Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза

Загоскина, Татьяна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза"

На правах рукописи

" Н

А 5

ЗАГОСКИНА Татьяна Юрьевна

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ТВЕРДОФАЗНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 2004 г.

Работа вынолнеиа в Иркутском ордена Трудового Краспого Зиамеии паучпо-всследовагельском противочумном институте Сибири и Дальпего Востока Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

Засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Голубииский Евгсиий Павлович.

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Марков Евгений Юрьевич.

Официальные оппонеиты:

Доктор медицинских наук, профессор Тимченко Нелли Федоровна.

Доктор медицинских наук, профессор Чубепко Галина Ивановна.

Доктор медицинских наук Воронцова Галина Марковна.

Ведущая организация: Научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья (г. Ставрополь)

Защита состоится « Мь> ЛнЯсугЛ- 2004 г. в « часов на заседании Специализированного диссертационного совета Д 208.007.02 Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690950, г. Владивосток, ул. Острякова, 2, корпус 3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Владивостокского медицинского университета

Автореферат разослан «,

2003 г.

Ученый секретарь Специализированного Р.Н Диго

диссертационного совета )

кандидат медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллез - одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека и животных - выявлен на всех обитаемых континентах земли (Corbel M.J., 1997). Тревожным свидетельством глобального распространения этой болезни стало обнаружение в последние годы естественно инфицированных возбудителем бруцеллеза морских животных -китов, дельфинов, тюленей и других (Foster G. et al., 1996; Jahans K.L. et al., 1997; Cloeckaert A. et al., 2000). В бывшем СССР и России заболевания людей и животных бруцеллезом зарегистрированы практически во всех регионах (Калиновский А.И. и др., 2001; Таран И.Ф., Лямкин Г.И., 1996).

В последние годы серьезное внимание уделяется возбудителю бруцеллеза как возможному эффективному средству биологического терроризма (Korte-peter M.G., Parker G.W., 1999; ZoonK.C., 1999).

Полигостальность бруцеллеза, полиморфизм возбудителя, хроническое, часто бессимптомное течение заболевания у животных и разнообразие клинических проявлений у людей делают его трудно диагностируемым, что в свою очередь отражается негативно на своевременности начала и, следовательно, - качестве лечения больных.

Серьезную проблему при проведении лабораторной диагностики бруцеллеза представляет факт сходства некоторых антигенов бруцелл, ряда других патогенных и сапрофитных микроорганизмов и даже органов и тканей человека и животных (Ефременко В.И. и др., 2001; Paulsen I.T. et al., 2002). Спектр и структура перекрестно реагирующих антигенов, особенно тех из них, которые локализованы на поверхности клетки и в силу этого определяют особенности как специфического, так и неспецифического взаимодействия, нуждаются в дальнейшем тщательном изучении. Актуальна проблема изыскания надежных критериев оценки выраженности и значения перекрестных реакций, а также поиск способов их минимизации.

Основным способом лабораторного подтверждения диагноза бруцеллеза человека и животных на протяжении многих лет является серологическое обследование, предусматривающее постановку в разных сочетаниях роз-бенгал и кард-тестов, реакций Хеддльсона, Райта, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации, Кумбса, которые могут быть дополнены реакциями иммунодиффузии, непрямой иммунофлуоресценции (Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, 1986).

достаточно высокую чувствительность и в то же время - технологичность изготовления диагностикумов, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Предложенная в последние годы для диагностики бруцеллеза полимеразная цепная реакция (Шестопалов М.Ю. и др., 1997; Балахонов C.B., 2000) во многом соответствует этим критериям, но, к сожалению, может быть реализована лишь в хорошо оснащенных лабораториях.

В 70-80-х годах прошлого столетия внимание привлекла идея использования иммунохимических методов обнаружения антигенов возбудителя бруцеллеза и антител к ним. В числе первых из них стали иммунофермент-ный анализ (Голубинский Е.П. и др., 1982; Меринов С.П. и др., 1984., Carlson Н.Е. et al., 1976; Hurvell В., 1978) и дот-иммуноанализ (Roop R.M. et al., 1987; Chand P. et al., 1989).

Важной тенденцией в диагностической медицине в последнее время является внедрение в практику методов анализа "доктор-офис", позволяющих без значительных затрат на приобретение оборудования и обучение персонала, получать информацию в кабинете врача, в домашних или полевых условиях.

В связи с этим остаются актуальными задачи формулирования основных принципов конструирования и применения альтернативных агглютина-ционным твердофазных тест-систем, подбора наиболее подходящих для них иммуносорбентов, эффективных иммунореагентов и маркеров.

Цель исследования - разработка методологических подходов к конструированию твердофазных иммунохимических тест-систем и оценка пригодности их использования для диагностики бруцеллеза.

Задачи исследования:

• оценить возможность и эффективность использования в диагностических твердофазных тест-системах поверхностных антигенных комплексов или индивидуальных антигенных фракций возбудителя бруцеллеза;

• изыскать надежные методические подходы к получению высокоактивных противобруцеллезных S- и R-сывороток, пригодных для использования в качестве источника специфических IgG при конструировании чувствительных и специфичных твердофазных иммунохимических тест-систем;

• разработать методические основы конструирования и применения диагностических тест-систем (иммуноферементной, иммуноэритроадсорбцион-ной и вариантов дот-иммуноанализа) применительно к бруцеллезу;

• оценить эффективность применения разработанных диагностических тест-систем на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте проведена комплексная оценка пригодности поверхностных антигенных фракций бруцелл

для конструирования твердофазных диагностических тест-систем на бруцеллез (а.с. №316008 от 01.07.90 г.; патент № 2051963 от 10.01.96 г.).

Разработаны методические приемы и предложены рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сывороток против корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл в гладкой и шероховатой формах (патент № 2051963 от 10.01.96 г.). Впервые предложена схема получения высокоактивной агглютинирующей сыворотки против очищенного ЛПС бруцелл (патент № 20010577 от 15.04.94 г.).

Одними из первых в стране разработаны методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроадсорбционной тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью исследовать экспериментальный, клинический и полевой материал на присутствие возбудителя бруцеллеза в Б- и 11-формах, растворимых антигенов бруцелл и антител к ним. По результатам государственных межведомственных комиссионных испытаний (г. Москва, 1985 г.) иммуноферментная тест-система признана соответствующей отраслевым медико-биологическим требованиям.

Впервые отработаны методические подходы к конструированию диагно-стикумов для дот-иммуноанализа с использованием специфических белка А стафилококка и поверхностных антигенных фракций бруцелл, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения возбудителя бруцеллеза и его антигенов, а также противобруцеллезных антител. Показана возможность исследования с золотосодержащими диагностическими препаратами экспериментального и клинического материала.

Впервые разработаны и апробированы на экспериментальном и клиническом уровне методические основы конструирования диагностикумов для дот-иммуноанализа с использованием в качестве маркеров специфических и антигенных фракций бруцелл частиц коллоидного серебра для детекции корпускулярных и растворимых антигенов возбудителя бруцеллеза и антител к ним (патенты №№ 2202798,2202799 и 2202800 от 20.04.03 г).

Впервые предложена методика приготовления угольного диагностикума для проведения дот-иммуноанализа на стрипах с целью скрининга сывороток на наличие противобруцеллезных антител.

Теоретическая и практическая значимость диссертации

вании рациональности выбора конкретных твердофазных методов лабораторной диагностики бруцеллеза из числа альтернативных; разработке методических приемов конструирования диагностических тест-систем с использованием в качестве маркеров специфических иммунных реагентов различных молекулярных и корпускулярных меток.

Как теоретическое, так и практическое значение имеют материалы изучения иммунохимических свойств антигенов бруцелл с точки зрения возможности использования их в качестве специфических зондов при конструировании антигенных диагностикумов для различных серологических реакций, для получения высокоактивных антисывороток, иммуноаффинной изоляции специфических антител, количественной оценки содержания антигена в исследуемом материале и т.д.

В связи с тем, что существующие коммерческие агглютинирующие бруцеллезные антисыворотки в виду их невысокой специфической активности не пригодны для использования в твердофазных иммунохимических тест-системах, разработанные методические приемы и рекомендованные рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сывороток против корпускулярных и растворимых антигенов Б- и Л-бруцелл позволяют получать в достаточном количестве специфические антитела, пригодные для использования в нативном состоянии или в виде отдельных фракций для конструирования диагностических препаратов.

Разработанные методические подходы и принципы конструирования твердофазных иммунохимических диагностических тест-систем с применением в качестве маркеров специфических иммунных реагентов молекулярных и корпускулярных неорганических меток позволяют использовать их не только для приготовления высокочувствительных, специфичных диагностических препаратов на бруцеллез, но и применительно к другим особо опасным инфекциям, в частности, - чуме и туляремии (патент № 2203496 от 27.04.03 г.).

По результатам исследований составлены две инструкции и 12 методических рекомендаций, 2 из которых утверждены на федеральном уровне, получено 7 патентов и авторских свидетельств на изобретения, оформлено 9 рацпредложений. Наши разработки внедрены в практику научно-исследовательского противочумного института Кавказа и Закавказья (г. Ставрополь), Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск), Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока (г. Магадан), Института ветеринарной медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова (г. Саратов), Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов), Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (г. Саратов). Хабаровской противочумной станции (г. Хабаровск).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность эффективного использования в диагностических твердофазных тест-системах поверхностных антигенных комплексов или индивидуальных фракций возбудителя бруцеллеза.

2. Методические подходы и рациональные схемы получения высокоактивных специфических S- и R-сывороток против корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл, критерии оценки их пригодности для конструирования диагностических препаратов.

3. Конъюгирование отдельных антигенных фракций бруцелл со шлепперами, а также сочетанное введение животным комплекса Аг=Ат с феракрилом способствует резкому повышению эффективности иммунизации.

4. Методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроадсорбционной тест-систем, обеспечивают высокую эффективность обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов возбудителя бруцеллеза в гладкой и в шероховатой формах, а также антител к ним в экспериментальных и в полевых условиях.

5. Разработанные методические подходы позволили использовать в процессе конструирования препаратов для диагностики бруцеллеза неорганические маркеры (частицы коллоидных металлов - золота, серебра - и углерода). Полученные тест-системы высокочувствительны, специфичны, универсальны (обнаружение антигенов и антител в экспериментальном и клиническом материале), экспрессны, демонстративны и высоко информативны.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V монголо-советской конференции по профилактике чумы и других особо опасных инфекций. Улан-Батор, 1982; Втором международном конгрессе по эндотоксину (2nd Congress of the International Endotoxin Society). Вена, 1992; Международном симпозиуме "Мониторинг здоровья населения и окружающей среды. Технология и информационные базы данных - 2001". - Греция, о. Крит, 2001; Международной научно-практической конференции "Современный эпидпотенциал природных очагов чумы". Алматы, 2001; Международных научных конференциях (Natural Infectious diseases). Ulaanbaatar, 2001, 2002; Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Москва, 1982; Всесоюзной научной конференции специалистов противочумных учреждений "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций". Иркутск, 1984; Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций", Ставрополь, 1986; I Всесоюзной научно-практической конференции по иерсиниозам. Владивосток, 1986; Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным". Новосибирск, 1989; Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых инфекци-

онных болезней. Иркутск, 1994; Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1993; VII съезде ВОЭМП. М., 1997; 2й Всероссийской конференции "Гомео-стаз и инфекционный процесс". Саратов, 1998; Объединенной научной сессии Общего собрания Сибирского отделения РАМН "Новые медицинские технологии". Новосибирск, 2000; Юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". Оболенск, 1999; научной конференции "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций". Ставрополь, 1991; научно-практической конференции "60 лет противочумной службы Кавказа. Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний". Ставрополь, 1995; научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". Новосибирск, 1998; региональных научных конференциях "Медико-биологические проблемы Восточной Сибири". Иркутск, 1988, "Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке". Чита, 1993 и "Актуальные проблемы санитарно-каран-тинной службы на транспорте Дальневосточного региона", Владивосток, 2003; научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. 1982-2003 гг.

Публикации. Содержание работы отражено в 63 научных публикациях, из которых 25 опубликованы в ведущих научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК России для публикации основных научных результатов докторских диссертаций, 10 - в материалах международных и 14 - Всесоюзных - Российских конференций, симпозиумов в зарубежных, центральных и региональных изданиях, сборниках трудов конференций; 7 заключительных отчетах; в Государственном реестре изобретений РФ зарегестрировано 7 патентов. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Основные материалы диссертации получены лично автором. По отдельным разделам работу проводили совместно с сотрудниками биохимического отдела, отдела зоонозных инфекций, лаборатории диагностических сывороток, музея живых культур Иркутского противочумного института, научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (пос. Кольцово Новосибирской области).

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 8 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения по работе, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Общий объем диссертации 260 страниц. Текст иллюстрирован 43 таблицами и 20 рисунками. Список литературы содержит 215 отечественных и 514 иностранных источников. Материалы представлены в 7 научных отчетах по плановым темам НИР, выполненным при участии автора в качестве исполнителя, ответственного исполнителя или руководителя.

Краткое содержание работы

Литературный обзор представлен в 1 главе, где обобщены материалы об антигенном спектре бруцелл, обсуждены вопросы общности отдельных антигенных детерминант возбудителя бруцеллеза с аналогичными структурами ряда патогенных и сапрофитных микроорганизмов, пригодности и перспективности использования отдельных антигенных фракций бруцелл для конструирования диагностических препаратов. Подробно рассмотрены используемые в настоящее время в медицинской и ветеринарной лабораторной практике методы исследования разнообразного материала, предназначенные как для обнаружения самого инфекционного агента или его антигенов, так и для выявления специфических антител.

Сведения об использованных материалах и методах изложены во 2 главе. Отдельные оригинальные методики представлены в соответствующих разделах третьей-восьмой глав.

Штаммы. В работе использовали 58 штаммов бруцелл, их которых 11 -Brucella melitensis (1-3 биоваров), 15 - В. abortus (1-9 биоваров), 10 - В. suis (1-3 биоваров), 10 - В. rangiferi, 2 - В. neoíomae, 9 - В. ovis и 1 - В. canis. Бру-целлы каждого вида представлены референтными штаммами. Для контроля специфичности диагностических тест-систем использовали штаммы гетеро-логичных бактерий: Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, У. enterocolitica 0:3 и 0:9, Francisella tularensis, Vibrio cholerae, Shigella flexneri, Salmonella typhi-murium, Escherichia coli, Proteus vulgaris. Все штаммы микроорганизмов получены из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока и обладали типичными для представителей соответствующих видов биологическими свойствами.

Диагностический материал. Объектами исследования служили образцы сывороток крови здоровых, больных и вакцинированных людей, сывороток крови и внутренних органов домашних и диких животных, грызунов, панты северных оленей (всего 7500 проб), 250 проб из искусственно и естественно инфицированных объектов внешней среды. Экспериментальный материал включал суспензии внутренних органов и сыворотки крови от кроликов (400), морских свинок (350), белых мышей (80). Всего исследовано 8580 проб.

Микробиологические методы. В разделе содержится описание бактериологических методов, использованных при культивировании и изучении свойств возбудителей бруцеллеза и гетерологичных микроорганизмов.

Для приготовления ацетонвысушенных клеток (и одновременной инактивации) микробную массу заливали трехкратным объемом охлажденного до 4°С ацетона и инкубировали б сут со сменой ацетона через 48 ч. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали на воздухе и измельчали в фарфоровой ступке.

Обеззараживание микробной взвеси осуществляли также обработкой в течение 24 ч цетилтриметиламмонийбромидом (цетавлоном) (Serva, ФРГ) в конечной концентрации 2% и раствором мочевины в конечной концентрации 4.5%.

Препаративные методы. Клеточные оболочки получали дифференциальным центрифугированием суспензии бруцелл, разрушенных на УЗ-дезинтеграторе, с последующей их обработкой панкреатическими РНК-азой и ДНК-азой (Марков Е.Ю., 2000).

Поверхностные антигенные фракции получали экстракцией ацтонвысу-шенных бруцелл 5, 8 и 10%-ными растворами NaCl при 65, 42 и 37"С (Голу-бинский Е.П. и др., 1988; Загоскина и др., 1989; Методические рекомендации..., 2001).

ЛПС S-бруцелл изолировали путем водно-фенольной экстракции (Moreno Е. et al., 1979; Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982; Львов В.А. и др., 1985); экстракцией смесью фенол-уксусная кислота-вода, тритоном Х-100, солянокислым гуанидином, 8 М мочевиной (Stone S. et al., 1982); трихлоруксусной кислотой по методу Буавена в модификации Е.А. Драновской (1978); толуолом с последующим фракционированием сульфатом аммония (Baker Е.Е. et al., 1947); хлоридом и цитратом натрия (Raynaud М., Digeon М., 1949); автокла-вированием с последующей гельфильтрацией (Berman D.T. et al., 1980). R-ЛПС получали водно-фенольной экстракцией клеток штамма В. ovis H-58R с дальнейшим осаждением препарата этанолом и гель-фильтрацией через се-факрил S-300 (Moreno Е. et al., 1979).

БПА выделяли из клеток бруцелл уксуснокислым гидролизом с последующим осаждением этанолом по методу В. White (1931) в модификации П.А. Вершиловой, Е.А. Драновской (1976).

Фракции белков наружных мембран выделяли из клеточных оболочек бруцелл согласно I. Moriyon, D.T. Berman (1982), D.R. Verstreate et al. (1982) в нашей модификации (Голубинский Е.П. и др., 1989).

Поверхностные антигены, экстрагируемые с помощью цетавлона, получали по методике М.С. Blake, Е.С. Gotschlich (1982) в модификации Е.Ю. Маркова (2000).

Деградированный липополисахарид (ДПС) получали гидролизом очищенного ЛПС в растворе уксусной кислоты (Moreno Е. et al., 1981), нативный гаптен - в соответствии с методикой L. Fernandez-Lago et al. (1982).

Очистку ЛПС проводили с применением гельфильтрации через сефакрил S-300 (Львов В.А. и др., 1985), обработки ферментами с последующим ультрацентрифугированием (Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982), ионообменной хроматографии на ДЭАЕ-тойопале 650 М (Ременцова М.М. и др., 1975), аффинной хроматографии на бромциан-активированной сефарозе 4 В, содержащей антитела против чЛПС (Руослахти Э., 1979; Issekuts А., 1983),

5-кратной обработки диметилсульфоксидом с последующими ультрацентрифугированием и гельхроматографией (Moreno Е. et al., 1979), обработки ультразвуком с последующим дифференциальным центрифугированием (Kreutzer D.L., Robertson D.C., 1979).

Химические и физико-химические методы. Содержание в препаратах белка определяли по методам И.О. Lowry et al. (1951) и М.М. Bradford (1976) (стандарт - БСА), гексоз - в реакции с фенолом (Хансон Р., Филлипс Дж., 1984) (стандарт - глюкоза) после гидролиза препаратов в 2 н. растворе серной кислоты в течение 2 ч при 95°С, суммарное количество нуклеиновых кислот -спектрофотометрически по A.C. Спирину (1958) (стандарт - РНК производства НПО "Биолар", г. Олайне) с предварительным удалением на холоду кисло-торастворимых (0.5 н. НСЮ4) компонентов из анализируемого материала, КДО - по методу Y.D. Karkhanis et al. (1978), ЛПС - колориметрическим методом в реакции с карбоцианиновым красителем "Stains all" (Serva, ФРГ) (J. Janda, E. Work, 1971).

Аминокислотный состав белковосодержащих комплексов изучали на аминокислотном анализаторе AAA-88I (ЧССР). Образцы предварительно гидролизовали в 6 н. HCl при 110°С в учение 24 ч. Калибровочным стандартом служил раствор аминокислот "ВДН" (Англия).

Состав жирных кислот липидного компонента ЛПС определяли методом газожидкостной хроматографии на установке Хром-4 (ЧССР). Образцы предварительно гидролизовали в смеси (1:5) концентрированной HCl и метанола (100°С, 5 ч). После охлаждения к гидролизату добавляли равный объем дН20 и метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном. Органический растворитель выпаривали, остаток высушивали в вакууме, растворяли в хлороформе и хроматографировали на стальной колонке с 10%-ным полиэти-ленгликольсукцинатом. Температура термостата - 200°С, газ-носитель - гелий, скорость потока водорода - 26 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин.

Гетерогенность препаратов определяли в диск-электрофорезе (Маурер Г., 1971), ДСН-электрофорезе (Laemmli U.K., 1970) в 12.5% полиакриламидном геле. Электрофореграммы окрашивали на белки кумасси R-250 (Fairbanks G. et al., 1971), на углеводы - ионами серебра (Tsai С.М., Fresch С.Е., 1982).

Центрифугирование ЛПС в градиенте плотности сахарозы (0.77, 1.44 и 2.02 М) проводили в течение 16 ч при 7°С (Schnaitman С.А, 1970).

Электрофоретический анализ антигенных препаратов проводили в блоках гомогенных (10% и 12.5% акриламида) и градиентных (5-20% акриламида) полиакриламидных гелей в присутствии ДСН с последующей окраской на белки кумасси ярко-синим R-250 (Serva, ФРГ) (Laemmli U.K., Favre М., 1973).

Иммунохимические методы. Наличие антигенов в различных фракциях определяли в реакции иммунодиффузии и одномерном иммуноэлектрофорезе (Марков Е.Ю., Хавкин Э.Е., 1981; Crowle A.J., 1973), иммуноблотинге

(Towbin H. et al., 1979), твердофазных иммуноферментном, иммуноэритроад-сорбционном методах и дот-иммуноанализе с частицами коллоидных металлов (золото, серебро) с использованием кроличьих гипериммунных антисывороток и очищенных IgG. Последние изолировали фракционированием сульфатом аммония и каприловой кислотой (McKinney М.М., Parkinson А., 1987); осаждением сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией через ДЭАЭ-целлюлозу 52 (Жатон Ж.-К. и др., 1981); аффинной хроматографией с использованием протеин А-сефарозы 4В (Закревский В.И. и др., 1982); ионообменной хроматографией через ДЕАЕ-АШ Gel Blue (бюллетень фирмы Bio-Rad № 115). F(ab')2 фрагменты кроличьего IgG получали путем его ферментативного гидролиза с последующей гель-фильтрацией (Farr A.G., Nakane Р.К., 1981).

Усложнение структуры антигенных фракций бруцелл осуществляли конъюгированием с одним из высокомолекулярных соединений: протамин-сульфатом натрия (ПрС), бычьим сывороточным альбумином (БСА), поливи-нилимидазолом (ПВИ), частицами коллоидного золота (КЗ).

Сшивание антигенов с ПрС и БСА осуществляли при помощи 5%-ного водного раствора глутарового альдегида (Голубинский Е.П. и др., 1991). Связывание антигенов с ПВИ и КЗ проводили путем простой адсорбции.

В качестве молекулярных меток при конструировании диагностикумов для ИФА использовали щелочную фосфатазу (Sigma, США), уреазу (Merk, ФРГ), пероксидазу хрена (Serva, ФРГ и Олайненского завода химреактивов) и пенициллиназу (Московского экспериментального завода ВНИИА).

В работе испытаны следующие методы конъюгации белка с ферментом: IgG=lll® - Е. Engvall, Р. Perlmann (1971); S-IgG=ypea3a - Н.М. Chantier с со-авт., (1982); S-IgG=neHHU№uinHa3a - И.Б. Шимко с соавт. (1989); S-IgG=nX -P.K. Nakane, A. Kawaoi (1974), S.T. Avrameas et al. (1978), M.B. Wilson, P.K. Nakane (1978), A.G. Fan, P.K. Nakane (1981), M. Imagawa et al. (1982); F(ab')2-ПХ - A.G. Fan, P.K. Nakane (1981).

Субстратом для щелочной фосфатазы служил паранитрофенилфосфат (Serva, ФРГ), уреазы - мочевина (Реахим, СССР), пероксидазы - ортофени-лендиамин, 2.2-дианизидин, З.З-дианизйдин, 3.3-диаминобензидин (все фирмы Serva) или 5-аминосалициловая кислота (Реахим, СССР), пенициллиназы - иодинол с Na- или К-бензилпенициллином (Медфарм, Россия).

В иммуноэритроадсорбционном анализе в качестве оптически плотной корпускулярной метки использовали эритроциты крови человека, животных (баран, лошадь, морская свинка) или птиц (петух, курица, индюк, гусь).

Конъюгаты IgG=03-TA, IgG=C3-rA, IgG=C3-nH-T-500, ДО=СЭ-ПЭГ готовили по разработанной нами методике (Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., 1989), IgG=C3-CrCl3 - по методу M. Steinitz, S. Tamir (1985).

Агрегированную противобруцеллезную сыворотку конъюгировали с эритроцитами (АПС-ГА=СЭ) согласно рекомендации Е.А. Драновской и др. (1986).

Золь золота готовили кипячением раствора золотохлористоводородной кислоты (Sigma, США) с цитратом натрия (Хомутовский O.A. и др., 1986). Монодисперсную суспензию золота насыщали IgG или антигенами в соответствии с рекомендациями I. Raska (1988) в нашей модификации (Загоскина Т.Ю.идр., 1998,1999).

Приготовление коллоидного серебра и его нагрузку IgG и антигенами бруцелл проводили по методике А.Г. Полтавченко с соавт. (1998) в нашей модификации (Загоскина Т.Ю. и др., 2001,2002).

Подготовку углеродного маркера и его связывание с антигенной фракцией осуществляли в соответствии с рекомендациями А.Г. Полтавченко с соавт. (1997) в нашей модификации (Загоскина Г.Ю. и др., 2002).

Дот-иммуноанализ выполняли на нитроцеллюлозной мембране (Serva, ФРГ) или фильтрах "Synpore" (Хемапол, Чехия).

Серологические методы. Постановку традиционных серологических реакций на бруцеллез (реакций Райта, Хеддльсона, Кумбса, РПГА, РДСК) осуществляли согласно "Методическим рекомендациям по бруцеллезу" (Пини-гин А.Ф., Петухова О.С., 1978).

Статистическую обработку материалов исследования проводили общепринятыми методами, рассчитывая среднеарифметические величины, их средние ошибки, доверительный интервал и достоверность различий по критерию Стьюдента (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962), Результаты считали достоверными при вероятности ошибки не более 0.05 (р<0.05) по отношению к контролю. При определении химического состава ошибка измерения не превышала 5%. Титры антител выражали в виде прямых значений разведения сыворотки или в средних геометрических величинах (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

3. Получение и характеристика поверхностных антигенных фракций бруцелл и специфических антител

До настоящего времени среди исследователей нет единодушия в выборе какой-либо определенной антигенной фракции или конкретного антигена в качестве специфического лиганда при конструировании иммунохимических тест-систем для серодиагностики бруцеллеза: одни рекомендуют использовать ЛПС (иммунодоминантый антиген бруцелл) или продукты его деградации (О-ПС, ДПС), считая этот комплекс самым иммунологически активным, обеспечивающим наиболее высокую чувствительность анализа. Другие изыскивают альтернативные подходы, поскольку большинство перекрестно реагирующих антигенных детерминант расположено на ЛПС. Наиболее перспективными в этом плане представляются протеиновые фракции бруцелл

или отдельные полипептиды с определенной молекулярной массой. Однако и здесь единого мнения не существует. В связи с этим проблемам выбора наиболее подходящей специфической антигенной фракции мы уделили достаточно серьезное внимание. В число исследованных антигенов вошли клеточные оболочки бруцелл и их составляющие (ЛПС, ДПС, БПА), белковополи-сахаридные и белковые фракции наружных мембран (всего 31 препарат).

Поскольку ЛПС как иммунодоминантный компонент микробной клетки довольно широко используется исследователями при проведении серологической диагностики бруцеллеза, мы уделили повышенное внимание изучению этого антигенного комплекса. Из множества методов выделения и очистки ЛПС грамотрицательных бактерий наиболее эффективным в отношении бруцелл является экстракция фенольно-водными смесями, которая обеспечивает, особенно при исполнении по схеме Е. Moreno et al. (1979), наибольшее содержание (до 91.1%) и высокую антигенную активность препарата. Другие испытанные реагенты (ТХУ, насыщенный толуолом гипертонический раствор NaCl, растворы хлорида и цитрата натрия) по экстрактивной способности в отношении ЛПС бруцелл существенно уступают фенольно-водной смеси. Не способствуют эффективной изоляции ЛПС и водные растворы мочевины, солянокислого гуанидина и тритона Х-100. При всех достоинствах серьезным недостатком фенольно-водной экстракции ЛПС бруцелл является продолжительность йроцедуры получения очищенного препарата. С учетом этого обстоятельства мы апробировали на бруцеллах разных видов эффективный альтернативный метод, позволивший существенно ускорить процедуру изоляции очищенного ЛПС S-бруцелл. Метод основан на разной растворимости белков в двухфазной системе, образуемой при прогревании белкового раствора в присутствии тритона Х-114, в результате чего ЛПС сосредоточивается в детергентной, а белки и нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе (Марков Е.Ю., 2000). Более эффективна, но и значительно более трудоемка очистка нЛПС 5-кратным осаждением ДМСО и переосаждением метаноловым реагентом с последующей гельфильтрацией на колонке с се-факрилом S-300 (Moreno Е. et al., 1979), а также обработкой нуклеазами и протеазами с последующей гельфильтрацией через сефакрил S-300.

Путем уксуснокислого гидролиза ЛПС (Moreno Е. et al., 1981) получен ДПС, состоящий, в основном, из углеводов и в минимальных количествах -белка, НК и ЛПС.

БПА - белковополисахаридный антиген (бруцеллезный протективный антиген по П.А. Вершиловой, Е.А. Драновской, 1975) получен путем уксуснокислого гидролиза бруцелл. При наличии определенных особенностей, индивидуально присущих ЛПС и БПА, можно выделить и некоторые свойства, которые сближают их между собой. В частности, оба препарата активно взаимодействуют со специфическими антителами, в том числе в со-

ставе конъюгатов IgG=4>epMeHT, IgG=3pmpouHTbi, ^С=коллоидное золото, 1§0=коллоидное серебро, что послужило в дальнейшем основанием для их использования в качестве препаратов для положительных контролей при постановке твердофазных иммунохимических реакций; испытания в качестве специфических иммунных реагентов (сенситинов) наряду с другими антигенными фракциями бруцелл для конструирования антигенных диагностику-мов (эритроцитарных, с частицами коллоидных металлов или активированного угля), а также для приготовления иммуносорбентов при обнаружении противобруцеллезных антител в ИФА. С учетом определенного сходства физико-химических, иммунохимических и биологических свойств ЛПС, ДПС и БПА мы предположили, что в состав БПА входит преимущественно не на-тивный, а деградированный ЛПС. Основанием для такого заключения послужила общность методологии получения БПА и ДПС, основанной на применении уксуснокислого гидролиза. Принципиальное технологическое различие состоит лишь том, что кислотный гидролиз при изоляции ДПС осуществляется на этапе чЛПС, а БПА - целой клетки. Это обстоятельство закономерно приводит к тому, что при сходстве этих препаратов по химическому и антигенному составу БПА отличается от ДПС заметно большим содержанием балластных компонентов, которые определяют различия между ними в им-муногенных свойствах.

Кроме указанных препаратов, мы изолировали, изучили и апробировали в различных иммунохимических реакциях и диагностических тест-системах около трех десятков поверхностных антигенных комплексов и индивидуальных антигенов бруцелл. В их число вошли клеточные оболочки; экстракты, полученные при воздействии на S- и R-клетки различных химических реагентов (хлористого натрия, мочевины, цетавлона, солянокислого гуанидина); белковые компоненты наружных мембран, изолированные воздействием и последующим фракционированием ионными детергентами (ДОХ, ДСН) при разной температуре; нативный гаптен. Выделенные препараты представляют собой полимерные комплексы, включающие липид, полисахарид в сочетании с варьирующим количеством белка и нуклеиновых кислот. В большинстве препаратов определен КДО, что является косвенным доказательством присутствия в них ЛПС. Отмечена определенная пропорциональность содержания в исследованных фракциях КДО и ЛПС, которые в наибольшем количестве выявлены в КО, несколько меньше - в солевых и мочевинных экстрактах и значительно меныце - в цетавлоновом супернатанте, 8%-ном "горя-чем"солевом экстракте, белках наружных мембран, экстрагированных ДОХ (37°С).

ЛПС бруцелл в шероховатой форме {В. ovis И-58) существенно уступают S-ЛПС по содержанию углеводов, что согласуется с литературными данными (Moreno Е. et al., 1979, 1984). Обращает особое внимание наличие во всех

фракциях (солевых, мочевинных) R-бруцелл S-ЛПС. Это обстоятельство позволяет понять причину неудачных попыток некоторых исследователей использовать R-бруцеллы для получения с диагностической целью препаратов, не контаминированных S-ЛПС.

Все антигенные фракции, изолированные из бруцелл в гладкой и шероховатой формах, хотя и с разной активностью, взаимодействуют со специфическими IgG противобруцеллезных сывороток. При проверке антигенной активности выделенных препаратов установлено, что наиболее активным является ЛПС бруцелл, который в ИФА выявляется в наименьшей по сравнению со всеми остальными фракциями концентрации: 1.0-5.0 нг/мл. Это явление совершенно понятно, если учесть, что при инфицировании человека или животных бруцеллами основной пул вырабатываемых антител направлен против ЛПС как наиболее токсичного компонента клетки. Достаточно высокую антигенную активность проявили БПА, мочевинный и цетавлоновый супернатанты, солевые экстракты. С меньшей активностью взаимодействовали со специфическими антителами БНМ, ДПС, НГ, а также ЛПС и белковые фракции, изолированные из бруцелл в R-форме (табл. 1).

Оценку диагностической значимости полученных антигенных фракций проводили, анализируя их способность взаимодействовать как со специфическими (противобруцеллезными), так и с гетерологичными (коммерческие агглютинирующие кроличьи сыворотки против возбудителей туляремии, чумы, псевдотуберкулеза, кишечных иерсиниозов 0:3 и 0:9, лептоспироза, дизентерии, сальмонеллеза, холеры) антителами в дот-иммуноанализе с сереб-росодержащим маркером. Антитела в бруцеллезных антисыворотках обнаруживались при разведениях последних в диапазоне 8-10'2-10'7. Большая часть поверхностных антигенных фракций бруцелл перекрестно реагировала, хотя и с разной активностью, с гетерологичными антителами. Установлено, что антигенные фракции бруцелл, в большей степени контаминированные ЛПС, обусловливают меньшую специфичность диагностических тест-систем, сконструированных на их основе, а больший удельный вес в препаратах полипептидов м.м. 18-36 кДа, обеспечивают более высокую специфичность. Интересным является факт наличия неспецифического взаимодействия (в ряде случаев в сравнительно высоких титрах) части сывороток крови доноров (гипотетически свободных от бруцеллеза и не подвергнутых специфической вакцинации) с большинством антигенных фракций бруцелл. Это явление не нашло достаточного отражения в специальной литературе, хотя имеются данные, свидетельствующие об антигенной общности возбудителей бруцеллеза, чумы, холеры, патогенов растений, с одной стороны, и органов и тканей человека и животных, - с другой (Ефременко В.И. и др., 2001; Paulsen I.T. et al., 2002).

Таблица 1. Антигенная активность поверхностных фракций бруцелл

Исследуемая фракция Концентрация Аг по данным ИФА (нг/мл)

KO(S) 18.5±1.5

S-ЛПС (фенольная фаза) (Moreno Е. et al., 1979) 1.0±0.05

Водная фаза (Moreno Е. et al., 1979) 37.0±2.6

R-ЛПС (Moreno Е. et al., 1984) 150.0±12.0

дпс 37.0±2.6

БПА 9.2±0.7

НГ 150.0±12.0

ТХУ-экстракт 18.5±1.5

"Холодный" фенольно-водный экстракт (Захарова И.Я., Ко-сенко Л.В., 1982) 4.6±0.4

"Горячий" фенольно-водный экстракт (Захарова И.Я., Косен-коЛ.В., 1982) 2.3±0.2

Фенольно-водный экстракт (Львов В. А. и др., 1985) 2.3±0.2

Экстракт (фенол-уксусная кислота-вода) (Stone et al., 1982) 37.0±1.5

Экстракт (гуанидингидрохлорид) (Stone et al., 1982) 75.0±6.2

Экстракт (тритон Х-100) (Stone et al., 1982) 75.0±6.2

Экстракт (раствор мочевины) (Stone et al., 1982) 37.0±3.0

Экстракт солевой (10% NaCl) (S) 9.2±0.3

Экстракт солевой (10% NaCl) (R) 150.0±4.5

Экстракт солевой (5% NaCl) 9.2±0.3

Экстракт солевой (8% NaCl) 9.2±0.3

Цетавлоновый супернатант 4.6±0.2

Цетавлоновый осадок 37.0±1.5

Мочевинный супернатант 1 (S) 9.2±0.3

2 (S) 9.2±0.3

Преципитат, насыщение (NH4)2S04:

2C/ó 37.0±1.5

40% 75.0±2.3

60% 37.0±1.5

80% 75.0±2.3

БНМ:

фракция ДОХ (37°С) 150.0±4.5

ДСН (37°С) 150.0±12.0

ДСН (56°С) 300.0±6.0

-"- ДСН(100°С) 600.0±12.0

Для сравнения, нормальные кроличьи сыворотки, по нашим данным, аре-активны в отношении антигенов бруцелл.

Из стремления повысить специфичность анализов большинство выделенных антигенных препаратов было дополнительно фракционировано с использованием простейших приемов: гельфильтрации через сефакрил S-300, осаждения сульфатом аммония при разной степени насыщения (20-80%), этанолом, разделения на фазы тритоном Х-114, центрифугирования. Некоторые препараты были обработаны активированным углем, эритроцитами барана и человека. К сожалению, подобные методические приемы в большинстве случаев не решали проблему устранения ложноположительных результатов.

Из числа исследованных антигенов наиболее специфичными оказались цетавлоновый супернатант, экстрагированный из вакцинного штамма В. abortus 19 ВА (специфичность 85.0±4.0%), 8% "горячий" солевой экстракт из вакцинного штамма бруцелл (специфичность 82.0±4.1%) и фракция мембранных белков, изолированная из КО В. abortus И-146 с помощью дезокси-холата натрия при 37°С (специфичность 80.0±3.3%) (перекрестное реагирование с отдельными донорскими сыворотками) (табл. 2).

Менее специфичными (наличие ложноположительных реакций с шигел-лезной и сальмонеллезной кроличьими антисыворотками и рядом донорских сывороток) были 5%-ные "горячие" солевые экстракты (специфичность 75.0±5.0%), выделенные из вакцинного штамма В. abortus 19ВА при температуре 65°С, и водная фаза (водно-фенольный метод выделения ЛПС) (специфичность 79.0±4.7%, взаимодействие с туляремийной, сальмонеллезной и шигеллезной гипериммунными кроличьими и отдельными донорскими сыворотками), а также БПА (специфичность 75.0±5.0%, взаимодействие с кишечной иерсиниозной 0:9, шигеллезной, сальмонеллезной гипериммунными кроличьими и отдельными донорскими сыворотками). Использование в качестве антигена препаратов ЛПС и его фрагмента - ДПС приводило в большинстве случаев к получению ложноположительных результатов с туляремийной, холерной, сальмонеллезной, дизентерийной, иерсиниозной 0:9 и чумными гипериммунными кроличьими антисыворотками некоторых серий и донорскими сыворотками (специфичность 67.0±5.2%). Близкие результаты были получены с мочевинными супернатантами 1 и 2 и ТХУ-экстрактами (специфичность 68.0±5.3%). Антигенные комплексы, изолированные из бруцелл в шероховатой форме, также не были строго специфичны и перекрестно реагировали с большинством гетерологичных кроличьих и донорскими сыворотками, хотя и с разной интенсивностью (специфичность 67.0±5.2%). На-тивный гаптен очень слабо стабилизировал золи коллоидных металлов, вероятно, вследствие наличия в его составе большого количества гидрофоб-

Таблица 2. Оценка специфичности антигенных фракций бруцелл в дот-иммуноанализе с серебросодержащим маркером

Антиген в составе коныогата Ag=KC Источник получения Специфичность Ar (%)

чЛПС В. abortus (S) 67.0±5.2

нЛПС 65.0±5.5

ЦПС 67.0±5.2

БПА 75.0±5.0

ЛПС (тритоновый Х-114) 67.0±5.2

Тритоновая (Х-114) водная фаза 62.0±5.7

Экстракт по Е. Baker et al. (1947) 70.0±5.4

Экстракт по M.Raynaud, М. Digeon (1949) 72.0±4.3

"ГХУ-экстракт по В. White (1931) 68.0±5.3

Экстракты по S.S. Stone et al. (1982):

гуанидингидрохлоридом В. abortus (S) 66.0±5.5

тритоном Х-100 68.0±5.3

10°/о солевой экстракт (37°С) В. abortus (S) 70.0±5.4

В. ovis (R) 70.0±5.4

8% солевой экстракт (42°С) В. abortus (S) 82.0±4.1

5% солевой экстракт (65°С) 75.0±5.0

Водная фаза по Е. Moreno et al. (1979) 79.0±4.7

Мочевинный супернатант 1 70.0±5.4

Мочевинный супернатант 2 70.0±5.4

Мочевинный супернатант 1 P ovis (R) 67.0±5.2

Мочевинный супернатант 2 67.0±5.2

Цетавлоновый супернатант В. abortus (S) 85.0±4.0

Цетавлоновый осадок 70.0±5.4 ■

Белки наружной мембраны:

' ДОХ 37°С В. abortus (S) 80.0±3.3

ДСН 37°С 75.0±5.0

ДСН 5б°С 75.0±5.0

ных молекул, что затруднило оценку его эффективности для использования в дот-иммуноанализе.

Важной проблемой явился установленный нами факт недостаточно прочного связывания препаратов ЛПС с молекулярными и корпускулярными маркерами, в частности, с пероксидазой хрена и частицами коллоидных металлов. Рабочий титр конъюгатов ЛПС=ПХ обычно не превышал 1:40, что не обеспечивало высокой чувствительности определения. Отрицательным моментом использования конъюгатов Аг=коллоидные металлы является небольшой срок сохранения их специфической активности (порядка нескольких дней). Наши данные подтверждают литературные (Raska I., 1988), что прочному связыванию поверхностных антигенов бруцелл с золем золота и серебра препятствует высокое содержание в препаратах гидрофобных молекул, которые слабо стабилизируют золи коллоидных металлов. Поскольку это явление трудноустранимо, мы считаем, что для детекции противобруцеллез-ных антител целесообразнее и проще конструировать твердофазные иммуно-химические тест-системы не на основе антигенов бруцелл, а с использованием антивидовых IgG.

Важным компонентом при конструировании твердофазных иммунохими-ческих тест-систем для детекции антигенов бруцелл являются высокоактивные противобруцеллезные сыворотки. Попытки использования коммерческих агглютинирующих сывороток, производимых в стране, оказались безуспешными из-за относительно низкого титра в них специфических IgG-антител.

Из нативных S-антигенов, апробированных в разных опытах, наиболее высокую активность антисывороток в серологических реакциях обеспечили смесь живых клеток штаммов В. abortus И-146 и В. melitensis 565 (Голубин-ский Е.П. и др., 1988; Загоскина Т.Ю. и др., 1989). При длительной, многократной, подкожной, одномоментно в несколько точек иммунизации кроликов этими антигенами титр антител в сыворотках крови достигал в ИФА не менее 3-Ю"6, в РИД - не менее 1:64. Сыворотки, полученные иммунизацией животных живыми вирулентными клетками S-бруцелл, обладают большей специфической активностью и аффинностью Ат, чем сыворотки, полученные против растворимых Аг бруцелл.

Водно-солевые экстракты наиболее приемлемы при иммунизации кроликов представителем бруцелл в R-форме - В. ovis И-107. Они оказались даже более предпочтительными, чем живые клетки, что, скорее всего, связано с возможностью диссоциации R—>S, имеющей место в организме животного (Пинигин А.Ф., 1976; Репина Л.П., 19S4) и, естественно, изменяющей картину иммунного ответа. Новизна решения подтверждена получением патента (Патент № 2051963, 1996 г.).

Мы попытались отойти от традиционного способа получения гипериммунных сывороток, привлекая для стимулирования антителогенеза вещества, принципиально отличные от полного адъюванта Фрейнда. Повышение эффективности иммунизации было достигнуто модификацией бруцеллезных антигенов путем конъюгирования их с другими высокомолекулярными структурами (БСА, протаминсульфат - ПрС) или адсорбцией на органических (поливинилимидазол) и неорганических (коллоидное золото) носителях, которые сами по себе не обладали антигенными свойствами. Значительное повышение иммуногенности конъюгированных препаратов по сравнению с исходными отмечено у КО=ПрС, нЛПС=ПрС, БПА=ПрС, меньшее - у БПА=БСА и солевых экстрактов=КЗ. Особенно впечатляющий эффект достигнут при иммунизации комплексом очищенного ЛПС В. теШепз1х 16М=1§0 иммунной сыворотки кроликов, которые предварительно получили феракрил. Титр специфических антител в ИФА достигал 7-10"6, в РПГА -1:20480, в РИД - не менее 1:32. В доступной литературе мы не нашли публикаций о получении агглютинирующих сывороток против чЛПС бруцелл с таким высоким титром специфических антител. Оригинальность подхода и новизна решения поставленной задачи подтверждены получением патента (Патент № 2010577, 1994 г.). Конкретные результаты сравнительного изучения специфической активности. антисывороток, полученных при иммунизации кроликов разными антигенными препаратами, суммированы в таблице 3.

Полученные материалы позволили выработать определенную тактику получения сывороток и критерии оценки пригодности их использования для целевого назначения. Главными из них мы считаем то, что конструирование твердофазных иммунохимических тест-систем для детекции Б-бруцелл и их антигенов целесообразнее проводить на основе Ат сывороток, полученных иммунизацией животных (кроликов) живыми вирулентными клетками бруцелл в Б-форме. Титр специфических Ат этих сывороток в ИФА должен составлять не менее 3 10"6, в РИД - не менее 1:64. При детекции Я-бруцелл и их антигенов оправдано использование Ат сывороток против поверхностных растворимых Я-антигенов. Титр специфических Ат этих сывороток должен составлять не менее 8.2-10"5 в ИФА и 1:32- в РИД.

Поскольку чувствительность твердофазных методов лабораторной диагностики определяется степенью чистоты используемого в реакции и, следовательно, плотностью распределения его на поверхности сорбента (Ма-нолов А.Д., 1985; Плаксин Д.Ю., 1986; Марков Е.Ю., 2000), совершенно очевидной была задача изоляции противобруцеллезного максимальной гомогенности. Решение этой задачи состояло в применении относительно несложного, а потому практичного, комплекса методов, включающего осажде-

Таблица 3. Специфическая активность кроличьих антисывороток

Антиген Титры AT

вИФА вРПГА в РИД

Живые клетки В. abortus И-146 и В. melitensis 565 1:3276800(21.8) 1:40960(15.1) 1:64(6.0)

Живые клетки В. abortus 19 ВА 1:409600 (18.9) 1:1024(10.2) 1:16(3.3)

Живые клетки В. ovis И-107 1:51200(15.3) - 1:8(3.0)

КО В. abortus 19 В А 1:51200(16.0) 1:10240(10.5) 1:8 (3.0)

КО В. abortus 19 В А, конъюгнро-ванные с ПрС 1:819200 (19.«) 1:40960(15.1) 1:32(5.0)

Солевой экстракт из В. melitensis 565, В. abortus И-146 и В. suis 1330 1:819200 (19.8). 1:40960(15.1) 1:32 (5.0)

Солевой экстракт из В. ovis И-107 1: 819200 (19.8) - 1:32(5.0)

Горячий солевой экстракт из В. abortus 19 В А +ПАФ 1:819200 (19.7) 1:10240(12.9) 1:32(4.8)

Горячий солевой экстракт из В. abortus 19 ВА+КЗ 1:409600 (18.9) 1:5120(12.0) 1:32(4.6)

Горячий солевой экстракт из В. abortus 19 В А +ПВИ 1:204800 (17.8) 1:2560(11.0) 1:8 (3.0)

О-полисахарид+КЗ 1:204800 (10.5) 1:800 (9.8) 1:8(3.0)

иЛПС В. melitensis 565 и В. abortus И-146 1:51200 (15.8) 1:1024(10.0) 1:8(2.6)

нЛПС В. melitensis 565 и В. abortus И-146, конъютированные с ПрС 1:409600(18.2) 1:2048 (11.1) 1:16(4.0)

чЛПС В. melitensis 565 и 8. abortus И-146 1:20480 (14.8) 1:800(9.7) 1:4(2.0)

чЛПС В. melitensis 16 М с феракрилом 1:6553600(22.4) 1:20480(14.2) 1:32(5.0)

БПА В. abortus 19 В А 1:20480(14.8) 1:400 (8.8) 1:4(2.1)

БПА В. melitensis 565 и В. abortus И-146 1:25600(14.9) 1:800 (9.8) 1:4(2.1)

БПА В. melitensis 565 и В. abortus И-146, конъюгирован-ные с ПрС 1:204800(17.8) 1:6400 (12.9) 1:8 (3.2)

БПА В. melitensis 565 и В. abortus И-146, конъюгирован-ные с БСА 1:204800(17.7) 1:6400.(12.8) 1:8 (3.0)

Примечание: в скобках - средние геометрические титры антител

антител к ним. Преимуществом наших разработок является реализация идеи получения конъюгата Ат=ПХ не только на основе S-IgG, но и R-IgG, а также их смеси. При использовании этой же смеси и для получения твердофазного иммуносорбента создается возможность одновременного выявления S- и R-бруцелл или их антигенов, причем без заметного снижения чувствительности метода (Загоскина Т.Ю. и др., 1993). Это имеет большое практическое значение при работе в смешанных очагах бруцеллеза.

Хорошие диагностические возможности ИФА продемонстрированы нами и при обнаружении противобруцеллезных антител в экспериментальном и клиническом материале. Наиболее репрезентативной признана непрямая модификация ИФА, при которой для сенсибилизации лунок планшета использовали БПА, а иммуноферментные кокъюгаты готовили на основе антивидовых антител (против IgG кролика, барана или человека) и пероксидазы хрена (IgG=nX).

Независимо от объекта исследования, показана высокая чувствительность метода: у иммунизированных животных и больных бруцеллезом людей титр специфических антител в ИФА достигал 8'10'2-10"7. В отдельных исследованных человеческих сыворотках отмечены положительные результаты (в разведениях что обусловлено рядом объективных причин, которые будут проанализированы ниже.

При оценке специфичности непрямого варианта ИФА для обнаружения противобруцеллезных антител с использованием коммерческих и экспериментальных гетерологичных кроличьих антисывороток (чумной, кишечной иерсиниозной 0:3 и 0:9, псевдотуберкулезной, дизентерийной, сальмонел-лезной), лошадиной противотуляремийной сыворотки, а также нормальных кроличьей, лошадиной и человеческих сывороток положительные результаты получены только с сыворотками против возбудителя кишечного иерсиниоза 0:9.

Результаты апробирования нИФА в полевых условиях подтвердили высокую чувствительность, специфичность и информативность ИФА при исследовании сывороток крови человека (1560 проб), северных оленей (75 проб), крупного рогатого скота (250 проб) и некоторых хищных животных (Голу-бинский Е.П. и др., 1982; Меринов С.П. и др., 1984; Карепин Е.Ю. и др., 1991; акты испытаний - в приложении к диссертации) (табл. 5).

При исследовании 5000 свежевзятых пантов северных оленей на базе лаборатории экологии Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока Магаданской области ИФА с нашим диагно-стикумом при определении антигена бруцелл цо чувствительности в 11 раз превосходил РБТ (акт внедрения - в приложении).

Перспективность ИФА как метода экспрессной диагностики бруцеллеза показана нами при выборочном обследовании коренного населения в Били-

Таблица 5. Результаты применения иммуноферментного, иммуноэритроад-сорбционного и гемагглютинационного методов обнаружения антигенов бруцелл при исследовании полевого материала

Объект исследования Количество объектов Количество положительных реакций

ИЭАМ ИФА РНАт

Северные олени 75 30 40 8

Собака 1 1 1 1

Лиса рыжая 1 1 1 1

Крыса серая 2 1 2 1

Полевка рыжая 1 0 0 0

Мышь полевая 6 3 4 2

Мышь домовая 8 4 5 2

Плацента коровы 2 1 1 1

Подстилка коровы 18 10 13 3

Навоз коровий 12 6 7 2

Всего 126 57 72 21

бинском районе Магаданской области (Карепин Е.Ю. и др., 1991). При исследовании в ИФА на наличие антигена образцов органов северных оленей (75 голов), волков и песцов положительные результаты получены в 24.3% от северных оленей и в 45.5% случаев - от хищников. Специфичность результатов подтверждена выделением одного штамма бруцелл (гемокультуры) от человека, 23 штаммов - от северных оленей и одного - от волка. Все штаммы идентифицированы как В. гап§1/еп.

Высокая чувствительность и специфичность иммуноферментного метода обнаружения антигенов бруцелл подтверждена на государственных комиссионных испытаниях подобных тест-систем на базе ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва, 1985 г.).

Стремление иметь параллельную высокочувствительную и специфичную, но более простую и экономически доступную тест-систему послужило основанием для развертывания работ по изысканию других маркеров для имму-нохимических реакций.

5. Иммуноэритроадсорбционный метод обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним

Принципы, лежащие в основе иммуноферментного метода обнаружения антигенов бруцелл, частично заимствованы нами при конструировании им-муноэритроадсорбционного метода индикации возбудителя бруцеллеза и его антигенов. Разработка ИЭАМ определялась, прежде всего, целесообразно-

стью наличия не альтернативной, а параллельной высокочувствительной тест-системы, которая при необходимости могла бы применяться самостоятельно или в комплексе с ИФА и дру1 лми диагностическими методами. Положительным моментом такой тест-системы является ее независимость от импортных и дорогостоящих отечественных реактивов и оборудования, отказ от работы с вредными для персонала и окружающей среды субстратами. Привлекательным элементом ИЭАМ является использование в качестве маркера антител эритроцитов, которые, хотя и страдают известными недостатками, тем не менее, широко применяются в диагностических тестах, хорошо известных работникам практических учреждений.

Принцип ИЭАМ при обнаружении антигенов состоит в том, что специфические антитела, адсорбированные на стенках и- или У-образной лунки твердой фазы, специфически взаимодействуют с искомым антигеном, а последний затем иммунологически связывается со специфическим антителом, меченым эритроцитами. Меченые эритроцитами антитела, вступившие во взаимодействие с антигеном, остаются на стенках иммуносорбента (с образованием регистрируемого визуально "зонтика"), при отсутствии антигена в исследуемом материале эритроциты под действием силы тяжести скатываются на дно лунки, формируя "пуговку" (рис. 1).

П»! • •,»/« у» * „» » !• (•

* > <•<<•(•,<

& * I * р I • *

^ ¡М*

.V £ {ъ:

Рисунок 1. Вид камеры Терасаки с результатами ИЭАМ: ряды б-10 - "зонтики", ряды 1,2- "пуговки" Источником для сенсибилизации твердой фазы и приготовления антительного эритроцитарного диагностикума могут быть использованы те же кроличьи анти-Б- и антиЛ-сыворотки, что и в случае ИФА. В принципиальном плане не имеет каких-либо особенностей техника исполнения двух первых этапов иммуноэритроадсорбционной реакции - приготовление твердофазного иммуносорбента и взаимодействие с ним искомого специфического антигена исследуемого материала. В ИЭАМ в качестве твердой фазы использовали 60-луночные микрокамеры с объемом лунок 20 мкл (камеры Терасаки). Это дало возможность миниатюризовать ИЭАМ-тест, осуществляя его в

микромодификации, что в свою очередь позволило существенно повысить производительность и экспрессность метода. По чувствительности ИЭАМ несколько уступает ИФА, но, тем не менее, позволяет выявлять нанограммо-вые количества растворимых и несколько десятков тысяч КОЕ/мл корпускулярных (Э- и II-) антигенов (2.0-104-5.0-106 КОЕ/мл). Подобно ИФА, ИЭАМ высокоспецифичен и имеет многоцелевой универсальный характер применения, что позволяет использовать его при исследовании разнообразного материала как в лабораторных, так и полевых условиях (Загоскина Т.Ю. и др., 1988, 1989; Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., 1989) (табл. 5). Дополнительным достоинством Б-^О- и Я-^О-эритроцитарных конъюгатов является возможность их использования в РПГА в качестве антительного диагности-кума.

При всех отмеченных достоинствах ИФА и ИЭАМ в обеих тест-системах используются маркеры биологического происхождения, что, несомненно, обусловливает лабильность соответствующих диагностикумов под влиянием разнообразных внешних воздействии и временного фактора.

Не случайно, в последнее время наблюдается тенденция замены биологических маркеров более прочными неорганическими (металлы).

6. Теоретические и практические основы разработки диагностических тест-систем с использованием в качестве маркера частиц коллоидного золота

Характер связи макромолекул с коллоидными частицами металлов сложен и не до конца изучен (Лазка I., 1988). Он определяется рядом параметров, включающих молекулярный вес макромолекул, межфазное напряжение (коллоидные частицы-вода), электрический заряд, растворимость, рН и ионную силу.

В процессе конструирования диагностикумов для дот-иммуноанализа (ДИА) мы теоретически рассчитали и эмпирически подобрали оптимальные условия коньюгирования частиц металлов с каждой используемой антигенной фракцией бруцелл, белком А или ^О, а также ионную силу растворов, обеспечивающую стабилизирующий эффект при связывании макромолекул с поверхностью золотых частиц. Крайне важным являлось определение количества иммунного реагента, адсорбируемого на частицах золя, обеспечивающего стабильность приготовленного комплекса.

Постановка дот-иммуноанализа и учет результатов были традиционны, едины независимо от.используемой в диагностикумах метки (золото, серебро, уголь).

Применение КЗ в твердофазных методах иммуноанализа основано на интенсивной красной окраске этого маркера, позволяющей определять результаты реакции визуально. Более того, чувствительность анализа можно повысить, используя технику усиления окрашивания адсорбированного на мем-

бране золота серебром. Оно основано на реакции, применяемой в фотографии и получившей название физического проявления (Картужанский А.Л., Красный-Адмони Л.В., 1986). "Физический" проявитель содержит, помимо восстановителя (действующего начала традиционного "химического" проявителя), ионы или комплексы металлов, которые осаждаются на центры скрытого или слабого изображения. При гистохимическом серебрении в качестве таких центров выступают гранулы золота. КЗ катализирует восстановление ионов серебра (из соли) до металлического серебра. Образующаяся вокруг частиц золота оболочка металлического серебра в свою очередь ускоряет восстановление золота, и реакция становится автокаталитической.

Для получения КЗ одинаково пригодны два способа восстановления золо-тохлористоводородной кислоты (ЗХВК) - цитратом и боргидридом натрия.

В ходе экспериментов нами установлено, что для стабилизации идентичных золей требуются неодинаковые количества белка из разных источников. По нашим данным, полисахаридсодержащие антигенные комплексы хуже стабилизируют золь и менее прочно удерживаются на частицах золя, чем белковые фракции.

Для обнаружения антигенов бруцелл сконструированы диагностикумы на основе противобруцеллезных IgG и стафилококкового белка А, меченных частицами КЗ. Установлено, что водорастворимые антигены бруцелл - ЛПС и БПА - в ДНА с конъЮгатом K3=IgG обнаруживались в концентрации 8.0-64.0 нг/мл. В результате обработки мембран гидрохиноном и лактатом серебра чувствительность метода существенно (в 3.2-16 раз) возрастала, и оба антигена обнаруживались уже в концентрации 0.5-10.0 нг/мл. Чувствительность ДИА в отношении корпускулярных антигенов S-бруцелл варьировала в диапазонах 1.25-10s-5-105 (обычный вариант) и 3.9-103-6.25-104 (усиленный вариант) КОЕ/мл. Бруцеллы в R-форме (В. ovis, В. canis) или в незавершившейся стадии R-диссоциации (В. abortus 82), т.е. лишенные или дефицитные в отношении О-специфической полисахаридной части молекулы ЛПС, выявлялись в ДИА в значительно более высоких концентрациях (1.910б-3.12-108 КОЕ/мл). В объектах внешней среды и биологическом материале возбудитель бруцеллеза обнаруживается в концентрации 3. 9-103-1.9-106 КОЕ/мл. Вид исследуемого образца (вода, почва, корма, молоко, смывы с разных объектов, сыворотка крови или внутренние органы животных) на чувствительность анализа существенного влияния не оказывает. Тем не менее, исследование в дот-иммуноанализе некоторых образцов (гемолизированная кровь, желчь и т.п.) ограничено ввиду прочного окрашивания пигментами мембраны при нанесении исследуемой пробы.

Общий вид мембранного фильтра с результатами ДИА с золотым маркером при исследовании материала на антиген бруцелл представлен на рисунке 2.

Рисунок 2. Общий вид мембранного фильтра с результатами ДИА с золотым маркером при исследовании материала на антиген 1 - отрицательный контроль (гетерогенный антиген);

2-10 - положительные результаты в пробах с разным содержанием антигенов бруцелл

При сопоставлении материалов дот-иммуноанализа с золотым маркером, ПЦР и бактериологического метода при детекции бруцелл в динамике инфекционного процесса у морских свинок, зараженных вирулентными штаммами возбудителя, наибольшее количество положительных ответов зафиксировано в ДИА (72.0%). Информативность бактериологического анализа и ПЦР была существенно ниже (18.7 и 36.0%, соответственно). Больший процент положительных находок в ДИА по сравнению с ПЦР, объясняется, на наш взгляд, не более высокой чувствительностью первого, а возможностью детекции наряду с корпускулярными субкорпускулярных фракций (дериватов микробных клеток), а также растворимых антигенов. Это согласуется с данными С. Romero с соавт. (1995), у которых при параллельном исследовании проб молока от больных животных в ИФА и ПЦР чувствительность первого составила 98.2, второго - 87.5%.

Для создания универсального диагностикума мы попытались вместо про-тивобруцеллезного IgG использовать стафилококковый белок А.

Принцип метода состоит в том, что стафилококковый белок А, в том числе меченный золотом, способен связываться с Fc-фрагментом практически любого IgG. Исходя из этого, нанесенный на мембрану исследуемый образец сначала обрабатывали антисывороткой к искомому антигену и только затем осуществляли иммунопроявление белком А, меченным КЗ (|-Аг+Ат+БА=КЗ). Искомый антиген в этом случае легко детектируется по взаимодействию с используемой антисывороткой. ДИА с конъюгатом белок А=КЗ успешно применен для выявления антигенов бруцелл в искусственно контаминиро-

Во всех исследованных сыворотках крови КРС противобруцеллезные антитела в ДИА выявлены в титрах - 1:400-1:1600, что с учетом отсутствия клинических признаков заболевания бруцеллезом мы расценили как следствие специфической вакцинации, которой поголовно подвергаются животные в коллективных хозяйствах (справки ветнадзора). Факт способности ДИА выявлять поствакцинальный ответ, несомненно, имеет позитивное значение.

При исследовании патологического материала (гомогенаты лимфатических узлов и органов больного бруцеллезом КРС, сыворотки крови больных людей) из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Иркутской области положительные результаты в ДИА на наличие антигенов бруцелл получены в 15% случаев. Положительные реакции в ДИА полностью совпадали с результатами параллельного исследования материала в ПЦР, проведенной М.Ю. Шестопаловым с соавт. (1997). При этом наличие бруцеллеза КРС в области подтверждено выделением культуры В. abortus 3 биовара из пробы, положительно реагировавшей на бруцеллез в ДИА и ПЦР.

Полученные материалы позволяют констатировать, что ДИА является высокочувствительным, специфичным, зысокоинформативным и доступным экспресс-методом, эффективным при использовании не только в экспериментальных условиях, но и при работе с клиническим материалом.

7. Дот-иммуноаналнз с частицами коллоидного серебра для обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним

В поисках более доступных и дешевых каталитически активных металлов, способных выявляться "физическим проявлением", мы обратили внимание на другой благородный металл - серебро. Золи серебра достаточно стандартны и легко воспроизводимы, а сконструированные с их участием тест-системы по чувствительности практически не уступают остальным рассмотренным твердофазным методам. Диагностикумы, сконструированные нами по принципу физической адсорбции на частицах маркера специфических к определяемому лиганду иммунореагентов (IgG или Аг), позволили выявлять как антигены бруцелл, так и антитела к ним. Оригинальность нашего подхода подтверждена получением трех патентов: "Способ обнаружения антигенов бруцелл", "Способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа" и "Способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа" (№№ 2202798, 22002799, 22002800 от 20.04.03 г.).

Результаты индикации бруцелл или их антигенных фракций позволяют характеризовать ДИА с использованием серебряного маркера как высокочувствительный метод. Растворимые антигены выявляются в нанограммовых количествах (ЛПС - в концентрации 4.4±0.8, БПА - 16.0±3.2 нг/мл). Чувствительность анализа при индикации корпускулярных антигенов варьирует бо-

лее широко и зависит от ряда причин, в частности, состояния диссоциации: бруцеллы в S-форме выявляются в диапазоне концентраций 15.6-103-6.24-104, тогда как бруцеллы в R-форме - в концентрации >3.9-106 КОЕ/мл.

При исследовании контаминированных бруцеллами разных видов объектов внешней среды возбудитель бруцеллеза легко обнаруживается в сложных смесях (52.0±2.4-103 - 63.8±2.8-104 КОЕ/мл), причем вид исследуемого объекта не отражается на конечных результатах анализа.

Общий вид мембранного фильтра с результатами ДИА с серебряным маркером при обнаружении антигенов бруцелл аналогичен представленному на рисунке 2.

При конструировании тест-систем для обнаружения противобруцеллез-ных антител в ДИА апробированы 31 выделенная нами поверхностная фракция бруцелл. Наибольшие стабилизирующую способность, чувствительность и специфичность в составе "серебряного" диагностикума обеспечивал цетав-лоновый супернатант (специфичность 85.0i4.0%), несколько меньшую - 8% "горячий" солевой экстракт (82.0±4.1%) и фракция белков наружной мембраны ДОХ 37°С (80.0±3.3%). Эти диагностикумы не взаимодействовали с гете-рологичными сыворотками животных, а ложноположительные результаты (в низких титрах антител) возникали преимущественно при работе с сыворотками крови человека. Практически равноценные по стабилизирующим свойствам и чувствительности результаты получены при использовании в ДИА конъюгатов серебряного маркера с БПА (75.0±5.0%), 5% "горячим" солевым экстрактом (75.0±5.0°/о) и водной фазой по Е. Moreno et al. (1979) (79.0±4.7°/о), однако ложноположительные результаты в этих случаях имели место не только при работе с донорскими, но и с гипериммунными кроличьими ши-геллезной, иерсиниозной 0:9 и сальмонеллезной антисыворотками. Все другие антигенные фракции в составе диагностикумов в невысоких титрах (<1:800) перекрестно реагировали с несколькими гетерологичными сыворотками - холерной, шигеллезной, иерсиниозной 0:9, туляремийной, сальмонеллезной.

В ДИА с серебросодержащим маркером исследовали сыворотки крови больных людей из городской инфекционной больницы с разными клиническими формами бруцеллеза; работников Иркутского мясокомбината; сыворотки крови КРС, взятые на Иркутском мясокомбинате; в качестве отрицательного контроля - сыворотки доноров со станции переливания крови. Параллельно материал исследован в традиционных серологических реакциях. Установлено, что рутинные серологические реакции уступают по чувствительности ДИА. Наибольшее количество положительных результатов при хроническом бруцеллезе получено в ДИА, затем по убывающей - в РК, РХ, РПГА, РА, РДСК. В ряде случаев в виду недостаточной чувствительности специфические антитела в традиционных серологических реакциях не выяв-

лялись даже в сыворотках крови от больных с документированным диагнозом бруцеллеза. В ДИА оказалось возможным определение Ат (и антигена) не только в сыворотках крови больных бруцеллезом людей, но и поствакцинальных Ат (1:200-1:800) (табл. 6). Во всех сыворотках крови КРС выявлен невысокий уровень поствакцинальных противобруцеллезных Ат.

В связи с особой актуальностью разработки методических приемов по обнаружению атипичных форм возбудителя бруцеллеза и с учетом накопленного опыта нам удалось сконструировать диагностическую тест-систему для выявления Ат к бруцеллам в L-форме. Специфические Ат в экспериментальных кроличьих сыворотках, полученных против бруцелл в L-форме, обнаруживались в титрах >1:1600. При параллельном исследовании этих сывороток в традиционных серологических реакциях (РА, РПГА) получены отрицательные результаты.

При постановке ДИА на пористых подложках с использованием частиц коллоидных металлов нельзя не учитывать малые линейные размеры маркеров, позволяющие диагностикуму проникать глубоко в поры мембраны, в связи с чем возникают сложности отмывания твердой фазы от не связавшегося препарата. Как правило, при этом отмывочные процедуры предусматривают длительную инкубацию подложки в промывающем буфере с многократной сменой последнего, часто с активацией отмывания на мешалке или шуттеле. Такие отмывочные процедуры увеличивают время проведения анализа. Преодоление этого недостатка возможно при использовании в качестве маркеров более крупных частиц, в частности, - углеродных.

8. Дот-нммуноанализ с частицами углерода для обнаружения противобруцеллезных антител

Значительно более практичной и дешевой меткой является углеродный маркер - активированный уголь. Положительное качество активированного угля - универсальность его сорбционных свойств в отношении разнообразных лигандов при физиологических значениях рН. Кроме того, использование сравнительно крупных частиц маркера облегчает процедуры отмывания как самого диагностикума в процессе его приготовления, так и твердофазного носителя от не связавшегося угольного препарата, поскольку крупные размеры частиц диагностикума не позволяют ему проникать глубоко в поры подложки. В зависимости от поставленной задачи сенситинами активированного угля могут быть антитела, антигены, стафилококковые протеины А и G, стрептавидин и др.

Для конструирования антигенного диагностикума с целью выявления противобруцеллезных антител в сыворотках крови экспериментальных животных мы избрали 8% "горячий" солевой экстракт из клеток В. abortus 19 ВА. При испытании в лабораторных условиях специфические антитела в тит-

Таблица 6. Результаты комплексного серологического обследования работников мясокомбината

ДИА Реакция Реакция Реакция

Хеддльсона Райта Кумбса

Титр Выявление Аг Выявление Ат К-во положительных проб К-во положи-тельных проб К-во К-во К-во отри-ца-тельных проб

Исследовано Ат К-во К-во К-во К-во К-во отрица- поло-

в ДИА положительных проб отрицательных проб положительных проб отрицательных проб отрицательных проб тельных проб жительных проб

15 0 0 15/15.2 0 15/15.2 0 15/15.2 0 15/15.2 0 15/15/2

18 1:200 0 18/18.2 18/18.2 0 0 18/18.2 0 18/18.2 0 18/18.2

30 1:400 4/4.1 26/26.2 30/30.3 0 15/15.2 15/15.2 0 30/30.3 0 30/30.3

19 1:800 4/4.1 15/15.2 19/19.2 0 - 17/17.2 2/2.0 0 19/19.2 5/5.0 14/14.1

12 1:1600 8/8.0 4/4.0 12/12.1 0 12/12.1 0 0 12/12.1 5/5.0 7/7.0

4 1:3200 3/3.0 1/1.0 4/4.0 0 4/4.0 0 1/1.0 3/3.0 3/3.0 1/1.0

1 1:25600 1/1.0 0 1/1.0 0 1/1.0 0 1/1.0 0 1/1.0 0

Всего 99 20/20.2 79/79.8 84/84.8 15/15.2 49/49.5 50/50.2 2/2.0 97/98.0 14/14.0 85/86.0

Примечание: в числителе - абсолютное количество; в знаменателе - в процентах

рах 1:50-1:800 выявлены во всех кроличьих противобруцеллезных сыворотках (35 серий), полученных против растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл и хранившихся в условиях холодильника. При этом высота титров Ат в ДИА и ИФА в абсолютном большинстве случае находились в прямой корреляции: чем выше титр Ат в ДИА, тем он выше и в ИФА (табл. 7).-

Таблица 7. Результаты исследования в ДИА сывороток крови лабораторных

животных

Серия сыворотки Характеристика сыворотки Титр антител

в ДИА в ИФА

1 2 3 4

1 Поливалентная 1:800 (9.8) 1 3276800 (21.8)

95 1:200 (7.6) 1 409600(18.2)

97 1:800 (9.7) 819200(19.8)

98 1:200 (7.6) 1 409600(18.2)

308 1:400 (8.8) 1 819200(19.8)

411 1:100 (6.7) 102400(16.6)

412 1:200 (7.7) 409600(18.2)

586 1:200 (7.7) 409600(18.2)

587 1:400 (8.8) 409600(18.2)

646 1:200 (7.7) 409600(18.2)

647 1:800 (9.7) 1 3276800 (21.8)

648 1:400 (8.8) 819200(19.8)

929 1:200 (7.7) 409600(18.2)

932 1:400 (8.8) 819200(19.8)

1036 1:200 (7.6) 409600(18.2)

1039 1:400 (8.8) 819200(19.8)

4 против ЛПС 1:100 (6.7) 102400(16.6)

7887 1:100 (6.6) 1:51200(15.8)

7889 1:200 (7.7) 1:409600(18.2)

7890 1:400(8.8) 1:3276800 (21.8)

7891 1:100(6.6) 1:102400(16.6)

6 . против БПА 1:200(7.6) 1:409600(18.2)

7 1:400(8.7) 1:409600(18.2)

9 1:200(7.7) 1:204800(17.8)

14 1:200 (7.8) 1:204800(17.8)

2678 против БПА+ПрС 1:50 (5.6) 1:51200(15.8)

2679 1:200 (7.7) 1:409600(18.2)

2680 1:100 (6.6) 1:204800(17.8)

2777 1:50 (5.6) 1:51200 (15.8)

Продолжение таблицы 7

1 2 3 4

11 против 10% солевого экстракта 1:800 (9.8) 1:819200(19.8)

13 1:200 (7.6) 1:409600(18.2)

10518 1:400^(8.8) 1:409600 (18.2)

64 против 1:200(7.7) 1:204800 (17.8)

66 мочевинного 1:400 (8.7) 1:409600 (18.2)

67 супернатанта 1 1:400 (8.8) 1:819200(19.8)

Коммерческие агглютинирующие бруцеллезные антисыворотки (4 серии) 1:400 (8.7) 1:409600(18.2)

ИКС (4 серии) отр. отр.

Примечание: в скобках - средние геометрические титры антител Гетерологичные и нормальные кроличьи сыворотки в ДИА с угольным диагностикумом дали отрицательные результаты.

Способ применения угольного диагностикума прост, не требует квалификации оператора и регистрирующей аппаратуры. Низкая стоимость маркера, экономное использование иммунореагентов, а также малые энерго- и трудозатраты при производстве являются дополнительными его достоинствами. Разработанный вариант ДИА может быть рекомендован для первичного скрининга сывороток крови на бруцеллез. Внешний вид стрипов и варианты результатов ДИА с угольным диагностикумом при обнаружении антигенов бруцелл представлен на рисунке 3.

Алюминиевая фольга

Нитроцеллюлоза

•шй ;Я|

пол.контроль^ _р.триц. контроль^

_образец _

Т1

Результат: Отрицательный Положительный

Рисунок 3. Внешний вид стрипов и варианты результатов анализа

Резюмируя весь полученный материал по конструированию и применению твердофазных иммунохимических тест-систем для лабораторной диагностики бруцеллеза, следует еще раз подчеркнуть их достаточно высокую чувствительность и специфичность при исследовании материала на наличие корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл. Специфичность ИФА, ИЭАМ, ДИА с золотой и серебряной метками доказана в опытах с детектированием F. tularensis, Sh. flexneri, S. typhimurium, V. cholerae, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica 0:3, E. coli, P. vulgaris, которые, в отличие от бруцелл, не выявлялись в максимальной из испытанных концентраций - Ю8 КОЕ/мл. Из патогенных бактерий исключением являются Y. enterocolitica 0:9, что обусловлено наличием общих компонентов ЛПС кишечных иер-синий и бруцелл (Желудков М.М., 1982, 1983; Умнова Н.С. и др., 1987; Diaz-Aparicio Е. et al., 1993; Kittelberger R. et al., 1998). Однако в клинико-лабо-раторном диагнозе это обстоятельство по разным причинам, а том числе несходству клинической картины заболевания бруцеллезом и иерсиниозом, не играет определяющей роли.

Более сложной представляется ситуация при использовании лабораторных методов, в том числе твердофазных, для обнаружения антител в биологических жидкостях макроорганизма. В своих экспериментах мы отмечаем наличие положительных результатов в бруцеллезных тест-системах при исследовании сывороток донорской крови. С недавних пор известно, что сыворотки крови здоровых людей могут содержать антитела к ряду инфекционных агентов - Sh. flexneri, S. abortus equi, S. typhimurium, S. enteritidis, P. aeruginosa, E. coli 026:B6, 02 (Ванеева Н.П. и др., 1995; Левина Л.А. и др., 1995; Gad El-Rab М О., Kambal A.M., 1998). Л.А. Левина с соавт. (1995) обнаружила противоэшерихиозные антитела не только в сыворотках крови доноров, но и в коммерческих препаратах иммуноглобулинов человека. "Провокационную" роль могут сыграть установленные факты сходства антигенов и генома бруцелл, некоторых компонентов органов и тканей человека, патогенов и симбионтов растений и животных (Ефременко В.И. и др. 2001; Paulsen I.T. et al., 2002). Не исключено участие в иммунологических сдвигах в организме и так называемых нанобактерий - мельчайших микроорганизмов, родственных бруцеллам, отнесенных к a-2-подгруппе протеобактерий (Cisar J.O. et al., 2000), с которыми в последнее время связывают формирование мочекаменной болезни у людей.

Нельзя сбрасывать со счета и факт, что бруцеллы содержат поверхностные антигены, сходные с аналогичными компонентами целого ряда патогенных и даже сапрофитных микроорганизмов (Cloeckaert А. et al., 1996; Freer Е.

et al., 1996; Weynants V. et al., 1996; DrancourtM. et al., 1997; Kittelberger R. et al., 1997; Velasco J. et al., 1997, 2000), а человек в течение жизни непременно сталкивается с этими возбудителями. Одним из факторов, способных отрицательно сказаться на чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, является способность S- и R-ЛПС (так же как ЛПС Е. coli) неспецифически связываться с иммуноглобулином М сывороток крови, что приводит к появлению ложноположительных результатов (Lamb V.L. et al., 1979). Известно также, что антитела к коровой части ЛПС могут являться причиной "природного иммунитета" к некоторым бактериям, а антитела к липиду А могут быть обнаружены в нормальных сыворотках после перенесенной инфекции, вызванной любыми грамотрицательными бактериями (Warren H.S. etal., 1988; Warren H.S., ChedidL.A., 1988). Следует также иметь в виду, что при многих инфекционных заболеваниях, в частности при бруцеллезе, развиваются аутоиммунные реакции с выработкой аутоантител. В числе механизмов, которые приводят к возникновению аутоиммунных нарушений, предполагается реакция организма на перекрестно реагирующие экзогенные бактериальные антигены (Петров Р.В., Зарецкая Ю.М., 1970; Станиславский Е.С., 1971; Ефременко В.И. и др. 2001).

С позиций совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза прикладное значение могут иметь следующие рекомендации:

1. При исследовании экспериментального, полевого и клинического материала на наличие возбудителя бруцеллеза или его антигенов целесообразнее использовать дот-иммуноанализ с коллоидными металлами. Основными критериями, определяющими этот выбор, являются высокая чувствительность и специфичность разработанных тест-систем, простота приготовления диагно-стикумов, позволяющая сохранить нативность и специфическую активность препаратов IgG, адсорбируемых на частицах коллоидных металлов, демонстративность результатов исследования. Немаловажное значение имеет безопасность работы для персонала (отсутствие токсичных или канцерогенных ингредиентов), более низкая себестоимость анализов, миниатюризация (объем тестируемого материала - 1 мкл), простота постановки реакции. Выбирая из двух коллоидных металлов - золота и серебра, предпочтительнее использовать золь серебра как более дешевый и доступный. Если концентрация возбудителя в образце достаточно высока и нет необходимости осуществлять усиление результатов реакции, то логичнее использовать золь золота, т.к. в положительных случаях формируются окрашенные в розовый цвет пятна и отпадает необходимость в дополнительном проявлении результатов, что обеспечивает большую экспрессность анализа.

2. При исследовании экспериментального материала от животных на наличие противобруцеллезных антител мы рекомендуем использовать ДИА с применением в качестве специфического зонда одной из рекомендованных антигенных фракций бруцелл.

3. При исследовании клинического материала (сыворотки крови людей) целесообразнее, на наш взгляд, использовать непрямой вариант ИФА. Количество или выраженность неспецифических реакций в ИФА несколько ниже, чем в ДИА с коллоидными металлами. Это может быть связано с тем, что:

• Нитроцеллюлозные мембраны по сорбционной емкости значительно превосходят полистироловые планшеты, в результате чего они в большем количестве и с большей плотностью адсорбируют разнообразные по молекулярной массе и заряду фракции сыворотки крови;

• Твин 20, используемый для разведения образцов сывороток и отмывания планшетов в ИФА, обеспечивает уменьшение количества неспецифических реакций, в то время как в ДИА с коллоидным серебром этот детергент применять нельзя из-за формирования в его присутствии агрегатов коллоидных частиц;

• Проявляющая активность соответствующих растворов в ДИА с коллоидными металлами значительно выше, чем в ИФА, поскольку механизм проявления различен. В ДИА реакция автокаталитическая, поэтому потенциальная возможность этой реакции очень высока и обеспечиваемая чувствительность может выражаться в пикограммовых количествах. Между тем, одна молекула фермента в ИФА расщепляет определенное количество молекул субстрата, в связи с чем возможности каталитической реакции ограничены.

ВЫВОДЫ

1. Из бруцелл разных видов изолирован и охарактеризован по физико-химическим и иммунохимическим свойствам 31 антигенный препарат. Фракция, экстрагируемая из клеток вакцинного штамма В. abortus 19 ВА цетавло-ном, обеспечивает наиболее высокую специфичность сконструированных на ее основе твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза.

2. Конструирование твердофазных иммунохимических тест-систем для детекции возбудителя бруцеллеза или его антигенов в гладкой форме целесообразнее проводить на-основе Ат сывороток, полученных иммунизацией животных живыми вирулентными клетками бруцелл в S-форме; для детекции R-бруцелл или их антигенов - с использованием сывороток, полученных против поверхностных растворимых антигенов R-бруцелл.

3. Протаминсульфат, бычий сывороточный альбумин при конъюгирова-нии с антигенными фракциями бруцелл (КО, ЛПС, БПА), а также феракрил

при сочетанном введении с комплексом Антиген=Антитело способствует резкому повышению эффективности иммунизации экспериментальных животных.

4. Разработаны методические основы конструирования ИФА-тест-систем для раздельного и сочетанного обнаружения возбудителя бруцеллеза (и его антигенов) в гладкой и шероховатой формах и противобруцеллезных Ат. Высокая чувствительность, специфичность, универсальность и экспрессность ИФА подтверждена при апробировании метода в экспериментальных и полевых условиях и в процессе государственных межведомственных комиссионных испытаний (г. Москва, 1985 г.). Для выявления антигенов бруцелл предпочтителен прямой сэндвич-вариант ИФА, для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотках крови людей - непрямая модификация метода (нИФА). Предлагаемый комплексный RS-антигенный диагностикум для ИФА может быть эффективно использован в смешанных очагах бруцеллеза.

6. Разработан иммуноэритроадсорбционный микрометод обнаружения в лабораторных и полевых условиях антигенов S- и R-бруцелл, который при аналогичной специфичности несколько уступает ИФА по чувствительности, но превосходит его по экономичности и доступности ингредиентов реакции. Сконструированный для ИЭАМ конъюгат IgG=3pitTpounTbi может успешно использоваться как антителъный эритроцитарный диагностикум для РПГА.

7. Разработаны тест-системы для детекции в ДИА антигенов бруцелл и антител к ним с использованием в качестве метки специфических антител, антигенов и стафилококкового белка А частиц коллоидных металлов - золота или серебра. ДИА пригоден для исследования на бруцеллез разнообразного экспериментального и клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью результатов. При исследовании антигенсодержа-щего материала ДИА по ряду параметров превосходит другие твердофазные методы и может быть использован в качестве скрйнирующего теста.

8. Предложен простой и экономически доступный вариант ДИА на стри-пах для выявления противобруцеллезных антител в сыворотках крови лабораторных животных с использованием в качестве диагностикума 8% "горячего" солевого экстракта из вакцинного штамма В. abortus 19 ВА, меченного частицами активированного угля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Голубинский Е.П., Меринов С.П., Рудник М.П., Загоскина Т.Ю. Имму-ноферментные методы для обнаружения возбудителей особо опасных инфекций и антител к ним // Эпидемиол. и профилакт. особо опас. инфекций в МНР и СССР. - Улан-Батор, 1982. - С. 20-27.

2. Меринов С.П., Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Пинигин А.Ф. Использование иммуноферментного метода для обследования людей на бруцеллез И Соврем, аспекты профилакт. зоонозных инфекций: Тез. докл. на Всесоюз, конф.

специалистов противочум. учреждений. - Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 113 -114.

3. Меринов С.П., Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Захлебная О.Д., Ла-укнер И.В., Грачева Н.Ж., Широков В.А., Коха A.M. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним // Там же. - С. 111113.

4. Голубинский Е.П., Меринов С.П., Меринова Л.В., Лесников Н.П., Шишкина Л.П., Загоскина Т.Ю., Коха A.M. Применение иммуноферментного метода для обнаружения антигенов туляремийного микроба и антител к ним у людей при эпизоотологическом обследовании // Там же - С. 129-131.

5. Миронова Л.П., Меринов С.П., Загоскина Т.Ю., Коха A.M. Антигенные взаимосвязи у представителей рода Brucella // Иерсиниозы : Тез. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Владивосток. - С.51-53.

6. Иванова Т.И., Осипенко И.И., Петухова О.С., Широков В.А., Загоскина Т.Ю. Реакции иммунитета на введение бруцеллезных вакцин у морских свинок // Актуал. вопр. иммунодиагн. особо опас. инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Ставрополь, 1986. - Ч. 1. - С. 64-66.

7. Загоскина Т.Ю., Алексеева Л.А, Петухова О.С. Использование иммуно-эритроадсорбционного метода для выявления антигенов возбудителя бруцеллеза // Медико-биологические проблемы Восточной Сибири. - Иркутск, 1988.

- С.107-108.

8. Голубинский Е.П., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Загоскина Т.Ю., Репина Л.П. Иммуногенные свойства различных фракций клеток бруцелл // Иркутский н.-и. Противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 1989. - 13 с. -Деп. в ВИНИТИ 28.07.89, № 4872 В-89 (Реф. 12 Ц 531 ДЕП, РЖ "Биология". -1989,- №12).

9. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И. Использование им-муноэритроадсорбционного метода для обнаружения возбудителя бруцеллеза // Актуал. пробл. профилакт. бруцеллеза и организации мед. помощи больным : Тез. докл. Всесоюз. конф. - М., 1989. - С. 95-96.

10. Загоскина Т.Ю., Захлебная О.Д., Лаукнер И.В., Репина Л.П., Марков Е.Ю. Получение высокоактивных сывороток против цельных клеток и отдельных антигенов бруцелл для использования в различных иммунохимиче-ских реакциях //Там же. - С. 119-121.

И. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю. Иммуноэритроадсорбционный метод обнаружения антигенов бруцелл // Лабораторное дело. - М., 1989. - 7 с. Деп. в ВИНИТИ 12.09.89, № 5827-В89.

12. Марков Е.Ю., Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П., Репина Л.П., Чарная Т.Г. П Авторское свидетельство 316008 СССР, МКИ А 61 К 39/02, С 12 К 5/00 Способ получения иммуногенного препарата из микроорганизмов рода Brucella / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ.

- № 4518477; Заявлено 19.07.89; Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 01.07.90 г.

13. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Парная Т.Г. Некоторые свойства липополисахарида бруцелл // Соврем, аспекты профилакт. зоонозных инфекций : Тез. докл. науч. конф. - Ставрополь, 1991.-С. 9-10.

14. Голубинский Е.П., Марков Е.Ю., Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Чарная Т.Г. Протективная активность клеточных оболочек бруцелл, конъю-гированных с протаминсульфатом // Там же. - С. 10-12.

15. Карепин Е.Ю., Калиновский А.И., Репина Л.П., Загоскина Т.Ю. Бруцеллез в Магаданской области // Там же. - С. 32-34.

16. Петухова О.С., Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Чарная Т.Г. Динамика иммунологического ответа лабораторных животных на введение экспериментальных бруцеллезных химических вакцин // Там же, - С. 50-52.

17. Голубинский Е.П., Домарадский И.В., Загоскина Т.Ю., Миронова Л.П., Марков Е.Ю., Алексеева Л.А. Иммуноферментный вариант реакции нарастания титра бактериофага для обнаружения жизнеспособного возбудителя чумы // Информацион. бюллетень. - Саратов, 1992. - № 1. - С. 15-16.

13. Markov E.Yu., Nikolaev V.B,, Zagoskina T.Yu., Urbanovitch. L.Ya., Rudykh A.R. Isolation and purification of bacterial lipopolysaccharides from cell free extracts by phase separation using Triton X-114 // Bacterial Endotoxin: Recognition and Effector Mechanisms / Proceedings of the 2nd Congress of the International Endotoxin Society (Vienna, 17-20 August 1992). - Ed. by J. Levin, C. R. Alving, R. S. Munford, P. L. Stutz. - Vienna, Austria. -1992. - Abstr. Nr. 80001.

19. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П., Голубинский Е.П., Марков Е.Ю., Алексеева Л.А., Карепин ЕЛО. Использование иммуноэритроадсорбционного метода для обнаружения возбудителя бруцеллеза // Пробл. природно-оча-говых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке : Тез. докл. региональной науч.-практ. конф. - Чита, 1993. - С. 54-56.

20. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П., Репина Л.П., Голубинский Е.П., Марков Е.Ю., Алексеева Л.А Разработка высокочувствительной тест-системы для обнаружения бруцелл в шероховатой форме II Там же. - С. 57-58.

21. Марков Е.Ю., Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Чарная Т.Г., Калиновский А.И. Способ повышения иммуногенности антигенов бруцелл // Иммунология и специфич. профилакт. особо опас. инфекций : Материалы Рос. науч. конф. - Саратов, 1993. - С. 95-96.

22. Патент 5023123 С1 5 А 61 К 39/40. Способ получения диагностических сывороток / С.Н.Тюменцев, Н.М.Андреевская, И.С.Тюменцева, А.И.Калиновский, Л.П.Репина, Т.Ю.Загоскина .Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Заявка № 2010577; Заявлено 09.07.91 г., Зарегистрировано в Гос. Реестре изобретений РФ 15.04.94 г.

23. Тюменцев С.Н., Калиновский А.Й., Андреевская Н.М., Марков Е.Ю., Репина Л.П., Загоскина Т.Ю. Получение бруцеллезной кроличьей агглюти-

нирующей сыворотки с использованием антигенов бруцелл // Актуал. пробл. профилакт. особо опас. и природно-очаговых. инф. болезней : Тез. докл. науч. конф. - Иркутск, 1994. - С. 162-163.

24. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Алексеева Л.А. Применение антител, меченных коллоидным золотом, для обнаружения антигенов возбудителя бруцеллеза // Акт. вопр. профилакт. особо опас. и др. инф. заболеваний : Материалы науч.-практ. конф. 60 лет противочум. службы Кавказа. - Ставрополь, 1995. -С. 153-154.

25. Патент на изобретение 5057381 С 1 6 С 12 N 1/20 А 61 К 39/10. Штамм бактерий Brucella ovis - продуцент бруцеллезных R-антигенов / Л.П. Репина, А.И. Калиновский, Т.Ю. Загоскина. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Заявка № 2051963; Заявлено 31.07.92 г.; Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений РФ 10.01.96 г.

26. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Алексеева Л.А. Точечный иммунный анализ с использованием антител, меченных коллоидным золотом, для обнаружения антигенов бруцелл // Материалы VII съезда ВОЭМП. - М., 1997. -Т.1.-С. 440-441.

27. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Калиновский А.И., Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П. Теоретические и прикладные аспекты разработки новых иммуногенных препаратов на основе антигенов поверхностных структур бактериальной клетки возбудителей особо опасных инфекций // Там же. - Т. 1. -С.231-232.

28. Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков, С.П. Меринов, Е.П. Голубинский. Поверхностные полисахаридсодержащие антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением // Материалы VII съезда ВОЭМП. - М., 1997. - Т. 2. -С. 177-178.

29. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Меринов С.П., Голубинский Е.П. Поверхностные полисахаридсодержащие антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением // Материалы науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 177-178.

30. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Обнаружение возбудителя бруцеллеза с использованием антител, меченных частицами коллоидного золота // Гомеостаз и инфекционный процесс: Материалы 2й Всерос. конф. - Саратов, 1998. - С. 27.

31. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Обнаружение бруцеллезных антител в сыворотках крови людей и животных с использованием специфического антигена, меченного коллоидным золотом // Там же. - С. 27.

32. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П., Есина Н.Л. Использование антигенов бруцелл, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения специфических антител методом дот-

иммуноанализа Н Пробл. инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Материалы науч. конф. - Новосибирск, 1998.-С. 37.

33. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П. Характеристика рутинных методов выявления антигенов бруцелл // Журн. инфекционной патологии. - 1998. -Т. 5, № 4. - С. 12-17.

34. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Го-лубинский Е.П. Поверхностные полисахаридсодержащие антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением // Там же - С. 17-21.

35. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. - 1998. -№ 6. - С. 64-68.

36. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Использование белковополисахаридного антигена бруцелл, меченного частицами коллоидного золота, для обнаружения специфических антител методом дот-иммуноанализа // Клин. лаб. диагностика. - 1999. - № 3. -С. 39-41.

37. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Выявление антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа с использованием специфических антител, меченных частицами коллоидного золота // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1999. - № 3. - С. 26-29.

38. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Выявление антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа с использованием стафилококкового белка А, меченного частицами коллоидного золота // Пробл. особо опас. инфекций. - Саратов, 1999. - Вып. 79. -С. 77-81.

39. Загоскина Т.Ю., Меринов С.П., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П, Вак-цинопрофилактика бруцеллеза: современное состояние и перспективы // ГУ Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - 1999. - 23 с. - Деп. в ВИНИТИ 21.09.99 г., № 2898-В99.

40. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П. Перспективные методы лабораторной диагностики бруцеллеза // Пробл. мед. и экологической биотехнологии : Тез. докл. юбилейной науч. конф. - Оболенск, 1999. - С. 64.

41. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П. Использование частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител для обнаружения антигенов бруцелл // Новые медицинские технологии (Объединенная науч. сессия Общего собрания СО РАМН}: Тез. докл. - Новосибирск, 2000. - 1 с. (1тр://\т\у.са1а1у815/п8к/ зи/сЬет/тесИсша/- 4/45ЛЫт1).

42. Загоскина Т.Ю. Твердофазные методы обнаружения антигенов бруцелл // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Материалы меж-

дун. науч.-практ. конф. "Соврем, эпидемический потенциал природных очагов чумы". - Алматы, 2001. - Вып. 3. - С. 25-30.

43. Николаев В.Б., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Попова Ю.О., Докори-на A.A., Мирончук Ю.В. Использование специфических реагентов, меченных частицами коллоидного серебра, для обнаружения антигенов Francisella tu-larensis и антител к ним методом дот-иммуноанализа // Там же. - С.196 -198.

44. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю. Твердофазные методы исследования в лабораторной диагностике бруцеллеза // Журн. инфекционной патол. -2001. -Т. 8,№2-3.-С. 94-101.

45. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител // Журн. микробиол. - 2001. - № 3. - С. 65-69.

46. Загоскина Т.Ю., Докорина A.A., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с использованием в качестве маркеров специфических антител частиц коллоидных металлов // Инфекционные болезни в практике терапевта. - Харьков, 2001. - С. 91-93.

47. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Балахонов C.B., Андреевская Н.М., Докорина A.A., Голубинский Е.П. Дот-иммуноанализ с использованием специфических антител, меченных коллоидным серебром, для детекции чумного микроба // Там же. - С. 93.

48. Калиновский А.И., Репина Л.П., Загоскина Т.Ю., Михайлов Л.М., Шестопалов М.Ю., Балахонов C.B., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П. Актуальные проблемы эпидемиолого-эпизоотологического мониторинга за бруцеллезом в Сибири // IX Междун. симпозиум "Мониторинг здоровья населения и окруж. среды. Технология и информацион. базы данных-2001": Тез. докл. (Греция, о. Крит, 29 апреля-06 мая 2001 г.). - М., 2001. - С. 116-118.

49. Zagoskina Т. Yu. A new method of brucellosis express-diagnostics // Natural Infectious diseases. - Ulaanbaatar, 2001. - P. 80-81.

50. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Докорина A.A., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченых частицами коллоидного серебра, для выявления антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Клин. лаб. диагностика - 2002. - № 6. - С. 38-39.

51. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Меринов С.П., Докорина A.A., Голубинский Е.П Дот-иммуноанализ с частицами коллоидного серебра в качестве специфического.антигена для исследования сывороток крови людей на бруцеллез // Мед. паразитология. - 2002. - № 2. - С. 15-17.

52. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе // Сибирь-Восток. - 2002. - № 3 (51). - С. 10-12.

53. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Получение серебряных золей - маркеров для иммуноанализа // Сибирь-Восток. - 2002,- № 4 (52). - С. 18-20.

54. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Стабилизация коллоидного серебра // Сибирь-Восток. - 2002. - № 6 (54). - С. 17-18.

55. Загоскина Т.Ю., Полтавченко А.Г., Докорина А.А., Меринов С.П., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П. Обнаружение противобруцеллезных антител в сыворотках крови эспериментальных животных в дот-иммуноанализе с антигенной фракцией бруцелл, маркированной частицами активированного угля // Сибирь-Восток. - 2002. - № 8 (56). - С. 8-9.

56. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. - 2002. - № 9 (57). - С. 7-9.

57. Полтавченко А.Г., Лавриненко И.А., Костровский В.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Получение и оценка чувствительности серебряных им-мунозолей при постановке иммуноанализа в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. - 2002. - № 12 (60). - С. 14-17.

58. Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Balakhonov S.V., An-dreevskaya N.M., Polyavchenko A.G., Dokorina A.A., Golubinsky E.P. The use of silver immunosols for detection of Yersinia pestis antigens in dot immunoassay // Scientific J. of Center for Infectious Diseases with Natural Foci. - 2002. - N 10. -P. 53-55.

59. Poltavchenko A.G., Poltavchenko D.A., Zagoskina T.Yu. Colloid silver as perspective marker of immunoassay // Ibid. - P. 84-87.

60. Патент № 2202800 РФ, МКИ7 G 01 N 33/532, 33/569. Способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа / Т.Ю. Загоскина, Е.П. Голубинский, А.И. Калиновский, А.А. Докорина. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ МЗ РФ. - Заявка № 200117886/13; Заявлено 05.07.2000; Опубл. 20.04.2003, Бюл. № 11. Приоритет 05.07.2000.

61. Патент № 2202799 РФ, МКИ7 G 01 N 33/532, 33/569. Способ обнаружения антигенов бруцелл / Т.Ю. Загоскина, Е.П. Голубинский, А.И. Калиновский, Е.Ю. Марков, А.А. Докорина. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ МЗ РФ. - Заявка № 200117885/13; Заявлено 05.07.2000; Опубл. 20.04.2003, Бюл. №11.- Приоритет 05.07.2000.

62. Патент № 2202798 РФ, МКИ7 0 01 N 33/532, 33/569. Способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа / Т.Ю. Загоскина, А.И. Калиновский, Е.П. Голубинский, А.А. Докорина. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ РФ. - Заявка № 200117884/13; Заявлено 05.07.2000; Опубл. 20.04.2003, Бюл. № 11. Приоритет 05.07.2000.

63. Патент № 2203496 РФ, МКИ7 й 01 N 33/532, 33/569. Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба / В.Б. Николаев, Т.Ю. Загоскина, ЕЛО. Марков, А.А. Докорина, Ю.В. Мирончук, Н.Г. Гефан, Е.П. Голубин-ский. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ РФ. - Заявка № 2001118472/14; Заявлено 04.07.2001; Опубл. 27.04.2003, Бюл. № 12. Приоритет 04.07.2001.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Аг антиген (антигены)

АПС агрегированная противобруцеллезная сыворотка

Ат антитело (антитела)

БА белок А стафилококка

БСА бычий сывороточный альбумин *

БНМ белки наружной мембраны

БПА белковополисахаридный антиген

ДМСО диметилсульфоксид

дН20 дистиллированная вода

ДОХ дезоксихолат натрия

ДПС деградированный липополисахарид

ДСН додецилсульфат натрия

ДСН-ПАГЭ диск-электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН

ЗФР забуференный физиологический раствор

ИФА иммуноферментный анализ

ИЭАМ иммуноэритроадсорбционный метод

кдо кетодезоксио ктонат

КЗ коллоидное золото

КО клеточная оболочка

КОЕ колониеобразующая единица

КРС крупный рогатый скот

КС коллоидное серебро

ЛПС липополисахарид

м.к. микробные клетки

м.м. молекулярная масса

НГ нативный гаптен

нИФА непрямой иммуноферментный анализ

НК нуклеиновые кислоты (

нЛПС неочищенный ЛПС

НКС нормальная кроличья сыворотка

нлс нормальная лошадиная сыворотка

о-пс О-специфический полисахарид

ПААГ полиакриламидный гель

ПАФ полный адъювант Фрейнда

ПВИ поливинилимидазол

ПрС протаминсульфат

пх пероксидаза хрена

ПЭГ полиэтиленгликоль

РА пробирочная реакция агглютинации, реакция Райта

РБТ Роз-Бенгал тест

РДСК реакция длительного связывания комплемента

РК реакция Кумбса

РПГА реакция пассивной гемааглютинации

РСК реакция связывания комплемента

РХ реакция Хедцльсона

сэ стабилизированные эритроциты

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФЭ формалинизированные эритроциты

чЛПС чистый ЛПС

э эритроциты

до иммуноглобулин класса О

кДа килодальтон

. Подписано к печати 5 декабря 2003 г. Формат бумаги 60x90 1/16 Бумага писчая Объем 2.2 п.л. Тираж 80 экз. Заказ № 48 Редакционно-издательский отдел Иркутского госуниверситета 664000, г. Иркутск, б-р Гагарина, 36

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Загоскина, Татьяна Юрьевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация представителей рода Brucella.

1.2. Антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением.

1.3. Методы лабораторной диагностики бруцеллеза.

1.4. Иммунохимические методы с использованием мембранных под- 57 ложек.

1.5. Коллоидные металлы в конструировании диагностических тестсистем.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Диагностический материал.

2.3. Микробиологические методы.

2.4. Препаративные методы.

2.5. Химические и физико-химические методы.

2.6. Иммунохимические методы.

2.7. Серологические методы.

2.8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕРХНОСТНЫХ

АНТИГЕННЫХ ФРАКЦИЙ БРУЦЕЛЛ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

3.1. Выделение, очистка и характеристика физико-химических и g ^ биологических свойств поверхностных антигенных фракций бруцелл.

3.2. Получение высокоактивных противобруцеллезных сывороток ^ для конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем.

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИММУ

НОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ.

4.1. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов S-бруцелл

4.2. Сравнительная характеристика испытанных вариантов ИФА при обнаружении антигенов S-бруцелл.

4.3. Применение иммунопероксидазного метода для обнаружения антигенов R-бруцелл.„.,.

4.4. Разработка ИФА для одновременного обнаружения антигенов Sи R-бруцелл.

4.5. Обнаружение противобруцеллезных антител с помощью непрямого варианта ИФА.*.

4.6. Апробация ИФА при исследовании полевого и клинического материала.

ГЛАВА 5. ИММУНОЭРИТРОАДСОРБЦИОННЫЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ И АНТИТЕЛ К НИМ.

5.1. Конструированче ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл

5.2. Использование ИЭАМ для выявления антигенов R-бруцелл.

5.3. Апробация конъюгата IgG=C3-rA в качестве антительного эритроцитарного диагностикума для РПГА.

5.4. Апробация ИЭАМ при исследовании клинического и полевого материала.

ГЛАВА 6. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА ИММУННЫХ РЕАГЕНТОВ ЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА.

6.1. Разработка дот-иммуноанализа для выявления антигенов бру-целл с помощью конъюгата IgG=K3.

6.2 Разработка дот-иммуноанализа с конъюгатом стафилококковый белок А=КЗ для обнаружения Аг бруцелл.

6.3. Дот-иммуноанализ с конъюгатом Аг=КЗ для выявления проти-вобруцеллезных антител.

6.4. Апробация дот-иммуноанализа при исследовании клинического материала на бруцеллез.

ГЛАВА 7. ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗ С ЧАСТИЦАМИ КОЛЛОИДНОГО СЕРЕБРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ И АНТИТЕЛ КНИМ.

7.1. Теоретические и методические основы использования коллоидного серебра в качестве маркера иммунных реагентов.

7.2. Разработка дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов бруцелл .'.

7.3. Разработка дот-иммуноанализа для обнаружения противобру-целлезных антител.

7.4. Дот-иммуноанализ для обнаружения антител против бруцелл в L-форме.

7.5. Апробация дот-иммуноанализа при исследовании клинического материала на бруцеллез

ГЛАВА 8. ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗ С ЧАСТИЦАМИ УГЛЕРОДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ.

8.1. Конструирование диагностикума для обнаружения антител на основе антигена, меченного активированным углем.

8.2. Дот-иммуноанализ с угольным диагностикумом при исследовании кроличьих сывороток на бруцеллез.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза"

Актуальность проблемы. Бруцеллез - одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека и животных - выявлен на всех обитаемых континентах земли (Corbel M.J., 1997). Тревожным свидетельством глобального распространения этой болезни стало обнаружение в последние годы естественно инфицированных возбудителем бруцеллеза морских животных - китов, дельфинов, тюленей и других (Foster G. et al., 1996; Jahans K.L. et al., 1997; Cloeckaert A. et al., 2000). В бывшем СССР и России заболевания людей и животных бруцеллезом зарегистрированы практически во всех регионах (Калиновский А.И. и др., 2001; Таран И.Ф., Лямкин Г.И., 1996). В последние годы серьезное внимание уделяется возбудителю бруцеллеза как возможному эффективному средству биологического терроризма (Kortepeter M.G., Parker G.W., 1999; Zoon К.С., 1999).

Полигостальность бруцеллеза, полиморфизм возбудителя, хроническое, часто бессимптомное течение болезни у животных и разнообразие клинических проявлений у людей делают его трудно диагностируемым, что отражается негативно на своевременности начала и, следовательно, - качестве лечения больных.

Серьезную проблему при проведении лабораторной диагностики бруцеллеза представляет факт сходства некоторых антигенов бруцелл, ряда других патогенных и сапрофитных микроорганизмов и даже органов и тканей человека и животных (Ефременко В.И. и др., 2001; Paulsen I.T. et al, 2002). Спектр и структура перекрестно реагирующих Аг, особенно локализованных на поверхности клетки и в силу этого определяющих особенности как специфического, так и неспецифического взаимодействия, нуждаются в дальнейшем изучении. Актуальна проблема изыскания надежных критериев оценки выраженности и значения перекрестных реакций, а также поиск способов их минимизации.

Основным методом лабораторного подтверждения диагноза бруцеллеза человека и животных на протяжении многих лет является серологическое обследование, предусматривающее постановку в разных сочетаниях РХ, РА, РБТ, КТ, РПГА, РСК или РДСК, РК, которые могут быть дополнены РИД, непрямой ИФТ (Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, 1986).

Однако традиционные методы лабораторной диагностики бруцеллеза, используемые в практическом здравоохранении и ветеринарии, не всегда в достаточной мере чувствительны, специфичны, экспрессны, информативны. В связи с этим актуален поиск альтернативных тест-систем, сконструированных на иных принципах, но, тем не менее, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время - технологичность изготовления диагностикумов, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Предложенная в последние годы для диагностики бруцеллеза ПЦР (Шестопалов М.Ю. и др., 1997; 6

Балахонов С.В., 2000) во многом соответствует этим критериям, но, к сожалению, может быть реализована лишь в хорошо оснащенных лабораториях.

В 70-80-х годах прошлого столетия внимание привлекла идея использования имму-нохимических методов обнаружения Аг возбудителя бруцеллеза и Ат к ним. В числе первых из них стали ИФА (Голубинский Е.П. и др., 1982; Меринов С.П. и др., 1984; Carlson Н.Е. et al., 1976; Hurvell В., 1978) и ДИА (Roop R.M. et al., 1987; Chand P. et al., 1989).

Важной тенденцией в диагностической медицине в последнее время является внедрение в практику методов анализа "доктор-офис", позволяющих без значительных затрат на приобретение оборудования и обучение персонала получать информацию в кабинете врача, в домашних или полевых условиях.

В связи с этим остаются актуальными задачи формулирования основных принципов конструирования и применения альтернативных агглютинационным твердофазных тест-систем, подбора наиболее подходящих для них иммуносорбентов, эффективных иммуно-реагентов и маркеров.

Задачи исследования:

• изыскать надежные методические подходы к получению высокоактивных противо-бруцеллезных S- и R-сывороток, пригодных для использования в качестве источника специфических IgG при конструировании чувствительных и специфичных твердофазных иммунохимических тест-систем;

• разработать методические основы конструирования и применения диагностических тест-систем (иммуноферментной, иммуноэритроадсорбционной и вариантов дот-иммуно-анализа) применительно к бруцеллезу;

Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте проведена комплексная оценка пригодности поверхностных антигенных фракций бруцелл для конструирования твердофазных диагностических тест-систем на бруцеллез (а.с. № 316008 от 01.07.90 г.; патент №2051963 от 10.01.96 г.).

Разработаны методические приемы и предложены рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сывороток против корпускулярных и растворимых

Аг бруцелл в гладкой и шероховатой формах (патент № 2051963 от 10.01.96 г.). Впервые предложена схема получения высокоактивной агглютинирующей сыворотки против очищенного ЛПС бруцелл (патент № 2010577 от 15.04.94).

Одними из первых в стране разработаны методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроадсорбционной тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью исследовать экспериментальный, клинический и полевой материал на присутствие возбудителя бруцеллеза в S- и R-формах, растворимых Аг бруцелл и Ат к ним. По результатам межведомственных комиссионных испытаний (Москва, 1985 г.) иммуноферментная тест-система признана соответствующей ОМБТ.

Впервые отработаны методические подходы к конструированию диагностикумов для ДИА с использованием специфических IgG, белка А стафилококка и поверхностных антигенных фракций бруцелл, меченных частицами КЗ, для обнаружения возбудителя бруцеллеза и его Аг, а также противобруцеллезных Ат. Показана возможность исследования с золотосодержащими диагностическими препаратами экспериментального и клинического материала.

Впервые разработаны и апробированы на экспериментальном и клиническом материале методические основы конструирования диагностикумов с использованием в качестве маркеров специфических IgG и антигенных фракций бруцелл частиц КС для детекции корпускулярных и растворимых Аг возбудителя бруцеллеза и Ат к ним (патенты №№ 2202798,2202799,2202800 от 20.04.03 г.

Впервые предложена методика приготовления угольного диагностикума для проведения ДИА на стрипах с целью скрининга сывороток на наличие противобруцеллезных Ат.

Теоретическая и практическая значимость диссертации

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения об антигенных комплексах бруцелл, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области усовершенствования иммунодиагностики бруцеллеза. Полученные материалы послужили методической основой для конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем на бруцеллез. Теоретический аспект исследований состоит и в анализе возможных способов минимизации неспецифических реакций при проведении серологической диагностики бруцеллеза, обосновании рациональности выбора конкретных твердофазных методов лабораторной диагностики бруцеллеза из числа альтернативных; разработке методических приемов конструирования диагностических тест-систем с использованием в качестве маркеров специфических иммунных реагентов различных молекулярных и корпускулярных меток.

Как теоретическое, так и практическое значение имеют материалы изучения иммунохимических свойств Аг бруцелл с точки зрения возможности использования их в качестве специфических зондов при конструировании антигенных диагностикумов для различных серологических реакций, для получения высокоактивных антисывороток, имму-ноаффинной изоляции специфических Ат, количественной оценки содержания Аг в исследуемом материале и т.д.

В связи с тем, что существующие коммерческие агглютинирующие бруцеллезные антисыворотки в виду их невысокой специфической активности не пригодны для использования в твердофазных иммунохимических тест-системах, разработанные методические приемы и рекомендованные рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сывороток против корпускулярных и растворимых Аг S- и R-бруцелл позволяют получать в достаточном количестве специфические Ат, пригодные для использования в нативном состоянии или в виде отдельных фракций для конструирования диагностических препаратов.

По результатам выполненных исследований составлены две инструкции и 12 методических рекомендаций, 2 из которых утверждены на федеральном уровне, получено 7 патентов и авторских свидетельств на изобретения, оформлено 9 рационализаторских предложений. Наши разработки внедрены в практику научно-исследовательского противочумного института Кавказа Закавказья (г. 'Ставрополь), Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск), Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока (г. Магадан), Института ветеринарной медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова (г. Саратов), Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов), Хабаровской противочумной станции Минздрава РФ (г. Хабаровск). Копии актов о внедрении -в приложении.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность и эффективность использования в диагностических твердофазных тест-системах поверхностных антигенных комплексов или индивидуальных фракций возбудителя бруцеллеза;

• Методические подходы и рациональные схемы получения высокоактивных специфических S- и R-сывороток против корпускулярных и растворимых Аг бруцелл, критерии оценки их пригодности для конструирования диагностических препаратов;

• Конъюгирование отдельных антигенных фракций бруцелл со шлепперами, а также сочетанное введение животным комплекса Аг=Ат с феракрилом способствует резкому повышению эффективности иммунизации.

• Методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроад-сорбционной тест-систем, обеспечивают высокую эффективность обнаружения корпускулярных и растворимых Аг возбудителя бруцеллеза в гладкой и в шероховатой формах, а также Ат к ним в экспериментальных и в полевых условиях.

• Методические подходы позволили использовать в процессе конструирования препаратов для диагностики бруцеллеза неорганические маркеры (частицы коллоидных металлов - золота, серебра - и углерода). Полученные тест-системы высокочувствительны, специфичны, универсальны (обнаружение Аг и Ат в экспериментальном и клиническом материале), экспрессны, демонстративны и высоко информативны.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждены на V монголо-советской конференции по профилактике чумы и других особо опасных инфекций. Улан-Батор, 1982; Втором международном конгрессе по эндотоксину (2nd Congress of the International Endotoxin Society). Вена, 1992; Международном симпозиуме "Мониторинг здоровья населения и окружающей среды. Технология и информационные базы данных - 2001". - Греция, о. Крит, 2001; Международной научно-практической конференции "Современный эпидпотенциал природных очагов чумы". Алматы, 2001; Международных научных конференциях (Natural Infectious diseases). Ulaanbaatar, 2001,2002; Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Москва, 1982; Всесоюзной научной конференции специалистов противочумных учреждений "Современные аспекты профилактики зооноз-ных инфекций". Иркутск, 1984; Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций", Ставрополь, 1986; I Всесоюзной научно-практической конференции по иерсиниозам. Владивосток, 1986; Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным". Новосибирск, 1989; Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых инфекционных болезней. Иркутск, 1994; Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1993; VII съезде ВОЭМП. М., 1997; 2-й Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс". Саратов, 1998; Объединенной научной сессии Общего собрания Сибирского отделения РАМН

Новые медицинские технологии". Новосибирск, 2000; Юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". Оболенск, 1999; научной конференции "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций". Ставрополь, 1991; научно-практической конференции "60 лет противочумной службы Кавказа. Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний". Ставрополь, 1995; научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". Новосибирск, 1998; региональной научной конференции "Медико-биологические проблемы Восточной Сибири". Иркутск, 1988; региональной научно-практической конференции "Проблемы природно-очаговых и зооноз-ных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке". Чита, 1993; научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. Иркутск, 1982-2003 гг.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 63 научных публикациях в зарубежных, центральных и региональных изданиях, сборниках трудов конференций, в четырех заключительных отчетах. В Государственном реестре изобретений РФ зарегистрировано 7 патентов и авторское свидетельство.

Основные результаты, приведенные в диссертации, получены лично автором. Исследования по отдельным разделами проводились совместно с сотрудниками биохимического отдела, отдела зоонозных инфекций, лаборатории диагностических сывороток, музея живых кулмур, научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (пос. Кольцово, Новосибирская область).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Загоскина, Татьяна Юрьевна

выводы

1. Из бруцелл разных видов изолирован и охарактеризован по физико-химическим и иммунохимическим свойствам 31 антигенный препарат. Фракция, экстрагируемая из клеток вакцинного штамма В. abortus 19 ВА цетавлоном, обеспечивает наиболее высокую специфичность сконструированных на её основе твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза.

2. Конструирование твердофазных иммунохимических тест-систем для детекции возбудителя бруцеллеза или его антигенов в гладкой форме целесообразнее проводить на основе Ат сывороток, полученных иммунизацией животных живыми вирулентными клетками бруцелл в S-форме; для детекции R-бруцелл или их антигенов - с использованием сывороток, полученных против поверхностных растворимых антигенов R-бруцелл.

3. Протаминсульфат, бычий сывороточный альбумин при конъюгировании с антигенными фракциями бруцелл (КО, ЛПС, БПА), а также феракрил при сочетанном введении с комплексом Антиген=Антитело способствует резкому повышению эффективности иммунизации экспериментальных животных.

4. Разработаны методические основы конструирования ИФА-тест-систем для раздельного и сочетанного обнаружения возбудителя бруцеллеза (и его антигенов) в гладкой и шероховатой формах и противобруцеллезных Ат. Высокая чувствительность, специфичность, универсальность и экспрессность ИФА подтверждена при апробировании метода в экспериментальных и полевых условиях и в процессе государственных межведомственных комиссионных испытаний (Москва, 1985 г.). Для выявления антигенов бруцелл пре-почтителен прямой сэндвич-вариант ИФА, для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотках крови людей - непрямая модификация метода (нИФА). Предлагаемый комплексный RS-антигенный диагностикум для ИФА может быть эффективно использован в смешанных очагах бруцеллеза

6. Разработан иммуноэритроадсорбционный микрометод обнаружения в лабораторных и полевых условиях антигенов S- и R-бруцелл, который при аналогичной специфичности несколько уступает ИФА по чувствительности, но превосходит его по экономичности и доступности ингредиентов реакции. Сконструированный для ИЭАМ конъюгат IgG=3pn-троциты может успешно использоваться как антителъный эритроцитарный диагностикум для РПГА.

7. Разработаны тест-системы для детекции в ДИА антигенов бруцелл и антител к ним с использованием в качестве метки специфических антител, антигенов и стафилококкового белка А частиц коллоидных металлов - золота или серебра ДИА пригоден для исследования на бруцеллез разнообразного экспериментального и клинического материала, харак теризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью результатов. При исследовании антигенсодержащего материала ДИА по ряду параметров превосходит другие твердофазные методы и может быть использован в качестве скринирующего .теста.

8. Предложен простой и экономически доступный вариант ДИА на стрипах для выявления противобруцеллезных антител в сыворотках крови лабораторных животных с использованием: в качестве диагностикума 8% "горячего" солевого экстракта из вакцинного штамма В. abortus 19 В А, меченного частицами активированного угля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бруцеллез - одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека и животных - выявлен на всех обитаемых континентах земли. В бывшем СССР и России заболевания людей и животных бруцеллезом зарегистрированы практически во всех регионах. Полигостальность бруцеллеза, полиморфизм возбудителя, хроническое, часто бессимптомное течение инфекции у животных и разнообразие клинических проявлений заболевания у людей делают его трудно диагностируемым, что негативно отражается на своевременности начала и, следовательно, - качественности лечения больных. В последние годы серьезное внимание уделяется возбудителю бруцеллеза как возможному эффективному средству биологического терроризма (Kortepeter M.G., Parker G.W., 1999; Zoon К.С., 1999).

Объективный мониторинг за эпидемиолого-эпизоотологическими проявлениями бруцеллеза невозможен без использования новых, более информативных лабораторно-диагностических тестов.

Основным способом лабораторного подтверждения диагноза бруцеллеза человека и животных на протяжении многих лет является серологическое обследование, предусматривающее постановку в разных сочетаниях РХ, РА, РПГА, РБТ, РСК или РДСК, РК, которые могут бьггь дополнены реакцией непрямой иммунофлуоресценции, РИД (Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, 1986). Однако традиционные методы лабораторной диагностики бруцеллеза не всегда достаточно информативны. В связи с этим актуален поиск альтернативных тест-систем, сконструированных на иных принципах, но, тем не менее, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время - технологичность изготовления диагностикумов, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, экспрессность.

Серьезную проблему при проведении лабораторной диагностики бруцеллеза создает сходство некоторых Аг бруцелл и ряда других патогенных и сапрофитных микроорганизмов и даже органов и тканей человека и животных (Ефременко В.И. и др., 2001; Paulsen I.T. et al., 2002). Спектр и структура перекрестно реагирующих Аг, особенно локализованных на поверхности клетки и в силу этого определяющих особенности как специфического, так и неспецифического взаимодействия, нуждаются в дальнейшем тщательном изучении. Актуальна проблема изыскания надежных критериев оценки выраженности и значения перекрестных реакций, а также поиск способов их минимизации.

До настоящего времени среди исследователей нет единодушия в выборе конкретной антигенной фракции или отдельного Аг в качестве специфического зонда при конструировании иммунохимических тест-систем для серодиагностики бруцеллеза: одни рекомендуют использовать ЛПС или продукты его деградации (О-ПС, ДПС). Другие изыскивают альтернативные подходы, поскольку большинство неспецифических реакций в ходе проведения лабораторных исследований связано именно с ЛПС. Наиболее перспективными в этом плане представляются протеиновые фракции бруцелл или отдельные полипептиды. Однако и здесь единого мнения не существует, в связи с чем выбору и изоляции наиболее подходящей специфической антигенной фракции мы уделили достаточно серьезное внимание.

В число исследованных Аг вошли КО бруцелл и их составляющие (ЛПС, ДПС, БПА), белковополисахаридные и белковые фракции наружных мембран (всего 31 препарат).

Поскольку ЛПС является иммунодоминантным компонентом микробной клетки и широко используется в серологической диагностике бруцеллеза, мы уделили значительное внимание изучению этого антигенного комплекса. Из множества методов выделения и очистки ЛПС грамотрицательных бактерий применительно к бруцеллам наиболее эффективным является экстракция фенольно-водными смесями, которая обеспечивает, особенно при исполнении по схеме Е. Moreno с соавт. (1979), наибольшее содержание (до 91.1%) и высокую антигенную активность препарата. Другие испытанные реагенты (насыщенный толуолом гипертонический раствор NaCl, растворы хлорида и цитрата натрия, ТХУ, мочевины, солянокислого гуанидина, тритона Х-100) по экстрактивной способности в отношении ЛПС бруцелл существенно уступают фенольно-водной смеси. При химическом анализе в составе выделенных разными способами препаратов, помимо ЛПС, выявлены белок (14.3-27.2% в зависимости от метода выделения), углеводы (16.7-25.3%), НК (0.1-0.91%), КДО (0.16-0.62%). Столь высокое содержание белка указывает на то, что значительная его часть является балластной. Химическую неоднородность полученных препаратов ЛПС подтверждают результаты их изучения в РИД, ИЭФ, ДСН-ПААГЭ, ИБ.

При апробировании целого арсенала приемов избавления нЛПС от балластных компонентов (гельфильтрация, ионообменная и иммуноаффинная хроматография, ультрацентрифугирование, обработка нуклеазами и протеолитическими ферментами, химическими реагентами, термическое воздействие, многократное переосаждение органическими растворителями - самостоятельно или в комплексе) наиболее щадящей, простой по исполнению, но достаточно надежной по конечному результату признана и рекомендована методика получения чЛПС, основанная на многократном переосаждении неочищенного препарата ДМСО и метаноловым реагентом с последующей гельфильтрацией на сефакриле S-300. Освободить нЛПС от значительного количества балластных белков и НК позволяет и обработка его тритоном Х-114. Близка по эффективности, но значительно более трудоемка очистка нЛПС обработкой нуклеазами и протеолитическими ферментами с последующей гельфильтрацией. Препарат чЛПС, полученный нами из клеток штамма В. abortus И-146, содержал не более 2.5% белка, 27.1-28.2% углеводов, следы ИК, до 0.68% КДО, формировал одну линию преципитации в РИД и ИЭФ.

Путем уксуснокислого гидролиза клеток бруцелл получен БПА - белковополисахарид-ный антиген (бруцеллезный протективный антиген по П.А. Вершиловой, Е.А. Дранов-ской, 1975), а при уксуснокислом гидролизе чЛПС - ДПС (Moreno Е. et al., 1981). При сходстве этих препаратов по химическому и антигенному составу БПА отличается от ДПС заметно большим содержанием балластных компонентов, которые определяют различия между ними в иммуногенных свойствах.

Изолированы, изучены и апробированы в различных иммунохимических реакциях и диагностических тест-системах КО; экстракты, полученные при воздействии на S- и R-клетки различных химических реагентов (хлористого натрия, мочевины, цставлона); белковые компоненты НМ, изолированные воздействием и последующим фракционированием ионными детергентами (ДОХ, ДСН) при разной температуре; нативный гаптен.

Все выделенные из бруцелл препараты представляют собой сложные комплексы, включающие липид, полисахарид в сочетании с варьирующим количеством белка и НК. В большинстве препаратов выявлен КДО, что является доказательством присутствия в них ЛПС. Отмечена определенная пропорциональность содержания в исследованных фракциях КДО и ЛПС, которые в наибольшем количестве выявлены в КО, значительно меньше -в 8% "горячем"солевом экстракте, БНМ, экстрагированных ДОХ (37°С) и в наименьшем количестве - в цетавлоновом супернатанте. Антигенная фракция, экстрагируемая из бруцелл цетавлоном, включающая в доминирующем количестве полипептиды м.м. 18-36 кДа, обеспечивает наиболее высокую специфичность сконструированных на ее основе твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза.

При проверке антигенной активности выделенных препаратов установлено, что наиболее активным является ЛПС бруцелл, который в ИФА выявляется в наименьшей по сравнению со всеми остальными фракциями концентрации: 1.0-5.0 нг/мл. Это наблюдение легко объяснимо, если учесть, что при инфицировании человека или животных бруцелла-ми основной пул вырабатываемых Ат направлен против ЛПС как наиболее токсичного компонента клетки. Достаточно высокую антигенную активность проявили БПА, мочевииный и цетавлоновый супернатанты, солевые экстракты. С меньшей активностью взаимодействовали со специфическими Ат БНМ, ДПС, НГ, а также ЛПС и белковые фракции, изолированные из бруцелл в R-форме.

Диагностическую значимость антигенных фракций изучали по их способности взаимодействовать как со специфическими (противобруцеллезными), так и с гетерологичными (коммерческие агглютинирующие кроличьи сыворотки против возбудителей туляремии, чумы, псевдотуберкулеза, кишечных иерсиниозов (сероваров 0:3 и 0:9), лептоспироза, дизентерии, сальмонеллеза, холеры) Ат. Показано, что Ат в бруцеллезных антисыворотках обнаруживались при разведениях последних в диапазоне 810'2-10"7. Установлено, что антигенные фракции бруцелл, в большей степени контаминированные ЛПС, обусловливают меньшую специфичность диагностических тест-систем, сконструированных на их основе. Большая часть поверхностных антигенных фракций бруцелл перекрестно реагировала, хотя и с разной активностью, с гетерологичными Ат кроличьих сывороток. Интересным является факт наличия неспецифического взаимодействия бруцеллезных препаратов с частью сывороток крови доноров (предположительно свободных от бруцеллеза и не подвергнутых специфической вакцинации) в разведениях <8 10'2. Это явление не нашло достаточного отражения в специальной литературе и, вероятно, обусловлено наличием тождественных антигенных комплексов у возбудителя бруцеллеза и организма человека. Правомерность такого мнения подтверждают литературные данные, свидетельствующие об антигенном сходстве возбудителей бруцеллеза, чумы, холеры, патогенов растений, с одной стороны, и органов и тканей человека, животных и растений - с другой (Ефремен-ко В.И. и др., 2001; Станиславский Е.С., 1971', Bjorek L., 1988; Paulsen I.T. et al., 2002). Эти и другие объективные причины будут проанализированы нами ниже.

Из числа исследованных Аг наиболее специфичными оказались цетавлоновый су-пернатант, экстрагированный из вакцинного штамма В. abortus 19 В А (специфичность 85.0±4.0%), 8% "горячий" солевой экстракт из вакцинного штамма бруцелл (специфичность 82.0±4.1%) и фракция БНМ, изолированная из КО В. abortus И-146 с помощью ДОХ при 37°С (специфичность 80.0±3.3%) (перекрестное реагирование с отдельными донорскими сыворотками). Менее специфичными (наличие ложноположительных реакций с шигеллезной и сапьмонеллезной кроличьими сыворотками и рядом донорских сывороток) были 5%-ные "горячие" солевые экстракты (специфичность 75±5.0%), выделенные из вакцинного штамма В. abortus 19ВА при температуре 65°С и водная фаза (водно-фенольный метод выделения ЛПС) (специфичность 79±4.7%, взаимодействие с туляремийной, сапьмонеллезной и шигеллезной гипериммунными кроличьими и отдельными донорскими сыворотками), а также БПА (специфичность 75±5.0%, взаимодействие с кишечной иерсини-озной 0:9, шигеллезной, сапьмонеллезной гипериммунными кроличьими и отдельными донорскими сыворотками). Использование в качестве Аг препаратов ЛПС и его фрагмента - ДПС приводило в большинстве случаев к получению положительных результатов с туляремийной, холерной, сапьмонеллезной, дизентерийной, иерсиниозной 0:9 и чумными гипериммунными кроличьими сыворотками некоторых серий и донорскими сыворотками (специфичность 67±5.2%). Близкие результаты были получены с мочевинными суперна-тантами 1 и 2 и ТХУ-экстрактами (специфичность 68±5.3%). Антигенные комплексы, изолированные из R-бруцелл, также не были строго специфичны и перекрестно реагировали с большинством гетерологичных кроличьих и донорскими сыворотками, хотя и с разной интенсивностью (специфичность 67±5.2%). НГ очень слабо стабилизировал золи коллоидных металлов, вероятно, вследствие наличия в его составе большого количества гидрофобных молекул, что затруднило оценку его эффективности для использования в ДИА.

Важной проблемой явился установленный нами факт недостаточно прочного связывания препаратов ЛПС с молекулярными и корпускулярными маркерами, в частности, с ПХ и частицами коллоидных металлов. Рабочий титр конъюгатов ЛПС=ПХ обычно не превышал 1:40, что не обеспечивало высокой чувствительности определения. Отрицательным моментом использования конъюгатов Аг=КЗ и Аг=КС является небольшой срок сохранения их специфической активности (порядка 2-3 дней). Наши данные подтверждают литературные (Raska I., 1988), что прочному связыванию поверхностных Аг бруцелл с золями золота и серебра препятствует высокое содержание в препаратах гидрофобных молекул, которые слабо стабилизируют золи коллоидных металлов. Поскольку это явление трудно устранимо, мы считаем, что для детекции противобруцеллезных Ат целесообразнее и проще конструировать твердофазные иммунохимические тест-системы не на основе Аг бруцелл, а с использованием антивидовых IgG.

Важным компонентом при конструировании твердофазных иммунохимических тест-систем для детекции Аг бруцелл являются высокоактивные противобруцеллезные сыворотки. Попытки использования коммерческих агглютинирующих сывороток, производимых в стране, оказались безуспешными из-за относительно низкого титра в них специфических IgG-антител.

Оценивая результативность использованных нами традиционных и модернизированных способов и схем иммунизации животных мы установили некоторые закономерности:

• наиболее эффективны схемы, предусматривающие длительное, периодически повторяющееся антигенное воздействие на организм животного, что достигается как двух-цикловыми схемами инъекций Аг, так и увеличением числа инъекций за один цикл;

• подкожное введение Аг, особенно в несколько точек тела одновременно, по эффективности иммунизации превосходит внутривенные инъекции;

• эффективность иммунизации животных резко возрастает при конъюгировании или комплексировании Аг бруцелл с некоторыми потенциирующими препаратами - ПрС, БСА, феракрилом.

• сыворотки, полученные иммунизацией животных живыми вирулентными клетками бруцелл, обладают большей специфической активностью и аффинностью Ат, чем сыворотки, полученные против растворимых Аг бруцелл.

• для получения сывороток против бруцелл в шероховатой форме наиболее приемлсмы водно-солевые экстракты из R-бруцелл, т.к. в организме животного возможна реверсия клеток R—»S, изменяющая картину иммунного ответа.

Полученные материалы позволили выработать определенную тактику получения сывороток и критерии оценки пригодности их использования для целевого назначения. Главными из них мы считаем то, что конструирование твердофазных иммунохимических тест-систем для детекции S-бруцелл и их Аг целесообразнее проводить на основе Ат сывороток, полученных иммунизацией животных живыми вирулентными клетками бруцелл в S-форме. Титр специфических Ат этих сывороток в ИФА должен составлять не менее 310"6, в РИД - не менее 1:64. При детекции R-бруцелл и их Аг оправдано использование Ат сывороток, полученных против поверхностных растворимых R-Ar. Титр специфических Атэтих сывороток должен составлять не менее 8.2-10'5 в ИФА и 1:32 в РИД.

Эволюционное многообразие форм возбудителя бруцеллеза, пластичность его биологических свойств и обусловленное этим своеобразие антигенной структуры разных представителей рода бруцелл существенно затрудняют разработку универсального диагностического теста Очевидно, например, что современные тест-системы, сконструированные на основе анти-5-сывороток, не применимы или, во всяком случае, ограниченно применимы для идентификации В. ovis. В. canis и природных R-диссоциантов бруцелл других видоа

С учетом этого обстоятельства мы решали не только задачу повышения чувствительности и специфичности разрабатываемых методов лабораторной диагностики бруцеллеза и индикации возбудителя в разных объектах, но и расширения диапазона их применения, универсализации. Наличие в нашем распоряжении индивидуальных и групповых Аг бруцелл и высокоактивных противобруцеллезных анти-S- и анти-R-c ыво роток, дало возможность идти по пути разработки тест-систем как персонального, так и одновременного обнаружения бруцелл в гладкой и шероховатой формах.

В процессе отработки техники постановки ИФА для обнаружения Аг возбудителя бруцеллеза мы испытали прямой и непрямой сэндвич-варианты реакции, конкурентный метод, а также биотин-авидиновую систему. В ходе сравнительного анализа в качестве оптимальной при обнаружении Аг бруцелл выбрали прямую сэндвич-модификацию ИФА, которая наряду с высокой чувствительностью (>2.5-104 КОЕ/мл - корпускулярных S-Ar, >1.0 нг/мл - растворимых Аг) и специфичностью обеспечивала экспрессность анализа.

Из апробированных ферментов предпочтение отдано ПХ, которая выгодно отличается от щелочной фосфатазы, уреазы и пенициллиназы возможностью широкого выбора субстратов ферментативной реакции, а избранные хромогены (ортофенилендиамин или 2,2 (3,3)-дианизидин) обеспечивают получение контрастного окрашивания реакционной смеси, облегчающего учет результатов ИФА как визуальным, так и инструментальным способами.

В настоящее время на базе НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва) производятся ИФА-наборы для выявления Аг возбудителя бруцеллеза и Ат к ним. Преимуществом наших разработок является реализация идеи получения конъюгата Ат=ПХ не только на основе S-IgG, но и R-IgG, а также их смеси. При использовании этой же смеси и для получения твердофазного иммуносорбента создается возможность одновременного выявления S- и R-бруцелл или их Аг, причем без заметного снижения чувствительности метода. Это имеет большое практическое значение при работе в смешанных очагах бруцеллеза.

О специфичности ИФА при обнаружении Аг бруцелл свидетельствуют отрицательные результаты исследования материала, содержащего массивные дозы грамотр и нательных бактерий 9 видов. Положительные результаты с Y. enterocolitica 0:9 не изменяют этого заключения, поскольку перекрестные реакции имеют место лишь при очень высоких концентрациях иерсиний (>107).

Хорошие диагностические возможности ИФА продемонстрированы нами и при обнаружении противобруцеллезных Ат в экспериментальном и клиническом материате. Наиболее репрезентативной признана непрямая модификация ИФА, при которой для сенсибилизации лунок планшета использовали БПА, а иммуноферментные конъюгаты готовили на основе антивидовых Ат (против IgG кролика, барана или человека) и ПХ.

Независимо от объекта исследования, показана высокая чувствительность метода: у иммунизированных животных и больных бруцеллезом людей титр специфических Ат в ИФА достигал 810'2-10'7. В отдельных исследованных человеческих сыворотках отмечены положительные результаты (в разведениях <810"), что обусловлено рядом объективных причин, которые будут проанализированы ниже.

При оценке специфичности нИФА для обнаружения противобруцеллезных Ат с использованием коммерческих и экспериментальных гетерологичных кроличьих сывороток (противочумной, кишечной иерсиниозной 0:3 и 0:9, псевдотуберкулезной, дизентерийной, сальмонеллезной), лошадиной противотуляремийной сыворотки, а также НКС, HJIC и НЧС положительные результаты получены только с сыворотками против возбудителей кишечного иерсиниоза 0:9.

Апробация нИФА в полевых условиях подтвердила высокую чувствительность, специфичность и информативность метода при исследовании сывороток человека, северных оленей, КРС и некоторых хищных животных (Голубинский Е.П. и др., 1982; Меринов С.П. и др., 1984; Карепин Е.Ю. и др., 1991). Перспективность ИФА как метода индикации возбудителя бруцеллеза или его Аг показана нами при исследовании свежевзятых пантов и органов северных оленей, волков и песцов, выборочном обследовании коренного населения Билибинского района Магаданской области (Карепин Е.Ю. и др., 1991). Высокая чувствительность и специфичность ИФА при обнаружении Аг бруцелл подтверждена на государственных комиссионных испытаниях метода на базе НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва, 1985 г.).

Принципы, лежащие в основе ИФА при обнаружении Аг бруцелл, частично заимствованы нами при конструировании для индикации возбудителя бруцеллеза и его Аг им-муноэритроадсорбциошюго теста. Положительным моментом такой тест-системы является ее независимость от импортных и дорогостоящих отечественных реактивов и оборудования, отказ от работы с вредными для персонала и окружающей среды субстратами. Привлекательным элементом ИЭАМ является использование в качестве маркера Ат эритроцитов, которые, хотя и страдают известными недостатками, тем не менее, широко применяются в различных диагностических тестах, хорошо известных работникам практических учреждений.

По принципу постановки ИЭАМ сходен с прямым сэндвич-вариантом ИФА: в том и другом случаях имеет место трехкомпонентная система, включающая Ат, искомый Аг и меченые эритроцитами Ат. Сходство методов проявляется и в том, что первые два этапа -сенсибилизация твердой фазы специфическими Ат и реакция иммуносорбции искомого Аг по качественному составу взаимодействующих компонентов в том и другом случаях идентичны. Что касается третьего этапа - взаимодействия Аг с конъюгатом, то в ИФА и в ИЭАМ он различается как по физико-химическим характеристикам конъюгатов, так и по механизмам их действия.

В результате сравнительного изучения эритроцитов человека, животных и птиц предпочтение отдано бараньим эритроцитам, которые, помимо доступности, легко поддаются необходимой технологической обработке (сферизация, стабилизация), активно взаимодействуют с IgG, обладают оптимальной седиментационной способностью, не подвергаются спонтанной агглютинации. Приготовленные на их основе IgG=C3-rA конъюгаты стабильно сохраняют исходные свойства при консервации или в лиофилизированном виде 12-14 мес.

В ИЭАМ в качестве твердой фазы рекомендовано использовать 60-луночные микрокамеры с объемом лунок 20 мкл (камеры Терасаки), что позволяет миниатюризовать тест, осуществляя его в микромодификации, и повысить производительность и экспрессность метода.

По чувствительности ИЭАМ несколько уступает ИФА, но, тем не менее, позволяет выявлять нанограммовые количества растворимых и несколько десятков тысяч КОЕ/мл корпускулярных (S- и R-) антигенов (5 104-2 105 КОЕ/мл). Подобно ИФА, ИЭАМ высокоспецифичен и имеет многоцелевой универсальный характер применения, что позволяет использовать его при исследовании разнообразного материала как в лабораторных, так и полевых условиях (Загоскина Т.Ю. и др., 1988, 1989; Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., 1989). Дополнительным достоинством S-IgG- и R-IgG-эритроцитарных конъюгатов является возможность их использования в РПГА в качестве антительного диагностикума.

При всех отмеченных достоинствах ИФА и ИЭАМ в обеих тест-системах используются маркеры биологического происхождения, что, безусловно, обусловливает лабильность соответствующих диапюстикумов под влиянием разнообразных внешних воздействии и временного фактора. Не случайно, в последнее время наблюдается тенденция замены биологических маркеров более прочными синтетическими или неорганическими, в частности частицами коллоидных металлов.

В процессе конструирования диапюстикумов для ДИА мы теоретически рассчитали и эмпирически подобрали оптимальные условия адсорбции частиц металлов с каждой используемой антигенной фракцией бруцелл, белком А стафилококка или IgG. Крайне важным являлось определение количества иммунного реагента, адсорбируемого на частицах золя и обеспечивающего стабильность приготовленного комплекса. Постановка ДИА и учет результатов традиционны, едины независимо от используемой в диагностикумах метки (золото, серебро).

Для получения КЗ одинаково пригодны оба апробированные способа восстановления золотохлористоводородной кислоты - цитратом и боргидридом натрия.

Для обнаружения Аг бруцелл сконструированы диагн ости кумы на основе противобруцеллезных IgG и стафилококкового БА, меченных частицами КЗ. Установлено, что растворимые Аг бруцелл (ЛПС и БПА) в ДИА с конъюгатом IgG=K3 обнаруживались в концентрации 8-64 нг/мл. При обработке мембран гидрохиноном и лактатом серебра чувствительность метода существенно (в 3.2-16 раз) возрастала, и оба Аг обнаруживались уже в концентрации 0.5-10 нг/мл. Чувствительность ДИА в отношении корпускулярных антигенов S-бруцелл варьировала в диапазонах 1.2510s-510$ (обычный вариант) и 3.91036.25-104 (усиленный вариант) КОЕ/мл. Бруцеллы в R-форме (В. ovis, В. canis) или в неза-вершившейся стадии R-диссоциации (В. abortus 82) выявлялись в ДИА в значительно более высоких концентрациях (1.9 1 06-3.12 108 КОЕ/мл). В объектах внешней среды и биологическом материале возбудитель бруцеллеза обнаруживался в концентрации 3.9 1031.9 106 КОЕ/мл. Вид исследуемого образца (вода, почва, корма, молоко, смывы с разных объектов, сыворотка крови или внутренние органы животных) на чувствительность анализа существенного влияния не оказывал. Тем не менее, исследование в ДИА некоторых образцов (гемолизированная кровь, желчь и т.п.) ограничено ввиду прочного окрашивания мембраны пигментами при нанесении исследуемой пробы.

Для создания универсального диагностикума вместо противобруцеллезного IgG использован стафилококковый БА. ДИА с конъюгатом БА=КЗ успешно применен для выявления Аг бруцелл в искусственно контаминированных объектах внешней среды - воде, почве, сене, кормах, смывах с инвентаря при чувствительности (7.8-104-25Т04 КОЕ/мл) и специфичности, сопоставимыми с аналогичными категориями при использовании конъюгата IgG=K3. Достоинством конъюгата БА=КЗ является его универсальный характер, поскольку он может использоваться для индикации не только Аг возбудителя бруцеллеза, но и возбудителей других инфекционных болезней, для чего дополнительно необходимо иметь лишь набор антисывороток к искомым патогенам.

Специфичность ДИА с золотым маркером доказана в опытах с детектированием F. tularensis, Sh. flexneri, S. typhimurium, V. cholerae, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica 0:3, E. coli, P. vulgaris, которые, в отличие от бруцелл, не выявлялись даже в а максимальной из испытанных концентраций - 10 КОЕ/мл. Исключение составили клетки Г. enterocolitica 0:9, формировавшие окрашенные пятна в концентрации >106 КОЕ/мл, что обусловлено общими детерминантами ЛПС кишечных иерсиний и бруцелл (Умнова Н.С. и др., 1987; Желудков М.М., 1996, Caroff М. et al., 1984; Hurvell В., 1873). Полученные результаты расцениваются как свидетельство высокой специфичности разработанной диагностической тест-системы.

При конструировании диагностикума для выявления в сыворотках крови людей и животных специфических Ат мы апробировали ряд S- и R-антигенных фракций бруцелл. Основная задача состояла в отборе такого препарата, который, во-первых, обладал бы достаточно высокой стабилизирующей способностью по отношению к золю золота, а, во-вторых, обеспечивал бы максимально возможные чувствительность и специфичность метода. Установлено, что заданным принципам в наибольшей мере соответствуют конъюгата на основе цетавлонового супернатанта, в несколько меньшей - БПА и водной фазы (вводно-фенольный метод экстракции ЛПС по Е. Moreno с соавт., 1979). При высокой чувствительности (титры специфических Ат в диапазоне 4Т0"2-10"6) специфичность ДИА при использовании цетавлонового супернатанта=КЗ составила 85.0±4.0, Б ПА-КЗ - 75±5.0 и ВФ=КЗ - 79±5.4%. Более низкие показатели специфичности анализа отмечены при использовании конъюгатов ЛПСНКЗ (65±5.5%), ДПС=КЗ (67±5.2%) и 10% солевой экс-тракт=КЗ (70±5.4%). Наиболее выраженные перекрестные реакции в ДИА с БПА=КЗ и ВФ=КЗ наблюдались с сыворотками против Y. enterocolitica 0:9, однако в невысоких титрах (<1:800) имели место с шигеллезной, сальмонеллезной антисывороткам и и отдельными сыворотками крови доноров.

При сопоставлении материалов ДИА с золотым маркером, ПЦР и бактериологического метода при детекции Аг бруцелл в динамике инфекционного процесса у морских свинок, зараженных вирулентными штаммами возбудителя, наибольшее количество положительных ответов зафиксировано в ДИА (72.0%). Информативность бактериологического анализа и ПЦР была существенно ниже (18.7 и 36.0%, соответственно). Больший процент положительных находок в ДИА, чем в ПЦР, объясняется, на наш взгляд, возможностью детекции наряду с корпускулярными субкорпускулярных фракций (дериватов микробных клеток), а также растворимых Аг. Это согласуется с данными С. Romero с со-авт. (1995), у которых при параллельном исследовании проб молока от больных животных в ИФА и ПЦР чувствительность первого составила 98.2, второго - 87.5%.

ДИА с золотосодержащим маркером успешно применен для обнаружения Аг бруцелл и специфических Ат в сыворотках крови больных бруцеллезом людей из городской инфекционной больницы и сыворотках крови КРС, взятых на Иркутском мясокомбинате.

Исходя из материалов исследований, можно констатировать, что все варианты ДИА с частицами КЗ, рекомендуемые для обнаружения Аг бруцелл и противобруцеллезных Ат высокочувствительны, экспрессны, экономичны, доступны, с успехом могут использоваться при проведении массового скрининга эпидемиологически значимого материала на бруцеллез.

Диапюстикумы, сконструированные нами по принципу физической адсорбции на частицах маркера специфических иммунореагентов (IgG или Аг), позволили выявлять как Аг бруцелл, так и Ат к ним. Оригинальность нашего подхода подтверждена получением положительных решений Роспатента РФ на выдачу трех патентов.

Результаты индикации бруцелл или их антигенных фракций позволяют характеризовать ДИА с использованием серебряного маркера как высокочувствительный метод. Растворимые Аг выявляются в нанограммовых количествах (ЛПС - в концентрации 4.4±0.8, БПА - 16.0±3.2 нг/мл). Чувствительность анализа при индикации корпускулярных Аг варьирует более широко и зависит от ряда причин, в частности, состояния диссоциации: бруцеллы в S-форме выявляются в диапазоне концентраций 15.610J-6.24 104, тогда как бруцеллы в R-форме - в концентрации

3.9-106 КОЕ/мл.

При исследовании контаминированных бруиеллами объектов внешней среды возбудитель бруцеллеза легко обнаруживается в сложных смесях

52.0103±2.410J

63.810J±2.810J КОЕ/мл), причем вид исследуемого объекта не отражается на конечных результатах анализа

Специфичность диагностической тест-системы обнаружения Аг доказана отрицательными результатами исследования в ДИА микроорганизмов традиционного набора: ни один из них не обнаружен даже в максимальной (108 КОЕ/мл) испытанной концентрации.

195

Исключение составили клетки Y. enterocolitica 0:9, которые формируют окрашенные пятна при концентрации микроба >10б КОЕ/мл.

При конструировании тест-систем для обнаружения противобруцеллезных Ат в ДИА апробирована 31 выделенная нами поверхностная фракция бруцелл. Наибольшие стабилизирующую способность, чувствительность и специфичность в составе "серебряного" ди-агностикума обеспечил цетавлоновый супернатант (специфичность 85.0±4.0%); несколько меньшую - 8% "горячий" солевой экстракт (82.0±4.1%) и фракция БНМ ДОХ 37°С (80.0±3.3%). Эти диагностикумы не взаимодействовали с гетерологичными сыворотками животных, а ложноположительные результаты (в невысоких титрах) возникали преимущественно при работе с сыворотками крови человека. Практически равноценные по стабилизирующим свойствам и чувствительности результаты получены при использовании в ДИА конъюгатов серебряного маркера с БПА (75.0±5.0%), 5% "горячим" солевым экстрактом (75.0±5.0%) и водной фазой по Е. Moreno с соавт. (1979) (79.0±4.7%), однако ложноположительные результаты в этих случаях имели место не только при работе с донорскими, но и с гипериммунными кроличьими шигеллезной, иерсиниозной 0:9 и саль-монеллезной сыворотками. Все другие антигенные фракции в составе диагностикумов в невысоких титрах перекрестно реагировали с несколькими гетерологичными кроличьими сыворотками - холерной, шигеллезной, иерсиниозной 0:9, туляремийной и сальмонеллез-ной.

ДИА с серебросодержащим маркером успешно апробирован при исследовании сывороток крови людей из городской инфекцйонной больницы с разными клиническими формами бруцеллеза; работников Иркутского мясокомбината; сывороток крови КРС, взятых на Иркутском мясокомбинате. Параллельно материал исследован в традиционных серологических реакциях. Установлено, что рутинные серологические реакции уступают по чувствительности ДИА. Наибольшее количество положительных результатов при хроническом бруцеллезе получено в ДИА, затем по убывающей - в РК, РХ, РПГА, РА, РДСК. В ряде случаев в виду недостаточной чувствительности специфические Ат в традиционных серологических реакциях не выявлялись даже в сыворотках крови от больных с документированным диагнозом бруцеллеза. В ДИА оказалось возможным определение Ат не только в сыворотках крови больных бруцеллезом людей (в указанном материале в ряде случаев выявляются и Аг бруцелл), но и поствакцинальных Ат. Во всех сыворотках крови КРС выявлен невысокий уровень поствакцинальных противобруцеллезных Ат.

В связи с особой актуальностью разработки методических приемов по обнаружению атипичных форм возбудителя бруцеллеза и с учетом накопленного опыта нам удалось сконструировать диагностическую тест-систему для выявления Ат к бруцеллам в L-фор-ме. Специфические Ат в экспериментальных кроличьих сыворотках, полученных иммунизадней кроликов бруцеллами в L-форме, обнаруживались в титрах >1.6-10"3. При параллельном исследовании этих сывороток в традиционных серологических реакциях (РА, РПГА) получены отрицательные результаты, что подтверждает высокие диагностические возможности и большую информативность ДИА.

Таким образом, сконструированные серебросодержащне тест-системы в сравнении с традиционными серологическими реакциями на бруцеллез более чувствительны, экс-прессны, экономичны (объем исследуемого образца 1-2 мкл), а в случае обнаружения Ат к L-бруцеллам - уникальны. Постановка ДИА может осуществляться даже в слабо оснащенных лабораториях и в полевых условиях, не требует специально подготовленного персонала. Недостатком антигенных диагностикумов является ограниченный срок годности препаратов, что связано с особенностью физико-химического состава Аг бруцелл, состоящих преимущественно из гидрофобных структур и поэтому недостаточно прочно стабилизирующих золь серебра и сравнительно недолго удерживающихся на нем.

При постановке ДИА на пористых подложках с использованием частиц коллоидных металлов нельзя не учитывать малые линейные размеры маркеров, позволяющие диагно-стикуму проникать глубоко в поры мембраны, в связи с чем возникают сложности отмывания твердой фазы от не связавшегося препарата. Как правило, при этом отмывочные процедуры предусматривают длительную инкубацию подложки в промывающем буфере с многократной сменой последнего, часто с активацией отмывания на мешалке или шутте-ле. Такие отмывочные процедуры увеличивают время проведения анализа, однако, и они не всегда бывают достаточно эффективными. Как следствие, может формироваться высокий фон подложки. Преодоление этого недостатка возможно при использовании в качестве маркеров более крупных частиц, в частности, - углеродных.

Весьма практичной и дешевой меткой является углеродный маркер - активированный уголь. Положительное качество активированного угля - универсальность его сорбци-онных свойств в отношении разнообразных лигандов при физиологических значениях рН. Кроме того, использование сравнительно крупных частиц маркера облегчает процедуры отмывания как самого диагностикума в процессе его приготовления, так и твердофазного носителя от не связавшегося угольного препарата, поскольку крупные размеры частиц диагностикума не позволяют ему проникать глубоко в поры подложки. В зависимости от поставленной задачи сенситинами активированного угля могут быть Ат, Аг, стафилококковые белки А и G, стрептавидин и др.

Для конструирования антигенного диагностикума с целью выявления противобруцеллезных Ат в сыворотках крови экспериментальных животных мы избрали 8% "горячий" солевой экстракт из клеток В. abortus 19 ВА. При испытании в лабораторных условиях специфические Ат в титрах 1:50-1:800 выявлены во всех кроличьих противобруцеллезных сыворотках (35 серий), полученных в разные годы против растворимых и корпускулярных Аг бруцелл и хранившихся лиофилизированными в условиях холодильника. При этом высота титров Ат в ДИА и ИФА в абсолютном большинстве случае находились в прямой корреляции: чем выше титр Ат в ДИА, тем он выше и в ИФА. Гетерологичные кроличьи сыворотки и ИКС в ДИА с угольным диагностикумом были отрицательными.

Предлагаемый угольный диалюстикум за счет высокой контрастности маркера позволяет достигнуть достаточную чувствительность иммуноанапиза, а универсальная адсорбирующая способность маркера позволяет легко получать широкий спектр диагностических препаратов на основе разнообразных Аг, антивидовых IgG и других иммунореа-гентов. Способ применения угольного диапюстикума прост, не требует квалификации оператора и регистрирующей аппаратуры. Низкая стоимость маркера, экономное использование иммунореагентов, а также малые энерго- и трудозатраты при производстве являются дополнительными его достоинствами. Разработанный вариант ДИА может быть рекомендован для первичного скрининга сывороток крови на бруцеллез.

Резюмируя весь полученный материал по конструированию и применению твердофазных иммунохимических тест-систем для лабораторной диагностики бруцеллеза, следует еще раз подчеркнуть их достаточно высокую чувствительность и специфичность при исследовании материала на наличие Аг (корпускулярных и растворимых) бруцелл. Из патогенных бактерий, пожалуй, единственным исключением являются Y. enterocolitica 0:9, положительно реагирующая в бруцеллезной тест-системе, что обусловлено наличием общих компонентов ЛПС кишечных иерсиний и бруцелл (Желудков М.М., 1982, 1983; Ум-нова Н.С. и др., 1987; Diaz-Aparicio Е. et al., 1993; Kittelberger R. et al., 1998). Однако в клинико-лабораторном диагнозе это обстоятельство по разным причинам, а том числе несходству клинической картины заболевания бруцеллезом и иерсиниозом, не играет решающей роли.

Более сложной представляется ситуация при использовании лабораторных методов, в том числе твердофазных, для обнаружения Ат в биологических жидкостях макроорганизма (человека или животных). В этом процессе, как нами неоднократно указываюсь выше, имеют значение не только метод исследования, но и (иногда даже в большей мере) характер исследуемого материала С недавних пор известно, что сыворотки крови здоровых людей могут содержать Ат к ряду инфекционных агентов - Sh.flexneri, S. abortus equi, S. typhimurium, S. enteritidis. P. aeruginosa, E. coli 026:B6, 02 (Ванеева Н.П. и др., 1995; Левина Л.А. и др., 1995; Gad EI-Rab М О., Kambal A.M., 1998). Л.А. Левина с соавт. (1995) обнаружила противоэшсрихиозные Ат не только в сыворотках крови доноров, но и в коммерческих препаратах иммуноглобулинов человека "Провокационную" роль могут сыграть установленные факты общности Аг и генома бруцелл, некоторых компонентов органов и тканей человека, патогенов и симбионтов растений и животных (Ефременко В.И. и др. 2001; Paulsen I.T. et al., 2002). Е.С. Станиславский (1971) указал на сходство углеводного состава и структуры некоторых микробных полисахаридов с эритроцитами человека и определенными компонентами растений отдельных видов.

Очевидно, что возможность перекрестного реагирования и получения ложнополо-жительных результатов может в той или иной мере отразиться на специфичности диагностической тест-системы. В своих экспериментах мы подтвердили эти наблюдения, отметив наличие положительных результатов в бруцеллезных тест-системах при исследовании сывороток донорской крови.

Нельзя сбрасывать со счета и факт, что бруцеллы содержат поверхностные Аг, сходные с аналогичными компонентами целого ряда патогенных и даже сапрофитных микроорганизмов (Moreno Е. et al., 1990; Freer Е. et al., 1996; Weynants V. et al., 1996; Drancourt M. et al., 1997; Kittelberger R. et al., 1995, 1996, 1998; Velasco J. et al., 1998,2000), а человек в течение жизни непременно сталкивается с этими возбудителями. Одним из факторов, способных отрицательно сказаться на чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, является способность S- и R-ЛПС (так же как ЛПС Е. coli) неспецифически связываться с IgM сывороток крови, что приводит к появлению ложноположитель-ных результатов (Lamb V.L. et al., 1979). Известно также, что Ат к коровой части ЛПС могут являться причиной "природного иммунитета" к некоторым бактериям, а Ат к липиду А могут быть обнаружены в нормальных сыворотках после перенесенной инфекции, вызванной любыми грамотрицательными бактериями. Это указывает на то, что при определенных условиях данный Аг экспонируется на клеточной поверхности и может индуцировать образование Ат (Warren H.S., Chedid L.A., 1988; Warren H.S. et al., 1988). Следует также иметь в виду, что при многих инфекционных заболеваниях, в частности при бруцеллезе, развиваются аутоиммунные реакции с выработкой аутоантител. В числе механизмов, которые приводят к возникновению аутоиммунных нарушений, предполагается реакция организма на перекрестно реагирующие экзогенные бактериальные антигены (Петров Р.В., Зарецкая Ю.М., 1970; Станиславский Е.С., 1971; Ефременко В.И. и др. 2001). Можно надеяться, что все эти проблемы в будущем будут преодолены, однако на нынешнем этапе наиболее кардинальным способом их устранения, с нашей точки зрения, может быть подбор специфичного Аг для конструирования на его основе диагностического препарата.

1. При исследовании экспериментального, полевого и клинического материала на наличие возбудителя бруцеллеза или его Аг целесообразнее использовать ДИА с коллоидными металлами. Основными критериями, определяющими этот выбор, являются высокая чувствительность и специфичность разработанных тест-систем, простота приготовления диагностикумов, позволяющая сохранить нативность и специфическую активность препаратов IgG, адсорбируемых на частицах коллоидных металлов, в противовес химическому связыванию IgG с ферментом (ПХ) в случае конструирования конъюгата для ИФА, при котором возможно снижение как каталитической функции фермента, так и антиген-связывающн активности Ат. Немаловажное значение имеет безопасность работы для персонала (отсутствие токсичных или канцерогенных ингредиентов), более низкая себестоимость анализов, миниатюризация (объем тестируемого материала - 1 мкл). Выбирая из двух коллоидных металлов - золота и серебра, предпочтительнее использовать золь серебра как более дешевый и доступный. Если концентрация возбудителя либо его Аг в образце достаточно высока и нет необходимости осуществлять усиление результатов реакции, то логичнее использовать золь золота, т.к. в положительных случаях формируются окрашенные в розовый цвет пятна и отпадает необходимость в дополнительном проявлении результатов, что обеспечивает большую экспрессность анализа.

2. При исследовании экспериментального материала от животных на наличие про-тивобруцеллезных Ат мы также рекомендуем использовать ДИА с коллоидными металлами и одной из рекомендованных антигенных фракций бруцелл.

3. При исследовании клинического материала (сыворотки крови людей) целесообразнее, на наш взгляд, использовать нИФА. Несмотря на то, что по литературным данным, ИФА при работе с человеческими сыворотками не является абсолютно специфичным методом, количество или выраженность неспецифических реакций в этом тесте несколько ниже, чем в ДИА с коллоидными металлами. Это может быть связано с тем, что:

• нитроцеллюлозные мембраны по сорбционной емкости значительно превосходят полистироловые планшеты, в результате чего они с большей плотностью адсорбируют разнообразные по молекулярной массе и заряду фракции сыворотки крови;

• Твин 20, используемый для разведения образцов сывороток и отмывания планшетов в ИФА, обеспечивает уменьшение количества неспецифических реакций, в то время как в ДИА с КС этот детергент применять нельзя из-за формирования в его присутствии агрегатов коллоидных частиц;

• проявляющая активность растворов в ДИА значительно выше, чем в ИФА. Механизм проявления различен. В ДИА реакция автокаталитическая, поэтому потенциальная возможность этой реакции очень высока, а обеспечиваемая чувствительность может выражаться в пикограммовых количествах. Одна молекула фермента в ИФА расщепляет определенное количество молекул субстрата, в связи с чем возможности каталитической реакции ограничены.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Загоскина, Татьяна Юрьевна, Владивосток

1. Альтон Дж., Джонс Л.М. Лабораторные методы диагностики бруцеллеза. Женева, 1968.-С. 41-61.

2. Арбулиева Е.А. Клинико-патогенетическое значение инфекционной антигене-мии при различных формах бруцеллеза : Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1985. -21 с.

3. А.с. 467933 СССР МКИ Ф\А 61 К 39/00. Способ получения антигена (для профилактики бруцеллеза) / Вершилова П.А., Драновская Е.А. Заявка 28.07.72; Опубл.: Бюл. ГКИО. - 1975. - № 15. - С. 48.

4. Афанасьев Е.Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella II Автореф. дисканд. мед. наук. Саратов, 1984. - 20 с.

5. Ахмедов А.Н., Рыбкин B.C., Тихонов Н.Г. и др. Информативность иммунофер-ментного анализа при поиске антигенов бруцелл // Особо опас. инфекции на Кавказе : Тез. докл. Ставрополь, 1987. - Ч. 1. - С. 24-26. ■

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962. - 180 с.

7. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры и бруцеллеза (эпидемиологическое и диагностическое значение) : Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 2000. - 33 с.

8. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И. Оптимизация детекции бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции // Мол. генетика, микробиол., вирусол. 1996.-№4.-С. 33-35.

9. Барамова Ш.А., Клименко В.А., Султанов А.А. Эффективность применения антительного эритроцитраного диагностикума в лабораторных и производственных условиях при обнаружении бруцелл // Бруцеллез с.-х. жив-х. Омск, 1989. - С. 107-112.

10. Барыкинский Г.М., Тузиков Ф.Б. Физико-химические свойства фотогидрозолей серебра и других препаратов на его основе по данным спектрофотометрии, спектроскопии

11. УПКР, рентгеноструктурного анализа и других методов // Препринт № 5 : Серебро в медицине, биологии и технике. Новосибирск, 1996. - С. 136-157.

12. Березин И.В., Угарова Н.Н., Киршенгольц Б.М. Метод очистки пероксидазы // Биохимия. 1975. - Т. 40, № 2. - С. 297-301.

13. Богатырев В.А., Дыкман JI.A.r Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиол. 1991. - Т. 60. - С. 524-529.

14. Богданчикова Н.Е. Зайковский В.И. Коломийчук В.Н. и др. Физико-химические свойства препаратов коллоидного серебра // Препринт : Коллоидное серебро. Физико-химические свойства. Применение в медицине. Новосибирск, - 1992. - С. 5-14.

15. Борен К, Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами // М.,1986.- 660 с.

16. Борисов В.А., Малов И.В., Аитов К.А. и др. Современное состояние проблемы бруцеллеза (лекция для практических врачей) // Журн. инфекционной патол. 2000. -№ 1-2. - С. 57-79.

17. Бусев А.И., Иванов В.М. Аналитическая химия золота. М., 1973. - 245 с.

18. Ванеева Н.П., Янишевская М.Н., Александрова Т.Н., Яншина И.Л. Определение специфических токсинов Pseudomonas aeruginosa в коммерческих препаратах иммуноглобулина человека // Журн. микробиол. 1995. -№ 1. - С. 59-61.

19. Венгеров Ю.Ю., Булгарина Т.В., Кущ А.А. и др. Современные методы иммуноанализа (иммуноферментного) для диагностики вирусных инфекций // Биотехнология.1987. Т. 3, № 3. - С. 291-295.

20. Вершилова П.А., Драновская Е.А. Бруцеллезный протективный антиген, его химическая и иммунобиологическая характеристика // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1976. - № 3. -С. 333-335.

21. Вершилова П.А., Чернышева М.И., Дубровская И.И. и др. Изучение диагностической ценности реакции пассивной гемагглютинации при бруцеллезе // Сов. Медицина -1969.-№1.- С. 128-131.

22. Винокуров В.М. Химическое серебрение зеркал. М., 1950. - 156 с.

23. Власов Г.С., Судовцов В.Е., Шепелева И.Б., Краснопоршина Л.И. Точечный им-муноферментный анализ в биологических исследованиях // Науч. докл. Высшей школы. Биологические науки. 1991. 4. - С. 5-21.

24. Габдуллина В.Н., Распопин B.JI., Розенсон Р.И. и др. Приготовление антительного диагностикума для выявления антигенемии у больных бруцеллезом // Ветеринария. -1989. -№ 1. С. 49-51.

25. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.Б., Егоров А.М. Получение и свойства иммуно-пероксидазных комплексов // Биохимия. -1979. Т. 44, вып. 2. - С. 1614-1621.

26. Гайер Г. Электронная электрохимия. М., 1974. - 488 с.

27. Гаранина С.Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза : Автореф. дис.канд. мед. наук.1. Саратов, 1996.-20 с.

28. Гайдара Б., Желудков М.М., Чернышева М.И. Оценка эффективности лабораторных методов диагностики бруцеллеза // Журн. микробиол. 1994. - № 4. - С. 55-58.

29. Гнутов И.Н., Ерохина С.Г. Изучение возможной роли возбудителя энзоотичного аборта овец в инфекционной патологии человека // Журн. микробиол. 1980. - № 2. -С. 34-38.

30. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю. Иммуноэритроадсорбционный метод обнаружения антигенов бруцелл // Ред. журн. "Лабораторное дело". М., 1989. - 7 с. Деп. ВИНИТИ 12.09.89, № 5827-В89.

31. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю. и др. Некоторые свойства ли-пополисахарида бруцелл // Соврем, аспекты профилакт. зооноз. инфекций : Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, 1991. - С. 9-10.

32. Голубинский Е.П., Меринов С.П., Рудник М.П., Загоскина Т.Ю. Иммунофер-ментные методы для обнаружения возбудителей особо опасных инфекций и антител к ним // Эпидемиол. и профилакт. особо опас. инфекций в МНР и СССР. Улан-Батор, 1982. -С. 207.

33. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Антигенная структура бруцелл // Успехи соврем, биологии. 1991. - Т. 3, N 6. - С. 890-904.

34. Григорьева Г.И., Улицкая А.А. Иммуноферментный анализ для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота // Вестн. с.-х. науки. 1990. - № 2. - С. 86-91.

35. Дегтяренко Л.В. Некоторые аспекты диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота // Там же. С. 122-123.

36. Джеймс X. Теория фотографического процесса. JL, 1980. - 672 с.

37. Джонс О.Т., Эрнест Ю.П., Мак-Иэми М.Дж. Солюбилизация и реконструкция мембранных белков // Биологические мембраны. Методы : Пер. с англ. / Под ред. Дж.Б. Финделя, У .Г. Эванза. М., 1990. - С. 196-250.

38. Драновская Е.А. Лабораторные методы диагностики бруцеллеза / Под ред. П.А. Вершиловой. М., 1968. - 19 с.

39. Драновская Е.А. Эндотоксин бруцелл // Тез. докл. Всесоюз. конф. по бруцеллезу.- М., 1978. С. 53-55.

40. Дубровская И.И., Курдина Д.С. Химический состав и токсические свойства антигена, полученного из бруцелл водно-эфирной экстракцией // Вопр. мед. химии. 1969.- Том XIV, № 6. С. 580-584.

41. Дыкман Л.А. Развитие методологии иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота : Автореф. дис. .канд. биол. наук. Саратов, 1996. - 19 с.

42. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. 1997. - Т. 62, вып. 4. - С. 411-418.

43. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Применение дот-иммуноанализа и иммунозолотых маркеров для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. -1999. № 4. - С.93-94.

44. Дыкман Л.А., Семенов С.В., Староверов С.А. и др. Применение метода дот-иммуноанализа конъюгатов коллоидного золота для идентификации Y. pseudotuberculosis И Материалы VIII Всерос. съезда ЭМП. 2002. - Т. 3. - С. 256-257.

45. Жатон Ж.-К., Брандт Д.Ч., Вассали П. Выделение и характеристика иммуноглобулинов, антител и их полипептидных цепей // Методы исследований в иммунологии : Пер. с англ. М., 1981. - С. 58-82.

46. Желудков М.М. Использование реакции Кумбса и метода иммунофлуоресценции с целью выявления неполных антител при бруцеллезе // Журн. микробиол. 1980. - 2. -С. 45-49.

47. Желудков М.М. Значение перекрестных реакций в оценке серологического диагноза бруцеллеза у человека // Журн. микробиол., 1982. № 4. - С. 37-40.

48. Желудков М.М. Характеристика специфических антител и иммунологических реакций к перекрестнореагирующим антигенам (Yer. enterocolitica 0-9) при бруцеллезе у людей: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1983. - 22 с.

49. Желудков М.М. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза // Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организация мед. помощи больным : Тез докл. Всесоюз. конф. М. - 1989. - С. 91-92.

50. Желудков М.М., Кулаков Ю.К. Использование в иммуноферментном анализе белковых антигенов бруцелл, синтезированных в клетках Escherichia coli Н Журн. микробиол. 1998. - № 5. - С. 74-77.

51. Желудков М.М., Павлова И.П., УмНова Н.С. и др. Использование иммунофер-ментного анализа для выявления бруцеллезных антител разных классов // Там же. С. 107108.

52. Желудков М.М., Павлова И.П., Умнова Н.С., Перекопский И.С. Иммунофер-ментный метод в диагностике бруцеллеза людей // Журн. микробиол. 1986. - № 8. -С. - 59-63.

53. Желудков М.М., Чернышева М.И. Использование дитиотреитола для выявления специфических IgG-антител при бруцеллезе//Лаб. Дело. 1987. -Jfe 11. - С. 870-871.

54. Жигмонди Р. Коллоидная химия. Харьков, Киев, 1933. - 256 с.

55. Загоскина Т.Ю., Алексеева JI.A, Петухова О.С. Использование иммуноэритроад-сорбционного метода для выявления антигенов возбудителя бруцеллеза // Медико-биол. пробл. Восточной Сибири. Иркутск, 1988. - С.107-108.

56. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Меринов С.П. и др. Дот-иммуноанализ с частицами коллоидного серебра в качестве специфического антигена для исследования сывороток крови людей на бруцеллез // Мед. паразитол. 2002. - № 2. - С. 15-17.

57. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. 1998. - № 6. -С. 64-69.

58. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И. и др. Выявление антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа с использованием стафиллококкового белка А, меченного частицами коллоидного золота // Пробл. особо опас. инфекций. -1999. Вып. 79. -С. 77-81.

59. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител // Ж. микробиол. 2001. - № 3. - С. 65-69.

60. Закревский В.И., Ефременко В.И., Фарбер С.М. и др. Приготовление и применение иммуносорбентов для изучения антигенного состава микроорганизмов I и П группы // Волгоград, 1982. 21 с.

61. Заревина Л.И., Таран И.Ф., Василенко Н.Ф. и др. Использование твердофазного имуноферментного метода для диагностики бруцеллеза // Ускоренные методы диагностики инфекционных болезней. Кишинев, 1987. - С. 42-44.

62. Захарова ИЛ., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982.- 183 с.

63. Здродовский П.Ф. Бруцеллез. М., 1953. - 315 с.

64. Зыкин Л.Ф., Васильев Д.А. L-формы возбудителей зооантропонозов. Ульяновск, 2000. - 68 с.

65. Ильинский О.А., Арбулиева Е.А., Драновская Е.А., Двуреченская Г.С. Инфекционная антигенемия и циркулирующие иммунные комплексы при хроническом бруцеллезе // Сов. медицина. 1985. - № 9. - С. 18-23.

66. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. М., 1976. - 164 с.

67. Каральник Б.В., Еркинбекова Б.К., Грушина Т.А. Ускоренная идентификация бактерий агглютинацией на стекле эритроцитов, сенсибилизированных антителами // Журн. микробиол. 1999. - № 3. - С. 74-77.

68. Каральник Б.В., Студенцова В.К., Булашев А.К. и др. Бруцеллезный антительный эритроцитарный днагностикум из моноклональных антител // Журн. микробиол. -1991.- № 4. С. 63-66.

69. Карепин Е.Ю., Калиновский А.И., Репина Л.П., Загоскина Т.Ю. Бруцеллез в Магаданской области // Соврем, аспекты профилакт. зоонозных инфекций : Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, 1991. - С. 32-34.

70. Картужанский А.Л., Красный-Адмони Л.В. Химия и физика фотографического процесса. Л., 1986. - 250 с.

71. Кириллов Н.К. Антигенная активность клеточных стенок и цитоплазматических фракций бруцелл. // Науч. тр. Казанского гос. ветеринарного института. 1979.- Вып. 132. - С. 52-55.

72. Кичиева Б.Н., Чернышева М.И., Желудков М.М. Изучение субклассов IgG у больных хроническим бруцеллезом // Журн. микробиол. 1983. - № 6. - С. 95-97.

73. Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа. Пер. с англ.- М., 1991. 279 с.

74. Коляков И.Е., Сайдулдин Т., Драновская Е.А. Диагностическое значение реакции Кумбса при бруцеллезе // Там же. 1974. - № 3. - С. 93-94.

75. Крейнгольд С.У. Каталиметрия в анализе реактивов и веществ особой чистоты. -М., 1983.-190 с.

76. Кривеня В.Я., Елигулашвили Р.К. Получение и исследование иммуноферментных комплексов // Вирусные гепатиты типов А и В. Рига, 1983. - С. 110-115.

77. Кройт Г.Р. Наука о коллоидах. М., 1955. - 538 с.

78. Кулаков Ю.К., Желудков М.М. Молекулярные основы вирулентности бруцелл П Мол. генетика, микробиол., внрусол. 2001." - № 4. - С. 8-12.

79. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Драновская Е.А., Скавронская А.Г. Сравнительное изучение антигенной структуры штаммов Brucella canis с помощью иммуно-блотгинга // Там же. 1997. - № 3. - С. 15-17.

80. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Лаврова В.А. и др. Сравнительный анализ антигенов различных видов Brucella методом иммуноблота с антисыворотками иммунизированных кроликов //Там же. 1998. - Хе 2. - С. 7-13.

81. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Толмачева Т.А. и др. Использование молеку-лярно-биологических методов для идентификации бруцелл при сравнительном анализе штаммов, выделенных от больных собак // Там же. 2000. - № 4. - С. 7-12.

82. Куличенко А. Н., Гаранина С. Б., Амплеева Э. А. и др. Способ детекции бруцелл при помощи полимеразнои цепной реакции // Пробл. особо опасных инфекций. 1994. - Вып. 4 (74).-С. 165-172.

83. Лабораторные работы и задачи по коллоидной химии / Под ред. Ю.Г. Фролова.- М., 1986. 215 с.

84. Левина Л.А., Мигунов В.Н., Зайцева Е.В. и др. Противоэшерихозные антитела в сыворотке крови неиммунизированных доноров и препаратах иммуноглобулина человека // Журн. микробиол. 1995. 1.-С. 62-66.

85. Львов ВЛ., Маликов В.Е., Шашков А.С. и др. Соматические антигены рода Brucella: строение О-спсцифической цепи полисахарида Brucella melitensis II Биорганиче-ская химия. 1985. - Т. 116 № 7. - С. 963-970.

86. Львов В.Л., Плужникова Г.Н.,* Лапина Е.Б., Дмитриев Б.А. "Поли-Б"-полисахаридный антиген бруцелл // VIII Всесоюз. конф. "Химия и биохимия углеводов" : Тез. докл. Пущино, 1987. - С. 213-214.

87. Львов В.Л., Плужникова Г.Н., Лапина Е.Б. и др. Молекулярная природа антигена полисахарида В (поли-В) из бруцелл // Биоорганическая жимия. 1987. - № 13. -С. 1070-1074.

88. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Лямкин Г.И и др. Бруцеллез // Лабораторная диагностика возбудителей особо опас. болезней. Саратов, 1998. - Т. 1. - С. 90-110.

89. Маматова Э.Б., Искандеров М.И. Иммуноферментный анализ для выявления бруцеллезных антигенов // Ветеринария. 1987. - № 4. - С. 26-27.

90. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии. // Журн. микробиол. 1985. -№4.-С. 100-107.

91. Маракушев С.А. Геомикробиология и биохимия золота. М., 1991.- 167 с.

92. Марков ЕЛО. Поверхностные структуры и антигены холерного вибриона, бруцелл и туляремийного микроба: Автореф. дисдокт. биол. наук. Иркутск. - 2000. -39 с.

93. Марков Е.Ю., Хавкин Э.Е. Иммуноэлектрофоретический анализ сложных белковых смесей // Электрофоретические методы анализа белков / Под ред. Р.К. Саляева, П.Д. Решетова. Новосибирск, 1981. - С. 68-97.

94. Маурер Г. Диск-электрофорез (Теория и практика электрофореза в по-лнакриламидном геле). М., 1971. - 247 с.

95. Меринов С.П., Загоскина Т.Ю. Голубинский Е.П. и др. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним // Соврем, аспекты профилакт. зооноз. инфекций. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 111-113.

96. Меринов С.П., Широков В.А, Коха А.М. К характеристике липополисахарида бруцелл И Всесоюз. биохим. съезд: Тез. стенд, сообщ. М., 1986. - Т. 3. - С. 18-19.

97. Методические рекомендации по получению высокоактивных гипериммунных противобруцеллезных сывороток / Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Репина Л.П. и др. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 1988. «9 с.

98. Методические рекомендации по приготовлению и применению овисного антигенного диапюстикума / Меринов С.П., Широков В.А., Репина Л.П. и др. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 1962. - 5 с.

99. Методические рекомендации по контролю специфической стерильности биологических препаратов, приготовленных из бруцелл / Петухова О.С., Калиновский А.И., Лаукнер И.В. и др. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 1987. - 4 с.

100. Методические рекомендации по бруцеллезу / Пинигин А.Ф., Петухова О.С. Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 1978. - 48 с.

101. Мешандин А.Г., Ванеева Л.И., Агапкина Н.П. и др. Использование модифицированных полистироловых планшетов в твердофазном иммуноферментном анализе для диагностики некоторых инфекций // Журн. микробиол. 1993. - № 5. - С. 97-100.

102. Мирзаева М.А. Применение реакции аггрегатгемагглютинации в диагностике бруцеллеза // Материалы 5 Объед. съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана.- Алма-Ата, 1991. - Т. 5. - С. 46-47.

103. Миронова Л.П., Меринов С.П., Загоскина Т.Ю., Коха A.M. Антигенные взаимосвязи у представителей рода Brucella // Иерсиниозы: Тез. Всесоюз. науч.-практ. конф. -Владивосток, 1986. С.51 -53

104. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М., 1991.- 280 с.

105. Михайлов Л.М., Титенко А.М., Рудник М.П., Захлебная О.Д. Использование моноклональных антител для определения общих детерминантов Brucella spp. и Yersinia enterocolitica 0:9 // Журн. микробиол. 2000. - № 3. - С. 63-66.

106. Молиш X. Реакции с а-нафтолом (реакция Молиша) // В кн.: Методы химии углеводов. Под ред. Н.К. Кочетова М., 1967. - С. 21.

107. Мюллер М., Отто М., Вернер Г. Каталитические методы в анализе следов элементов. М., 1983. - 195 с.

108. Нифантьев В.М., Ищанова Р.Ж. Пути усовершенствования диагностики бруцеллеза // Акту ал. вопр. профилакг. бруцеллеза и организация медицинской помощи больным : Тез докл. Всесоюз. конф. М. - 1989. - С. 93-94.

109. Ниязов У.Э., Мельниченко Л.П., Ромахов В.А. и др. Диагностическая эффективность овисного антигена для РДСК // Там же. С. 140-141.

110. Общая вирусология: Руководство под ред. Гайдамович С.Я., Жданова В.М. -М., 1982.-Т. 1.-493 с.

111. Опалейчук И.С., Умнова Н.С., Желудков М.М., Павлова И.П. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики бруцеллезной инфекции // Журн. микробиол. -1991.-N 7. С. 61-63.

112. Патент RU 2010577 С1 (51)5 А 61 К 39/40. Способ получения диагностической сыворотки / С.Н. Тюменцев, Н.М. Андреевская, И.С. Тюменцева, А.И. Калиновский, Л.П.

113. Репина, Т.Ю. Загоскина. Иркутский НИПЧИ Сибири и ДВ МЗ РФ. Заявка Х> 5023123/13; Заявлено 09.07.91; Опубл. 15.04.94, Бюл. № 7. Приоритет 09.07.91.

114. Петров Р.В., Зарецкая Ю.М. Радиационная иммунология и трансплантолотя. -М., 1970.-543 с.

115. Пинигин А.Ф. Лабораторная диагностика бруцеллеза и методы работы с культурами бруцелл. Иркутск, 1960. - 121 с.

116. Пинигин А.Ф. Бруцеллез северных оленей. Иркутск, 1971. - 111 с.

117. Пинигин А.Ф., Петухова О.С. О новом типе бруцелл // Изв. Иркутского н.-и. противочум. ин-та Сибири и ДВ. 1960. - Т. 23. - С. 346-349.

118. Подоляко М.М., Баташев В.В., Уралева B.C. и др. Имуноферментный метод обнаружения бруцеллезных антител и антигена в сыворотке крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств // Журн. микробиол. 1995. - № 6. - С. 53-54.

119. Полак Д., Ван Норден С. Введение в иммунохимию: современные методы и проблемы. М., 1987. - 185 с.

120. Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Ничеухина С.Н. и др. Использование имму-носуспензий на основе углеродных маркеров для определения антител к вирусу паротита методом поверхностного дот-иммуноанализа // Биотехнология. 1999. - № 3. - С. 146-150.

121. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // Журн. микробиол. -1998. № 2. - С. 108-111.

122. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А. Стабилизация коллоидного серебра // Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 6 (54). - С. 17-18.

123. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе // Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 3(51).-С. 10-12.

124. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей сере-боа в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 9 (57). - С. 7-9.

125. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Получение серебряных золей-маркеров для иммуноанализа // Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 4 (52). -С. 18-20.

126. Ременцова М.Н, Нифантьев В.М., Шин Н.Г., Кондратьева О.В. Исследование нуклеопротеидных фракций бруцелл, полученных методом ионообменной хроматографии //Антропоэооноэы в Казахстане. Алма-Ата. - 1975.- С. 76-74.

127. Ременцова М.М., Постричева О.В., Рыбалко С.И. Бруцеллез промысловых животных. Алма-Ата, 1969. - 155 с.

128. Репина Л.П. Биологическая характеристика R- и S- вариантов Brucella ovis : Автореф. дис. канд. биол. наук. Алма-Ата, 1984. - 18 с.

129. Родионов П.П., Третьяков В.В. Колларгол и протаргол, свойства // Препринт: Коллоидное серебро. Физико-химические свойства. Применение в медицине. Новосибирск, 1992.-С. 5-14.

130. Розовский Г.И. Химическое меднение с применением в качестве восстановителя борогидрида / Исследования в области осаждения металлов : Материалы к XI Респ. конф. электрохимиков Литовской ССР. Вильнюс, 1971. - С. 93-95.

131. Руководство к лабораторным занятиям по биоорганической химии под ред. СЛ. Тюкавкиной. М., 1985. - 247 с.

132. Руослахти Э. Иммуносорбенты в очистке белков // М., 1979. 128 с.

133. Рыбкин B.C., Яковлев А.Т., Ахмедов A.M., Жуков А.Н. Поливалентный диаг-иостикум для обнаружения бруцеллезных антител у людей и животных иммунофермент-ным методом // Иммунология и специфич. профилакт. особо опас. инфекций. Саратов, 1993. - С. 260.

134. Садыков С.Т. Обнаружение бруцеллезного антигена в патологическом материале при помощи реакции нейтрализации антител (РНАТ) // Тр. Всесоюз. ин-та эксп. ветеринарии. 1976. - Вып. 1 -2. - С. 51 -54. •

135. Сайдулдин Т. К методике постановки реакции Кумбса в бактериальном варианте // Лабораторное дело. 1970. - № 6. - С. 372-373.

136. Санитарные правила СП 1.2.011 94. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности. - М., 1994. - 152 с.

137. Сведберг Т. Образование коллоидов. Л., 1927. - 113 с.

138. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. -М., 1988.-279 с.

139. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот// Биохимия. 1958. - Т. 23, вып. 5. - С. 656-662.

140. Станиславский Е.С. Перекрестно реагирующие антигены микробов и вакцино-профилактика // Журн. микробиол. 1971. - № 10. - С. 42-47.

141. Стэндифер Д.К. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов (гетерогенный анализ) // Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М., 1988. - С. 172-192.

142. Студенцова В.К., Грушина Т.А. Экспресс-метод серологической диагностики бруцеллеза // Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организации медицинской помощи больным : Тез. докл. Всесоюз. конф. М. -1989. - С. 112-113.

143. Студенцова В.К., Каральник Б.В., Амиреев С.А. и др. Определение антигенов возбудителя бруцеллеза в РПГА с антительным диагностикумом // Там же. С. 101-102.

144. Студенцова В.К., Сатгаров А.И., "Ременцова М.М., Джубангалиев М.У. К использованию микрометодов постановки серологических реакций в диагностике бруцеллеза // Там же. С. 115-116.

145. Сухаренко С.Н., Вафакулов Б.К., Тынчерова Ф.М. и др. Изучение неполных антител в популяции различных групп в очагах коровьего бруцеллеза в Кашка-Дарьинской области // Журн. микробиол. 1977. - № 8. - С. 59-62.

146. Сучков Ю.Г., Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов иммунными у-глобулинами // Журн. микробиол. 1965. - № 8. - С. 63-67.

147. Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Бруцеллез. Ставрополь, 1996. - 173 с.

148. Турапов М.Т., Рашидова Р.А., Ниязматов А.А. и др. Диагностическое значение реакции агрегат-гемагглютинации при бруцеллезе // Актуал. вопросы бактериальных инфекций. Ташкент, 1986. С. 93-97. • '

149. Уилкинз Т.А., Броуверс Г., Марешаль Ж.К. и др. Иммуноанализ методом подсчета частиц // В кн.: Новые метода иммуноанализа. М., 1991. - С. 222-236.

150. Умнова Н.С., Желудков М.М., Павлова И.П., Шаханина КЛ Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом // Журн. микробиол. 1987. -№ 9.-С. 103-107.

151. Уралева B.C., Поляков И.И., Пустовалов А.Н. Применение флуоресцирующих антител для обнаружения бруцелл в объектах внешней среды и органах животных (экспериментальные данные) // Тр. Ростовского-на-Дону противочум. ин-та. 1961.- Ка 18. -С. 171-187.

152. Файгль Ф., Ангер В. Капельный анализ неорганических веществ. М., 1976. -Т. 2.-С. 116-117.

153. Фарканов И.Ж. Выявление источника бруцеллезной инфекции путем исследования молока прямым методом иммунофлуоресцирующих антител (ПМФ) // Ауыл ша-руашылык фылымынын хабаршысы. Вестн. с.-х. науки. 1971. -№ 8. - С. 108-109.

154. Финдлей Дж. Б. Выделение и модификация мембранных белков и пептидов // Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Б. Финдлей, У.Г. Эванза. -М., 1990.-С. 251-307.

155. Хазипов Н.З., Новошинов Г.П., Тюрикова Р.П. Иммуноферментный и радиоиммунный анализ в диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных // V Всесоюз. биохим. съезд: Тез. стендовых сообщений. М., 1986. - Т. 3. - С. 310.

156. Хаиров С.Г., Шахбанов А.А. Влияние детергента вторичного алкилсульфата натрия на Бр. Абортус 18 // Профилакт. и лечебные мероприятия в условиях отгонного животноводства. Махачкала, 1981. - Том 12. - С. 16-19.

157. Хансон Р., Филлипс Дж. Химический состав бактериальной клетки // Методы общей бактериологии. Пер. с англ. М., 1984. - Т. 2. - С. 283-373.

158. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоидный журнал. 1995. - Т. 57, № 3. - С. 412-423.

159. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Спектральныесвойства коллоидного золота // Оптика и спектр. 1996. - Т. 80. - С. 128-137.•

160. Хомутовский О.А., Луцик М.Д., Передерей О.Ф. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. Киев, 1986. - 168 с.

161. Чернышева М.И Ускоренные методы обнаружения бруцелл // Новые методы диагностики зоонозных инфекций под ред. М. И. Чернышевой, Г.А. Объедкова. Минск, 1982.- 126 с.

162. Чернышева М.И., Асланян Р.Г. Реакция нейтрализации антител при бруцеллезе // Журн. микробиол. 1975. - № 7. - С. 37-40.

163. Чернышева М.М., Асланян Р.Г., Щербак Ю.Ф., Мнацаканян А.Г. Выявление антител в сыворотке крови при бруцеллезе непрямым методом иммунофлуоресценции // Журн. микробиол. 1968. - № 8. - С. 62-65 .

164. Чернышева М.М., Вашкевич Р.Б., Степушин А.Е., Иванов Т.В. Реакция пассивной гемагглютинации при бруцеллезе северных оленей // Ветеринария. 1972. - № 12. -С. 96.

165. Чернышева М.И., Губина Е.А., Желудков М.М., Перекопская Т.И. Использование роз-бенгал антигена для пластинчатой реакции агглютинации при бруцеллезе человека // Журн. микробиол. 1980. - № 6. - С. 84-88.

166. Чернышева М.И., Желудков М.М. Определение полных и неполных IgG-антител у больных острым бруцеллезом // Журн. микробиол. 1981. - № 5. - С. 144-145.

167. Чернышева М.И., Желудков М.М., Перекопский И.С. Сравнительная оценка методов определения антител класса IgG при бруцеллезе у людей // Журн. микробиол. -1986.- №2.- С. 114-115.

168. Чернышева М.М., Князева Э.Н., Щербак Ю.Ф. Сравнительное изучение диагностической ценности серологических реакций при хроническом и резидуальном бруцеллезе // Советская медицина. 1971. - № 12. - С. 82-86.

169. Шалкаускас М.И., Вашкялис А.Ю. Химическая металлизация пластмасс.- Л., 1977.-168 с.

170. Шестопалов М.Ю. Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза : Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск, 2000. - 23 с.

171. Шестопалов М.Ю., Балахонов С.А., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. По-лимеразная цепная реакция в лабораторной диагностике бруцеллеза // Итоги, проблемы, перспективы: Тез. докл. Юбилейной науч.- практ. конф. Иркутск, 1997. - С. 134-136.

172. Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И., Балахонов С.В. и др. Особенности ПЦР-диагностики бруцеллезной инфекции у людей // Мол. генетика, микробиол., вирусол. -1999. -№3. С. 12-17.

173. Шимко И.Б., Леви М.И., Таран И.Ф. Разработка иммунопенициллиназной антивидовой тест-системы ИФА для определения антител при бруцеллезе у людей // Деп. в ВИНИТИ 19.01.90, № 394-В90. Реф. в РЖ Биология. - 1990. - 5 Ц39.

174. Шимко И.Б., Леви М.И., Таран И.Ф., Шимко Т.А. Коньюгат стафилококкового белка А с ферментом пенициллиназой для определения антител при бруцеллезе с помощью ИФА // Деп. в ВИНИТИ 19.01.90, № 396-В90. Реф. в РЖ Биология. - 1990. - 5 ЦЗЗ.

175. Abalos P., Ibarra L., Pinochet L. et al. Residual ant\-Brucella abortus strain 19 antibodies detected in adult cattle by two indirect-ELISA tests // Vet. Rec. 1996. - Vol. 138, N 6. -P. 140.

176. Abalos P., Daffher J., Pinochet L. Evaluation of three Brucella soluble antigens used in an indirect EL1SA to discriminate S19 vaccinated from naturally infected cattle // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 71, N 1-2. - P. 161-167.

177. Abela B. Epidemiology and control of brucellosis in ruminants from 1986 to 1996 in Malta // Rev. Sci. Tech. 1999. - Vol. 18, N 3. - P. 648-659.

178. Adone R., Ciuchini F., Olsen S. Field validation of the use of RB51 as antigen in a complement fixation test to identify calves vaccinated with Brucella abortus RB51 // Clin. Di-agn. Lab. Immunol. 2001. - Vol. 8, N 2. - P. 385-387.

179. Afzal M.f Tengerdy R.P., Squire P.G., Ellis R.P. Characterization of Brucella ovis lipopolysaccharide and its use for diagnosis of ram epididymitis by enzyme-linked immunosorbent assay// J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20, N 6. - P. 1159-1164.

180. Ahvonen P., Jansson E., Aho ВС. Marked cross-agglutination between Brucellae and a subtype of Yersinia enterocoliticz // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1969. - Vol. 7, N 2. -P. 291-295.

181. Aida Y., Pabst M J. Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-l 14 // J. Immunol. Methods 1990. - Vol. 132.-P. 191-192.

182. Alonso-Urmeneta В., Moriyon L, Diaz R., Blasco J.M. Enzyme-linked immunosorbent assay with Brucella native hapten polysaccharide and smooth lipopolysaccharide // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26, N 12. - P. 2642-2646.

183. Al-Shamahy H.A., Wright S.G. Enzyme-linked immunosorbent assay for Brucella antigen detection in human sera // J. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 47, N 2. - P. 169-72.

184. Alton G.G., Maw J., Rogerson B.A., McPherson G.G. The serological diagnosis of bovine brucellosis: an evaluation of the complement fixation, serum agglutination and rose Bengal tests // Aust. Vet. J. 1975. - Vol. 51, N 2. - P. 57-63.

185. Amin A.S., Hamdy M.E., Ibrahim A.K. Detection of Brucella melitensis in semen using the polymerase chain reaction assay // Vet. Microbiol. 2001. - Vol. 83, N 1. - P. 37-44.

186. Angus RD, Barton CE. The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis // Dev. Biol. Stand. 1984. - Vol. 56. - P. 349-356.

187. Araj G.F. Enzyme-linked immunosorbent assay, not agglutination, is the test of choise for the diagnosis of neurobrucellosis // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol, 25, N 4. - P. 942.

188. Araj G.F., Azzam R.A. Seroprevalence of Brucella antibodies among persons in high-risk occupation in Lebanon // Epidemiol. Infect 1996. - Vol. 117, N 2. - P. 281-288.

189. Araj G.F., Brown G.M., Haj M.M., Madhvan N.V. Assessment of brucellosis card test in screening patients for brucellosis // Epidemiol. Infect. 1988. - V. 100, N 3. - P. 389-398.

190. Ariza J., Pellicer Т., Pallare's R., Gudiol F. Specific antibody profile in human brucellosis // Clin. Infect. Dis. 1992. - Vol. 14, N 1. - P. 131-140.

191. Asbakk 1С, Gall D., Stuen S. A screening ELISA for brucellosis in reindeer // Zen-tralbl. Veterinarmed. В. 1999. - Vol. 46, N 9. - P. 649-657.

192. Avrameas S.T., Teraynck S.T. Peroxidase labeled antibody and F-ab conjugates with enhanced intracellular penetration// hnmunochemistry. 1971. - Vol. 8. - P. 1175-1179.

193. Baker E., Sommer H., Foster L.M. et al. Antigenic structure of Pasteurella pestis and the isolation of a crystalline antigen // Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1947. - Vol. 64. - P. 139143.

194. Baldi P.C., Araj G.F., Racaro G.C. et al. Detection of antibodies to Brucella cytoplasmic proteins in the cerebrospinal fluid of patients with neurobrucellosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - Vol. 6, N 5. - P. 756-759.

195. Baldi P.C., Miguel S.E, Fossati C.A., Wallach J.C. Serological follow-up of human brucellosis by measuring IgG antibodies to lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella species // Clin. Infect Dis. 1996. - Vol. 22, N 3. - P. 446-455.

196. Baldi P.C., Velikovsky C.A., Braden B.C. et al. Structural, functional and immunological studies on a polymeric bacterial protein // Braz. J. Med. Biol. Res. 2000. - Vol. 33, N 7. - 741-747.

197. Baldi P.C., Wanke M.M., Loza M.E., Fossati C.A. Brucella abortus cytoplasmic proteins used as antigens in an ELISA potentially useful for the diagnosis of canine brucellosis // Vet. Microbiol. 1994. - Vol. 41, N 1-2. - P. 127-134.

198. Baldi P.C., Wanke M.M., Loza M.E. et al. Diagnosis of canine brucellosis by detection of serum antibodies against an 18 kDa cytoplasmic protein of Brucella spp. // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 57, N 2-3. - P. 273-281.

199. Balke E., Weber A., Fronk B. Differentiation of Brucella by acrylamide-gel electrophoresis // Zentralbl. Bakteriol. Orig А. 1977. - Bd. 238, H. 1. - P. 80-85.

200. Barbuddhe S.B., Kumar P., Malika S.V. et al. Seropositivity for intracellular bacterial infections among abattoir associated personnels // J. Commun. Dis. 2000. - Vol. 32, N 4. -P. 295-299.

201. Barbuddhe S.B., Yadava V.K. Efficaci of indirect haemolisis test in the diagnosis of human brucellosis // J. Commun. Dis. 1997. - Vol. 29, N 3. - P. 283-285.

202. Barbuddhe S.B., Yadava V.K., Singh D.K. Detection of IgM and IgG antibodies against Brucella by dot-ELISA in humans // J. Commun. Dis. 1994. - Vol. 26, N 1. - P. 1-5.

203. Baschong W., Lucoeq J.M., Roth J. "Thiocyonate gold": small (2-3 nm) colloidal gold for affinity cytochemical labeling in electron microscopy // Histochemistry. 1985. - Vol. 83, N5.-P. 409-411.

204. Batra H.V., Chand P., Garvju L. et al. Dot-enzyme linked immunosorbent assay for the detection of antibodies in bovine brucellosis // Res. Vet. Sci. 1989. - Vol. 46, N 2. - P. 143146.

205. Batteiger В., Newhall W.J., Jones R.B. The use of tween 20 as a blocking agent in the immunilogical detection of proteins transferred to nitrocellulose membranes // J. Immunol. Methods. 1982. - Vol. 55, N 3. - P. 297-307.

206. Baum M., Zamir O., Bergman-Rios R. et al. Comparative evaluation of microagglu-tination test and serum agglutination test as suplementary diagnostic methods for brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, N 8. - P. 2166-2170.

207. Beh KJ., Lascelles A.K. The use of the antiglobulin test in the diagnosis of bovine brucellosis // Res. Vet. Sci. 1973. - Vol. 14, N 2. - P. 239-244.

208. Behnke O., Ammitzboll Т., Jessen H. et al. Non-specific binding of protein-stabilized gold sols as a source of error in immunocytochemistry // Eur. J. Cell Biol. 1986. - Vol. 41, N 2. - P. 326-338.

209. Bercovich Z., Taaijke R. Enzyme immunoassay using mouse monoclonal anti-bovine antibodies for the detection of Brucella abortus antibodies in cow milk // Zentralbl. Veteri-narmed. В. 1990. - Bd. 37, H. 10. - P. 753-759.

210. Bergey D. Manual of determinative bacteriology. Baltimore, 1957.

211. Berman D.T., Jones L.M. Radial immunodiffusion a confirmatory test for bovine brucellosis // Proc. Annu. Meet US Anim. Health. Assoc. - 1980a. - Vol. 84. - P. 118-127.

212. Berman D.T., BCurtz R.S. Relationship of biological activities to structures of Brucella abortus endotoxin and LPS // Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - Vol. 138, N 1. • P. 98-101.

213. Berman D.T., Wilson B.L, Moreno E. et al. Characterization of Brucella abortus soluble antigen employed in immunoassay// J. Clin. Microbiol. 1980. - Vol. 11, N 4. - P. 355362.

214. Bilecki S., Dziubek Z., Osuch T. Indirect immunofluorescence test in serological diagnosis of brucellosis in man // Przegl. Epidemiol. 1971. - Vol. 25, N 1. - P. 63-71.

215. Bio-Rad Labs Bulletin 1310. Western blotting detection systems: how do you choose? 1987 - p. 3.

216. Bjorek L. Protein L, a novel bacterial cell wall, protein with affinity for light chaines // J. Immunology. 1988. - Vol. 140, N 4. - P. 1194-1197.

217. Blake M.S., Gotschlich E.C. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae II Infect, hnmun. 1982. - Vol. 36, N 1. -P. 277-283.

218. Blais B.W., Yamazaki H., Rigby C.E. Use of hydrophobic cloths as antibody adsorbents for enzyme immunoassay: detection of Brucella antigens // Vet. Microbiol. 1989. -Vol. 20, N2.-P. 155-163.

219. Bordier C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-l 14 solution // J. Biol. Chem. -1981. Vol. 256, N 4. - P. 1604-1607.

220. Bowden R.A., Verger J.M., Grayon M. et al. Simultaneous expression of smooth and rough phase properties related to lipopolysaccharide in a strain of Brucella melitensis II J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 39, N 5. - P. 363-370.

221. Brada D., Roth J.Golden blot-detection of polyclonal and monoclonal antibodies bound to antigens on nitrocellulose by protein A-gold complexes // Anal. Biochem. 1984. -Vol.142, N1.-P. 79-83.

222. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye finding // Anal. Biochem. 1976. -Vol. 72. - P. 248-254.

223. Braun W. Covalent lipoprotein from the outer membrane of Escherichia coli // Bio-chim. Biophys. Acta. 1975. - Vol. 415. - P. 335-377.

224. Bricker В. J., Hailing S.M. Enhancement of the Brucella AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine strains SI9 and RB51 // J. Clin. Microbiol. 1995. -Vol. 33, N6.-P. 1640-1642.

225. Bricker B.J., Hailing S.M. Differentiation of Brucella abortus bv 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv 1 by PCR // J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol. 32, N11.-P. 2660-2666.

226. Brown W.H., Hernandez de Anda J. Brucellosis in adult beef cattle of Mexican origin shipped direct-to-slaughter into Texas // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998. - Vol. 212, N 5. -P. 705-707.

227. Bundle D.R., Cherwonogrodzky J.W., Carrof M., Perry M.B. The lipopolysaccha-rides of Brucella abortus and B. melitensis II Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - Vol. 138, N 1. - P. 92-98.

228. Bundle D.R., Cherwonogrodzky J.W., Gidney M.A.J. et al. Definition of Brucella A and M epitopes by monoclonal typing reagents and synthetic oligosaccharides // Infect. Immun. -1984. Vol. 57, N 9. - P. 2820-2836.

229. Bundle D.R., Cherwonogrodzky J.W., Perry M.B. Structure M-antigen of the lipopolysaccharide O-chain (M-antigen) and polysaccharide В produced by Brucella melitensis 16M // FEBS Lett. 1987. - Vol. 216, N 2. - P. 261-264.

230. Bundle D.R., Gidney M.A.J., Репу M.B. et al. Serological confirmation of Brucella abortus and Yersinia enterocolitica 0:9 antigens by monoclonal antibodies // Infect. Immun. -1984. Vol. 46, N 2. - P. 389-393.

231. Bundesen P.G., Wyatt D.M., Cottis L.E. et al. Monoclonal antibodies directed against Brucella abortus cell surface antigens // Vet. Immunol. Immunopathol. 1985. - Vol. 8, N 3. - P. 245-260.

232. Cambiaso C.L., Limet J.N. Latex agglutination assay for human anti-Brucella IgM antibodies // J. Immunol. Methods. 1989. - Vol. 122, N 2. - P. 169-175.

233. Cardenas A.L., Maki L.R. Detection of antibody in rams with contagious epididymitis, using the enzyme-linked immunosorbent assay // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47, N4.-P. 738-739.

234. Carlsson H.E., Hurvell В., Lindberg A.A. Enzyme linked immunosorbent assay (ELIS A) for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica II Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1976. - Vol. 84, N 3. - P. 168-176.

235. Caimichael L.E., Joubert J.C. A rapid slide agglutination test for the serodiagnosis of Brucella canis infection that employs a variant (M-) organism as antigen // Ibid. 1987. -Vol. 77.Nl.-P. 3-12.

236. Carmichael L.E., Zoha S.J., Flores-Castro R. Problems in the serodiagnosis of canine brucellosis: dog responses to cell wall and internal antigens of Brucella canis II Dev. Biol. Stand. 1984. - V. 56.-P. 371-383.

237. Caroff M., Bundle D.R., Perry M.B. Structure of the O-chain of the phenol-phase soluble cellular lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica serotype 0:9 // Eur. J. Biochem. -1984. Vol. 139, N 1. - P. 195-200.

238. Casas J., Partal Y., Liosa J. et al. Detection of Brucella with an automatic hemocul-ture sistem: Bact/Alert // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1994. - Vol. 12, N 10. - P. 497-500.

239. Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A. et al. Epididymitis by Brucella ovis: experimental infection in virgin ram lambs // New Microbiol. 1999. - Vol. 22, N, 3. - P. 227-31.

240. Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A. et al. Evaluation of tests employed in serological diagnosis of brucellosis caused by Brucella ovis II New Microbiol. 2000. - Vol. 23, N 3. - P. 281288.

241. Chand P., Batra H.V., Sadana J.R. Detection of Brucella specific protein-A reactive antibodies in buffaloes by dot-enzyme-linked immunosorbent assay // Vet. Rec. 1988. -Vol. 122, N. 7. - P. 162-163.

242. Chand P., Sadana J.R., Batra H.V. Comparison of a dot-ELISA and a plate-ELISA for bovine brucellosis diagnosis // Vet. Rec. 1990. - Vol. 127, N 7. - P. 169-170.

243. Chand P., Sadana J.R., Batra H.V., Chauhan R.S. Comparison of the dot-immunobinding assay with the complement fixation test for the detection of Brucella antibodies in sheep // Vet. Microbiol. 1989. - Vol. 20, N 3. - P. 281-287.

244. Chand P., Khanna R.N., Sadana J.R. Counter-immunoelectrophoresis for the detection of Brucella antigen and antibodies in the diagnosis of brucellosis in buffaloes // J. Appl. Bacteriol. 1988. - Vol. 64, N 5. - P. 445-449. •

245. Chand P., Sadana J.R., Batra H.V., Chaugan R.S. Comparison of the dot-immu-noblotting assay with the complement fixation test for the detection of Brucella antibodies in sheep // Vet. Microbiol. 1989. - Vol. 20, N 3. - P. 281-287.

246. Chandler H.M., Cox J.C., Healey К. et al. An investigation of the use of urease-antibody conjugates in enzyme immunoassays // J. Immunol. Methods 1982. - Vol. 53, N 2. -P.187-193.

247. Chappel R.J., Hayes J. Comparison of radioimmunoassay with the complement fixation test and the indirect haemolysis test in the field diagnosis of bovine brucellosis // J. Hyg. (Lond.). 1983. - Vol. 90, N 1. - P. 67-70.

248. Chappel R.J., Hayes J., Brain G.J., McNaught D.J. A modified radioimmunoassay for antibodies against Brucella abortus II J. Hyg. (Lond.). 1982. - Vol. 88, N 1. - P. 1-9.

249. Chappel R.J., Williamson P., McNaught D.J. et al. Radio-immunoassay for antibodies against Brucella abortus: a new serological test for bovine brucellosis // Ibid. 1976. -Vol. 77, N3.-P. 369-376.

250. Cherwonogrodzky J.W., Perry M.B. Structural elucidation of the Brucella melitensis M antigen by high-resolution NMR at 500 MHz // Biochemistry. 1987. - Vol. 26, N 26. -P. 8717-8726.

251. Cheville N.F., Olsen S.C., Jensen A.E. et al. Effects of age at vaccination on efficacy of Brucella abortus strain RB51 to protect cattle against brucellosis // Am. J. Vet. Res. 1996. -Vol. 57,N8.-P. 1153-1156.

252. Cheville N.F., Stevens M.G., Jensen A.E. et al. Immune responses and protection against infection and abortion in cattle experimentally vaccinated with mutant strains of Brucella abortus И Ibid. 1993. - V. 54, N 10. - P. 1591-1597.

253. Chin J.C., Pang В., Carrigan M. Comparison of seroreactivity of rams with brucellosis in a complement fixation test, whole cell ELISA and by immunoblotting // Vet. Microbiol. 1991. - Vol. 26, N 3. - P. 291-299.

254. Chin J.C., Plant J.W. Temporal ELISA response of rams to Brucella ovis following experimental infection or vaccination // Res. Vet Sci. 1989. - Vol. 46, N 1. - P. 73-78.

255. Chin J., Turner B. Extraction of membrane antigens from Brucella ovis and an assessment of their serological activity by immunoblotting // J. Gen. Microbiol. 1990. - Vol. 136, Pt 8. - P. 1615-1622.

256. Chin J.C., Plant J.W., Claxton P.D. Evaluation of surface components of Brucella ovis as antigens for the detection of precipitin amtibody in serums from srtifically exposed rams // Aust. Vet. J. 1983. - Vol. 60, N 9. - P. 264-267.

257. Cho H.J., Niilo L. Diagnostic sensitivity and specificity of an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of Brucella ovis infection in rams // Can. J. Vet Res. 1987. -Vol. 51, N1.-P. 99-103.

258. Chow M.K., Zukoski C.F. Colloidal gold // J. Colloid. Interface Sci. 1994. -Vol. 165. - P. 97-109.

259. Chukwu C.C. Differentiation of Brucella abortus and Brucella enterocolitica serotype 09 infections in cattle: the use of specific lymphocyte transformation and brucellin skin tests 11 Vet. Q. 1987. - Vol. 9, N 2. - P. 134-142.

260. Clavareau C., Wellemans V., Walravens K. et al. Phenotypic and molecular characterization of a Brucella strain isolated from a minke whale (Balaenoptera acutorostrata) // Microbiology. 1998. - Vol. 144, Pt 12. - P. 3267-3273.

261. Cloeckaert A., Grayon M., Grepinet O. An IS 711 element downstream of the bp26 gene is specific marker of Brucella spp. isolated from marine mammals // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - Vol. 7, N 7. - P. 627-29.

262. Cloeckaert A., Tibor A., Zygmunt S. Brucella outer membrane lipoproteins share antigenic determinants with bacteria of the family Rhizobiaceae // Ibid. 1999. - Vol. 6, N 4. -P. 627-629.

263. Cloeckaert A., Verger J.M., Grayon M., Grepinet O. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa outer-membrane proteins of Brucella II Microbiology. 1995. - Vol. 141, Pt 9. - P. 2111-2121.

264. Cloeckaert A., Verger J.M., Grayon-M., Grepinet O. Polymorphism at the dnaK locus of Brucella species and identification of a Brucella melitensis species-specific marker // J. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 45, N 3. - P. 200-205.

265. Cloeckaert A., Zygmunt M.S., De Wergifosse P. et al. Demonstration of peptidogly-can-associated Brucella outer-membrane proteins by use of monoclonal antibodies // J. Gen. Microbiol. 1992. - Vol. 138, Pt 7. - P. 1543-1550.

266. Cloeckaert A., Zygmunt M.S., Dubray G., Limet J.N. Characterization of O-poly-saccharide specific monoclonal antibodies derived from mice infected with the rough Brucella melitensis strain B115 // Ibid. 1993. - Vol. 139, Pt 7. - P. - 1551-1556.

267. Cohen F.B., Robins В., Lipstein W. Isolation of Brucella abortus by percutaneous liver biopsy// New England J. Med. 1957. - Vol. 257. - P. 228-230.

268. Colak H., Usluer G., Ozgunes I. et al. Comparison of the Wright, indirect Coombs and enzyme immunoassay IgG methods for the diagnosis of chronic brucellosis // Mikrobiyol. Bui. -1992. Vol. 26, N 1. - P. 56-60.

269. Colloidal gold: principles, methods and applications / Hayat M.A. ed. Academic Press. - San Diego. - 1989. - Vol. 1,2, P. 51-79,36-77.

270. Colmenero J.D., Reguera J.M., Cabrera F.P. et al. Combined use of rose Bengal and indirect immunofluorescence in the diagnosis of brucellosis // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. -1989. Vol. 7, N 6. - P. 316-320.

271. Coombs R.R. Assay utilising red cells as markers // Immunoassays for the 80s. -1981.-P. 17-33.

272. Coombs R.R., Edebo L., Feinstein A., Gurner B.W. The class of antibodies sensitizing bacteria measured by mixed reverse passive antiglobulin haemagglutination (MRPAH) // Immunology. 1978. - V. 34, N 6. - P. 1037-1044.

273. Cooper C.W. Prevalence of antibody to Brucella in asymptomatic well individuals in Saudi Arabia // J. Trop. Med. Hyg. 1992. - Vol. 95, N 2. - P. 140-142.

274. Corbel M. J. Identification of the immunoglobulin class active in the rose bengal plate test for bovine brucellosis // J. Hyg. Camb. 1972. - Vol. 70, N 4. - P. 779-795.

275. Corbel M.J. The direct fluorescent antibody test for detection of Brucella abortus in bovine abortion material // J. Hyg. (bond.). 1973. - Vol. 71, N 1. - P. 123-129.

276. Corbel M.J. Evaluation of an immunodiffusion test for the detection of antibodies to

277. Brucella abortus in bovine serum // J. Med. Microbiol. 1973. - Vol. 6, N 1. - P. 67-76.

278. Corbel M.J. Recent advance in the study of Brucella antigens and their serological cross-reactivity// Vet. Bull. 1985. - Vol. 55. - P. 927-942.

279. Corbel M.J. Brucellosis: an overview // Emerg. Infect. Dis. 1997. - Vol. 3, N 2. -P. 213-221.

280. Corbel MJ., Cockrem D.S., Brewer R.A. Differentiation of smooth and rough Brucella strains by lectins // Vet. Rec. 1983. - Vol. 113, N 12. - P. 261-262.

281. Cortez A., Scarcelli E., Soares R.M. et al. Detection of Brucella DNA from aborted bovine foetuses by polymerase chain reaction // Aust. Vet. J. 2001. - Vol. 79, N 7. - P. 500-501.

282. Dabdoob W.A., Abdulla Z.A. A panel of eight tests in the serodiagnosis and immunological evaluation of acute brucellosis // East Mediterr. Health J. 2000. - Vol. 6, N 2-3. -P. 304-312.

283. Da Costa M., Guillou J.P., Garin-Bastuji B. et al. Specificity of six gene sequences for the detection of the genus Brucella by DNA amplification // J. Appl. Bacterid. 1996. -Vol. 81, N 3. - P. 267- 275.

284. Dajer A., Luna-Martinez E., Zapata D. et al. Evaluation of a fluorescence-polarization assay for the diagnosis of bovine brucellosis in Mexico // Prev. Vet. Med. 1999. -Vol. 40, N1.-P. 67-73.

285. Danscher G., Norgaard O. Light microscopic visualization of colloidal gold on resin-embedded tissue // J. Histochem. Cytochem. 1983. - Vol. 31, N 12. - P. 1394-1398.

286. Davis D.S. Brucellosis in wildlife / Nielsen K. and Duncan J.R. (ed.), Animal brucellosis. CRC Press, Boca Raton, Fla., 1990. - P. 321-334.

287. Davies G. The rose Bengal test // Vet. Rec. 1971. - Vol. 88, N 17. - P. 447-449.

288. Daza R.M., Damaso D., Moreno M. Comparative study of different serological tests for the diagnosis of brucellosis // Med. Clin. (Bare.). 1981. - Vol. 76, N 2. - P. 57-60.

289. Delgado S., Fernandez M., Carmenes P. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of sheep infected and vaccinated with Brucella melitensis H J. Vet. Diagn. Invest. 1995. - Vol. 7, N 2. - P. 206-209.

290. Delia S., Vullo V., Mastroianni C.M. et al. Use of dot immunobinding assay (DIB) for the rapid diagnosis of human brucellosis // J. Infect. 1987. - V. 14, N 1. - P. 88-89.

291. De Mey J., Moeremans M. The preparation of colloidal gold probes and their use as marker in electron microscopy // In: Advanced techniques in biological electron microscopy / Ed. by J.K. Koechler. Berlin, 1986. - P. 229-271.

292. Desai M.P., Hilfinger J.M., Amidon G.L. et al. V. Immune response with biodegradable nanosphereres and alum: studies in rabbits using staphylococcal enterotoxin B-toxoid // J. Microencapsulation. 2000. - Vol. 17, N 2. - P. 215-222.

293. De Wergifosse P., Lintermans P., Limet J.N., Cloeckaert A. Cloning and nucleotide sequence of the gene coding for the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella abortus //J. Bacterid. -1995. Vol. 177, N. 7. - P. 1911-1914.

294. Dhar R., Lastimoza J.L., Hira P.R. A modified fluorescent antibody test for the diagnosis of brucellosis // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1988. - Vol. 11, N 4. - P. 189-194.

295. Diaz R., Garatea P., Jones L.M., Moriyon I. Radial immunodiffusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 10, N 1. - P. 37-41.

296. Diaz R., Chordy A. Immunoelectrophoretic analysis in Brucella suis II Experienta. -1966. Vol. 22, N 12. - P. 825-930.

297. Diaz R., Jones L.M., Leong D., Wilson J. Surface antigens of smooth Brucella II J. Bacterid. 1968. - Vol. 96, N 4. - P. 893-901.

298. Diaz R., Maravi-Poma E., Rivero A. Comparison of counter-immunoelectrophoresis with other serological tests in the diagnosis of human brucellosis // Bull. World Health Organ. -1976. Vol. 53, N 4. - P. 417-424.

299. Diaz R., Toyos J., Salvo M.D. et al. Studies on the polysaccharide В and native hapten of Brucella and Yersinia enterocolitica serotype 9 // Dev. Biol. Stand. 1984. - Vol. 56. -P. 213-220.

300. Diaz R., Toyos J., Salvo M.D., Pardo M.L. A simple method for the extraction of polysaccharide В from Brucella cells for use in the radial immunodiffusion test diagnosis of bovine brucellosis // Ann. Rech. Vet. 1981. - Vol. 12, N1. - P. 35-39.

301. Diaz-Aparicio E., Marin C., Alonso-Urmeneta B. et al. Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis infection of goats // Ibid. 1994. - Vol. 32, N 5. -P. 1159-1165.

302. Dise Т., Brunell P.A. Antibovine antibody in human sera as a cause of nonspcificity in enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, N 6. - P. 987-990.

303. Dohoo I.R., Wright P.F., Ruckerbauer G.M. et al. A comparison of five serological tests for bovine brucellosis // Can. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 50, N 4. - P. 485-493.

304. Drancourt M., Brouqui P., Raoult D. Afipia clevelandensis antibodies and cross-reactivity with Brucella spp. and Yersinia enterocolitica 0:9 II Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1997. Vol. 4, N 6. - P. 748-752.

305. Dranovskaya E.A., Vershilova P.A. The endotoxin "Brucella" // Ann. Sclavo. 1977. -Vol. 19, N1.-P. 109-116.

306. Dubray G., Charriaut C. Evidence of three major polypeptide species and two major polysaccharide species in the Brucella outer membrane // Ann. Rech. Vet. 1983. - Vol. 14, N 3. -P. 311-318.

307. Dubray G., Limet J.N. Evidence of heterogeneity of lipopolysaccharides among Brucella biovars in relation to A and M specificities // Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. -Vol. 138, N 1. - P. 27-37.

308. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold to obtain antibio-tin antibodies // J. Microbiol. Methods. 1996. - Vol. 24. - P. 247-248.

309. Ebani V.V., Cerri D., Bey R.F. et al. An immunoblotting te-chnique for the serodiagnosis of brucellosis by Brucella ovis II New Microbiol. 2000. - Vol. 23, N 1. - P. 55-62.

310. Edmonds M.D., Ward F.M., O'Hara T.M., Elzer P.H. Use of western immunoblot analysis for testing moose serum for Brucella suis biovar 4 species antibodies // J. Wildl. Dis. -1999. Vol. 35, N 3. - P. 591-595.

311. Eggert F.M., Edebo L.B., Gurner B.W., Coombs R.R. A simplified procedure for measuring the class of anti-bacterial antibodies by mixed reverse passive antiglobulin haemag-glutination (MRPAH) II J. Immunol. Methods. 1979. - Vol. 26, N 2. - P. 125-140.

312. Engvall E.f Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin Gil hnmunochemistry. 1971. - Vol. 8, N 9. - P. 871-874.

313. EP N 0258963. Immunoassay method using colloidal gold II Graham H., Mochnal D., Chang C., Kang J. Ortho Diagnostic Systems Inc. - U.S., New Brunswick, 1987.

314. EP N 0296398. Immunoassay method for detecting antibodies and antigens / Todd W., Barstad P. BDR, Hamburg, 1988.

315. EP 0298368. Immunoassay with unmetall colloidal particles. Yost D., Russel J., Yang J. - Abbot laboratories. - U.S., Chicago, 1988.

316. EP N 0321008. Immunoassay with using unmetall labels // Van Doom A., Wi-chers J., Van Gelder W. Holland Byotechnology B.V-., NL, 1988.

317. Ewalt D.R., Payeur J.B., Martin B.M. et al. Characteristics of a Brucella species from a bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) // J. Vet. Diagn. Investig. 1994. - Vol. 6, N 4. -P. 448-452.

318. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. 1971. - Vol. 10, N 13. - P. 26062617.

319. Faraday M. Experimental relations of gold (and others metals) to light // Phil. Trans. Royal. Soc. 1857. - Vol. 147. - P. 145-181.

320. Farr A.G., Nakane P.K. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review // J. Immunol. Methods. 1981. - Vol. 47, N 2. - P. 129-144.

321. Faulk W., Taylor G.M. An immuftocolloid method for the electron microscope // hnmunochemistry. 1971. - Vol. 8, N 11. - P. 1081-1083.

322. Fayazi Z., Ghadersohi A., Hirst R.G. Development of a Brucella suis specific hybridisation probe and PCR which distinguishes B. suis from Brucella abortus II Vet. Microbiol. -2002. Vol. 84, N 3. - P. 253-261.

323. Fayomi В., Laudat P., Audurier A., Zohoum I. Human brucellosis in Benin: results of serological survay among exposed workers // Med. Trop. (Mars.). 1987. - Vol. 47, N 2. -P. 145-148.

324. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M. Detection of Brucella by polymerase chain reaction in bovine fetal and maternal tissues // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - Vol. 4, N 1. - P. 79-83.

325. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M., Sanborn M.R. Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction // J. Appl. Bacteriol. 1990. - Vol. 69,N2.-P. 216-227.

326. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M., Stich R.W. Amplification fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174, N 23. - P. 7778-7783.

327. Feldherr C.M., Marshall J.M. The use of colloidal gold for studies of inracellular ez-changed in the ameloa Chaos chaos // J. Cell. Biol. 1961. - Vol. 12. - P. 640-645.

328. Fenske G. Value of the antiglobulin test and indirect immunofluorescence test in the serological diagnosis of bovine brucellosis // Arch. Exp. Veterinarmed. 1977. - Vol. 31, N 2. -P. 211-226.

329. Fernandez-Lago L., Diaz R. Demonstration of antibodies against Brucella melitensis 16M lipopolysaccharide and native hapten in human sera by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1986 - Vol. 24, N 1. - P. 76-80.

330. Fernandez-Lago L., Moriyon I., Toyos J., Diaz R. Immunological identity of Brucella native hapten, polysaccharide B, and Yersinia enterocolitica serotype 9 native hapten // Infect. hnmun. Vol. 1982. - Vol. 38, N 2. - P. 778-780.

331. Ferris R.A., Schoenbaum M.A., Crawford R.P. Comparison of serologic tests and bacteriologic culture for detection of brucellosis in swine from naturally infected herds // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1995. - Vol. 201, N 10. - P.1332-1333.

332. Ficapal A., Alonso-Urmeneta В., Velasco J. et al. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate // Vet. Rec. 1995. - Vol. 137, N 6. -P. 145-147.

333. Flores-Castro R., Carmichael L.E. Canine brucellosis. Current status of methods for diagnosis // Cornell. Vet. 1978. - Vol. 68, Suppl 7. - P. 76-88.

334. Foster G., Jahans K. L., Reid R. J., Ross H. M. Isolation of Brucella species from cetaceans, seals and an otter // Vet. Rec. 1996. - Vol. 138, N 24. - P. 583-586.

335. Freer E., Rojas A., Weintraub A. et al. Heterogeneity of Brucella lipopolysaccharides // Res. Microbiol. 1995. - Vol. 146, N 7. - P. 569-578.

336. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodis-perse gold suspension // Nature Phys. 1973. - Vol. 241. - P. 20-22.

337. Gad El-Rab M.O., Kambal A.M. Evaluation of a Brucella enzyme immunoassay test (ELISA) in comparison with bacteriological culture and agglutination // J. Infect. 1998. -Vol. 36, N2.-P. 197-201.

338. Gall D.f Nielsen K. Improvements to the competitive ELISA for detection of antibodies to Brucella abortus in cattle sera // J. Immunoassay. 1994. - Vol. 15, N 3. - P. 277-291.

339. Gall D., Nielsen K., Forbes L. et al. Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids // J. Wildl. Dis. 2001.-Vol. 37, N1.-P. 110-118.

340. Gall D., Nielsen K., Forbes L. et al. Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for the detection of serum antibodies to Brucella abortus in bison //J. Wildl. Dis. 2000. - Vol. 36, N 3. - P. 469-476.

341. Gallien P., Dorn C., Alban G. et al. Detection of Brucella species in organs of naturally infected cattle by polymerase chain reaction // Vet. Rec. 1998. - Vol. 142, N 19. - P. 512544.

342. Gamazo C., Vitas A.I., Lopez-Goni I. et al. Factors affectin detection of Brucella melitensis by BACTEC NR 730, a nonradiometric system for hemocultures // J. Clin. Microbiol. -1993. V. 31, N 12. - P. 3200-3203.

343. Geraci D., Locorotondo G., Parlato A. et al. Immunochemical identification of antigens of Brucella melitensis by means of CRIE // Microbiologica. 1987. - Vol. 10, N 2. - P. 161169.

344. Geraci D.f Locorotondo G., Parlato A. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for Brucella melitensis-associated antigens // Ibid. 1988. - Vol. 11, N 3. - P. 213-218.

345. Gilsdorf M.J., Thoen C.O., Temple R.M. et al. Experimental exposure of llamas (Lama glama) to Brucella abortus: humoral antibody response // Vet Microbiol. 2001. -Vol. 81, N1.-P. 85-91.

346. Goldbaum F.A., Velikovsky CA., Baldi P.C. et al. The 18-kDa cytoplasmic protein of Brucella species an antigen useful for diagnosis- is a lumazine synthase // J. Med. Microbiol. - 1999. - Vol. 48, N 9. - P. 833-839.

347. Gomez-Miguel M.J., Moriyon I. Demonstration of a peptidoglycan-linked lipoprotein and characterization of its trypsin fragment in the outer membrane of Brucella spp. // Infect. Immun. 1986. - Vol. 53, N 3. - P. 678-684.

348. Gomez M.C, Rosa C., Geijo P., Escribano M.A. Comparative study of the Brucella-capt test versus the Coombs test for Brucella II Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1999. -Vol. 17, N6.-P. 283-285.

349. Gorrell M.D., Milliken G.L., Anderson B.J., Pucci A. An enzyme immunoassay for bovine brucellosis using a monoclonal antibody specific for field strains of Brucella abortus И Dev. Biol. Stand. 1984. - Vol. 56. - P. 491-494.

350. Gottuzo E.t Carillo C., Guerra J., Liosa L. An evaluation of diagnostic methods for brucellosis the value of bone marrow culture // J. Infect Dis. - 1986. - Vol. 153. - P. 122-125.

351. Gourdon F., Beytout J., Reynaud A. et al. Human and animal epidemic of Yersinia enterocolitica 0:9, 1989-1997, Auvergne, France // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5, N 5. -P. 719-721.

352. Greiser-Wilke I., MacMillan A.P., Moennig V. Analysis of sera from two cattle herds suspected of brucellosis using a competition enzyme immunoassay with monoclonal antibodies // Tierarztl. Prax. 1991. - Bd. 19, H. 2. - P. 131-134.

353. Guarino A., Fusco G., Di Matteo A. et al. Indirect ELISA for the diagnosis of brucellosis in water buffaloes (Bubalus bubalis) in Italy // Vet Rec. 2001. - Vol. 149, N 3. - P. 88-90.

354. Hadjichristodoulou C., Papatheodorou C., Soteriades E. et al. Epidemiological study of brucellosis in eight Greek villages using a computerised mapping programme // Eur. J. Epidemiol. 1999. - Vol.15, N 7. - P. 671-680.

355. Hall S.M., Confer A.W., Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Detection of serum antibody to Brucella abortus in cattle by use of a quantitative fluorometric immunoassay // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20, N 6. - P. 1023-1027.

356. Hanson Т.Е., Johnson W.O., Gardner I.A. Log-linear and logistic modeling of dependence among diagnostic tests // Prev. Vet. Med. 2000. - Vol. 45, N 1-2. - P. 123-137.

357. Hayes J., Chappel R.J. A comparison of the results of the brucellosis radioimmunoassay and other serological test in experimentally infected cattle // J. Hyg. (Lond.). 1982. -Vol. 88, N1.-P. 21-28.

358. Heck F.C., Williams J.D., Pruett J. -et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies to Brucella abortus in bovine milk and serum // Am. J. Vet. Res. 1980. -Vol. 41, N 12. - P. 2082-2084.

359. Heinfeld J.F. A small gold-conjugated antibody label: improved resolution for electron microscopy // Science. 1987. - Vol. 236. - P. 450-453.

360. Heizmann W., Botzenhart K., Doller G. et al. Brucellosis: serological methods compared // J. Hyg. (London). 1985. - Vol. 95, N 3. - P. 639-653.

361. Herman L., De Ridder H. Identification of Brucella spp. by using the polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58, N 6. - P. 2099-2101.

362. Hoffinan W.L., Jump A.A. Tween 20 removes antibodies and other proteins from nitrocellulose // J Immunol Methods. 1986. - Vol. 94, N 1-2. - P. 191-196.

363. Holgate C.S., Jackson P., Cowen P.N., Bird C.C. hnmunogold-silver staining method of immunostaining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. 1983. - Vol. 31, N7.-P. 938-944.

364. Holmes В., Popoff M., Kiredjian M., Kersters K. Ochrobactrum anthropi gen. nov., sp. nov. from human clinical specimens and previously known as group Vd. // Int. J. Syst. Bacte-riol. 1988. - Vol. 38. - P. 406-416.

365. Horisberger M. Colloidal gold and its application in cell biology // Int. Rev. Cytol. -1992. Vol. 136. - P. 227-287.

366. Hornitzky M., Searson J. The relationship between the isolation of Brucella abortus and serological status of infected, non-vaccinated cattle // Aust. Vet. J. -1986. Vol. 63, N 6. -P. 172-174.

367. Howell E.E., Nasser J., Schray K.J. Coated tube enzyme immunoassay: factors affecting sesnstivity and effects of reversible protein binding to polystyrene // J. Immunoassay. -1981. Vol. 2, N 3-4. - P. 205-225.

368. Hsu S.M., Raine L., Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: A comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures // J. Histochem. Cytochem. 1981. - Vol. 29, N 4. - P. 577-580.

369. Huddleson I.F. The differentiation of the species of genus Brucella II Am. J. Publ. Health. 1929. - Vol. 1. - P. 18-24.

370. Hunter S.B., Bibb W.F., Shih C.N. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay witm major outer membrane proteins of Brucella melitensis to measure immune responce to Brucella species // J. Clin. Mucrobiol. 1986. - Vol. 24, N 4. - P. 566-572.

371. Issekutz A.C. Removal of gram-negative endotoxin from solutions by caffinity chro-matografy// J. Immunol. Methods. 1983. - Vol.61, N3. - P. 275-281.

372. Isloor S., Renukaradhya G.J. Rajasekhar M. A serological survey of bovine brucellosis in India II Rev. Sci. Tech. 1998. - Vol. 17, N 3. - P. 781-785.

373. Jacques L, Olivier-Bemardin V., Dubray G. Efficacy of ELISA compared to conventional tests (RBPT and CFT) for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep // Vet. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N 1. - P. 61-73.

374. Jahans K.L., Foster G., Broughton E.S. The characterisation of Brucella strains isolated from marine mammals // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 57, N 4. - N. 373-382.

375. Jamison JA., Rich G.E., Kyrkou M.R. et al. Outbreak of brucellosis at a South-Australian abattoir. I. Clinical and serological findings // Med. J. Aust 1981. - Vol. 2,N 11. -P. 593-596.

376. Janda J., Work E. A colorimetric estimation of lipopolysaccharide // FEBS Lett. -1971. Vol. 16, N 4. - P. 343-345.

377. Joiner K.A. Studies of the mechanism of bacterial resistance to complement killing and on the mechanism of action of bacterial antibody// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. -Vol. 121.-P. 99-133.

378. Joint FAO/WHO expert committee on brucellosis. Sixth reports.Geneva, 1986. -133 p.

379. Jones L.M., Berman D.T., Moreno E. et al. Evaluation of a radial immunodiffusion test with polysaccharide В antigen for diagnosis of bovine brucellosis // J. Clin. Microbiol. -1980. Vol. 12, N 6. - P. 753-760.

380. Karkhanis Y.D., Zeltner J.J., Jackson J.J., Carlo D.J. A new and improved microas-say to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolisaccharide of gram-negative bacteria // Ann. Biochem. 1978. - Vol. 85, N 2. - P. 595-601.

381. Kato K., Hamguchi Y., Fukui H., Ishikawa E. Enzyme-linked immunosorbent assay 1. Novel method for synthesis of the insulin-p-D-galactosidase conjugate and its applicability for insulin assay // J. Biochem. 1975. - Vol. 78, N 1. - P. 235-237.

382. Kerby P.J., Quiroga J.L., McGrane J.J., Stagg D.A. Field evaluation of an indirect ELISA for detection of brucellosis in lowland Bolivia // Trop. Anim. Health. Prod. 1997. -Vol. 29,N2.-P. 65-72.

383. Kerkhofs P., Botton Y., Thiange P. et al. Diagnosis of bovine brucellosis by enzyme immunoassay of milk // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 24, N I. - P. 73-80.

384. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral extinction of colloidal gold and its biospecific conjugates // J. Colloid. Interface Sci. -1996. Vol. 180. -P. 436-445.

385. Kittelberger R., Diack D.S., Vizcaino N. et al. Characterization of an immunodominant antigen in Brucella ovis and evaluation of its use in an enzyme-linked immunosorbent assay// Vet. Microbiol. 1998. - Vol. 59, N 2-3. - P. 213-227.

386. Kittelberger R., Hansen M., Ross G.P., Hilbink F. A sensitive iimnvmoblotting technique for the serodiagnosis of Brucella ovis infections // J. Vet. Diagn. Invest. 1994. - Vol. 6, N2.-P. 188-194.

387. Klein G.C., Behan K.A. Determination of Brucella immunoglobulin G agglutinating antibody titer with dithiothreitol // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol.14, N 1. - P. 24-25.

388. Knosel H., Hempel E., Forschner E. Experiences in the control of brucellosis in cattle herds in the government district of Hannover // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1991. -Bd. 98, H. 9. - P. 356-358.

389. Kolar J. Diagnosis and control of brucellosis in small ruminants // Prev. Vet. Med. -1984.-Vol. 2.-P. 215-225.

390. Kortepeter M.G., Parker G.W. Potential biological weapons threats // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5, N 4. - P. 523-527.

391. Krambovitis E., Tselentis J., Tsoukatos D. A simple enzyme immunoassay for detecting brucellosis antibodies // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 4, N 3. - 129-136.

392. Kreutzer D.L., Robertson D.C. Surface macromolecules and virulence in intracellular parasitism: comparison of cell envelope components of smooth and rough strains of Brucella abortus И Infect. Immun. 1979. - Vol. 23, N 3. - P. 819-828.

393. Kropf J., Quitte E., Gressner A.M. Time-resolved immunofluorometric assays with measurement of a europium chelate in solution: application for sensitive determination of fi-bronectin // Anal. Biochem. 1991. - Vol. 197, N 1. - P. 258-265.

394. Kubuafor D.K., Awubila В., Akanmori B.D. Seroprevalence of brucellosis in cattle and humanus in the Akwapim-South district of Ghana: public health implications // Acta Trop. -2000. Vol. 76, N 1. - P. 45-48.

395. Kulshrestha R.C., Atal P.R., Wahi P.N. A study of gel diffusion test and immu-noelectrophoresis on Brucella antigen-sonic extract // Indian J. Pathol. Bacterid. 1969. -Vol. 12, N3.-P. 109-113.

396. Kumar P., Singh D.K., Barbuddhe S.B. Sero-prevalence of brucellosis among abattoir personnel of Delhi // J. Commun. Dis. 1997. - Vol. 29, N 2. - P. 131-137.

397. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227, N 259. - P. 680-685.

398. Laemmli U.K., Favre M. Maturation of the head of bacteriophage T 4.1. DNA packaging events // J. Mol. Biol. 1973. - Vol. 80, N 4. - P. 575-599.

399. Lamb V.L., Jones L.M., Schurig G.G., Berman D.T. Enzyme-linked immunosorbent assay for bovine immunoglobulin subclass-specific response to Brucella abortus lipopolysac-charides // Infect. Immun. 1979. - Vol. 26, N 1. - P. 240-247.

400. Landry M.L., Mayo D.R., Hsiung G.D. Rapid and accurate viral diagnosis // Phar-mac. Ther. 1989. - Vol 40, N 2. - P. 287-328.

401. Laudat P., Van Der Mee-Marquet N., Loulergue J., Audurier A. Informative capacity of 8 serological tests in the diagnosis of human brucellosis // Pathol. Biol. (Paris). 1995. -Vol. 43, N9.-P. 754-759.

402. Lawman M.J., Thurmond M.C., Reis KJ. et al. Solid-phase radioimmunoassay for the detection of immunoglobulins against bovine Brucella abortus II Vet. Immunol. Immunopa-thol. 1984. - Vol. 6, N 3-4. - P. 291-305.

403. Leal-Klevezas D.S., Martinez-Vazquez I.O., Garcia-Cantu J. et al. Use of polymerase chain reaction to detect Brucella abortus biovar 1 in infected goats // Vet. Microbiol. -2000. Vol. 75, N 1. - P. 91-97.a

404. Leal-Klevezas D.S., Martinez-Vazquez I.O., Lopez-Merino A., Martinez-Soriano J.P. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals //J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, N 12. - P. 3087-3090.

405. Lehrer S., Nowotny A. Isolation and purification of endotoxin by hydrolytic enzimes // Infect. Immun. 1972. - Vol. 6, N 6. - P. 928-933.

406. Leiva Leon J., de la Rosa M., Plata J. et al. An immunoblotting study of serologic response in patients with acute brucellosis // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1991. - Vol. 14, N 6. -P. 515-518.

407. Leiva J., Mendoza J., Navarro J.M., Pattern of antibodies in acute human brucellosis defined by Western blotting // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1990. - Vol. 8, N 1. - P. 15-18.

408. Leiva J., Plata J., Martinez M.J. et aL Effect of the extraction of LPS (R) on the demonstration of the serological response in acute brucellosis by immunoblotting // Ibid. 1991. -V. 9, N 8. - P. 464-467.

409. Leong D., Diaz R., Wilson J.B. Identification of the toxic component of Brucella abortus endotoxin and its labeling with radioactive chromate // J. Bacterid. 1968. - Vol. 95, N2.-P. 612-617.

410. Leuvering J.H., Thai PJ., Van der Waart M., Schuurs A.H. A sol particle agglutination assay for human chorionic gonadotrophs // J. Immunol. Methods. 1981. - Vol. 45, N 2. -P. 183-94.

411. Limet J.N., Berbinschi A., Cloeckaert A. et al. Longitudinal study of brucellosis in mice by immunoassay of lipopolysaccharide-related antigens in blood and urine // J. Med. Microbiol. 1988. - Vol. 26, N 1. - P. 37-45.

412. Limet J.N., Cloeckaert A., Bezard G. et al. Antibody response to the 89-kDa outer membrane protein of Brucella in bovine brucellosis // J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 39, N 6. -P. 403-407.

413. Lindberg A.A., Haeggman S., Karlson К et al. Enzyme immunoassay of the antibody response to Brucella and Yersinia enterocolitica 09 infections in humans // J. Hyg. (Lond). -1982. Vol. 88, N 2. - P. 295-307.

414. Lindler L.E, Hadfield T.L., Tall B.D. et al. Cloning of a Brucella melitensis group 3 antigen gene encoding Omp28, a protein recognized by the humoral immune response during human brucellosis // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 7. - P. 2490-2499.

415. Lord V.R., Rolo M.R., Cherwonogrodzky J.W, Evaluation of humoral immunity to Brucella sp in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen // Am. J. Vet. Res. 1989. - Vol. 50,Nll.-P. 1813-1816.

416. Lowry H.O., Rosebrough N J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

417. Lu Q., Zhang W., Hao Z. Study on double antigens sandwich enzyme immuno-assay for detection of Brucella specific antibodies in human and animals // Ibid. 1999. - Vol. 20, N 2. -P. 118-121.

418. Lucero N.E., Escobar G.I., Ayala S.M., Lopez G. Sensitivity and specificity of an indirect enzyme-linked immunoassay for the diagnosis of Brucella canis infection in dogs // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51, N 8. - P. 656-660.

419. Lucero N.E., Foglia L., Ayala S.M. et al. Competitive enzyme immunoassay for diagnosis of human brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 10. - P. 3245-3248.

420. MacMillan A. Convetional serological tests / In K. Nielsen, J.R. Duncan (ed). Animal brucellosis. CRA Press, Inc, Boca Raton. - 1990. - P. 155-198.

421. Magee J.T. An enzyme-labelled immunosorbent assay for Brucella abortus antibodies //J. Med. Microbiol. 1980. - Vol. 13, N 1. - P. 167-172.

422. Mahajan N.K., Kulshreshtha R.G. Counterimmunoelectrophoresis detection of Brucella antigens in fetal stomachs of aborted sheep // Vet. Rec. 1986. - Vol. 119, N 18. - P. 455456.

423. Mahajan N.K., Kulshreshtha R.C. Comparison of serological tests for Brucella melitensis infection in sheep // Trop. Anim. Health Prod. 1991. - Vol. 23, N 1. - P. 11-16.

424. Maichomo M.W., McDermott J.J., Arimi S.M., Gathura P.B. Assessment of the Rose-Bengal plate test for the diagnosis of human brucellosis in health facilities in Narok district, Kenya // East Afr. Med. J. 1998. - Vol. 75, N 4. - P. 219-222.

425. Marin C.M., Alonso-Urmeneta В., Moriyon I. et al. Comparison of polyclonal, monoclonal and peroxidase conjugates in an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of Brucella ovis in sheep // Vet. Rec. 1998. - Vol. 143, N 14. - P. 390-394.

426. Marin C.M., Jimenez de Bagues M.P., Blasco J.M. et al. Comparison of three serological tests for Brucella ovis infection of rams using different antigenic extracts // Vet. Rec. -1989. Vol. 125, N 20. - P. 504-508.

427. Marmonier A., Berthet B. Serological diagnosis of human brucellosis by means of an immunoenzymatic technic (ELISA). I. Estimate of some parameters of the reaction and practical application. Pathol. Biol (Paris). - 1981. - Vol. 29, N 2. - P. 77-81.

428. Martinez de Tejada G., Pizarro-Cerda J., Moreno E., Moriyo I. The outer membranes of Brucella spp. are resistant to bactericidal cationic peptides // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N 8. - P. 3054-3061.

429. Marx A., Ionescu J., Pop A. Immunochemical studies on Brucella abortus lipo-polysaccharides // Zentralbl. Bakteriol. А. 1983. - Bd. 253, H. 4. - S. 544-553.

430. Matar G.M., Khneisser LA., Abdelnoor A.M. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, N 2. - P. 477-478.

431. Mathai E., Singhal A., Verghese S. et al. Evaluation of an ELISA for the diagnosis of brucellosis Indian // J. Med. Res. 1996. - Vol. 103. - P. 323-324.

432. McCullough N.B. DNA homology relationships within the genus Brucella II Proc. Annu. Meet. U S Anim. Health Assoc. 1968. - Vol. 72. - P. 79-82.

433. McKinney M.M., Parkinson A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites II J. Immunol. Methods. 1987. - Vol. 96, N 2. -P. 271-278.

434. McMahon K.J. Comparison of an agar-gel immunodiffusion test with other serological methods for differentiating Brucella infected from vaccinated cattle II Can. J. Сотр. Med. -1983. Vol. 47, N 1. - P. 86-87.

435. McMahon KJ. Comparison of the 2-mercaptoethanol and dithiothreitol tests for determining Brucella immunoglobulin G agglutinating antibody in bovine serum II Can. J. Сотр. Med. 1983. - Vol. 47, N 3. - P. 370-372.

436. McMahon KJ., Renner E.D., Allmaras G.W. et al. An agar-gel immunodiffusion test for detection of Brucella antibodies in human serum // Can. J. Microbiol. 1979. - V. 25, N 7. -P. 850-854.

437. Meikle P J., Perry M.B., Cherwonogrodzky J.W., Bundle D.R. Fine structure of A and M antigens from Brucella biovars // Infect, hnmun. 1989. - Vol. 57, N 9. - P. 2820-2828.

438. Memish Z., Mah M.W., Al Mahmoud S., Shaalan M., Khan M.Y. Brucella bacteremia: clinical and laboratory observations in 160 patients // J. Infect. 2000. - Vol. 40, N 1. -P. 59-63.

439. Mikolon A.B., Gardner LA., Hietala S.K. et al. Evaluation of North American antibody detection tests for diagnosis of brucellosis in goats II J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1716-1722.

440. Mirabet E., Torregrosa R., Hira P.R. et al. The indirect immunofluorescence test in the diagnosis of brucellosis // Rev. Clin. Esp. 1988. - Vol. 182, N 1. - P. 18-21.

441. Mishal J., Ben-Israel N., Levin Y. et al. Brucellosis outbreak: analysis of risk factors and serologic screening II Int. J. Mol. Med. 1999. - V. 4, N 6. - P. 655-658.

442. Moeremans M., Daneels G., Van Dijck A. et al. Sensitive visualization of antigenan-tibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold/silver staining // J. Immunol. Methods. 1984. - Vol. 74, N 2. - P. 353-360.

443. Molnar E., Molnar L., Vale W.G. Value of different serological tests in the diagnosis of bovine brucellosis in the Amazonian region // Acta Vet. Hung. 1998. - Vol. 46, N 2. -P. 199-210.

444. Morata P., Queipo-Ortuno M.L, de Dios Colmenero J. Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 9. - P. 2443-2446.

445. Morata P., Queipo-Ortuno M.I., Reguera J.M. et al. Posttreatment follow-up of brucellosis by PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 10. - P. 3743-3746.

446. Morata P., Queipo-Ortuno M.L, Reguera J.M. et al. Diagnostic yield of a PCR assay in focal complications of brucellosis // Ibid. 1999. - Vol. 37, N 12. - P. 4163-4166.

447. Moreno E., Berman D.T. Brucella abortus lipopolysaccharide is mitogenic for spleen cells of endotoxin-resistent C3H/HeJ mice // J. Immunol. 1979. - Vol. 123, N 6. - P. 2915-2919.

448. Moreno E., Berman D.T., Boettcher L.A. Biological activities of Brucella abortus lipopolysaccharides // Infect. Immun. 1981. - Vol. 31, N 1. - P. 362-370.

449. Moreno E., Borowiak D., Mayer H. Brucella lipopolysaccharides and polysaccharides // Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - Vol. 138, N 1. - P. 102-105.

450. Moreno E., Jones L.M., Berman D.T. Immunochemical characterization of rough Brucella lipopolysaccharides // Infect. Immun. 1984. - Vol. 43, N 3. - P. 779-782.

451. Moreno E., Mayer H., Moriyon I. Characterization of native polysaccharide hapten from Brucella melitensis И Infect Immun. 1987. - Vol. 55, N 11. - P. 2850-2853.

452. Moreno E., Pitt M.W., Jones L.M. et al. Purification and characterization of smooth and rough lipopolysaccharides from Brucella abortus II J. Bacteriol. 1979. - Vol. 138, N 2. -P. 361-369.

453. Moreno E., Speth S.L., Jones L.M., Berman D.T. Immunochemical characterization of Brucella lipopolysaccharides and polysaccharides // Infect. Immun. 1981. - Vol. 31, N 1. -P. 214-222.

454. Moreno E., Stackebrandt E., Dorsch M. et al. Brucella abortus 16S rRNA and lipid A reveal a phylogenetic relationship with members of the alpha-2 subdivision of the class Pro-teobacteriz. II J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, N 7. - P. 3569-3576.

455. Moreno M.S., Esquerdo G.L., Gonzalez C.P. et al. Diagnosis of brucellosis in an endemic area. Evaluation of routine diagnostic tests // Med. Clin. (Bare.). 1992. - Vol. 98, N 13. -P. 481-485.

456. Moreno-Lafont M.C., Lopez-Merino A., Lopez-Santiago R. Cell response to a salt-extrable and sonicated Brucella melitensis 16M antigen in human brucellosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995. - Vol. 2, N 3. - P. 377-380.

457. Morgan W.J., MacKinnon D.J., Lawson J.R., Cullen G.A. The rose bengal plate agglutination test in the diagnosis of brucellosis // Vet. Rec. 1969. - Vol. 85, N 23. - P. 636-641.

458. Morgan W.J.B., Richards R.A. The diagnosis, control and eradication of bovine brucellosis in Great Britain // Vet. Rec. 1974. - Vol. 94. - P. 510-517.

459. Moriyon I., Berman D.T. Effects of nonionic, ionic, and dipolar ionic detergents and EDTA on the Brucella cell envelope // J. Bacteriol. 1982. - Vol.152, N 2. - P. 822-828.

460. Moriyon I., Gamazo C., Diaz R. Properties of the outer membrane of Brucella II Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - Vol. 138, N 1. - P. 89-91.

461. Moyer N.P., Evins G.M., Pigott N.E. et al. Comparison of serologic screening tests for brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, N 10. - P. 1969-1972.

462. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - Vol. 155. - P. 335-350.

463. Muncz F., Kormendy В., Mocsy M. Comparison of agar gel precipitation and complement fixation test for the detection of Brucella ovis infection // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1979. - Vol. 26, N 1. - P. 11-14.

464. Myers D.M., Varela-Diaz V.M. Serodiagnosis of ram epididymitis by counterimmu-noelectrophoresis, using Brucella ovis surface R antigen // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 10, N4.-P. 451-453.

465. Myers D.M., Varela-Diaz V.M. Serological and bacteriological detection of Brucella canis infection of stray dogs in Moreno, Argentina // Cornell. Vet. 1980. - Vol. 70, N 3. -P. 258-265.

466. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. - Vol. 22, N 12. - P. 1084-1091.

467. Navarro E., Fernandez J.A., Escribano J., Solera J. PCR assay for diagnosis of human brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 5. - P. 1654-1655.

468. Navas E., Guerrero A., Cobo J., Loza E. Faster isolation of Brucella spp. from blood by isolator compared with BACTEC NR // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1993. - Vol. 16, N 1. - P. 79-81.

469. Nicoletti P. An evaluation of serologic tests used to diagnose brucellosis in buffaloes (Bubalus bubalis) II Trap. Anim. Health Prod. 1992. - Vol. 24, N. 1. - P. 40-44.

470. Nielsen K. Use of dried smooth lipopolysaccharide antigen coated polystyrene plates for diagnosis of bovine brucellosis by enzyme immunoassay // J. Immunoassay. 1998. -Vol. 19, N1.-P. 39-48.

471. Nielsen K., Gall D. Fluorescence polarization assay for the diagnosis of brucellosis: a review // J. Immunoassay Immunochem. 2001. - V. 22, N 3. - P. 183-201.

472. Nielsen К., Gall D., Lin M. et al. Diagnosis of bovine brucellosis using a homogeneous fluorescence polarization assay // Vet. Immunol. Immunopathol. 1998. - Vol. 66, N 3-4. - P. 321-329.

473. Nielsen K., Gall D., Smith P. et al. Validation of the fluorescence polarization assay as a serological test for the presumptive diagnosis of porcine brucellosis // Vet. Microbiol. -1999. Vol. 68, N 3-4. - P. 245-253.

474. Nielsen K., Gall D., Smith P. et al. Fluorescence polarization assay for the diagnosis of bovine brucellosis: adaptation to field use // Vet. Microbiol. 2001. - V. 80, N 2. - P. 163-170.

475. Nielsen K.H., Kelly L., Gall D. et al. Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis // Vet. Immunol. Immunopathol. 1995. - Vol. 46, N 3-4. - P. 285-291.

476. Nielsen K., Kelly L., Gall D. et al. The use of divalent cation chelating agents (EDTA/EGTA) to reduce non-specific serum protein interaction in enzyme immunoassay // Vet. Res. Commun. 1994. - Vol. 18, N 6. - P. 433-437.

477. Nielsen K., Kelly L., Mallory M. Standardization of smooth lipopolysaccharide preparations for use in diagnostic serological tests for bovine antibody Brucella abortus II J. Immunoassay. 1998. - Vol. 19, N 4. - P. 239-250.

478. Nielsen K., Smith P., Gall D. et al. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of antibody to Brucella abortus in milk // Vet. Microbiol. -1996. Vol. 52, N 1-2. - P. 165-173.

479. Nielsen O., Stewart R.E., Nielsen K. et al. Serologic survey of Brucella spp. antibodies in some marine mammals of North America // J. Wildl. Dis. 2001. - Vol. 37, N 1. - P. 89100.

480. Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium. Transmembrane diffusion of some hydrophobic substances // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - 433. - P. 118-132.

481. Nunez-Torres E.D., Diaz-Aparicio E., Hernandez-Andrade L. et al. Sensitivity and specificity of an ELISA as a screening test for the diagnosis of Brucella ovis in sheep // Rev. Latinoam. Microbiol. 1997. - Vol. 39, N 3-4. - P. 123-128.

482. Nunez-Torres E., Diaz-Aparicio E., Tenorio V.R. et al. Stability of antigen and agarose used in a double immunodiffusion serologic test for Brucella ovis I I J. Vet. Diagn. Invest. -1998. -VoL 10, N1.-P. 113-115.

483. Olsen S.C, Evans D., Hennager S.G. et al. Serologic responses of Brucella abortus strain 19 calfhood-vaccinated cattle following adult vaccination with strain RB51 // J. Vet. Di-agn. Invest. 1998. - Vol. 8, N 4. - P. 451-454.

484. Olsen S.C., Stevens M.G., Cheville N.F., Schurig G. Experimental use of a dot-blot assay to measure serologic responses of cattle vaccinated with Brucella abortus strain // Ibid. -1997. Vol. 9, N 4. - P. 363-367.

485. Omar F.Z., Zuberi S., Minns R.A. Neurobrucellosis in childhood: six new cases and review of the literature // Dev. Med. Child. Neurol. 1997. - Vol. 39, N 11. - P. 762-765.

486. Omer M.K., Skjerve E., Holstad G. et al. Prevalence of antibodies to Brucella spp. in cattle, sheep, goats, horses and camels in the State of Eritrea; influence of husbandry systems // Epidemiol. Infect. 2000. - Vol. 125, N 2. - P. 447-453.

487. Omer M.K., Skjerve E., MacMillan A.P., Woldehiwet Z. Comparison of three serological tests in the diagnosis of Brucella infection in unvaccinated cattle in Eritrea // Prev. Vet. Med. 2001. - V. 48, N 3. - P. 215-222.

488. Orduna A., Almaraz A., Prado A. et al. Evaluation of immunocapture-agglutination test (Brucellaca.pt) of human brucellosis //J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N 11. - P. 40004005.

489. O'Reilly D. J., Cunningham B. An assessment of the brucellosis card test // Vet. Rec. 1971. - Vol. 88, N 23. - P. 590-594.

490. Oreskes I., Singer J.M. The mechanism of particulate carrier reactions. 1. Adsorption of human-globulin to polystyrene latex particles // J. Immunol. 1961. - Vol. 86. - P. 338-344.

491. Ortega M., Lara A., Perez M.J. et at Bacteremia caused by Brucella sp. with negative conventional serology// Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2001. - Vol. 19, N 1. - P.34.

492. Osoba A.O., Balkhy H., Memish Z. et al. Diagnostic value of Brucella ELISA IgG and IgM in bacteremic and non-bacteremic patients with brucellosis // J. Chemother. 2001. -Vol. 13, Suppl. 1. - P. 54-59.

493. Ouahrani-Bettache S., Soubrier M.P., Liautard J.P. IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains // J. Appl. Bacterid. 1996. - Vol. 81, N2.-P. 154-160.

494. Palade G.E. Blood capillares of the heart and other organs // Circulation. 1961. -Vol. 24. - P. 37.

495. Palmer D.A., Douglas J.T. Analysis of Brucella lipopolysaccharide with specific and cross-reacting monoclonal antibodies // J. Clin.-Microbiol. 1989. - Vol. 27, N 10. - P. 23312337.

496. Parrat D., Nielsen K.H., White R.G. Radioimmunoassay of IgM, IgG and IgA Brucella antibodies // Lancet. 1977. - Vol. 1, N 8021. - P. 1075-1078.

497. Patterson J.M., Deyoe B.L., Stone S.S. Identifications of immunoglobulins associated with complement fixation, agglutination, and low pH buffered antigen test for brucellosis // Am. J. Vet. Res. 1976. - Vol. 37, N 3. - P. 319-324.

498. Paulo P.S., Vigliocco A.M., Ramondino R.F. et al. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - Vol. 7, N 5. - P. 828-831.

499. Paulsen LT., Seshadri R., Nelson K.E. et al. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, N20. - P. 13148-13153.

500. Perera V.Y., Creasy M.T., Winter AJ. Nylon bead enzyme-linked immunosorbent assay for detection of sub-picogram quantities of Brucella antigens // J. Clin. Microbiol. 1983. -Vol. 18, N3.-P. 601-608.

501. Perry M.B., Bundle D.R. Lipopolysaccharide antigens and carbohydrates of Brucella II In Adams L.G. (ed.), Advances in Brucellosis research. Texas A&M University, Austin, 1990. P. 76-88.

502. Potasman I., Even L., Banai M. et al. Brucellosis: an unusual diagnosis for a seronegative patient with abscesses, osteomyelitis, and ulcerative colitis // Rev. Infect. Dis. 1991. -Vol. 13, N6.-P. 1039-1042.

503. Prior M.G., Niilo L., Reeker W.H. Use of the brucellosis card test for screening cattle in Saskatchewan I/ Can. J. Сотр. Med. 1975. - Vol. 39, N 2. - P. 107-109.

504. Puri N., Sinko PJ. Adjuvancy enhancement of muramyl dipeptide by modulating its release from a physicochemically modified matrix of ovalbumin microspheres. II. In vivo investigation // J. Control. Release. 2000. - Vol. 69, N 1. - P. 69-80.

505. Queipo-Ortuno M.I, Garcia-Ordonez M.A., Colmenero J.D. Hydrogen peroxide improves the efficiency of a peripheral blood PCR assay for diagnosis of human brucellosis // Bio-techniques. 1999. - Vol. 27, N 2. - P. 248-250,252.

506. Queipo-Ortuno M.I., Morata P., Ocon P. et al. Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral-blood PCR assay II J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 11. - P. 2927-2930.

507. Qureshi Т., Stittmatter J., Turner K., Davis D.S. Experimental infection of white-tailed deer with rangiferine brucellosis // J. Wildl. Dis. 1999. - Vol 35, N 2. - P. 388-391.

508. Quinn R., Campbell A.M., Phillips A.P. A monoclonal antibody specific for the A antigen of Brucella spp. // J. Gen. Microbiol. 1984. - Vol. 130, Pt 9. - P. 2285-2289.

509. Raybould T.J. Antigens of diagnostic significance in Brucella abortus И Can. J. Microbiol. 1982. Vol. 26, N 6. - P. 557-566.

510. Raybould T.J., Chantler S. Serological differentiation between infected and vaccinated cattle by using purified soluble antigens from Brucella abortus in a hemagglutination system // Infect. Immun. 1980. - Vol. 29, N 2. - P. 435-441.

511. Raynaud M., Digeon M. // C. R. Acad. Sci. (Paris). 1949. - Vol. 229. - P. 564-566.

512. Renoux G., Plommet M., Philippon A. Microreactions d'agglutination et de fixationdu complement pour le diagnostic des brucelloses // Ann. Rech. Vet. 1971. - Vol. 2. - P. 263269.

513. Renoux G., Renoux M. Passive hemagglutination test for individual or epidemiologic diagnosis of human brucellosis // Sem. Hop. 1978. - Vol. 54, N. 43-44. - P. 1337-1342.

514. Renoux G., Renoux M., Guillaumin J.M. Biological properties and chemical composition of a soluble fraction of Brucella abortus. Monospecific A or M antigens // Dev. Biol. Stand. 1976. - Vol. 31. - P. 100-109.

515. Renoux G., Renoux M., Tinelli R. Phenol-water fractions from smooth Brucella abortus and Brucella melitensis: immunochemical analysis and biological behavior // J. Infect. Dis. 1973. - Vol. 127, N 2. - P. 139-148.

516. Renukaradhya G.J., Isloor S., Crowther JR. et al. Development and field validation of an avidin-biotin enzyme-linked immunosorbent assay kit for bovine brucellosis // Rev. Sci. Tech. 2001. - Vol. 20, N 3. - P. 749-756.

517. Rijpens N.P., Jannes G., Van Asbroeck M. et al. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62, N 5. - P. 1683-1688.

518. Rodriguez-Torres A., Ramos-Sanchez M.C., Orduna-Domingo A. et al. Differential scanning calorimetry investigations on LPS and free lipids A of the bacterial cell wall // Res. Microbiol. 1993. - Vol. 144, N 9. - P. 729-740. .

519. Rogoff E.E., Romano R., Hahn E.W. The prevention of Ehrlich ascites tumor using intraperitoneal colloidal 198Au. Dose vs. size of inoculum // Radiology. 1975. - Vol. 114, N 1. - P. 225-226.

520. Rojas N., Frier E., Weintraub A. et al. Immunochemical identification of Brucella abortus lipopolysaccharide epitopes // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1994. - Vol. 1, N 2. -P. 206-213.

521. Romero C., Gamazo C., Pardo M., Lopez-Goni I. Specific detection of Brucella DNA by PCR // J Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33, N 3. - P. 615-617.

522. Romero C., Pardo M., Grillo M.J. et al. Evaluation of PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay on milk samples for diagnosis of brucellosis in dairy cattle // Ibid. -1995. Vol. 33, N 12. - P. 3198-3200.

523. Roop R.M, Preston-Moore D., Bagchi Т., Schurig G.G. Rapid identification of smooth Brucella species with a monoclonal antibody // Ibid. 1987. - Vol. 25, N 11. - P. 20902093.

524. Ross H.M., Foster G., Reid RJ. et al. Brucella species infection in sea-mammals // Vet. Rec. 1994. - Vol. 134, N14. - P. 359.

525. Rossetti O.L., Arese A.I., Boschiroli M.L., Cravero S.L. Cloning of Brucella abortus gene and characterization of expressed 26-kilodalton periplasmic protein: potential use for diagnosis //J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, N 1. - P. 165-169.

526. Rubio M., Barrio В., Diaz R. Usefulness of Rose Bengal, Coombs and counter-immunoelectrophoresis for the diagnosis of human brucellosis cases with negative seroagglutina-tion // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2001. - Vol. 19, N 8. - P. 406-407.

527. Ruiz M.P., Peralta F.G., Valle R., Aijona R. Microbiological diagnosis of brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1819.

528. Salinas-Melendez J.A., Martinez-Munoz A., Avalos-Ramirez R. et al. Serological activity of white-tail deer against several species of Brucella // Rev. Latinoam. Microbiol. 1998. -VoL 40, N 3-4. - P. 124-127.

529. Samartino L., Gall D., Gregoret R., Nielsen K. Validation of enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of bovine brucellosis // Vet. Microbiol. 1999. - Vol. 70, N3-4.-P. 193-200.

530. Samartino L., Gregoret R., Gall D., Nielsen K. Fluorescence polarization assay: application to the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina // J. Immunoassay. 1999. - Vol. 20, N3.-P. 115-126.

531. Sambrook J., Gething MJ. Protein structure. Chaperones, paperones // Nature. -1989. Vol. 342, N 6247. - P. 224-225.

532. Sanchez D.O., Zandomeni R.O., Cravero S. et al. Gene discovery through genomic sequencing of Brucella abortus // Infect. Immun.'- 2001. Vol. 69, N 2. - P. 865-868.

533. Sangari F.J., Aguero J. Identification of Brucella abortus В19 vaccine strain by the detection of DNA polymorphism at the ery locus // Vaccine. 1994. - Vol. 12, N 5. - P. 435-438.

534. Sandhu K.S., Joshi D.V. Comparative study in cattle and buffaloes for evaluation of various diagnostic tests for brucellosis // Indian J. Pathol. Microbiol. 1993. - Vol. 36, N 4. -P. 458-465.

535. Santos J.M., Verstreate D.R., Perera V.Y., Winter AJ. Outer membrane proteins from rough strains of four Brucella species // Infect. Immun. 1984. - Vol. 46, N 1. - P. 188-194.

536. Saz J. V., Beltran M., Diaz A. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of brucellosis // Eur. J. Clin. Microbiol. -1987. Vol. 6, N 1. - P. 71-74.

537. Schnaitman C.A. Protein composition of the cell wall and cytoplasmic membrane of Escherichia coli И J. Bacteriol. 1970. - Vol. 104, N 2. - P. 890-901.

538. Serra J., Velasco J., Godoy P., Mendoza J. Can the Brucellacapt test be substituted for the Coombs test in the diagnosis of human brucellosis? // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. -2001. Vol. 19, N 5. - P. 202-205.

539. Servicio Nacional de Sanidad Animal. Procedure manual: serological diagnosis of bovine brucellosis. Buenos Aires, 1993.

540. Shehabi A., Shakir K., El-Khateeb M. et al. Diagnosis and treatment of 106 cases of human brucellosis // J. Infect. 1990. - Vol. 20, N 1. - P. 5-10.

541. Sifuentes-Rincon A.M., Revol A., Barrera-Saldana H.A. Detection and differentiation of the six Brucella species by polymerase chain reaction // Mol. Med. 1997. - Vol. 3, N 11. - P. 734-739.

542. Simon R., Priefer U.f Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria // Bio/Technology. -1983.-Vol. 10.-P. 783-791.

543. Singh S.V., Gupta V.K., Singh N. Comparative evaluation of a field-based dot-ELISA kit with three other serological tests for the detection of Brucella antibodies in goats // Trop. Anim. Health Prod. 2000. - Vol. 32, N 3. - P. 155-163.

544. Smits H.L., Basahi M.A., Diaz R. et al. Development and evaluation of a rapid dipstick assay for serodiagnosis of acute human brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N12.-P. 4179-4182.

545. Snowden K., Hommel M. Antigen detection immunoassay using dipsticks and colloidal dyes // J. Immunol. Methods. -1991. Vol. 140, N. - P. 57-65.

546. Sowa B.A., Kelly K.A., Ficht T.A. et al. SDS-soluble and peptidoglican-bound proteins in the outer membrane-peptidoglycan complex of Brucella abortus II Vet. Microbiol. -1991. Vol. 27, N 3-4. - P. 351-369.

547. Spencer T.L., Burgess G.W. Enzyme-linked immunosorbent assay for Brucella ovis specific antibody in ram sera // Res. Vet. Sci. 1984. - Vol. 36, N 2. - P. 194-198.

548. Sreevatsan S., Bookout J.B., Ringpis F. et al. A multiplex approach to molecular detection of Brucella abortus and/or Mycobacterium bovis infection in cattle // J. Clin. Microbiol. -2000. Vol. 38, N 7. - P. 2602-2610.

549. Stack J.A., Perrett L.L., Brew S.D., MacMillan A.P. Competitive ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples // Vet. Rec. 1999. - Vol. 145, N 25. -P. 735-736.

550. Steinitz M., Tamir S. Solubilization of cell-membrane-antigen and its coupling to fixed and non-fixed erythrocytes // J. Clin. Lab. Immunol. 1985. - Vol. 18, N 4. - P. 195-198.

551. Steinitz M., Tamir S. The coating of erythrocytes with detergent-solubilized molecules: a general method for improved coupling of antigens and antibodies // J. Immunol. Methods. 1985. - Vol. 76. - N 1. - P. 27-38.

552. Stemshom В., Nielsen K. The bovine immune response to Brucella abortus. IV. Studies with a double immunodiffusion test, for antibody against A2 // Can. J. Сотр. Med. -1981. Vol. 45, N 2. - P. 147-153.

553. Stevens M.G., Hennager S.G., Olsen S.C., Cheville N.F. Serologic responses in diagnostic tests for brucellosis in cattle vaccinated with Brucella abortus 19 or RB51 // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 4. P. 1065-1066.

554. Stevens M.G., Olsen S.C. Antibody responses to Brucella abortus 2308 in cattle vaccinated with B. abortus RB51 // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 3. - P. 1030-1034.

555. Stevens M.G., Olsen S.C., Cheville N.F. Comparative analysis of immune responses in cattle vaccinated with Brucella abortus strain 19 or strain RB51 // Vet. Immunol. Immunopa-thol. 1995. - Vol. 44, N 3-4. - P. 223-235.

556. Sting R., Ortmann G. Experience with simple ELISA test systems for Brucella serology in cattle, sheep and goats // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2000. - Bd. 113, H. 1. -P. 22-28.

557. Stojek N., Stroczynska-Sikorska M. Further studies of the acid plate agglutination reaction in the diagnosis of brucellosis in humans // Wiad. Lek. 1992. - Vol. 45, N 11-12. -P. 436-439.

558. Stone S.S., Patterson J.M., Deyoe B.L. Extraction, separation, and partial characterization of Brucella abortus antigens // Am. J. Vet. Res. 1982. - Vol. 43, N 1. - P. 149-153.

559. Stuart F.A., Corbel M.J., Brewer R.A. Experimental Brucella abortus infection in pigs // Vet. Microbiol. 1987. - Vol. 14, N 4. - P. 365-379.

560. Sturesson C., Degling-Wikingsson L. Comparison of poly(acryl starch) and poly(lac-tide-co-glycolide) microspheres as drug delivery system for a rotavirus vaccine // J. Control Release. 2000. - Vol. 68, N 3. - P. 441-450.

561. Sutherland S.S., Evans R.J., Bathgate J. Application of an enzyme-linked immunosorbent assay in the final stages of a bovine brucellosis eradication program // Aust. Vet. J. -1986. Vol. 63, N 12. - P. 412-415.

562. Sutherland S.S., Hollander L. Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies and complement fixation test for cattle vaccinated and infected with Brucella abortus И Vet. Microbiol. -1986. Vol. 12, N 1. - P. 55-64.

563. Szulowski K., Iwaniak W., Pilaszek J. et al. The ELISA for the examination of hare sera for anti-Brucella antibodies // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1999. - Vol. 22, N 1. - P. 33-40.•

564. Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Specific enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine antibody to Brucella abortus II J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20, N 2. - P. 209213.

565. Tang L.Y., Qiu H.Y., Li Y.K. The epidemiologic value of polymerase chain reaction to the diagnosis of brucellosis patients // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 1997. - Vol. 18, N3.-P. 153-155.

566. Tchemeva E., Rijpens N., Jersek В., Herman L.M. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis // J. Appl. Microbiol. 2000. - Vol. 88, N 1. - P. 69-80.

567. Tcherneva E., Rijpens N., Naydensky C., Herman L. Repetitive element sequence based polymerase chain reaction for typing of Brucella strains I I Vet. Microbiol. 1996. -Vol. 51, N1-2.-P. 169-178.

568. Techniques in immunocytochemistry / Ed. by Bullock G.R., Petrusz P. Academic Press. - London, 1982. - Vol. 1; 1983. - Vol. 2; 1985. - Vol. 3.

569. Teixeira-Gomes A.P., Cloeckaert A., Bezard G. et al. Identification and characterization of Brucella ovis immunogenic proteins using two-dimensional electrophoresis and immunoblotting // Electrophoresis. 1997. - Vol. 18, N 8. - P. 1491-1497.

570. Thoen C.O., Bruner J.A., Luchsinger D.W., Pietz D.E. Detection of brucella antibodies of different immunoglobulin classes in cow milk by enzyme-linked immunosorbent assay // Am. J. Vet Res. 1983. - Vol. 44, N 2. - P. 306-308.

571. Thoen C.O., Hopkins M.P., Armbrust A.L. et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies in sera of Brucella juts-infected swine // Can. J. Сотр. Med. 1980. - Vol. 44, N 3. - P. 294-298.

572. Tibor A., Saman E., de Wergifosse P. et al. Molecular characterization, occurrence, and immunogenicity in infected sheep and cattle of two minor outer membrane proteins of Brucella abortus II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, N 1. - P. 100-107.

573. Timbs D.V., Moxham J.W., Liberona H.E. The use of automated complement fixation techniques in the brucellosis eradication scheme // N.Z. Vet. J. 1978. - Vol. 26, N 3. -P. 52-56.

574. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophorenic transfer of proteins from polyac-rilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.

575. Trap D., Gaumont R. Comparison of counterimmunoelectrophoresis with standard serological tests in the diagnosis of ovine brucellosis // Ann. Rech. Vet 1982. - Vol. 13, N 1. -P. 33-39.

576. Tryland M., Kleivane L., Alfredsson A. et al. Evidence of Brucella infection in marine mammals in the North Atlantic Ocean // Vet Rec. 1999. - Vol. 144, N 21. - P. 588-592.

577. Tryland M., Derocher A.E., Wiig Y., Godfroid J. Brucella sp. antibodies in polar bears from Svalbard and the Barents Sea // J. Wildl. Dis. 2001. - Vol. 37, N 3. - P. 523-531.

578. Tsai C.M., Fresch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Analyt. Biochem. 1982. - Vol. 119, N 1. - P. 115-119.

579. Turkevich J. Colloidal gold // Gold. Bull. 1985. - Vol. 18. - P. 86-91, 125-131.

580. Turkevich J., Garton G., Stevenson P.C. The color of colloidal gold // J. Colloid Sci. 1954. - Vol. 9. - P. 26-35.

581. Turner D.R., Wolowoiuk C. Electroless copper plating as an image amplifier for electrolytic printing // J. Electrochem. Soc. 1971. - Vol. 118, N 7. - P. 1235-1239.

582. U.S. Patent N 4775636. Blot overlay assay using colloidal metal particles / Moer-mans M., Daneels G., De Mey J. Janssen Pharmaceutica N.V. - Belgium, Beerse, 1988.

583. U.S. Patent N 5112606 МКИ5 A 61 К 39/395, С 07 К 15/28. Method of producing antibodies using colloidal metal as carrier / S. Sadao № 414608; Заявлено 29.09.89; Опубл. 12.06.89. Приоритет 10.01.86. № 61-3825 (Япония); НКИ 530/839.2.

584. US Patent N 5252496. Carbon Black Immunochemical Label / Princeton J.K., Wy-ckoffY., Edison Y.H., 18.12.1989.

585. US Patent WO 96/22532. Immunoassay Method and Reagent Involving Suspendible Carbon Labelled Bioaffine Particles / Lonnberg M., Carlson J., 20.01.1995.

586. Uzal F.A., Carrasco A.E., Nielsen K. et al. An indirect ELISA using a monoclonal anti IgGl enzyme conjugate for the diagnosis of bovine brucellosis // Vet. Microbiol. 1996. -Vol. 52,N1-2.-P. 175-180.

587. Van Aert A., Brioen P., Dekeyser P. et al. A comparative study of ELISA and other methods for the detection of Brucella antibodies in bovine sera // Vet. Microbiol. 1984. -Vol. 10, N1.-P. 13-21.

588. Van Beek L.K.H. Special properties of physical development process // J. Photogr. Sci. Eng. 1976. - Vol. 20, N 2. - P. 88-91.

589. Vanzini V.R., Aguirre N., Lugaresi C.I. et al. Evaluation of an indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina // Prev. Vet. Med. 1998. - Vol. 36, N 3. - P. 211-217.

590. Vanzini V.R., Aguirre N.P., Valentini B.S. et al. Comparison of an indirect ELISA with the Brucella milk ring test for detection of antibodies to Brucella abortus in bulk milk samples // Vet. Microbiol. 2001. - Vol. 82, N 1. - P. 55-60.

591. Velasco J., Bengoechea J.A., Brandenburg K. et al. Brucella abortus and its closest phylogenetic relative, Ochrobactrum spp., differ in outer membrane permeability and cationic peptide resistance // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, N 6. - P. 3210-3218.

592. Verger J.M., Grayon M. Characteristics of 273 strains of Brucella abortus of African origin// Dev. Biol. Stand. 1984. - Vol. 56. - P. 63-71.

593. Verger J.M., Grimont F., Grimont P. A.D., Grayon M. Brucella, a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. - Vol. 35. -P. 292-295.

594. Verstreate D.R., Creasy M.T., Caveney N.T. et al. Outer membrane proteins of Brucella abortus: isolation and characterization // Infect. Immun. 1982. - Vol. 35, N 3. - P. 979989.

595. Verstreate D.R., Winter AJ. Comparison of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis profiles and antigenic relatedness among outer membrane proteins of Brucella abortus strains // Infect. Immun. 1984. - Vol. 46, N 1. - P. 182-187.

596. Vigliocco A.M., Silva Paulo P.S., Mestre J. et al. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella ovis И Vet. Microbiol.- 1997. Vol. 54, N 3-4. - P. 357-368.

597. Vizcaino N., Cloeckaert A., Verger J. et al. DNA polymorphism in the genus Brucella И Microbes Infect. 2000. - Vol. 2, N 9. - P. 1089-1100.

598. Vizcaino N., Cloeckaert A., Zygmunt M.S., Dubrey G. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the Brucella melitensis omp31 gene coding for an immunogenic major outer membrane protein // Infect Immun. 1996. - Vol. 64, N 9. - P. 3744-3751.

599. Vizcaino N., Fernandez-Lago L. A rapid and sensitive method for the identification of Brucella species with a monoclonal antibody // Res. Microbiol. 1992. - Vol. 143, N 5. -P. 513-518.

600. Vizcaino N., Verger J.M., Grayon M. et al. DNA polymorphism at the omp-31 locus of Brucella spp.: evidence for a large deletion in Brucella abortus, and other specific-specific markers // Microbiol. 1997. - Vol. 143, Pt 9. - P. 2913-2921.

601. Waghella S., Wandera J.G., Wagner W.G. Comparison of four serological tests in the diagnosis of caprine brucellosis // Res. Vet. Sci. 1980. - Vol. 28. - N 168-171.

602. Walker R.L., LeaMaster B.R., Stellflug J.N., Biberstein E.L. Use of enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Brucella ovis in sheep: field trial // Am. J. Vet. Res. 1985. - Vol. 46, N 8. - P. 1642-1646.

603. Warren H.S., Chedid L.A. Future prospects for vaccine adjuvants // Crit. Rev. Immunol. 1988. - Vol. 8, N 2. - P. 83-101.

604. Warren H.S., Riveau G.R., de Deckker F.A., Chedid L.A. Control of endotoxin activity and interleukin-1 production through regulation of lipopolysaccharide-lipoprotein binding by a macrophage factor// Infect Immun. 1988. - Vol. 56, N 1. - P. 204-212.

605. Weber A, Hussein N. A. The indirect immunofluorescence test for the demonstration of Brucella canis infections in beagles // Zentralbl. Veterinarmed. 1976. - Bd. 23, H. 2. -S. 151- 157.

606. Weber A, Krauss H. Usefulness of the agar gel precipitation test for the diagnosis of Brucella canis infections in beagles // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 1975. - Bd. 88, H. 22. - P. 425-427.

607. Weynants V., Tibor A., Denoel P.A. et al. Infection of cattle with Yersinia enteroco-litica 0:9 a cause of the false positive serological reactions in bovine brucellosis diagnostic tests // Vet. Microbiol. 1996. - Vol. 48, N 1-2. - P. 101-112.

608. Williams J.D., Heck F.C., Davis D.S., Adams L.G. Comparison of results from five serologic methods used for detecting Brucella abortus antibody activity in coyote sera // Vet. Immunol. Immunopathol. 1991. - Vol. 29, N 1-2. - P. 79-87.

609. Williamson C.C., Oberem P.T., Poerstamper C. et al. An ELISA using an SDS extract of Brucella abortus strain 99 as antigen to detect B. abortus antibodies in cattle sera // Onderstepoort J. Vet. Res. 1988. - Vol. 55, N 1. - P. 1-3.

610. Wilson D.V., Thomley M.J., Coombs R.R. A solid phase assay with radioactively labelled antibody for the detection of Brucella abortus II J. Med. Microbiol. 1977. - Vol. 10, N3.-P. 281-292.

611. Wilson G.S., Miles A.A. The serological differentiation of smooth strains of the Brucella group // Brit. J. Exp. Pathol. 1932. - Vol. 13. - P. 1-13.

612. Wilson M.B., Nakane P.K. The covalent coupling of proteins to periodate-oxidized sephadex: a new approach to immunoadsorbent preparation // J. Immunol. Methods. 1976. -Vol. 12, N 1-2. - P. 171-181.

613. Winter AJ. Outer membrane proteins of Brucella // Ann. Inst. Pasteur Microbiol. -1987. Vol. 138, N 1. - P. 87-89.

614. Wyckoff T.J.O., Raetz C.R.H., Jackman J.N. Antibacterial and anti-inflammatory agents that target endotoxin // Trends in Microbiol. 1998. - Vol. 6, N 4. - P. 154-159.

615. Yagupsky P. Detection of Brucellas in blood cultures // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37,N11.-P. 3437-3442.

616. Yagupsky P., Peled N., Press J. et al. Comparison of BACTEC 9240 Peds Plus medium and isolator 1.5 Microbial Tube for detection of Brucella melitensis from blood cultures // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 6. - P. 1382-1384.

617. Young E.J. Serologic diagnosis of human brucellosis: analysis of 214 cases by agglutination tests and review of the literature // Rev. Infect. Dis. 1991. - V. 13, N 3. - P. 359-372.

618. Young EJ. An overview of human brucellosis // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol. 21, N 2. - P.283-289.

619. Young E.J. Utility of the enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosing neurobrucellosis // Clin. Infect. Dis. 1998. - Vol. 26, N 6. - P. 1481.

620. Zerva L., Bourantas K., Mitka S. et al. Serum is the preferred clinical specimen for diagnosis of human brucellosis by PCR // J. Clin. Microbiol. 200U - Vol. 39, N 4. - P. 16611664.

621. Zoon K.C. Vaccines, pharmaceutical products, and bioterrorism: challenges for the U.S. Food and Drug Administration // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5, N 4. - P. 534-536.

622. Zsigmondy R. Ueber wSssrige Losungen metalischen Goldes // Anal. Chem. 1898. Bd. 301. - S. 29-54.

623. Zygmunt M.S., Baucheron S., Vizcaino N. et al. A. Single-step purification and evaluation for serological diagnosis of Brucella ovis infection in rams // Vet. Microbiol. 2002. -Vol. 87, N3.-P. 213-220.

624. Zygmunt M.S., Cloeckaert A., Dubray G. Brucella melitensis cell envelope and lipopolysaccharide epitopes involved in humoral immune response of naturally and experimentally infected sheep // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 10. - P. 2514-2522.

625. Zygmunt M.S., Debbarh H.S., Cloeckaert A., Dubray G. Antibody response to outer membrane antigens in naturally infected and.Revl vaccinated sheep // Vet. Microbiol. 1994. -Vol. 39, N1-2.-P. 33-46.

626. Zygmunt M.S., Dubray G., Bundle D.R., Perry M.B. Purified native haptens of Brucella abortus B19 and B. melitensis 16M reveal the lipopolysaccharide origin of the antigens // Ann. Inst. Pasteur. 1988. - Vol. 139, N 4. - P. 421-423.

627. Zygmunt M.S., Gilbert F.B., Dubray G. Purification, characterization, and seroacti-vity of a 20-kilodalton Brucella protein antigen // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30, N 10. -P. 2662-2667.1. БЛАГОДАРНОСТИ

628. Считаю своим приятным долгом поблагодарить заведующего биохимическим отделом, доктора биологических наук, старшего научного сотрудника Е.Ю. Маркова за содействие в выполнении диссертации, ценные советы и замечания при планировании и оформлении работы.

629. Искренне благодарю ученого секретаря института кандидата медицинских наук А.Г. Трухину за методическую помощь в решении многочисленных организационных проблем.

Информация о работе

Загоскина, Татьяна Юрьевна
доктора медицинских наук
Владивосток, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы