Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРИЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРИЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ"



На правах рукописи

ПОДВИГИНА ОЛЬГА АНАТОЛЬЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРИЕМЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

06.01.05 - Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Воронеж 2003

Диссертация выполнена в отделе биотехнологии всероссийского научно - исследовательского институт» сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Маэлумова.

Научный консультант - доктор биологических наук,

профессор, Жуиежалова Таямш Пет/хина

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор, Еуторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Торон Александр Андреевич

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Калягин Юрий Сидорович

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский и проектио-технологичесюгй институт ралса (ВНИГГГИ ралса)

Зашита состоится «1% ЬХ>~ с/-** 2003 гола * .'.?... часов в аудитории ¿¿У на »седании лиссертатюнного совета Д 220 0] 0.03 Воронежского государственного аграрного университета имени К.Д, Глинки по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Мичурина, I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского государственного аграрного университета имени К.Д. Глинки

Автореферат разослан ц У » _2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Щедрина Д.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Важнейшей проблемой селекции сахарной свеклы является получение новых исходных форм и ускоренное создание и внедрение высоко продуктивных сортов и гибридов. Дальнейший прогресс в селекции свеклы требует усовершенствования традиционных подходов с использованием современных методов биотехнологии. Исследования по применению методов биотехнологии на сахарной свекле немногочисленны и очень разрознены. Наиболее изученным и широко используемым в селекции является метод микроклоиаль-ного размножения сахарной свеклы (Амерханова, Рахимбаев, 1986; Славова, 1988; Ильенко, 1989; Знаменская, Жужжалова, 1989). Исследования отдельных вопросов по индуцированию пшлоидии методом культуры неоплодотворенных семяпочек (Ильенко, Белоус, 1987; Славова, Рафаилом, 1991; Подвигнна, Знаменская, Жужжалова, 1994; Hosemans, Bossoutrot, 1983,1985; Van Geyt, Speckmann, HaHuin, 1987; Gibson Margaret, 1987; Lux, Herrmann, Claudia, 1990; Seman, Farago, 1990) проводились независимо друг от друга и не дали полного представления о методе получения гомозиготных линий сахарной свеклы. Представленные в литературе данные по применению методов эмбриокультуры и длительного сохранения микроклонов сахарной свеклы в условиях ni vitro (Белоус и др., 1988; Цупикова, 2001; Mîedema, 1982; Lux eLa1„ 1991) очень ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данных вопросов. В настоящее время наиболее интенсивно развивается метод генетической инженерии, позволяющий получать трансгенные растения сахарной свеклы, устойчивые к гербицидам (Левенкои др., 1993; Богомолова, 2002).

Однако возможности применения известных бнотехнол отческих методов весьма ограничены, т.к. они являются узкоспецифичными не только для различных генотипов одного вида, но даже для разных этапов культивирования эксплантов одного генотипа. Поэтому необходима индивидуальная разработка специфических условий для различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять пенный селекцонный материал в культуре изолированных тканей и органов такой важной культуры, как сахарная свекла.

В связи с этим возникает потребность теоретического обоснования особенностей воспроизведения растений в культуре in vitro с учетом ютипотентио-сто клеток сахарной свеклы. Актуальным является также разработка режимов индукции гаплоидных и диплоидных регенерантов при культивировании неоп-лодотворенных семяпочек и зародышей, условий культивирования полученных гаплоидных, реституционных диплоидных и других новых материалов, режимов длительного беспересадочного культивирования мнкроклонов сахарной свеклы.

Методы гаплоид и и, эмбриокультуры и длительного субкультивирования и их сочетание с традиционной селекцией позволят повысить репродукционный потенциал системы размножения сахарной свеклы, получать новый исходный материал, обогащенный в генетическом отношении, длительно сохранять цен-

UliSUCXA

'і>-'-\Д «Ой лнтврвЛГ,*»

w ^-МШ^_

1

ный генофонд в условиях in vitro it тем самым значительно сокращать селекционный процесс, а следовательно, и период создания новых сортов и гибридов.

Всс это определяет актуальность и необходимость проведения данной работы.

Цель и тадачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в разработке биотехнологических методов индукции и сохранения новых форм сахарной свеклы и установлении особенностей морфогенетического развития микроклонов в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1 .Определить влияние экзогенных и эндогенных- факторов на индукцию гаплоидных регенератов сахарной свеклы нз неогмодогворениых семяпочек.

2. Разработать оптимальные условия получения гаплоидных и реституционных диплоидных линий свеклы в условиях in vitro.

3. Установить лимиткруюише факторы воспроизводства растений при культивировании незрелых и зрелых зародышей сахарной свеклы.

4. Разработать параметры длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы.

¿.Определить влияние ингибирующих веществ на морф©физиологическое развитие клонов в период депонирования и после него.

6.Изучить пути морфогенеза растений свеклы в условиях in situ и in vitro.

Научная новизна. Впервые установлено влияние эндо- н экзогенных воздействий на индукцию таплоидии in vitro изнеоплодотвореиных семяпочек. Экспериментально показано, что наибольшей склонностью к индукции галлои-дии обладают материалы от самоопыления и гибридного происхождения. Выявлена положительная корреляция между регенерашюнной способностью неоп-' лодотаоренных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro и количественным выражением аномального развития мужских гамет, что может служить маркерным признаком при отборе донорского материала. Получены новые да-ные о взаимосвязи стадий развития зародышевого мешка с этапами развития мнкрогаметофнта, что можно использовать при отборе эксплантов с наибольшей склонностью к индукции. Показано стимулирующее действие рентгеновского облучения и пониженных температур на формирование гаплоидных структур из неоплодотворенных семяпочек свеклы. Получены оригинальные данные о влиянии физиологически активных веществ на индуцирование адвентивных побегов гаплоидных проростков, расширяющие существующие представления о значении гормонов при культивировании растений в условиях in vitro. Впервые разработана последовательность чередования питательных сред на этапах стабилизации, микроразмножения гаплоидных и автодиплоидных линий сахарной свеклы. Установлен эффективный режим колхицинирования гаплоидных растений свеклы в условиях in vitro. ;'

- Впервые определены методические подходы эмбриокультуры незрелых зародышей сахарной свеклы, включающие оптимальные стадии развития эксплантов, состав питательной среды и температурной-световой режим культивирования. • '

Модифицирован состав питательной среди В}, основанный на измене-шш осмотического, углеводного уровня н добавленн нингибнрующих вешеств, для беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свекл и. Впервые показали морфологические и анатомические изменения клеточных структур растений при длительном суб культивирован ни на мигкбирующих средах и дальнейшем их рекультивировании. Экспериментально доказана возможность увеличения продолжительности хранения меристем но го материала свеклы в те* чей не 12-18 месяцев беспересадочного культивирования на моднфтшро ванных средах.

Впервые выявлены н описаны этапы морфогенетического развитая адвентивных почек, незрелых и гаплоидных зародышей в условиях in vitro. Изучены' и пред стоплены пути морфогенеза при воспроизведении растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo и in vitro. Определены морфо- ai (атомически e отличия растений свеклы, вырашенных в условиях in situ и in vitro, выражающихся в образовании структурных изменений клеток черешка к листа, проводящей системы и пзренхимпых тканей. '''

Практическая значимость и реализация результатов ирс^слопаний. Установленные параметры культивирования тканей сахарной свеклы позван luí усовершенствовать метод индуцирования голлоиднн при культивировании неопло-дотворенных семяпочек. Разработанный метол получения гомозиготного материала методом индукции галл о ид ии в условиях in vitro позволил создать и передать на Льговскую ОСС 12 реституционных линий сахарной свеклы, что подтверждает возможность его использования в практической селекции.

Режимы культивирования незрелых зародышей дали возможность разработать параметры метода эмбриокуяьтуры, которые могут быть использованы для получения растений от несовместимых н межвидовых скрешнваннП и восстановления длительно хранившегося в семенах селекционного материала. С помощью данного метола восстановлены, размножены и переданы селекционерам В1ШИСС 9 линнй (семена урожая 1981 года).

Для создания коллекции генофонда сахарной свеклы разработан метод длительного беспересадочного культивирования микроклопов на модифицированных питательных средах, позволяющий в течение длительного периода сохранять ценные селекционные генотипы в условиях in vitro. Данным методом в течение 3-х лет сохранялись 28 селекционных номеров, а затем 12 из них были переданы селекционерам для дальнейшей работы.

Разработанные в процессе исследований методические подходы могут использоваться в различных областях биотехнологии, в учебных программах по биологии, цитологии, селекции в высших и средних учебных заведениях. Полученный п результате изучении новый исходный материал сахарной свеклы также может использоваться в дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях.

На тлншту выносятся следующие положения.

1. Экспериментальное обоснование воздействия экзогенных н стимуляции эндогенных факторов на регенерационную способность нсоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы и условиях in vi tro для получения гаплоидов.

2-Происсс формирования гаплоидных, автодинлоидных линий зависит от гормональной нагрузки питательной среды и морфологического развития репс-нерактов,

3.Регенеранно и ная способность незрел их н зрел их зародышей в условиях in viíro определяется генстипичсскнми различиями донорского материала, условиями культивирования (гормональный и углеводный состав среды, темпера-турно-световой режим), стадией дифференциации тканей незрелых зародышей.

4. Установленные воздействия ыодлфнцнроаанного состава питательной среды на рост >! развитие михроклонов сахарной свеклы при субкультнвнрова-ннн позволяют увеличивать беспересадочный период и сохранять в чистоте селекционный материал в виде меристем пых коллекций в течение длительного времени (2-5 лет).

5. Регуляция морфобнохнмическнх изменений в росте, развитии и жизнеси ocoChoctií эксплаитов в период депонирования и после него обеспечивают высокую выживаемость и способность к дальнейшему размножению мнкрокло-нов сахарной свеклы.

6. Система воспроизведения растений сахарной свеклы вусловнях in si tu, In vivo и in vitro основана на свойстве тогипогектностм растительных клеток.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены н обсуждены на зональной конференции молодых ученых н специалистов (Каменная степь, 19S6); районых научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Рамонь, 1927-1989); конференции молодых ученых ВНИИ С {Киев, 1988); межрегиональой научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Воронеж, 1993); Всесоюзных и Международных совещания "Гамстная и зиготная селекция", "О|ггогснетнка высших растений" (Кишенев, 1986, 19S9); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); XI International symposium "Embriology and seeU reproduction"(JIenинград, 1990); Российский симпозиум "Новые методы по биотехполопш растений" (Пушино, 1993); International syroposium "Piant biotechnology and genctic engeneering" (Kiev, 1994); конференции "Молекул я рно-генсшчсские маркеры и селекция растений** (Киев, 1994); Международном симпозиуме "Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований" (Саратов, 1994); Всероссийской научно-практической конференции "Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики" (Рамонь,199б); VH Международной конференции "Кналогня клеток растений in vitro, биотехнология н сохранение генофонда" (Москва, 1997); II съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999); International conferece "Gcnetic collections, isogenec and alloplasmic Unes" (Novosibirsk, 2001); VI Международной конференции "Регуля-.

торы роста и развития растений в биотехнологиях" (Москва, 2001); Межрегиональной конференции, посвященной 90-летню со дня рождения профессора С.И. Машкика (Воронеж, 2002), заседаниях Ученого совета ВНИИСС (Рамонь, 1986-2003).

Структура и обт<ч работы. Диссертация cocioirr in введения, шести глав, выводов, практических рекомендации!, списка литературы, Основной текст изложен на 227 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, Ь2 рисунка. Синеок цитируемой литературы cocroirr из 427 наименований, из них 198 на иностранных языках.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, 4 находятся в печати.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕ 1*11АЛЫ II МЕТОДЫ РАБОТЫ

Экспериментальная работа выполнялась во Всероссийском НИИ сахарной свеклы н сахара им. АЛ. Мазлумова в 1985-2002 г.г. (ВНИИСС, Рам опеки П район, Воронежской области). Исследования проводились в рамках отраслевой научно-технической программы "Сахароносные растения и сахар" и тематического шала ВНИИСС 01.01.111. "Изучить рать генотипа и влияния факторов регуляции генома на систему размножения сахарной свеклы".

Для исследований привлекались сорта Рам опекой. Льговской, Белоцер-ковской, Уладовской селекции, фертильныс и стерильные линии, гибриды F| -F¿ на стерильной основе, созданные в селе кие игре ВНИИСС (Ошевнев, Бычкова, Нужлииа, Богомолов) н дикие виды свеклы Beta согоШ flora и Beta trtgyna. Экспериментальная часть работы выполнялась в полевых и лабораторных условиях отдела биотехнологии ВНИИСС.

В качестве стерилизующих are i tro в при введении в культуру изолированных тканей сахарной свеклы использовали растворы сулемы (0,05-0,1%), хлорамина Б (10%), хлорной воды (0,05), хлоргекенднна (2-4%), время экспозиции материала колебалось от 30 минут до 4 часов.

Для культивирования экенладтгов применялась питательная среда Гамбор-га (Gamborg, Eveüng, 1968). Техника стерилизации, приготовления питательных сред - по Р.Г. Бутснко (1975). В основную питательную среду добавляли 6-бепзнламиноиурии, кнпепш, гиббереллин, НУК, ИМК, ИУК в различных кои* цеитрациях и соотношениях, сахарозу 20-50 г/л, рН рабочего раствора 5,8-6,0.

Обработку материзла пониженной температурой (+ 4-6° С) при экспозиции 1-3 суток проводили в бытовом холодильнике, рентгеновское облучение осуществляли установкой "Реие-И-Свстлана" при дозах 1000-5000 ре1гтген.

Для культивирование эксплаитов в условиях темноты использовались термостаты ( температура -+23-26°С).

Колхициннровзние гаплоидных рссенерактов производилось путем накалывания раствора колхицина на точку роста (Моснна, 1967), погружением кор-

nett культуральиых растений в раствор мутагена и добавлением колхицина и питательную среду. Концентрации колхицина от 0,005% до 0,5%.

С целью получения межвидовых гибридов Beta vulgaris с Beta coral I ¡flora и Beta trigyna проводили принудительное опыление собранной пыльцой диких видов...

В качестве ннгибирующнх веществ при длительном беспересадочном культивировании микроклонов сахарной свеклы в питательную среду добавляли химические, регуляторы роста: гияразкд малеи новой кислоты, феруловую и салициловую кислоты, 2,4-Д ихл орфенокснуксусную кислоту, хлорхолиихлор!ш, осмотические компоненты: сорбит, увеличенное количество агора, а также изменяли минеральный it углеводный состав среды. Концентрации химических веществ находились в пределах от 0,001 до 5 мг/л, минеральных - 8-14 г/л, осмотических - 2-16 г/л. Режим депонирования длился 12 н более месяцев. По окончании субкультивирования растения размножали, укореняли и высаживали в грунт но методике, разработанной В.В. Знаменской, Т.П. Жужжаловой (1995).

Гистохимические исследования длительно культивируемых растений проводили на 1^1,6,9,12 месяцы депонирования на временных препаратах согласно методике, изложенной в учебном пособии ИЛ. Паламарчук, Т.Д. Весе-лоеой (1965).

Все цитологические it биохимические анализы выполнены на точках роста, сегментах черешка, листа, стебля, соцветиях, семенах по следующим методикам: изучение мейоза к гаметогенеза микроспорошгта - по методике Н.ЭЗаЯковскоП, Г.И. Ярмолкж (1968), определение фертильностп иыльисвых зерен - по методике D.H. Юрцепа, D.A. Пухальского (1968), подсчет числа хромосом - но методике, разработанной в ВИР (1986), формирование зародышей и семени - по методике ЭЛ. ПаушевоЙ (1980), элекгофорез нзоферментов в крахмальном геле - no Е.В. Лсвшсс (1980). Цитологические препараты просматривали па микроскопах МБИ-6, МБИ-15, Icnaval. Фотографирование препаратов на микроскопах МБИ-15 н lenaval, окуляр 8-10", объектив - 12,5-40% Рисунки выполнены при помощи рисовального аппарата РЛ-5 при увеличении 7x8.

Поаюрностъ каждого опыта 2-3-х кратная. Для математической обработки применялся дисперсионный анализ (критерий хг к критерий Фишера) (Горя, 1978; Доспехов, 1979).

■ ИНДУЦИРОВАНИЕ ГЛПЛОИДИИ ИЗ 11 ЕЮ ИЛ ОДОТВО РЕПНЫХ СЕМЯПОЧЕК САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

н * ч

Влияние эндогенны* факторов на индукцию гаплонлнн

В настоящее шремя широкое распространение в мировой практике получило использование кгтерознсных гибридов при возделывании сахарной свеклы, Основным требованием, предъявляемым к родительским компонентам, используемых в селекции на [егерознс, является их гомози гот кость по большин-

ству генов. В традиционной селекции гомозиготоюсть материала достигается глубоким инцухтом, что влечет за собой инбрелную депрессию.

Альтернативным путем получения гом о штатных линий сахарной свеклы1 является метод индукции гзллоидип из иеоплодотворенных семяпочек в условиях in vilro, позволяющий я короткий срок получать гомозиготный материал практически ло всем генам.

Процесс воспроизведения гаплоидных растений в условиях in vitro определяется прежде всего на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от конкретных (¡микологических условий и различных по действию индуцирующих факторов (Батыглпа, 1987; Лтанасов, 1993; Бутсико, 1999; Подвиги на, Знаменская,* 1993).

Правильное использование индуцирующих факторов, способствующих повышению регенерационной способности и со плод отворенных семяпочек, невозможно Сез глубокого изучения теоретических основ и закономерностей развития нового распгтелыюго организма в условиях in vitro.

Наши исследования показали, <гго важное значение в регуляции процесса образования гаплоидных структур играют такие эндогенные факторы, как гено-типнческие особенности донорского материала, стадии развития женского га-метофита, расположение экспланта на растении и другие.

Частота формирования гаплоидов у селекционного материала'варьировала в широких пределах от 0,6 до 11,1 9«, что является доказательством генетического контроля морфогеиетического развшгия иеоплодотворенных семяпочек. Наибольшую склонность к индукции гаплоидии проявлял селекционный материал, подверженный неоднократному иннухту» и гибридные комбинации с участием этого материала. Частота образования гаплоидных регенератов у такого материала колебалась в пределах 1,7-11,1 % и 4,9-10,5 % соответственно. Фор* мы с ЦМС и сорта-популяции проявляли значительно меньшую склонность к индукции ганлоилин - в среднем 2,0 %.

Нашими исследованиями было установлено, что отзывчивость данного магериала на индукцию гаплоилни находилась в прямой зависимости ог содержания аномальных структур в мужском гамстофнте (рис.1).

Рис.1, Зависимость регенерааиошгай способности неонлодої ворсн н ых семяпочек от количества нарушений в мужском гачстофитсу сслсмиюшюсо маптрнадд.

Цитологическое исследование донорского материала позволили выявить некоторые особенности в развитии микрогаметофита фертмлышх линий, выражающиеся в нарушении функций веретена, нерегулярном образовании кал-лозной перегородки, отсутствием цитокинеза в холе мейоза, а затем в появлении нередуцировалных гамет и аломхтьних пыльцевых зерен и микроспор. Наличие аномальных микроспор достигало 183 (при 27 Ч'о стерильности) и пыльцевых зерен до 27 % у отдельных растений.

Согласно coaремениым представлениям (Батыгина, 1987,2000), формирование женского тамстофнта генетически связано с процессами дифференциации мужского гаметофта. Выявленные нами цитологические нарушения микрогаметофита, по-видимому, являются генетическим признаком, к могут использоваться в качестве маркеров при очборе донорского материала при индуиирова* кии гоплонднц в культуре неоплолотвтренных семяпочек. Поэтому генотипы с наибольшими отклонениями в формировании генеративных органов имеют большую склонность к г иду кип и гаплоидов в культуре in vitro.

Определенное значение при индуцировании гаплоидов сахарной свеклы имеют,месторасположение неоплодотворенных семяпочек на соцветии и стадии развития зародышевых мешков. Нами установлено, что регенерационноЙ спо-соСностью обладают семяпочки, содержащие зародышевые мешки на розных стадиях развития, Эксплакш иг более крупных бутонов (1-10 бутоны от цветка) формировали 2-3,2 % гаплоидных проростков. Неоплодотворенные семяпочки ит бутонов средней части соцветия (11-20 бутоны) образовывали 1,8-5,0 % рс-гсп грантов, а мелкие и менее развитые бутоны (21-30), расположенные в верхней части соцветия, индуцировали от 0,8 до 3 % гаплоидов.

., Цитоэмбриол отческое изучение стадий развития женского гаметофита показало, что гаплоидные регенераты наиболее активно индуцировались из семяпочек, содержащих недифференцированные зародышеые мешки - 8 ядерные к прошедшие дифференциацию - 7-клеточные. Подобные зародышевые мешки имели семяпочки средней части соцветия -16-20 бутоны вверх от цветка, .

, Склонность неоатол о творенных семяпочек к индукции гаплоид и и в культуре in vitro зависит от места нахождения их из семенном растении. Максимальный выход га пл о продукции % был зафиксирован при эксплантации семяпочек с центрального побега и почти в 2 раза превышал perei lepaiwoi иiy>o способность семяпочек с ветвей второго порядка (2,5 %).

Регенерацнонная способность семяпочек зависела и от погодных условий в период введения в культуру. Анализ получен них нами данных показал, что при резких колебаниях дневных и ночных температур вохтуха (16,4-19,6° С днем и 7,2-9,50С ночью) наблюдалось увеличение выхода гаплоидных проросг-ков с веточек нижнего яруса - до 5,8 % против 4,2 % с верхнего. Положительное влияние холода при индукции гаплоидов отмечалось и другими исследователями (Бугара, Русина, 1988; Тарагонов, 1999; Lux ct.al., 1990).

Воздействие экзогеных факторов на рсгснсранноинуто способность неошюдотворенных семяпочек в условиях in vitro

Другая часть факторов, оказывающих значительное влияние на регенераций иную способность неоплодотворенных семяпочек, искусственно создаются исследователями и относятся к экзогенным. Из комплекса экзогенных факторов существенным является сезонность выращивания донорского материала и введения в культуру. Нами установлено, что привлечение донорского материала, выращенного в поле, способствовало увеличению выхода гаплоидных регенератов до 4,9 % (табл. 1).

При зимне-весенней (февраль-март) эксплантации семяпочек с растений, выращенных в условиях теплицы, количество регенерантов было значительно меньше.

Наши эксперименты по изучению условий культивирования семяпочек доказали возможность управления морфогенетическим процессом развития экспл антов. Культивирование эсгшантов при 16 часовом- фотопериоде и освещенности 5 тыс. люкс более чем в 2 раза стимулировало скорость развития и количество гаплоидных регенератов. При этом выявлено существенное влияние генотипических особенностей донорского материала на выход гаплопро-дукции при различных условиях культивирования. У большинства генотипов условия темнота индуцировали в большей степени развитие каллуса.

Таблица 1 - Влияние сроков введения семяпочек в культуру ш vitro для индуцирования гаплондии -

Условия Введено Получено

выращи- семяпо- новообразо- регенератов

Годы вания чек ваний ■

растений- %от 1 % от вве-

доноров шт. шт. % HIT. новообра- денных се-

зований ' мяпочек

1989 поле 720 58 8,1 35 60,3 4,9

1992 595 40 6,7 28 70,0 4,7

1997 1835 34 1,8 29 85,3 1,6

1998 898 29 3,2 26 89,7 ' 2;9

среди 1034,5 40,3 3.9 29.5 73,2 2,9

1992 теплица 946 15 1,6 11 73,3 и

1993 660 29 4,4 27 93,1 4,1

1997 1180 22 1,9 19 86,4 1,6

1998 1220 10 0,8 9 90,0 0,7

среди 1001,5 19 1.9 16.5 86.8 " Г.6

Критерий Фишера поле 9,5 2,72 3,86

теплица 13,23 5,77 5,99

теор. 7,71

Варьирование гормонального состава питательной среды влекло появление четырех основных направлений морфогенеза неоплодотвореиных семяпочек:

- прямая регенерация (эмбриоидогенез);

- катлусогенез, образование иеморфогенного каллуса;

- перерождение первичного регенеранти в каялусо подобную структуру с вторичной регенерацией растений (образование адвентивных побегов);

- формирование уродливих структур, перерождение первичного регенерант» в каллусоподобную структуру без дальнейшего развития.

Наличие в питательной среде габбереллина в количестве 0,5-2,0 мг/л вызывало образование гаплоидных проростков путем прямой регенерации. Добавление к гиббереллину ШГТОКШІІШОВ (б-БАП и кинетина) и ауксинов (ИМК) в различных сочетаниях и концентрациях стимулировало развитие всех четырех направлений морфогенеза. Совместное действие гиббереллина, 6-БАП, ИМК в большей степени влияли на ре генерационную способность неоплодотвореиных семяпочек, чем присутствие в среде гнббереллина, книстика, ИМК. На всех вариантах сред с 6-БЛП наблюдался достаточно высокий (3-12 %) уровень регенерации, при этом ог 20 до 100 % первичных регенерзнтов под действием гормонов имели измененную структуру и индуцировали ог 1,1 % до 14,0% вторичных регенераитов. Количество од всі гти&ных побегов колебалось от I ло 8 на один первичный гаплоидный проросток, что являлось важным моментом при дальнейшем размножении гаплоидных растений.

Определенное значение в регуляции индукции гаплоидов играет предварительная обработка экспл актируемых органов физическим факторами (холендовой шок, рентгеновское облучение). Наши исследования показал», что выход гаплоидных регенераитов зависел от дозы рентгеновского облучения и колебался от 0,8 до 5,3 Чі. Оптимальная доза обработки составляла 3000 рентген, увеличение доз облучения вело к возникновению нежелательных мутаций.

Эмбриогенная способность семяпочек, подвергнутых обработке пониженной температурой-+4-6 0 С, находилась в полной зависимости от времени года при введении эксплантов и экспозиции обработки. При ран не-весен нем введении семяпочек с растений, выращенных в теплице, наибольшее количество гаплоидных структкр (6,15 %) было получено при холодовой обработке в течение 3 суток, при введении летом - 4,12 % при длительности воздействия пониженной температурой в течение 2 суток. Данные результаты объясняются тем, что цветущие растения в теплине подвергались искусственному воздействию холодом и для индукции гашюндни экеллантам требовалось большая экс-ПОЗНШ1Я обработки.

Изучение совместного влияния холодовой обработки эксплантов и гормонального состава питательной среды на регенерационную способность неоплодотворепных семяпочек показало, что стимулирующий эффект наблюдался при нахождении эксплзтов в холоде в течение 3 суток и дальнейшем культивировании на всех вариантах сред. Наибольшей склонностью к индукции гаплоидов

(6,4 %) обладали семяпочки после 3-х дневной холодової! обработки и культивируемые на питательной ереле с 2 мг/л гмббереллина (рисЛ).

экспомиия обработки,

*

питагелгные среды

1 ' сутки

1 - ГК-0,5 мг/л; 2-ГК-1,0 мг/л; 3 - ГК-2,0 мг/л; 4-6-БЛП-О^мг/л, ГК-2 мг/л, IlMK-0,1 мг/л

Рнс.2 Зависимость ре генерационной способности семяпочек от длительности холодовоtt обработки

ГЛПЛОИДИЯ КАК УСКОГКННЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

С получением новых гаплоидных растений перед исследователями встает задача создания гомозиготных линий и применение их в селекционном процессе. Эффективность использования таких линий в сслскнин прежде всего определяется способностью гаплоидов индуцировать новую генетическую изменчивость, которая не отмечается при обычном получении чистых линий путем са-моошдлеиия. Гибридизация полигаплоидов также приводит к большей изменчивости по сравнению с гибридизашісГі пнцухт-лпннП (Головин, 1977; Gallais, 1978; D.Gcrard, 19S3). Получение гомозиготных линий сахарной свеклы путем индуцирования гаплоидов в условиях in vitro позволяет ускоренно создавать чистые линии в течение 1,5-2 лет, 'по сокращает длительность этого процесса в 5-6 раз (Дтанасов, 1993).

І Іаши исследования показали, что і алло палые регенераты на начальных этапах развития отличались слабым развитием и жизнеспособностью, что обусловлено их одинарным набором хромосом. Гибель растений на этой стадии достигала 45,5 % в зависимости от генотипа донорского материала. Реакция ре-генерантев на смену питательной среды была однозначной у большинства генотипов и выражалась в незначительном образовании дополнительных побегов и дальнейшей гибели растений, достигающей почт 55 % по отдельным генотп-пам. В связи с зтич, для формирования гаплоидных линий нами било предложено проведение этапа стабилизации, включающего последовательное нсполь-

Форчиропание гаплоидных лнннП In vitro

зоваиис питательных сред с различной гормональной нагрузкой и отбор наиболее жизнеспособных, активно растущих и размножающихся растений.

Согласно нашим наблюдениям, способность гсиыоидных регенерантов бистро адаптироваться к условиям окружающей среди, а именно к смене питательной среды, и приобрести склонность к формированию пазушных побегов зависела от генетических особенностей донорского материала. Выживаемость гаплоидов, полученных путем прямой регенерации на средах с гиббереллнном, после первого пассажа у различных генотипов колебалась от 45,5 % до 100 %. Развігтие растений Ti скорость размножения при смене питательных сред (ростовая, без гормональная, ростовая) у некоторых генотипов происходили очень активно, что позволило к 4 пассажу получить ИЗ гаплоидных растений (регенеранти от донора РФ 1338) (табл.2).

Таблица 2-Влиянне генотипа при размножении гаплоидных зкеплаїггов __(1992-1993 г.г.)_

Селекционный

материал Получено гаплоидных растений. шт

1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж 4 пассаж

РФ 1338 3 26 20 113

РФ 358 8 25 6 18

РФ 358-е ' 4 11 7 14

РФ 718 4 23 15 30

РФ 5 х РФ «6 3 10 10 43

При получении гаплоидных растений на средах, содержащих комплекс гормональных веществ, формировались адвентивные побег» различной величины и возникали проблемы образования уродливых структур, признаки нитрификации у гаплоидных проростков. Повторное культивирование таких структур на среду с гормонами (б-КАП, кннстин, гиббереллин по 0,2 мг/л) влекло за собой гибель 23,3-34,4 % растений. Вероятно, это происходило из-за постепенного накопления в тканях фитогормонов выше необходимого физиологического уровня, что вело к появлению токсического действия, формированию растений с измененной морфологией н гибели (Сельскохозяйственная биотехнология, 1998). В связи с этим, этап стабилизации гаплоидных регенерантов с индукционных сред, содержащих комплекс гормонов - гиббереллин, б-БДП, ИМ К, заключался в чередовании следующих сред: безгормональная - ростовая - безгормональная, , ■За это время регенераты почти всех генотипов приобретали выравненное^ и склонность к формированию пазушных побегов. Отбор наиболее развитых, неинфииированных растений позволил создать гаплоидные линии, характеризующиеся стабильной плоили остью и выравнен костью no Idh, Gdh, Me-t нзофермеїтшм локусам (Фелу лова. Подвижна, 1994).

Диилоилнзании и соїдаине реституционных линий

Как известно, гаплоидные растения не способны давать потомство, так как при отсутствии гомологичных хромосом нарушено прохождение мейоза, что ю результате приводит к формированию нежизнеспособных гамет (Сурма-кипа, 19S7). Для создания гомозиготных линий, способных участвовать в селекционном процессе, гаплоидные растения необходимо перевести на более высокий уровень плондности.

Дія сахарной свеклы известны различные способы получения полиплоидных форм на основе колхицин и ровання путем обработки I) сухих н прорастающих семян (Бормотов, Турбин, 1972; Savluky, 1968), 2) растений при образовании семядолей (Мое и на, 1967; Дсмчннская, 1968), 3) головок маточных корнеплодов (ІОсубов, M оси на, 1970; Rosenthal, 1958), 4) верхушек цветоносных побегов (Лутков и др., 1963; Emould, 1946). Применение современных методов биотехнологии позволило проводить диплоидизацию при культивировании тканей in vitro с меньшими затратами и времени. Но удвоение хромосом в условиях En vitro происходило у незначительного количества обработанных микроклонов - до 38 % (Bossoutrot, Hosemans, 1985; Hansen etal., 1994; Hansen, Andersen, 1998).

Проведенное нами изучение различных способов обработки микроклонов сахарной свеклы раствором колхицина показало различную эффективность их применения. При погружении корневой системы пробирочных гаплоидных растений в раствор колхицина было установлено, что длительность обработки (36 н 48 часов) и повышенные концентрации мутагена (0,2 - 0,3 °Ь) негативно влияли на обрабатываемые растения и увеличивали количество миксоплондов. При накалывании колхицина на апексы гаплоидных растений, выращиваемых в груїгте, было достигнута 100 % днплоидизапня при концентрации мутагена 0,20,3 "/а. Однако, недостатками этих методов оказался большой расход колхицина, трудоемкости, отсутствие быстрого размножения дннлоидизированного материала, что привело к необходимости проведения данного этапа работ в условиях in vitro.

Наши исследования показали, что добавление в питательную среду колхицина в кон цен грации 0,2-0,3 % вызывало латный некроз точек роста и гибель регенераігтов. Снижение концентрации мутагена до 0,1 % приводило к угнетению мнкроклонов, выживаемость их снижалась до 60-65 % диллоидизации подвергались 65,2-86,5 % выживших растений. Наиболее оптимальной оказалась концентрация колхицина 0,005 % при воздействии в течение двух суток. Количество диплоидных растений в данном случае составляло 83,3 % (рис. 3).

Цитологические »следования колхнцинировнных микроклонов позволили нам обнаружить у мнксошюидных растений постепенный возврат к гаплоидному уровню нлондностм.

Рис.3 Состояние реіенерантов свеклы после каїкицинировзния в условиях in vitro

Это происходит потому, что после обработки мутагеном некоторая часть клеток остается незатронутой действием колхицина, и так как цикл деления гаплоидных клеток примерно в 1,4 раза короче диплоидных (Даеояи и др., 1972), то через некоторое время гаплоидные клетки способны восстановить прежний уровень плонднослt растения. Вместе с тем, физиологически активные вещества группы шггокининов способствуют стимуляции деления полиплоидных клеток (ІСунах, Сидоренко, Зоснмович,1977; Nagl, Rucker, 1974), *гто было учтено в экспериментах [ІЛЛаратонова (1999) при научении стабилизации нлондности регенерантов сахарной свеклы после колхицинирования.

Проведенные исследования показали, что повышение концентрации кине-тнна в питательной среде (0,5-1 мг/л) способствовали воспроизводству полиплоидных клеток. Культивирование регенерантов после колхицинирования на среде с 0,25 мг/л кинетина в течение месяца приводило к образованию в растениях 0,1 % гаплоидных клеток, 96,4 % - диплоидных, 3,5 % - мнксоплондных { табл.3). Проверка нлоидностн через 90 дней показала наличие 100 % диплоидных клеток.

Полугенные авгоднплоилиые гомозиготные растения сахарной свеклы размножались в культуре in vitro путем регулярных нересалок на ростовую питательную среду (гиббереллин, кинетин, 6-БЛП по 0,2 мг/л). Пересадки на свежую питательную среду проводили через 4-6 педель, при этом отбирали наиболее жизнеспособные и неннфннированные растения. Сформированные реституционные линии пересаживали па питательную среду для корнсобразования, а затем в грунт теплицы. Наилучшим периодом посадки микроклонов в теплицу являлся весенне-летний период и смесь почвы с перегноем в качестве субстрата. Приживаемость микроклонов в данных условиях колебалась от 68,8 % до 87,5 %.

Таблица 3 - Влияние концентрации кннетина на воспроизводство клеток разной плоилност

Конце і пра- Количество устнппых клеток с числом Количество

цн я гормона. хлоронластоп, % (на 30 лень) ДИ1Ь10ИД0В,%

мг/л (90 день)

до 12 12-14 Gatee 14

1 0 27,4 72,6 35,0

0,75 0 49,3 50,7 60,0

0,5 0 73,9 26,1 80,0

0,25 0,1 96,4 3,5 100

контроль 9,5 85.4 5,1 20.0

Метод создания юмоиноппл линий сахарной сиеклы tía основе нидуинрования гаплоидны

Гомо»нотные линии сахарной свеклы поломают принудительным самоопылением растений исходной формы в течение нескольких поколений. Недостатками известного способа является длительность получения линейного материма, большие затраты, невозможность получения линий от самонесовместимых растений и форм, обладающих мужской стерильностью. Методом, ускоряющим процесс создания гомозиготных линий, является способ получения линий при помощи опыления кастрированных растений или МС-форм пыльцой, обработанной у-лучамн в дозе 1500-2000 Гр. (Л.с. № 1708210, Жужжалова и др., 1991).

Па современном этапе с развитием биотехнологии широкое применение нашел метод индуцирования гаплоилни в культуре репродуктивных органов.

Полученный нами в ходе исследований экспериментальный материал послужил принципиальной основой для разработки метола создания гомозиготного материала сахарной свеклы. Метод включает в себя несколько этапов:

•подбор донорского материала осуществляется путем использования любых генотипов, отдавая предпочтение гибридному и иннухтированному материалу. Для эксплантации используются веточки первого порядка и бутоны с 1 поЮ от цветка.

•индуцирование гаплоидных регенератов проводится с использованием предобработки холодом при температуре +4-6°C в течение 2-3-х суток н/кли рентгеновским облучением в дозе 3000 рентген. Культивирование нсоплодотво-ренных семяпочек осуществляется на питательной среде В,, содержащей 50 г/л сахарозы и гормональный комплекс: гнббереллин - 1 мг/л, б-СДП • 0,3 мг/л, ИМК-0,1 мг/л.;

-стабилизация гаплоидов осуществляется одновременно с микроразмножением и проводится в течение 3-4 пассажсй с чередованием ростовой (гнббереллин, киистин. б-БЛП по 0,2 мг/л) - безгормональной - ростовой сред для

нормально развитых регенерантов, и безгормонально К - ростовой - безгормо-налыюН сред для для слабо развитых адвентивных побегов.

•днплоцлизация гаплоидного материала осуществляется путем добавления в питательную среду 0,005% колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов. Стабилизация колхититрованных растений ведется при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинети-на в течение месяца.

•м икроразм ножен не' реституционных линий проводится путем регулярных пересадок на ростовую питательную среду.

•формирование корней осуществляется при культивировании мнкроклонов на среде с I мг/л ПУК. Затем следует пересадка клонов в грунт (рис.4).

В результате провезенных исследований нам удалось от одной исходной формы получать 6-38 гаплоидных регенераитов. Проведение всех последующих этапов позволило сформировать от 1 до 20 гаплоидных линий, а затем 1-18 реституционных линий. В конечном итоге 12 реституционных линий сахарной свеклы были переданы на Льговскую ОСС н в настоящее время участвуют в се-лекционо-генетической программе исследований.

ЭМБРИОКУЛЬТУРЛ В СИСТЕМЕ IN VITRO

Влияние возраста іксплаїїта на процесс регенерации в условиях in vitro

Половая гибридизация является одним из средств создания генетического разнообразия исходного селекционного материала. Однако лишь ограниченное число межвидовых и внутри видовых скрещиваний может привести к получению полноценных гибридных растений (Прилюк, 1984; Дунаева, 2000; Jassem, 1976; Bosemark, 1979; Bajaj, Gosa), 1982; Savitskry, 1981; МаІІпі, 1999). Невозможность осуществления тахих скрещиваний очень часто связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что, в свою очередь, может быть обусловлено либо его ранней гибелью, либо дегенерацией эндосперма.

Поэтому для эффективного получения определенной генетической комбинации желаемых признаков традиционными способами используют метод эмбриокультуры, позволяющий в условиях in vitro выращивать регенеранты из зигогических зародышей на рашых стадиях их развития.

В ходе проведенных нами исследований было выявлено, что на процесс регенерации п условиях in vitro большое влияние оказывает возраст экспланта. Введение незрелых зародышей сахарной свеклы в условия in vitro показало, что дальнейшее развитие наблюдалось у небольшой части эксплантов.

о.

Ж

о

ДЗнсрсмі: растения

КОДШ^смки;

Недевиї t ку.1іт\ ру

4к

fltpIKHOM

регенерант

еюричняі ptlCHCfUIH«, 6-ї шт.

СГІЇЯЇНИЦШ И M«»pípíJMH5*CK!ie tMUBUBf 0 Kill И Є г гландо s

craíii.iirwoHi а мш popí) ми о же ниє, JínCHOpOUHUe ПОЛИПЛОИД0(

*

<jk» ^ ^

KCpHeOÍfÍJOUHUÍ JKJ«ІДИ • rp)HT

Pite. 4 Схема получения гомошгогного материала сахарной свеклы Іп vitro

Общее количество полученных проростков колебалось от 1,3 до 33,9 по всего 25,8 % проростков били нормально развитыми (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние вотраста зародышей на получение жизнеспособных проростков

Возраст зародыша, дни после опыле-

_ния_

3 5 8 12

Ввелено эксплантов, шт.

157 307 186

163

Получено проростков

всего.

шт.

2 18 63 41

1.3 5,9 33,9 25,2

нормально развитых.

шт.

2 12 48 34

1,3

3,9

25.8

20.9

НСР005 0,39 0,39

Фенологические наблюдения позволили установить, что зародыши на ранних стадиях развития (3-5 дневные) формировали до 3,9 % нормально развитых проростков, но имели склонность в 20 % к образованию каллусной массы. По-видимому, недифференцированные ткани зародыша иод действием гормонов питательной среды начинали активно делиться, образуя каллусы. Наибольшей склонностью к дальнейшему развитию в условиях in vitro облазали зародыши 8-12-ти дневные. Очевидно, ото связано с тем, что в этот период происходит дифференциация тканей и активное формирование апикальных меристем и проводящей системы зародыша. Гормональный комплекс питательной среды, вероятно, в большей степени стимул и руст деление клеток развивающихся эксплантов, увеличивая тем самым количество проростков в условиях in vitro.

Культивирование незрелых 8-12 дневных зародышей вместе с тканями семяпочки снижало уровень образования проростков на питательной среде до 41 %. По-видимому, окружающие ткани ннгибпровали развитие зародышей, что значительно снижало и количество полученных регенеракгов. Подобное явление наиболее часто наблюдается при межвидовой гибридизации (Батыгима, 1974; Банникова, 19S6),

Согласно нашим наблюдениям, культивирование зародышей свеклы вместе с тканями семяпочки способствовало и более длительному формированию регенератов, которые визуально становились заметными через 8-14 дней нахождения в культуре и были слабо развитыми.

Вычлененные ш семяпочек 12-ти дневные зародыши (их длина не превышала 2 мм) имели четко выраженные семядольные листочки н первичный корешок, и их выживаемость в условиях in vitro достигала 98 а/ч. Введение в культуру вызывало активизацию деления меристсматичсскнх тканей, в результате чего к четырем дням культивирования ратмеры эксплантов увеличивались вдвое, появлялась окраска пню коптя и листьев.

Проведенные намн исследования позволили отметать, что на жизнеспособность незрелых зародышей в условиях культуры тканей влияет способ опыления. Ток, при свободном опылении МС-растений частота формирования регенератов была значительно ниже таковой при принудительном опылении этого же материала. Данная тенденция наблюдалась на различных этапах развития зародышей, и количество морфологически развитых регенерантов колебалось при свободном опылении от 0,6 до 22,7 % и в пределах 1,0-33,3 % при принудительном (рис.5).

) ) 1 11 гт ір,гт ті f ill и і

Рис.5 Развиїис зародышей в культуре in vitro при различных способах опилен ня

Очевидно, при принудительном опылении возрастала частота пібрндизапни и увеличивался процент жизнеспособных зародышей.

Проведенные нами попытки культивирования зрелых зародышей с целью восстановления селекционного материала in длительно хранившихся семян (урожай 1981 года) показали, что основную роль при этом играет геношн. У 9 изучаемых селекционных номеров лабораторная всхожесть семян колебалась от 0 до15 їй. В условиях in vitro прорастание ссмян наблюдалось в пределах 26,960,6 %. Количество нормально развитых растений из них составляло 11,5-33,7 % в зависимости от генотип ичсскнх особенностей материала.

Влияние условий культивирования на жизнеспособность за ролы шей

Одним из основных факторов при культивировании зародышей in vitro является состав питательной среди. Потребность изолированной завязи в пита* тельных веществах изменяются в зависимости оттого, в какой момент она была перенесена в условия in vitro - на ранних этапах, когда она содержит зиготу или ранний прозмОрно и ядерный эндосперм, или на более поздних стадиях, когда эмбрион дифференцирован и хорошо развит эндосперм (Butenkо, Strocorcov, Balabaeva, 1967; Fujimura, Komamine, 1975).

Экспериментальные данные, полученные нами в ходе исследований, подтвердили тот факт, что незрелым Зародышам в возрасте 3 дней для дальнейшего

развития требовалось наличие большего содержания сахарозы и гормонов в питательной среде. Количество нормально развитых проростков при этом не превышало 5,0 % (табл.5). С увеличением возраста зародышей их потребность в гормонах несколько снижалась.

Таблица 5 - Влияние состава среды и возраст зародышей на их жизнеспособность в условиях in vitro

3 дня 5 дней 8 дней

tfs Гормон. Кол-во Получено проростков

состав сахара. всего, норм. всего, норм. всего, норм.

среды. г/л % разви- % разви- % разви-

мг/л ты х.% тых,% тых,1! о

1 0 20 3,1 1,5 17,1 143 10,0 10,0

2 0 40 4,0 2,0 2*5 0 17,8 17,8

3 Гк, Кн, 20 0 0 1,0 0 33,3 25,0

ВЛП-0,2

4 Гк, Кн, 40 7,5 5,0 4.0 0 31,1 33,3

БЛН-0,2

5 Гк, Кн, 20 1,7 1,7 12,0 12,0 24,4 24,4

БАП-0,1

6 Гк, Кн, 40 1.7 1,7 12,0 12,0 48,6 48,6

БЛП-0,1

7 Гк.Кн-0,1 20 3,1 1,5 133 6,7 26,7 233

НУК-0,05

8 Гк,Кн-0,1 40 8,9 4,5 10,0 10,0 30,0 30,0

НУК-0,05

HCPojw • 0,31 031 1,19 1,18 1,66 2.02

Сопоставляя полученные данные, можно проследить общую тенденцию -частота образования проростков увеличивалась при наличии в питательной среде большего количества сахара. Так, культивирование 8-ми дневных зародышей приводило к формированию 10,0-25,0 % растений на среде с 20 г/л сахарозы, а содержание 40 г/л углеводов стимулировало регенерацию 17,8-48,6 % введенных эксплантов.

Наши опыты но изучению культивирования зрелых зародышей сахарной свеклы не выявили острой потребности их в.гормональных веществах. Наибольшее количество всхожих семян (59,5 %) и потом развитых регенератов (31,0 %) наблюдалось при культивировании семян на безгормональной питательной среде. Увеличение углеводного питания положительно влияло на прорастание семян в условиях in vitro.

Определенное значение при культивировании незрелых зародышей имеет и температурно-свеговой режим. В холе исследований было выявлено, что незрелые зародыши сахарной свеклы в условиях культуры тканей развивались

как на свету, так и в темноте. В тем новых условиях культнвировання происходило формирование большего количества недифференцированных структур -каллусы, разросшиеся и витрифнпированные ткани листьев и пшокошлей. Это увеличивало общее количество полу ченных проростков с 4,0 до 48,6 "і, но одновременно снижало и образование нормально развитых регенератов с 18,9 до 2,7 %. Культивировал не эксплантов на световом режиме снижало формирование недифференцированных структур и положительно влияло на развитие жизнеспособных проростков, количество которых увеличивалось с возрастом зародышей до 2^ -9,0 ЇІ.

Воіможлосгь применения эмбрио культуры для получения межвидовых гибридов и апомиктичных форм

Дикие сородичи сахарной свеклы, представленные видами , из секций Patellars и Corollinae, как правило, от скрещиваний с Beta vulgaris дают нежизнеспособные или стерильные в силу отсутствия гомологии между хромосомными наборами гибриды (Jassem, 1976). В настоящее время современная техника культуры зародышей и тканей делает реальным более интенсивное вовлечение диких сородичей в работу по переносу желаемых генов от-диких форм в культурные сорта сахарной свеклы.

Проведенные нами исследования по получению и дорашнванию в условиях in vitro межвидовых гибридов Beta vulgaris н Beta corolliflora, Beta trigyra показали, что недифференцированные зародыши прорастали на шттельноП среде с частотой 1,3-73 %, но на ранних стадиях развития погибали (рис.б)

□ ч^тетяфогыорсм*** np4po<t*4«. s qttjvtfmtttoatb ppepotries. s

Рис.б Развитие незрелых межвидовых зародышей в условиях in vitro

С увеличением возраста зародышей их жизнеспособность увеличивалась и достигала 25,0 % в скрещиваниях с В. corolliflora и 27,4 % с В. Irigyna. При этом также наблюдалась ранняя тбель части регенератов и образование не-' морфогенных структур. В результате этого выживаемость проростков снижа-* лзсь до 12^ и 16,2 % соответственно. Дальнейшее культивирование проростков

от межвидовых скрещиваний выявило наличие морфологических лрнзнахов диких видов свеклы.

Изучение в условиях in vitro селекционного материала с признаками ал сими ктнчес кого развития семян выявило низкую склонность клеток зародышевого мешка к автономному разшптао. Формирование апомиктнчных зародышей в условиях культуры тканей прежде всего зависело от генотипа донорского материала. Частота образования нормально развитых проростков колебалась от 1,4 % до 12,5 °/о. Однако следует отметить, что до 30,8 % проростков погибали на ранних стадиях своего развития.

На основании проведенных исследований установлены параметры культивирования незрелых » зрелых зародышей сахарной свеклы, позволяющие выращивать растеши в условиях in vitro от внутри- к межвидовых скрещиваний и восстанавливать ранее созданный и длительно хранившийся в семенах селекционный материал.

СОХРАНЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Влияние соетппа питательной среды при длительном беспересадочном культивирован ни

Проблема сохранения большого количества генотипов различных культур сейчас стоит очень остро. Хранение живой ткани в виде семян не всегда возможно, в Blue вегетативного материала • требует много затрат и большие земельные площади.В настоящее время наиболее надежной стала технология сохранения материала в условиях in vitro в виде растущих коллекций или в виде клеточных или мсрнстемиых культур, хранящихся в крнобанках при глубоком замораживании в жидком азоте (-196° С). Реально возможным при длительном сохранении материала в культуре in vitro является изменение состава питательной среды.

Проведенные нами исследования по изменению минерального состав питательной среды (замена хлорида кальция на нитрат) покатали, что повышенное содержание азота вызывало активный рост микроклонов в течение первых б месяцев культивирован к я, а затем наблюдался резкий спад ростовых процессов и некроз нижних листьев. В связи с этим выживаемость эшишпов к 9 месяцам суСкультивирования снизилась до 70 % при 75 % на контроле.

Аналогичная тенденция развития микроклонов была установлена при использовании сред с уменьшенным вдвое количеством макросолей. В результате этого к 12 месяцам депонирования не более 30 % растений оставались живыми.

Создание более плотной питательной среды за счет увеличения количества агара (до 16 г/л при норме 7 г/л) вызывало замедление интенсивности роста растений^ тем самым увеличивая беспересадочный период. В течение всего периода культивирования наблюдался замедленный рост мнкроклонов, не превышающий 0,6-0,2 см в месяц (табл.б). Выживаемость растений после 12 месяцев

депонирования колебалось от 80 % до 90 % на изучаемых вариантах сред при 45 % на контроле.

- В ходе экспериментов по изучению влияния различных концентраций сахарозы на длительность субкультивированиа микроклоков сахарной свеклы нами бььчо установлено, что уменьшенке'кол1Гчестваугл сводов (15-5'г/л при норме 20 г/л) приводило к активизации рбста в первое 4-6 месяцев, ¿йтсм, вероятно, из-за недостатка углеводного литания, происходила нскроптаци я листьев и гибель растений, при этом нх выживаемость к 9 месяцам субкультивирования снизилась до 75-80 %.

.Таблица 6 - Влияние модифицированного состава питательной среды на развитие микроклопов свеклы при депонировании

Ингибнруюшее Концен- Средний Период - 12 месяцев

тра*.

вещество цня, - ежемесяч- активно- отмершие выжива-

г/л ный при- го роста, листья, емость.

рост, месяц % %

см

Сахароза 5 0,5 6 55,0 75

Сахароза 100 0,2 4 68,0 65

Глюкоза 10 0.7 7 56,1 80

Сахаро* 10:4 0,07 4 62,5 80

зхсорбкт 13 ОД 12 30,0 ' 80

Агар - 0,6 5 69,0 60

Контроль

НСР 1,46 1,78

• Повышенное содержание сахарозы (40-60 г/л) не действовало угнетающе на растения свеклы, в течение 7 месяцев они активно росли. К 9 месяцам депонирования микроклоны имели 56,8 % и 51,3 % отмерших листьев, но их выживаемость составляла 100 % и 95 "/о. Снижение активности роста у растений наблюдалось с повышением количества сахарозы до 80-100 г/л. Высота о лига их растений по отношению к контролю составляла 61,7 %, а среднемесячный прирост не превышал- 0,2 см. После 9 месяцев субкультивирования микротомы сохраняли до 52 % живых листьев и 10О % выживаемость. Вероятно, такое увеличение каш честна сахарозы вызывало осмотический стресс у растений сахзр-ной свеклы, что позволяло замедлять рост и дольше сохранять жизнеспособность.

Наши исследования по замене сахарозы глюкозой в количестве 5-20 г/л показали, что равнозначная замена не оказывала ннгибирующего действия-на мнкроклоны свеклы. Период активного роста увеличивался до 7 месяцев, выживаемость после 12 месяцев субкультивирования составляла 60 %. Снижение количества глюкозы до 10-5 г/л способствовало сохранению 43,9-32,2 % листо-

вого аппарата и 80-85 % растений после 12 месяцев беспересадочного культивирования.

Проведенное намн изучен не состояния микроклонов при депонировании на питательных средах с частичной заменой сахарозы сорбитом (5 г/л сахарозы + 2-4 г/л сорбита) выявило, что у растений в первые 7 месяцев наблюдался активный'рост, а затем еще более активно началось обмирание нижних листьев, что повлекло снижение высоты растений от -0,7 до -0,9 см в месяц. К 12 месяцам депонирования при значительной гибели листового аппарата - 73,2-81,1 % резко снизилась выживаемость растений - 45-65 %.

Увеличение содержания сахарозы до 10 т/л и наличие 2-4 г/л сорбита снижали активность роста микроклонов и некроз листьев, тем самым увеличивая выживаемость зкеплшпов до SO % Наибольшим ингнбируюшим эффектом обладала питательная среда, содержащая 10 г/л сахарозы и 4 г/л сорбита, по физиологическое состояние растений этого варианта бьшо неудовлетворительным.

Для проведения дальнейших исследований нами были отобраны два варианта питательных сред - с повышенной концентрацией агара (13 г/л) и наличием глюкозы (10 г/л), позволяющие при длительном субкультивировании на них сохранять высокую выживаемость и жизнеспособность микроклонов сахарной свеклы.

Роль химических ингибиторов при депонировании микроклонов сахарной свеклы

Вое физиологические процессы, в том числе и рост, осуществляются через механизмы гормонально*ин гиб игорной регуляции, изменить направление которой в условиях in vitro возможно путем добавления определенного физиологически активного вещества в питательную среду.

В наших исследованиях для снижения активности ростовых процессов н увеличения сроков беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы было установлено, что применение гидразида малеиновой кислоты (ГМК) в концентрациях 0,5-2 мг/л оказывало стимулирующий эффект на растения. .Активизация роста экспла!гтов в течение первых 3-5 месяцев вела при дальнейшем культивировании к некрозу 70 % листьев и, следовательно, к отрицательной величине среднемесячного прироста -0,4-0,6 см. Это повлияло на выживаемость микроклонов, которая к 9 месяцам депонирования составляла ЗО-фО % при 75 % живых растений на контрольном варианте (табл. 7).

Аналогичное стимулирующее действие на растения сахарной свеклы оказывал препарат 2,4-Д. Активный рост отмечался в течение 7-8 месяцев у микроклонов, культивируемых на срезах с 0,001 и 0,01 мг/л 2,4-Д, высота itx достигала 4,7 см при 3,4 см на контроле. Некроз 71,9 % листьев после 9 месяцев культивирования приводил к снижению высоты растений на 0,9-1,2 см и выживаемости до 15 %.

Таблица 7 - Развитое микроклонов свеклы при субкультивировании ив средах, содержащих ингнбирующие вещества

Ингибируюшее Концентра- Средний Период 12 месяцев

вещество ция, ежеме- активно- отмер- .выжива-

мг/л сячный го шие ЛИ- емость,

прирост. роста, СТЬЯ, %

см месяц %

ГМК 0,5 0,5 5 - 60

2,4-Д 0,001 0,7 8 62,3 85 .

ССС 2,5 0,2 9 32,7 60

Салициловая к-та 0,2 0,6 6 64,7 • 95

Феруловая к-та 3.Û U 7 70,0- 55-

Контроль - 0.2 4 66,7 60

НСР 0,704 0,743

Увеличение концентрации 2,4-Д до 0,1 мг/л индуцировало образование каллусной и верифицированной тканей, что недопустимо при длительном культивировании гжсллангоа.

В ходе проведенных экспериментов нами было установлено, что добавление в питательную среду хлорхолинхлорида (ССС) в концентрациях от 0,05 до 1,0 мг/л не оказывало ингибируюшего эффекта на растения свеклы. Стимуляция роста, ках н в предыдущих опытах, при 12-ти месячном субкультивиро-ваннн приводила к 30 - 55 % гибели растений. Замедленный рост клонов в течение 9 месяцев был отмечен на варианте среды, содержащей 2,5 мг/л ССС. После 12 месяцев депонирования наблюдалась сохранность 67,3 % листового аппарата и 60 % растений. Наличие 5,0 мг/л ССС в среде сильно ингибнровало рост микроклонов, прирост был отрицательной величиной -0,1-0,2 см, в результате чего к 12 месяцам субкультнвнрования оставалось живыми лишь 50%экс-плантов. .■ ^

Применение в качестве ингибитора феруловой кислот не дало ожидаемого результата. Данный регулятор роста в концентрациях от 3 до 10 мг/л действовал как стимулятор, активизируя рост растений до 5,8 см в течение 5 месяцев, В результате последующего некроза листьев оставалось живыми лишь 35,5-24,7 % листового аппарата и выживаемость растений к 12 месяцам субкультивирования снижалась до 20-55 %.

При добавлении в питательную среду другого регулятора роста фенол ь-ной природы - салициловой кислоты, было установлено ингибируюшее действие данного вещества на микроклоны сахарной свеклы. Замедленный рост в течение первых б месяцев культивирования на средах, содержащих 0,001-0,8 мг/л салициловой кислоты, позволил к 12 месяцам депонирования сохранить 33,938,1 % листового аппарата. При этом выживаемость растений холебатдеь в пределах 60-95 %. Увеличение концентрации ФЛВ (1-2 мг/л) продемонстрировало наиболее сильный ингибирующий эффект по отношению к микроклонам сахар-

ной свеклы. Средняя величина прироста не превышала 0,3 см и выживаемость растений к 12 месяцам с)Окультивирования составляла 65-95 Однако физиологическое состояние растений было неудовлетворительным.

В результате проведенных нами экспериментов для дальнейшего изучения были выделены два варианта питательных сред, содержащие 2,5 мг/л ССС и ОД мг/л салициловой кислоты, позволяющие при небольшой величине среднемесячного прироста (0,2-0,6 см) в течение 9-12 месяцев депонирования сохранять 90-95 % микроклонов.

Гнстоінмнческое її аиатомо-морфологическое изучение микроклоноп сахарной свеклы при длительном беспересадочном культивировании

В основе роста к развития растений лежит реализация генетической информации, которая определяется системой эндогенной биологической саморегуляции, формирующейся под действием внешних факторов. Экспериментальное воздействие на растительную клетку экзогенных эффектонов вызывает изменение эндогенной регудяторной системы, экспрессию генетической информации, поднимает на более высокий уровень метаболизм растения (Кефели, 1984; Полевой, СоламзтЪва,'1991; Шевелуха, 1992).

Проведенные нами совместно с Цупиковой JI,A, (2002) гнегохимнчеекке исследования подтвердили общеизвестный факт, что наибольшая интенсивность реакций главных составляющих метаболических, структурных и функциональных основ клетки (белки, литщы, углеводы) проявлялась в период активного роста микроклонов. Этот период на контрольном варианте среды (безгормональная среда) длился 3-5 месяцев, на опытных вариантах - до 9 месяцев.

Нашими исследованиями било выявлено, что с увеличением срока депонирования микроклоцов происходило накопление белковых веществ: пептиды и ннзкомолекулярные белки обнаруживались в наружных, ассимилирующих тканях паренхимы, полипептиды накапливались в точках роста и окружающих их паренхимных тканях, белки ароматического ряда - в проводящих тканях и точках роста. У микроклонов, культивируемых на среде с ССС, отмечалось преобладание пет ид os и низком олекля рн ьгх белков, па других вариантах сред, и особенно с агаром, - полипетидных соединений.

При проведении анализа на наличие аминокислот было установлено, что наибольшая интенсивность реакции наблюдалась в точках роста, молодых листьях, в клетках эпидермы и проводящих сосудов. Это указывает на активность процессов метаболизма, идущих в данных тканях. В черешках листьев, в'старых листьях отмечено незначительное содержание аминокислот. Наличие ингиби-рующих факторов, особенно ССС it салициловой кислоты, снижало интенсивность реакции на аминокислоты. 1

Сопоставляя наши данные с результатами других исследователей (Кулас-ва, 1973, 1988; Бавнна, Константинова, Аксенова, 1975), можно предположить, что растительный организм в этом случае проявляет генетически закрепленную

целесообразность ответных реакции на воздействия экзогенных факторов, регулируя белковый синтез клеток в создавшейся ситуации.

Изучение ферментативной активности тканей растений свеклы при депонировании показало, что интенсивность качественных реакций к 9 месяцам с)б-культивирования достигала максимума, а затем уменьшалась. Качественная реакция на тггохромокендазу прявлялась с большей интенсивностью в ассимилирующих тканях паренхимы и проводя шей системе. Реакция на пероксняазу наблюдалась батее интенсивно в тканях точки роста и проводящей системе. На опытных Bapnairrax сред отмечалось снижение интенсивности реакций на ферменты, особенно на тггохромокендазу при культивировании с дефицитом глюкозы. Вероятно, недостаток углеводного питания снижал энергетическую активность дыхательных процессов. Снижение интенсивности реакций на фер-mcittu, вероятно, связано с приостановкой ростовых и структурно образовательных процессов в период депонирования. Нарушения в деятельности ферментных систем, по-видимому, также определяется действием генетических факторов, локализованных в ядре и других орган ел ах клетки, содержащих ДНК (Powling, 1982).

Усиление интенсивности реакции на аскорбиновую кислоту было нами отмечено в течении периода роста регенератов. Локализация аскорбиновой кислоты наблюдалась в зоне проводящих сосудов, эиндермалышх и паренхим-них тканях листьев и стеблей. Наличие в питательной среде химических ингибиторов и глюкозы снижало ишснснвность реакции на аскорбиновую кислоту.

Проведенная нами качественная реакция на глюкозу позволила выявить локализацию данного углевода в проводящих и ассимилирующих тканях и отметить возрастание н тенен в ноет и реакции при длительном культивировании. Наиболее интенсивное окрашивание препаратов отмечалось у растений, выращиваемых на среде с глюкозой.

Гистохимическое изучение микроклонов свеклы при депонировании из наличие крахмала показало, что в первые месяцы культивирования обнаруживались декстрины - промежуточные продукты гидролиза крахмала, растворимые в воде. Наиболее интенсивно они окрашивались в мернстематических тканях точек роста. При дальнейшем культивировании (З-б месяцев) крахмал был обнаружен в виде мелких зерен во всех ассимилирующих тканях, вдоль проводящих сосудов н в паренхимных клетках в основаниях точек роста. К 12 месяцам депонирования наблюдалось укрупнение крахмальных зерен, что свидетельствует о запасной функции данного углевода. Запасной крахмал локализовался в основном в паренхиме апикальной точки роста и основании пазушных точек роста. Мелкие фракции крахмальных зерен располагались вдаль проводящей системы преимущественно в верхней части побега.

Наличие в питательной среде ССС сокращаю количество мелких фракций крахмала во всех тканях растений, при этом крупных фракций отмечено не было. Повышенное содержание в среде агара стимулировало у культуральных растений образование амилоплаетов в клетках эпидермы. По-видимому, при осмотическом действии агара затруднялзсь нодача минеральных веществ из пи-

тотальной среды, что всю к обменным реакциям, направленным на накопление запасных веществ в виде крахмальных зерен.

В ходе исследований на наличие основного опорного полисахарида клеточных стенок растений - целлюлозы (клетчатой) нами было установлено, что с увеличением времени культивирования усиливалась интенсивность реакции. Ото свидетельствовало о накоплении клетчатки в тканях регенерантов, располагающейся вокруг проводящих сосудов. Наиболее яркой интенсивностью окрашивания были отмечены препараты растений, культивируемые 12 месяцев на средах, содержащих ССС и увеличенное количество агара. Действие ССС на процесс одревеснения изучено давно и применяется в сельском хозяйстве прежде всего для увеличения прочности садом ы у злаковых культур (Витвицкнй, 1979; Лаханов, 2001; Hoffman, 1974).

Растения сахарной свеклы в условиях in vitro представляют собой укороченные стебли с расположенными на них по спирали листьями, собранных в розетку. В пазухах листьев закладываются пазушные или боковые почки, ростовая активность которых зависит от состава питательной среды.

Проведенные нами цитологическое и анатомо-морфологнческое изучение черешков и листьев свеклы показало, что у растений, выращенных в условиях in situ, в "ушках" черешков с ребристой наружной стороны и вокруг центрального проводяшего пучка располагалось 2-3 слоя клеток уголковой колленхимы, паренхима состояла из 7-8 слоев мелких, плотно расположенных клеток, встречались сросшиеся кристаллы оксалата кальция - идиобласты. Все это придавало прочность черешку.

В черешках культу рал ьных растений нами было отмечено отсутствие уголковой колленхимы, наличие дополнительных проводящих сосудов, 3-4 слоя клеток паренхим ной ткани более крупных размеров и рыхлой структуры.

В ходе цитологического изучения поперечного среза листа растений in vitro выявлено формирование более крупных клеток мезофкла с рыхлой структурой. Проводящие пучкн данных растений были погружены, жилки не выступали над поверхностью листовой пластинки. V микроклонов, культивируемых на средах с комплексом гормональных веществ, наблюдались в центральной жилке листа слившиеся проводящие сосуды. Количество слоев клеток уголковой колленхимы вокруг жилок листа у микроклонов in vitro было в 2-2,5 раза меньше, чем у растений in situ. Также в листьях культур ал ьных растений отмечено значительно меньшее количество кристаллов оксалата кальция. У растений, лодвегнутых длительному беспересадочному культивированию, кроме всего было замечена беспорядочная структура палисадной паренхимы листа.

Рекультивирование микроклонов сахарной свеклы после депонирования

Длительное беспересадочное культивирование на питательных средах, содержащих ингибирующие вещества, является для растений сильным стрессом. При прекашснии действия экстремального фактора организм возвращается к оптимальным условиям среды, включая механизм репарации. В обшсм плане

он состоит из усиления всех заблокированных стрессом процессов (синтез, энергообразование и т.д.), нормализации разнообразных функций до оптимального уровня и зависит от мобилизации потенциальных возможностей различных физиологических реакций, изменений взаимосвязанных процессов, что обусловлено генетическими особенностями материала (Олейникова, 1976; Stocker, 1961).

Проведенные нами исследования показали, что ослабленные после длительного беспересадочного культивирования микроклоны свеклы проявили различную реакшпо при переносе их на свежую ниппельную среду. Растении, депонируемые на средах с измененным минеральным и углеводным питанием, на свежей питательной среде чувствовали себя прекрасно: активно росли (высота составляла 2,7 см) и формировали пазушные побеги, количество которых достигало 17 шт. на одну пробирку. Средний коэффициент размножения растений на гормональной питательной среде колебался от 8,2 ло 10 черенков (табл. 8).

Таблица 8- Действие ингибирующих веществ на рост и развитие

регенератов свеклы при последующем культивировании

№ Ингибиру- Концен- Ростовая среда Безгормональная среда

п/ юшне трации ср. высота ср. коэф. ср. высота ср. коэффи-

п вещества растений. размно- растений, циент раз-

см жения см множения

1 Са( NOjh &г/п 1,1 9.2 1,6

10 1,8 8,5 2,0 1

12 1,8 9,5 2.1 1

14 1.3 8,3 2.0 1

2 сахароза 5тУл 1,5 8,2 2.2 1

10 U 9,8 U9 1

15 1,4 10 2.5 1

3 салиншю 0,5 мг/л U 8,5 1,0 1

вая кисло- 1.0 1,1 10,8 0.9 1

та 1,5 1,2 8,0 3,0 1

2.0 0,8 7.8 0.0 1

4 тк 0,5 мг/л 0,9 10,2 U

1,0 1,0 10,8 0,9 1

1,5 U 9,2 1,1 1

2.0 1,0 9,8 1.4 1

5 Феруло- 0,5 мг/л 1.7 7,5 14 , .

вая 1,0 u 10 2,5 ... 1

кислота 1,5 1,7 9,0 3,3 1

2.0 M 9.3 1,5 I

Заметное последействие на рост регснерантов при культивировании на ростовой и безгормональной срезах оказывали ннпібігторьі роста, в частности салициловая кислота и ГМК. Средняя высота растений после 4 недель культивирования не превышал 1,3 см и 1,4 см на свежих средах. Это свидетельствует о том,что в тканях растений происходило постепенное накопление ингнСнрую-щнх веществ выше необходимого физиологического уровня, что вело в дальнейшем к появлению токсического действия и торможения роста. Однако данный факт не повлиял на пролиферацию пазушных меристем и коэффициент размножения составил 10,8. Длительное беспересадочное культивировал не на среде с феруло вой кислотой не оказало инпібируюшего действия на дальнейшее выращивание микроклонов в условиях in vitro.

Проведенные нами фенологические наблюдения позволили определить заметное влияние всех химических инпібітторов на морфологические признаки растений, проявляющиеся в формировании мелких, узких, с бледной окраской листовых пластинок.

Дальнейшее культивирование регенеранте в на гормональной ростовой среде для размножения привело к исчезновению морфологических отличий. При атом не отмечалось последействия ингибирующих веществ на последующих этапах микроразмножения, корнеобразования, посадки в грунт и вегетации.

Результатом проведенных исследований явилась разработка метода длительного беспересадочного культивирования микроклонов сахарной свеклы (до 12 и более месяцев), включающего несколько этапов: -введение и микрораэмножение материала; -депонирование на модифицированных средах; •рекультивирование и микроразмножение; -кор необразован не и пересадка в грунт.

Метод позволил создать коллекцию ценных генотипов сахарной свеклы, состоящую из 28 селекционных номеров, и сохранять их в течение 3-х лет. Л также в течение С лет поддерживать коллекцию стевии in 37 сортообразнов в условиях in vitro.

ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

Пути и способы воспроизведении растений сахарной свеклы в условиях in situ и in vivo

Морфогенез - процесс формирования, заложения, роста и развития органов (органогенез), тканей (гистогенез), клеток (цитокинез). В процессе роста и развития возникает целостный организм специфической формы в соответствии с генотипом вида и конкретными условиями существования. Можно сказать, что морфогенез - это процесс превращения питательных веществ в структуру тела.

Исследования, посвященные изучению морфогенеза у сахарной свеклы, немногочисленны и, в основном, освещают особенности органогенеза (Кобозева, 1962; Красочкин, 1971; Жужжалова, 1999) и взаимосвязь этапов органогенеза с возрастными изменениями растений в период развития (Фоменко, 2003).

Онтогенетическое развитие растений сахарной свеклы в условиях in situ начинается с прорастания семени, при этом меристем этическая верхушка стебля в основании семядолей являе!ся очагом листообразования. Листья формируются в течение всего вегетационного периода и располагаются по спирали. В первый год вегетации образуется корнеплод и розетка листьев. Головка корнеплода является стеблем с укороченными междоузлиями, с верхушечной н пазушными почками. Верхушечная почка находится в центре головки корнеплода, и из нее формируется центральный стебель с листьями. Из пазушных почек образуются побеги второго порядка. Почки дают начало цветоносным побегам на 2 году жизни или позднее.

Согласно литературным источникам и собственным наблюдениям (Ха-речко-Савицкая, 1940; Зайковская, 1968; Жужжалова, 1971; Подвигина, 1994) воспроизведение нового организма у сахарной свеклы происходит прежде всего путем формирования семени в течение 28 дней. Развитие зародыша в этот период условно делится на следующие этапы:

3-х дневный - четырех клеточный нрозмбрио;

5-ти дневный - шзровндный зародыш на суспснзоре;

8-ми дневный - сердцевидная стадия зародыша;

12-ти дневный - торпедовидная форма зародыша;

16-ти дневный - зародыш изгибается по форме зародышевого мешка и

достигает его половины;

20 -тн дневный - зародыш достигает 3/4 размера зародышевого мешка; 24-х дневный - зародыш дорастает до халазального конца семяпочки н принимает кольцеобразную форму;

28-ми дневный - заканчивайся полная дифференциация зародыша. Анализируя литературу, также было выявлено, что кроме полового пути образования нового индивидуума у сахарной свеклы наблюдается бесполый путь при семенном воспроизведении, проявляющийся в явлениях полизмбрио-нии и апомиксиса. При полиэмбрионии наблюдается образование двух и более зародышей в одном зародышевом мешке или семени. Аналогичное явление отмечалось ранее другими исследователями у многосемянных форм свеклы как аномальное (Хорсчко-Савн икая,1940; Зайковская, 1968) и рассматривалось как проявление близнецовостн (Добрсиова, Лутков, Макжос, 1965; Kruse, 1960). Позже была установлена цитоэчбриологическая (Жужжалова, 1978) и генетическая (Мхзсикнй, Малецкая, Костыря,1988) природа данною явления, подтверждающие факт формирования репродуктивных органов.

Наличие нуцелярных (Зайковская и др., 1978; Сеилова, Коновалов, Балков, 1994) и интегументальных (Сеилова, Абду рахманов, Хайленко, 1984) зародышей (эмбриоидов) было обнаружено у некоторых форм свеклы, обладающих элементами алочиктического размножения.

Сахарная свекла обладает способностью н к вегетативному размножению, основанное на отделении ростовых почек к новых растения от материнского организма. Получение клонов с головки корнеплода нашло свое широкое при-мелен не в селекционной практике сахарной свеклы в прошлом веке (Мазлумов, 1996). Для ускорения селекционного процесса, а главное, для обеспечения участия в направленном регулировании опыления, корнн-пелнгрн резались на 6-8 частей, из которых одну часть использовали для клонирования, а остальные -для получения семян а этом же году. С части корнеплода, предназначенного для размножения, после укоренения вырезали 1-5 клонов и снова укореняли. Таким образом в течение 3-4 лег получали 300 и более клонов, идыглеших материнскому растению.

Кроме того, у сахарной свеклы обнаружено такое явление, как **герраго-логическос изменение" - возникновение растений из меристем л их тканей стебля. У растений 2 года жизни наблюдается образование на стеблях вегетативных проростков, представляющих из себя сформированную розетку листьев, укороченный стебель и корневую 'lacTb. При отделении данных растений от материнского организма и посадки в грунт, они достаточно хорошо приживаются (60%), что может быть использовано в селекционной практике для сохранения исходных форм. Аналогичные данные отмечались и другими исследователями (Тутаюк, Алиева, 1975; Нужд и на, 1992; Цупнкова, 2002).

Согласно литературным данным и собственным наблюдениям, у сахарной свеклы морфогенез в условиях in situ и in vivo может осуществляться патовым и беспалым путем, вызывая образование новых оргашпмов. Поэтому сахарная свекла размножается семенами и вегетативными структурами, Ото дало нам основание налагать, >tro развитие растений свеклы в условиях in situ и in vivo подчиняется закономерностям, выявленных для высших цветковых растений, и определить пути морфогенеза: при семени ом патовом размножении как эмбриогенез, при семенном бесполом - эмбриоидогенез, при вегетативном - геммори-зогенсз.

Цитоэмбрн алогические особенности эмбриогенеза, змбрноидогеиеза и органогенеза у сахарной свеклы в условник In vitro

Реализация конкретного пути морфогенеза в условиях in vitro детерминирована, т.е. в значительной мерс определяется генетическими и физиологическими характеристиками индивида и условиями культивирования. Пластичность растительных клеток весьма высока, что вероятно, определяется их тотн-потентностью и ведет к глубоким морфогспстическим перестройкам на разных этапах развития* организма. Такие перестройки могут быть вызваны нарушениями определенных морфогснетнческих корреляций на клеточном, тканевом, органном и орган и змеином уровнях.

Морфогенез в условиях in vitro осуществляется различными способами и имеет разные морфатогичсские проявления при получении регенерантов. Кок

показали маши исследования в культуре ткан ей сахарной свеклы воспроизведение растений идет путем прямой регенерации и через каллусогснсз.

Формообразовательные процессы развивающихся зкеплаїггов сахарной свеклы (вегетативных и генеративных структур) достаточно часто осуществляется посредством каллусогенеза. Каллус - это гетерогенная структура, образующаяся в результате пролиферации клеток на раневой поверхности растительных объектов. Каллус представляет собой гетерогенную интегрированную систему, поскольку образуется из исходно разных клеток генеративных или вегетативных органов. Его морфогснетнческнс нотенннм видоепенифнчны н могут меняться в процессе генезиса и в определенной степени зависят от определенных факторов (температуры, влажности, времени культивирования и тл.). Каллус состоит из неоднородных клеток, тотмпотеипгость которых различна, что и определяет ttx различные пути морфогенеза.

Проведенные нами исследования показали, что при культивировании вегетативных и генеративных структур сахарной свеклы под действием гормонального комплекса тггательной среды формируются морфогенные каллусы (более плотной, мелкозернистой структуры, белого или желтоватого цвета), склонные к образованию корней - ризогенез, ростовых почек - гемчогенсз, реже все вместе - гемморизогенез. Рыхлые, водянистые, крупнозернистые каллусы чаше всего не способны к органогенезу и быстро нскротнруют. Воспроизведение растений из каллусных структур возможно при геммогенезе и гемморнзо-генезе, если не наблюдается физиологических отклонений в развітні ре ген е-рантов. Часто индуцирует развитие каллусов у экоьзантов сахарной свеклы присутствие в питательной среде цнтокининов, особенно б-БЛП, но этот гормон вызывает витрнфикашно тканей регенерантов, что недопустимо на многих этапах культивирования. Но в связи с тем, что каллус является нестабильной системой и при этом увеличивается период получения регенератов, то памп был выбран путь прямой регенерации новых особей свеклы из генеративных и вегетативных структур в условиях in vitro.

При прямой регенерации наблюдается несколько путей морфогенеза культивируемых структур сахарной свеклы.

1. При культивирован ни незрелых зародышей про и сході гг морфогенети-чсское развіпие путем эмбриогенеза. Проведенные нами цитоэмбриологические исследования эмбриогенеза в культуре незрелых зародышей показали, 'по развитие глобулярных зародышей в условиях in vitro значительно отличались от развтня зародышей, экешшгтированных на более поздних этапах роста. У глобулярных зародышей не наблюдалось дифференциации тканей, а образование регенерата происходило за счет активного деления клеток ззрооыша в течение 4-6 недель культивирования. Изолированные сердцевидные зародыши в течение 2-3 недель формировали семядоли к первичный корешок, торпедо-видные зародыши на 2-3 день культивирования приступали к активному росту и формировали регенераты.

2. Формирование эмбриоидоп (эмбрпондогенез) из половых клеток зародышевых мешков, ведущих к образованию гаплоидных регенерантов в культуре

неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, осуществляется за счет активизации деления пшлоііл'іых клеток /год действием гормонального комплекса среды (Подвигана, 1994). В ходе исследований по изучению эмбрноидогеза нами било установлено, что все клетки зародышевого мешка способны к дальнейшему развитию. Через два дня нахождения в культуре in vitro в зародышевых мешках наблюдалось активное деление клеток яйцевого аппарата или антипод. В большинстве случаев зародыши формировались в мнкропилярной зоне и по истечении 3-х дней культивирования состояли из S-12 клепок н имели форму овала. К S-му дню нахождения на питательной среде зародыши приобретали форму шара па ножке, размеры которого значительно увеличивались и к 20 дню заполняли все пространство зародышевого мешка. Следует отметить, что в данных условиях не наблюдалось четко выраженой дифференциации клеток зародыша, отложения крахмала в клетках нуцелуса и формирования перисперма. После 28 дней культивирования зародыши разрывали интеїумеїггьі н появлялись на поверхности семяпочки. В это время наблюдалось появление семядольных листочков и первичного корешка. Дальнейший рост и развитие гаплоидного проростка происходило за счет компонентов питательной среды.

Анализируя подученные данные, нами установлено, >гто эчбриоилы на начальных этапах развития проходили стадии, аналогичные формированию зи-готических зародышей, только несколько быстрее. При этом отсутствовало формирование ссмени и его частей - эндосперма, перисперма, оболочки и периода покоя в условиях in vitro.

3. Образование эмбрноидов из соматических клеток вегетативных структур (эмбрноидогенез) (Жужжалова, 1999). Формирование эмбрноидов наблюдалось на черешках листьев молодых проростков из клеток эпндермалыюго слоя. Сердцевидные многоклеточные структуры при дальнейшем культивировании преобразовывались в росговие почки, а затем в растения.

4. Формирование адвентивных побегов (геммогенез) определяется потенциальной способностью клеток к іигтоднфферснцировкс и трансформации в другие клеточные типы, Проведенные нами цитологические исследования установили, что оранообразовательный процесс у эксилаитов сахарной свеклы начинался с возникновения в субэпкдермальном слое клеток черешков и гип окотил ей гаплоидных или диплоидных проростков инншіальной клетки. После деления ее по типу дробления формировалась сферическая масса мелких изоднаметрнчсских клеток - мсрнстсматический очаг. Наблюдалось единичное и множественное образование мсистематических очагов, когда бугорки делящихся клеток располагались кучками рядом друг с другом. Меристематическис бугорки имели дорсовеїпральное строение. На внешней стороне бугорка затем начинались пернклинальные деления по всей окружности. Это приводило к образованию серповидного валика и при морди я первого листа. ПрнморлиЙ листа появлялся в виде серпа в листал ыюЙ части периферической меристемы. При дальнейшем росте первый лист постепенно обрастал среднюю часть меристем am чсско го бугорка, а внутренняя часть в ходе своего развития приобретала яйцевидную форму. Позднее наблюдалась

дифференциация клеток внутренней части ростовой почки, в которой выделялись три зоны - апикальная, средняя и базальная. В апикальной зоне происходило разрастание одной из ее латеральных (боковых) сторон, в результате чего формировался следуший примордий листа. В средней части ростовой почки формировался тяж камбия, идущий от ближайшего проводящего пучка. Базальная зона ростовой иочкн являлась основанием, соединяющим почку с тканями материнского растения.

Визуально ростовые почки на начальных этапах своего развития выглядели в виде белых крупинок, расположенные одиночно или (руинами, наблюдались на тканях разросшегося птокотиля, черешков и центральных жилок листьев. По истечении 2-4 недель из них формировались нормально развитые регенераты, количество которых достигало 8-12 іщук на один первичный проросток.

В условиях in vitro при создании экспериментальных систем со строго определенными, регулируемыми условиями, свойство тотнлотентности растительных клеток проявляется в большей степени и пути морфогенеза у эксплан-тов сахарной свеклы (генеративных и вегетативных структур) развиваются в следующих направлениях:

- эмбриогенез - культура незрелых зародышей;

- змбиоіцогенез - культура неоилодотворенных семяпочек при индуцировании гаплоидии или культивирование вегетативных структур;

-органогенез 1. геммогенез - формирование адвентивных побеюв на кат-лусе, черешке листа, гипокотиле регенеранта; 2. рюогенеа - образование корней иа регенеранте и/или каллусе; 3. ісмморизогенез - формирование проростка с корнем на каллусе или сегменте растения.

Воспроизведение растений для дальнейшего микроразмножения в условиях in vitro происходит со всех направлений морфогенеза, кроме ризогенсза (рис. 7).

Рис. 7 Направления морфогенеза в культуре in vitro эксплаытов сахарной свеклы

выподы

1. Определено влияние эндогенных факторов на индукцию гаплоидных регенератов. Установлено, что наилучшей регенеранионной способностью обладают маатсриалы гибридного н линейного происхождения {в среднем 5,5 и 4,9%). Снижение выхода гаплоидов наблюдается у донорского материала сор-то в-популяций и форм с ЦМС - 2,0?4. Формирование женского гамстофнта генетически связано с процессами дифференциации мужского, поэтому аномалии развития в мужском гамсгофнте являются надежным маркерными признаками при отборе донорского материала. Показана положительная корреляция между количественным выражением аномального развития мужских гамет и регенерац ионной способностью нсо плод отворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro. Рс генерационная способность неоплод отворен пых семяпочек завиатг от стадий развития макро гамстофнта и расположения экспланта на семенном растении. Частота формирования гаплоидов 4,5% отмечалась у семяпочек, содержащих 7 клеточный /8ядерный зародышевый мешок и расположенных на центральном побеге цветущего растення свеклы.

2. Установлено влияние экзогенных факторов на регенерацнонную способность нсо плод отворенных семяпочек сахарной свеклы в культуре репродуктивных органов. Увеличение выхода гаплоидных регенерантов до 4,9% отмечается при эксплантации семяпочек с растений, выращенных в открытом грунте. Преобрабогка семяпочек холодом, изолированных с растений, выращенных в летний период, в течение 3-х суток вызывает 4,21% нндукиин гаплоидов. Обработка пониженной температурой эксплантов с тепличных растений при экспозиции 2 суток стимулирует развитие до 6,15% регенерантов. Рентгеновское облучение донорского материала в дою до 3000 рентген индуцирует ре генерационную способность неоцлодотворенных семяпочек до 5,3"о.

3. Гормональный состав питательной среды определяет индуцирование гаплоид и и в условиях in vitro. Наличие в среде 2 мг/л гиббереллина вызывает развитие гаплоидного зародыша путем прямой регенерашт непосредственно из клеток зародышевого мешка. Добавление 6-ВАП или кннстнна в концентрации 0,1-0,3 мг/л стимулирует развитие каллусогепеза. Комплексное действие гиббереллина, 6-БАГ1, НМК индуцирует формирование адвентивных побегов (вторичная регенерация) на структурно измененных гаплоидных проростках в количестве 6-8 растений на один первичный эксплант.

4. Разработаны элементы стабилизации гаплоидных форм в записи мост и от морфологического развития регенерантов. Для нормально развитых регенерантов, полученных путем эмбрпоплогепеза, этап стабилизации и микрораз-множен ия заключается в чередовании срсл: ростовая (Гк, Кн, б-ПАП по 0,2 мг/л)- безгормональная - ростовая. Для менее развитых алвснтивнык"побегов необходим сначала культивирование на безгормональной, потом на ростовой среде. Это позволяет добиваться %"о выживаемости гаплоидных регенерантов.'

5. Формирование реституционных линий сахарной свеклы определяется режимами колх и пикирования и стабилизации. Добавление 0,005? о колхицина в

питательную среду и культивирование на ней в течение 2 суток ведет к удвоению хромосом у 83,3% гаплоидных растений. Окончательная ди арендизация обеспечивается при культивнроваини автоднплоидов па питательной среде с 0,25 ыг/л кинетнна. '"

6. Разработан метод получения гомозиготного материала путем индукции гаплоидии из неоплолотворенных семяпочек сахарной свеклы, включающий следующие этапы: подбор донорского материала н введение в культуру; индуцирование гаплоидии; стабилизация и мнкроразмножение гаплоидов; липлои-дкзация и стабилизация реституционных диплоидов; микроразм пожени с нового исходного материала; корнсообразован не in vitro и пересадка в грунт.

7. Разработаны основные параметры культивирования незрелых зародышей. Лимитирующими факторами, обеспечивающими наибольший уровень регенерации являются 8-12 дпевпый возраст зародыша в период активной дифференциации тканей, соблюдение температурно-светового режима (культивирование в темноте в течение 4-х недель при температуре +23-25° С ), состава питательной среды (нал»пне 40 г/л сахарозы н физиологически активных веществ).

8. Модифицирован состав питательной среды В3 для проведения депонирования микроклонов сахарной свеклы в течение 12-18 месяцев. Замена в питательной среде сахарозы глюкозой (10 г/л) позволяет при 7-ми месячном замедленном росте растений к 12 месяцам культивирования сохратгтъ 44% листового аппарата и 80% живых клонов. Увеличение количества агара (13 г/л), повышающее плотность среды, при росте микроклонов в течение года сохраняет 60% листьев и 90% регенерактов. Добавление в питательную срсду ретарданта ССС (2,5 мг/л) и салициловой кислоты (0,2 мг/л) оказывают влияние на замедление роста микроклонов, их максимальный среднемесячный прирост не превышает 0,2 см, и выживаемость растений после 12 месяцев депонирования составляет 90-95%.

9. Присутствие в питательной среде ингнбширов роста снижают активность жизнен о важных физиологических процессов (активность дыхательных ферментов, аскорбиновой кислоты), тем самым замедляя рост м и кро клонов. В тоже время ингибирующне вещества способствуют накоплению белков, крахмала, лигнина, увеличивающих жизнеспособность эксплантов при длительном субкульти вироваини.

10. Длительное беспересадочное культивирование микроклонов сахарной свеклы на средах, содержащих ингибирующне вещества, способствовало накоплению их в тканях растений. Активное последействие этих веществ проявлялось в начальный период рекультивирования материала в виде торможения роста, снижения активности "пролиферации пазушных побегов, измельчении листовых пластинок в условиях in vitro и в период вегетации в rpyine в удлинении головки корнеплода.

11. Процесс морфоген этического развитая растений сахарной свеклы в условиях in situ, in vivo определяется прежде всего геиотиличеекмми особенностями материала и проявляются в существовании двух способов воспрокзведе-

ния - полового it бесполого it двух типов размножения - семенного и вегетативного. Направления морфогенеза в данном случае наблюдаются следующие: при семенном половом - эмбриогенез, при семенном бесполом - эмбриондогенез, при вегетативном - гем мори зогенсз,

12. Морфогенетическое развитие эксплактов сахарной свеклы в условиях in vitro определяется гормональным комплексом питательной среды и происходит путем эмбриогенеза (культура незрелых зародышей), омбриоидогеиеза (культура неоплодотворенных семяпочек при индуцировании гаїїлонлин), органогенеза: ' ~

1) геммогенеза - формирование адвентивных побегов на каллусе, черешке листа, гипокошле регенеранти,

2) рюогенеза - образование корней на регенеранте it/нлн каллусе,

3) гемморизогенеза - формирование проростка С корнем на каллусе

или сегменте растения.

Рекомендации для практического использовании

1. Разработанный метод получения гомозиготного материала сахарной свеклы рекомендуется широко использовать в селекционной практике для создания нового исходного материала и высокопродуктивных сортов и гибридов.

2. Дія создания меристемных коллекций ценного селекционного материала сахарной свеклы рекомендовать метод длительною беспересадочного культивирования клонов на модифицированной питательной среде (увеличенное содержание агарадо 13 г/л).

3. Разработанные параметры культивирования незрелых зародышей следует использовать при получении гибридных растений от несовместимых и межвидовых скрещиваний и восстанавливать длительно хранившийся в семенах селекционный материал.

4. При разработке новых селекционных программ и технологий по ускоренному созданию нового исходного материала и высокопродуктивных гибридов рекомендуется широко применять разработанные для сахарной свеклы современные методы биотехнологии: получение гомозиготных линий методом гаплоид и и, эмбриокультуры, длительного сохранения материала.

5. Полученный в результате проведенных исследований материал (гомозиготные линии, селекционные линии после депонирования, восстановленный материал - урожай 1981 г.) целесообразно использовать в селекционном процессе.

Список основных pa бог, опубликованных по теме днесерташш

1. Жужжапоад Т.П. Особенности мейоза у ннбредиых линий сахарной свеклы /Т.Н. Жужжалова, В.В. Знаменская, O.A. Подвипша//Гамсто1енез, оплодотворение и эмбриогенез семенных растений, папоротников и мхов: Тез. докл. IX Всесоюз. совсщ. по эмбриологии растений, Кищенсв, 1986 г.: Тез. докл. - Ктосиеа; Шгииица, 1936. • С.55.

2. Подвиги на ОЛ. Особенности микроспорою юза н ферткльностн пыльцы ии-Средних линий сахарной свеклы /ОЛ. Подвипша, Т.П. Жужжалова/ЛЬгтшогия и анатомия культурных растений: Сб.науч. трудов ио прикладной ботанике, генетике и селекции. - Т. 124,-Л „ 1989. - С.83-85.

3. Подвипша O.A. Особенности микроспорогснеза у сахарной свеклы /O.A. Под-вигина. Т.П. Жужжалова, В.П. Ошсанев // О кто генетика высших растений: Bcecotoi, научной конфц Кишенея, 17-18 октября 1989 г.: Tea. докя. - Кишинев: Штнипца, 1989. -С.208-209,

4. Подвипша O.A. Влияние инбридинга на формирование мужского гачек»};ига сахарной свеклы // Рукопись во ВНИИТЭИ Агропром 30.01.89 - Госагроиром СССР.' 153/2. ВС-89 Дел.

5. Подвигииа ОЛ. Особенности формирования мужского гаметофига у самофер-тильных лини И-закрепителей ЦМС сахарной свеклы /ОЛ. Подвипша, Т.Н. Жужжало-ва, В.П. Ошевнсв, H.H. Грибанова // Резервы увеличения производства сахарной свеклы и сахара: Сб. научных трудов Всероссийского НИН сахарной свеклы и сахара.- Воронеж, 1990, - С.42-47.

6. Знаменская В.В. Индукция гнногенсза у сахарной свеклы /Й.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова, O.A. Подвиги на // Новью методы биотехнологии растений. Российский симпозиум, Пущино, 18-20 мая 1993г.-Пущине, 1993.-С.141,

7. Подвипша O.A. Культура н со плодотворен них семяпочек in vitro, как способ получения гаплоидных растений /O.A. Подвипша // Обеспечение эффективности функционирования производственного потенциала АПК России в условиях рыночных отношений: Сб.науч. тр. - Воронеж, 1993.- С.127-128.

8. Подвигииа O.A. Экспериментальное получение гаплоидных линий у сахарной свеклы / O.A. Подвиги на, В.В. Знаменская, Т.П. Жужжалова И Апомикеис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований: Труды междуиэр. симпозиума, Саратов, 21-24 июля 1994 г. - Саратов,' 1994. - С.122-123.

9. ФеДулова Т.П. Изофермснтние маркеры в идапифмкации гаплоидов сахарной свеклы /Т.П. Федулова, ОЛ. Подвипша // Молекул «рно-генетические маркеры и селекция растений: Матер, конф., Киев, 10-13 мая 1994г. - Киев: Аграрна наука, 1994. -С.69,

10. Подвиги на O.A. Морфогенетическая оценка допори ых растений при н планировании гаплоидов у сахарной свеклы /O.A. Подвипша, D.Ö, Знаменская, Т.П. Жужжалова // Молекуглриочснетичсские маркеры и селекция растений: Матер, конф., Киев, 10-13 мая 1994 г. - Киев: Аграрна наука, 1994.-С.121.

11. Знаменская В.В. Создание нового исходного материала в селении» сахарной свеклы /В.В, Знаменская, ОЛ. Подвипша, Т.П. Жужжалова // Сахарная свекла. - 1994, JSf б. - С8.

12. Знаменская В.В. Новый метод получения нового исходного материала в селекции сахарной свеклы / В.В. Знаменская, ОЛ. Подвипша // Методы комплексной оцен-

кн продукт31 [ости и устойчивое™ сельскохозяйственных растений: Сб. науч. трудов, -М., 1991.-С. 18-19.

13. Полянина О.Л. Индуцирование ганлоидии у сахарной свеклы: Лвтореф. дис, „.канд. с/х наук /O.A. Подвигина. -Рамонь, 1994. - 18 с.

14. Подвигнна О.Л. Индуцирован не гаплоидов у сахарной свеклы /О.Л. Подвигнна. B.D. Знаменская //Пути повышения эффективности свеклосахарного нротводства России в условиях рыночной экономики : Всероссийская научно-практическая конференция, Рамонц 1996 г.: Тез докл.- Рамонь, 1996. -С-57-58.

15. Знаменская В.В. Влияние физических воздействий на per«¡ерашонную способность нсовдолот коренных семяпочек сахарной свеклы /В.В. Знаменская, ОЛ, Нод-внгина, ПЛ. Тарэтонов // Биологии кллок растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция, Москва. 25-28 ноября 1997 г.: Тез. докл.-М,, 1997. -С.97.

16. Знаменская В.В, Микроклональное размножение Beta vulgaris/В.В. Знаменская, ОЛ, Подвиги Pia // Биология клеток растений in vitro,' биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная конференция, Москва, 25-28 ноября 1997 г.: То. ДОКД.-М., 1997.-С.419.

17. Подпитка О.Л. Депонирование сахарной свеклы в культуре in vitro /ОЛ. Подвигнна, В.В. Знаменская, Л.А. Пупнкова // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международная комферсинн», Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез.докл. - М., 1997. - С.529,

18. Федуловл Т.П. Использование малекулярно-геиетическнх маркеров при культивировании растительных клеток сахарной свеклы in vitro /Т.П Федулова, Т.П. Жуж-жазова, О.Л. Подвигнна, И.Н. Горина // Пнология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: VII Международна* конференция. Москва, 25-28 ноября 1997 г.: Тез. докл.-М., 1997.-С.353.

19. Подвиги на ОЛ. Эмбриологическое изучение гиногенеза сахарной свеклы в условиях in vitro /O.A. Подвигнна, Т.П. Жужжалова // Проблемы ботаники на рубеже XX-XI веков: 11(х) схезд Русского ботанического общества. CaHKt-IIeiepCjpr, 26-29 мая 1998 г.: Тез докл. - Т.1. - С.-Петерб>рг, I998.-C.128.

26. Знаменская В.В. Пути морфо! слеза в культуре неоплодогворсмиых семяпочек Beta vulgaris /В. В. Знаменская, O.A. Подвигнна // IV съезд общества физиологов растений России. Международная конф., Москва, 4-9 октября 1999 г.: Тез. докл. - М„ I999.-CJ85.

21. Подвит на O.A. Депонирование селекционного материала сахарной свеклы в условиях in vitro /ОЛ. Лодвигина, В.В. Знаменская, Л.А. Пуиикова// Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и иперензрии, Матер. Ц Международной конференции, Москва, 18-19 октября, 2000 г. - М.. 2000. - С. 210-211.

22. Подвигнна ОЛ. Депонирование селекционного материала сахарной свеклы на искусственных шггательных средах /O.A. Подвигнна. В.В. Знаменская, ЛЛ. Цупмкоаа //Сахарная свекла. - 2000, № 12. - С. 18-19.

23. Знаменская В.В. Влияние состава питательных сред на atiBitetnoeoöiioCTb экс-ататов при длительном культивировании Betavulgaris/B.B. Знаменская, ОЛ. Подвигала //11 съезд Вавнлоаского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля, 2000 г.: Тез. докл. - Санкт-Петербург, 2000. - С. 146-147.

24. Знаменская В.В. Регенерацией кзя способность семяпочек сачврной снеклы /В.В. Знаменская, Подвигнна ОЛ, H.A. Тора тонов // Сахарная свекла. • 2001, Ат 6. - С.' 16-18. '

25. Подвигина ОЛ. Влияние горчоїіальїюго состава питательных сред на индукцию гаплоидии сахаріюЛ свеклы / ОЛ. Подвигина, В.В, Знаменская // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях: VI Международная конф., МоекваЗООІг.: Тез. докл. - М.: Издательство МСХА, 2001. - С. 186. ■ •

26. Подвипіка О.Л. Индукция рюогенеза у сахарной свеклы в культуре m vitro /В.В. Знаменская, ОЛ. Подвигана, В.В. Фратова // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях; VI Международная конф„ Москва, 2001г.; Тез докл. - М.т Издательство МСХЛ, 2001. - С.160.

27. ПодяигикаОЛ. Пути морфогенеза при индукции гаплоидии in vilro у сахарной свеклы /ОЛ. Подвигина /Л'оютические основы эволюции и селекции: Материалы межригиои. коиф„ Воронеж, 16-18 октября 2002 г. - Воронеж, 2002. - C.48-SO.

28. Корниенко Л.В. Методы биотехнологии в селекционной практике / АН. Корниенко, Т.П. Жужжалова, В,В. Знаменская, ТЛІ. Федудова, О.Л. Подвигина, М.Л. Богомолов, Н.Н. Черкасова // Сахарная свекла. - 2002, № 9. - С.25.

'29. Подвигина ОЛ. Применение эмбриокультуры для преодоления покоя у дчи-тельиохралившихся семян caxepuott свеклы /ОЛ. Подвигина'/ Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России: Матер. Междунар. иаучно-прзктич. конф., Воронеж, 2003г. - Воронеж, 2003. - С. 72-74.

30. Подвигина ОЛ. Эмбриокультура сахарной свеклы ЮЛ. Подвигина// Факторы экспериментальной эволюции растений: Международная научно-практическая конференция, Украина, Алушта, 29 сенгабря-3 октября 2003г. (в печати)

. 31. Подвигина ОЛ. Цктоэмбриологичсские особенности эмОрио- и эмСрнондогс-иеза у сахарной свеклы в условиях in vitro ЮЛ. Подвигина, Т.Н. Жужжалова// Культурные растения России.- М„ 2003. (в печати) ' -

32. Пслаипша ОЛ, Особенности морфогенеза сахарной свеклы в условиях in vitro ЮЛ. Подвигина'/ Сахар'«* свекла. - 2003. is печати)

33. Фоменко 1I.P. Ратине аломиктичных зародышей в культуре in vitro /Н.Р. Фоменко, ОЛ. Подвигина, Т.П. Жужжалова // Международная научно-практическая конференция "Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений": Международная научно-практическая конференция, М.: 2003. (в печати)

34. Zrwmicnskaya V,V. llaploiil imlucchion in unfertilized ovules culture of Beta vulgaris L. /V.V. Znamcnskaya, T.P. Zhuzhzhalova, O.A. Podvigina // Abstracts of (he papers and posters, presented at XI International sympo$ium"Embriology seed reproduction", Leningrad, July3-7, 1990.-Leningrad: Nauka, I990.-P. 197,

35. Podvigina O.A. Peculiarities of male gametophyte forming of lines - fixators of sugar beet CMS (Beta vulgaris L.) /О.Л. Podvigina, T.P. Zhuihibalova, L.I. Oryol // Abstracts of the papers and posters, presented at XI International symposium"Embrio1ogy seed reproduction", Leningrad, July 3-7,1990. - Leningrad; Nauka, 1990. - P. 127.

36. Znamer.skaya V.V. Haplotdy of sugar beet /V.V. Znamcnskaya, O.A. Podvigina, T.P. Zhuzhzhalova // International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Unpen ecr-ing". Octobcr 3-6,1994, Kiev Na Ukraine- Kiev, 1994. - P. 115.

37. Podvigina O.A. Storing Suga Beet Gcnctic Material under in vitro Conditions / ОЛ. Podvigina,. V.V. Znamcnskaya, LA. Tsupikova // International Confcrenc Gen eric Collections, Isogcntc and Alloplatnic Lines. - Novosibirsk, Russia. July 30-August 3,2001. - Novosibirsk. - 2001,- P. 204-2 OS.

Тип. ВГАУ, зак. 429 - 2003 г„ т. 100 экз., объем 2,75 п. л.

$ 1 5 6 3 2