Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение линий спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы и исследование их фенотипических и генотипических особенностей

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение линий спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы и исследование их фенотипических и генотипических особенностей"

■11

" -

ИНСТИТУТ цитологии АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи УДК 576.35:578.085.23

АРЦЫБАШЕВА Ирина Вадимовна

ПОЛУЧЕНИЕ ЛИНИЙ СПОНТАННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ

КЛЕТОК КРЫСЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И ГЕНОТИПИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ

03.00.25—КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1989

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов диффе-ренцировки и малигнизации клеток Института цитологии АН СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук Т. Н. ИГНАТОВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук В. С. БАРАНОВ кандидат биологических наук Р. С. БАРКАН

Ведущее учреждение — НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова МЗ СССР.

на заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Защита состоится

1990 г. в « УЗ

» часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. Н. ПИСАРЕВА

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, РАБОТЫ

• -.} Актуальность проблемы.Анализ новообразований человека и опухолей лабораторных сявотных, ивдуцированных вирусами, а такзе классические исследования химического канцерогенеза, проведенного на «латках грызунов в культуре, убедительно показали, что неопластическая трансформация клеток является многостадийным процессом (Klein, Klein , 1985; Nicolson, 1987), в котором мояио выделять по крайней мере два этапа: I) иммортализация (супрессия клеточного старения); 2) приобретение клетками онкогенннх свойств. Показано, что иммортализация в своп очередь так-ае может включать несколько этапов (Matsumura et al., 1985; Fitzgerald et al., 1986). Анализ молекулярно-гене-тических механизмов, обеспечивающих нормальным диплоидным клеткам способность к неограниченному размнояению, представляет собой одну из центральных проблем в исследованиях канцерогенеза.

Хорошо известно, что процесс длительного культнвиро-зшшя in vitro нормальных диплоидных клеток млекопитающих а человека может привести к установлению постоянных линий спонтанно трансформированных клеток (Mukkerij et al», 1984; McCormic, Mäher, 1986; Tavaasoli, Shall, 1988). Однако, несмотря на vo, что этот факт известен давно (Sanford et al., 1950; Puck et al., 1958), наши знания о процессе становления линий и его отдельных стадиях, а такае о молекулярно-генетических механизмах спонтанной трансформации клеток в культуре недостаточны.

Изучение механизмов спонтанной иммортализации и он-когенной трансформации клеток в культуре необходимо не только для понимания процессов старения и неконтролируемого роста как таковых. В опытах с применением чужеродных трансформирующих генов со всей очевидностью встают вопросы о роли клеток-реципиентов и о влиянии окружающих нормальных клеток на реализацию потенций к неограничен-

нов пролиферации у трансформантных клеток. Условия, позволяющие клоногенным клеткам реализовать свои способности к неограниченному размножению, в настоящее время практически не исследованы.

Одним И8 перспективных подходов к решению поставленных вопросов является изучение факторов, обусловливающих фенотЕгшческие и генотилические различия и сходства клеток на достаточно большом наборе разнообразных клонированных линий как в момент становления самих линий, так и в процессе их культивирования.

Пели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов спонтанной трансформации клеток в культуре и определение специфических хромосомных изменений, коррелирующих с неконтролируемым ростом клеток. Конкретные задачи работы состояли в том, чтобы (I) разработать эффективный и воспроизводимый способ селекции постоянных линий спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы; (2) получить коллекцию новых постоянных линий эмбриональных клеток едысы, происходящих из одного клона или смеси нескольких клонов; (3) сравнить особенности размножения и онкогенности клеток подученных линий в момент их становления и в процессе длительного культивирования; (4) провести анализ хромосомных изменений клеток полученных линий и идентифицировать перестроенные и маркерные хромосомы, окрашенные на в-диски; (5) методом многошаговой селекции получить вариант линии эмбриональных клеток 1фысы, способных к неограниченному размножению в отсутствие сыворотки крови в «ультуральной среде; провести фенотипическую и кариотилическую характеристику полученного "бессывороточного" варианта.

Научная новизна работы. В настоящей работе разработан новый способ получения клонированных линий спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы, условно названный 2Т7. Он имеет существенные преимущества перед известными системами селекции постоянных линий трансфор-

мированных фябробластов грызунов ЗТЗ, ЗТ6 и т.п. (Todaro, Groen, 1968; Aaronson, Todaro, 1969; Kuroki et al», 1975) с помощью которых получают линии поликлонального происхождения и характеризующиеся высокой кариотипической изменчивостью. Способ 2Т7 дает возможность получать линии из первичных клонов, возникших из одиночных клоногенных клеток, т.е. исходно генетически однородные линии, или из смеси нескольких клонов. Применение данного способа позволило получить в одной и той se селективной системе 7 новых спонтанно трансформированнтгг линий LRec из клеток эмбрионов беспородных крыс и крыс породы Взстар с разной степенью экспрессии трансформированного фенотипа. Обнаружено, что в клетках полученных линий стабильно восцроиз-водятся идентичные хромосомные изменения, выражающиеся в увеличении числа копий хромосомы 7 и в образовании маркеров с ее участием. Полученные результаты позволили выделить по крайней мере две стадии, на которых могут находиться клетки в момент становления спонтанно трансформированных линий: дренеопластическут) и онкогенную. Пэлучена новая линия эмбриональных клеток крысы, способная неогра-ничегго долго размножаться в среде без сыворотки; среда, кондиционированная клетками "бессывороточной" линии, обладает рос тс табулирующей активностью.

Научно-практическое значение работы. Полученные в настоящей работе эуплоидные линии с минимальными хромосомными перестройками Moiyт быть использованы для изучения генетических механизмов иммортализации и онкогенной трансформации клеток in vitro. Обнаружение в клетках полученных линий маркерных хромосом, образованных при участии хромосомы 7, в которой как известно, локализуются онкогены с-туе И c-sia (sümegi et al., 1983; Pang et al., 1985) открывает перспективы для молекулярно-генетического анализа роли неслучайных изменений хромосомы 7 и ее локусов в процессе размножения клеток в культуре в целях исследо-

вання молекулярных механизмов иымортализации и оыкогенеза. Изучение клеточных факторов, предотвращающих старение клеток, а таете факторов, обеспечивающих стабилизацию и спонтанную прогрессию черт трансформированного фенотипа в ходе культивирования клеток, несомненно будет способствовать обнаружению новых генов, контролирующих размножение клеток, с онкогенной и антионкогенной активностью. Подученные данные о наличии ростовой активности в средах, кондиционированных клетками "бессыЕороточной" линии, могут представлять интерес для биотехнологических исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции ло генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 1986), I Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), Мэздународном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (Таллин, 1988), IV Международном конгрессе по клеточной биологии (Монреаль, 1988), Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы концерогенева и антиконцерогенеза (Ленинград, 1988), ХХП Ваегодном симпозиуме по цитогенетике (Братислава, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем работы. Диссертация изложена на ¿5 & страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 9 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культуры нормальных эмбриональных клеток крысы, а также спонтанно трансформированные клетки подученных автором линий LRec-1-LRec-7 (Leningrad Rat егаЪгуо cells) и "бессывороточной" линии LRec-1sf (serum free).

Культуры нормальных эмбриональных клеток получали многощ)атной обработкой тушек 13-15-суточннх эмбрионов (без головы и конечностей) смесью коммерческих растворов 0.25/S-Horo трипсина и O.OS^-ного Версена (1:1). Полученную суммарную клеточную суспензию центрифугировали при 2000 &/ мин в течение 15-%) мин при 4°С. Осадок ресус-пензировали в среде ДМЕЛ, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), затем клетки высевала в стеклянные чашки Петра диаметром 50 или ЮО мм в количестве 2-3'10® или 5-7*10® на I чашку соответственно. Чашки помещали в С02-индубатор (37°С, 6% С02. 100#-ная влажность).

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с ЭБС во флаконах Карреля с плошгдью 20-25 см^ в условиях повышенной плотности популяции. Для культивирования "кризисных" культур использовали два режима. При режиме I среду меняли регулярно на протяжении всего периода культивирования "кризисных" культур (перше 4 нед - 2 раза в неделю, затем - I раз в неделю), при режиме 2 производили однократную смену среды через 2-8 нед после начала "кризиса". В процессе получения линии LRec-I в среду добавляли мер-каптоэтанол, заменимые аминокислоты и пируват.

Линию LRec-iaf . способную размножаться в среде без сыворотки. получали на основе линии LRec-1 15-го пассажа путем достеленного 3-ступенчатого снижения ЭБС в среде с Ю до 0% (Тарунина, Игнатова, 1988). Для пассирования "бессывороточной" линии клетки снимали со стекла механи-

ческим способом.

Скорость размножения и величину насыщающей плотности кульур определяли по кривым роста. Клетки высевали в чашки Петри диаметром 35 мм в среду ДМЕМ с ЭБС. Изходное количество клеток на I чашку определяли индивидуально для кавдой линии. Среду меняли каждые 3-4 сут. Через кавдые сутки подсчитывали число клеток в культуре. За величину насыщающей плотности популяции принимали максимальное число клеток на единицу площади сосуда. Время удвоения популяции вычисляли по формуле t=T ig2/lg(Wdo), где No -число клеток в культуре в начале логарифмической фазы роста; N - число клеток в конце культивирования; Т - длительность культивирования клеток (Schaeffer, 1978).

Зависимость размножения клеток от концентрации сыворотки в среде определяли по числу колоний, образовавшихся через 15-20 сут после посева 100-500 клеток в среду ДМЕМ, содержащую ЭБС и 500~22-3 клеток в среду ДМЕМ с 1-2.5 и 0.5$ ЭБС.

Зависимость размножения клеток от субстрата определяли по эффективности клонирования в "мягком" агаре (Мас-pherson, 1982). Количество колоний, образовавшихся после посева Ш3, 10^, Ю^ клеток в чащки Петри диаметром 50 мм подсчитывали через 15-20 сут.

Онкогенность клеток оценивали по их способности образовывать опухоли у l-2-суточных крысят и 1фыс в возрасте 6 мес, которым подкожно вводили I или 3 млн и 5 млн клеток соответственно. За животными наблюдали в течение I года. Для пассирования опухолей в животных использовали дезагрегированные с помощью трипсина опухоли или их небольшие фрагменты.

Гистологический анализ опухолевого материала проводили, используя срезы опухолей, фиксированных в 10^-ном формалине, толщиной 5-6 мкм, окрашенные гематоксилином-оозином.

Препараты метафазных хромосом приготавливали обще-

принятым методом (Hencen, 1976) с некоторыми модификациями. Для накопления митотических клеток в среду добавляли раствор колхицина в конечной концентрации 0,06 мкг/ мл и инкубировали в течение 2-3 ч при 37°С. Шсле этого клетки подвергали гипотонической обработке 0,55$-ним раствором КС] при 20°С в течение 30-40 мин, фиксировали свежеприготовленным фиксатором (смесь метанола с уксусной кислотой в соотношении 3:1) и наносили по каплям на высушенные над терморегулируемой водяной баней предметные стекла.

Идентификация индивидуальных хромосом и выявление характерных для линий маркеров проводили с помощью окрашивания хромосомных препаратов на G -диски модифицированным методом Сибрайт (Seabright, 1971) в соответствии с номенклатурой G-Окрашенных хромосом Rattиз Norvegicua (Committee, 1973).

Наличие ростстимулирующей активности в средах, кондиционированных клетками (КС) "бессывороточной" линии LRec-isf определяли 2 способами: по влиянию КЗ на размножение массовых кульур гибридом и на интенсивность вклю-чения3Н-тимвдина в ДНК клеток стационарных культур мышиной эмбриональной линии NIH3T3 .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЦЕНИЕ

Получение постоянных линий эмбриональных клеток крысы. Линии спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы LRec получены с помощью комплекса экспериментальных приемов, условно названного нами по аналогии с системами селекции ЗТЗ, ЗТ6 и т.д. способом 2Т7: через каждые 2 сут пересевали (transfer) по 700 тыс клеток на I флакон с площадью20-25 см^. Получение линий включает несколько этапов: эксплантация клеток крысиных эмбрионов в культуру, серийное пассирование нормальных эмбриональных клеток до наступления "кризиса", или старения культуры, поддержание в стадии "кризиса" культур, в которых предполагается формирование колоний активно делящихся клеток.

В процессе культивирования нормальных клеток соблюдается условие повышенной плотности популяции, как начальной (700 тыс клеток на флакон), так и конечной (1.4 млн клеток на флакон). Как видно из результатов, представленных в табл.1, в "кризисных" культурах клеток, прошедших до "щшзиса" от 3 до 8 пассажей, через 1-3 мес после наступления "кризиса" образовывались колонии делящихся клеток с частотой в среднем около 6*10~® (1.4-11*10®).

Таблица I

Частота колоний в "кризисных" культурах эмбриональных клеток крысы в зависимости от условий культивирования

Возраст (сут) и порода эмбрионов

Число пассажей к моменту наступления "крз-зиса" культуры_

Режим «Уль-®^ Д'Тйавшше

тивирова- "" 9 тп5 полученной ния кри— постоянной

яипинт* ЗЕЙЗ8*«н»

КУЛЬТУРЫ

зисных культур

13 б/п

14 б/п

14 б/п

15 б/п 15 б/п 15 б/п

15, Вистар

3

5

6 8

5

6 5

I П

п п

I

п п

2

1

2

7-8 4

5-6

7-8

Ы1ес-1 Ьйес-2 ЬЯес-З Ьйес-4 ЬИес-5 ЬИес-б 1Жес-7

б/п - беспородный.

Таким образом, в 6 независимых опытах из индивидуальных клонов или смесей клонов были получены 7 новых спонтанно иммортализованных линий (I лини я - из клеток эмбрионов крыс породы Вистар). Линия ьиес-2 и, вероятно, линия ьиес з имеют моноклональное происхождение, остальные -поликлональное. Линии Ы1ес-2 и Ьйес-з подучены из клеток эмбрионов одной крысы, остальные линии - из клеток эмбрионов разных крыс. Культуры всех линий ьиес характеризуются

\

фябробластоподобным типом роста.

В целом мы полагаем, что предложенный способ селекции способствует ускоренному истощению пролиферативного пула популяции диплоидных клеток и наступлению "кризиса" в результате постепенной гибели подавляющего большинства нормальных клеток. Ля бель последних, вероятно, создает условия для размножения клоногенных клеток с повышенным пролиферативным потенциалом, который и обеспечивает им способность преодолеть состояние старения, низкая частота клопогонных вариантов и стабильная способность линий к самоподдержанию позволяют считать, что полученные линии возникли в результате мутаций.

Особенности размножения клеток линий тдеп. Особенности размножения клеток полученных линий исследовали на первых этапах после становления линий и в ходе дальнейшего культивирования, определяли скорость роста клеточных популяций и эффективность клонирования клеток на твердом субстрате в среде с разными концентрациями сыворотки и в "мягком" агаре.

Все линии, включая ьиес-1з£, характеризуются повышенной насыщающей плотностью клеток и, за исключением линии ьиес-з и ьиес-4, более коротким временем удвоения популяции по сравнению с соответствующими значениями для культур нормальных эмбриональных клеток крысы 3-4 пассажа (табл.2)..

Величина насыщающей плотности культур всех линий на начальных этапах после их становления составляла 9*104 клеток на I см^. Увеличение продолжительности культивирования приводило к достоверному (р<0.05) возрастанию величины насыщающей плотности и уменьшению ' времени удвоения популяции.

Полученные результаты позволяют считать, что изучаемые клетки сравнимы по фенотипу с клетками трансформированных линий. В то же время они свидетельствуют

Таблица 2

Ростовые характеристики нормальных эмбриональных клеток крысы и клеток постоянных линий

Культура или линия Число пассажей с момента получения культуры или линии Время удвоения популяции (ч) Насыщающая плотность культуры (число клеток на I см^«104)

Культура нормальных эмбриональных клеток 1-2 3-4 41 58 7.0J0.4 7.0jf).2

ЬИес-1 10-15 50 20.Q±I.0

30-35 32 40.0±2.0

60-65 32 41.0±2.0

Ы1ес-2 40-45 43 2I.0JD.6

ЬИес-З 40-45 74 26.0±1.0

1Иес-4 4-8 65 I0.0i0.5

ЪНес-5 20-25 45 2O.OJ0.8

Ы1ес-7 10-15 25 20.Oil. 0

И1ес-1е£ 40-45 144 I4.0J0.5

40-60 48 40.0,±2.0

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки ъйес-1з£ в первой серии опытов (40-45 пассажи) культивировали в среде с 5$ ЭБС, во второй серии опытов (40-60 пассажи) - в среде без ЭБС.

о неодинаковом усилении черт трансформированного фенотипа относительно таковых для культур нормальных эмбриональных клеток. Это подтверждают и представленные в работе данные по эффективности клонирования клеток линий Шее на твердом субстрате в средах с разными концентра-

циями ЭБС (табл.3).

Таблица 3

Эффективность клонирования клеток линий Ъйес

Число Эффективность клонирования клеток пассажей с при разном содержании сыворотки момента крови в среде (%)

становления---

линии 0.5 1-2.5 Ю

ЬИес-1 5-20 50.0±2.7 50.0±2.3 60.0±3.0

30-35 0 0 4.010.2

40-45 0 1.010.1 4.510.4

60-65 0 2.010.1 20.010.6

70-90 0 2.010.2 20.010.5

Мес-2 30-40 0 0 0

45-50 0 0 3.010.9

ЬИес-З 30-40 0 0 8.010.4

45-50 0 0 8.010.3

Ьйес-4 4-6 0 0 7.010.6

10-15 0 0 0

1Дес-5 5-15 0 0 0

20-25 0 0.40,10.03 4.010.3

ЬИес-7 4-6 0 0 20.0±0.6

15-20 0 0 0

Клетки линии Ьйес-1 на начальных стадиях культивирования (до 20 пассажа) отличались от клеток всех остальных линий способностью образовывать клоны при редком посеве с большей эффективностью независимо от содержания ЭБС в среде. Однако, уже через несколько пассажей эффективность клонирования клеток линии Ьйес-1 значительно снизилась как в среде с низкими концентрациями ЭБС, так и в среде с

10$ ЭБС. Вероятно, состояние, в котором линия имела высокую выживаемость и клоногенность в неблагоприятных условиях, было временным или переходным, и клетки с подобными свойствами исчезли из популяции в процессе дальнейшего культивирования. По-видимому, нельзя отрицать и того, что первоначальные условия селекции линии ыгес-1 при режиме культивирования I способствовали выживанию именно таких клеток. Остальные линии незначительно различались между собой по количеству клеток, способных образовывать клоны в среде с 10$ ЭБС. Особенность всех линий состояла в том, что количество клоногенных клеток в них варьировало в процессе культивирования.

Клонирование клеток в "мягком" агаре показало, что линии Шес-1-Ы1ес-6 не способны размножаться без твердого субстрата. В ходе культивирования эта характеристика клеток указанных линий не изменялась. Клетки линий Ы1ес-7 и Ы1ес-1з£ при посеве Ю^ на I чашку формировали клоны в агаре с эффективностью 6 и 14$ соответственно. Однако, число клеток в клонах не превышало величины 1215 и дальнейшего увеличения числа клеток не происходило. Возможно, имела место супрессия клонообразования в "мягком" агаре со стороны вцделяемых клетками гуморальных аутокринных факторов, подобных трансформирующим факторам роста типа ^ (Апгапо е1;'а1., 1986). В настоящее время получены предварительные данные о секреции клетками линии Ьйес-1вг упомянутого фактора (Костроминова и др., 1989).

Онкогенность клеток линий 1дес . По способности образовывать опухоли у сингенных животных полученные лиши условно можно разделить на 2 группы. К группе высокоон-когенных линий относятся линии ьиес-7 и ьнео-1а£, клетки которых уже на первых этапах культивирования образуют опухоли при прививке животным. Вторая группа включает линии ънес-1-ъиес-4 , У которых способность к образованию опухолей появилась лишь через 3-7 мес пассирования

в культуре после становления линий. Клетки линий LRec-5 на 20-25 пассажах и LRec-б на 4-8 пассажах не обладали онкогенными свойствами. Во всех опытах с положительным результатом опухоли появлялись одновременно у 100$ животных. При проверке онкогенности клеток на взрослых крысах, проведенной для линий LRec-1-LRec-3 и LRec-lsf после длительного ведения в культуре, появление опухолей обнаружили примерно у 50^ животных. Все опухоли хорошо трансплантировались как в l-10-суточных, так и в 6-месячных животных сингенного происхождения.

Гистологический анализ опухолей, образовавшихся в результате имплантации крысятам клеток линий LRec-1 и iRec-igf , показал, что они представляют собой полимор-фноклеточные саркомы.

Тагам образом, для большинства полученных линий характерно то, что первоначально ни в одной из них не обнаруживались клетки, способные к размножению при подкожной инъекции животным. Принципиальное отличие линий LRec-7 и LRec-1sf заключается в том, что уже на первых этапах культивирования в популяциях этих линий число онкогенных клеток было достаточно высоким. Как указывалось, линия LRec-7 получена из клеток эмбрионов крыс породы Вистар. Вполне возможно, что в процессе им-бридинга животных этой породы могла произойти гомозиго-тизация по генам, участвующим в контроле размножения или в контроле стабильности хромосом. (Этот результат требует дополнительного исследования, т.к. он может означать различную предрасположенность к спонтанной трансформации in vitro клеток эмбрионов не только крыс разных пород, но и животных других видов).

Сравнение популяций исследуемых линий по количеству клеток, способных образовывать опухоли и клоны в "мягком" агаре при культивировании по способу 2Т7 выявило направление прогрессии признаков трансформирован-

ного фенотипа в сторону увеличения онкогенности, но не приобретения независимости размножения от субстрата. По-видимомУ, эти два признака в клетках линий LRec не коррелируют, хотя большинство литературных данных, касающихся трансформированных клеток грызунов и человека, свидетельствуют об обратном (Freeman, Shin, 1974; Barret, 1980; Mukherij et al., 1984). Реже наблюдается способность клеток клонироваться в агаре в отсутствии онкогенности (Brett et al., 1986; Poirier, 1988).

Ростстимулирующая активность среды, кондиционированной клетками линии LRec-isf. Давно известно, что нормальные и трансформированные клетки могут выделять в среду факторы, стимулирующие пролиферацию других клеток (Васильев и др., 1969; Stocker et al., 1971; Ozanne et al., 1980).

О наличии в среде, кондиционированной клетками линии LRec-isf^ активности, стимулирующей размножение клеток гибридом, сввдетельствует достоверное (р<0.05) увеличение плотности гибрицомных культур при использовании сочетаний слоя перитониальных макрофагов и 50$ КС в отсутствие сыворотки крови и 5% сыворотки и 2Ъ% КС по сравнению с соответствующими контролями (за контроль принимали плотности культур клеток гибридом на 4-5 сут культивирования после посева без добавления КС). При добавлении в стационарные культуры NIH3T3 10 или 25$ КС в отсутствии сыворотки крови и 10$ КС в сочетании с О.Й сыворотки наблюдали достоверное (р < 0.05) усиление интенсивности включения % тимидина в ДНК клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что среды, кондиционированные клетками LRec-isf, содержат ростстиму-лирующие факторы.

Особенности кариотипа клеток линий t,rPq . Цитогене-тическое исследование линий LRec проводили на ранних этапах после их становления (табл.4). Главная отличите-

Таблица 4

Анализ кариотипа клеток линий ьнес на первых этапах культивирования

Число Число копий хромосомы 7 хромосом

линия Пас- модаль- непе- MI М2 MBI МВ2 "linjan саз ного реет--

класса роен- t(7; 19) del 7 t(7; 12) t(7:l4) ная

Ьйес-1 8 42 2 I 0 0 0

Ьйес-2 14 42 I I(70£S) 2(30$) I 0 0

ЬИес-З 15 42 I I I 0 0

Ьйес-4 8 75 2 I 2 0 0

Ьйес-5 25 76, 77 2 2 I 0 0

ЬИес-б 4 42 I I I 0 0

1Лес-7 8 79, 80 0 0 2 2 2

ЬНес-1з£ 14 43 I I I 0 0

Эксплан-

тат опу- 67, 68 1-2 I 2 0 0

холи ЬНес-1з£

льная особенность кариотипов клеток линий 1Нес-1-Ы1ес-6 заключается в том, что они содержат увеличенное число копий хромосомы 7, две копии участвуют в образовании маркеров Щ и М2. Шркерная хромосома Щ образована в результате транслокации хромосомы 19 на одну из копий хромосомы 7. При этом происходят делеция прицентромерно-го района q11 хромосомы 7 и делеция района q12 хромосомы 19. Маркер М2 представляет собой копию хромосомы 7 с де-лецией в районе q13-q22 . Неперестроенный гомолог хромосомы 7, также как и маркеры, стабильно сохраняются в клетках линий Ьйес-1-ънес-6. линия 1Иес-7 характеризуется большим разнообразием и количеством маркеров с учас-

тиеы хромосомы 7 по сравнении с линиями Ьйес-1-ьнес-б, а также отсутствием нормальных гомологов этой хромосомы и маркера Щ. Количество копий хромосомы 7, как неперестроенных, так и перестроенных, в клетках линий тес варьирует от 3 (линии ыгес-т-ыгес-з и ыгес-б ) до б (линия Ьйес7 ).

Наиболее детальный систематический анализ каротипа проведен на клз.тках линии Ы1ес-1. На протяжении длительного культивирования (более 3 лет) линия отличалась высокой стабильностью признаков кариотипа. Пс евд одипловд-ные клетки содержат 2 нормальные копии хромосомы 7 и маркер Щ. Маркерная хромосома М2 появилась спустя продолжительный отрезок времени после становления линии (20 пассажей в культуре), увеличение доли полиплоидных клеток до 12% и появление клеток с 3 дополнительными маркерными хромосомами наблюдали лишь через 1.5 года культивирования клеток линии.

В клетках линий Ы1ес-2-Ы1ес-7 маркер М2 был обнаружен уже на первых этапах культивирования. Клетки псевдодиплоидных линий ьиес-2, ьиес-з, ьиес-б и гипотет-раплоидных линий Ы1ес-4, Ы1ес-5 содержат различное число копий неперестроенной хромосомы 7, маркеров М1 и М2.

Среди всех изученных линий выделяется линия 1Иес-7. Как уже указывалось, в этой линии отсутствуют клетки с нормальными гомологами хромосомы 7 и маркером М1. Хромосома 7 участвует в образовании маркеров МВ1 и МВ2 (М Вистар I и М Вистар 2). Маркер МВ1 сформировался в результате транслокации короткого плеча одной из копий хромосомы 12 на хромосому 7, маркер МВ2 возник после транслокации копии хромосомы 14 на хромосому 7.

В клетках линий Ы1ес-4-Ы1ес-7 обнаружены дополнительные хромосомные маркеры, наибольшее число которых содержат линии Шес-5 и ьиес-7.

Клетки "бессывороточной" лиши 1Л*ес-1а£, прошедшей длительную селекцию без клонирования в условиях сниже-

ния концентрации ЭБС в среде, характеризуются околодипло-1 идным кариотипом (43 хромосош), наличием маркерных хромосом Щ и М2, 4 дополнительных маркеров и увеличением числа копий хромосомы б до 3. Обнаружена также трисомия хромосомы 2, одна из копий которой участвует в образовании дополнительного маркера, доля полиплоидных клеток в популяции составила

Кариологический анализ клеток эксплантата опухоли, возникшей при инокуляции 1-суточным крысятам клеток "бессывороточной" линии, выявил 3 группы кариотипов с числом хромосом 66,67 и 68 соответственно. Все кариотипы содержат нормальные и перестроенные (маркеры Ж и М2) копии хромосомы 7, дополнительные маркеры, а также 3 копии хромосомы 2, одна из которых принимает участие в формировании дополнительного маркера.

Анализ клеток линий Ьйес по составу половых хромосом показал, что все они, за исключением линии Ъйес-З, содержат II хромосош. В линии ЬИес-З обнаружены клетки, содержащие как Л, так я XI хромосомы.

Становление всех линий Ьйес сопряжено с появлением 3-ей копии хромосомы 7 и маркерных хромосом, образованных при участии хромосомы 7. Возможно, событием, обусловливающим иммортализацшо клеток, явилась мутация в районе центромеры хромосош 7. Мутация могла индуцировать нестабильное поведение хромосомы, которое могло реализоваться следующим образом: нерасхождение гомологов привело к трисомии хромосош 7 и обусловило дальнейшие перестройки специфических локусов в обоих гомологах после их расхождения. Клетки с 3 копиями хромосомы 7 и маркерными хромосомами оказались, вероятно, более жизнеспособными во время "кризиса" культуры и.спустя определенный период времени приобрели способность формировать клоны.

Таким образом, использованный в работе клональный метод селекции спонтанно трансформированных клеток позволяет получать постоянные линии эмбриональных клеток кры-

сы с минимальными воспроизводимыми изменениями кариотипа, которые касаются увеличения числа копий хромосомы 7 и ее перестроек, и разной степенью экспрессии признаков трансформированного фенотипа. В ходе культивирования неонко-генные иммортализованные клетки полученных линий приобретают способность формировать опухоли при подкожной прививке 1-2-суточныы и взрослым крысам. Характерная особенность клеток линий ы*ес-1-ьнес-6 заключается в отсутствии корреляции между онкогенностью и независимостью размножения от характера субстрата, в то время как у клеток линии Шес-7 эти признаки коррелируют.

довода

1. Предложенный в работе способ получения постоянных клеточных линий на основе клонов или их смесей из "предкризисных" культур дирлоидных эмбриональных клеток крысы является хорошо воспроизводимым и позволяет получать постоянные линии с достаточно высокой эффективностью. С его помощью в работе получены 7 новых линий спонтанно трансформированных эмбриональных клеток крысы ьиес.

2. Частоты, обнаружения клеток, способных к клонооб-разованию (1.4-П* 106). и стабильная способность этих клеток к размножению в культуре в течение неограниченно долгого времени позволяют считать, что генетическим механизмом становления линий ьиео являются мутации.

3. Анализ фенотипических характеристик полученных линий позволяет выделить два типа состояний популяции -пренеопластическое и неопластическое - при которых способность клеток к размножению в культуре может коррелировать с их разными пролиферативными потенциями в условиях редкого посева, сниженного содержания сыворотки крови в культуральной среде, при посеве в "мягкий" субстрат и при имплантации сингенным животным.

4. Результаты сопоставлений особенностей кариотипа и размножения клеток линий ыгес позволяют предположить,

что трисомия хромосомы 7 и, возможно, транслокация части материала хромосом 19, 12 или 14 на хромосому 7 сопряжены с иммортализацией клеток.

5. Результаты сопоставлений особенностей карнотипа и способности к образованию опухолей клеток линии Шеа-£ не показывают четкую корреляцию между приобретением он-когенности и специфическими хромосомными изменениями.

6. Трехступенчатая селекция клеток линии ьнес-1 находящихся на пренеопластической стадии иммортализацди, без последующего клонирования, позволяет получать иммор-талззованные "бессывороточные" онкогенные варианты клеток; способность клеток к неограниченному размножению в среде без сыворотки и образованию опухолей при прививке сингенным животным коррелирует с трисомией хромосомы 6. Среды, кондиционированные клетками полученного "бессывороточного" варианта ыгес-1з£ содержат ростстимулирую-щие факторы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Арцыбашева И.В., Игнатова Т.Н. Линии эмбриональных клеток крысы, трансформированных спонтанно и при обработке клонированными онкогенами рЕигазб.б и р-аЪ1 2.3 // Тез.Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. - М. - 1986. - С.52.

2. дрцева Н.М., федорцева Р.ф., Арцыбашева И.В., Игнатова Т.Н. Особенности изменения кариотипа эмбриональных крысиных клеток, трансформированных спонтанно и после обработки клонированными онкогенами // Тез. Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. - М. - 1986. - С.87-88.

3. Арцыбашева И.В., Ярцева Н.М., федорцева Р.ф., Игнатова Т.Н. Клонообразование как фактор спонтанной иммор-тализации клеток // Тез.1-го Всесоюзного рабочего совещания "Биофизика рака". - Черноголовка. - 1987. -С.14-15.

4. Ярцева H.IL, Федорцева Р.Ш.\Лйгнатова Т.Н. Неслучайные изменения кариотипа спонтанно иммортализованнкх клеточных линий крысы // ТРУДЫ У Всесоюзной межуниверситетской, конференции. - Тбилиси. - 1987. - С. 853854.

5. Игнатова Т.Н., Дрцыбашева И.В., федорцева P.O., Ярцева Н.М. Клеточные факторы иммортализации и онко-генной трансформации в условиях культуры // Тез. Международного симпозиума по молекулярной и клеточной онкобиологии. - Таллин. - 1988.

6. Artzybasheva I.V., Jartseva N.М., Ihnatova T.N., Fe-dortseva R.F., Averjanov A.V. Rearrangement in one of the three copies of 7 chromosome t (7; 19) as a possible mechanism of rat embryo cells immortalization // Abstr.IV Intern.congr.of cell biology.-Montreal. - 1988. - P.285.

7. Длескач B.A., Арцыбашева И.В., Цветкова Т.В., Филатова Н.А.. Смирнова И.С., Тарунина М.В. Биологическая активность культуральной среды, кондиционированной трансформированными крысиными фибробластами LRec-1sf // Цитология. - 1988. - Т. 30. - # 9. - С. II40-II4I.

8. Арцыбашева И.В., Игнатова Т.Н. Новые линии спонтанно трансформированных клеток, полученные из "предкризисных" культур эмбриональных клеток крысы // Цитология. - 1989. - Т.31.-#12. - С.

М - 33$/О Подписано к печати /-£*• /£>. . Заказ /6*24-

Тираж ПО. Формат бумаги 60x84 1/16. I печ. лист. Бесплатно ПО - 3 "Ленуприздата" 19П04 Ленинград, Литейный пр., д.55