Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретический анализ управления потоками в кинетической модели изолированного фермента

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теоретический анализ управления потоками в кинетической модели изолированного фермента"

tu

Московский Государственный Университет им. M.B. Ломоносова

На правах рукописи

НАРЦИССОВ Ярослав Рюрикович

УДК 577. 31

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УПРАВЛЕНИЯ ПОТОКАМИ В КИНЕТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ИЗОЛИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА.

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Проблемной лаборатории регуляции метаболизм. Медицинского Научно-Производственного Комплекса "Биотики".

Научный руководитель: Доктор физико-математических наук Б.Н. Холоденко

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук, профессор Г.Ю. Ризниченко Доктор биологических наук, профессор С.Э. Шноль

Ведущая организация - Институт Биохимии им. А.Н.Баха, РАН, Москва

Защита состоится »2?» Срб^рСУ^ 1997 г. в 15* .часов на зассданн диссертационного совета К.053.05.68 при Московском Государственном Университет по адресу: 119899, г.Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, кафедр биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Автореферат разослан "23 " 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета / • ' '

:юкгор биологических наук ' V , Б.А.Гуляе.ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Современный уровень исследований делает возможным оценивать различные характеристики каталитического цикла изолированного фермента. Развитие биофизических методов исследования конформационных переходов в белках, передачи электронов между группами активного центра, высокоточного измерения потоков вещества открывает перед исследователями новые возможности в построении сложнейших кинетических моделей для выделенных ферментов и переносчиков. При этом удается не только анализировать кинетику превращения отдельных метаболитов, но и определять значения отдельных констант скоростей. Это делает возможным рассматривать регуляцию потоков со стороны отдельных стадий процесса или внешних факторов. Количественно оценивать управление в системе с произвольной сложностью взаимных превращений интермедиатов позволяет теория контроля метаболизма.

Актуальность темы. Одним из направлений биофизики сложных систем является изучение регуляции клеточных процессов. Основой для этого служит оценка роли каждого отдельного звена метаболической цепи и возможность предсказывать поведение системы в ответ на какое-либо воздействие. Важнейшим направлением в этой области исследований является всестороннее изучение механизмов превращения метаболитов на уровне отдельного фермента и получение локальных характеристик мультиферментной системы. Знание общих закономерностей управления скоростью биохимических реакций и понимание структурно-функциональных особенностей организации метаболизма позволит перейти к регуляции на субклеточном и клеточном уровне. Кроме того, изучение управления потоками в модели изолированного фермента является принципиально гккным при решении биотехнологических задач, связанных с подбором наилучших условий для функционирования выделенных ферментов. Особое значение преобретает знание общих закономерностей регуляции при сопоставлении свойств нативных белков и белков-мутантов, полученных сайт-специфическим мутагенезом, а также при сравнении регуляторных свойств изоферментов.

Таким образом исследование управления потоками в модели изолированного фермента является важнейшей задачей как для применения методов биофизики сложных систем при количественном изучении регуляции в мультиферментной системе, так и для непосредственных прикладных задач генной инженерии и биотехнологии.

Цель диссертационной работы. Целью работы является 1) проведение теоретического анализа управления потоками в модели изолированного фермента; 2) разработка новых высокоэффективных методов получения коэффициентов управления стационарным потоком. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1) С помощью методов теории контроля метаболизма выявить общие закономерности распределения регуляции для случая кинетической модели изолированного фермента с разветвленным и неразветвленным кинетическим механизмом. Рассмотреть управление при наличии притока и оттока метаболитов.

2) Получить соотношения между кинетическими константами, позволяющие выделять стадию процесса, вносящую основной вклад в управление стационарным потоком.

3) Используя структуру кинетических схем, сформулировать правила поиска показателей регуляции для ферментативных механизмов любой степени сложности.

4) На конкретных примерах оценить возможность применимости гипотезы лимитирующей стадии при анализе управления потоком для изолированного фермента.

Научная новизна. Впервые для кинетической модели изолированного фермента строго обоснована необходимость рассмотрения минорной ветви с малым потоком при анализе регуляции скорости со стороны стадий процесса. Теоретически предсказано и на примере модели глкжокиназы печени продемонстрировано существование отрицательного управления со стороны стадии в случае разветвленного кинетического механизма. Предложен кардинально новый способ анализа регуляторных свойств единичного фермента при наличии притока/оттока метаболитов, заключающийся в нанесении на фазовую плоскость линий с постоянным управлением. Данный подход делает возможным совмещать анализ динамических и регуляторных свойств модели проточной ферментативной реакции. Впервые получены соотношения между кинетическими константами для неразветвленного цикла с произвольным количеством стадий, позволяющие выделить стадию, вносящую основной вклад в управление стационарным потоком, вне зависимости от абсолютных значений кинетических констант, входящих в нее процессов.

В общем виде получены профили управления для наиболее часто используемых механизмов ферментативной реакции. Предложены новые простые и наглядные методы

получения коэффициентов управления для моделей с кинетической схемой любой степени сложности.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждались на Международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах", Суздаль, 1995 г.; International Workshop "Membrane Bioenergetics", Moscow, 1995; Международной конференции "Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах", Тверь, 1996 г.; 7th BioTermoKinetic Workshop, Louvain-la-Neuve, 1996.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, 4* глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и' 3s приложений. Библиографический указатель включает 146 источников. Текст иллюстрирован 3 таблицами и 22 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Кинетическая модель изолированного фермента и профили управления. Постановка задачи. Рассмотрим изолированный фермент, осуществляющий взаимное превращение некоторого набора метаболитов. В рамках кинетического подхода предполагается, что течение всего акта катализа формализуется в виде графической схемы взаимных превращений интермедиатов фермента. Каждая элементяпная стадия процесса описывается с помощью констант скоростей прямой и обратной реакции. Концентрации субстратов и продуктов реакции считаются адиабатическими переменными и могут рассматриваться как параметры, На основе данных предпосылок кинетическая модель изолированного фермента можно быть сформулирована следующим образом:

V, = F[x,k,t')\ / = 1,..,Г

А -Л (1)'

А Е = Е

1

где Vl стационарные потоки; £" = {£,;..,Ем} - вектор стационарных форм фермента; Х- вектор концентраций субстратов; к - вектор кинетических констант.

Легко видеть, что функция потока зависит от нескольких переменных. Вектор стационарных концентраций форм фермента получается из второй системы уравнений задачи (1), и поскольку каждый элемент матрицы А зависит от кинетических констант и концентраций метаболитов, то £* в первых уравнениях задачи (1) всегда выражается через X и к.

Для того чтобы количественно охарактеризовать влияние каждого этапа на стационарную скорость процесса в целом (поток V), принято использовать величины логарифмических производных, заданных определенным образом (Kholodenko, Westerhoff, 1994; Kholodenko et al. 1994). Коэффициент управления i-й стадии определяет на сколько процентов изменится скорость реакции при изменении констант скорости прямой ) и обратной (к) реакций одновременно на 1%. Строгое математическое определение требует экстраполяции к бесконечно малым изменениям, после чего получаем определение:

c^.iLl (2)

1 ~~ У Qk | /к_,"СОт/ У '

Наряду с выше упомянутыми коэффициентами в исследованиях также используются коэффициенты управления потоком со стороны каждой из кинетических констант в отдельности (Brown, Cooper, 1993, 1994):

К ЗУ

Lli к dk±i' К '

Отметим некоторые свойства коэффициентов управления, определенных уравнениями (2) и (3). Для неразветвленного механизма реакции коэффициент управления констант скоростей в прямом направлении положителен и, наоборот, аналогичные коэффициенты для констант скоростей обратных реакций -отрицательны. Кроме того, сумма коэффициентов управления для кинетических констант прямой и обратной реакции есть коэффициент управления потоком со стороны стадии:

cf = с:;+с:; (4>

Для неразветвленного механизма модули коэффициентов управления любой стадии могут принимать произвольные значения между нулем и единицей. При этом

для любого механизма сумма коэффициентов управления по всем возможным стадиям равна единице. Кроме того, для неразветвленного цикла существуют соотношения, связывающие концентрации промежуточных интермедиатов цикла, константы равновесия и параметры управления (Brown, Cooper, 1994)

Для произвольного кинетического механизма доказана справедливость следующего выражения (Kholodenko et а). 1994):

[g,L [EL,

где стадии +J являются вытекающими из состояния i.

Zc:,- (6)

1*- Im j- ¡^.t

Поиск коэффициентов управления со стороны констант скоростей элементарных стадий. Для того чтобы анализировать управление стационарными потоками в кинетической модели изолированного фермента, необходимо прежде всего найти в явном виде совокупность всех коэффициентов управления. Сопоставление их величин и изучение динамики изменения профиля управления при создании различных условий позволит получить полную информацию о регуляторных свойствах рассматриваемой системы. Формально, искомые величины можно вычислить непосредственно из определений (2-4), однако подобный подход довольно громоздок и оправдывает себя только при наличии уже полученного решения системы (I) для какого-либо механизма. Поэтому особое внимание следует уделить различным способам нахождения С[,.

Из выражений (5,6) для случая неразветвленного цикла состоящего из N обратимых стадий с учетом нормировки на общее количество белка можно получить следующую зависимость коэффициентов управления со стороны констант скоростей элементарных стадий от концентраций форм фермента и констант равновесия:

с". =

Щ, [Е]ш

■Ё

/ \ 1-6,.. X

гк, Гк *=/ /

1

П*, / Ш. 1-1 /

1,/=1 0,1*1'

__У ' ■

N ¿—I Ы '

П*,-1 мгк

В случае разветвленного кинетического механизма получить в общем виде выражения, подобные (7), не удастся. При произвольной конфигурации схемы конкретный вид данных выражений зависит от числа звеньев, положения точек ветвления, количества стадий в каждой ветви и числа параллельных участков. Тем не менее, можно выявить некоторые общие закономерности управления на примере простейших механизмов. Рассмотрим схему с единичным разветвлением (первая ветвь: Е,Е\,Ег,Е\ поток VI ; вторая' ветвь: Е,Ег,£3,£; поток Уг\ У1+Уг=У; Ь=У\1\1) Предпологая известным отношение потоков по ветвям, а также считая заданными коэффициенты управления со стороны кинетических констант обратной реакции несложно получить:

С,У+С2У = 4

к-б<=4

4=£-С_5;

4 = 1 - (£, + Е2) - (С_у,+С + С*);

(8)

Анализируя разветвленные схемы, как правило, особое внимание уделяют сопоставлению потоков, текущих по параллельным ветвям. Одним из интересных предельных случаев для биологического рассмотрения является ситуация, при которой поток по одной из ветвей во много раз превосходит поток по другой. Поскольку в общем случае нет никаких оснований выделять одну ветвь относительно другой, будем считать, что V, —> 0; У2 -» V . Тогда справедливо:

= £ + £,+(СГ3-С!5);

КтС 8->0

ИшС|И = -(£, +СК3);

5-»0 ' 1 '

Пш С} = 1 + £-(£,+ Е2) - (СГ3 + С_'4 + 2 ■ СГ5);

(9)

Нетрудно показать, что сумма коэффициентов управления для ветви с потоком У\ равна нулю. Однако в общем случае наличие малого потока по одной ветви не является достаточным условием нулевого управления со стороны' констант скоростей ее

элементарных стадий. Иными словами, при рассмотрении регуляторных свойств системы нельзя пренебрегать ветвью даже с бесконечно малым потоком. Примечательно, что при выполнении условия:

имеет отрицательный знак. Биологический смысл этого результата заключается в том, что при увеличении константы к\ при постоянных остальных константах, общая скорость реакции уменьшится. Это означает, что при данных условиях смещение равновесия в сторону оттока в ветвь с низкой "проводящей способностью" затормозит превращение субстрата в продукт. Данный результат позволяет предположить возможность существования отрицательного управления стационарным потоком и со стороны всей стадии кинетического механизма при наличии одного или нескольких разветвлений. Кроме того, минорная ветвь не только обладает стадиями с ненулевой регуляцией, но и оказывает влияние на параллельную ветвь.

В том случае, когда известны не только константы равновесия и экспериментально измеренные стационарные концентрации интермедиатов ферментативного цикла, но и значения констант скоростей элементарных стадий, процесс вычисления параметров регуляции можно вести с учетом структуры'системы. При этом возможны два подхода: алгебраический и графический. Рассмотрим первый из методов: метод алгебраических дополнений. Прежде всего заметим, что стационарная скорость ферментативной реакции всегда представима в виде:

где се - общая концентрация фермента, к,5,Р- векторы кинетических констант, субстратов, продуктов соответственно. Вследствие этого, используя определение (3), получаем:

V

(10)

(И)

Заметим, что col и ш2 есть на самом деле комбинации определителей системы. Так, а>2 - это всегда определитель матрицы А (см. (1)), а <»1 есть линейная комбинация определителей матриц AEi. Это дает возможность найти способ вычисления производных в (11), исходя из структуры системы. Скорость в стационарном состоянии записывается в виде

. de.A--(12)

Далее, учитывая тот факт, что для любого i справедливо:

detА, = Л•[£,„,]; 4, «§««-4.; 03)

»•i

где íi¡j - элементы столбца t минора (1,i) матрицы А, а Ая - соответствующее им алгебраическое дополнение, (11) можно представить в развернутом виде:

с,"=*,-{с,-с2); (14)

Х>, - {{«/., -А,- -5W, • 4W)+K • Д.,-^1 Ч«))

2», •(*, 'det A,,-fc.,detA,J

Д, = + ^"("аЛ) • Аы.)

2=) • + ) • А,„);

где 8,5- дельта символ Кроннекера. Как видно из (14) , Аи и А - есть сумма произведений двух алгебраических дополнений элементов минора (1,0 матрицы А или определителя самой матрицы ка соответствующий им знак элемента минора или определителя.

Формулы (14) позволяют находить С|, , используя структуру матрицы системы (1). Аналогичным образом можно получить параметры регуляции с помощью графического метода Альтмана-Кинга. Ясно, что фактический процесс дифференцирования на графе состоит в поиске производных в выражении (3) . В силу линейной зависимости потока от каждой отдельной константы в производные войдут лишь те графы,

которые содержат соответствующую стадию. Принцип отбора в этом случае не трудно сформулировать в виде мнемонического правила:

Правило поиска коэффициента управления стационарным потоком со

1. Записать совокупности графов соответствующих числителю и знаменатель стационарного потока по правилам Альтмана-Кинга- Хилла.

2. Пометить деревья, содержащие ветвь для интересующей кинетической константы.

3. Выражение для производной на графе есть совокупность деревьев, содержащих ветвь для соответствующей константы.

4. Разность выражений, полученных как отношение производной на графе для числителя к самому числителю и отношение производной на графе для знаменателя к самому знаменателю, есть коэффициент управления стационарным потоком.

Несложно показать, что для неразветвленного никла функция, стоящая в чиелтеле выражения (10), всегда представляет собой разность произведений кинетических констант прямой и обратной реакции. Используя это обстоятельство, из формулы (11) легко получить:

Внимательно проанализировав формулу (15) с использованием метода графов, можно сформулировать следующее общее правило:

Коэффициент управления скоростью со стороны стадии неразветвленного цики ¡описывается в виде дроби. В числителе стоит сумма произведений кинетических констант для деревьев, втекающих во все вершины цикла и невключающих данную стадию, а я знаменателе - аналогичная сумма произведений для всех деревьев.

Коэффициенты управления скоростью для случая кинетической модели проточной ферментативной реакции с учетом регуляторных свойств внешних воздействий. Рассмотрим фермент, катализирующий превращение N субстратов в М продуктов. При этом предположим, что ферментативная реакция

стороны константы скорости .

(15)

Правило для цикла:

является проточной, т.е. в системе существут приток субстратов и отток продуктов, и, кроме того, скорости диффузии веществ в растворе много больше скоростей превращения метаболитов. В этом случае поведение системы описывается решением задачи Коши:

(IX

Л",«» = ЛГ,(0) =0!

где Ур..,Уг - есть решение присоединенной системы алгебраических уравнений:

А-у = Ё

и матрица А (см. (1) ) получена из соответствующей системы кинетических уравнений для быстрого набора переменных У, и уравнения материального балланса ферментативного цикла:

ь,

= 0,

Используя формулу (3), легко получить коэффициент управления потоком со стороны констант скоростей элементарных стадий:

Э1прШа.....аЛ7„..,ТтХ{0)

<£(/) = К, —* дк' ; (17)

где Х(1) есть решение системы (16). В большинстве случаев в метаболических цепях принято анализировать управление стационарными потоками. Тогда выражение (17) трансформируется в:

= • - лга (18)

где X,, 1 = 1 ,..,(ЛГ + М) есть концентрации метаболитов в стационарном состояниии системы. Следует подчеркнуть, что поиск данного состояния в модели проточной ферментативной реакции всегда требует выполнения определенных условий

в точках начального приближения. Используя термины теории контроля метаболизма для случая одного субстрата (5) и одного продукта (Р), можно записать необходимое условие сходимости итерационного процесса из выбранной окрестности к единственному решению:

где есть эластичность потоков по концентрации S и Р соответственно, a 5rn5g - отношение V к /и g.

Фазовые диаграммы регуляции. Анализируя регуляторные свойства ферментативной реакции как при наличии притока/оттока метаболитов, так и в отсутствии такового, необходимо сопоставлять динамику изменения профиля управления при различных значениях параметров. До настоящего времени изменение коэффициентов управления приходилось оценивать не только отдельно для каждой стадии, но и в зависимости от каждой из концентраций субстратов и продуктов. Предлагаемый здесь метод фазовых диаграмм позволяет отчасти решить данную проблему. Он состоит в том, что на фазовой плоскости концентраций метаболитов проводятся линии одинакого управления для отдельных стадий (изолинии). Изолинию, ограничивающую область в которой управление стационарным потоком меняется менее чем на 1%, будем называть главной изолинией. Очевидно, что каждая стадия будет иметь свою диаграмму, но характер расположения линий всегда будет таков, что в каждой точке выполняется условие теоремы суммирования. Полученные кривые напоминают изоклины, однако имеют совершенно иной смысл. Если при движении вдоль изоклины вблизи стационарного состояния проявляются динамические свойства системы, то при изменении концентрации вдоль кривых на фазовой диаграмме происходит сохранение управления потоком со стороны стадии. Это означает, что диаграмма показывает, как следует изменить концентрации, чтобы сохранить управление. При переходном процессе концентрации вблизи стационарного состояния будут меняться в соответствии с фазовым портретом. При этом управление со стороны стадий сохраняться не будет. Фактически движение вдоль изолиний на диаграммах регуляции возможно лишь в системе с непроточной ферментативной реакцией, где концентрации субстратов и продуктов являются параметрами, а не переменными. В случае проточной

ферментативной реакции использование подобных фазовых диаграмм поможет оценить регуляторные свойства системы вблизи стационарного состояния.

Различные типы ферментативных реакций и их профили управления. Особое внимание, как уже упоминалось выше, следует уделить получению общих соотношений, связывающих коэффициенты управления с другими параметрами и позволяющие делать выводы о характере регуляции. К сожалению для кинетического мемшизма произвольной структуры такие соотношения получить затруднительно. В конечном итоге регуляция стационарными потоками будет некоторым образом распределена по отдельным стадиям, что найдет свое отражение в величинах С' . Анализ данного распределения и составляет основу изучения управления в кинетической модели изолированного фермента. Однако довольно часто достаточно ;нап> стадию, вносящую основной вклад в управление потоком. Подобную стадию следует называть главной модой управления (вместо устаревшего и по сути неверного термина "лимитирующей" стадии).

Попытаемся получить условия, выполнение которых приводит к сосредоточению управления на стадии 1 неразветвленного цикла, содержащего N стадий. Поскольку в силу теоремы суммирования сумма всех коэффициентов равна единице и для неразветвленного цикла не существует отрицательных С) то, для того чтобы показать, что стадия I -есть главная мода управления, достаточно найти условия при которых:

Теорема о главной моде управления.

Если кинетические константы неразветвленного цикла, содержащего N стадий удовлетворяют следующим условиям:

то стадия / вносит основной вклад в управление стационарным потоком и является главной модой управления.

Следует особо подчеркнуть, что в данном случае речь не идет об абсолютных значениях кинетических констант. Это означает, что если выполняются условия теоремы, то

У/../*« =>

(20)

л- 1<

——»1; ——»1;

к

стадия / вносит основной вклад в управление вне зависимости от того, является ли она быстрой или медленной (или содержит быстрый или медленный процесс). Таким образом даже для самого простого поиска главной стадии, воздействующей на процесс в случае нсразветвленного цикла, нельзя анализировать кинетические константы в направлении течения реакции и искать среди них наименьшую.

Из формул (1,16) ясно, что изменение значений параметров системы приводит к изменению величин констант скоростей элементарных стадий и, как следствие, к модуляции стационарного потока. При этом произойдет перераспределение управления между отдельными стадиями. Предугадать характер поведения профиля управления можно лишь зная зависимости £(«,,.,,ак). Особый интерес могут представлять такие величины .параметров, при которых небольшие флуктуации Да, не приведут к изменению коэффициентов управления. Если подобная точка существует, то в ней должны выполняться следующие условия:

Если рассматривать непроточную ферментативную реакцию, при которой параметрами являются и концентрации метаболитов, то, воспользовавшись определением (3), несложно пол} чить систему нелинейных алгебраических уравнений:

где каждое 1-ое уравнение получено при раскрытии производных потока по кинетическим константам. Решив систему (22) од'.!!'. раз для определенного кинетического механизма, можно получить набор значений констант скоростей, при котором профиль управления имеет экстремум.

Параметры управления, используемые в кинетической модели, позволяют не только делать выводы об изменении скорости реакции для изолированного ферментя. но и находить локальные показатели регуляции для мультиферментных систем. В самом общем случае можно запнса гь:

(21)

Я,(й,А:) = 0, 1 = 1,. ..Л/

(22)

(23)

е', - эластичность ферментативной реакции по метаболиту Х:

Это уравнение позволяет найти эластичность по известным коэффициентам управления скоростью со стороны кинетических констант элементарных стадий. Для рассматриваемой постановки задачи (1) справедливо:

Таким образом, вычисление e'j сводится к суммированию коэффициентов управления со стороны тех констант скоростей, которые соответствуют процессам связывания метаболита X, с ферментом.

Особенности моделирования реакиий. катализируемых векторными ферментами. Среди типов ферментов, к которым применим кинетический подход, необходимо особо отметить мембранные белки, осуществляющие сопряженный перенос веществ между клеточными компартментами и каталитические реакции. В этом случае использование модели (1) несколько ограничено. Это связано с тем, что каталитический акт векторных ферментов весьма сложен и не всегда может быть однозначно и четко формализован в виде кинетического механизма. Кроме того, для данного примера существует возможность множественной и непростой регуляции стационарного потока со стороны параметров системы. Результат подобного рода воздействия сравнительно легко может быть обнаружен экспериментально, однако даже при наличии полного кинетического механизма бывает нелегко предугадать как и на какой именно стадии процесса оно сказывается. Одним из возможных путей решения данной проблемы является использование кинетической модели электро-химического замка. Ее сущность состоит в том, что на основании экспериментальных данных выбирается одна (или несколько) элементарных стадий, кинетические константы которых зависят от выбранного фактора, причем эта зависимость четко локализуется посредством запирающей функции или функции замка. Данный подход делает возможным более детальное исследование регуляции потоками со. стороны мембранного потенциала, ионного градиента при описании различных векторных ферментов, в том числе и первичных Др„-генераторов в митохондриях. Отметим, что именно для этого класса белковых комплексов удалось наиболее подробно разработать методы изучения управления стационарными потоками (Brown, 1992). Общепринятым , считается анализировать распределения регуляции дыхания в митохондриях между отдельными

(24)

комплексами дыхательной цепи, ферментами митохондрий и АДФ/АТФ-антипортером. В данной работе с помощью ингибиторного титрования азидом (Groen, et al, 1982) измерены коэффициенты управления для цитохромоксидаэы (комплекса IV) в митохондриях печени крыс, которым в' течение длительного времени вводили фенобарбитал per os в возрастающих дозах. По сравнению с контрольной группой в состоянии 4 (субстраты и фосфорилированный АТФ) намечалась тенденция к снижению управления дыханием (0,14+0,01(4) против 0,17+0,04(4) в контроле). При этом после добавления в полярографическую ячейку разобщителя (2,4-динитрофенола) происходило возрастание (0,35±0,05(4)) управления стационарной скоростью дыхания по сравнению с животными, не получавшими фенобарбитал (0,26±0,05(4)). Эти данные свидетельствуют как об изменении распределения управления для комплексов дыхательной цепи, так и об индивидуальной чувствительности цитохромоксидаэы к данному типу воздействия.

Анализ управления потоками в кинетической модели реакции изомеризации на примере триозо фосфат изомеразы. Общие закономерности управления стационарным потоком, полученные выше, позволяют делать выводы не только о регуляции в гипотетических системах, но и в кинетических моделях реальных ферментов. В работе рассматриваются несколько различных типов реакций, а именно: реакция изомеризации, катализируемая триозо фосфат изомеразой, обратимый гидролиз пирофосфата, катализируемый пирофосфатазой, реакция превращения глюкозы в глюкозо-6-фосфат, катализируемая глюкокиназой печени и натриевый цикл Na.K-АТФазы. В данном разделе рассматривается приложение метода фазовых диаграмм к реакции обратимого превращения дигидрооксиацетон фосфата (S) в глицеральдегид-3-фосфат (Р). Каталитический механизм для этого фермента представляет собой трехстадийный, обратимый неразветвленый цикл (Albery, Knowles, 1976). Стационарные фазовые диаграммы для отдельных стадий процесса, катализируемого триозо фосфат изомеразой, представлены на Рис.1. Стадия 1 имеет область максимального управления, ограниченную главной изолинией С* = 0.75 при высоких концентрациях продукта и низких концентрациях субстрата. Аналогичная область для стадии 2, ограниченная линией C¡ =0.68, находится при больших концентрациях субстрата и продукта. И, наконец, для стадии 3 управление не будет

меняться только в области микромольных концентраций дигидрооксиацетон фосфата в глицеральдегид-3-фосфата (С, =0.80).

Стадия 1

Е.

у

Стадия 3 > ' Стадия 2

ЕР

Рис.1. Стационарные фазовые диаграммы для триозо фосфат изомеразы. £ и Р обозначают дигидрооксиацетон фосфат и глицеральдегид-3-фосфат соответственно. Пунктиром обозначены гчивныс изолинии, т.е. линии ограничивающие область 'на графике эти области заштрихованы!. в которой управление потоком для стадии меняется менее чем на 1"Л.

Таким образом, применение метода фазовых диаграмм делает возможным в случае постановки задачи (1) получить области предельной регуляции со стороны отдельных стадий механизма, а также позволяет изменять концентрации так, чтобы управление стационарным потоком сохранялось. В случае протичной ферментативной реакции данный метод создает предпосылки для анализа одновременно ре^ляторных и динамических свойств модели.

Регуляторные характеристики ферментативного цикла пирофосфатазной реакции. Плрофосфатаза катализирует обратимый гидро'шз пирофосфата с участием молекул воды и ионов магния. Предполагается, что механизм ,ич данного фермента как из простеших, так и из клеток высших млекопитающих близок ;; упорядоченному уни-би механизму (S.nirnova et а!, 1995; Volk et al, 1996) . однако оиичис заключается в cyiuei. I вовании промежуточной стадии перехода от комплекса фер мента-субстрат к комп-Ь'ксу фермент-продукты. Зависимости коэффициентов управления от

концентраций неорганического фосфата и пирофосфата для фермента, выделенного из Е.соН, представлены на Рис.2. При фиксированных концентрациях неорганического фосфата (4мМ) и низких концентрациях пирофосфата основное

& + ! к+1 к '1 ЕМ„„ *ЕМ„ (МгРР)„ ЕМ„(МР)г^ *ЕМ„(МР)« *ЕМ„

к., К к> к<

п=1 или 2;

0. 04 0. ОБ 0. 08

РР, иМ

сг ,

Б

0.60. 4

0. 20

О. 04 0. Об

РР, ММ

Рис.2. Каталитический цикл пирофосфатазы. Р, РР и М - неорганический фосфат, пирофосфт» и ионы магния соответственно. На графиках представлены зависимости коэффиценпюв управления скоростью реакции в зависимости от концентрации пирофосфата ([Р.]=4 мМ) для фермента из E-coli дикого типа (А) и мутанта E20D (Б).

управление сосредоточено на стадии присоединения пиррофосфата к свободному ферменту (стадия 1), а остальные стадии каталитического акта вносят незначительный вклад в регуляцию стационарным потоком. По мере увеличения концентрации пирофосфата в среде происходит изменение регуляторных свойств системы; коэффициент управления скоростью реакции со стороны первой стадии падает, а

4

4

1

0.08

U. 02

управление со стороны остальных стадий плавно растет. При высоких концентрациях пирофосфата (около 100 мкМ) наибольший коэффициент управления имеет стадия обратимого удаления второго неорганического фосфата из активного центра (стадия 4). Следует особо отметить, что выполнение условий теоремы о главной моде управления для пирофосфатазы Е.соН приводит к необычному поведению регуляторных характеристик при изменении концентраций субстратов. Равновесие всей реакции при наличии даже небольшой концентрации пирофосфата всегда сильно смещено в сторону его гидролиза. Обратная реакция начинает протекать только при увеличении содержания неорганического фосфата на несколько порядков. В этих условиях логично делать оценку регуляторной роли каждой стадии по величине кинетических констант прямой реакции. Сопоставление этих величин позволяет предположить отсутствие стадии с превалирующим управлением во всем диапазоне концентраций метаболитов. Однако результаты исследования показывают, что при низких концентрациях пирофосфата основное управление будет сосредоточено на стадии 1, причем это справедливо даже в том случае, когда кинетическая константа кн в два раза больше самой быстрой константы скорости прямой реакции. Более того, при увеличении содержания неорганического фосфата свыше 4 мМ управление со стороны стадии связывания пирофосфата может достигать 80%.

Существенные различия наблюдались в профилях управления пирофосфотаз, полученных из различных источников.В том случае, когда отношение кинетических констант не соответствовало условиям теоремы о главной моде управления, эффект "лимитирования" со стороны стадии с быстрым процессом (обратимое присоединение пирофосфата к свободному ферменту) исчезал. Так в ферменте, выделенном из 8.сегеу|51ае при физиологических концентрациях неорганического фосфата, управление до 70-75% сосредоточено на стадии обратимого освобождения продукта из комплекса с ферментом (стадия 4). Остальные стадии имеют небольшое значение в регуляции, и самый большой из их коэффициентов не превышает 15%. Кроме того, в профиле управления этого фермента практически полностью отсутствует область доминирования в регуляции со стороны первой стадии. Подобная картина наблюдается и для пирофосфатазы из печени крыс. Причем между характером управления цитозольным и митохондриальным ферментом нет качественных различий. Таким образом, можно сделать вывод об идентичности регуляции скорости в пирофосфатазе печени крыс Э.сегеуЫае и, напротив, их резкое отличие в управлении потоком от

фермента E.coli. Управление стационарным потоком изменится, если происходит замена аминокислотных остатков в активном центре белка (глутаминовая кислота в 20м положении на аспарагиновую кислоту; мутант E20D). Анализ структурных и кинетических свойств мутанта E20D пирофосфатазы E.coli был проведен ранее (Volk et al., 1996). Здесь исследуется управление стационарным потоком для данного случая. Максимальное управление принадлежит стадии 4, а величина коэффициента управления скоростью со стороны стадии 2 претерпевает наибольшее изменение (до 450% в области низких концентраций пирофосфата по сравнению с диким типом). В целом характер управления для мутанта E20D пирофосфатазы Е. coli сходен с типом управления у ферментов из S.cerevisiae и печени крысы.

Кинетическая модель реакции превращения глюкозы в глюкозо-б-фосфат. катализируемая глюкокиназой. Глюкокиназа печени, четвертый изофермент семейства гексокиназ, катализирует необратимое фосфорилирование глюкозы в шестом положении, в результате чего обеспечивается включение экзогенного сахара в метаболизм клеток. Есть основания предпологать, что механизм реакции в данном случае соответствует неупорядоченному би-би механизму (Pettersson, 1986). При физиологических концентрациях АТФ (порядка 2.5 мМ для печени и около 1 мМ для других типов клеток) наибольший коэффициент положительного управления (т.е. такого управления, при котором уменьшение энергетического барьера данной стадии увеличивало бы скорость реакции) принадлежит стадии присоединения АТФ к комплексу фермент-глюкоза (стадия 3) (Рис.За). Однако увеличение концентрации глюкозы приводит к тому, что, начиная с 8-^9 мМ глюкозы в среде, максимальное положительное управление переходит к стадии освобождения АТФ из комплекса фермент-продукты (стадия 6). При тех же условиях влияние стадии связывания глюкозы со свободным ферментом на стационарный поток практически равно нулю.

Суммарное управление скоростью глюкокиназной реакции со стороны ветви с первым присоединением глюкозы (т.е. сумма коэффициентов управления стадий 1 и 3) уменьшается от 95% до 37% при увеличении концентрации глюкозы, а суммарный коэффициент управления со стороны ветви с первым присоединением АТФ меньше5% во всем диапазоне концентраций глюкозы. Поскольку отношение потоков по ветвям пропорционально отношению их суммарных коэффициентов управления, можно сделать вывод, что поток по первой ветви (через стадии 1 и 2) на

К ^ еб^ерк

* И, ь

Е

к> ЕвЛ ^ЕР/Я

10 15 20

глюкоза« мМ

ку* ЕгР

к\АТФ] / к

Е, * Е,АТФ Е, « * Е,

к' К// К

^/сДАТФ]

ЕгАТФ

Рис.3. Кинетическая схема и зависимость коэффициентов управления стационарной скоростью реакции, катализируемой глюкокиназой печени, со стороны отдельных стадий процесса (А). и 5г обозначают глюкозу и А ТФ соответственно. Кинетическая схема На-цикла Ыа. К-А ТФазы (Б)

много превосходит поток по второй. В тоже время каждая отдельная стадия (2 или 4) этой ветви вносит существенный вклад в управление скоростью реакции. Примечательно, что возрастание активности стадии 2 может приводить к значительному снижению выхода глюкозо-б-фосфата, о чем свидетельствует отрицательные значения коэффициента управления потоком со стороны кинетической константы. Следует заметить, что при уменьшении содержания АТФ ([АТФ] = 0.5 мМ) более чем вдвое от физиологической концентрации, единственным

максимальным коэффициентом на всем • диапазоне концентраций глюкозы (до 30 мМ) :тановится С[ , а отрицательный коэффициент управления C¡ почти не изменяется. При фиксированной концентрации глюкозы и изменении концентрации АТФ характер распределения управления скоростью реакции со стороны стадий не изменяется. Начиная с концентраций АТФ больших чем 2 мМ, соответствующие зависимости выходят на плато.

Построение модели Ng-Цикла Na, К-А ТФазы. Na+,K+ -АТФаза является типичным представителем вторичных генераторов мембранного потенциала, запасающих ионы против градиента концентрации за счет использования энергии, образующейся при расщеплении молекул АТФ (Kramer, 1994). Известно, что данная помпа состоит из субъединиц двух видов: аир, образует октомер, имеет стехиометрию 3Na+¡n/2K+out и распостранена почти во всех типах клеток (Skou, 1990). Если во внешнем растворе отсутствует К+ , то фермент способен связывать и гидролизавать АТФ в ходе процесса, получившего название Na-цикла. В самом общем случае форма Ei может переходить в Ег как связывая, так и не связывая АТФ на регуляторном сайте с низким сродством. Причем после связывания на Ei АТФ может гидролизоваться или же весь фермент переходит из формы Ei в форму Ег без потери АТФ (Campos Beaugé, 1994). На основе данных представлений может быть сформулирована кинетическая модель Ыа-цикла (Рис.Зб), особенности регуляции которой рассматриваются в данном разделе. Основной вклад в управление при физиологических концентрациях АТФ вносит стадия обратимого удаления неорганического фосфата из Ег состояния фермента. Однако общий характер управления существенно зависит от концентрации Pi . Так при низком содержании неорганического фосфата ([Р,]=60цМ) его обратимое удаление практически полностью контролирует гидролиз АТФ (управление ~92%). При высоких концентрациях Pi (бмМ) стадия 4 сосредотачивает не более 56% управления, и в тоже время возрастает влияние на поток со стороны ветви изомеризации фермента без гидролиза АТФ (стадии 3,5) Примечательно, что коэффициенты управления данных стадий имеют максимум в области концентраций аденозинтрифосфата порядка 600 цМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные в работе результаты дополняют теорию контроля метаболизма I области анализа управления стационарными потоками в кинетической моделг изолированного фермента и позволяют по новому взглянуть на многие проблемь биофизики сложных систем, в частности, лимитирование многостадийного процессг одной стадией. На основе использования постулатов классической теории удалось ж только выявить важные общие закономерности регуляции, но и проверить выполненж этих закономерностей на реальных биологических объектах. Предложеные методы вычисления параметров регуляции и их представление в виде фазовых диаграмм существенно расширяют возможности исследователей при изучении управления ферментативной реакцией. Таким образом, результаты работы показывают безусловную необходимость вычисления профилей управления для различных типов ферментов и открывают новые перспективы использования подходов теории контроля метаболизма для изучения нелинейных биологических процессов

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа управления стационарным потоком в кинетической модели изолированного фермента показано, что наличие одновременно медленного и быстрого процессов связывания субстратов с ферментом в разной последовательности приводит к появлению при определенных условиях возможности торможения общей скорости реакции при ускорении обратимого присоединения одного из субстратов в медленном процессе.

2. Установлено, что стадия, являющаяся быстрой, либо включающая быстрый элементарный процесс, может лимитировать скорость реакции в неразветвленном цикле. Получены условия, позволяющие предсказывать это явление, исходя из значений констант скоростей элементарных стадий.

3. Предложен новый метод, который может быть использован для' анализа регуляторных и динамических свойств в модели проточной ферментативной реакции. С помощью фазовых диаграмм управления для реакции изомеризации, катализирумой триозо фосфат изомеразой, найдены диапазоны концентраций

дигидрооксиацетон фосфата и глицерапьдегид-3-фосфат, в которых лимитирующими являются отдельные стадии каталитического цикла фермента.

I. Показано, что для пирофосфатазы E.coli при низких концентрациях пирофосфата и физиологических концентрациях неорганического фосфата доминирующей в управлении стационарным потоком является стадия обратимого присоединения пирофосфата. Точечная мутация аминокислоты в активном центре приводит к изменению характера управления. Основной вклад в регуляцию при этом вносит стадия обратимого удаления второго неорганического фосфата из активного центра.

5. Процесс обратимого присоединения неорганического фосфата к свободному ферменту является главным в управлении скоростью реакции, катализируемой пирофосфотазой для изоферментов, полученных из печени крыс и S.cerevisiae.

5. При отсутствии во внешней среде калия и физиологических концентрациях метаболитов основное регуляторное воздействие на скорость гидролиза АТФ для натриевого цикла Na/K-АТФазы оказывает стадия обратимого удаления неорганического фосфата из Ег состояния фермента. При низких концентрациях АТФ и высоких концентрациях неорганического фосфата больше половины всего управления состредоточено на стадии превращения формы Ei в Ег.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Нарциссов Я.Р. Необходимое условие сходимости итерационного процесса при поиске стационарного состояния в модели проточной ферментативной реакции с использованием профиля управления.// Труды международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах", Москва.- 1995.-С. 132-136.

2. Нарциссов Я.Р., Холоденко Б.Н. Контроль скорости глюкокиназной реакции ее элементарными стадиями.//Биохимия.-1996.-том 61.-вып. 7.-С. 1279-1284.

3. Нарциссов Я.Р. Использование коэффициентов управления скоростью биохимической реакции со стороны элементарных стадий для определения эластичности фермента. //Биофизика.-1996.-том 41.- вып. 5.- С.989-994.

4. Nartsissov Ya.R., Kholodenko B.N. Theoretical analysis of the flux control for glucokinase reaction. // In book: BioTermoKinetics of the Living Cell (Edited by H.W.

WesterhofT, J.L. Snoep, J.E. Wijker, F.E. Sluse, and B.N. Kholodenko). BioTermoKinetic Press, Amsterdam, 1996.-P.214-217.

5. Burbenskaya N.M., Nartsissov Ya.R., Komissarova I.A. The control of respiration rate b> cytochrome с oxydase in liver rat's mitochondria after chronic injections of phenobarbital. // Ibid. P.439.

6. Нарциссов Я.P. Поиск лекарственных средств по результатам моделирования выделенного фермента in vitro с использованием профиля управления. II Тезисы докладов III Российского Национального Конгресса "Человек и Лекарство".-М.-1996.-С.38.

7. Nartsissov Ya.R. Theoretical analysis of the flux control for a nonlinear model of an isoleted enzyme. // Abstracts of International Conference "Mathematical models of nonlinear exitation, transport, control in condensed systems and other mediums", Tver'.-1996.-P.92.

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ

119899, Москва, Воробьевы горы.

Заказ N 1242 Тираж 100 экз.