100 кДж/моль; для Нвр27-30 в присутствии 51: 68,2°С и 70 кДж/моль соответственно.

данных, полученных американскими авторами [Ме!каш е! а!., 2006], то они, по-видимому, являются экспериментальным артефактом.

Если малые белки теплового шока не влияют на тепловую инактивацию АТРазы 81, то, скорее всего, они не должны влиять и на тепловую денатурацию головки миозина, по крайней мере его моторного домена. Для проверки этого предположения мы провели калориметрический эксперимент, результаты которого представлены на Рис. 6. Поскольку в первую очередь нас интересовал вопрос о возможном влиянии БНзр на тепловую денатурацию 81, а не детальный механизм этого влияния, в этом эксперименте использовался смешанный препарат 81. Из Рис. 6 хорошо видно, что кривые теплопоглощения препаратов 81, полученные в отсутствие и в присутствии 1^27-30, практически идентичны (различие в энтальпии пиков 81 находится в пределах погрешности метода), из чего следует вывод, что Нвр27-30 не оказывает влияния на тепловую денатурацию 81. Однако присутствие денатурированного 81 оказывает заметное влияние на тепловую денатурацию Шр27-ЗВ. Это выражается в смещении максимума теплового перехода Н5р27-30 на 2,6°С в область более низких температур и уменьшении энтальпии перехода примерно на 30%. Такое изменение свойств Шр27-30 свидетельствует в пользу того, что он образует комплексы с денатурированным 81.

Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию 57

Для изучения влияния БНвр на агрегацию 81 мы применили метод ОЬ8, позволяющий регистрировать кинетику прироста среднего гидродинамического радиуса агрегатов (А,) в процессе инкубации при 43°С. Все эксперименты были выполнены только в условиях высокой ионной силы (100 мМ КС1), близкой к ее физиологическому значению. Работать при таком значешш ионной силы особенно удобно, т. к. в этих условиях тепловая агрегация обеих изоформ 81 протекает одинаково, не зависит от начальной концентрации 81 в широком диапазоне его концентраций и лимитируется первой стадией денатурации моторного домена головки миозина. Поэтому в этой серии экспериментов мы использовали смешанный (не разделенный на изоформы) препарат 81. Результаты

Время инкубации (мин)

Рис. 7. Влияние Hsp27-3D на кинетику тепловой агрегации S1 (0,5 мг/мл) в процессе инкубации при 43ГС, регистрируемую методом DLS по приросту Rb. Кривая 1 соответствует S1 в отсутствие sHsp; кривые 2-5 - S1 в присутствии Hsp27-3D. Весовые соотношения Hsp27-3D/Sl составляли 1:4, 1:2, 1:1 и 2:1 для кривых 2, 3, 4 и 5 соответственно. Распределение

гидродинамических радиусов

образующихся агрегатов было унимодальным в течение времени наблюдения во всех экспериментах.

кспериментов приведены на Рис. 7. Кривая 1 соответствует препарату без вШр. Хорошо видно, что присутствие Нзр27-!Ш частично или полностью подавляет рост Я» (кривые 2-5). Защитный эффект Шр27-30 на процесс агрегации зависит от весового соотношения аНхр/Эк по мере его увеличения он усиливается (кривые 2 и 3), а при достижении им величины 1:1 рост агрегатов подавляется почти полностью (кривая 4). Дальнейшее увеличение этого соотношения уже не оказывает влияния на процесс тепловой агрегации Б1 (см. кривые 4 и 5), поэтому мы можем заключить, что при весовом соотношении, равном 1:1, достигается некое насыщение. По-видимому, при этом весовом соотношении образуются комплексы с Шр27-30, в которых все «липкие участки» на молекуле частично или полностью денатурированного Б1 полностью экранированы за счет взаимодействия с малым белком теплового шока.

Рассмотрим теперь вопрос о стехиометрии взаимодействия с Шр27-ЗВ. Допустим, что она постоянная и не зависит от весового соотношения Н5р27/'Э 1. Если это так, то при ненасыщающих весовых соотношениях Шр27/81 (меньше 1:1) мы должны наблюдать расщепление распределения гидродинамических радиусов образующихся агрегатов на две субпопуляции, одна из которых соответствовала бы 81, полностью насыщенному малым белком тепловго шока, а другая - избыточному 81, лишенному вНвр. частиц первой субпопуляции оставался бы почти неизменным во время инкубации, в то время как во второй субпопуляции наблюдался бы быстрый рост . Однако при всех весовых соотношениях распределение гидродинамических радиусов образующихся агрегатов оставалось строго унимодальным (по крайней мере в течение тех промежутков времени наблюдения, для которых на Рис. 7 приводятся временные зависимости Дь). Таким образом, мы можем заключить, что стехиометрия взаимодействия 81 с вНвр варьирует в зависимости от весового соотношения бИбр/Э! . Следует подчеркнуть, что этот вывод о стехиометрии взаимодействия хорошо согласуется с представлением о том, что в клетке вНвр не обладают высокой специфичностью к своим мишеням.

Нами установлено, что в условиях высокой ионной силы агрегация чистого S1 (в отсутствие sHsp) полностью лимитируется первой стадией денатурации его моторного домена, иными словами - каждое столкновение уже существующего агрегата с другими молекулами S1, у которых моторный домен частично денатурирован, приводит к слипанию. Отметим, что кривые 1-3 на Рис. 7 являются экспонентами, т. е. в тех случаях, когда рост агрегатов не подавлен полностью, агрегация S1 в присутствии Hsp27-3D (как и в его отсутствие) лимитируется какой-то реакцией первого порядка, которая, однако, как это хорошо видно из Рис. 7, протекает медленнее, чем агрегация S1 в отсутствие sHsp. Следовательно, присутствие в системе sHsp привносит новую лимитирующую скорость стадию в процесс тепловой агрегации S1. Кроме того, скорость этой новой лимитирующей стадии тем меньше, чем выше весовое соотношение sHsp/Sl (оптимальное значение Ья (95% доверительный интервал) составляет 5.3±0.1 мин для чистого S1 (кривая 1 на Рис. 7) и увеличивается до 9.1±0.7мин и 14.8±0.5 мин при весовом соотношении Hsp27-3D/Sl, равном 1:4 (кривая 2) и 1:2 (кривая 3) соответственно). Почти полное подавление роста Ль при весовом соотношении 1:1 и выше можно формально интерпретировать как приближение скорости этой стадии к нулю. Исходя из этого, можно предположить, что в присутствии sHsp имеет место образование комплексов частично или полностью денатурированного S1 с шапероном. Это сопровождается частичным или полным (в зависимости от весового соотношения sHsp/Sl) экранированием «липких участков» на поверхности S1, что приводит к уменьшению вероятности слипания при столкновении (которая зависит от суммарной площади доступных для взаимодействия «липких участков»). При низких весовых соотношениях sHsp/Sl (ниже 1:1) образуются комплексы Sic Hsp27-3D, в которых не все липкие участки на поверхности частично или полностью денатурированного S1 экранированы от растворителя. По мере увеличения весового соотношения изменяется стехиометрия образующихся комплексов таким образом, что на одну молекулу S1 приходится больше молекул Hsp27-3D, и в результате суммарная площадь не экранированных «липких участков» уменьшается, приближаясь к нулю при весовом соотношении 1:1.

Аналитическое соосаждепие Hsp27-3D с S1

Интерпретируя результаты экспериментов по изучению влияния sHsp на тепловую агрегацию S1, мы предположили образование комплексов S1 с Hsp27-3D. Чтобы проверить это предположение, была поставлена серия экспериментов по аналитическому соосаждению S1 с Hsp27-3D. Мы использовали смешанный (не разделенный на изоформы) препарат S1, т. к. эти эксперименты проводились в условиях высокой ионной силы (100 мМ NaCl). В качестве шаперона был выбран Hsp27-3D, неспособный образовывать крупные олигомеры. Нами было экспериментально показано, что даже после инкубации его раствора при 43"С в течение часа Hsp27-3D не осаждается при высокоскоростном центрифугировании и весь остается в супернатанте. Это значит, что свободный (т. е. не

ЕЭ Время(мин) О 10 20 30 60 ш^Л »«» —НС

^Hsp

г j «за с ■•■>«-•♦ ~~ ^LC» —-------------------— LC3

Рис. 8. Аналитическое соосаждение Hsp27-3D с S1. Приведены элекгро-фореграммы супернатантов, полученных после ультрацентрифугирования образцов чистого S1 (0,5 мг/мл) (А) и смеси S1 (0,5 мг/мл) с Hsp27-3D (0,5 мг/мл) (Б), предварительно прогретых в течение различных промежутков времени при 43°С. Для каждой дорожки указано время инкубации. Обозначения: НС - тяжелая цепь SI; Hsp - Hsp27-3D; LCI, LC3 -«щелочные» легкие цепи миозина А1 и А2 соответственно. (В) Количественный анализ результатов, представленных на (А) и (Б): исчезновение S1 (кривая 2) и Hsp27-3D (кривая 3) из супернатантов в процессе инкубации их смеси; кривая 1 соответствует S1, инкубированному в отсутствие Hsp27-3D. Содержание S1 в супернатантах отслеживалось по содержанию его тяжелой цепи. Точки на графике - средние значения ± SD трех независимых экспериментов.

п Время (мин) О 10 15 20 30 60

вовлеченный в комплексы с Б1) Н5р27-30 всегда будет оставаться в супернатанте при ультрацентрифугировании. Смесь белков или чистый 51 прогревали при 43°С в течение различных промежутков времени, после чего препараты охлаждали, подвергали ультрацентрифугированию (20 мин при 140000 g) и исследовали содержание 81 и Шр27-ЗВ в супернатантах. Типичные электрофореграммы супернатантов представлены на Рис. 8А (81 без кНвр) и Рис. 8Б (81 в присутствии Нзр27-30, весовое соотношение 1:1). На Рис. 8В приведены результаты количественной обработки этих электрофореграмм. Исчезновение 81 из супернатантов регистрировалось по исчезновению его тяжелой цепи (обозначена как НС на Рис. 8А,Б). Можно видеть, что Нзр27-30 замедляет, но не предотвращает переход в осадок. Кроме того, количество этого шаперона в супернатанте тоже уменьшается по мере инкубации его смеси с при 43°С. Исчезновение Н5р27-ЗЭ из супернатантов хорошо коррелирует с исчезновением 81 (коэффициент корреляции между количествами НС-81 и Шр27-30 в супернатанте равен 0,9094). Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что в этих условиях Шр27-30 образует прочные комплексы с частично или полностью денатурированным 81 и включается в состав образующихся агрегатов.

Выводы

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проведен детальный сравнительный анализ тепловой денатурации двух изоформ изолированной головки миозина (субфрагмент 1 миозина, 81), содержащих разные «щелочные» легкие цепи: А1 и А2. Показано наличие в молекуле 81 двух калориметрических доменов (т. е. участков, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга), причем более термостабильный домен денатурирует в 2 стадии.

2. На основании сопоставления данных ДСК, собственной триптофановой флуоресценции и инактивации АТРазы проведена идентификация калориметрических доменов Б1. Установлено, что более термостабильный из них отражает тепловую денатурацию моторного домена миозиновой головки, а менее термостабильный соответствует регуляторнному домену головки. Показано, что две изоформы 81 различаются лишь по параметрам тепловой денатурации регуляторного домена.

3. Установлено, что в условиях высокой ионной силы (в присутствии 100 мМ КС1) тепловая агрегация двух изоформ 81 протекает с одинаковой скоростью, которая лимитируется первой стадией денатурации моторного домена.

4. Показано, что в условиях низкой ионной силы БI (А I) существенно отличается от 81(А2) по механизму тепловой агрегации. Это обусловлено взаимодействиями дополнительного №концевого сегмента легкой цепи А1, отсутствующего у А2, с другими молекулами Б1. Такие взаимодействия, сопровождаемые обратимой агрегацией 81(А1), имеют место даже при неденатурирующих условиях.

5. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния на тепловую денатурацию 81 и инактивацию миозиновой АТРазы, однако эффективно подавляют тепловую агрегацию за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами 81.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Markov D.I.. Pivovarova A.V., Chernik I.S., Gusev N.B., Levitsky D.I. (2008) Small heat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPase inactivation. FEBSLett., 582, 1407-1412.

2. Марков Д.И.. Николаева О.П., Левицкий Д.И. (2010) Влияние «существенной» легкой цепи А1 миозина на агрегационные свойства миозиновой головки. Acta Naturae, 2, № 2(5), 81-85.

3. Markov D.I.. Zubov E.O., Nikolaeva O.P., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) Thermal denaturation and aggregation of myosin subfragment 1 isoforms with different essential light chains. International Journal of Molecular Sciences, 11,4194-4226.

Тезисы докладов:

1- Markov D.I.. Gusev N.B., Levitsky D.I. (2008) Interaction of myosin subfragment 1 with small heat shock proteins. Abstracts of the International Symposium "Biological Motility: Achievements and Perspectives " (Pushchino, Moscow Region, May 11-15,2008), p. 4041.

2. Markov D.I.. Pivovarova A.V., Levitsky D.I., Gusev N.B (2008) Analysis of effect of human small heat shock protein Hsp27 on thermal denaturation of skeletal muscle myosin and actin. Abstracts ofXXXVIl European Muscle Conference (Keble College, Oxford, UK, September 13-16, 2008), p. 101.

3. Левицкий Д.И., Пивоварова A.B., Марков Д.И.. Гусев Н.Б. (2009) Как малые белки теплового шока защищают актин и миозин от агрегации в условиях стресса. Тезисы докладов IVРоссийского симпозиума «Белки и пептиды» (г. Казань, 23-27 июня 2009 г.) с. 64.

4. Марков Д.И. (2010) Механизм тепловой денатурации и агрегации субфрагмента 1 миозина. Тезисы докладов XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва 12-15 апреля 2010 г.), с. 57.

5. Markov D.T.. Zubov Е.О., Nikolaeva О.Р., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) Thermally induced denaturation and aggregation of myosin subfragment 1: new insight and proposed mechanism. Abstracts of International Symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies " (Pushchino, Moscow region, Russia, May 11-15,2010), p. 164-165.

6. Markov D.I.. Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) New insight into the mechanism of thermal denaturation and aggregation of the myosin head. FEBS J., v. Ill, Suppl. 1, p. 290. (Abstracts of the 35'H FEBS Congress and YSF20I0, Gothenburg, Sweden, June 23 -July 1,2010).

Данный автореферат разрешается перепечатывать и копировать частично или полностью при выполнении следующих условий:

1. материал воспроизводится в неизменном виде;

2. указывается ссылка на источник;

3. перепечатывание или копирование производится в некоммерческих целях.

Марков Д. И.

Подписано в печать 11 ноября 2010 г. Объем 1,0 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 837 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марков, Денис Игоревич

Список используемых обозначений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Структура и основные свойства миозина

2. Структура хмиозиновой головки.

3. Легкие цепи миозина.

4. Применение метода ДСК для исследования S1.

5. Новый подход к анализу необратимой тепловой денатурации мультидомен-ных белков (по [Зубов, 2001] с изменениями).

6. Агрегация белков, вызванная их тепловой денатурацией.

7. Малые белки теплового шока.

8. Взаимодействие малых белков теплового шока с миозином.

Глава 1. Материалы и методы

1.1. Разглицеринизация миозина.

1.2. Получение SI [Weeds, Taylor, 1975].

1.3. Определение концентрации белков.

1.4. Определение АТРазной активности.

1.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS.

1.6. Исследование тепловой денатурации S1 методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

1.7. Расчет и вычитание химической базовой линии в ДСК экспериментах

1.8. Исследование температурных зависимостей флуоресцентных свойств S

1.9. Тепловая инактивация АТРазы S1 и миозина.

1.10. Исследование агрегации S1 методом регистрации светорассеяния.

1.11. Метод динамического лазерного светорассеяния (DLS).

1.12. Аналитическое соосаждепис.

1.13. Расчетные процедуры

Глава 2. Результаты и их обсуждение

2.1. Исследование тепловой денатурации изоформ методом ДСК.

2.2. Тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценции изоформ

2.3. Тепловая инактивация АТРазы

2.4. Тепловая агрегация изоформ в условиях высокой ионной силы.

2.5. Тепловая агрегация изоформ в условиях низкой ионной силы.

2.6. Влияние малых белков теплового шока на индуцируемую нагреванием инактивацию АТРазы и миозина.

2.7. Влияние Нзр27-ЗВ на тепловую денатурацию

2.8. Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию Э1.

2.9. Исследование комплексов, образуемых Нзр27-31) с в процессе совместной инкубации при 43 °С, методом аналитического соосаждения.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации"

Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высо-коконсервативиого участка, который получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. Практически все sHsp формируют крупные олигомерные комплексы, различающиеся по своей структуре и количеству мономеров [Haslbeck, 2002]. Показано наличие зависимости шапероноподобной активности sHsp от их четвертичной структуры [Shashidharamurthy et al, 2005; Lelj-Garolla, Mauk, 2006]. Кроме того, эти белки могут подвергаться фосфорилированию под действием различных иротеинкиназ, что также отражается как на их олигомерной структуре, так и на шапероноподобной активности [Haslbeck, 2002; Гусев и др., 2002; Rogalla et al., 1999].

В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них наиболее подробно изучены а А- и агВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl). Как Hsp27, так и аВ-кристаллин экспрессируются в большом количестве в мышечной ткани, и их содержание увеличивается в ответ на различные повреждающие воздействия. Весьма вероятно, что одна из функций этих белков - это взаимодействие с актином и миозином (главными белками сократительного аппарата мышц) при неблагоприятных условиях. Изучению взаимодействия sHsp с актином было посвящено довольно много работ; в частности, было показано, что эти белки не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не влияют на процесс тепловой денатурации актина, но при этом эффективно предотвращают его тепловую агрегацию, образуя небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином [Pivovarova et al, 2005; Pivovarova et al., 2007]. Значительно меньше было известно о взаимодействии sHsp с миозином. К моменту начала наших исследований этому вопросу была посвящена всего одна работа [Melkani et al., 2006], в которой было показано, что в условиях, имитирующих тепловой шок (инкубация при 43 °С), аВ-кристаллин не только предотвращает агрегацию скелетномышечного миозина, но также частично подавляет инактивацию его АТРазы. Исходя из полученных результатов, авторы указанной работы заключили, что в условиях теплового шока эНвр могут взаимодействовать с головками миозина и предотвращать их тепловую денатурацию (приводящую к агрегации и инактивации АТРазы) [Ме1каш еЬ а1., 2006]. Подобные заключения, однако, представлялись нам весьма странными, особенно в-, свете результатов исследований взаимодействия вНвр с актином. Вследствие этого, одной из целей даиной работы стало подробное исследование влияния яНэр на процессы тепловой денатурации и агрегации миозиновой головки. Важно отметить, что сам процесс тепловой агрегации миозиновой головки ранее почти не исследовался (особенно в условиях физиологической ионной силы), поэтому другой не менее важной целью настоящей работы было детальное исследование этого процесса.

Головки миозина могут быть изолированы путем ограниченного протеолиза молекул скелетномышечного миозина. Изолированная головка (называемая субфрагментом 1 миозина (81)) состоит из двух главных структурных доменов - моторного (или каталитического, содержащего активный центр АТРазы и участки связывания с актином) и регуляторного. Последний (в случае 81, полученного путем химотрипсинолиза в отсутствие двухвалентных катионов) представляет собой длинную а-спираль, с которой неко-валентно ассоциирована «существенная» (или «щелочная») легкая цепь. Эта легкая цепь существует в виде двух изоформ: А1 и А2. Основное отличие А1 от А2 - это наличие у нее дополнительной М-концевой последовательности из 41 остатка. Поэтому препарат 81, получаемый из миозина скелетных мышц, представляет собой смесь двух изоформ, содержащих только одну из этих легких цепей: 81 (А1) или 81(А2).

Исследованию тепловой денатурации 81 посвящено довольно много работ. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было установлено, что она полностью необратима; применение подхода «последовательного отжига» позволило выявить три тепловых перехода [Шныров и др., 1989; Ьеуйэку еЬ а1,1990; 1991; 1992]. Были также сделаны попытки идентификации этих калориметрических переходов, т. е. выявления их соответствия определенным структурным доменам 81 [ЬеугЬэку, 1994]. Стоит, однако, отметить, что метод «последовательного отжига» недостаточно строг и дает лишь приблизительную информацию о механизме тепловой денатурации белка. Кроме того, большинство работ было выполнено на смешанном препарате 81 (без его разделения на изоформы). В то же время детальное понимание процесса тепловой агрегации белка невозможно без знания детального механизма его денатурации. Стоит отметить, что относительно недавно в нашей лаборатории был предложен новый, физически более строгий метод анализа данных

ДСК для необратимо денатурирующих белков.В результате еще одной целью данной работы было подробное исследование механизма тепловой денатурации изолированных изоформ S1 и возможный пересмотр полученных ранее результатов.

Итак, целью данной работы стало подробное изучение тепловой,денатурации' и агрегации^ S1' и влияния sHspua эти процессы в условиях, приближенных к условиям теплового шока. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Методом ДСК провести подробные исследования тепловой денатурации препаратов Sl(Al) и S1(A2) при двух значениях ионной силы: «¿20 мМ и «120 мМ. Провести математический анализ полученных данных с целью нахождения калориметрических доменов (т. е. участков молекулы, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга).

2). Исследовать тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценциии S1 и тепловую инактивацию его АТРазы. Сопоставляя полученные результаты с данными-ДСК, попытаться провести идентификацию калориметрических доменов S1, т. е. выявить-их соответствие определенным структурным доменам S1.

3). Методами турбидометрии и динамического лазерного светорассеяния (DLS) исследовать механизм тепловой агрегации изоформ S1 при двух значениях ионной силы: «20 мМ и «120 мМ.

4). Изучить влияние малого белка теплового шока Hsp27-3D (Hsp27 с тремя имитирующими фосфорилирование заменами: S15D, S78D; S82D) на тепловую денатурацию S1, инактивацию его АТРазы, а также на агрегацию S1 в условиях, имитирующих тепловой шок (43 °С), при значениях ионной силы, близких к физиологическим («120 мМ).

Научная новизна и практическая значимость

Впервые детально.исследован механизм тепловой денатурации и агрегации изоформ Sic применением методов химической кинетики. Установлено наличие в молекуле S1 двух калориметрических доменов, причем более термостабильный домен денатурирует в две стадии. Существенные различия между изоформами S1 в кинетических параметрах денатурации выявлены только для первого калориметрического домена независимо от условий ионной силы. Проведена идентификация калориметрических доменов и установлено, что-менее термостабильный домен соответствует регуляторному домену миозиновой головки,. а более термостабильный - моторному домену.

Показано, что в условиях высокой ионной силы (120-130 мМ) тепловая агрегация протекает одинаково у обеих изоформ Б1, не зависит от концентрации белка и лимитируется необратимой денатурацией моторного домена. Более того, в этих условиях механизм тепловой агрегации коренным образом отличается от такового для всех ранее исследованных белков: рост агрегатов осуществляется не за счет слипания стартовых агрегатов, а за счет последовательного налипания на эти агрегаты отдельных молекул Э1, моторный домен которых частично денатурирован. Напротив, в условиях низкой ионной силы (20 мМ Нереэ) обнаружена существенная разница в агрегации между двумя изоформа-ми 81. Необратимая агрегация 81(А2) является следствием тепловой денатурации этой изоформы 81 и мало зависит от концентрации белка, а в случае 81(А1) отсутствуют какие-либо корреляции мел-еду тепловой денатурацией и агрегацией этой изоформы 81 и наблюдается выраженная концентрационная зависимость агрегации. Кроме того, показано, что в условиях низкой ионной силы спонтанная агрегация 81(А1) происходит даже при +4 °С. В последнем случае агрегация является полностью обратимой: образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора. На основании этих данных сделан вывод, что при низкой ионной силе агрегация 81(А1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка и по крайней мере отчасти обусловлена взаимодействиями дополнительного И-концевого сегмента легкой цепи А1 с другими молекулами 81.

Показано, что в условиях ионной силы, близких к физиологическим, вНвр не влияют ни на тепловую денатурацию 81, ни на инактивацию его АТРазы, однако эффективно защищают его от тепловой агрегации, образуя устойчивые комплексы с частично или полностью денатурированным молекулами 81. В зависимости от весового соотношения зНвр/Э! рост агрегатов либо замедляется, либо подавляется вовсе.

Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации и агрегации сложных мультидоменных белков и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Отсутствие концентрационной зависимости и разницы между изоформами в кинетике роста агрегатов в условиях высокой ионной силы делают Э1 особенно удобным объектом для исследования шапероноподоб-ной активности малых белков теплового шока и других агентов, подавляющих тепловую агрегацию белков. Во-первых, отпадает необходимость разделения препарата 81 на изоформы, а во-вторых, эффект шаперона будет зависеть только от молярного (или весового) соотношения шаперон/81.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Марков, Денис Игоревич

Выводы

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проведен детальный сравнительный анализ тепловой денатурации двух изоформ изолированной головки миозина (субфрагмент 1 миозина, 81), содержащих разные «щелочные» легкие цепи: А1 и А2. Показано наличие в молекуле Б1 двух калориметрических доменов (т. е. участков, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга), причем более термостабильный домен денатурирует в 2 стадии.

2. На основании сопоставления данных ДСК, собственной триптофановой флуоресценции и инактивации АТРазы проведена идентификация калориметрических доменов 81. Установлено, что более термостабильпый из них отражает тепловую денатурацию моторного домена миозиновой головки, а менее термостабильный соответствует регуляторнному домену головки. Показано, что две изоформы Э1 различаются лишь по параметрам тепловой денатурации регуляторного домена.

3. Установлено, что в условиях высокой ионной силы (в присутствии 100 мМ КС1) тепловая агрегация двух изоформ протекает с одинаковой скоростью, которая лимитируется первой стадией денатурации моторного домена.

4. Показано, что в условиях низкой ионной силы 81(А1) существенно отличается от 81(А2) по механизму тепловой агрегации. Это обусловлено взаимодействиями дополнительного Ы-концевого сегмента легкой цепи А1, отсутствующего у А2, с другими молекулами Э1. Такие взаимодействия, сопровождаемые обратимой агрегацией 81 (А1), имеют место даже при неденатурирующих условиях.

5. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния на тепловую денатурацию и инактивацию миозиновой АТРазы, однако эффективно подавляют тепловую агрегацию за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами 81.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марков, Денис Игоревич, Москва

1. Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 67, 613-623.

2. Зубов Е.О. (2001) Новый подход к изучению доменнойструктуры головки миозина. Дипломная работа студента 6 курса кафедры биофизики Физического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

3. Клюева A.B., Левчук Ю.Н., НабокаЮ.Н. (2002) Фотон-корреляционная спектроскопия белков. Укр. биохим. оюурнал., 74, №5, 12-26.

4. Курганов Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биол. химии, 42, 89-138.

5. Левицкий Д.И. (1986) Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения. Успехи биол. химии, 27, 74-101.

6. Левицкий Д.И. (1987) Структурные особенности и функциональная роль молекул, миозина. В кн.: Структура и функции белков сократительных систем (ред. Пинаев Г.П.) Изд-во «Наука», Л., 5-31.

7. Левицкий Д.И. (1991) Структура миозиновой головки. Биохимия, 56, 1539-1566.

8. Левицкий Д.И., Бобков A.A., ГолицынаН.Л., Николаева О.П., Павлов Д.А., Поглазов Б.Ф. (1996) Калориметрические исследования стабильных комплексов субфрагмента 1 миозина с аналогами аденозинтрифосфата и фосфата. Биофизика, 41, 64-72.

9. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А., остко-ва Е.В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63, 381-394.

10. Любарев А.Е., Курганов Б.И. (2000) Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биол. химии, 40, 43-84.

11. Павлов Д.А., Бобков A.A., Николаева О.П., Магретова H.H., Дедова И.В., Левицкий Д.И. (1995а) Влияние модификации остатка лизина-83 на термостабильность субфрагмента 1 миозина и ее изменения, вызываемые связыванием нуклеотидов. Биохимия, 60, 1100-1109.

12. Павлов Д.А., Левицкий Д.И., Дедова И.В., Потехин С.А., Николаева О.П., Погла-зов Б.Ф. (19956) Влияние метилирования остатков лизина на свойства комплексов субфрагмента-1 миозина с АДФ и аналогами фосфата. ДАН, 341, 696-698.

13. Павлов Д.А., Собешек А., Левицкий Д.И. (1998) Калориметрические исследования тепловой денатурации фрагментов миозина гладких мышц и их комплексов с ADP и аналогами фосфата. Биохимия, 63, 1116-1128.

14. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59-98.

15. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. (1982) Миозин и биологическая подвижность. Изд-во "НаукаМ., 160 С.

16. Пономарев М.А. (2000) Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. Москва, 2000.

17. Филимонов В.В., Потехин С.А., Матвеев C.B., Привалов П.Л. (1982) Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии. 1. Алгоритмы деконволюции сложных кривых теплопоглощения. Молекулярная биология, 16, 551-562.

18. Хворов Н.В., Левицкий Д.И., Букатина А.Е., Шныров В.Л., Поглазов Б.Ф. (1990) Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. Доклады АН СССР, 315, 745-748.

19. Шныров В.Л., Левицкий Д.И., Веденкина Н.С., Николаева О.П., Хворов Н.В., Пермяков Е.А., Поглазов Б.Ф. (1989) Доменная структура субфрагмента 1 миозина. Доклады АН СССР, 304, 1497-1499.

20. Abillon E., Bremier L., Cardinaud R. (1990) Conformational calculations on the Alal4-Pro27 LCI segment of rabbit skeletal myosin. Biochim. Biophys. Acta, 1037, 394-400.

21. Andreev O.A., Saraswat L.D., Lowey S., Slaughter C., Borejdo J. (1999) Interaction of the N-terminus of chicken skeletal essential light chain 1 with F-actin. Biochemistry, 38, 2480-2485.

22. Anson M., Geeves M.A., Kurzawa S.E., Manstein D.J. (1996) Myosin motors with artificial lever arms. EMBO J., 15, 6069-6074.

23. Bagshaw C.R., Trentham D.R. (1974) The characterization of myosin-product complexes and product-release steps during the magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase reaction. Biochem. J., 141, 331-349.

24. Barnett V.A., Thomas D.D. (1987) Resolution of conformational states of spin-labeled myosin during steady-state ATP hydrolysis. Biochemistry, 26, 314-323.

25. Berka M., Rice J.A. (2005) Relation between aggregation kinetics and the structure of kaolinite aggregates. Langmuir, 21, 1223-1229.

26. Bobkov A.A., Khvorov N.V., Golitsina N.L., Levitsky D.I. (1993) Calorimetric characterization of the stable complex of myosin subfragment 1 with ADP and beryllium fluoride. FEBS Lett, 332, 64-66.

27. Bobkov A.A., Levitsky D.I. (1995) Differential scanning calorimetric study of the complexes of myosin subfragment 1 with nucleoside diphosphates and vanadate or beryllium fluoride. Biochemistry, 34, 9708-9713.

28. Bobkov A., Sutoh K., Reisler E. (1997) Nukleotide and actin binding properties of isolated motor domain from Dictyostellium discoideum myosin. J. Muscle Res. and Cell Motil., 18; 563-571.

29. Borejdo J., Ushakov D.S., Moreland R., AkopovaI., Reshetnyak Y., Saraswat L.D., Kamm K., Lowey S. (2001) The power stroke causes changes in the orientation and mobility of the termini of essential light chain 1 of myosin. Biochemistry, 40; 3796-3803.

30. Burke M., Rajasekharan K.N., Maruta S., Ikebe M. (1990) A second consensus sequence of ATP-requiring proteins resides in the 21-kDa G-terminal segment of myosin subfragment-1. FEBS Lett., 262, 185-188.

31. Chalovich J.M., Stein L.A., Greene L.E., Eisenberg E. (1984) Interaction of isozymes of myosin subfragment 1 with actin: effect of ionic strength and nucleotide. Biochemistry, 23, 4885-4889.

32. Chaussepied P., Kasprzak A.A. (1989) Isolation and characterization of the G-actin-. myosin head complex. Nature, 342, 950-953.

33. Cheney R.E., Mooseker M.S. (1992) Unconventional myosins. Curr. Opin. in Cell Biol., 4, 27-35.

34. Chernik I.S., Panasenko O.O., Li Y., Marston S.B., Gusev N.B. (2004) pH-Induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27 kDa (HspBl). Biochem. Biophys. Res. Commun., 324, 1199-1203.

35. Cope M.J., Whisstock J., Rayment I., Kendrick-Jones J, (1996) Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function. Structure, 4, 969-987.

36. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K.M., Cohen C. (1998) Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. Cell, 94, 559-571.

37. Engelgardt V.A., Ljubimova M.N. (1939) Myosin and adenosinetriphosphatase. Nature, 144, 668-669.

38. Fisher A.J., Smith C.A., Thoden J.B., Smith R., Sutoh K., Holden H.M., Rayment I. (1995a) X-ray structures of the myosin motor domain of Dictyostelium discoideum complexed with MgADP.BeFx and MgADP.AlF4-. Biochemistry, 34, 8960-8972.

39. Fisher A.J., Smith C.A., Thoden J., Smith R., Sutoh K., Holden H.M., Rayment I. (1995b), Structural studies of myosin:nucleotide complexes: a revised model for the molecular basis of muscle contraction. Biophys. J., 68, 19s-28s.

40. Prank G., Weeds A.G. (1974) The amino-acid sequence of the alkali light chains of rabbit skeletal-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 44, 317-334.

41. Freire E., Biltonen R.L. (1978) Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous systems. Biopolymers, 17, 463-479.

42. Geeves M.A., Goldmann W.H. (1990) The influence of anions, ionic strength and organic solvents on the interaction between actin and myosin subfragment 1. Biochem. Soc. Trans., 18, 584-585.

43. Golitsina N.L., Shnyrov V.L., Levitsky D.I. (1992) Thermal denaturation of the alkali light chain-20 kDa fragment complex obtained from myosin subfragment 1. FEBS Lett., 303, 255-257.

44. Goodno C.C. (1982) Myosin active-site trapping with vanadate ion. Methods Enzymol., 85, 116-123.

45. Gopal D., Burke M. (1996) Myosin subfragment 1 hydrophobicity changes associated with different nucleotide-induced conformations. Biochemistry, 35, 506-512.

46. Grand R.J., Perry S.V. (1983) Preparation of the alkali and P light chains of chicken gizzard myosin. Amino acid sequence of the alkali light chain. Biochem. J., 211, 267-272.

47. Greaser M.L., Moss R.L., Reiser P.J. (1988) Variations in contractile properties of rabbit single muscle fibers in relation to troponin T isoforms and myosin light chains. J. Physiol., 406, 85-98.

48. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Moll. Life Sci., 59, 1649-1657.

49. Haslbeck M., Franzmann T., Weinfurtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nature Struct. Mol. Biol., 12, 842-846.

50. Hayashibara T., Miyanishi T. (1994) Binding of the ammo-terminal region of myosin alkali 1 light chain to actin and its effect on actin-myosin interaction. Biochemistry, 33, 12821-12827.

51. Henry G.D., Dalgarno D.C., Marcus G., Scott M., Levine B.A., Trayer I.P. (1982) The occurrence of alpha-N-trimethylalanine as the N-terminal amino acid of some myosin light chains. FEBS Lett., 144, 11-15.

52. Henry G.D., Winstanley M.A., Dalgarno D.C., Scott G.M., Levine B.A., Trayer LP. (1985) Characterization of the actin-binding site on the alkali light chain of myosin. Biochim. Biophys. Acta., 830, 233-243.

53. Hernandez O.M., Jones M., Guzman G., Szczesna-Cordary D. (2007) Myosin essential light chain in health and disease. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 292, H1643-H1654.

54. Hess J.F., FitzGerald P.G. (1998) Protection of a restriction enzyme, from heat inactivation by alpha]-crystallin. Mol. Vis., 4, 29.

55. Holmes K.C. (1997) The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. Curr. Biol, 7, R112-R118.

56. Holt J.C., Lowey S. (1977) Distribution of alkali light chains in myosin: isolation of isoenzymes. Biochemistry, 16, 4398-4402.

57. Hook D.W., Harding J.J. (1997) Molecular chaperones protect catalase against thermal stress. Eur. J. Biochem., 247, 380-385.

58. Houdusse A., Kalabokis V.N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. (1999) Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. Cell, 97, 459-470.

59. Houdusse A., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. (2000) Three conformational states of scallop myosin SI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11238-11243.

60. Hozumi T., Muhlard A. (1981) Reactive lysyl of myosin subfragment-1: location on-the 27K fragment and labeling properties. Biochemistry, 20, 2945-2950.

61. Huston E.E., Grammer J.C., Yount R.G. (1988) Flexibility of the myosin heavy chain: direct evidence that the region containing SHI and SH2 can move 10 A under the influence of nucleotide binding. Biochemistry, 27, 8945-8952.

62. International standard ISO 22412:2008(E); Particle size analysis-Dynamic light scattering (DLS); International Organization for Standartization, 2008.

63. Jencks W. P. (1981) On the attribution and additivity of binding energies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 4046-4050.

64. Johnson K.A., Taylor E.W. (1978) Intermediate states of subfragment-1 ATPase: réévaluation of the mechanism. Biochemistry, 17, 3432-3442.

65. Kazmierczak K., Xu Y., Jones M., Guzman G., Hernandez O.M., Kerrick W.G., Szczesna-Cordary D. (2009) The role of the N-terminus of the myosin essential light chain in cardiac muscle contraction. J. Mol. Biol, 387, 706-725.

66. Kendrick-Jones J., Szentkiralyi E.M., Szent-Gyorgyi A.G. (1976) Regulatory light chains in myosins. J. Mol. Biol, 104, 747-775.

67. Koh T.J., Escobedo J. (2003) Cytoskeletal disruption and small1 heat shock protein translocation immediately after lengthening contractions. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 286, C713-C722.

68. Kominz D.R., Carroll W.R., Smith E.N., Mitchell E.R. (1959) A subunit of myosin. Arch. Biochem. and Biophys., 79, 191-199.

69. Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L. (1997) Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. Biophys. Chem., 69, 125-135

70. Kurzawa S.E., Manstein D.J., Geeves M.A. (1997) Dictyostellium discoideum myosin II: characterisation of functional myosin motor fragments. Biochemistry, 36, 317-322.

71. Labbe J.P., Audemard E., Bertrand R., Kassab R. (1986) Specific interactions of the alkali light chain 1 in skeletal myosin heads probed by chemical cross-linking. Biochemistry, 25, 8325-8330.

72. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

73. Lelj-Garolla B., Mauk A.G. (2005) Self-association of a small heat shock protein. J. Mol. Biol., 345, 631-642.

74. Lelj-Garolla B., Mauk A.G. (2006) Self-association and chaperone activity of Hsp27 are thermally activated. J. Biol. Chem., 281, 8169-8174.

75. Levitsky D.I. (1994) Domain structure of the myosin head. In Soviet Sci. Rev. Section D: Physico-Chem. Biol. (Skulachev V.P., ed), Harwood Acad. Publ. GmbH: Newark, NJ, USA., vol. 12, Part 1, pp. 1-53.

76. Levitsky D.I., Khvorov N.V., Shnyrov V.L., Vedenkina N.S., Permyakov E.A., Poglazov B.F. (1990) Domain structure of myosin subfragment-1. Selective denaturation of the 50 kDa segment. FEBS Lett., 264, 176-178.

77. Levitsky D.I., Nikolaeva O.P., Vedenkina N.S., Shnyrov V.L., Golitsina N.L., Khvorov N.V., Permyakov E.A., Poglazov B:F. (1991) The effect of alkali light chains on the thermal stability of myosin subfragment 1'. Biomed. Sei., 2, 140-146.

78. Levitsky D.I., Ponomarev M.A., Geeves M.A., Shnyrov V.L., Manstein DlJ. (1998) Differential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of the motor domain* fragments of Dictyostelium discoideum myosin II. Eur. J. Biochem., 251, 275-280.

79. Lopez Mayorga 0., Freire E. (1987) Dynamic analysis of differential scanning calorimetry data. Biophys. Chem., 27, 87-96.

80. Lörinczy D., Belagyi J. (1995) Effects of nucleotide on skeletal muscle myosin unfolding in myofibrils by DSC. Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, 592-598.

81. Lörinczy D., Belagyi J. (2001) Nucleotide binding induces global and local structural, changes of myosin head in muscle fibers. Eur. J. Biochem., 268, 5970-5976.

82. Lowey S., Benefield P.A., Silberstein L., Lang L.M. (1979) Distribution of light chains in . fast skeletal myosin. Nature, 282, 522-524.'

83. Lowey S., Saraswat L.D., Liu H., Volkmann N., Hanein D. (2007) Evidence for an interaction between the SH3 domain and the N-terminal extension of the essential light chain in class II myosins. J. Mol. Biol., 371, 902-913.

84. Lowey S., Slayter H.S., Weeds A.G., Baker H. (1969) Substructure of the myosin molecule. I. Subfragment of myosin by enzymatic degradation. J. Mol. Biol, 42; 1-29.

85. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (1993a) Function of skeletal muscle myosin heavy and light chain isoforms by an in vitro motility assay. J. Biol Chem., 268, 20414-20418.

86. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (1993b) Skeletal muscle myosin light chains are essential for physiological speeds of shortening. Nature, 365, 454-456.

87. Lymn R.W., Taylor E.W. (1971) Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomiosin. Biochemistry, 10, 4617-4624.

88. Mahmood R., Elzinga M., Yount R.G. (1989) Serine-324 of myosin's heavy chain is fotoaffinity-labeled by 3'(2')-0-(4-benzoylbenzoyl)adenosine triphosphate. Biochemistry, 28, 3989-3995.

89. Maita T., Umegane T., Kato Y., Matsuda G. (1980) Ammo-acid sequence of the L-l light chain of chicken cardiac-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 107, 565-575.

90. Maita T., Umegane T., Matsuda G. (1981) Amino-acid sequence of the L-4 light chain of chicken skeletal-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 114, 45-49.

91. Margossian S.S., Lowey S., Barshop B. (1975) Effect of DTNB light chains on the interaction of vertebrate skeletal myosin with actin. Nature, 258, 163-166.

92. Marini I., Moschini R., Del Corso A., Mura U. (2000) Complete protection by alpha-crystallin of lens sorbitol dehydrogenase undergoing thermal stress. J. Biol. Chem., 275, 32559-32565.

93. Markossian K.A., Yudin I.K., Kurganov B.I. (2009) Mechanism of suppression of protein aggregation by alpha-crystallin. Int. J. Mol. ScL, 10, 1314-1345.

94. Marsh D.J., Lowey S. (1980) Fluorescence energy transfer in myosin subfragment-1. Biochemistry, 19, 774-784.

95. Marsh D.J., Stein L.A., Elsenberg E., Lowey S. (1982) Fluorescently labeled myosin subfragment 1: identification of the kinetic step associated with the adenosine 5'-triphosphate induced fluorescence decrease. Biochemistry, 21, 1925-1928.

96. Maruta S., Miyanishi T., Matsuda G. (1989) Localization of the ATP-binding site in the 23-kDa and 20-kDa regions of the heavy chain of the skeletal muscle myosin head. Eur. J. Biochem., 184, 213-221.

97. Matsuda G., Maita T., Kato Y., Chen J.I., Uraegane T. (1981) Amino acid sequences of the cardiac L-2A, L-2B and gizzard 17 000-Mr light chains of chicken muscle myosin. FEBS Lett., 135, 232-236.

98. Matsuda G., Maita T., Umegane T. (1981) The primary structure of L-l light chain of chicken fast skeletal muscle myosin and its genetic implication. FEBS Lett., 126,111-113.

99. Melkani G.C., Cammarato A., Bernstein S.I. (2006) alpha-B-Crystallin maintains skeletal muscle myosin enzymatic activity and prevents its aggregation under heat-shock stress. J. Mol Biol., 358, 635-645.

100. Mornet D., Pantel P., Audemard E., Derancourt J., Kassab E. (1985) Molecular movements promoted by metal nucleotides in the heavy-chain regions of myosin heads from sceletal muscle. J. Mol Biol, 183, 479-489.

101. Moss D.J., Trentham D.R. (1983) Distance measurement between the active site and cysteine-177 of the alkali one light chain of subfragment 1 from rabbit skeletal muscle. Biochemistry, 22, 5261-5270.

102. Mrakovcic-Zenic A., Oriol-Audit C., Reisler E. (1981) On the alkali light chains of vertebrate skeletal myosin. Nucleotide binding and salt-induced conformational changes. Eur.J. Biochem., 115, 565-570.

103. Musacchio A., Noble M., Pauptit R., Wierenga R., Saraste M. (1992) Crystal structure of a Src-homology 3 (SH3) domain. Nature, 359, 851-855.

104. Nikolaeva O.P., Bobkov A.A., Orlov V.N., Levitsky D.I. (1997) Thermal stability of myosin subfragment 1 dramatically decreases upon tryptic cleavage in the N-terminal region of myosin heavy chain. J. Muscle Res. Cell Motil., 18, 258.

105. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B., Gusev N.B. (2003) Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem., 270, 892-901.

106. Permyakov E.A., Burstein E.A. (1984) Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys. Chem., 19, 265-271.

107. Phan B.C., Peyser Y.M., Reisler E., Muhlrad A. (1997) Effect of complexes of ADP and phosphate analogs on the conformation of the Cys707-Cys697 region of myosin subfragment 1. Eur. J. Biochem., 243, 636-642.

108. Phan B.C., Reisler E. (1992) Inhibition of myosin ATPase by beryllium fluoride. Biochemistry, 31, 4787-4793.

109. Pivovarova A.V., Chebotareva N.A., Chernik I.S., Gusev N.B., Levitsky D.I: (2007) Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by forming soluble complexes with denatured actin. FEBS J., 274, 5937-5948.

110. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and* agrégation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 331, 1548-1553.

111. Pliszka B., Redowicz M.J., Stepkowski D. (2001) Interaction of the N-terminaJ part of the Al essential light chain with the myosin heavy chain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 281, 924- 928.

112. Ponomarev M.A., Timofeev V.P., Levitsky D.I. (1995) The difference between- ADP-beryllium fluoride and ADP-aluminium fluoride complexes of the spin-labeled myosin subfragment 1. FEBS Lett., 371, 261-263.

113. Pope B., Wagner P.D., Weeds A.G. (1981) Studies on the actomyosin ATPase and the role of the alkali light chains. Eur. J. Biochem., 117, 201-206.

114. Prince H.P., Trayer H.R., Henry G.D., Trayer I.P., Dalgarno D.C., Levine B.A., Cary P.D., Turner C. (1981) Proton nuclear-magnetic-resonance spectroscopy of myosin subfragment 1 isoenzymes. Eur. J. Biochem., 121, 213-219.

115. Privalov P.L. (1982) Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem., 35, 1-104.

116. Privalov P.L., Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol., 131, 4-51.

117. Rajaraman K., Raman B., Ramakrishna T., Rao C.M. (2001) Interaction of human recombinant alphaA- and alphaB-crystallins with early and late unfolding intermediates of citrate synthase on its thermal denaturation. FEBS Lett., 497, 118-123.

118. Rayment I., Holden H.M., Whittaker M., Yohn C.B., Lorenz M., Holmes K.C., Milligan R.A. (1993b) Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science, 261, 58-65.

119. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. (1993a) Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science, 261, 50-58.

120. Reedy M.K. (1993) Myosin-actin motors: the partnership goes atomic. Structure, 1, 1-5.

121. Reisler E. (1982) Sulfhydryl modification and labeling of myosin. Methods Enzymol., 85, 84-93.

122. Sanchez-Ruiz J.M. (1995) Chapter 6. Differential scanning calorimetry of proteins. Subcellular biochemistry, volume 24• Proteins: Structure, Function, and Engineering. Edited by B.B. Biswas and Siddhartha Roy. Plenum Pres, New York, 1995.

123. Saraste M., Sibbald P., Wittinghofer A. (1990) The P-loop a common motif in ATP-and GTP-binding proteins. TIBS, 15, 430-434.

124. Schroder R.R., Manstein D.J., Jahn W., Holden H., Rayment I., Holmes K.C., Spudich J.A. (1993) Three-dimensional atomic model of F-actin decorated with Dictyostelium myosin SI. Nature, 364, 171-174.

125. Sellers J.K., Goodson H.V., Wang F. (1996) A miosyn family reunion. J. Muscle Res. Cell Motil., 17, 7-22.

126. Shnyrov V.L., Sanchez-Ruiz J.M., Boiko B.N., Zhadan G.G., Permyakov E.A. (1997) Applications of scanning microcalorimetry in biophysics and biochemistry. Thermochim. Acta, 302, 165-180.

127. Shriver J.W., Kamath U. (1990) Differential scanning calorimetry of the unfolding of myosin subfragment 1, subfragment 2, and heavy meromyosin. Biochemistry, 29, 2556-2564.

128. Silberstein L., Lowey S. (1981) Isolated and distribution of myosin isoenzymes in chicken pectoralis muscle. J. Mol. Biol, 148, 153-189.

129. Singh B.N., Rao K.S., Ramakrishna T., Rangaraj N., Rao Ch.M. (2007) Association of alpha-B-crys t allin, a small heat shock protein, with actin: role in modulating actin filament dynamics in vivo. J. Mol. Biol., 366, 756-767.

130. Sivaramakrishnan M., Burke M. (1982) The free heavy chain of vertebrate skeletal myosin subfragment 1 shows full enzymatic activity. J. Biol Chem., 257, 1102-1105.

131. Smith C.A., Rayment I. (1996) X-ray structure of the magnesium(II).ADP.vanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution. Biochemistry, 35, 5404-5417.

132. Spudich J.A. (1994) How molecular motors work. Nature, 372, 515-518.

133. Sturtevant J.M. (1987) Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. Phys. Chem., 38, 463-488.

134. Sutoh K. (1982) Identification of myosin-binding sites on the actin sequence. Biochemistry, 21, 3654-3661.

135. Sweeney H.L., Kushmerick M.J., Mabuchi K., Sreter F.A., Gergely J. (1988) Myosin alkali light chain and heavy chain variations correlate with altered shortening velocity of isolated skeletal muscle fibers. J. Biol. Chem., 263, 9034-9039.

136. Syrovy I. (1979) Polymorphism and specificity of myosin. Int. J. Biochem., 10, 383-389.

137. Szent-Gyorgyi A.G., Szentkiralyi E.M., Kendrick-Jones J. (1973) The light chains of scallop myosin as regulatory subunits. J. Mol. Biol, 74, 179-203.

138. Taylor U.S., Weeds A.G. (1977) Transient-phase of ATP hydrolysis by myosin sub-fragment-1 isoenzymes. FEBS Lett, 75, 55-60.

139. Timson D.J., Trayer LP. (1997) The role of the proline-rich region in Al-type myosin essential light chains: implications for information transmission in the actomyosin complex. FEBS Lett, 400, 31-36.

140. Timson D.J., Trayer H.R., Smith K.J., Trayer I.P. (1999) Size and charge requirements for kinetic modulation and actin binding by alkali 1-type myosin essential light chains. J. Biol. Chem., 274, 18271-18277.

141. Tong S.W., Elzinga M. (1990) Amino acid sequence of rabbit skeletal muscle myosin. 50 kDa fragment of the heavy chain. J. Biol. Chem., 265, 4893-4901.

142. Trayer H.R., Trayer I.P. (1985) Differential binding of rabbit fast muscle myosin light chain isoenzymes to regulated actin. FEBS Lett, 180, 170-173.

143. Trayer H.R., Trayer LP. (1988) Fluorescence resonance energy transfer within the complex formed by actin and myosin subfragment 1. Comparison between weakly and strongly attached states. Biochemistry, 27, 5718-5727.

144. Uyeda T.Q., Abramson P.D., Spudich J.A. (1996) The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4459-4464.

145. Wagner P.D., Giniger E. (1981) Hydrolysis of ATP and reversible binding to F-actin by myosin heavy chains free of all light chains. Nature, 292, 560-562.

146. Wagner P.D:, Slater C.S., Pope B., Weeds A.G. (1979) Studies on,the actin activation of myosin subfragment-1 isoezymes and the role of myosin light chains. Eur. J. Biochem., 99, 385-394.

147. Wagner P.D., Stone D.B. (1983) Myosin heavy chain-light chain recombinations and interactions between the two classes of light chains. J. Biol. Chem., 258, 8876-8882.

148. Wagner P.D., Weeds A.G. (1977) Studies on the role of myosin alkali light chains. Recombination and hybridization of light chains and heavy chains in subfragment-1 preparations. J. Mol. Biol, 109, 455-473.

149. Wang K., Spector A. (1996) alpha-Crystallin stabilizes actin filaments and- prevents cytochalasin-induced'depolymerization in a phosphorylation-dependent manner. Eur. J. Biochem., 242, 56-66.

150. Weeds A.G. (1969) Light chains of myosin. Nature, 223, 1362-1364.

151. Weeds A.G., Pope B. (1977) Studies on the chymotriptic digestion of myosin. Effect of divalent cations on the proteolytic susceptibility. J. Mol Biol, 111, 129-157.

152. Weeds A.G., Taylor R.S. (1975) Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. Nature, 257, 54-56.

153. Weitz D.A., Huang J.S., Lin M.Y., Sung J. (1985) Limits of the fractal'dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Phys. Review Lett., 54, 1416-1419.

154. Werber M.M., Peyser Y.M., Muhlrad A. (1992) Characterization of stable beryllium fluoride, aluminum fluoride, and vanadate containing myosin subfragment 1-nucleotide complexes. Biochemistry, 31, 7190-7197.

155. Werber M.M., Szent-Gyorgy A.G., Fasman G. (1972) Fluorescence studies on heavy meromyosin-substrate interactions. Biochemistry, 11, 2872-2883.

156. Winstanley M.A., Small D.A., Trayer LP. (1979) Differential binding of myosin subfragment one species to immobilized ADP, and actin: the influence of the alkali light chains. Eur. J. Biochem., 98, 441-446.

157. Winstanley M.A., Trayer H.R., Trayer LP. (1977) Role of the myosin light chains in binding to actin. FEBS Lett., 77, 239-242.

158. Yamamoto K., Sekine T. (1983) Interaction of alkali light chain 1 with actin: effect of ionic strength on the cross-linking of alkali light chain 1 with actin. J. Biochem,., 94,

159. Zhang Y., Liu X., Liu J. (2005) Recombinant human alphaA-crystallin can protect the enzymatic activity of CpUDG against thermal inactivation. FEBS Lett., 579, 2897-2900.2075-2078.

Информация о работе

Марков, Денис Игоревич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы