Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-кинетические свойства и регуляция активности ферментов метаболизма оксалоацетата растительной клетки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-кинетические свойства и регуляция активности ферментов метаболизма оксалоацетата растительной клетки"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ РАСТЕНИИ

На правах рукописи УДК 577.15:581.1

ИВАНИЩЕВ ВИКТОР ВАСИЛЬЕВИЧ

ДЮЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРД\ЕНТОВ /МЕТАБОЛИЗЛ1А ОКСЛЛОАЦЕТАТА РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

().'3.()().04— биохимия О.'] 00.12.— (физиология растении

Л ВТОРЕФЕРЛТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУШАНБЕ — 1992

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики растеши"! ЛИ Республики Таджикистан.

научный консультант

доктор химических наук, профессор Б. И. КУРГАНОВ.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В. Л. Калер; доктор биологических паук Л\. А. Бабаджапоиа; доктор биологических наук В. и. Муропец.

Ведущая организация: Циститу г почвоведения и фотосинтеза Российской ЛН.

на заседании специализированного совета (Д 013.08.01) по присуждению ученой степени доктора наук в Институте физиологии и биофизики растений АП Республики Таджикистан (734063, г.Душанбе, ул. ЛГши, 299/2).

С диссертацией мобпо ознакомиться в библиотеке Пнет шута физиологии и биофизики растении АН РТ (Душанбе, ул. Айпи, 299/2).

Автореферат разослан «. . V .» . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Р. И. ЧЕРНЕР.

Защита состоится «

»

1992 г. в . . . ч.

i. ■ '■, Л А ; ' • _ !. J;

::V,vJ!'á;n •-:--"-0ЩАН ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Океалоацетат* - один из наиболее вь;-скореакционноспособных субстратов, превращения которого играют резгычайно важную роль в метаболизме микроорганизмов, раститель-ых и животных тканей. Этот субстрат, по-видимому, является един-твенным в том отношении, что его трансформации катализируются рнмернс двумя десятками ферментов, представителей всех классов, ревращения OA выполняют разнообразные физиологические фуш^и7: в ависимэсти от компартаентации в клетке. Особая роль отведена это-у субстрату в качестве источника углекислого газа для ЫЪЩ у ра-тений САМ и С^-типа метаболизма углерода (Эдварде, Уокер, 1986).

Наряду с продолжающимися интенсивными исследованиями таких астений в последнее десятилетие выделилось новое направление, оторое состоит в изучении возможностей управления фотоспнтетиче-ким процессом у Cg-растений (Насыров, 1978, 1982, 1986). Теоретически это связывается с возможностью функционирования так назы-аскых механизмов концентрирования CO^i которые позволили бы пошить эффективность утилизации неорганического углерода растени-ми, т.к. известны значительные потери ассимилированного С0£ в роцессе фотодкхания. При этом центральные звенья предполагаемых [еханизмсв концентрирования QO^ Еключают функционирование тех или :ных ферментов (iiaoyrov , 1981; Магомедов, 1983; Aoyagi, Bascara , 1986; Rao, Singh. , 1986).

Фотосинтеткчески"' поток углерода в растительной клетке со-:ровоядается процессами переноса метаболитов через хюропластную шмбрану. Хлоропласта клеток мезофилла и обкладки проводящих пуч-:ов С^-растений обладают способностью избирательно поглощать те [ли иные метаболиты. С^-растения не. имеют специализированных хло-юпластов. При этом С^-хлоропласты способны поглощать как кетабо-:иты пентсзсфосфатного пути (Fliege е.а., 1978) > так и С^-¡.икарбонорые кислоты (НеЪег, 1974; Нагарр, 1978; behner, Heidt, 1973; Hatch е.а., 1984) » причём последние у С^-растений являются [сточником СО^ для ВПФЦ. Поэтому логично возникает вопрос о био-югическом значении поглощения С^-кислот Сд-хлороги астами и значимости такого поглощения для функционирования гипотетических ме-:анизмов концентрирования COg.

Е Сокращения: OA - оксалоацетат; ВП^Ц -восстановительный пентозо-фосфатный цикл; ФЕП - фосфоенолпируват; ВДГ - малатдегидрогенаяа

До недавнего времени считали, что челнок дикарбоновых кислоч выполняет исключительно функцию переноса восстановительных эквивалентов (НАД(Ф)Н) через мембрану Cg-хлоропластов (Ebbighausen с.а., 1987)- Однако, ряд экспериментальных данных подвергает сомнению эту точку зрения. Главное возражение состоит в том, что "малатный клапан" перестаёт работать при физиологических концентрациях 3-фосфоглицерата (Heber, 1974) . При этом в хлоропласта) наблюдается очень низкая концентрация НАД(Ф)Н (Heber, Santariua, 1965) » хотя считалось, что восстановительные эквиваленты переносятся, главным образом, из хлоропласта в цитоплазму- Кроме того, в мембране Сд-хлоропластов обнаружены специфические переносчики Сдикарбоновых кислот с чрезвычайно высоким сродством к ни: особенно, к OA (Hatch е.а., 1984) • При этом скорость поглощения OA достигает величин, сопоставимых со скоростью фотосинтетической ассимиляции COg (Ebbighausen е.а., 1987).

Столь драматические результаты невозможно интерпретировать, если рассматривать их вне связи с другими процессами, протека»!" ч ми в хлоропластах.

В конце 70-х годов бьшо показано функционирование в хлорс-пластах Сд-растений пируватдегидрогеназного комплекса (Silas, Givan, 1979; Williams, Randall, 1979) • Позднее он был выдало в высокосчищенном виде и охарактеризован (Camp, Randall, 1935; Сайр е.е., 1988) . В связи с этим возникает вопрос об источнике пирувата в хлоропластах. И здесь выявляется ецё одна проблема, поскольку в ряде работ (Enser, Heber, 1980; Scnultze-Siebert е.а., 1984) было показано, что пируват поглощается Сд-хлорэллг стами путём простой диффузии. При этом диффузионно поступающий пируват может обеспечить биосинтез не более 4-5% липидов, синтезируемых в хлоропластах (Hougkan е.а., 1979) . Поэтому вполне логично возникает вопрос об источнике' пирувата в хлоропластах.

'Отсутствие специфического переносчика пирувата в мембране Сд-хлоропластоБ даёт основание предполагать, что С^-дикарбонович кислоты, поглощаемые с высокой специфичностью и высокой скорост: хлоропластами, могут быть эндогенными (хлоропластными) источник; ми пирувата. Однако, решение этого вопроса и, следовательно, bei цепочки отмеченных выне взаимосвязанных проблем, начиная с меха низма концентрирования СО^» оказалось невозможным вследствие то что необходимые сведения о растительных ферментах метаболизма С¿-дикарбоновых кислот и, в первую'очередь, OA - отсутствовали.

Б этом аспекте актуальность исследования состоит в познании возможностей реализации ферментативного превращения дикарбоновых кислот в хлоропластах высших растений.

Цель и задачи исследования. Выше изложенное позволило сфор>-мулнровать цель работы, которая состояла в изучении-мол екулярно-кинетаческих свойств и регуляции активности ферментов метаболизма ОА, Ч'Л) позволило бы раскрыть ферментативные механизмы взаимосвязи иысокоспецифического поглощения и метаболизма С^-дикарбоновых кислот с процессами переноса через хлоропластцую мембрацу восстановительных эквивалентов, биосинтеза липидов в хлоропластах и фотосинтетической ассимиляцией СО.а также полнее раскрыть физиологическое значение метаболизма С^-дикарбоновых кислот в хлоропластах высших растений.

Поставленная цель.предусматривала решение ряда конкретных задрч:

1. Выявить особенности функционирования и молекулярно-кине-тических свойств ФЕП-карб ок с икиназ ы растительного происхождения;

2. Исследовать оксалоацетатдекарбоксилазную реакцию, катализируемую НДЦФ-ЗДГ декарбоксилирующей из листьев растений;

3. Изучить молекулярно-кинетические свойства НАД-ВДГ из хло-ропластов Сд-растения;

4. Выявить в хлоропластах С^-растений фермент(ы), способный дикарбоксилировать ОА, выделить его в высокоочюценном виде и идентифицировать по имеющимся в научной литературе характеристикам;

5. Предложить потенциальные пути воздействия функционирования ферментов метаболизма ОА на фотосинтетический процесс у Сд-растений и качественно и количественно оценить возможную степень этого воздействия на ассимиляцию С0£.

Научная новизна. В работе развиваются представления'о биологической роли метаболизма С^-дикарбоновых кислот в листьях-Сд-растений. При этом основное внимание уделяется ферментам, метаболизма ОА - центрального субстрата, через образование которого происходят взаимопревращения С ^-кислот.

Установлено, что свойства $ЕП-карбоксикиназы растительного происхождения отличаются от характеристик фермента животного и бактериального происхождения. При этой полученные данные о кинетическом поведении- ФЕП-карбоксккиназы: ингибированиц как-прямой,, гп" у '■.•/¡рцтной реакции образующимися продуктами, а также НАДН,

заставляют более осторожно трактовать известные данные о функционировании этого фермента в качестве основного поставщика СО^ А-т БП1'Ц у С^-растений СЕП-карбоксикиназного типа, ограничивая необходимые условия для реализации такого механизма. При этом показа но, что у Сд-растений фермент может функционировать как карбокси лаза и как декарб оке плаза, однако, в последнем случае его подклю чение к фотосинтетической ассимиляции СО., оказывается невозможны Исследование оксалсацетатдекарбоксилазной реакции, каталкзи руемой НАДФ—?4ДГ декарбоксилирующей растительного пргсехскдения, показало, что как и для фермента из бактерий или животной ткани предпочтительным кофактором реакции являются ионы марганца. Пр/ •>том установлено, что для эффективного катализа необходимо создание "правшп-Н'.й" конформации фермента под действием ион-л металл! прежде, чем реакция будет инициирована субстратом. Ьш;ьлено, что "тонкое" воздействие на молекулу фермента могут оказывать конь; метала, на не ОА. Также установлено, что нарушение кинь.ическоп механизма реакции: порядка связывания эффектора и субстрата' - пр! водит к снижению наблюдаемой активности фермента, обусловленной изменением эффективности взаимодействия субъединиц этой жДГ.

Впервые была выделена хлорспластная НДД-зависиыая ЬЩГ. Иссл( дованы её свойства и кинетическое поведение. Установлено, что кинетические константы хлоропластного фермента являются иными, чем у фермента пероксисомального, цитоплазматического или митохондри-;ального происхождения. При этом кинетическим методом показано, что наибольшее влияние на взаимодействие актлвных центров фермента оказывают ОА - в реакции его восстановления и НАД - в реакции окисления маната. Результаты исследования регуляции активности фе^ мента показали, что ЭДГ не подвержена влиянию физиологических концентраций НАДФ, АД^, АТФ, что позволяет приписать ей ряд физиологических функций, которые ранее связывали с действием НАДФ-за-висимой 1»5дГ' и, в частности, участие в функционировании челнока малат-ОА через оболочку С^-хлоропластов.

в хлоропластах С^-растений обнаружена оксалоацетатдекарбокс^ лазная активность, не связанная с проявлением активности нзвестщ. оксалоацетатдекарбоксилирующих ферментов таких, как ФЕП-карбокси-киназа, НДД-ЩГ, декарбоксилирукхцая ОА, и НАДФ-ЬЩГ декарбоксили-рующая. Впервые выделена в высокоочищенном виде и охарактеризована ОА-декарбоксилаза. Показано, что свойства фермента похожи на

свойства ОА-дехарбоксилазы из микроорганизмов и клеток печени крысы. При этом установлено, что величина pH-оптимума и вел;:1 константы Михаэлиса к субстрату реакции для ОА-декарбсксилаз;.; из хлоропластов ксдссдквчнжса отличаются от соответствующих параметров фермента ряда микроорганизмов. Исследование кинетического поведения фермента из хлоргчластов подсолнечника показало, что субстрат реакции не ояазывает влияния на взаимодействие активных центров ОА-декарбохсилазы-. Установлено, что АТФ и АДФ являются сильными ингибиторам ферментативной активности. При этом пс::азано, что при физиологических условиях "тонким" регулятором фермента:: -:з-ной активности может быть АТФ, но не АД5.

Предложена математическая модель, описывающая подключение метаболизма С^-дикарбоновых кислот к фотосинтетическсй ассимиляции СС>2 у высших растений. Установлено, что функционирование ферментов метаболизма С^-дикарбоновых кислот у С^-растений мо;?.ет приводить только к увеличению эффективности карбоксилирования, но не к образованию механизма концентрирования COg, подобного :;.г/, который известен для С*-щстен;гй. При этом показано, что слрдг,-л.тащим компонентом функционирования механизма концентрирование (^является чаличие такой структуры листа, при которой группа клеток, где происходит эндогенное выделение GOg я его ассимиляция на рибул6зо-1,5-бисфосфат-карбоксилазе1 окружена, мембраной с низкой проницаемостью для COg.

Научно-практическая ценность работы. Обобщённые сведения о ферментах метаболизме ОА и малата расширяют представления о рели динамической структуры ферментов в катализе реакции в определён:: направлении. При этем данные о механизме реакции декарбоксилиро-вания ОА позволяют утверждать, что переходное состояние конфор-мации субстрата не связано нёстке со структурой образующихся продуктов реакции. Такая картина является характеристикой специфичности ферментов и позволяет пенлть порой значительные'отличия в величине удельной активности и ряде других свойств, з тем числе энергетических показателях реакции, определённого фермента, очищенного до гомогенного состояния из разных источников.

Результаты изучения ФЕЛ-карбсксиккназы, НАД£-"ДГ дскарбоксн-лирукпсЯ, а также обобщённые литературные данные приводят к заключению о тем, что ферменты, декарбсксилирующие ОА, обладает, по-видимому, ебщим, гаи требованием соблюдения общего, кинетическим

механизмом, обусловленном определенной последовательностью связывания эффекторов и субстратов и диссоциации продуктов. При этом наиболее существенными в процессе реакции яеляются особенности каталитического механизма, обусловленные природой и конформацией конкретного фермента, функционирующего в определённых физиологических условиях.

Исследование молекулярно-кинетических свойств впервые выделенной хлоропластной НЛД-зависимой ВДГ показывает, что фермент способен выполнять в хлоропласте ряд физиологических функций, при писывавшихся до последнего времени НАДФ-зависимой ЦЦГ и, в первук очередь, участвовать в функционировании челнока С^-дикарбоновых кислот через мембрану С^-хлоропласта, а также служить поставщик ОА для ОА-декарбоксилазы хлоропластов.

Результаты исследования, свидетельствуя о функционировании ранее неизвестного пути метаболизма С^-кислот в хлоропластах С^-растений, существенно расширяют представления о взаимосвязи метаболизма С^-дикарбоновых кислот с переносом восстановительных эквивалентов через мембрану хлоропластов, биосинтеза липидов в хлоропластах и фотосинтетической ассимиляции СС^.

Открытие оксалоацетатдекарбоксилазной реакции, протекающей в Сд-хлоропластах, выделение, очистка и идентификация ОА-декарбо! силазы решают проблему быстрого появления пирувата в Сд-хлоропла-стах, не имеющих в своей мембране специализированного переносчик; этого субстрата, объясняя обнаруженную ранее чрезвычайно высокую специфичность хлоропластных мембранных переносчиков малата и ОА 1 субстратам, а также высокую скорость поглощения С^-дикарбоновых кислот Сг,-хлоропластаыи. При этом уточняется биологическая роль

О

"малатного челнока", которая состоит, главным образом, не в переносе восстановительных эквивалентов через мембрану хлоропластов, как считалось ранее, но скорее - в обеспечении пируватдегидр^ге-назного комплекса пируватом, способствуя биосинтезу липидов в хлоропластах.

Полученные результаты также раскрывают один из ферментативн механизмов, связанных с адаптацией растений к изменяющимся внутренним или внешним факторам, который состоит в активизации метаболизма С^-дикарбоновых кислот в хлоропластах посредством увеличения удельной активности соответствующих ферментов:. НАД-зависим ЬЩГ и ОА-декарбоксилазы.

Предложенная математическая модель подключения :.:етабс лиз;/.а С^-дикарбоновых кислст к фотосинтетической ассимиляции плар-.— ляет .делать г«;вод о тем, что повышенное 4ункционироранис фер:--н-

ьътаболизг-а ОА у С^-растений не может привести к возниккс. ник механизма концентрирования С0£• При этом выявлена множественность потенциальных путей воздействия СО^, выделяющегося в реакции декарбоксклкгснания ОА, на различные процессы ь хлорогластах С^-растений, :::;к-зт служить.основой для развития -лтьус направлений з исследгч^нии влияния метаболизма С^-дикарбснс?ь:х кисл: •. на процессы, -ротекогсцие в Сд-хлоропластах.

Всё Еыс.е изложенное представляется важным для решения зад&ч сравнительной 7 эволюционной биохим:.и, теории ферментативного катализа, углубления понимания физиологической картины фотосиктетн-ческсго усвоения. СС,, растениями, эволюционных аспектов фотосинтеза, фотоскнтеткческий'продуктивности растений и возможностей управления ею, а также возможностей использования ферментов расти-ького происхождения в биосенсорах и биокомпьютерах.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на 1С съезде *2Б0 (Москва, 1984), Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" (Пуцино, 198&Х о Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 4 Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 19Ь6), оторок съезде Всесоюзного общества физиологов растений ( Минск, 1990), 4 Всесоюзной конференции молодых учёных по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), 5 Международном молодёжном симпозиуме "Регуляция метаболизма растений" (Варна, 1990), Международной конференции "Фотосинтез и фотоб1.отехнология" (Пущине, 1991), Международной конференции "Итоги и перепектиеы энзи-мологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" (Душанбе, 1991), на конференциях молодых учёных и специалистов Таджикской СС? (Душанбе, 198&, 1989), а также на научных семинарах з Институте физиологии растений им. М.Попова Болгарской АН и в Институте физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан.

Дубликат»;. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ и получено положительное решение на изобретение.

Объём к структура работы. Диссертация изложена на 36£ стра-

ницач, содержит 70 рисунков, 34 таблицы и состоит из введения, шес.и глав, заключения, выводов и списка цитированной литературы (эЗС ссылок). .

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали листья растений хлорис (Chloric gayana Kunth) , кукурузы (Zea coya L.) , хлс пчатника (Gosaypiura hiroatua L.) , свеклы (Beta vulgaris L.), щетинника (Setaria viridis (L.) Beauv.) , подсолнечника (Helion-tiiui armuuc Li) , тритикале (triticale) , ржи (Scoole cereale

выделение зсторопдастов. Навеску листьев измельчали ножницами на полоски шириной 2-4 и растирали в фарфоровой ступке в тече-н'/е 20-30 секунд или гомогенизировали в разматьчителе тканей РТ—I при скорости вращения ножа 8 тыс. об/мин в течение 30-35 секунд е присутствии З-Ь-кратного по отношению к биокассе объёка. среды выделения, содержавшей 0,05 Н трис-HCI буфер или глициновый буфер pi i 8-8,5, сахарозу 0,4 tí, хлорид натрия или калия 0,1 1.Í, полиэти-л^нгликоль (М 40 000) 6%, ыетабисульфит натрия-0,004 ÍÚ, грклон Б 0,002 !>!, дитиотреитол 0,002 М. Полученный гомогекат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 100 g в течение 2 кинз осадок отбрасывали, а супернатант вновь центрифугировали в точен; I—10 минут в зависимости от объекта при 1000 g. Осаждённые центрифугированием хлоропласт промывали 2-5 мл той se среды выделен;

вновь центрифугировали при 1000 g . К полученному осадку хлоро-плаотов добавляли бидистиллят и использовали в экспериментах.

Выделение высокоочищенных ферментов. Ферменты Еыделяли из r¡ могенатов листьев pic тений, либо предварительно получали хлоропл; с ты, которое разрусали заморакиванием-оттаиванием. Гомэгенат листьев или хлоропл ас "-об дважды насыщали сульфатом аммония и получе ный осадок подвергали дальнейшей очистке с использованием сефаде сов, ДЗАЭ-ыолселекта или ДЭАЭ-целлилоэы.

Определение активности ферментов.

Активность £Э1-карбоксикиназы определяли по модифицированны методам (Cannata, 1970; Hatch, 1973) . Реакция карбоксилировани ФЕП: реакционная смесь содержала - ФЕП 0,67 мМ, АДФ I i¿¿, "'¿Gig 2,5 i¿!, MnCIo 2,5 uM, бикарбонат натрия 10 t/iú, НАДН 0,1 ьй, ЬЩГ I Е, 0,05 Ы натрий-ацетатный буфер pH 5,5 и ферментный препарат. Реакция декарбонсилирования 0А: реакционная смесь содеряала'ОА 0,25 «И, АТФ 0,1 кЫ,'JfaCIo 1,7 кМ, ДТТ 5 иМ, 0,025 13 глкцил-глии

эвый буфер рН 7,0 и ферментный препарат.

Активность НАДФ-ВДГ декарбоксилирующей определяли в реакцион-ой-смеси, содержавшей 0,5 мМ OA, 3,3 мМ MnCI^, 0,025 M глицил-пициновый буфер рН 7,0 и ферментный препарат. Реакцию декарбокси-иропания малата проводили в среде, содержавшей 2 мМ мал ата, ,1 мМ НАДФ, 3,3 мМ MgCI2, 0,1 M трис-HCI буфер рН Й,1 и фермент-ый препарат (Романова, 1980).

Активность НАД-ВДГ определяли следующим образом. Реакцию всс-тановления OA проводили в реакционной смеси, содержавшей 0,1 мМ А, 0,06 мМ НАДН, 0,05 M трис-HCI буфер рН 7,0 и ферментный препа-ат. Реакцию окисления малата проводили в среде, содержавшей 17 мМ алата, 0,25 мМ НАД, 0,05 M трис-HCI буфер рН 8,0 и ферментный репарат.

Активность ОА-декарбоксилазы определяли по модифицированному ¡етоду (Dimroth, Thomer, 190б) . Стандартная реакционная смесь одержала 0,1 мМ OA, 0,1 мМ НАДН, О,ТЕ лактатдегидрогеназы, 1,05 M фосфатный буфер рН 7,0 и препарат хлоропластоь или ферминт-1Ый препарат. В контрольных пробах отсутствовали: препарат хпоро-ш ас то в или очищенного фермента (контроль I) или лактатдегидроге-¡аза (контроль 2). Величину изменения оптической плотности в опы-:е за минусом обоих контролей использовали для расчётов.

Активность других ферментов определяли, как описано ранее [Практикум по биохимии, 1979; Романова, I960) с незначительными юдификациями.

В расчётах использовали мгалимолярные коэффициенты экстинк-дии 1,3 (для OA) и 6,22 (для НАД(Ф)Н).

Содержание белка определяли по методам, описанным в работах (bowry е.а., 1951 ; Бузун и др., 1982) или по поглощению растворов ферментов при 220 нм (Wrigley, Webster, 1968).

Содержание хлорофилла определяли по методу Арнона (Гаврилен-ко и др., 1975).

Молекулярную массу ферментов определят и гать-фильтрацией через сефадекс (¿-200 в модификации (Andrews, 1964) , либо гель-электрофорезом в ПААГ (Davis, 1964).

Результаты обрабатывали с использованием методов статистика (Лакин, 1973) и методов ферментативной кинетики (Курганов, 1976; Диксон, Уэбб, 1982; Hartin, Burgos, 1979) =

иссвдозаниь: рслл фе;1-карбскс;к;1назы

ь ¡¿лтаболизме оксашацетата

Сдин из гипотетических ферментативных механизмов, позволяющих рсгать проблема метаболизма С^-дикарбоновых кислот у Qg-pac-тений и связанных с ним вопросов, предусматривал участие СЬП-кар боксикиназы (Насыров, 1978, 1982; Магомедов, 1983, 1988). Поэтом дтя решения этой задачи исследовали свойства ФЕП-карбоксикиназы растительного происхождения.

Онтогенетический и филогенетический аспекты. В онтогенезе растений хлорис и хлопчатника наблюдали изменение удельной актив ности ФЕП-карбоксикиназы в гомогенатах листьев. Однако, не было обнаружено какой-либо закономерности. В филогенетическом аспекте наблюдали, что у С^-растения ФЕП-карбоксикиназного типа хлорис активность фермента была примерно на порядок выше, чем у других форм растений (С^-растений или С^-растёний НАДФ-малатдегидрогена ного типа).

Молекулярно-кинетические характеристики фермента. Установле' но, что ФЕП-карбоксикиназа высших растений является малоустойчивым ферментом и теряет полностью свою активность в течение 7-10 дней после выделения.

Определение молекулярной массы фермента показало, что ФЕП-карбоксикиназа из листьев хлорис имела величину молекулярной мае' около 350 ООО, в то время как кажущаяся молекулярная масса ферме та из листьев свеклы и хлопчатника была равна около 130 ООО.' Эта характеристика значительно отличается от той, которая известна для фермента животного происхождения.

Исследование кинетики действия фермента показало, что проду: ты реакции карбоксилирования £еп в процессе накопления тормозят дальнейший ход реакции. Та же картина была получена и для реакци АТФ-зависимого декарбоксилирования OA. Позднее эти еыводы были подтверждены прямыми исследованиями. Такие свойства фермента делают его похожим на фермент из митохондрий клеток печени (Chang с.а., 1966)

Поскольку известные величины К для фермента по отношению к АТФ, АДФ и OA значительно иике физиологических концентраций этих субстратов, а по отношению к НСОд - значительно выше физиологиче! ких концентраций этого субстрата, наибольший интерес-представлял

инетическое изучение влияния ЕЯ на величину удельной активности еркента, особенно с учётом того, что за этот субстрат потенциаль-:о могут конкурировать СЕЛ-карбскснлаза, енолаза и ряд других фе-¡менюв.

Изучение влияния концентрации ФЕИ на удельную активность '1ЕП-:арбоксикиназы показало, что криЕые имели сигноидшй вид (рис. I).

А х 10 16

-2

О {О

10'

-3

12

х ТО"4 М

-4—♦

¡Г

¡ри этом для Сд-растения :веклы наблюдали более рез-сий выход кривой предетав-¡енной зависимости на плато. Зид этих кривых в координатах двойных обратных величин /казьшал на сильную положительную кооперативноеть фермента по этому субстрату реакции. Кинетическая обработка криЕых, проведённая с использованием уравнения Хилла и коэффициента Хилла, рассчитанного двумя известными способами, позволила устано-. вить, что величина коэффици-энта Хилла при низких концентрациях субстрата для фермента из обоих источников должна быть выше 4, что предполагает участие, по крайне", мере, четырёх активных центров или субъединиц фермента в катализе реакции. При этом полученные данные позволяют говорить об акти-ваторной роли ФЕП в реакции его карбоксилирования. Рассчитанные величины Эд ^

равны-0,55 мМ для фермента из листьев хлорис и 0,20 - для фермента из листьев свеклы. Представленная картина отличает фермент растительного происхождения, по-видимому, в силу особой физиологи-

у

/

/

х Ю"4

Рис. I. Влияние концентрации ФЕП на величину удельной'активности фермента из листьев хлорис (а) и свеклы (б)

ческой роли, которую играет ФЕП-карбоксикиназа в листьях растени

Изучение регуляции метаболитами оксалоацетатдекарбоксилазно активности фермента, считающейся физиологически более важной, по казало, что среди ингибиторов наиболее сильным является НАДН, ко торил при концентрации 0,1 мМ полностью ингибировал эту реакцию. ФЕП в концентрации 0,1 мМ ингибировал реакцию АТФ-зависимого де-карбоксилирования 0А примерно наполовину, АДФ в той же концентра ции - на 15-25$. Пируват, малат.серин при той же концентрации изменяли величину активности ФЕП-карбоксикиназы ещё меньше.

Определение локализации, фермента показало, что у Сд-растени хлопчатника активность ФЕП-карбоксикиназы обнаруживалась только цитоплазме.

Проведённые исследования, свидетельствуя об особенностях молекулярных свойств и функционирования ФЕП-карбоксикиназы растите^ льного происхождения, позволяют прийти к заключению о том, что фермент у Сд-растений действует скорее как карбоксилаза, а не к а] декарбоксилаза и поэтому не может подключаться к функционировав! ВГ1ФЦ в качестве поставщика СО^, как это предполагалось в гипотетической схеме механизма утилизации С^-кислот у Сд-растений.

УТИЛИЗАЦИЯ ОКСАЛОАЦЕТАТА НАДФ-МАЖГДЕГВДР0ГЕНА30Й ДЕКАРБОКСИЛИРУЮЩЕЙ

Ещё одна предложенная схема функционирования ферментативное механизма утилизации С^-кислот в Сд-хлоропластах предполагает , участио НАДФ-ЩГ декарбоксилирующей (Аоуа£1, Вазз1шт, 1986). Однако до сих пор неизвестны Сд-растения, у которых активность этого фермента достаточно высока, чтобы изучить его свойства. Поэтому в качестве модельного объекта был взят фермент из листьев щетинника - С^-растения НАДФ-малатдегидрогеназного типа.

Молек.улярно-кинетические свойства. Исследование кинетики де! ствия фермента показало, что для проявления наибольшей начальной скорости реакции необходимо соблюдать "правильный" порядок добавления эффектора и субстрата в реакционную среду. При этом инициирование реакции должно осуществляться после того, как фермент обретёт "правильную" конформацию под влиянием эффектора - иона металла.

Изучение влияния концентрации 0А на величину удельной актив-

эсти НАДФ-ВДГ декарбоксилирующей показало, что зависимости имели яд гиперболических кривых (рис. 2). Смена порядка добавления регентов в реакционную реду приводила к изме-гнию величины началь-ой скорости реакции, гсределение наличия ипа кооперативности о ОА в координатах войных обратных вели-ин показало наличие резвычайно слабой (в ределах ошибки э.чс-еримента) положитель-:ой кинетической коо-еративности по субст-ату реакции.

■ Обработка получе-[ных результатов с ис-юльзованием уравнения 'илла и коэффициента Хи- МпС^.ч- ОА + фермент

[ла подтвердила эти вы-

юды, свидетельсвующие об очень слабом влиянии ОА на взаимодейст-)ие активных центров/субъединиц фермента. Это может быть связано : тем, что ОА является промежуточным веществом в реакции декарбс-ссилирования малата.

Расчёт Км традиционным способом дал величину 1,0+0,1 мМ для эбоих случаев (рис. 2). величина Бд 5 =0,21+0,08 мМ. Такие расхождения в величинах Км и 30 ^ свидетельствуют о том, что наблюда-змая величина начальной скорости реакции при наибольших в экспериментах концентрациях субстрата не достигала даже половины величины максимальной скорости реакции.

Изучение влияния рН среды на активность НАДФ-ЬЩГ декарбоксилирующей показало, что при наличии "правильной" конформации фермента его удельная активность практически не меняется в области величий рН 6-8. Нарушение кинетического порядка присоединения субстрата и эффэктора - иона металла приводила к резкому снижению величины удельной активности фермента при возрастании рН от 6 до

-НН—*

4-Л 2

£

0 2 4' 5 хЮ^М

Рис. 2. Влияние концентрации ОА на величину удельной активности фермента. Порядок добавления реагентов в среду: I - буфер + фермент + МпС12 ч ОА; 2 - буфер ч.

У (рис. 3). Одной из причин такого расхождения является, по-видимоцу, конкуренция свободных ионов металла и хелатных комплексов Мп-ОА за. активные центр»;! фермента в последнем случае. При этом с увеличением рН среды в области щелочных величин, по-видимог^у, ионы буфера, обеспечивающие щелочные условия, экранируют свободные ионы металла, . что в совокупности с конкуренцией комплексов типа Мп-ОА за активные центры фермента приводит к резкои^у снижению удельной активности фермента.

0,2

0,1

Н»М, 4 *

рН

0,05

0,03

0,01

6

рН

8

Рис. 3. Влияние рН среды на активность НАДФ-ЦЦГ декарбоксилирующей.

I и 2 - те же обозначения, что на рис. 2.

Исследование влияния ионов магния и марганца на активность фермента. В первых экспериментах было установлено, что ионы марганца являются предпочтительными для катализа реакции декарбокси-лирования ОА, что делает его сходным с ферментом из животных тканей и микроорганизмов. Изменение концентрации ионов марганца в реакционной среде приводило к изменению удельной активности НАД1>-ВДГ декарбоксилирующей (рис. 4). Сигмоидность кривых сохранялась при изменении порядка запуска реакции, однако, при этом величина Б0 5 менялась незначительно: с 1,5+0,5 мМ до 2,4+0,2 мМ, что связано, по-видимому, с конкуренцией свободных ионов марганца и комплекса типа Мп-ОА за активные центры фермента в случае иницииро-

*

1Ь

3 2 I

О

0,4 0,2

0

¥ У

У ^

Г»-*-*"

2 4 ХЮ"3М

8 х Ю"3 М

0 4

Рис. 4. Влияние концентрации 'АЯ'.^п маргал,!. (а) и магния (•."

на актишо'/ль фермента. I и 2 - тс, ке ^кЬэдагч.ши-., чи и на рис. ^.

ванил реакции ферментным препаратом.

Кинетическая обработка кривых показала, что фермент обладает положительной кинетической кооператизностью по ионам марганца (Ь» I). При этом при низких концентрациях ионоь марг^ ца (¡/.инее 2,3 ») в случае инициирования рь акции ферментом следует говорит 1. наличии отрицательной кинетической кооперативное™ ни »току фч.кто{у (Ь < I). Дальнейшее увеличение концентрации и_,ноь Ми1"*" прлвод/ло к появлению сильной ¡плояи тел^нь-й кооиеративностк и.; марганцу (и =2,ЗЬ). В то же ири»: в случаи инициирования реакции иксалоацетатом величина коэффициента Хулла достигаль блюй ььпе-ких величин ( 1г>3,1).

Относительно влльнкя ионоь магния были установлен;, чп* даке

при такой высокой концентрации, как ,10 мМ, скорость реакции был почти такой же, как при концентрации ионов марганца менее, чем I мМ. Величина sQ =4,5+0,5 мМ. Максимальная достигавшаяся в экспериментах величина скорости реакции в присутствии насыщающи концентраций ионов магния всё равно составляла не более 12-20$ от той, которая достигалась в присутствии насыщающих концентрац ионов марганца. Кинетический анализ зависимости скорости реакци от концентрации MgCIg свидетельствует о положительной кинетичес кооперативности фермента по ионам магния ( h=2,I).

Полученные результаты дают основание сделать заключение о том, что ионы металлов играют ведущую роль как во взаимодействи активных центров (субъединиц) фермента, так и в конформационном контроле реакции декарбоксилирсвания OA со стороны молекулы НАДФ-ЦДГ декарбоксилирущей. При этом установлено, что реакция декарбоксилирования OA у Срастений является физиологически не менее важной, чем основная реакция декарбоксилирования малата. Результаты исследования позволяют также говорить о потенциально возможности реализации ферментативного' С ^-метаболизма у Сд-раст ний с участием этого фермента, однако, проблема состоит в том, функционирует ли он у какой-либо определённой группы Cg-растени

ОБРАЗОВАНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ 0КСАЛ0АЦЕТАТА ПРИ УЧАСТИИ НАД-МАЛАТДЕГВДРОГЕНАЗЫ ИЗ ХЛ0Р0ЩСТ0В Сд-РАСТЕНИЯ

Челнок дикарбоношх кислот через мембрану Сд-хлоропластов предполагает участие цитоплазматической и хлоропластной малатде гидрогеназ. До недавнего времени считали, что в хлоропластах ре акцию взаимопревращения OA и малата катализирует НАДФ-за!": ,,"ая МДГ, КФ IЛ.1.82 (Pickenscher, Scheibe, 1988) Однако, резуль таты исследования физико-химических и регуляторных свойств ферм та позволяют сомневаться в такой точке зрения. Поэтоцу наше вни ние было обращено на хлоропластную НАД-зависимую ВДГ, функци нирование которой было показано ранее (Pierpoint, 1963; Anderson, House, 1979; Sallal, Himer, 1983) ' , но свойства фермент не были изучены, что и составило следующую задачу исследования.

Выделение фермента. ¡1АД-МДГ присутствует в клетках растени в виде ряда форм: цитоплазматической, пероксисомальной, митохон ркальной, хлоропластной (см., например, Броновицкая, Кретович,

70; О'ЗцПз.узи, '.'/сЗсПпс, "072) . Чтобы избежать проблемы опре-ления источника ЭДГ, для работы использовали не листья, а хлоро-асты. Данные очистки показывают что удельная активность фермен-возрастала примерно на два порядка (табл I). Максимальная ве-

Таблица I

Очистка УД Г из хлоропластов хлопчатника (50 г листьев)

Стадия очистки 1 ! Количество ! белка, мг ! Активность,! ! нка'./мг ' ! белка ! Степень очистки, раз

оропластный экстракт 51,4 2,4 I

акция насыщения Зй-65%

л ы{ата аммония плюс гель-

льтрация через сефадекс 11,0 12,0 5

лселект ДЭАЭ-50 0,03 250,2 104

чина активности достигала более 300 нкат/мг белка. Молекулярная сса определена гель-электрофорезом в 60 ООО.

Влияние субстратов реакции на активность фермента. Исследо-ние влияния концентрации субстратов прямой и обратной реакции . величину удельной активности фермента показало, что:

- кривые зависимости удельной активности от концентрации ОА ¡ели вид, подобный гиперболам на начальном участке с последующим мжением наблюдавшейся удельной активности при дальнейшем увели-нии концентрации этого субстрата (рис. 5). Одной из причин это-| явления мсжет быть ингибирование ферментативной активности из-пгкоы субстрата;

- кривые зависимости удельной активности ЦЦГ от концентрации ДН, малата или НАД также были похожи на гиперболические, но без 1Г'Д5ирования ферментативной активности при высоких концентрациях их субстратов (рис. 6-8).

Кинетический анализ формы кривых и выбор наиболее корректны шных, проведённый с помощью ЬЬМ, показали, что увеличение кон-?нтрации НАДН п реакционной среде приводит к увеличению паложи-¡льной кинетической кооперативности ЦЦГ по ОА. Физиологический шел гтсго явления заключается в том, что с увеличением концен-а'ши |-1ДДИ ь реакционной смеси относительно небольшое изменен1.'

О I 2 -3 х 10-4 ц

Влияние концентрации ОА на величину удельной активности лдг хлоропластов хлопчатника при различных начальных

;:он1ентрациях НАДН /ивМ/

А

концентрациях ОА /ихК/

15 х ТО"3 М

Рис. 7. Вяшшнв концентрации палата на величину удельной активности !ЩГ хлоропластов хлопчатника при различных начальных концентрациях НАД /мМ/

х КГ4 М

Рис. 8; Влияние концентрации НАД на величину удельной активности ВДГ при различных начальных концентрациях палата Ай/

концентрации OA вызывает относительно большее изменение удельной активности фермента. При этом показано, что начальные '.'частки кр них зависимости активности фермента от концентрации OA могут быт описаны уравнениями гиперболы.

Бе. ичина 3Q ^ для OA росла с увеличением концентрации НАДН в реакционной среде, что м>жет свидетельствовать влиянии восст новленного цугслеотйда на сродство ЦЦ' к OA. При >том увел чение степени взаимодействия активных центров (т.е. рост вел'.^- ны к эф фициента Хилла) сопровоадается уменьшением сродства ферыен:а О

Влияние НАДН. Кинетический анализ кривых зависимости активн сти фермента от концентрации НАДН позволяет сделать вывод о том, что для хлоропластной 1ЩГ характера наличие слаб й отрицательно кинетической кооперативноети по НАДН. Фиэи<логический смысл этог явления состоит в том, что относительно небо, ыаие изменения концентрации НДДН вызывают относительно меньшие изменения активност фермента.

Влияние палата. Кинетический анализ кривых зависимости акти вности фермента т концентрации палата при различных начальных концентрациях НАД (рис ) показал, что малат не влияет на взаим действие актившх центров МДГ, что фиэ алогически вполне оправда но, поскольку ин виво малат является против ионом калия, играя важную роль в процессах тургора и осмоса, и по оцу может накапливаться в клетках листьев растений в значительных к .личествах (Lfincc, Sustin,1974; Ting, 1931).

Влияние НАД. Анализ кривых зависимости ¿дельной активности ЬЩГ от концентрации НАД (рис. Ь) позволяет сделать вывод о том, что при физиологических концентрациях малата относительно неболь шое изменение концентрации НАД вызывает относительно большие изменения в величине удельной активности фермента.

Таким образом, в реакции восстановления OA влияние на ферме оказывает сам OA, а в обратной реакции окисления малата - НАД.

Рассчитанные кинетические константы в отношении субстратов реакции отличаются от тех, к»т;>риь известны для НАД-МДГ митохоьц риального, пероксисомального и цитоплазматического происхождени*

Исследование влияния рН среды iu активность фермента позволяет говорить о его иго^обности канализировать реакцию в обоих направлениях при наблюдаемых физиологических величинах рН в хле-

ропластах: pH 7-8.

Изучение влияния ряда метаболитов и, в частности, НАДЬ, НАД4-Н и некоторых других показало значительно меныцую чувствительно ;т: активности фермента к присутствию в реакционной среде этих метаболитов.

Таким образом, полученныврездогьтаты доказывают возможность проявления высокой активности ферментсм в хлоропластах в соответ- • ствувдих физиологических условиях я дает основание считать, что НАД-ВДЦГ способна выполнять ряд физиологических функций, приписывавшихся до последнего времени НАДФ-зависимой ЦДГ, и, в первую очередь, участвовать в работе челнока малат-ОА через мембрану хлоропласов.

ОБНАРУЖЕНИЕ ОКСАЛОАДЬТАТДИШРБОКСИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ХЛОРОПЛАСТАХ ЛИСТЬЕВ С3-РАСТШЙ

Наличие в хлоропластной мембране С^-рас тений высокоспецифичных переносчикjb С^-дикарбоновых кислот (Lehner, Heidt, 1973; Hatch o.a., 1934) , а также проблема поступления пирувата в С^-хлоропласты (lieber, Krause, 1971s Bnser, Heber, 1980; Heber, Heidt, 19S1I Schultse-ülobert е.а.,1984Хпозволяют предположить наличие в таких хлоропласта* фермента, декарб оке ил ирующе го какую-либо С^-дикарбоновую кислоту с образованием пирувата и COg.

Эксперименты показали, что в хлоропластах ряда Сд-растений обнаруживается оксалоацетатдекарбоксилазная активность, не связанная с проявлением активности НАД-ВДГ, декарб оксидирующей OA, КФ I. I Л. 38, либо НАДФ-ЦЦГ декарб оксидирующей, КФ I Л.1.40 (табл. 2). Представленные результаты показывают, значительный разброс в величинах активности в зависимости от объекта исследования.

В различные фазы развития растений хлопчатника и ржи величина обнаруженной активности менялась. Это служило косвенным свидетельством того, что обнаруженная активность не является артефактом, а обусловлена действием специфического фермента.

Доказательства энзиматической природы реакции. Исследовали влияние концентрации OA на величину удельной активности хлоропла-стных препаратов. Установлено, что кривые имели сложный вид (рис. 9). При этом величина K(J=49+20 мкМ была близка .к величине Ку специфического перени.чика OA через мембрацу хлоропласта (Hatch o.a., 193/1) . Определение pH-оптимума показало, что максимальная

Таблица 2

Удельная активность хг оропластных препаратов некоторых С^-растений по декдрбоксил/рованию ОА

Фаза ( Удельная акт-вноЬть ОА-дшарбокси-

па:: пития' 1 лазы_.__._

« ^ 1 1 1

• 'г белка 1 мсмоль на I мг хг

' \ " . . 1 роФиала в чау

Рас

Тритикале ¿-хчредеЛьные »

прароотки - , 1-«13+0,06 8 »СМ) .7

Р-.'-с" начало .колоше- . 1

ния 2,9+0,4 22,0+4,1

массовое коло-;

шение 1,5+0,3 15,62:3,1

Хлопчатник семядольные ■

листая • ,0.63+0,07 17,0*3,1

вегетация - 0,5^0,12 14,0+2,1

начало цвете- '0,43+0,06 • ■

ния 10,0+0,8

Подсолнечник вегетация 0,23+0,02 74,1+18,2

0,50

0,25

У

/

г

/

О 4 8 12 30 45 =

х 10 5 М

Рис. 9. Влияние концентрации'ОА на величину удельной оксалоацетатдекарбоксилазной активности хлоропластного гомогената хлопчатника

А

к«явность проявлялась в интервале веЛич:л рН 6,?-7,4. Ксоутедовя-м влияния концентрации общего йторопластного белка реакционен смесй на величину его удельной оксалоаце"а1'дек'., :,л)ки-.'гглной ««явности показало, что с увеличение:.: содержания белка от«о уде-ьная активность падала. Полученное доказательства энзима, гическ ой [риродн реакции позволили поставить Задачу по в-датен-лз эысоко-мищенны* ферментных лрепаратов, их идентификации и изучению не-¡Л'ОфЫХ свойств. '

Наиболее удобным объектом в этом стнмкгнии оказались (хюте--тя подсолнечника.' Данные очистки ОА-декасбяксилазы из хло:.. плг< -ров подсолнечника приведены.в табл. 3. В результате очи:-" кг у;.с-

- ' , Таблица 3 Оч/стка ОА-декарЙоксилйзы из хлорсгьтастов 05 г-листьев подсолнечника в фазе поздней р^гетацж*

! Уде...лая ! Сп- "сш-

Стад;ш очистим . ! «.хичество, »

I °£ЛКа* !• нкат/ыг бел-! чг-;о раз ! иг ! ка !

Хлсрспл'.стный экстракт Фракция насыщения 35-С5/6 сульфата аммония плюс гель-фильтлация через еефад»;кс Ыолселект ДОаЗ-50

льная активность фермента возрастала'примерно на два <-:•«:> и / достигала величин 270-ЗМ н?ат/мг белка. Пр-, этом ви ч?!

активностью ОА-декарбоксилазы обнаруживал:: и актиинг-отг НАД-йЩ*'^' что дало основание говорить о во: --ожности - образования комплекса-.// этими дт-умя ферментами. ~

Нр*/ электрофорезе активных фрадцйй обнаруживал:' 2 полосы белка: ^сновцую, в которой обнаруживали ак^иьность иА-дмсагбсхсклэ-зы, и более слабую, в которой обнаруживали активность ЗДГ. Содержание к&Г по белку в полученных препаратах в лучших случаях превышало 15-2Я&. Молекулярная масса 0А-де к а рб ыс с ил аз п оп редел яка в 65 ООО.

Свойства ОА-декарбоксилазы. Исследование к'и::огики дейсгзгя фермента указывало на возможность ингибирования ферментативной

■34' ' " I

14 • ■ ' . 43,6 э

0.8 270,0 -

активности образующимся в процессу реакции пирувгт'м. Изучение-влияния концентрации СА па величин/ удел l ной активности фермента показало, что кривая имела гипкрвллиъеский вид (рис. 10). Кине-

0

Рис. 10

х ТО"4 M

Влияние концентрации UA на величину удельной активности ОА-декарбоксилапы хлоропластом подсолнечника

тический анализ формы кривых позволил сделать вывод о том, что при физиологических концентрациях ОА не оказывает существенного воздействия на активные центры фермента ( h =1).

Определение сродства фермента к ОА показало, что величина SQ ^ =75+Я ыкЫ, что соответствует известным данным для очищенного фермента из микроорганизма Klebsiella aerogenes и клеток печени крысы (Stexn, 1967; Dimroth, 1981).

pH-Оптимум реакции определён в 6,5-7,5 единиц pH среды, что соответствовало данным о ферменте из микроорганизмов Aerobacter aerogenes и Klebsiella aerogenes (Stern,1967; Dimroth,19Э1).

Изучение регуляции активности üA-декарбоксилазц позволило выявить только два эффектора, способных в значительной степени оказывать влияние на её активность. Ото - АТ& и АДФ (рис. II). Кинетический анализ кривых зависимости активности фермента от концентрации АТФ показал, что при изменении физиологических концентраций АТФ ОА-декарбоксилаза более чувствительна к изменению концентрации этого метаболита, чем при высоких нефизиологических

¿а

А

100

?

х Ю"2 И

А

200

100

о

х Ю-2 М

Рис. II. Влияние концентрации АТФ (а) и АДФ (б) на активность ОА-декарбоксллазы

концентрациях АТФ. Анализ зависимости активности ОА-декарбоксила-зы от концентрации АДФ показывает, что относительно большие изменения концентрации 'этого эффектора вызывают относительно меньшие изменения в величине удельной активности фермента.

Известно, что при включении света с началом функционирования фотосинтетического процесса в хлоропластах наблюдается изменение концентраций нуклеотидов. При этом наибольшие изменения происходят в концентраций АТФ (КоЪяуазМ е.а.,1979) • Учитывал положительную

б

кинетическую неоперативность по АТФ можно говорить о том, что АТФ являете/) "тонким" регулятором активности ОА-декарбоксилазы в хло-ропластах подсолнечника.

Таким образом, было показано, что ОА-декарбоксилазная активность п хлоропластах листьев Сд-растений связана с функционированием ЭА-декарбоксилазы, свойства которой сходны со свойствами фермента из клеток печени крысы и некоторых микроорганизмов.

Итак, было установлено, что метаболизм С^-кислот в хлоропласта* листьев С^-растсний может осуществляться при участии НДЦ-зави-симой ЦДГ и ОА-декарбоксилазы.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕТАБОЛИЗМА ОКСАЛОАИЕТАТА С ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ АССИМИЛЯЦИЕЙ С02 У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Полученные доказательства функционирования в хлоропластах С^-растений неизвестного ранее пути метаб! лизма С^-дикарбоновых кислот с участием НАД-ВДГ и ОА-декарбоксилазы, приводящего к образованию пирувата и С0£, ставят ряд дополнительных вопросов о его бис логическом значении. Решению этой задачи посвящена заключительная глава исследования.

Соотношение активностей НАД-ВДГ и ОА-декарбоксилазы в хлоро-пластных гомогенатах в онтогенезе. В экспериментах с семядольными и настоящими листьями хлопчатника в онтогенезе не было обнаружено какой-либо закономерности в изменении удельной активности ЦЦГ, либо ОА-декауйоксилазы. В то же время соотношение активностей обоих ферментов представляло собой параболическую зависимость в течение исследованного периода развития листа (рис. 12), которая может сл^ жить качественным критерием соотношения возможностей для ферментативного превращения ОА в хлоропластах по пути образования малата, либо декарбоксилирования. В онтогенезе растений подсолнечника получена аналогичная кривая, в которой параболическая зависимое?! скорее угадывается (рис. 12). При этом "экстремум функции" значительно {^стянут во времени. Такие зависимости можно объяснить спецификой разных растений в отношении синтеза и накопления сахарозы или крахмала, а также 'различных фосфосахаров и веществ вторичного происхождения, сказывающихся в целом на процессе фотосинтеза и, возможно, на метаболизме С ¡-дикар';снових кислот ь хлоропластах Сд-

VA 2

О 30 60 90

ДНИ

Рис. 12. Изменение отношения активностей ВДГ (Aj) и ОА-декарбоксилазы (А^) в онтогенезе листьев хлопчатника (I - семядольного, 2 - настоящего) ' и растения подсолнечника (3)

эастений (Potter, 1980; Stitt е.а., 1985; Stltt, 1986).

Профиль ионообменной хроматографии ОА-декарбоксилазы в онтогенезе растений подсолнечника. В фазу ранней вегетации наблюдзли трофиль элюции, показанный на рий. 13. При элюции с колонки мол-;електа ДЭАУ-50 ОА-декарбоксилаза элюировалась одновременно с ВДГ. Использование более "крутого", "растянутого" или ступенчатого гра-;иента концентраций фосфатного буфера не позволяло разделить обе штивности, что предполагает образование комплекса молекулами обо-IX ферментов.

При переходе к фазе цветения и в фазу цветения наблюдали изменение удельной активности обоих ферментов во фракциях (рис. 13). 1ри этом удельная активность ОА-декарбоксилазы оказывалась явно 5олее высокой, чем активность ВДГ. Такие результаты предполагают, 1то в эти фазы развития растений подсолнечника увеличивается воз-ложность утилизации С^-дикарбоновых кислот по пути декарбоксилиро-зания с образованием пиргувата и СО;?.

0П34С/ШШ

0,02г

0,01

ОП^/шш

0,05 0,04 0,02

О

о

I

С* X ж * «

оп

'280

0,10 0,05

5 10 15 фракции

ОП,

280

* ' с, о

10 15

фракции

0,10 0,05

О

Рис. 13. Кривые элюции белка /I/ с колонки молселекта ДЭА5-50 при ионообменной хроматографии. Величины удельной активности ВДГ /о/ и ОА-декйрбоксилазы /х/ во фракциях Растения подсолнечника в фазу ранней вегетации /а/ и цЕетення /б/

О

5

Аналогичную смену профиля удельной активности обоих ферментов наблюдали и для растений хлопчатника. Однако, в этом случае эксперимент проводили с растениями в фазу ранней вегетации (4-6 настоящих листьев). При этом у растений, выросших при достаточной влагообеспеченности удельная активность ВДГ явно превышала удельную активность ОА-декарбоксилазы, которая была весьма незначительна. Когда же растения выращивали при явно недостаточном поливе при высокой температуре окружающего воздуха (в условиях засухи), то профиль удельной активности ОА-декарбоксилазы и ВДГ при элюции с колонки молселекта ДЭАЭ-50 был аналогичен то\у, что изображён на рис. 13, б, т.е. активность ОА-декарбоксилазы во фракциях явно превалировала над активностью ВДГ. Подобная картина наблюдалась и на ранних этапах очистки фермента (табл. 4).

Таблица 4.

Соотношение активностей ОА-декарбоксилазы и ЩГ у растений хлопчатника

Условия !(-. ! Удельная активность, ! Отношение

выращивания! очистки ! нкат/мг белка_[ активностей,

I 1 ВДГ ! ОА-декар- ! ВДГ/ОА-дека-_!_! _! боксилазы ! рбоксилаза

К о рмал ьные хл о ропл ас тный

экстракт 1,93+0,21 0,28+0,02 6,9

фракция 35-65%

насыщения суль-

фатом аммония

плюс сефадекс 9,54+0,80 5,03+0,41 1,9

Засуха хлоропластный

экстракт 11,0+1,2 12,1+0,9 0,9

фракция 35-65%

насыщения суль-

фатом аммония

плюс сефадекс 16,6+1,4 23,5+1,8 0,7

Таким образом, полученные результаты показывают, что уровень функционирования ОА-декарбоксилазы и 1'ДГ в хлоропласта* Сд-расте-ний может зависеть как от вида растения'(фазы е.го раз в и тля), так и от наличия внешних неблагоприятных факторов.'При-этом раскрыва-

ется один из ферментативных механизмов (увеличение удельной акте кости НАД-ЦДГ и ОА-декарбоксилазы), с помощью которых растению удаётся поддерживать сьса жизнеспособность путём активизации метаболизма органических кислот при неблагоприятных условиях внешней среды (Krarapitz, Pock, 1984 ; Магомедов, 1988).

Субхлотюпластная локализация ОА-декарбоксилазы. Проблема локализации фермента тесно связана с вопросом о той возможной физиологической роли, которую выполняет этот фермент in situ . Исследование на хлоропластах ржи показало, что.активность фермента обнаруживалась только в мембране оболочек хлоропластов. 3 то же время эксперименты с хлоропластами подсолнечника позволили установлю, что наибольшая удельная активность обнаруживалась в стро-.v.t . Ь ламеллах/тилакоидах и мембранах оболочек хлоропластов уде-'.;ыкш активность фермента была значительно ниже. При этом обработка ;:с&йран 0,20^-ы тритоном Х-100 в присутствии 10"^ М ЬДТА при-«годала к снижению удельной активности фермента.

Таким образом, было показано-, что ОА-декарбоксклаза может находиться не только в строме хлоропластов, но и быть связана с мембранами.

Теоретические аспекты исследования взаимосвязи метаболизма СА с. фотзскнтетачаской ассимиляцией COq. "функционирование метаболизма С^-дикарбоновЦх кислот играет ключевую роль в ассимиляции С©2 у растений САМ и С^-типа фотосинтетического метаболизма углерода. У С^-растенин ферменты превращения OA: ФЕП-карбоксилаза, £ЕП-карбоксикиназа, НАДФ-Ь'ДГ декарбоксилирующая, НАД-ВДГ и ОА-де-кар'оксилаза выполняют иную физиологическую роль, непосредственно не связанную с усвоением углекислого газа. Однако, идея о подключении этих ферментов к процессу фотосинтетической ассимиляции СGg.находит своё отражение в гипотетических механизмах (Насыров, 19с2; Магомедов, 1983; Aoyaci, Baosliara, 1936) . Трудности экспериментальной проверки этой идеи заставляют обращаться г. теоретическим исследованиям.

Среди известных исследований наибольший интерес с этой точки зрения представляет математическая модель, предложенная Д.Е.Фридляндом (1989). Однако, на наш взгляд, поскольку в модели учитывается процесс фотодыхания только как оксигеназная реакция гБ£?-карбоксилазы, постольку исходное уравнение для последующих

преобразований дол:;:но иметь общий 2ид (íarquhar, 1983): = Н - % - v; - Ra t

где í* - скорость видимого газообмена по СОр; Н - поток неорганического углерода из цитоплазма в хлоропласт (Cg-ргстение) или из клетки мезофилла б клетки обкладки проводящих пучков (С^-расте-ние); ty - поток неорганического углерода, противоположный потоку Н; скорость Енделения CCg при фотодыхании; Ra- скорость выделения COg в цитоплазме (Cg-рзстение) или клетке мезофилла (C¿-растение), не зависящая от интенсивности освещения и концентрации СО^. Тогда дальнейшие преобразования приводят к аналитическому выражению общего вида как для Cg, так и для С рас тений:

р. í"f" +

' Хт [ Кс (i - Oi/lfJ- Г] + PS [ Кс (i + 4 /^J2 ' где максимальная активность .ФЕП-карбсксилазн; констан-

та Кихаэлиса для связывания НСОд на ФЕП-карбоисилазе; - мак-

симальная скорость карбсясилирования РБФ; К„ - константа Михаэли-са для С0£; 0¡ - концентрация 0^ в хлороатасте Сч-растенил или клетках обкладки С рас тения; KQ - константа Михаэлиса для > Г - углекислотныи компенсационный пункт; PS - произведение коэффициента проницаемости СОр для мембраны ка величину суммарной площади оболочек хлоропластов у Сд-рас тения или клеток обкладки проводящих пучков у С растения.

Решая это уравнение, а также рассматривая предельные случаи: Р —— 0 и Р —•— , путём подставления соответствующих величин параметров, приходим к заключению- о том, что Cg- и С ^-растения различаются таким образом, что у последних существуют значительные препятствия для диффузии COg из клеток обкладки проводящих пучков в клетки мезофилла (Р —■— 0). В то же время для Сд-ра-стений отсутствуют препятствия для диффузии COg из хлоропластов в цитоплазму (Р —■— о=> ). Полученные результаты позволяют говорить о том, что даже максимально -высокая активность ферментов С^-мета-бслизма у Cg-растений всё же не.позволяет им создавать механизма концентрирования COgi хотя и может приводить к увеличению показателя эффективности карбсксилирования. Такой вывод приводит к заключению о том, что в процессе возникновения растений С^-типа ве-

.вущее место занимает особая структура ("кранц"-анатомия) листа, а не увеличение активности ферментов С^-синдрома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопление разнообразных сведений в области биохимии и физиологии и, особенно, энзимологии делает необходимыми попытки анализа полученного материала с разных точек зрения. Одна из таких попыток предполагает выявление наиболее реакционноспособных субстратов, являющихся своеобразными точками соприкосновения разнообразных биохимических циклов и путей превращения органического вещества в живом организме. В этом случае появляется возможность рассматривать высокореактивные субстраты, как универсальные звенья, ■с помощью которых природе удаётся связывать в единую сеть множество путей превращения метаболитов. При этом преобладающая активность одного-двух путей превращения такого субстрата может драматически сказываться на возможностях функционирующих метаболических циклов и ограничивать деятельность некоторых из них в конкретном компартменте. Такая картина позволит в дальнейшем углубить понимание вопроса о том, почему одни процессы более активно протекают в данном компартменте, а другие - менее активно. Т.е. это мс-жет привести к появлению новых идей и взглядов на проблемы организованности, упорядоченности и целесообразности на разных уровнях организации живого, что представляет значительный интерес точки зрения кибернетического понимания организации биосистем (СетроЕ, 1971).

Появление работ, посвященных высокореактивным субстратам, даёт возможность не только увидеть универсальность этого субстрата для множества превращений, реализуемых в природе, но и позволяет в значительной степени углубить и расширить наши знания и понимание механизма конкретной реакции, катализируемой ферментами различных классов, выявить общие черты в ферментативном катализе данной реакции, особенностей её регуляции в связи с происхождением фермента, общие и особенные черты (характеристики) в механизме действия отдельных ферментов. Такой взгляд позволяет также обнаружить новые "контрольные" точки путей метаболизма и заставляет иначе рзглянуть на уже известные. Переосмысление накопленных данных с предлагаемых позиций может быть полезным для уточнения

оо

•зрархиа координированного контроля цело!; группы мет^бггмгч^снн" ¡утей "ли биохимические: циклов, а таяке, возмогло, з рс-геик;: :>",-> ззеев происхождения ферментов и даке их классификации.

С этих позиций, на нал взгляд, OA является одним из наиболее интересных субстратов, трансформации которого катализирует /-коло ;вух десятков ферментов. OA - единственный метаболит, подвермел-чый воздействия ферментов всех классов. При этом особый интерес :: точки зрения биологического значения трансформации этого субстрата имеет, по-видимому, реакция его декарбсксилировакия, которая представляет значительный интерес и с точки зрения химии, к яг: один из модельных объектов, помогающих понять специфику ферментативного катализа в отличие от неферментативного.

Ключевая фуккцнч OA в ассимиляции к превращении неоргаигсе.;-ког/, углерода в органический у значительной группы, так К1йШ>а-.~ кых растений САМ и С,,-типа, стаьит вопрос о метаболизме С^-киел-г. у С.-,-растений и физиологическом значении этого явления. Отсутствие сведений о свойствах ферментов превращения С „-дгасарбонт кх кислот листьев Cg-растениЙ позволили поставить цель по изучению моле;;улярно-к5'рег:гчссК1:х и регуляторах свойств таких ферментов .

Пройденные эксперименты, а такзе теоретическое ксследоышке в совокупности с имеющимися литературными данными дали возможность говорить о функционировании в хл о ро пластах Cg-растений ранее неизвестного пути превращения С «-дикарбоновых кислот, приводящего к образованию пнрувата и COg (ряс. 14), a также раскрыть его физиологическое значение для таких растений. При этем реакция Дакаре оксидирования OA в Cg-хлорспластах потенциально мог.ет сказывать влияние на ряд процессов в хлоропластах посредством образующегося в реакции С0о:

-способствовать образован»® карбам.атов ферментов и белков, повьзая их растворимость.и облегчая диффузию в строме хлоропласта (Kita, 1979);

- участвовать в процессах переноса ионов через хяороплазткыс мембраны по модели, аналогичной той, которая предложена для микроорганизмов и клеток животного присхождекия (Chow, Chan, 19В2; Dinroth, Hilpert, 1984; Vlikena o.a., 1933; Thcaaa, 198Э);

- приводить к кратковременному локальному изменению pH г строме за счёт превращения образующегося COg в кон бикарбоната с

Рис. 14. Гипотетическая схема подключения эндогенных /л'ечн'-! С0? к функционированию ВПФЦ у С,-растений

частием карбоангидразы (Комарова, Доман, 1982; Лазова, 1989; raklinova е.а., 1982);

- быть источником субстрата: HCOg - для ФЕП-карбоксилазы ? [итоплазме клетки;

- оказывать влияние на фотосинтетический транспорт элекгро-юв, например (Шин и др., 1989);

- включаться в цикл Кальвина при участии РБФ-карбсксилазы;

- вместе с мембранносвязанной карбоангидразой тилакоидов созывать возможность для потока неорганического углерода внутрь тифоида, что может приводить к функционированию своеобразного механизма концентрирования СС^, подобного описанному ранее (Г.рони-ia. и др., 1981; Пронина, Семененко, 1984);

- увеличивать синтез АТФ, возможно, через прямое воздействие на конформацию хлоролластного сопрягающего фактор (Cohen, ilacPeek, 1980);

- оказывать влияние на скорость транскрипции хлоропластных генов белков или ферментов, например, карбоангидразы (Bailly, Со-Leman, 1988; Spalding, Jeffrey, 1989);

- создавать физический эффект микроперемешивания среды строки.

Полученные результаты также дают основание считать, что в

эволюционном процессе возникновение С^-растений связано прежде всего с образованием новой структуры (анатомии) листа, а не с увеличением активности ферментов С^-синдрома.

Результаты исследования ставят ряд новых задач по обнаружению растений с повышенной активностью ферментов выявленного пути утилизации С^-дикарбоновых кислот, по исследованию онтогенетических изменений этой активности, а также в связи с различными стрессовыми' воздействиями на растение, углубляя понимание общих и особенных механизмов самозащиты растений от таких воздействий. При этом особый интерес представляет решение вопросов об изменении физико-химических характеристик ОА-декарбоксилазы в иных для растения условиях, как это наблюдается, например, у микроорганизмов (Stern, 1967; Dimroth, 1981) , о регуляторных свойствах, активном центре и динамической структуре фермента из различных растений с точки зрения сравнительной биохимии, а также углубления понимания функционирования отдельных ферментов с точки зрения общей теории ферментативного катализа. При этом обобщённая схема подключения эндогенных источников С02 к работе ВПФЦ (ряс. 14), разработанная

С учётом лолученных экспериментальных данных, также ставит ряд новых вопросов в области физиологии растений, которые требуют сь; его изучения, выходящего за рамки настоящего исследования.

ВЫВОДЫ'

I. Анализ механизмов ферментативного декарбоксилирования оксалоацетата показал, что переходное состояние конформации субстрата не связано жёстко со структурой образующихся продуктов реакции. Такая картина является характеристикой специфичности ферментов и позволяет понять порой значительные отличия в удельной активности и ряде других свойств, в том числе энергетических показателях реакции, определённого фермента, очищенного до гомоген него состояния из различных источников. При этом обобощённый ма териал расширяет представления о функционировании динамической структуры фермента, приспосабливаемой природой для трансфорацик субстрата по определенному пути.

2. Показано, что молекулярные свойства и кинетическое поведение ФЕП-карбоксихиназы растительного происхождения отличаются от поведения фермента животного или.бактериального происхождения что может быть связано с его иной физиологической ролью у высей» растений. При этом устаноачено, что ФЕП-карбоксикиназа растений обладает невысокой стабильностью активности во времени, имеет вь с окую молекулярную массу и сложную систему регуляции активное: Полученные результаты свидетельствуют о том, что у Сд-растений фермент выполняет скорее функцию карбоксилазы, чем декарбоксила: г:и о':см предполагавшееся ранее участие ФЕП-карбоксиккназы в со; данни механизма концентрирования СО^ У Сд-растений оказывается

3. Исследование реакции декарбоксилирования оксалоацетата ' кр'зугствии КАД2-малатдегидрогеназы декарооксилирукцей из лксты цг: лодка показало, чте субстрат не оказывает влияния на вэаимс-дс/ствие активных центров фермента. При отом важнейсее значение для пг ¡явления высокой активности играет "правильная" ксч^лрмац Фермента, создаваемая ионами металлов. Установлено, что замена металла-активатора и смена порядка запуска реакции позволяет сл дить за изменением конформационного контроля каталитического ме ханизма реакции со стороны молекулы фермента.

4. Впервые получена в высокоочищенном виде НАД-малатдегкдро-генапа из хлоропласте в листьев хлопчатника. Установлено, что кинетическое поведение хлоропластного фермента отличается от поведения фермента цитозольной, пероксисомальной и митохондриальной локализации. выявлено, что наибольшее влияние на фермейт оказывает оксалоацетат в реакции его восстановления и НДЦ - в реакции окис-чения малата. Также установлено, что в зоне физиологических значений рН !/.ДГ способна катализировать реакцию как в прямом, так и н обратном направлениях. Полученные данные свидетельствуют о том, что фермент способен выполнять в хлоропласте-ряд физиологических Ьункций, приписывавшихся ранее НАДФ-зависимой МДГ и, в.первую очередь, он может участвовать в функционировании челнока матат-ОА -¡ерс-з оболочку хлоропласта Сд-растений.

Ь. Установлено, что носителем оксалоацетатдекарбоксилазной гктивности в хлоропластах ряда Сд-растений является ОА-декарбск-г/.-шза. Разработанный метод выделения фермента позволил впервые юлучить растительную ОА-декарбоксилазу в высокоочищенном виде. 1р.* исследовании свойств и особенностей кинетического поведения фермента установлено, что ОА-декарбоксилаза похожа по ряду свойств - константе Михаэлиса, молекулярной массе, рН-оптимуму - на фер-гент из микроорганизмов и печени крысы. Выявлено только два высокоэффективных ингибитора активности фермента: [АТФ]д ^=1,94 мМ ! [АД^]0>5=1,63 мМ.

6. Получены экспериментальные доказательства о функционировали в хлоропластах Сд-растений ранее неизвестного пути метаболизма С^-дикарбоновых кислот, приводящего к образованию пирувата и

Установлено, что физиологическое-значение этого пути мета-Золизма С ^-кислот меняется в онтогенезе листа, растения, а также три воздействии на растение внешних неблагоприятных факторов. )ткрытие с-ксалоацетатдекарбоксилазной активности в Сд-хлороплас-¡ах решает проблему быстрого появления пирувата в хлоропластах, объясняет чрезвычайно высокую специфичность хлоропластных мембранных переносчиков малата и оксалоацетата к субстратам, а также зысокую скорость поглощения С^-дикарбоновых кислот Сд-хлоропласта-ди. Полученные результаты позволяют говорить о тесной взаимосвязи метаболизма дикарбоновых кислот с процессами -переноса восстановительных эквивалентов через мембрану хлоропластов, биосинтеза -"пнцов 'и фотосинтеза.

7. С помощью математической модели показано, что увеличение активности ферментов метаболизма оксалоацетата приводит к изменению эффективности карбоксилирования растения. При этом установ лено, что даже максимально высокая активность ФЕП-карбоксилазы у С^-растений не позволяет им приблизиться по показателям эффектив ности карбоксилирования к С^-растешям. Полученные результаты от □ергают возможность функционирования механизма концентрирования СО^ у Сд-растений в отсутствии специализированной анатомии листе

Материалы диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Иванищев В.В., Насыров Ю.С. Кинетика действия ФЕП-карбо1 сикиназы из листьев хлопчатника и кукурузы // Докл. АН ТадЖчССР 1984.- Т. 27.- № 6.- С.'338-341.

2. Иванищев В.В. Свойства ФЕЛ-карбокеикиназы высших растен] // Материалы Республиканской научно-технич. конф. молодых учёны: и специалистов Тадж. ССР:Тез. докл. Секция биол., 1985.- С. 48.

3. Иванищев В.В. Фосфоенолпируват-карбоксикиназа Сд- и С^-растений // Биохимия.- 1985.- Т. 50.- № 9.- С. 1481-1487.

4. Иванищев В.В., Насыров Ю.С. Свойства ФЕП-карбоксикиназы еысших растений // Всес. симп. "Связь метаболизма углерода и аз та при фотосинтезе": Тез. докл.- Пущина, 1985.- С. 102-103.

5, Иванищев В.В., Хасанов И.К. Кинетическое поведение дву киназ, использующих в реакциях АТФ // 1У Конф. биохимиков респ. Ср. Азии и Казахстана.: Тез. докл.- Ашхабад, 1986.- С. 256^257.

6. Иванищев В.В. Влияние некоторых метаболитов на активное фосфоенолпируват-карбоксикиназц из листьев хлорис // Докл. АН Тадж. ССР.- 1988.- Т. 31.- № 7,- С. 478-430.

7. Иванищев В.В. Декарбоксидирование щавелево-уксусной кис -члоты экстрактами из листьев щетинника // Докл..АН Тадж. ССР.-

1988.- Т.31.- № 8.- С. 548-551.

8. Иванищев В.В. Влияние ионов магния и марганца на ферме! тативцую реакцию декарбоксидирования щавелевоуксусной кислоты , Докл. АН Тадк. ССР.- 1988.- Т. 31.- № 9.- С. 620-623.

9. Иванищев В.В. Влияние субстрата на оксалоацетатдекарбо; лазцую активность хлоропластов из листьев хлопчатника // Докл. АН Тадж. ССР.- 1989.- Т. 32.- № 3.- С. 202-205.

"39 ~

10. Иванищев В.В. Влияние рН среды на оксалсацетатдекарбок-силазную активность хлоропластов из листьев хлопчатника // Докл. АН Тадж. ССР.- 1989.- Т. 32.- № 4.- С. 277-279.

11. Иванищев В.В. Изучение оксалоацетатдекарбсксилазной активности хлоропластов из листьев хлопчатника // Сб. трудов Республиканской научно-практ. конф. молодых учёных и специалистов Тадж. ССР: Тез. докл. секции биол. - Душанбе, 1989.- С. 29.

12. Абдуллаев А., Горенкова Л.Г., Иванищев В.В. О распределении некоторых ферментов метаболизма С^-клслот в хлоропласт-хх ржи // Физиология растений.- 1989.- Т. 36.- Р 4.- С. 665-668.

13. Иванищев В.В., Абдуллаев А., Горенкова Л.Г., Ибрагимова Г.Б. Активность фосфоенолпируват-карбоксикиназы в компартмен-тах листьев хлопчатника // Изв. АН Тадж. ССР. Отд. биол. наук.-1990.- )Ь I (118).- С. .53-55.

14. Ivanishchev V. The transformation of oxaloacetate with enzymes from chloroplasts of C-3 plant3 // V-th Intern, youth cymp. on Plant Metabolism regulation: Abstracts. 3-12 Oct., Varna," Bulgaria, 1990.- P. 16,

15. Иванищев В.В. Об оксалоацетатдекарбоксилазной активности хлоропластов из листьев Сд-растений // Физиология растений. -1990.- Т. 37.- 6.- С. 1065-1071.

16. Иванищев В.В. Исследование энзнмологпи превращения ок-салоацетата в хлоропластах Сд-растениЯ // Тс-з. до::л. 4 Ecu;, конф. молодых ученых по физиологии растительной кпож: (&'кск, 15-20 апреля, 1990 г.).- М., 1990.- С. 51.

17. Иванищев В.В. 0 свойствах оксал'-ацетатдекарбокоилазы из хлоропластов подсолнечника // Докл. АН Тадж. ССР.- 1990.- Т. 33.-j; II.- С. 774-777.

18. ¡'еанкцев Ь.Б. Ккистячсские свойства ИАГ-малатдогидрога-назы из хлоропластом хлопчатника // Дскл. АН То;:-:. ССР.- 1990.-Т.ЗЗ.- $ 12С. 839-842.

19. Ivanishchev V. The transformation of oxaloacetate with enzymes from ohloroplasts of C-3 plant о // Proc. V-th Intern, youth synp. "Plant Uetabolicm angulation".- Sofia, 1991«- P. 8895.

20'. Иванищев b.3. 0 возможности окспериментальногэ обнаружения Сд-растений с механизмом кащентрирования С0% // Тез. докл. и сообщений Мендунар. конф. "'¿ютосинтез и фото^'котехнология".-

. Пущино, 19Э1.- С. 7-8.

21. Иванищев Б.В. О роли малатдегидригоназы к сксалоацетат-декарбоксилазы в фотосинтезе Сд-растений // Тез. докл. и сообщений Междунар. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология".- Пущино, 1991.- С. 14.

22. Иванищев В.В., Курганов Б.И. Неферментативное и ферментативное декарйокскл'лрованле оксалоацетата // Биохимия.- 1992.Т. 57,- 4.- С. 495-503.

23. Ивани.1.ев Я.а., Курганов Б.И. Ферменты метаболизма малага': характеристика, регуляция активности и биологическая роль // Биохимия.- 1992.- Т. 57.- № 5.- С. 653-662.'

24. Иванищев В.В. Об определении эффективности карбоксилиро-ванйя у растений, обладающих механизмом концентрирования С0£ // Физиология растений.- 1992.- Т. 39.- № 3.

25. Иванищев В.В. Выделение и некоторые свойства высоко-очищенной оксалоацетатдекарбоксилазы из хлоропластов подсолнечника // Физиология растений.- 1992.- Т. 39.- № 4.

26. Иванищев В.В. Способ получения оксалоацетатдекарбоксилазы из хлоропластов подсолнечника // Положительное решение на изобретение № 4887677/13(115839).

Подписано г- печать 13.ГО.01г. Зормэт СЛ<С!Т/ГС. Бумаг? тип ,г1. С-*сетнак печг.т». Усл.пзч.л.2,5.

Уч:ип£_. л. 2 Г. Тирпж 100. "лглп '"17С___

" ипагп.':-1!'.:" Академии наук гйогу'С/Т'.г.' ' "тг,-

'"УГ^. ул. Т21 корп.2.'