Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретический анализ проблемы старения и иммортализации клеток животных: возможная роль ядерных протоонкогенов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Теоретический анализ проблемы старения и иммортализации клеток животных: возможная роль ядерных протоонкогенов"

пнстатут БИОЛОГИ! РАЗВИТИЯ ИЫВДШ Н.К. КОЛЬЦОВА АН СССР *

Но правах рушпясз

ИШНЧИКОВ СраЯ 1й1ЕШ!ОЮТ

УДГС 577.95: 616-006

теоретически! анализ провлеш .старения ii егяргдлизацйа клеток ажотшх: воюющая роль адетш иотоонношюв

03.00.15 - гекагккя

¿.втортагрлт диссертации на соискание ученой степей*! кандидата биологически, наук

Москвя, 1391

Реоога шполыано о лаборатория вксшрзшнт&зьшх иадэлаа шужолаП Всесошдаго ошшлогипзского научного центра ¿121 СССР (директор - окад&иш: АШ СССР H.H. Тршк лшкоа).

Офацццдьша ошонапты:

профессор| доктор Сиологичаских паук АЛ1. Зотхш доктор иадшршсгаа тук А.Д. АльтетеЯл

Ведущая оргспшацал - Пясгатут иолакуляраоа Сиодогш ш. В.А. Энгельгардаа АН СССР.

о ¿7 чаооа но заседании Спацааднзнрогшшого Ученого согэга (Д 002.8&.01) при Икопггутв биологии passaraa ш. U.U. Кольцова АН СССР по адресу: £17603, Москва, ул. Вгшлоая 26.

С дассертшяеа ussho озшаоштъся в бн&Езотека Еютптуто Оиашгш развитая пи. Н.1£. Кольцова А}} СССР.

Автореферат разослеа ^'

199 <? Г.

Учашха сакрсуорь Сшфюлнзнровакыого совете

ОБЩАЯ ХДРАКТЕРИСТИСЛ РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТИП. В основе старения организма, по мнению гогих авторов, лежит ограниченность потенциала делений норма-ьных клеток животных. Существует множество теорий старения, пнако ни одну из них нельзя признать удовлотворительной. Ряд эорий исходит из того, что основной причиной старания является вкопление повреждения ДНК. Но если Он повреждения ДНК были ричикой старения, то клетки большей плоидности были менее чув-твительны к повреждениям и кили дольше, однако гаплоидные сам-ы оси НаЬгоЬгасоп имеют такую та продолжительность , как диплоидные, а тетраплоидные фибробласта человека совершают только Ее удвоений популяции в культуре. сколько и диплоидные. других теориях .старения предполагается, что старение вызыва-тся уменьшением числа пролиферирувдих клеток за счет их диффэ-■енцировки. Но во взрослом организме доля пролиферирувдих кле-'он мала вовсе но потому, что остальные клетки неспособны дели-ься: многие ич них вступают в деления при ранении или добавле-эга факторов роста. Из деления подавлены пз~за регуляции пролиферации по типу отрицательной обратной связи (благодаря ауто-¡ринным ингибиторам делений). Такая система стремится в устой-ШЕсе стационарное состояние, здесь нет механизма уменьшения (оли пролиферирущих клеток. Таким образом, накопление повреждений днк или снижение числа пролиферируших клеток, которые действительно сопровождают стзрение, являются не причинами старения, з следствиями каких-то других процессов. Подчеркнем, что ¡тарение тканеспещфгшо - разные ткани стареют с разными' скоростями, а клетки разных типов совериают разное число делений в сультуре. Это говорит о том, что. процесса, лежащие в основе )?аренля, находятся под контролем ттсапеспецифкческой рпгуляшн?

- г -

Злокачественные sa клетки могут неограниченно делиться к In uttro, так и In utuo. Приобретение клетками этой способное (кмиортализацдя) происходит при трансфекц.л ядерного онкоге или активации соответствующего протоонкогена. Протоонког&ны 8то нормальные клеточные гены, экспрессируеыые ткана- и стада специфично; индуцируемые ими опухоли также ткано еле цифзчк Иммортализирувдую способность они приобретают, если начина! транскрибироваться конститутивно (например, под контролем вир; сного промотора) и их мРНК теряют дестабилизирующие 'учаегга Подчеркнем, что и сами продукты этих генов является ядершл ДНК-связываодиыи белками, причем для некоторых из них показанс что они участвуют в регуляции транскрипции. Логично полагав что раз изменения в экспрессии ядерных протоонкогенов привод! к иммортализации клеток, то они же и ответственны За ограшгш ность потенциала делений у нормальных клеток. Таким оОразо* причины и старения, и иммортализации клеток лежат в структур системы регуляции экспрессии генов Животных.

В литературе обсуждались три возможных механизма действи ^ядерных протоонкогенов на пролиферацию: учветие их продукте непосредственно в репликации хромосом, их влияние на транскрип цию генов, участвующее в репликации ДНК и читозе, и щс участи в передаче пролиферативного сигнала от факторов компетенции которые вызывают всплеск их концентраций. Но ни одно из эти предполокений не оОьясняет проблему иммортализации: ь^дь ядер нне протоонкогены экспрессирувтся и в нормальных клетках, поче му ке те совершают ограниченное число деления( И почему онкоге ны, кодирующие факторы роста, их рецепторы, G-Овлки и протеин киназы, которые как раз стимулируют деления, не вызывают иммор тапизатт клеток? Таким образом, проблема ограниченности потен циала делений клеток в их имортализации при мутациях, изменяю щи. экспрессию ядерных протоонкогенов, весьма актуальна.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - предлагать возмогшие объяснения проблемы тарения и иммортализации клеток животных, основанные на свойс-вах ядерных протоонкогенов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые предложены две альтернативные одели, описывающие старение и иммортализацию клеток животных ; позиции регуляции экспрессии генов. Перввя модель основана на редгголожении, что у высших животных большинство тканеспецифи-:еских регуляторных белков не активирует свою собственную транскрипцию и причиной старения является распад мРНК для белков, ;еобходимых для пролиферации. Вторая модель основана на проти-юположном предположении - что продукт ядерного протоонкогена кооперативно активирует собственную транскрипцию. Такая система 'бразует триггер. Если система находится в области, окружающей дао из устойчивых стационарных состояний, то клетка способна [влиться; но в митозе система с некоторой вероятностью может юрейти в область, окружающей другое устойчивое стационарное юстояние. йз него система уже не сможет выйти при добавлении акторов роста, т.е. клетка терминально дифференцируется. Обе юдели объясняют явление иммортализации.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Работа позволяет по-новому оглянуть на процессы, лежащие в основе старения и злокачест-¡енного перерождения клеток. Она имеет не только теоретическое (начение, но и дает идеи многочисленных экспериментов. Экспери-■ентальная проверка предложенных моделей позволит выбрать из шх ту,, которая ближе к истине, и поможет пониманию процессов, гежащих в основе старения и рака.

ПУБЛИКАЦИИ. По томе диссертации опубликовано 6 статей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована на совмести научной конференции лаборатории молекулярной биологии вируса лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборат* рии клеточного метаболизма и лаборатории экспериментальных м< делай опухолей ВОЩ АМН СССР 5 июля 1991 г. .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на К страницах и состоит.из введения, обзора литературы, двух теор* тических моделей, заключения и списка литературы (374 ссылки; Работа содержит 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Часть I. Обзор литературы.

В первой главе приводятся современные сведения о регуляцв транскрипции у 8укариот: о позитивных и негативных рэгуляторш * алементах, о регуляторных белках. В дассертации часто использу ется термин "регулон": это груша генов,-разбросанных по гено му, но содержащих сайты опознавания одного регуляторного белка благодаря чему эти гены эксцросскруются координирование).

Во второй главе рассмотрена регуляция трансляции и стаби льности мРНК. Приводятся данные, что при переходе в транслируй мое состояние определенные мРНК дестабилизируются, что особен» характерно для "маскированных" мРНК. предполагается, что в сос таве свободных информосом такие мРНК защищены от РНКаз стабили зируюцими белками, а при активации трансляции ати белки высво бокдаются и ыРНК становятся чувствительными к РНКазам.

В третьей главе проанализированы сведения о старении клеток и тканей. Аргументируется, что в основе старения организм!

эльшинства тканей лекит ограниченность потенциала делений кле-эк "пейсмекерных", наиболее быстро стареющих тканей. Приведена ргументы против теорий, объясняющих старение за счет накопле-т повреадений ДНК или дафференцировки клеток.

В четвертой главе рассмотрены сведения о факторах роста и эйлонах, о вторичных мессендаерах и протеинкиназах. Показана пючевая роль фосфорилирования белков в передаче сигнала от акторов роста внутрь клетки и в регуляции клеточного цикла ротеинкиназой р340с1сг.

Пятая глава посвящена роли онкогенов в злокачественной рансформации клеток. Цитоплазматические онкогены (чьи продукты эмологичны белкам, участвующим в передаче сиг от факторов эста) уменьшают потребность клеток в факторах роста, тогда как цернне онкогены (чьи продукты учаотвуют в регуляции транскрипт) вызывают иммортализацию клеток. Подробно рассмотрены свой-гва ядерных онкогенов й протоонкогенов гаус-семейства, с-туЬ, -Хоз, р53, гена для большого Т-антигена БУ40 и полиомавирусов, ГА аденовирусов, Е6/Е7 папилломавирусов и ретинобластомного эна ИВ.

Часть 2. Мод ели старения и ииыортализацяи клеток.

Глава 6. Иоде ль с отсутстшеы оамоподдеряання синтеза регуляторных белков.

Первая модель исходит из предположения, что у высших живо-шх нет самоподдеркания синтеза большинства тканеспецифических згуляторных белков. В иерархии регуляторных генов имеется лишь дан цикл - цикл "зародышевого пути", обеспечивающий онтогенез недущего поколения (рис. I). Возглавляют иерархию ооцит-спо-' к^ическ'л^ тегулони. вт^т^й кя^!»*"'т л^пя^уэтт, рдаг,

специфические регулоны, и т.д. В оогенезе синтезируются "nací рованные" м?НК для регуляторных белков, управляющих регулош гаструлн; при дроблении они достаются раз,,дм бластомерам, ощ деляя их первичную дафференцировку. регуляторные белки и мРНК распадаются и разбавляются при делениях клеток, так ч вскоре подчиненные им гаструла-специфические регулоны пересте работать. Но во время их работы синтезировались мРНК для peí ляторных белков, управляющих следущим каскадом регулонов; <, рез некоторое время исчезнут и эти мРНК, и т.д. Смэна актиш регулонов продолжается до стадии взрослого организма (последа го каскада иерархии регулонов), где регулонам, перестающим \ ботать, замены уже не будет. Поскольку многие гены, необходим для жизнедеятельности клеток, экспрессируются тканеспецифич^ ослабление активности регулонов взрослого организма приведет деградации и гибели клеток. Этим, возможно, и вызваны многоч» ленные нарушения жизнедеятельности в старепдих клетках (ухуди ние репарации повреждений ДНК, накопление продуктов воздейстЕ свободных радикалов и т.п.). Таким образом, естественные еле; твия отсутствия самоподдерзсания синтеза регуляторных белков это стадиеспецифичность экспрессии генов и старение организь Только половое клетки "избец>вт" стареният в будущие, яйцеклет попадают мРНК для регуляторных балков, управляющих ооцит-ciwi фачными регулонами, с которых вновь синтезируются мРНК для { гуляторных белков, управляющих регулонами гаструлы.

В долгоживущих клетках мРНК для регуляторных белков дола быть очень стабильны, что могло бц осуществляться при поме "маскирующих" (защищающих от РНКаз) белков, подавляющих тра! ляцию этих мРНК. В модели предполагается, что продукты peryj нов дифференцированных клеток путем изменения концентрации вт ричных мессенджеров вызывают специфическую репрессию транслж мРНК для регуляторных белков, активирующих эти регулоны,, т

что эта мРНК (Д-мРНК) транслируются ляаь изредка. В противопо-лсвяость этому, в про лифе риру шцтх клетках мРНК (П-мРНК) для регуляторных белков, необходимых для пролиферации, долиш транслироваться благодаря факторам роста, в.;иящих на вторичные мессендаеры. В отсутствие факторов росто П-мРНК не транслирувт-ся и клетки находятся в состоянии покоя или дифференцировки. П-мРНК сштозируются на определенной стадии онтогенеза и постепенно разбавляются по мере клеточных делений, так что в конце концов на все клетки их не хватит. Клетки, которым не досталось П-мРНК, за счет продуктов П-мРШС и управляемого ша регулона совершат еще несколько делений, а затем терминально дифференцируются. Асимметрия клеточных делений к наличие в культуре клеток с большим и малым потенциалом делений - это экспериментальные факты. За счет многокаскадности регулонов, специфичных для какого-либо типа клеток, можно объяснить, почему кпэтки совершают в культуре пятьдесят и более удвоения популяция: число делений пропорционально числу каскадоп, если мРНК для регуляторных белков верхних каскадов стабилыш. Клетки разных типов могут иметь рапное члсло каскадов, а экспрессия регуляторных генов и стабильность их продуктов могут различаться. Это нота? объяснить различия в скорости старения разшх тканей и разных видов животных. За счет стохастической потери и распада П-мРНК число удвоений параллельно пассируеюи культур долено варьировать, причем промежуток мезду митозами долкэн возрастать по мере пассировшшя; именно это наблюдается в эксперименте.

Каждый каскад может содержать несколько регулонов, активируемых разными факторами роста (рис. 2). Это позволяет объяснить существование стеолоеых и коммитированных клеток. Стволовая клетка, согласно модели, содержит по крайней мере одну копию мРНК (С-мРНК) для регуляторного белка, активирующего верхний регулон ткани. Потомки стволовой клетки, которым нр

лась С-мРНК, получаот нокоторое количество К1-иРНК и К2-ыРИ Пра воздэйсташ одного фактора роста активируется К^регуло! прц воздействии другого фактора роста актируется К2~регуло! Но до тех пор, пока клетки содараат и К^иРШ, и К2-мРНК, оз вдгут транс-даффврзнцироБЕТЬся при воздействии иного, чек пе] воначальпо, фактора роста. Когда ке эти иРНК исчезнут, клеи УЕЭ но смогут изменить направление своего развития, т.е. 02 будут цомшиироьанными. Аналогичный механизм моаат лажать основа детерминации клеток в раннем развитии.

Отсутствие с амоподдергания синтеза рагуляторша белков нормальных клетках объясняет и явление шмортализации: если ге для П-ыРНК, К-мРНК влп С-ыРНК попадет под контроль чужого про мотора и будет транскрибироваться конститутивно, то клетки смо гу? дэлиться неограниченно. Это объясняет ряд свойств ядорш цротоонкогенов.

В основа оошюзматической сегрегации может лекать распре дедание в ооплазыэ "маскированных" мРНК для рагуляторных белко: и кядукторов. Если рэгулягорние мРНК (очевидно, это и есть детерминанты) распределена мозаично, то, незавяико от распрэде-лапая м?на для индукторов, по окончании -дробления., болшнаствс бластомеров будет содержать по одаоау виду рагуляторных {«РНК г т смоает изменить своз да4$ерэнцзфовку ^мозаичное' развитие). Если ке рзгуляторнш мРНК. перемешаны, а мРНК для квдукторо! распределена шзаично, то направление дифферакцировка бластома-ров определяется кндукторыи н изранится при их переноса в другой шсто зароддаа (регулятивное развитие). Позднее в онтогенеза переход от стадии к стадии происходит, когда достигается достаточная концентрация индукторов. Казалось бы, индукторы долкны достичь достаточной концентрации за время порядка периода их полураспада в мавклеточной среда (несколько часов или даке шнут); но стадии .амбряогеявза прадолааэтсл иногда месяцы.

опшсщую роль здесь начинав? играть пространственные взаш.юот-ошейпя клеток. Например, когда эмбрион еще не гадает сосудистой истемы, индукторы диффундирует за границы сокретирущой их ¡сани. По мере роста ткани ее объем (и скорость секреции) рзо-эт быстрее, чем поверхность (а скорость диффузии определяется о), так что концентрация индукторов как в секретирующей тканл, ак и в соседних тканях растет. Индуктора ногут действовать на эседние ткани (истинная индукция) либо на саму секретирущую <ань (самодифференцировка). Другой пример - если эмбриональные петки разных типов были перемешаны, то благодаря амебоидным зиткэниям и избирательному сродству клетки одного типа постепе-ю группируются и образуют обособленные ткани. Если тают а кле-си секретируют индукторы, то переход к следующей стадии проищет, когда они накопят критическую массу. Таким образом,, щукторы играют -интегрирующую роль, ткань созревает как целое.

Рост тканей и органов животных со временем обычно заме для-'ся, что обусловлено межклеточными взаимодействиями: концент-|ция ингибиторов делений возрастает, а концентрация факторов юга снижается. Согласно данной модели, в некоторых тканях гае замедление роста мокет иметь место в момент, когда все :етки содержат много П-мРНН. Большинство таких клеток ди®е-нцируется и через некоторое время погибнет; время их еизни дет таким же, как и у тер?ганально дифференцированных клеток, нако, если большая доля такой.ткани будет удалена, практичес-все клетки смогут вступить в деления, поскольку они содержат мРНК. При этом будут синтезированы новые Д-мРНК, так что ань омолодится, регенерация печени и почек происходит именно ким сбразом. В других тканях остановка роста может произойти, гда многие клетки уже не содержат Л-мРПК, так что регенерация дэт происходить за счет делений лишь небольшой части клеток, к известно, а то наиболее распространенный опоооб регенерата».

Саг.о замедление роста ткани ыолзг бить следствие:.', разбавления П-иРНК: терминально дифференцируясь, клетки секретируют ингибиторы делений незрелых клеток, способствуй экономному расходова-ш их запаса делений.

Однако не все свойства ядерных протоонкогенов согласуются о этой моделью. Они транскрибируются и в пролифэрируюада, и в покояцихся клетках (хотя в последних гораздо слабее), а во время дофферонцировки их транскрипция регулируется негативно. В покоящееся клетках их продукты (и ыРНК, и белки) экстремально нестабильны (период полураспада 10-30 мин), а после индукщш факторами роста втп мРКК стабилизируются на некоторое вреия. Поэтому, хотя отсутствие сакоподдвраания синтеза рагуляторних белков вполне макаг быть причиной старения некоторых евдов аа-вотных или некоторых тканей ылекопитанща, автор данной диссертации стал искать иные варианты регуляции экспрессии генов, способные объяснить старение н ишортализацию клеток.

Глава 7. Триггерпля иода ль.

Ешюгся данные о том. что ядерные црйтоонкогены шгибнруют

ши активируют свою собственную транскрипции и транскрипщш

о

других ядерных протооакогеков. Спстэмн с обратной связями часто обладают двуш пли Оолао устоачивао стацкопаршки состошш-яга, т.е. являются триггерами. В качестве произра такого триггера расслютриа систему, в которой продукт протсоккогеиа А кооперативно активирует транскрипции самого гена А, а такав влияет на транскрипцию генов, участвующих в регуляции клеточного цикла. Изменение концентрации мРНКд в единицу времена будет

<За/сК ---^-г- - а п а V, - и_ ,

1 + К/сР 1 2

где £m - иакскмальная скорость синтеза кШ^; о - концентрация Салка Л; h - постоянная Холла; X - кажущаяся коксганта диссоциации h молекул А п сайтов кг связывания перед геном А; а - вероятность распада мРННд в оданицу времени. Очевидно, скорость синтеза Солка А пропорциональна п, а скорость распада пропорциональна а:

da/dt » и - и а ,

где £а - константа скорости трансляции mPHKa¡ u - константа распада белка А. Для наглядности будем.говорить только об изменениях концентрации мРНКА, поскольку учет такке изменений концентрации белка А не дает новой информации о поведении системы. Буден полагать, что концентрация белка А пропорциональна концентрации ыРНК (это выполняется, когда а << ш, например, когда ыНЗКд стабилизируются после добавления факторов роста):

ш

Тогда можно записать

da/dt =-т- - ал,

I + K'/nt1

где &' = Lg. .

ta

а

При малом значении т (а, как следствие, малом значении а) скорость синтеза мРНКА и, очень мала, тогда как скорость распада и, по сравнению с ней велика, поэтому т стремится к нулю (рас. 3). При некотором значении т (й) скорости синтеза и распада ыРНКА выравниваются; при более высоких концентрациях мРНКд их синтез начинает превышать распад. Тогда m будет возрастать, пока и и2 опять не сравняются. Это устойчивое стационарное состояние - т. Таким образом, система имеет одно неустойчивое стационарное состояние m и два устойчивых - 0 и т.

- 12 -

Ii МРНК, и белки ядершх протооикогенов крайне нестабильны в покоящихся клетках, а после добввления факторов росте стабильность мРНК сначала возрастает, а потом снижается. Это означает, что разным концентрациям факторов роста соответствуют разные вероятности распада мРНКА а, чему соответствуют разные углы наклона прямых 20, 21, 2г И'23. При малой концентрации факторов роста мРНКд нестабильны (а равна а1) и стационарная концентрация мРНК. ш. мала. Согласно данной модели, для запуска клеточ-

SL 1

ного цикла необходима пороговая концентрация мРНКд я^р. которая больше й,, так что клетки будут находиться в состоянии покоя или дафференцировки. Возможно даже,что при полном отсутствии факторов роста а настолько велика, что скорость синтеза мРНКА меньше скорости их распада при любых концентрациях мРНКд, так что система имеет единственное устойчивое стационарное состояние т = О. Это можно сопоставить с гибелью клеток в отсутствие факторов роста (для выживания покоящихся клеток добавляют обычно 0.5 % сыворстки).

Рассмотрим события, которые происходят при добавлении факторов роста к покоящимся клеткам (рис. 4). Сначала мРНК стабилизируются (а уменьшается до значения ctg), так что скорость синтеза мРНКд становится больше скорости их распада и т стремится к т3. Когда т превысит я^р. запускается прохождение клеточного цикла. Через некоторое время после добавления факторов роста стабильность мРНКА опять уменьшается (а возрастает до значения аг < ), dm/dt оказывается меньше нуля и т стремится к т2. В митозе хромосомы конденсированы и транскрипция не происходит, поэтому т уменьшается. Если к момепту возобновления транскрипции m будет больше йг, то dm/üt здесь больше нуля, так что т возрастает и цикл повторяется. Если же по окончании митоза т окажется меньше тг, то dm/üt будет уже меньше нуля и п уменьшится до нуля. Из этого состояния система уже на сможет

выйти при добавлении факторов роста, т.е. при изменениях а. Зто мояно интерпретировать как терминальную даффзрепцировку платка. Следует отметить, что скорость транскрипции ядерных протоспко-генов очень мала, пролифэрирущие клетки содоркат в лучшем случае по несколько десятков их мРНК. А поскольку распад мРНКА происходит случайным образом, есть некоторая вероятность, что по окончании митоза их концентрация станет меньше й2. К тому же при цитокинезе одной из дочерних клеток мокет достаться меньшее число мРНКд, чем другой. Таким образом, по окончании кавдого деления происходит выбор, останется ли клетка в цикле или терминально дифференцируется. Вероятностный характер такой терминальной дифференцировки приведет к вариабельности числа удвоений параллельных культур и числа делений потомков одной клетки.

Возможно, это ленит и в основе старения организма. Из рис. 3 видно, что чем меньше концентрация факторов роста, тем меньше я и тем больше й. В покоящихся клетках й1 находится в опасной близости к йц. Стохастические изменения числа мРНКА могут привести к спонтанной потере способности делиться у покоящихся или дафференцироз аккых клеток. Так что со временем в организме бу-дег- уменьшаться число дифференцированных клеток, способных делиться. Это объясняет и обратную корреляцию мезду возрастом донора и числом удвоений популяции в культуре. А прямую корреляции мезду максимальной продолжительностью шзш! вида и потенциалом удвоений клеток, так ке как и различия в числе делений тслэток разных тшов в культуре, можно объяснить за счет различий в вероятности терминальной дифференцировки клеток. Регенерация здесь описывается аналогично первой модели: в клетках печени и почек все клетки содерват мРНКд, поэтому все они могут приступить к делениям при резекции значительной доли органа, а у большинства других тканей.только часть клеток содорлшт мРНКА, за счет них и происходит регенерация.

- 14 -

Отсюда следует и объяснение шмортализациа. С одной стороны, если мРНКА потеряет дестабилизирующий участок, то в митоза мРНКд будут распадаться медленнее (а уменьшится), так что вероятность терминальной дифференцировки клеток будет гораздо меньше. С другой стороны, если ген А попадет под контроль чуаого промотора, то синтез мРНК^ будет происходить с постоянной скорость» С:

Ою/Ш = С - а и .

Система имеет единственное устойчивое стационарное состояние т - С/а. Такие клетки терминально дифференцироваться не смогут. При малой концентрации факторов роста они находятся в состоянии покоя, а при ео увеличении приступят к делениям.

Далее в диссертации рассматривается более полная модель, основанная на следующих данных. Добавление цпклогексимида приводит к увеличению стабильности ыИЖ ядерных протоошкзгенов, поэтому полагают, что их распад происходит благодаря какому-то лабильному белку (вероятно, эндонуклеазэ). Обозначим его белок В. Факторы роста вызывают стабилизацию мРНК ядерных протоошсо-генов, т.е. они либо подавляют синтез белка В, либо вызывают его инактивации. Поскольку циклогексимид и факторы роста при

I

совместном добавлении вызывают большую стабилизацию мРНК ядерных протоонкогенов, чем по отдельности ("супериндукцпя"), то они, вероятно, действуют по-разному. Так как циклогексимид заведомо подавляет синтез белка В, то факторы роста могли бы вызывать его инактивацию (например, путем фосфорилирования). Пос-л> добавления факторов роста мРНК ядерных протоонкогенов стабилизируются лишь на некоторое время, а затем их стабильность опять уменьшается. Это говорит о наличии обратной связи в системе. Предположим, что белок А активирует транскрипция гена В. После упрощений, в безразмерном Еиде модель мокно записать как

1 + 141П

е ар/ах = ц - % р ,

где (1 и р - с5езразмерше концентрации мРНКд и белка В; х безразмерное время; е - малый параметр; % ~ безразмерная концентрация комплексов фактор роста - рецептор; О - константа.

Эта модель приводит к тем ке выводам, что и упрощенная модель с одним геном А. Стоит отметить лишь, что иммортализецию могут вызывать и мутации гена В, приводящие к инактивации белка В или снижению его вкспрессии, при неизмененном гено А. Действительно, в некоторых опухолях не найдено изменений в структуро н экспрессии ядерщис протооккогенов. Модель предсказывает, что некоторые иммортализирупцие гены кодируют белки, влияющие не стабильность мРНК. Стоит отметить, что белки у-шус и с-тус распределены в ядрах там ке, где малые ядерные рибонуялеопротеиио-вые частицы; гены пг1 и шг?., конститутивно экспрессируемые в шус-иммортализованних фибробластах грызунов и индуцируемые сывороткой, посттрянскрипционно регулируются болком туе.

Данные о негативном влиянии ядерных протоонкогенов на сбою транскрипцию, казало-ь оы, на совпадают с этой моделью. Но белок В негативно влияет на свой синтез - путем распада мРНК для оелка А, активирующего синтез белка В. Так что данные ой отрицательных обратных связях вполне согласуются с этой моделью.

Какая из рассмотренных моделей блике к истине, пока сказать трудно. На это может дать ответ лишь эксперимент. Из обеих моделей следует важный выеод, что если ввести мРНК ядерных пр.- -тоонкогенов (например, при помощи липосом) в клетки тех тканей, где они экспрессируются в норме, то это приведет к увеличению числа клеток, способных делиться, а следовательно, к омоложению этих тканей. В культуре введение таких мРНК в клетки должно приводить к уве.чнчекж числа удвоений популяции.

выводы

1) Построена модель онтогенеза высших животных, основанная на предположении, что у них нет самоподдержания синтеза большинства ткатспецифических регуляторных белков. Число таких белков постепенно уменьшается, каскад за каскадом, что приводит к стадиеспецифгмеской экспрессии генов, а во взрослом организме к деградации и гибели клеток. Второе предположение - в долгожи-вущих клетках мРНК для регуляторных белков очень стабильны благодаря "маскирующим" белкам, репрессирующий их трансляцию. Модель объясняет имморгализацию клеток при попадании ядерного протоонногена под контроль чукого промотора. Следствиями модели являются наличие в культуре субпопуляций клеток с большим и с малым пролиферативным потенциалом, вариабельность числа, удвоений популяции. Модель объясняет такие проблемы эмбрионального развития, как компетенция, детерминация, мозаичное и регулятивное развитие, а также почему в печени и почках могут делиться все клетки, а в большинстве тканей - только часть клеток.

2) Построена триггерная модель регуляции экспрессии ядерного прогоонкогена. Рассмотрена система, в которой продукт про-тоонкогена кооперативно активирует свой синтез, а также синтез белка, расщепляющего мРНК протоонкогена; факторы роста вызывают инактивацию этого белка. Если система находится в области, окружающей одно из устойчивых стационарных состояний, то клетка гугособна делиться; но за счет подавления транскрипции в митозе система с некоторой вероятностью может перейти в область, окружающей другое устойчивое стационарное состояние, откуда ухе не сможет выйти при добавлении факторов роста, т.е. клетка терминально дифференцируется. Если ядерный протоонкоген попадет под контроль чукого промотора, то система будет иметь единственное

устойчивое стационарное состояние и клетки нэ смогут терминально дифференцироваться. К иммортализации приведут и мутации генов, чьи продукты специфически расщепляют мРНК протоонкогена, а также потеря этой мРНК дестабилизирующих участков.

3) Обе модели предсказывают, что при искусственном введении мРНК ядерных протоонкогенов в клетки увеличится потенциал клеточных, делений и произойдет омоложение тканей.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иерархия регулонов: связь с делением й дифференцировкой клеток. Успехи современной биологии, 1988, т. 105, N 3, с. 406-422.

2. Факторы роста, вторичные мессендаеры к онкогены. Успехи современной биологии, 1991, т. III, N I, с. 19-33.

3.■Онтогенез кивотных с позиции отсутствия самоподдержания синтеза регуляторшх белков. Генетика, 1891, т. 27, N 10, с. 1733-1743.

4. Триггерный подход к пролиферации, старению и иммортализации клеток животных. Генетика, 19ЭГ, г. 27, N 10, с. 1744-1753.

5. Гипотеза об вкстрахромосошшх регуляторных генах. Успехи совре ыэнной биологии, 1991, т. III, N5, с. 643-653.

6. Возможные механизмы действия факторов роста и старение клеток. Генетика, 1991, т. 27, N II, с. 1941-1949.

Рис. 1..Упрощенная схема иерархии регулонов. Прямоугольники - регулоны; жирные линии - продукта регуля-торных генов; штриховые линии - индукторы.

?во. 2. Пракар рагуляцан экспрессии регулонов в одной ткани.

dm> dt ч V ✓ '__ ^ -*

/ 1 / t ti / *Ь !<к 7" У" / \

0 S, в, вх

Рис. 3. Зависимость dm/dt от то при разшх концентрациях факторов роста. Скорости синтеза мРША v1 соответствует кривая 1, скорости распада мРНКА ug соответствуют прямые ?.Q (в отсутствие факторов роста, а = aQ), 2, <а = а,), 2г (а = аг) и 23 (а *= а3). Кривые I, II и III соответствуют разности и1 - vg при а = а,, ctg и (Xj, соответственно.

j

Рас. 4. Пзнакашм концентрации иРНКА после добавления фок >роа роста к покоетзшся клаткаи. В момент г0 добавлены факторы юта, в момент начинается митоз, в момент Г2 он заканчлва ■ся. Штриховая линия соответствует критическому значению т при |зшх а. Если но окончании митоза т выше штриховой линии, г- ■< врастает (кривая 1). Если я ниже штриховой линии, то т ум>ю |втся до нуля (кривая 2).

УЧАСТОК МНОЖНТЕЛЬМОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР ПОДП. К ПЫАТИ - ЗАКАЗ^^ ТИРАН3X3.