Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности изменения ростовых свойств клеток в процессе их спонтанной неопластической трансформации

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности изменения ростовых свойств клеток в процессе их спонтанной неопластической трансформации"

2 1 0 5 9 2

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

1УВАКОВА ¡Ларина Анатольевна

На правах рукописи УЖ 616-006:577.115.3

ОСОБЕННОСТИ ИЕМЕНЕНИЯ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОК В ПРОЦЕССЕ ИХ СПОНТАННОЙ НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ ТРАЕС&)ШАВДИ

Клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 19 9 2

Работа выполнена в секторе онкогенетики Института цитологии и генетики СО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Д.Н. Маянский Институт клинической и экспериментальной медицины СО РАМН,г. Новосибирск

■ кандидат биологических наук Е.И. Солёнов

Институт цитологии и генетики СО РАН,г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биоорганической химии

СО РАН,г.Новосибирск

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН Д-002.П.01 по адресу:630090, Новосибирск,проспект академика Лаврентьева 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и гьнетики СО РАН.

В.А. Лавровский

Институт цитологии и генетики

СО РАН,г.Новосибирск

Защита диссертации состоится

7

заседании Специализированного совета

Автореферат разослан

7

Ученый се1фетарь специализированного совэта доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Рост и дифферещировка любой клетки гао-гоклеточного организма жестко регулируется его гомсостатичеспх-ми системами (boewen3tein,i979 ).Сеть мзшглеточных сигналов лежит в основе установления и поддержания нормальной тканеЕоЗ структура.

Одно их определяющих свойств опухолевых клеток - это аномальная реакция на сигналы, контролирующие деление нормальных клеток (Васильев,Гельфанд,1981).Опухолевые клетки делятся срагдшэ-льно бесконтрольно,пока не убивают хозяина. Это фатальное отсутствие сдергивающего фактора явилось стимулом для интенсивного исследования регуляции клеточного деления. В настоящее время очевидно, что деление опухолевых клеток как в культуре in vitro ,тва п в тканях гораздо менее подвержено регуляции по принципу обратной связи,чем деление нормальных клеток.Показано,что опухолевые клетка в культуре обычно продолжают делиться,когда норлальные уг.е Ее делятся из-за контактного торможения ( АЬегсгопМе, 1979 ).Получены данные,свидетельствующие о том,что культивируемые опухолегке клетки могут терять зависимость от одного или нескольких ростовых факторов,регулирующих деление нормальных клеток ( Holley, l976;Kimichi et ai.,1987 ).Кроме того,обнаружена способность опухолеродннх клеточных линий секрегировать различные факторы роста ( Kurokawa,I989;0hmura,1990).Предполагается,что выше перечисленные ростовые свойства опухолевых клеток позволяют им преодолевать сдерживающее пролиферацию негативное влияние нормального тканевого окружения.

Несмотря на многочисленные литературные данные об изменении реакции трансформированных клеток на нормальные рост-регулирущие сигналы ( Bartholomew et al. , 197б; Sporn,Todaro, 19BCJ,ВКЛЭД ЭТИХ феноменов в становление опухолевого потенциала клеток остается гипотетическим. Слабо изучены изменения ростовых свойств клеток на начальных этапах спонтанной неопластической трансформации. Остается открытым вопрос о тал,изменение каких ростовых характеристик клеток необходимы для проявления у них признака опухоле-родности.Поиск ответов на эти вопросы является крайне актуальным. Однако, отсутствие адекватных моделей часто является причиной медленного накопления знаний в этой области.

Выбор модели исследования. Сложность изучения многостадийного процесса неопластической трансформации клеток в системе in vivo .когда из поля зрения исследователя ускользают первые этапы возникновения опухоли,способствовала развитию экспериментальных моделейin vitro .адекватно отражающих процесс опухолевой прогрессии.С этой целью использовали методы физического и химического воздействия на клетку ( Berwald.Sacha,1963;Brouty-Boye et al.,1979 ),a также трансфекцию в клетку определенных генетических элементов вирусов (Temin,1968¡Bell,1977) и хорошо изученных онкогенов (Land et al., 1983;Wiiaon et al.,1990 ).При этом в клетках происходят генетические изменения,приводящие к относительно быстрой их неопластической трансформации.

Особое место среди клеточных моделей неопластической трансформации занимают такие,в которых опухолеродный фенотип клетки приобретают "спонтанно" ( Ponten, 197б;Мес)с et al. ,1977;Mukherji et al. ,1984).Длительное пассирование in vitro первичной культуры

эмбриональных клеток мсжет приводить к появлению неопластически трансформированных вариантов ( Sanford,i965;Kuroki,l975).B этом случае накопление опухолеродного потенциала клетками происходит постепенно,многоэтапно,что в наибольшей степени отражает естественный процесс развития неошгазии in vivo .Л „таких моделях причины,приводящие к трансформации клеток, остаются гипотетическими. Однако,изучение параметров клеток,изменяющихся во время их неопластической трансформации .можно проводить уже на начальных этапах этого процесса. Принципиальная возможность такого подхода была продемонстрирована ранее в нашей экспериментальной группе на модели спонтанно трансформированных in vitro клеточных линий , полученных из эмбриональных фибробластов мышей и крыс (Лавровский и др., 1983;Лавровский и др. ,1984¡Лавровский и др. ,1987).Анализ изменчивости ряда иммунологических и морфологических параметров клеток показал,что отсутствие опухолеродности у клеточных линий связано с изменением скорее ростовых,а не иммунологических параметров клеток (Юрченко,1987).Проведение дальнейших исследований на существующей у нас модели могло оказаться мало эффективным,поскольку клеточные линии,как правило,гетерогенны по ряяу признаков (Noweil, 1986;Grandel,Rutin, 1991 ).Таким образом,для исследования изменений ростовых свойств клеток в процессе их спонтанной неопластической трансформации,в первую очередь,необходимо создание адекватной клеточной модели.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение ростовых свойств клеток,изменение которых может обусловливать приобретение ими опухолеродного фенотипа.

В соответствии с основной целью нашего исследования были поставлены следующие задачи:

1. Получение набора клональных клеточных линий,близко родственных по происхождению,но контрастных по признаку опухолеродпости, на основе уже существующей клеточной коллекции спонтанно трансформированных in vitro эмбриональных фибробластов мышей и крыс.

2. Оценка ростовых свойств клеток,изменяющихся в процессе их спонтанной неопластической трансформации:

2.1. Анализ реакции различных по опухолеродности клеток на сигналы, тормозящие пролиферацию,по оценке зависимого от плотности гомологичного и гетерологичного торможения деления клеток.

2.2. Анализ реакции различных по опухолеродности клеток на внешние митогенные сигналы от полипептидных ростовых факторов.

3. Оценка изменений в ауторегуляторных механизмах клеточного деления у опухолевых клеток с помощью сравнительного анализа биологической активности кондиционированных сред и клеточных лизатов контрастных по опухолеродности клонов.

Научная новизна. Впервые обнаружен феномен реверсии высоко опухолеродных спонтанно трансформированных клеточных линий к нормальному фенотипу.В отличие от проводимых ранее исследований, в данной работе впервые показано,что реверсии опухолевых клеток к нормальному фенотипу могут происходить с высокой частотой.

Получены уникальные данные клонального анализа,свидетельствующие о том,что частоты реверсий опухолеродных спонтанно трансформированных клеточных линий сохраняются в ряду последующих клеточных поколений.

Создана новая модель спонтанной неопластической трансформации. Модель представлена уникальным набором контрастных по опухолеродности клонов,полученных на основе 9 клеточных линий эмбриональных фибробластов v. ни ей и I линии крыс.

Впервые в рамках единол модели установлено,что контрастная опухолеродность клеточных клонов обусловлена различиями в чувствительности клеток к конкретным рост-регулирующим внутритканевым сигналам:контактному торможению деления со стороны нормальных клеток и митогенному действию ростовых факторов сыворотки кроЕИ ( ЭФР,ФРЭК,ФРТр,5РФ ).

Практическая ценность. Создана новая коллекция клеточных культур мышей и крыс, в ключавщая ряд близко родственных по происхождению,по контрастных по опухолеродности й ростовым свойствам клеточных клонов.

Полученная коллекция может быть рекомендована специалистам в области клеточной биологии и онкобиологии вчастности.в качестве модели для изучения механизмов неконтролируемого роста опухолевых клеток, выяснения причин их фенотипнческой и генотипичес-кой нестабильности. Предлагаемый набор клеточных культур может служить моделью для изучения функций онкогенов,а также поиска гепов - негативных регуляторов роста.

Апробация работы и публикации. Полученные результаты представлены в виде доклада на Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (г.Львов),на международных курсах febs "Онкогены и клеточный рост" (г.Киев),на III Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" (г.Чернигов),а также представлены и обсуждены на 1У Всесоюзной школе-семинаре колодах ученых "Перспективные направления и новые метода в молекулярной биологии" (г.Рига),на меалабораторном семинаре Института цитологии и генетики СО РАН (г.Новосибирск).

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение,обзор литературы,материалы и методы,результаты собственных исследований,обсуждение,вывода,список цитируемой литератур!. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 5 таблицами.Список литературы включает 263 цитируемых источника,из них 26 отечественных и 237 иностранных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И METO® ИССЛЕДОВАНИЯ

Кивотнне. В работе использовали 2-3 месячных самцов и самок мышей линий СЗН,СВА.ваьв/о ,а также крыс линии wag.Все животные были получены из лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и. генетики СО АН СССР.

! Клеточные культуры. Первичную культуру эмбриональных фибро-бластов получали трипсинизацией измельченных декапитированных эмбрионов,с последующей посадкой отдельных клеток в культуральные сосуда на среде Игла с 10$ сыворотки крупного рогатого скота (КРС).

Длительно перевиваете клеточные липки,получепше из эмбриональных фибробластоэ мышей и прио, пассировали in vitro на среде Игла с добавлением 8% сыворотки НРС,2# эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мхг/мл геятсмиидна, з течение болзз 18 :.'ес. 2-4 иес. клетки тестировали на опуголсродтгссть. Пг.рзллельло часть клеток каядой линии замораживали в глдксм азоте.

Дополнительно использовали стглдартанэ дязтга ,тапгй сэнют1/£ итнзсз ,предоставленные Институтом цлтологзя АН СССР (г.Лехптн-град),сс1г-б4(карцзло'!у легкого нсрх~) - отделением Института биохимии им. А. В. Палладипа М УССР (г. Львси), которое нмспрсзс^з на среде того ка состава.Все клетки культивировали в nxacTíii'Ozi^c сосудах ("Plow".England) п трипсзнпззрсвалл 0,025£ растворси зрпп-сина ("Serva",frg ).Судя по разнице вплетения кеченнпх уродила к урацила.все клеточные культуры ке содержали ьэкопяагг-а.

Клонирование клеток. КлонпровенЕв клеток прогодилл в 93-луночных плаипетах ("Flow",England )ме?одсм предельных разведений. Клетки высеватп пз расчета 0,5-1,0 клетка на лунпу на среде Игла с Ш* эмбриональной телячьей сыворотки.Учет и сцепку колоний проводили через 10-14 суток. В каждом эксперименте анализировали около 100 колоний.

Тесты на оптхолеродность. Клетки Еспнтнвали на опухолерод-ность,прививая их под кожу спины сингеншм животным в дозз 1x10®. Учет возникновения опухолей производили на протяжении 1-6 мес. Неспухолероднымз считали длительно перевиваемые in vitro клеточные линии и клоны,не способные образовывать опухоли в течение 2 мес. после перевивки.Степень опухолеродности клеток оценивали по:1)прививаемости клеток {% животных с опухолями);2)скорости роста опухолей (вес опухолей на 30 сутки);3)с помощью индекса опухолеродности; 4 )по показатели выживания животных с опухолью.

Рост клеток на клеточном монослое. Реакцатэ проводили в 96-луночных планшетахЛерез I сутки монослой соответствующих неопу-холеродных клеток обрабатывали митомнцином С ( "Serva",frg ) в концентрации'I мкг/мл в течение 5ч,после чего его отмывали'3 раза Тестируемые клетки высевали через I сутки на полученный монослой I и в контрольные лунки на пластик.Через 12-20ч в лунки добавляли 30 кБк/мл %-тимкдина на 2-Зч, после чего просчитывали радиоактивность клеток,перенесенных на бумажные фильтры.За 100$ принимали включение метки клетками на пластике. Определяли % ингибирования пролиферации клеток,растущих на монослое фибробластов.

Контактное торможение в плотном монослое. Клетки высевали в 96-луночные планшеты на среде Игла с 5% коровьей плазмы,обедненной тромбоцитами, (Umeno et а1.,1989)в разреженном (1,5x10^ клеток/см^) и плотном монослое (12,ОхЮ^клеток/см^).Через сутки добавляли %-тимидин на 2-Зч, после чего подсчитывали радиоактивность 5 тыс. клеток в обоих вариантах. За 100$ принимали радиоактивность клеток в разреженном монослое.Определяли % ингибирова-ния пролиферации клеток,растущих в плотном монослое.

Митогенный тест. Влияние полипептидных факторов роста:эпи-дермального фактора роста-ЭФР( "Serva" ,frg) .фактора роста эндоте-лиальных клеток-ФРЭК("Sigma",usa),фактора роста из тромбоцитов, частично очищенного по методуRainee,Ross (Raines,Ross, 1982 )-ФРТр,фактора роста фибробластов-ФРФ( "Serva",frg)оценивали по изменению включения клетками %-тимидина. Клетки высевали в 96-лу-ночные планшеты (12,0хЮ4клеток/см2)на среде Игла с 10% сыворотки КРСЛерез 4ч клетки промывали и инкубировали далее в среде, содержащей Ъ% плазмы или сыворотки КРС п один из факторов роста: ЭФР(12,0нг/мл), ФРЭК( 10, Омкг/мл ), ФРТр ( 20, Онг/мл, 1625ед. активности/ мг),ФРФ(0,1мкг/мл).Контроль - среда,содержащая только Ъ% плазмы или сыворотки КРСЛерез 18-22ч добавляли %-тимидин на 2-Зч,после чего просчитывали радиоактивность клеток. Эту величину в контрольном варианте принимали за единицу. Определяли во сколько раз изменяется радиоактивность клеток при их культивировании в среде, содержащей один из ростовых факторов.

Кондиционированные среды. Клетки выращивали до субконфлюент-ного монослоя.После 2-х кратной промывки средой Игла клетки культивировали дополнительно на среде с 1% сыворотки КРС,необходимой для поддержания их жизнеспособности.Через 2 суток собирали полученную таким способом кондиционированную среду (КС).

Белковые фракции из кондиционированных сред и лизатов клеток. Из КС белки экстрагировали 60% от насыщения р-ром сульфата аммония. Белковый осадок растворяли полностью Ш р-ром гуанидинтиоцианата ("Sigma",usa),смешивали с двумя объемными частями хлороформа,центрифугировали при I000S 20мин. Водную фазу использовали для гель-фильтрации на сефадексе g-25("Pharmacia Pine Chemicals','Sweden).

Для получения лизатов клетки (200 тыс) снимали 0,02$ р-ром трипсина-версена,отмывали и лизировали в 500 мкл Ш р-ра гуанидинтиоцианата. После чего добавляли 800 мкл хлороформа,перемешивали, центрифугировали при IOOOg 20 мин и отбирали водную фазу,из

J

которой ацетоном осаждали белки и растворяли их в 150 мкл 4М р-ра мочевины.Отделение солей и мочевины проводили на сефадексе g -25.Суммарные белковые фракции испытывали на митсгеннуто активность. В качестве контроля использовали среду Игла с 10% сыворотки.

Математическая обработка результатов. Все эксперименты повто-• ряли не менее 3 разданные суммировали и обрабатывали статистичесга

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание коллекции генетически близко родственных клеточных клонов различной опухолеродности. в качестве исходных родительских культур в тестах по клонированию использовали полученные нами ранее клеточные линии. эмбриональных фибробластов мышей разных гено-типов:сзн,сва,ваьв/о и крыс линии wag (рис. I). в процессе клонирования спонтанно трансформированных in vitro клеточных линий мышей с невысоким злокачественным потенциалом:рсзнэ1 .fc3h34 (генотип сзн) и fcba25 (генотип СВА) были получены близко родственные клеточные клоны,отличающиеся по прививаемости in vivo.Среди них в основном - слабо опухолеродиые клоны,аналогичные исходным родительским .щгаишсРСЗНЗКкП) ,fg3h31(k13),í,c3h34(kl6)fl,c3h34(kl8),

УСЗЮ1 (k 13 и --}РСЗНЭ1 ГСЗНЗКк«г>-*'

РСЗНЗЭ

1

k?0V.« {

РСЗНЭ»7(к

УСЗЮ»7 (к31 >--?СЗНз'т7 ?СЗНЗ»7(к29)'/ РСЗЯЗ»7(кЗЗГ

КЗЮ4(к1в>-*

—У.РСЗ'Юи

.. 1

PBALBO

I

РСВА21 ГВАХВ11

PC BAO ¡

13-17 16-20

тзз

J

К I

?СЗИ4те(к55)'

?CBA25(k22L

22 Ч»

РСВА2т1 0( к 19 b"-' FCEA2* 10 ( к7 ^ NJÄA2v10(k23)«' PCHAÍT10

PCBA2rlO(klf

FCHA2v40(k11X FCBA2»40(k12K>CBA2*40 РСВА2в«~ ' '

Рисунок I. Схема получения клеточных культур.

Одинарная стрелка - культивирование in vitro(х - месяцы),

пассирование in vivo,прерывистая - получение клонов. - 7 -

двойная

FBALBlTl2(k46>'

реже - неопухолеродаые: РСЗН31(к42),РСВА25(к22).Контраотных по опухолеродности вариантов при клонировании спонтанно трансформированных слабо опухолеродных линий получить не удалось.

Далее было проведено клонирование ряда высоко злокачественных клеточных ланий мышей: FC3H3v71FC3H4v8,РСВА2v40 .Эти клеточные линии были патучены спонтанной трансформацией in vitro .затем отсолокционпрованы in vivo на повышенную злокачественность,после чего вновь адаптированы к условиям роста в культуре in vitro .Пе-ревзвка таких клеток сингенным реципиентам вызывала появление значительных по размеру опухолей (4-10г) у 100$ животных к 30 дню, как правило приводя к полной гибели шшей в экспериментальной груп-пе.Наоавданннми оказались результаты клонирования этих линий.Действительно, основная масса клонов имела родительский фенотип и ха-рагяернзовалась высокой опухолеродностыз.Типичные представители: FC3H3v7(k29),FC3H3v7(k33),FC3H4v8(k55),FCBA2m .Однако, в клональ-ноа потомстве наряду с трансформированными по морфологии клонами, появлялась клоны псевдонормалъного фенотипа - плоские,с однослойным характером роста: FC3H3v7(ki8),FC3H3v7(k20),FC3H3v7(k31) , ' . FC3H4v8(k56). Перевивка таких клонов лшвотным приводила к появлению опухолей с более низкой частотой,чем у родительских линий, к тому се вес опухолей был минимальным (менее 0,02г).

Похожие результаты клонирования трех независимо полученных опухолеродных линий: FC3H3v7,FC3H4v8,FCBA2v40 убедительно свидетельствуют о том,что процесс выщеплензя в их клональном потомстве различных по морфологии и опухолеродности клеточных вариантов не случайный,не являющийся уникальной особенностью только одной клеточной культуры. Это положение подтверждают также количественные данные клонального анализа 5 высоко опухолеродных клеточных линий мышей и одной линии крыс.(рис.2).Четыре из шести родительских линий с определенной частотой образовывали 3 типа колоний: типично трансформированные колонии,менее плотные (промежуточного фенотипа) и колонии плоские,растущие однослойно.Только клетки крысиной высоко метастазирующей линии iN?a3v6 и высоко метастази-рупцей линии резнзт не ревертировали к нормальному фенотипу,либо ! частота таких реверсий не превышала 1%.

Контрастные по морфологии клоны резко отличались в тестах на прививаемость in vivo. Клетки трансформированных колоний образовывали быстро растущие опухоли у 100^ животных к 30 дню. Клетки плоских колоний или не образовывали опухоли вообще,или их образо-

Рисунок 2. Клонирование

езстн высоко опухолзродтгсс

клеточных лшша:ЛЗА131т12,

ГСЗН4У8, КША2г40 ,ГСЗЕЗ>7,

ГСЗНЗи.ИТаЗУб.

Символы с двойной огтвггсэ-кой - колсяаз тгатдаюр: ТИРОВАННОГО ТШ7а,С~ОЛТШЧр103

- прсмеяуточпого.йез страховки - нетраяс$српровзп~ 7СВАг740 ного. Цифра слева от сгето-лов - колото стаополсзг.! газдого юта (з %).

?ОЗЯЗт7

100 [

°6

ГаЗтб

Рисунок 3. Клонирование высоко олухолеродных клгточньк ЛИНИЙ : ГСЗНЗУ7. ,РСЗА2-/40.

УСЗЧЭУ? I-« могжрсаря?»

го 20 0

Е7 С. 0

И II 0

80 13 2

га 47 3

к Я и

40 33 2?

'«'Л

3-« иоа^пш* Д

о

3-4 ххг&громхк«

Ш Ш

о

КВлГгЮ 1-0« »ясуччья?*

—1

пЛ

9

4 ч . ьш рчеш

ванию предшествовал длительный латентный период (1-2 мес.),что свидетельствовало о возможной ре-реверсии этих клеток.

Таким образом,мы установили,что спонтанно трансформирован- • ныв опухолевые клетки способны с определенной,довольно высокой частотой ровертировать к нормальному фенотипу.

Данные многократного реклонирования двух высоко опухолерод-ных линий разных генотипов:fcba2v40 и FC3H3v7 дополнительно подтверждают это положение.Поскольку,в повторных циклах клонирования многослойно растущих клеточных клонов этих линий со -хранялась такая же высокая частота реверсии опухолевых клеток к нетрансформированному фенотипу (рис.3).Клетки плоских колоний при повторных клонированиях давали, за небольшим исключением, колонии только нетрансфоршрованного фенотипа.Однако,клетки-ревертвнты не утрачивали окончательно способности к дальнейшей неопластической трансформации. Пассирование in vitro в течение нескольких месяцев клеток нетрансформированных клонов в ряде случаев приводило к постепенному изменению морфологии клеток (более плотный характер роста),одновременно увеличивался их злокачественный потенциал.

Итак,клонирование спонтанно трансформированных высоко злокачественных линий привело к обнаружению феномена клеточных реверсий. Возможные спонтанные реверсии опухолевых клеток трансформированных вирусом описаны ранее (Stephenson et al.,1972 ). Однако,частоты этих событий крайне низкие ( Ю^-ИГ8 ).Наиболее интересными из полученных наш данных являются таковые о высокой степени реверсии опухолевых клеток к неопухолеродному состоянию. Частоты таких реверсий повторялись в ряду клеточных поколений с некоторыми вариациями по отдельным клонам.Кроме того,выявлена возможность ре-реверсий неопухолеродных клеток к опухолеродному состоянию,которые происходят .однако,с меньшей частотой.

Практическим результатом клонирования является создание коллекции близко родственных генетически клеточных клонов ряда независимо полученных клеточных линий нескольких генотипов мышей и одной линии крыс (рис.I).Созданная коллекция явилась удобной моделью для изучения изменений клеточных свойств,непосредственно связанных с появлением опухолеродного фенотипа клеток.

Чувствительность различных по опухолеродаости клеток к внешним сигналам.регулирующим клеточное деление. Первоначально исследовали изменение чувствительности клеток к экзогенным сигнален, регулирующим пролиферацию,в процессе спонтанной неопластической трансформации клеток. Оценивали чувствительность клеток к контактному торможению деления:I) во время роста клеток на монослое контактно-заторможенных культур,2) внутри гомологичного монослоя клеток;чувствительность клеток к митогенному действию полипептидных ростовых факторов (ЭФР,ФРЭК,ФРТр,ФРФ).

Для удобства тестирования ростовых характеристик клетки условно разделили на 3 группы:тип А - неопухолеродпые клеточнне линии и клоны,тип Б - слабо опухолеродные,прививающиеся с длительным латентным периодом и вызывающие гибель животных в отдаленный' период времени после перевивки,тип В - высоко опухолеродные клетки.

Восемь неопухолеродных клеточных культур (тип А) использовати для образования монослоя.Помещая различные по опухолеродкости клетки (тип А,Б,В) на мснослой,оценивали ингибарозание их пролиферации. Обнаружили,что монослойные культуры неопухолеродных клеток проявляют значительную дисперсию по способности пнгябировать рост любых других клеток. Некоторые культуры (PC3A2vio(k23) nFC3K8 ) по этому параметру превосходили даже первичнун культуру эмбриональных фибробластов.На глонослое именно таких "активных" культур все неопу-холеродные клетки (тип А) практически прекращали вклетать меченный предшественник синтеза ДНК,тогда как слабо и впсско опухолеродные культуры продолжали в той или иной степени пролиферироватъ (ряс. 4).

Установлено,что степень контактного торможения деления клеток внутри гомологичного монослоя также монет изменяться в процессе их неопластической трансформации.Показано,что большинство неопухоле-

Тжп теспг^бмгх мете«

Рисунок 4. Контактное торможение деления различных по опухолерод-ности клетс".

Слева направо:тип A-fcbao,FC3A21, FCBA25(k22),FCBA2v10(k23), FCBA2v40(k11).PC3H31(k42)-FC3H5, резнэ.ютзтзггап Б -FC3H31 (ki 1),

PC3H31(k13),FC3H34(kl6),FC3H34(k18) ТИП / B-FCBA2v10(k1),FCBA2m,FC3H3v7, FC3 НЗш,F3ALB1v12,FWa3v6.

Тжс A Tin Б Тта В

+ , Г*

+ w

-----

++ * ++ «j.

++

+

родпзк культур практически прекрасают деление в собственном кон-флгенгаом ыонослоо (рис.4).Однако,у отдельных культур типа А,в тс;» ЧЕСле первичной гуль туры эмбриональных фибробластов.ипгибз-ровгшпз нролЕферЕЦии было нз столь значительны!'. Следовательно, изменение этого ростового параметра клеток не гложет слукить щптерлеп их опухолородноотп.

Итап, прлобретонго $ябробластамз шией к крыс признака опу-холгродноотп в процессе их спонтанной кеоидагии сопровождается суеосгьзшЕЫ сЕпгаше;л их способности отвечать на сильные рэст-рзгулпрутаио сигналн от окрукшдих норглалънлх клеток. Дальнейшее увагегтеоте опухолеродного потенциала клеток (переход от слабо к шсэко опухолеродпоку состоянию) происходит без заметного из1,:э-еоеия этой ростовой характеристики.

В следующей серил экспериментов оценивали чувствительность рааигпшх по опухслеродносги клеток (тип А,Б,В) к митогенному действию 4-х ростовых факторов:Э$Р,Ф?ЭК.ЕРТр,Ф?Ф (рлс.5).

Тип В

Рисунок 5.Влияние фак-

ч 9 о

р.8 Н

ж 7

о 5 к

л 4

:з

н

и 2 ш а

Тип Б

И

Э5Р

4

3 2

I ..

о? «> 2

к 1 №

« о

Г

а г

и о

ш.

торов роста на пролиферацию различных по опу-холеродности клеток.

Слева направо:тип А-РСЗН5, РСЗН8,РСЗН31(к42), РСВА25(к22),РСВА2У10(к23), РСВА2у40(к11), 1ПНЗТЗ;

тип Б -РСЗНЗКкП), Р03Н31(к13),РСЗНЭ4(к1б), РСЗНЗД(к18); ТИП В -РСЗНЗУ7,РСЗНЗИ, .РСВА2У10(к1),РСВА2п, РВАЬВ1у12,Р«аЗу6.

ФРЭК

. гЬ т__- - •

ггПтп

ИшпГгт

«РТр

А

И

«и

ШЖ

+

+

+

+

+

Тип тестируемых клеток - 12 -

Все клетки типа А в плотном монослое облигатно реагировали увеличением синтеза ДНК в ответ на добавление одного из ростовых факторов.Среди слабо опухолеродных клеток (тип Б)лишь часть обладала аналогичной активностью,к тому же в меньшей степени.Ни 'дна из высоко опухолеродных культур не отвечала на митогенпое дейстзне ростозых факторов.В целом для всего ряда независимо полученных клеточных линий прослеживалась явная тенденция к снижению чувствительности одновременно к четырем различным митогенам.

Таким образом,в процессе спонтанной неопластической трансформации происходит изменение следующих ростовых свойств клеток: снижается чувствительность к контактному торможению деления со стороны нормальных клеток,уменьшается клеточный ответ на сывороточные митогенные ростовые факторы.Полученная на'л модель поз-^ ±н-, волила исследовать изменения рос-

100 г -

&Й „5

+

Г

1 е-

ШП

£

дан

Ж

тоеых свойств клеток не только в процессе их постепенного оклока-чествленпя.но и во время рззерсий опухолевых клеток к нормальному фенотипу,когда происходят относительно быстрая потеря клетками признака опухолеродности.Анализ ростовых свойств нескольких случайно выбранных колоний,контрастных по фенотипу,свидетельствовал о том,что метки трансформированных колоний по ростокхм характеристикам аналогичны родительским высо-"ко опухолэродннм клеточным линиям: для них характерна низкая чувствительность к контактному тортожению и отсутствие чупстглтелъности к митогенным факторам роста (рис.6).

Рисунок 6. Контактное торможение "деления и чувствительность к рос-"товым факторам у различных по морфологии клеточных колоний.

м.

Клетки кетр?лсфорг.*и- Клетки трансформиро рованных колонки влнн<лс колоний

+

к

РсьлгуюЕкгз)

Тогда как у клеток-ревертантов восстанавливается способность отвечать именно на те рост-регулнрущие сигналы,чувствительность к которым была утрачена родительскими линиями в процессе их спонтанной неопластической трансформации.

Таким образом,данные об изменчивости ростовых свойств клеток в процессе клеточных реверсий подтверждают положение о том,что приобретение признака опухолеродности спонтанно трансформированными культурами сопровождается снижением их чувствительности к внешним рост- регулирующим воздействиям.

Биологическая активность рост-регулирующих факторов.продуцируемых клетками разной опухолеродности. Поскольку в основе автономности роста опухолевых клеток может лежать' юс способность к продукции аутокринных митогенов.мы исследовали биологическую активность КС от различных по опухолеродности клеток. Оценивали влияние суммарных белковых фракции КС на пролиферацию 3-х пар близко родственных,но контрастных по опухолеродности клонов (рис.7).В КС неопухолеродных клонов не было обнаружено рост-стимулирующей активности. Напротив .белковые компоненты опухолеродных клонов обладали значительной митогенной активностью. Однако, в секретах одного из них (РСЗН4у8(к55))активность не выявлялась.Кроме того,КС первичной культуры эмбриональных фиброблас-тов обладала сильной рост-стимули-жвйг'п"1 рующей способностью.Поскольку для этих клеток,как и для опухолевых, кэязлски) характерно слабое контактное торможение деления в гомологичном

Рисунок 7. Влияние белковых фракций КС на пролиферацию неопухоле-роДНЫХ(РСВА2у10(к23),РСЗНЗУ7(к20), РСЗН4у8(к5б))и опухолеродных

(РСВА2т,РСЗНЗу7(к29),РСЗН4У8(к55)) КЛОНОВ.

..й,^,____и 1—3: КС неопухолеродных клеток

ШШ-Ш—I РСЗНЗу7(к20),РСЗН4у8(к5б),

к)Н4«(к5я РСВА2у10(к23);

4-7: КС опухолеродных клеток

РСВЛ2т,РСЗНЗт7(к29),РСЗН34(к18),

Щ17 Р°^?4КС ^первичной культуры эмбриональных фибробластов рсвао.

- 14 -

п1 т-х, \//л 14 3 4 5

монослое,мы предположили,что секреция аутокринных митогенов связана с интенсивностью пролиферации клеток.Действительно, стимуляция деления контактно-заторможенных клеток одного из неопухоле-родных клонов]?сзнзу7(к20) с помощью 12-0-тетрадеканоилфорбол-13 ацетата (в концентрации 2,5 нг/шг,в течение 2-х суток) вызывала появление рсст-стимулирующей активности в КС этих клеток, не уступающей по величине аналогичной активности,полученной из КС близко родственного,но опухолеродного клона гсзнзу7(к29) . Кроме того,анализ биологической активности суммарных белкоЕНх фракций из лизатов нескольких контрастных по опухолеродности клонов показал,что митогенной активностью,в той или иной степени, обладают лизаты всех,без исключения,тестируемых клеток,независимо от их опухолеродности.

Таким образом,выделение белковых ростовых факторов скорее не особенность опухолеродных клеток как таковых, а норлальное метаболистическое состояние активно пролиферирующих клеток.

ВЫВОДЫ

1. На основе 9 гетерогенных клеточных линий эмбриональных фибробластов мышей и I линии крыс создана уникальная коллекция контрастных по опухолеродности клоков,позволившая изучить особенности изменения ростовых свойств клеток в процессе их спонтанной неопластической трансформации,а также во время реверсии опухолевых клеток к нормальному фенотипу.

2. Показано,что все исследованные неопухолеродные клеточные культуры обладают высокой чувствительностью к сильным рост-ингибирующим сигналам, поступающим в процессе межклеточных взаимодействий от нормальных клеток,а также к рост-стимуллрующему действию различных факторов роста (ЭФР,ФРЭК,ФРТр,ФРФ).

3. В процессе спонтанной неопластическол трансформации происходит уменьшение чувствительности клеток к митогенным факторам роста и к контактному тор/южению деления. Вышеназванные изменения ростовых свойств клеток приводят к увеличению их опухолеродного потенциала. ,

4. Обнаружено,что спонтанно трансформированные опухолеродные клеточные линии способны с высокой частотой ревертировать

к нормальному фенотипу. Высокие частоты таких реверсий свидетельствуют в пользу гипотезы о том,что изменчивость,лежащая в их

основе,hockt немутационный характер. Данные клонального анализа позволяют считать частоты реверсий для каждой клеточной линии генетически закрепленными характеристиками.

5. Установлена взаимосвязь между процессом реверсии опухолевых меток к нормальному фенотипу и восстановлением высокой чувствительности клеток как к рост-ингибирующему влиянию нормальных клеток,так и к митогенным факторам роста.

6. Обнаруженные взаимосвязи позволяют предполагать,что механизмы,лежащие в основе изменчивости двух вышеназванных ростовых признаков,являются ключевыми в процессе спонтанной неошгасти-ческой трансформации клеток.

Описок работ опубликованных по теме диссертации.

1. Лавровский В.А. .Юрченко Ю.А. .Гувакова М.А.Иммунологические и морфологические свойства фибробластов, трансформированных^ vi-tro III.Распознавание макрофагами и активированными лимфоцитами мышиных z крысиных клеток разной степени опухолеродности // Цитология.-1987.-т.29,*5.-С.589-595.

2. Лавровский В.А. .Гувакова М.А.Выделение из мышиной опухолевой линии клонов,рост которых in vivo полностью заблокирован макрофагами // ДАН СССР.-1990.-т.310,£4.-С.9S0-992.

3. Гувакова М. А. .Лавровский В. А. Особенности'"двусторонней" регуляции пролиферации фибробластов мышей и крыс в процессе онко-генеза // Эксперим. онкология. -I99I. -т. 13,№2.-С.28-33.

4. Гувакова М. А.Неопластическая трансформация клеток при селекции вариантов,адаптированных к условиям роста in .vivp// Тезисы сообщения на Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации". -Цитология.-I99I.-т.33,Ä 5.-С.97-98.

5. Гувакова М.А. .Лавровский В.А. Биологическая активность факторов, продуцируемых клетками разной опухолеродности // Эксперим, онкология.-1992.-т. 14,JÍ3 .-С. 50-54.

6. Lavrovsky V.A..Guvakova М.А..Lavrovaky Y.V.High frequency of tumour cell reversion to nontumorigenic phenotype // Eur.J. Cancer.-1992.-v.28,N 1.-P.17-21.