Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Технология производства пробиотиков на основе Bacillus subtilis и их лечебно-профилактическая эффективность при инфекционных энтеритах телят
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов
Автореферат диссертации по теме "Технология производства пробиотиков на основе Bacillus subtilis и их лечебно-профилактическая эффективность при инфекционных энтеритах телят"
005047976
На правах рукописи
САТТОРОВ НОСИРЧОН РАСУЛОВИЧ
технология производства пробиотиков на основе bacillus subtilis и их лечебно-профилактическая эффективность при инфекционных энтеритах телят
06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук
17 т газ
Душанбе -2012
005047976
Работа выполнена в лаборатории микробиотехнологии Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура (ТАУ) и на кафедре ветеринарной санитарной экспертизы, микробиологии и зоогигиены Сумского национального аграрного университета (СНА У, Республика Украина).
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, академик
Сатторн И.
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Салнмов Т.М.;
член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Девришов Д.А.;
доктор медицинских наук, профессор Ходжаева Н.М.
Ведущая организация: НПП «Биологические препараты» Таджик-
ской академии сельскохозяйственных наук
Защита диссертации состоится 29 декабря 2012 г. в 1000 ч на заседании диссертационного совета ДМ 050.001.01 при Ветеринарном институте Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, г. Душанбе, ул. (Сахарова, 43, тел. (992-372) 27-39-95.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ветеринарного института Таджикской академии сельскохозяйственных наук.
Автореферат размещен 29 сентября 2012 г. на сайтах Ветеринарного института ТАСХН www.tajnivi.tj и ВАК России wvvw.vak2.ed.gov.ru
Автореферат разослан 28 ноября 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор ветеринарных наук, профессор
Н. Ярбаев
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В ветеринарной медицине при терапии и профилактике инфекционных заболеваний и стресса широко используют пробиотики - препараты, в состав которых входят живые микроорганизмы - естественные обитатели кишечного тракта теплокровных или сапрофиты, обитающие во внешней среде. Пробиотические препараты, которые безвредны, являются экологически чистыми и не имеют противопоказаний для применения, могут стать альтернативой антибиотикам (Куваева И.Б., 1976; Коршунов В.М. и др., 1996; тендеров Б.А. и др., 1997; Девришов Д.А. и др., 1998; Запруднов A.M. и др., 1999; Парникова С.И., 2002; Пестова Л.В. и др., 2006).
Совокупность свойств, реализованных в фенотипе бактерий-компонентов пробиотиков, а также биологически активных продуктов их метаболизма обусловливает спектр и выраженность лечебно-профилактической эффективности конкретного пробиотика, что определяет выбор наиболее активных бактерий-продуцентов (Ноздрин Г.А. и др., 1992; Бусол В.О. и др., 1995; Наумов М.М. и др., 2000).
В качестве основы для разработки лечебно-профилактических препаратов, перспективных для использования в ветеринарии, привлекают внимание исследователей экологически чистые живые культуры спорообразующих аэробных бактерий из рода Bacillus, что наряду с их полной безвредностью обусловлено высокой антагонистической активностью этих культур в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, продукцией БАВ. Бактерии рода Bacillus широко применяются для производства ферментов, биопрепаратов, средств защиты растений и т.п. (Антипов В.А., 1991; Кашин A.C., 2002).
Способность к росту на простых по составу и недорогих средах, высокий выход готового продукта, стабильность при хранении штаммов Bacillus делают их технологичными и позволяют создавать высокоэффективные технологии (Коляков Я.Е., 1970; Кашперова Т.А., 2005).
Для более длительного сохранения физико-химических и лечебных свойств пробиотики выпускают в основном в лиофилизированном виде в герметичных ампулах и флаконах. Однако наряду с известными достоинствами такие лекарственные формы пробиотиков не лишены и определенных недостатков: высокие затраты на индивидуальную и транспортную тару; наличие определенных технологических и иных ограничений, приводящих к нерациональному использованию ампул (флаконов) и относительно высокому проценту их выбраковки при производстве и контроле качества; специфические условия применения, отличающиеся рядом особенностей и др. (Вершинина И.Ю. и др., 1994; Ермолин A.B. и др., 1996; Пылаев С.А., 2001; Алтухов Ю.П. и др., 2002; Garber L.P. et al., 1995).
Большинство недостатков, свойственных производству пробиотиков в ампулах или флаконах, исключит серийный выпуск пробиотиков в порошках, жидкой, таблеточной и других лекарственных формах (ЛФ), упакованных во вмещающие большое количество доз емкости, что позволит применять эти пре-
параты для терапии и профилактики инфекционных заболеваний разных видов сельскохозяйственных животных и птиц (De Simone С. et al., 1995).
Применение пробиотических препаратов различного видового состава при выращивании молодняка животных снижает заболеваемость инфекционными желудочно-кишечными болезнями, повышает естественную резистентность молодняка и сохранность, коррегирует кишечный биоценоз, стимулирует откорм, сокращает продолжительность выращивания, уменьшает затраты кормов (Девришев Д.А. и др., 1998; Наумов М.М. и др., 2000; Пылаев С.А., 2001; Алтухов Ю.П. и др., 2002; Кашин А.С., 2002; Парникова С.И., 2002; Кашперова Т.А., 2005; Пестова JI.B. и др., 2006).
Целью исследования явились разработка технологии производства про-биотиков на основе Bacillus subtilis и исследование их лечебно-профилактической эффективности при инфекционных энтеритах телят.
Для достижения указанной цели решены следующие задачи:
1. Изучить эпизоотическую ситуацию по инфекционным энтеритам телят в хозяйствах Республики Таджикистан и северо-восточного региона Украины.
2. Отобрать и изучить морфологические, культуральные, биохимические, физиолого-биологические свойства, патогенность и антагонистическую активность штаммов Вас. subtilis для производства на их основе пробиотиков.
3. Изыскать эффективную питательную среду для культивирования Вас. subtilis.
4. Совершенствовать технологию сушки биомассы Вас. subtilis контактно-сорбционным методом.
5. Разработать технологию изготовления пробиотического препарата Суб-тилбен и изучить его свойства.
6. Разработать технологию изготовления пробиотика Лаксубтил и исследовать его свойства.
7. Изучить эффективность пробиотических препаратов Субтилбен и Лаксубтил при профилактике и лечении инфекционных энтеритов телят.
8. Разработать нормативно-техническую документацию на пробиотики Субтилбен и Лаксубтил и внедрить их в ветеринарную практику.
Научная новизна. Впервые в результате эпизоотологического мониторинга в животноводческих хозяйствах Северного, Центрального и Южного Таджикистана и северо-восточного региона Украины определена роль патогенных микроорганизмов в возникновении инфекционных энтеритов молодняка КРС.
Установлено, что инфекционные энтериты телят чаще всего вызываются бактериальной флорой, которая циркулирует в хозяйствах и выделяется от коров больных эндометритами, маститами и коров-бактерионосителей. Чаще всего этиологическим фактором этих заболеваний являлись Е. coli, S. dublin, Рг. vulgaris.
Для производства пробиотиков на основе Вас. subtilis отобраны наиболее перспективные непатогенные штаммы BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, проявляющие антимикробные свойства в отношении тест-культур микроорганизмов в низких концентрациях (3,9 - 31,2 млн м.к./мл) и характеризующиеся типичными для Вас. subtilis физиолого-биологическими свойствами, которые
обусловливают более широкий диапазон действия при сочетанном применении
этих штаммов. <
Модифицированы питательная среда, состоящая из пептона, картофельного крахмала, глюкозы, хлорида натрия и бентонита, для глубинного культивирования Вас. БиЬШ^ и контактно-сорбционный метод обезвоживания биомассы, содержащей бактериальную массу Вас. виМШв.
Разработаны составы и технологии производства пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил на основе штаммов ВБ и 09, ВБ Т1 Д 24 и В8 и Д 26. Изучены антагонистическая активность, токсикологические свойства, проведены доклинические исследования этих препаратов. Предложены методы контроля пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил, изучена их стабильность.
В эксперименте отработана рациональная схема применения пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил при профилактике и терапии инфекционных энтеритов телят. При производственных испытаниях сконструированных препаратов установлена их высокая лечебно-профилактическая и экономическая эффективность, которая превосходит таковую у препаратов-аналогов.
Научная новизна проведенных исследований подтверждена 5 патентами
РТ.
Практическая ценность. В результате проведенных исследовании ветеринарной практике предложены эффективные пробиотические препараты Субтилбен и Лаксубтил, обладающие этиотропным и патогенетическим действием и предназначенные для профилактики и терапии инфекционных энтеритов телят.
Разработана нормативная документация:
- Инструкция по изготовлению и контролю иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
- Технические условия на иммунобиотик Субтилбен (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
- Наставление по применению иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
- Решение 26-го заседания Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ от 24.11.2004 г. (Душанбе) о практическом использования препарата Субтилбен в ветеринарной практике СНГ;
- Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации колибакте-рйоза новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
- Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации ротавирус-аой инфекции телят (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
- Инструкция о мероприятиях по борьбе с сальмонеллезом новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
- Научно-обоснованная система получения здорового молодняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят (утв. СГВН МСХРТ, 11.09.2012 г.);
- Рекомендации по применению пробиотиков для профилактики и лечения пневмоэнтеритов телят (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.);
- Инструкция по изготовлению и контролю пробиотического препарата Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г.);
- Технические условия на пробиотик Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г);
- Наставление по применению пробиотика Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г.).
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Результаты изучения эпизоотической ситуации по инфекционным энтеритам телят в хозяйствах Таджикистана и северо-восточного региона Украины.
2. Результаты изучения морфологических, культуральных, биохимических, физиолого-биологических свойств, патогенности и антагонистической активности штаммов Вас. виЫШв, отобранных для производства на их основе пробиотиков.
3. Результаты изыскания эффективной питательной среды для культивирования Вас. виЬиНз.
4. Технология сушки биомассы Вас. виЫШБ контактно-сорбционным методом.
5. Технология изготовления пробиотического препарата Субтилбен и результаты изучения его свойств.
6. Технология изготовления пробиотика Лаксубтил и результаты исследования его свойств.
7. Результаты доклинических исследований пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил.
8. Результаты изучения эффективности пробиотических препаратов Субтилбен и Лаксубтил при профилактике и лечении инфекционных энтеритов телят.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемур (2006 - 2011 гг.); республиканских научно-практических конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе, 2006 - 2011 гг.); Международной научно-практической конференции «Биобезопасность и зоонозные инфекции» (Алматы, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Научное и клиническое применение традиционной медицины в Синьцзяне и соседних странах» (Урумчи, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарные проблемы в Центральной Азии - Продовольственная безопасность: Использование современных методов диагностики и профилактики инфекционных болезней животных» (Душанбе, 2011 г.).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 34 научные работы, получены 5 патентов РТ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.
Диссертация изложена на 361 странице, иллюстрирована 32 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 450 источников. В приложение включены материалы, подтверждающие внедрение результатов исследования в практику.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в 2006 - 2011 гг. в лаборатории микробиотехнологии ТАУ в соответствии с республиканской научно-технической программой «Разработка и внедрение эффективных биологических средств профилактики и терапии бактериозов и микоплазмозов животных» на 2005 - 2010 гг., зарегистрированной в Национальном патентно-информационном центре (НПИЦентр) РТ (№ госрегистрации 0105 ТД 236), и на кафедре ветеринарной санитарной экспертизы, микробиологии и зоогигиены СНАУ (Республика Украина).
Экспериментальные и производственные исследования проведены в 12 животноводческих хозяйствах районов республиканского подчинения (РРП: Кооперативное хозяйство (КХ) им. Л. Муродова, Открытое акционерное общество (ОАО) «Баракат», Производственный кооператив (ПК) «Ватан», ПК им. А. Юсупова, Учебно-производственное хозяйство (УПХ) ТАУ - Гиссарский р-н; Производственное аграрно-промышленное объединение (ПАПО) «Шахринав», ПК «Навруз» - Шахринавский р-н); Согдийской (Ассоциация дехканских хозяйств (АДХ) «Ленин»; Племенное хозяйство (ПХ) им. X. Мукарамова - Исфа-ринский р-н; ПК им. Дж. Расулова - Бободжон-Гафуровский р-н) и Хатлонскои областей (ОАО «Баракат», УПХ ТАУ - Яванский р-н) РТ.
2.1. Диагностические исследования
Бактериальные заболевания диагностировали на основании анализа эпи-зоотологических данных с учетом клинических признаков болезни, патолого-анатомических изменений и результатов бактериологического исследования патологического материала от больных, павших и вынужденно убитых больных телят.
При бактериологической диагностике микроскопировали мазки крови и мазки-отпечатки внутренних органов, на элективные питательные среды высевали выделенные из патологического материала культуры, для определения, , патогенности которых заражали лабораторных животных, затем культуры идентифицировали и типизировали серологическим методом.
Чувствительность выделенных культур к антибиотикам определяли методами серийных разведений с посевом на плотные питательные среды и бумажных дисков, оценивая результаты соответственно по задержке роста (МБсК) / гибели (МБцК) и величине зоны задержки роста микроорганизмов.
2.2. Штаммы Вас. subtilis
В работе использовали штаммы Вас. subtilis BS TJ Об BS TJ 07 BS TI ПЯ BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ 11, BS TJ 12, BS TJ Д 24, BS т} Д 26 из ко1кции при сравнительной характеристике которых изучали морфологические тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства, патогенносгь (онопроба), антагонистическую активность (методом серийных разведений с посевом на плотные питательные среды в отношении тест-культур Е соН S dublin, Pr. vulgaris), совместимость (при совместном культивировании на жидких и плотных питательных средах, после которого изучали морфологические тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства, патогенность и антагонистическую активность).
2.3. Антимикробная активность
Антагонистические свойства Субтилбена и Лаксубтила изучали методом серийных разведений.
2.4. Токсикологические свойства
Проверку безвредности Субтилбена и Лаксубтила осуществляли методом
™ТгОст"зз1-2005УЛЬТУРЬГ ИНФУЗ°РИИ C°,p0da Steinii согласн° требоваВ соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М
изучали острую и хроническую токсичность, раздражающие и аллергенное свойства Субтилбена и Лаксубтила.
2.5. Методы стандартизации пробиотиков на основе Вас. subtilis 2.5.1. Физико-химические свойства
Внешний вид, наличие механических примесей, плесени определяли визуально при рассмотрении отобранных образцов при хорошем естественном освещении на белом фоне на расстоянии 25 - 30 см от глаз.
Определение размера таблеток и массы таблеток проводили по ГФ XI (вып. 2, с. 156).
Определение времени распадаемости проводили по ГФ XI (вып. 2 с. 158). ' '
Концентрацию водородных ионов (рН) 10% водной суспензии определяли потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 175).
Определение массовой доли влаги проводили по ГОСТ 24061-89.
2.5.2. Биологические свойства
Подсчет количества микробных клеток Вас. subtilis. Пробы (Субтилбен в форме гранул и таблеток) суспендировали физиологическим раствором в 10 -15 раз и заправляли суспензией подготовленную камеру Горяева, в 5 квадратах которой под микроскопом определяли количество микробных клеток и рассчитывали их число.
Определение количества жизнеспособных клеток Вас. subtilis. В пробирку, содержавшую 1 г (мл) ЛФ на основе Вас. subtilis, добавляли 9 см3 стерильного физиологического раствора, после тщательного перемешивания 0,5 см суспензий переносили во вторую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора, из которой 0,5 см3 разведенной суспензии - в третью, из третьей - в четвертую, из четвертой - в пятую, из пятой - в шестую пробирку с 4,5 см физиологического раствора.
Из последней (шестой) пробирки по 0,5 см3 суспензии пипеткой засевали в шесть чашек Петри с картофельным агаром, колебательными движениями распределяя суспензию по всей поверхности агара. Культивировали 36 ч при (37+0,5)°С, после чего учитывали результаты исследования (определяли количество больших и малых по диаметру колоний).
Проверку на стерильность осуществляли по ГОСТ 28085-89.
Контаминацию микоплазмами исключали по ГФ XI (вып. 2, с. 15).
Антагонистические свойства определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах в отношении моно- и ассоциаций патогенов Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.
Испытание токсичности проводили по ГФ XI (вып. 2, с. 182).
2.6. Определение стабильности Субтилбена
Образцы экспериментальных серий лекарственных препаратов на основе Вас. subtilis при температуре 30°С помещали в термостат на сроки, соответствующие 6, 12, 18, 24, 30, 36 и 42 мес. естественного хранения, в которые изучали стабильность физико-химических и биологических свойств.
Экономическую эффективность пробиотических препаратов рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (утв. ГУВ МСХ СССР, 1982 г.), а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений» (утв. МСХ СССР, 1983 г.).
Методики отдельных экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.
Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стыодента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).
За основу выводов и практических предложений взяты результаты кон-^ тролируемых опытов в лабораторных и производственных условиях.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3. ИНФЕКЦИОННЫЕ ЭНТЕРИТЫ ТЕЛЯТ
3.1. Эпизоотическая ситуация в Северном, Центральном и Южном Таджикистане
На молочнотоварных фермах (МТФ) Таджикистана Е. coli, S. dublin и Рг. vulgaris являются возбудителями инфекционных энтеритов молодняка КРС, вероятность возникновения и тяжесть течения которых определяют внешние факторы, влияющие на естественную резистентность и иммунологическую реактивность организма.
В результате исследования 700 проб патологического материала (фекалии, кровь, паренхиматозные органы) от новорожденных телят из 12 животноводческих хозяйств РРП, Хатлонской и Согдийской областей РТ наибольшее количество больных инфекционными энтеритами телят (42,0%) выявлено в хозяйствах РРП, наименьшее (25,0%) - Хатлонской области (табл. 1).
Таблица 1
Результаты бактериологического исследования патологического материала от новорожденных телят (2006 - 2011 гг.)
РРП Область
Согдийская Хатлонская
и « всего 7 2 3
12
о я м неблагополучных 7 2 2
в 1 и 11
5 и всего 420 126 154
to о 700
о. с положительных 176 (42,0) 42 (33,0) 39 (25,0)
257 (40,3)
Примечание. В скобках указано процентное значение.
В 97 (76,3%) пробах выделены моновозбудители, 30 (23,7%) - ассоциации патогенов. В 59,8% (76) случаев возбудителем инфекционного энтерита была Е. coli, в 10,2 (13) -Pr. vulgaris, 6,3% (8) - S. dublin, 14,2% (18) - ассоциации Е. coli и Pr. vulgaris, 5,5% (7) - ассоциации Е. coli и S. dublin, 4,0% (5) - ассоциации Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris.
3.2. Эпизоотическая ситуация в хозяйствах северо-восточного региона Украины
Результаты бактериологических исследований Сумской, Харьковской и Черниговской государственных областных и районных лабораторий ветеринарной медицины за 2007 - 2011 гг. свдетельствуют, что в хозяйствах северо-
восточного региона Украины, специализирующихся на выращивании КРС, чаще всего циркулируют сальмонеллы сероваров S. dublin, S. typhimurium, S. en-teritidis; эшерихии- Ol, 08,04,078,086,0101 и Olli; стафилококки - St. aureus, St. saprophyticus, St. epidermidis; стрептококки - Str. agalactiae, Str. dysga-lactiae, Str. pyogenes, Str. uberus, Str. pneumoniae. Реже из патматериала изолировали синегнойную палочку, протей и пастереллу.
При бактериологических исследованиях в 32,2% случаев изолировали Е. coli, 15,6 - Ps. aeruginosa, 10,1 - Pr. vulgaris, 9,9 - St. aureus, 5,9 - S. enteritidis, 5,7 - Str. uberus, 20,6% случаев приходилось на долю остальных видов микроорганизмов.
При серотипизации эшерихий и сальмонелл установлено, что в регионе циркулируют серовары эшерихий - 08 (16,9%), 04 (11,1%), Ol (10,4%), 078 (10,1%), 086 (9,8%), 0101 (8,5%), Olli (7,3%), не тонировались - 24,9% и сальмонелл - S. enteritidis (55,7%), S. dublin (23,5%), S. typhimurium (20,8%).
При бактериологическом исследовании больных и павших телят изолирована условно-патогенная микрофлора - 12 видов (Е. coli - 23,1% случаев, Ps. aeruginosa - 17,6, S. enteritidis - 13,7, S. dublin - 10,5, S. typhimurium - 8,8, Pr. vulgaris - 6,1, St. aureus - 5,6, Str. pyogenes - 5,6, Str. pneumoniae - 4,6, Str. epidermidis - 2,6, P. multicida - 1,8% случаев).
Таким образом, инфекционные энтериты молодняка КРС вызываются бактериальной флорой, которая циркулирует в хозяйствах и выделяется от коров, больных эндометритами и маститами. Чаще всего этиологическим фактором этих заболеваний были эшерихии, сальмонеллы, протей и синегнойная палочка, что обусловливает актуальность разработки новых антибактериальных лекарственных средств и рациональных способов их применения.
4. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ВАС. SUBTIL! S
4.1. Подбор штаммов Вас. subtilis
Из изученных (BS TJ 06, BS TJ 07, BS TJ 08, BS TJ 09, BS TJ 10, BS TJ 11, BS TJ 12, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26) для производства на их основе пробиотиков отобраны наиболее перспективные штаммы Вас. subtilis - BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26, - проявляющие антимикробные свойства в отношении тест-культур микроорганизмов в низких концентрациях (3,9 - 31,2 млн м.к./мл).
Установлено, что штаммы BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 характеризуются типичными для Вас. subtilis физиолого-биологическими свойствами, которые могут обусловить более широкий диапазон их действия при сочетанном
применении. v '»-
Изученные штаммы характеризуются отсутствием гемолитической активности, у них не обнаружены ферменты, которые могут обуславливать патогенные свойства (лецитиназа, гиалуронидаза), обладают важными технологическими свойствами - растут в присутствии 7%-ной NaCl, не нуждаются в ами-
нокислотах и витаминах, не проявляют взаимного антагонизма при совместном культивировании.
Таким образом, морфологические, культуральные, ферментативные свойства, отсутствие патогенности, высокая противомикробная активность и физио-лого-биологические свойства штаммов ВБ и 09, В 8 ТС Д 24 и В8 ТС Д 26 послужили основанием для использования их при изготовлении пробиотиков.
4.2. Модифицированная питательная среда для культивироваиня Вас. $иЬШк
Для выращивания Вас. эиЫШз рекомендуют картофельные среды, но получаемая концентрация бацилл в бактериальной массе не превышает 1—3 млрд/мл и недостаточна для изготовления пробиотиков.
Проведены эксперименты по глубинному культивированию Вас. зиЫШэ
на:
1) элективной питательной среде (среда для выращивания Вас. эиЫШз), содержащей фосфатнокислый калий - 0,1%, азотнокислый натрий — 1%, глюкозу - 1%, хлорид натрия - 0,01%, сернокислый магний - 0,1%, сернокислое железо - 0,1 % и дистиллированную вод}' - до 100%;
2) картофельной питательной среде, содержащей пептон - 0,25%, картофельный крахмал - 0,25%, глюкозу - 0,125%, хлорид натрия - 0,01% и дистиллированную воду-до 100%.
При культивировании на элективной питательной среде (вариант I) рост бактерий был слабым, наблюдали ее незначительное помутнение, а на картофельной питательной среде (вариант II) отмечали обильный рост, ее помутнение и выпадение осадка, что определило направление дальнейших исследований с целью модификации этой среды для получения качественной бактериальной массы с высоким содержанием споровых форм бактерий.
Определено, что эффективной питательной средой для выращивания Вас. виЫШБ (вариант VI) является состоящая из 0,25% пептона, 0,25% картофельного крахмала, 0,125% глюкозы, 0,01% хлорида натрия и 10% бентонита.
Таким образом, морфологические, культуральные, ферментативные свойства, противомикробная активность отобранных для производства пробиотиков штаммов Вас. виЫШБ В8 ТС 09, ВБ ТС Д 24 и ВБ ТС Д 26 при культивировании на модифицированной нами среде в сравнении с исходными штаммами не изменялись, что определило использование этой среды при производстве пробиотиков.
4.3. Сушка бактериальной массы модифицированным контактно-сорбционным методом
Нами модифицирован контактно-сорбционный метод обезвоживания бактериальной массы штаммов Вас. виЫШБ В8 ТС 09, В8 ТС Д 24 и ВБ ТС Д 26 и бентанито-пектиновую смесь (бентонит месторождения «Каратаг» - Республика Таджикистан, Шахринавский р-н). Минеральный и растительный адсорбенты стимулировали рост микроорганизмов, которые продолжали культивировать
24 ч при температуре (3 7+0,5 )°С. Затем производственную серию биомассы сушили при (50+0,5)°С в течение 48 ч. .
4.4. Субтилбен в форме порошка
4.4.1. Состав и технология производства
Основные технологические стадии производства Субтилбена на основе штаммов Вас. зиЫШэ В8 ТЗ 09, ВБ Т; Д 24 и ВЭ и Д 26 в форме порошка представлены на рисунке 1.
1. Получение первичных культур производственных штаммов (ПШ)
С полужидкого агара культуры производственных штаммов Вас. БиЫШБ
В 8 и 09, В 8 Т1 Д 24 и В 8 и Д 26 засевают в пробирку с модифицированным картофельным питательным бульоном и выращивают в течение 24 ч при температуре (37+0,5)°С.
2. Получение матричных культур производственных штаммов
Первичные культуры проверяют на чистоту, засевают в колбы Эрленмей-
ера (объемом 1,5 л), наполненные модифицированным картофельным питательным бульоном не более 2/3 объема, и инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 24 ч.
3. Изготовление бактериальной массы (БМ) методом глубинного культивирования (I стадия)
Чистые культуры производственных штаммов (ВБ "П 09, В8 "П Д 24 и В8 -Л Д 26) 24-часового роста в количестве 10% объема (1 л) засеваемого модифицированного картофельного питательного бульона (рН 7,4 - 7,6) инокулируют в 10-литровые бутыли и выращивают при температуре (37±0,5)°С в течение 48 ч.
4. Приготовление бентонито-пектиновой смеси (БПС)
Пектин перемешивают с бентонитом в соотношении 37:60 до получения однородной смеси.
5. Приготовление гомогената бентонито-пектиновой смеси и бактериальной массы производственных штаммов Вас.
Бентонито-пектиновую смесь добавляют в бактериальную массу производственных штаммов Вас. БиЫШэ В8 Т1 09, В8 П Д 24 и ВБ и Д 26 и перемешивают.
6. II стадия культивирования бактериальной массы
В течение 24 ч при температуре (37+0,5)°С минеральные и растительные адсорбенты стимулируют рост микроорганизмов.
7. Сушка производственной серии биомассы
Контактно-сорбционным методом обезвоживания биомассу в течение 48 ч сушат при температуре (50+0,5)°С.
8. Измельчение высушенной производственной серии биомассы
Производственную серию биомассы после сушки измельчают в шаровых
мельницах, порошок просеивают через сито.
9. Выдержка на складе временного хранения (СВХ) до получения заключения контролера ОТК.
• Получение первичных культур ПШ •Контроль морфологических, культуральных и биохимических свойств, отсутствия
контаминации
•Получение матричных культур ПШ
•Изготовление БМ методом глубинного культивирования (I стадия) •Контроль морфологических, культуральных и биохимических свойств, отсутствия
контаминации
•Приготовление БПС
•Приготовление гомогената БПС и БМ производственных штаммов Вас. виЫПй •Контроль морфологических, культуральных и биохимических свойств, отсутствия __контаминации
•II стадия культивирования БМ
•Сушка производственной серии БМ •Контроль морфологических, культуральных и биохимических свойств, отсутствия
контаминации
•Измельчение высушенной производственной серии БМ
•Выдержка на СВХ
•Контроль морфологических, культуральных и биохимических свойств, отсутствия _ __контаминации, токсичности
10
11
•Этикетировка и укладка в индивидуальную упаковку
•Укладка в групповую упаковку и этикетировка
12
•Хранение на складе готовой продукции
Рис. 1. Технологические стадии производства Субтилбена в форме порошка на основе штаммов Вас. хиЬНКв.
10. Этикетировка и укладка в индивидуальную упаковку.
И. Укладка в групповую упаковку и этикетировка.
12. Хранение на складе готовой продукции.
4.4.2. Антимикробная активность
Установлена высокая бактериостатическая и бактерицидная активность Субтилбена в форме порошка на основе штаммов Вас. subtihs в отношении исследованных тест-микробов. МБсК пробиотика для Е. coli и P. multocida составляла 0,3, S. dublin, Pr. vulgaris и St. aureus - 0,6 мг/мл. Гибель (МБцК) тест-культур изученный пробиотический препарат вызывал в концентрациях, превышающих бактериостатические в два раза.
Таким образом, выделение Вас. subtilis БАВ обусловливает высокую антагонистическую активность Субтилбена в форме порошка на основе штаммов Вас. subtilis в отношении музейных штаммов и изолятов Е. coli, S. dublin, п. vulgaris, P. multocida и St. aureus.
4.4.3. Токсикологические свойства
В соответствии с требованиями ГОСТа Р 52337-2005 Субтилбен в форме порошка относится к нетоксичным препаратам микробиологического синтеза, под действием которых за установленное время остаются активными свыше 80% стилохоний. Через 3 ч воздействия исследовавшимся препаратом активность стилохоний опытного ряда составила 89%, а в контроле - 90%.
Безвредность Субтилбена в форме порошка также изучали на белых мышах (массой 18 -20 г; 3 группы, п=10), кроликах породы шиншилла (массой 2,5 - 2 7 кг- 3 группы, п=5) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 - 33 кг; 3 группы, п=5), которым препарат в дозе 0,3 г/кг массы тела вводили с водой перорально в объемах соответственно 0,5; 10 и 30 мл 2 раза в сут в течение 7 дней.
В течение 14 сут наблюдения не было ни одного случая падежа животных что свидетельствует о безвредности Субтилбена в форме порошка.
' Острую токсичность пробиотика изучали в опытах на белых мышах (массой 18 - 20 г п=10) и новорожденных телятах черно-пестрой породы (массой 31 - 33 кг, п=5), из которых по принципу парных аналогов сформировали по 6
ГРУППБелым мышам Субтилбен в форме порошка в виде суспензии на физиологическом растворе вводили однократно перорально в объеме 0 5 мл в дозах 1,0 (1-я группа), 1,5 (2-я), 2,0 (3-я), 2,5 (4-я), 3,0 г/кг массы тела (5-я); телятам - в объеме 30 мл в тех .же дозах. Контрольным животным в соответствующих объемах вводили физиологический раствор.
За лабораторными животными и телятами наблюдали в течение 14 дней, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движении.
Гибели опытных животных не наблюдали, клиническое состояние опытных и контрольных животных не отличалось.
Следовательно, Субтилбен в форме порошка на основе штаммов ВБ 17 09, ВБ и Д 24 и ВБ и Д 26 относится к нетоксичным веществам.
В опытах по скармливанию Субтилбена в форме порошка в течение 20 сут трем группам (п=10) белых мышей (массой 18 - 20 г) и трем группам (п=10) кроликов породы шиншилла (массой 2,5 - 2,7 кг) в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела изучали хроническую токсичность. Животные контрольных групп (п-10) пробиотик не получали. За лабораторными животными наблюдали в течение 30 дней.
Установлено, что при длительном введении Субтилбена в форме порошка в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных животных не отличается от контрольных.
Применение Субтилбена порошка в дозах 0,6; 1,5 и 3,0 г/кг массы тела не влияет на динамику массы тела, которую определяли на 5, 10, 15 и 20 сут: у опытных и контрольных животных (величины статистически не отличались) Пробиотик не вызывал повышения температуры тела и не влиял на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.
Влияние Субтилбена в форме порошка на кожу изучали методом однократной аппликации 10% суспензии на белых мышах (массой 18 - 20 г, п=6).
Повторное местное раздражающее действие пробиотика исследовали на белых мышах (самках, массой 18 - 20 г, п=6) и кроликах (самках, массой 2,5 -2,7 кг, п-6), которым ежедневно на выстриженный участок кожи в межлопаточной области наносили соответственно по 1 и 2 капли 10% суспензии Субтилбена в форме порошка в течение соответственно 14 и 21 дня. Животным контрольных групп (п-6) по той же методике наносили подсолнечное масло. Наблюдение за белыми мышами вели в течение 30, кроликами - 60 дней.
При изучении раздражающих свойств Субтилбена в форме порошка методом аппликации на кожу установлено, что кожа кроликов на месте нанесения порошков оставалась гладкой, эластичной, неуголщенной, безболезненной и без признаков гиперемии.
На кроликах (самках, массой 2,5 - 2,7 кг), которых разделили на две группы (п=6) изучали действие Субтилбена в форме порошка на слизистую оболочку глаза, которое при однократном и повторном введении выражено слабо.
4.4.4. Стандартизация и стабильность
Нами разработаны качественные и количественные методы исследований предусмотренные ОСТ 91500.05.001.00 в требованиях к качеству порошков, для стандартизации и контроля качества, изучения стабильности при хранении Субтилбена в форме порошка на основе штаммов Вас. виЫШз.
Результаты проверки качества трех экспериментальных серий показали хорошую воспроизводимость и точность разработанных качественных и количественных методов контроля.
Качество препарата характеризуется следующими физико-химическими и биологическими показателями:
1. Внешний вид и цвет - порошок серовато-белого цвета.
2. Наличие механических примесей, плесени - нет.
3. Концентрация водородных ионов (рН) 10% водной суспензии - 6,5 -7,0. •
4. Массовая доля влаги - не более 10%.
5. Стерильность - посторонняя микрофлора отсутствует.
6. Количество м.к. Вас. subtilis - 30 млрд/г.
7. Количество жизнеспособных клеток Вас. subtilis - 75 - 80%.
8. Контаминация бактериальной и грибной микрофлорой - отсутствует.
9. Контаминация микоплазмами - отсутствует.
10. Антагонистические свойства (МБцК в отношении Е. coli и Р. multocida, S. dublin, Pr. vulgaris и St. aureus) - 0,3 - 1,2 мг/мл.
11. Токсичность - нетоксичен.
На основании проведенных исследований предложены требования к качеству Субтилбена в форме порошка на основе штаммов Вас. subtilis BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26.
Изучение стабильности Субтилбена в форме порошка методом «ускоренного старения» при повышенных температурах (37 и 50°С; образцы экспериментальных серий помещали в термостат на сроки, соответствующие 0,5; 1; 2 и 3 годам естественного хранения) показало, что по физико-химическим и биологическим показателям качества пробиотик оставался стабильным в течение срока, соответствующего 2 годам естественного хранения.
4.5. Субтилбен в форме гранул и таблеток
4.5.1. Состав и технология производства
На основе адсорбированной на минеральных и растительных веществах и высушенной контактно-сорбционным методом бактериальной массы штаммов Вас. subtilis BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 в лаборатории микробиотехнологии ТАУ разработан пробиотик Субтилбен в форме гранул и таблеток, состав которого и количественное содержание компонентов приведены в таблице 2.
Таблица 2
Композиция пробиотического препарата Субтилбен, %
Компонент Кол-во
Порошок, содержащий бактериальную массу (30 млрд м.к./г) BS TJ 09 29,0
BS Т J Д 24 29,0
BS TJ Д 26 29,0
Крахмал _ 5,0
Сахарный сироп 3,0
Кальция стеарат 5,0
Основные технологические стадии изготовления Субтилбена в формах гранул и таблеток представлены на рисунках 2 и 3.
• Подготовка оборудования, помещения, инвентаря, спецодежды
' Растаривание сырья
• Отвешивание сырья
Контроль отсутствия контаминации
' Загрузка сырья в смеситель
Влажное гранулирование
• Сушка гранулята
• Контроль физико-химических свойств, отсутствия контаминации
10
11
12
Сухое гранулирование
• Выдержка на СВХ
Контроль физико-химических и биологических свойств
• Этикетировка и укладка в индивидуальную упаковку
• Укладка в групповую упаковку и этикетировка
• Хранение на складе готовой продукции
Рис. 2. Технологические стадии изготовления Субтилбена в форме гранул.
Подготовка оборудования, помещения, инвентаря, спецодежды
• Растаривание сырья
• Отвешивание сырья
Контроль отсутствия контаминации
1 Загрузка сырья в смеситель
• Влажное гранулирование
• Сушка гранулята
Контроль физико-химических свойств, отсутствия контаминации
! • Сухое гранулирование
Опудривание
Таблетирование
10
• Выдержка на СВХ
Контроль физико-химических и биологических свойств
• Этикетировка и укладка в индивидуальную упаковку
11 I
\/ 12
■ Укладка в групповую упаковку и этикетировка
_ ч___
!* • Хранение на складе готовой продукции
Рис. 3. Технологические стадии изготовления Субтилбена в форме таблеток.
Полученные результаты вошли в инструкцию по изготовлению и методы контроля, технические условия препарата Субтилбен в форме гранул и таблеток (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).
4.5.2. Стандартизация и стабильность
Воспроизводимость и точность разработанных качественных и количественных методов контроля препарата подтверждены результатами исследования 5 экспериментальных серий Субтилбена в форме таблеток и обеспечивают в соответствии с требованиями ФС 42-3476-98 и ГФ оптимальный уровень качества стандартизируемого объекта в процессе его производства, хранения и применения.
В результате пяти опытов установлено, что таблетки имеют круглую форму, серовато-белого цвета мраморного характера, диаметром 16 мм, массой 2,0±0,1 г. Время распадаемости таблеток в среднем составляло 15,2 мин. Массовая доля влаги колебалась от 3,0 до 4,5% и pH 10%-ной водной суспензии составлял 7,0. В 1 г препарата содержалось 24 млрд м.к., количество жизнеспособных клеток колебалось от 75±0,5 до 85±0,5%. Препарат был безвреден для животных, не контаминирован посторонней микрофлорой. Бактерицидная активность в отношении моно- и ассоциированных патогенов возбудителей (Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris) инфекционного энтерита телят составила 15,6 - 31,2 млн М.К./МЛ.
Предложенные на основании проведенных исследований требования к качеству пробиотика Субтилбен в формах гранул и таблеток вошли в инструкцию по изготовлению и контролю, ТУ на препарат (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.).
При хранении физико-химические и биологические свойства препарата оставались стабильными в течение 36 мес.: при определении количественных показателей достоверных расхождений в полученных результатах не отмечали (Р<0,05).
Срок хранения Субтилбена в форме гранул и таблеток по списку Б, в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от света и атмосферных осадков месте, при температуре не выше 30°С по результатам проведенных исследований установлен в течение 3 лет.
4.6. Лаксубтил в форме суспензии
4.6.1. Композиция и технология изготовления
В лаборатории микробиотехнологии ТАУ разработан пробиотик Лаксубтил в форме суспензии на основе штаммов Вас. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26. Состав препарата и количественное содержание компонентов представлены в таблице 3.
Состав пробиотика Лаксубтил, %
Компонент Кол-во
Бактериальная масса (30 млрд м.к./г) В8 ТЛ 09 0,0005
В8 ТЛ Д 26 0,0005
Сахароза 5,0
Коровье молоко 94,999
Смывы суточных агаровых культур штаммов Вас. зиЫШв ВЯ ТС 09 и ВБ ТС Д 26 при пероральном кроликам, телятам (9 млрд м.к./кг массы тела) и парентеральном (100 млн м.к./кг массы тела) белым мышам введении в объемах соответственно 0,6; 10,5 и 0,3 мл не обусловливали физиологические отклонения у опытных животных в сравнении с контрольными, что свидетельствует об отсутствии патогенное™ у испытанных штаммов.
МБсК штаммов Вас. БиЫШБ ВЭ ТС 09 и ВБ ТС Д 26 в отношении Е. соН 7,8 млн м.к./мл; МБцК - 15,6 млн м.к./мл.
Штаммы ВБ ТС 09 и ВБ ТС Д 26 характеризуются типичными для Вас. киЬиПз физиолого-биологическими свойствами, которые могут обусловить более широкий диапазон их действия при сочетанном применении. Эти штаммы характеризуются отсутствием гемолитической активности, у них не обнаружены ферменты, обуславливающие патогенные свойства (лецитиназа, гиалурони-даза), обладают важными технологическими свойствами - растут в присутствии 7%-ной ИаС1, не нуждаются в аминокислотах и витаминах, не проявляют взаимного антагонизма при совместном культивировании. Кроме того, по сравнению с другими испытанными отобранные нами штаммы В 8 ТС 09 и В Б ТС Д 26 при сквашивании молока образовывали однородную суспензию.
Таким образом, морфологические, культуральные, ферментативные свойства, отсутствие патогенности, высокая противомикробная активность и физио-лого-биологические свойства штаммов Вас. бцЫШб ВБ ТС 09 и ВБ ТС Д 26 послужили основанием для использования их при изготовлении пробиотика Лаксубтил.
Основные технологические стадии изготовления Лаксубтила в форме суспензии представлены на рисунке 4.
4.6.2. Стандартизация и стабильность
Результаты проверки качества трех экспериментальных серий, показали хорошую воспроизводимость и точность разработанных качественных и количественных методов контроля Лаксубтила, характеризующегося следующими физико-химическими и биологическими показателями:
1. Внешний вид и цвет - суспензия серовато-белого цвета.
2. Наличие механических примесей, плесени - нет.
3. Концентрация водородных ионов (рН) - 4,5 — 5,0.
4. Количество микробных клеток Вас. БиЫШэ - 500 млн/мл.
5. Количество жизнеспособных клеток Вас. зиЫШэ - 85 - 90%.
к
Подготовка оборудования, помещения, инвентаря, спецодежды
Растаривание сырья
• Отвешивание сырья
1 Контроль отсутствия контаминации
Пастеризация и охлаждение молока до 40°С
Культивирование БМ производстенных штаммов на молоке
• Контроль отсутствия контаминации
Приготовление суспензии
• Инкубация БМ при температуре 25 - 37°С в течение 24 ч
Контроль физико-химических свойств, отсутствия контаминации
Розлив суспензии во флаконы и пипетки
Укупорка флаконов
10
• Выдержка на СВХ Контроль физико-химических и биологических свойств
11
Этикетировка и укладка в индивидуальную упаковку
12
Укладка в групповую упаковку и этикетирозка
13
Хранение на складе готовой продукции
Рис. 4. Технологические стадии изготовления Лаксубтила.
6. Контаминация бактериальной и грибковой микрофлорой - отсутствует.
7. Контаминация микоплазмами - отсутствует.
8. Антагонистические свойства (МБцК в отношении Е. coli) - 15,6-31,2 млн м.к./мл.
9. Токсичность - безвреден.
Требования к качеству Лаксубтила, предложенью на основании результатов проведенных исследований, вошли в инструкцию по изготовлению и контролю, технические условия на препарат (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г.)..
Изучение стабильности Лаксубтила при естественном хранении (+18 -+20°С) и в условиях холодильника (+2 - +8°С) выявило, что в первом случае физико-химические и биологические свойства пробиотика оставались стабильными 2 сут, во втором - 10 дней, в течение которых препарат хранят по списку Б.
5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ВАС. SUBT1LIS
5.1. Антагонистические свойства 5.1.1. Субтилбен
Методом двукратных серийных разведений в жидкой (МПБ) и плотной (МПА) средах на ассоциациях Е. coli и S. dublin, выделенных от больных инфекционными энтеритами телят в животноводческих хозяйствах РТ, изучили антагонистические свойства Субтилбена. При МБсК в мазках тест-культур, окрашенных по Граму, наблюдали задержку роста, МБцК через 24 - 72 ч инкубации - только грамположительные палочки Вас. subtilis.
Установлена высокая бакггериостатическая и бактерицидная активность Субтилбена в отношении исследованных тест-культур (табл. 4), задержка роста которых происходила при концентрации препарата 7,8 - 15,6, а гибель - 15,6 -31,2 млн м.к./мл. Соответствующие показатели для известного препарата Био-спорин составили 62,5 - 125 и 125 - 250 млн м.кУмл.
Таблица 4
Антагонистические свойства пробиотика Субтилбен в отношении ассоциации Е. coli и S. dublin, млн м.к./мл
Опыт
1 2 3
Субтилбен МБсК 7,8 7,8 15,6
МБцК 15,6 15,6 31,2
Биоспорин МБсК 62,5 125 125
МБцК 125 250 250
В отношении односуточной бульонной культуры S. dublin (концентрация - 1 млрд м.к./мл) методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде изучили динамику антагонистической активности Субтилбена, которую оценивали через 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36 и 48 ч.
Изменение морфологии S. dublin начиналось спустя 6 ч после контакта с препаратом: клетки тест-культуры увеличивались в размере и принимали различную форму. Количество клеток S. dublin через 12 - 18 ч начинало уменьшаться, лизис тест-культур заканчивался через 48 ч после контакта с Субтилбе-ном.
В контрольных пробирках изменение морфологии тест-культуры не наблюдали, что свидетельствует о связи бактерицидной активности изученного препарата с выделением Вас. subtilis биологически активных веществ.
Таким образом, Субтилбен обладает высоким антибактериальным действием и при контакте с препаратом полный лизис патогена (S. dublin) происходит спустя 48 ч.
5.1.2. Лаксубтил
Лаксубтил обладает высокой антагонистической активностью в отношении Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris как в отдельности, так и в различных ассоциациях. Минимальное количество пробиотика, которое приводило к гибели бактерий, составило 15,6-31,2 млн м.к./мл. Противомикробное действие Лаксуб-тила было равнозначно таковому у препарата сравнения Субтилбен.
Методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде в отношении односуточной бульонной культуры наиболее часто выделявшихся серотипов Е. coli (концентрация - 500 млн м.к./мл) изучали динамику антагонистической активности Лаксубтила, оценивая ее через 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36 и 48 ч.
Через 6 ч после контакта с препаратом начиналось изменение морфологии Е. coli, выражавшееся в увеличении размеров и изменении формы клеток, количество которых начинало уменьшаться через 6 - 12 ч, а через 48 ч после контакта с Лаксубтилом лизис тест-бактерий заканчивался (рис. 5).
Рис. 5. Динамика лизиса Е. coli после контакта с Лаксубтилом, %.
Таким образом, бактерицидная активность Лаксубтила в отношении Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris как в отдельности, так и в различных ассоциациях, выделенных от больных инфекционными энтеритами телят, проявлялась в концентрациях 15,6 и 31,2 млн м.к./мл и была обусловлена выделением В. subtilis биологически активных веществ, о чем свидетельствует отсутствие изменения морфологии тест-культуры в контрольных пробирках (минеральные и растительные вещества, входящие в состав Лаксубтила).
5.2. Токсикологические свойства Субтилбена и Лаксубтила
5.2.1. Безвредность
При изучении безвредности пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток, Лаксубтил в форме суспензии установлено, что через 3 ч воздействия препаратами активность стилохоний опытного ряда составила 89% (в контроле - 90%). Следовательно, пробиотики Субтилбен и Лаксубтил относятся к безвредным средствам микробиологического синтеза, под действием которых за установленное время остаются активными свыше 80% стилохоний.
5.2.2. Острая токсичность
В соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» острую токсичность пробиотиков Лаксубтил и Субтилбен изучали на лабораторных животных, за которыми, содержавшимися в обычных условиях, перед началом исследований наблюдали в течение 14 дней. Последний раз корм давали накануне опыта вечером, прием воды не ограничивали.
Из 40 белых мышей (массой 18-21 г) по принципу парных аналогов сформировали по 5 групп (п=8): 4 опытные и 1 контрольная. Лабораторным животным опытных групп препараты вводили перорально однократно в дозах:
- гранулы и таблетки Субтилбен в форме суспензии в объеме 0,5 мл: 0,05 г (1-я группа), 0,1 г (2-я), 0,15 г (3-я) и 0,2 г (4-я группа) - в пересчете на 1 кг массы тела соответственно 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 г;
- суспензия Лаксубтил: 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я), 0,3 мл (3-я) и 0,5 мл (4-я группа) - в пересчете на 1 кг массы тела соответственно 5,0; 10,0; 15,0 и 25,0 мл.
Контрольным животным (5-я группа) в таком же объеме вводили физиологический раствор.
Кратковременное снижение двигательной активности опытных белых мышей отмечали в первые 3 - 4 ч наблюдений, клиническое состояние которых в дальнейшем не отличалось от такового у контрольных животных. Ни одного случая гибели опытных белых мышей за все время исследования не было.
Таким образом, в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 пробиотики Субтилбен и Лаксубтил при энтеральном введении в максимальной дозе (соответственно 10000 мг/кг и 25000 мкл/кг массы тела) не вызывают гибели экспериментальных животных, поэтому относятся к VI классу токсичности (нетоксичным веществам).
5.2.3. Хроническая токсичность
Хроническую токсичность гранул и таблеток Субтилбен, суспензии Лак-субтил изучали в опытах по вскармливанию препаратов 1 раз в день в течение 30 сут трем группам (п=10) кроликов породы шиншилла (массой 2,5 - 2,7 кг) в 1-, 2- и 3-кратной ориентировочно-терапевтической дозе (Субтилбен - 0,3 г/кг, Лаксубтил - 5,0 мл/кг массы тела). Животные контрольной группы (п=10) препараты не получали. За лабораторными животными наблюдали во время всего опыта, по окончании которого их усыпляли и проводили патологоанатомиче-ское вскрытие.
Установлено, что длительное введение Субтилбена и Лаксубтила в дозах соответственно 0,3; 0,6 и 0,9 г/кг; 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела не влияет на поведение, аппетит, прием воды, состояние слизистых оболочек и шерстного покрова опытных кроликов, у которых не наблюдали повышения температуры тела, характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость лабораторных животных не изменялись.
При патологоанатомическом исследовании у опытных кроликов не отмечали нарушений в размере и структуре паренхиматозных органов (сердце, печень и селезенка), бывших однородного цвета, без кровоизлияний и дистрофических изменений.
Следовательно, пробиотики Субтилбен и Лаксубтил не обладают хронической токсичностью при оральном введении лабораторным животным.
5.2.4. Раздражающее и аллергенное свойства
Раздражающее действие гранул и таблеток Субтилбен, суспензии Лаксубтил изучали на 6 кроликах породы шиншилла (массой 2,5 - 2,7 кг), которым ежедневно делали аппликации на выстриженных участках кожи нативного препарата в дозе 0,1 см3 в течение 26 сут, учитывая реакцию кожи (гиперемия, болезненность, утолщение кожной складки, расчесы) и клиническое состояние организма лабораторных животных.
Раздражающее действие гранул и таблеток Субтилбен, суспензии Лаксубтил на слизистую оболочку глаза определяли на 2 группах (п=6) самок кроликов породы шиншилла (массой 2,5 - 2,7 кг), первым (опытная группа) из которых в конъюнктивальный мешок однократно закапывали 10%-ную суспензию разных лекарственных форм пробиотиков в объеме 0,1 см3, вторым (контроль) - инсталлировали воду в том же объеме. Влияние препаратов оценивали по проявлению гиперемии, инъекции сосудов склеры, слезотечению.
При изучении кожно-резорбтивного и местного действия на кожу мышей (массой 18-21 г) в опытной группе (п=6) делали однократную ^аппликацию 10%-ной суспензии гранул и таблеток Субтилбен и Лаксубтила, в контрольной группе (п=6) - подсолнечного масла.
Определение повторного местного раздражающего действия препаратов проводили на мышах (самках, массой 18-21 г), которым ежедневно на выстриженный участок кожи в межлопаточной области в течение 14 дней наносили по 1 капле 10%-ной суспензии гранул и таблеток Субтилбен и Лаксубтила (опытная группа, п=6), животным контрольной группы (п=6) - по 1 капле под-
солнечного масла. Наблюдение за животными опытных и контрольных групп вели в течение 30 дней.
Повторное местное действие изучали также на кроликах (самках, массой 2,5 - 2,7 кг), которьм ежедневно на кожу в течение 21 дня наносили по 2 капли 10%-ной суспензии гранул и таблеток Субтилбен и Лаксубтила (опытная группа, п=6), контрольным животным (п=6) - по 2 капли подсолнечного масла. За опытными и контрольными кроликами наблюдали в течение 60 дней.
Действие Субтилбена и Лаксубтила на слизистую оболочку глаза определяли на кроликах (самках, массой 2,5 - 2,7 кг), которых разделили на две группы (п=6): опытным животным в конъюнктивальный мешок однократно в количестве 1 капли закапывали 10%-ную суспензию гранул и таблеток Субтилбен и Лаксубтила, контрольным - воду.
При исследовании раздражающего свойства пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток, Лаксубтил в форме суспензии методами аппликации на кожу и инсталляции на слизистую оболочку глаз установлено, что кожа лабораторных животных на месте нанесения препаратов оставалась гладкой, эластичной, неутолщенной, безболезненной и без признаков гиперемии, не наблюдали покраснения слизистой (оболочки) глаз, инъекции сосудов склеры, слезотечения. Отрицательная реакция кожи, слизистой оболочки и организма белых мышей и кроликов на нанесение разрешающей дозы Субтилбена и Лаксубтила свидетельствует об отсутствии сенсибилизации организма.
5.2.5. Влияние Субтилбена и Лаксубтила на качество мяса
Ветеринарно-санитарная экспертиза и бактериологические исследования свидетельствуют о доброкачественности мяса, полученного после убоя кроликов, обработанных гранулами и таблетками Субтилбен, суспензией Лаксубтил.
Мясо кроликов после 5-кратной дачи препаратов в дозах соответственно 0,3 г/кг и 5 мл/кг массы тела 1 раз в сут не отличалось по качеству от мяса контрольных (интактных) животных, на разрезе мышечная ткань красноватого цвета, поверхность разреза влажная, эластичная, плотная; бульон прозрачный без посторонних запахов.
При бактериологическом исследовании проб мяса и внутренних органов не обнаружено их обсемененности микроорганизмами из групп токсикоинфек-ций. Мазки-отпечатки из проб мяса опытных и контрольных животных окрашивались плохо.
В препаратах из поверхностных слоев обнаруживались отдельные колонии (по 1 - 3 в поле зрения микроскопа) кокковой микрофлоры. Микрофлора не выделялась в препаратах из глубоких слоев мышц.
5.3. Доклинические исследования
Переносимость гранул и таблеток Субтилбен, суспензии Лаксубтил исследовали общепринятыми методами. По принципу аналогов для каждого препарата сформированы 4 группы (п=11; опытные - 1 - 3-я, контрольная - 4-я) новорожденных телят черно-пестрой породы массой 31 - 33 кг. В опытных группах Субтилбен и Лаксубтил применяли соответственно из расчета 0,3; 0,6 и
0,9 мг/кг; 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела (условно-терапевтическая, двух- и трехкратная дозы от условно-терапевтической) в течение 20 сут.
За телятами наблюдали во время опыта и в течение 14 дней после него, учитывая общее состояние, внешний вид, поведенческие реакции, прием пищи и воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений.
Перед проведением опыта, а также в 1-ый, на 3-ий, 5-ый, 10-ый, 15-ый и 20-ый день применения Субтилбена и Лаксубтила проводили биохимические исследования крови.
В течение всего экспериментального периода ни одна из применяемых доз Субтилбена и Лаксубтила не оказала отрицательного действия на организм телят, которые были активны и не отставали в развитии и приросте живой массы от контрольных животных.
Ни в опытных, ни в контрольной группах гибели животных не наблюдали. Среднесуточный прирост телят в опытных группах превышал контрольные показатели на 2,9% (Субтилбен - 1-я группа) и 2,5% (Лаксубтил — 1-я группа), 4,1% (Субтилбен - 2-й 3-я группы) и 3,6% (Лаксубтил - 2-й 3-я группы), что свидетельствует о безвредности испытанных пробиотиков, применение которых не оказывает отрицательного влияния на организм телят.
Использование Субтилбена и Лаксубтила в применяемых дозах не вызывало повышения температуры тела и не влияло на характер локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.
Проведенные нами исследования показали, что пробиотики Субтилбен и Лаксубтил позитивно влияют на количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и уровень гематокрита.
Гематологические показатели крови телят как опытных, так и контрольной групп находились в пределах нормы. Повышение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, уровня гематокрита в крови телят опытных групп в пределах верхних границ физиологической нормы свидетельствует, что изученные пробиотики стимулируют эритропоэз и лейкопоэз, не изменяя стабильности кроветворения и постоянства в составе и общем количестве периферической крови.
Пробиотики Субтилбен и Лаксубтил не оказывают существенного влияния на биохимические показатели крови телят. При воздействии препарата на организм животных все изучавшиеся показатели не претерпевали значительных изменений и существенно не отличались от контрольных, что свидетельствует об отсутствии у Субтилбена и Лаксубтила токсического действия на организм животных.
6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ СУБТИЛБЕНА И ЛАКСУБТИЛА ПРИ ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЭНТЕРИТОВ ТЕЛЯТ
6.1. Профилактическая эффективность
В экспериментальных условиях профилактическая эффективность про-биотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии исследована в сравнении с препаратом-аналогом (Биоспорин) на 2 молочнотоварных фермах, стационарно неблагополучных по инфекционным энтеритам телят.
Субтилбен в дозах 0,2 (1-я группа, п=20), 0,3 (2-я группа, п=20), 0,4 (3-я группа, п=20), 0,5 г/кг массы тела (4-я группа, п=20) и Лаксубтил 3,0 (1-я группа, п=20), 5,0 (2-я группа, п=20), 10,0 (3-я группа, п=20), 15,0 г/кг массы тела (4-я группа, п=20) в течение 10 дней 1 раз в сут телятам выпаивали с молозивом (молоком); Биоспорин (5-я группа, п=20) использовали в соответствии с наставлением по применению.
В течение месяца за животными вели клиническое наблюдение, учитывая общее состояние, прирост массы тела, заболеваемость и сохранность.
Результаты клинических наблюдений свидетельствуют о высокой профилактической эффективности Субтилбена в форме гранул (табл. 5) и таблеток (табл. 6), Лаксубтила в форме суспензии (табл. 7), выразившейся в предотвращении инфекционных энтеритов телят в оптимальных терапевтических дозах (0,3 г/кг и 5,0 мл/кг массы тела), сохранности и хорошем общем состоянии соответственно 100, 95 и 100% телят, увеличении пророста массы тела. Биоспорин предотвращал заболеваемость телят инфекционными энтеритами в 70 -80% случаев.
Таблица 5
Результаты изучения в эксперименте профилактической эффективности Субтилбена в форме гранул
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 2 | 3 | 4
Доза, г/кг массы тела
0,2 03 0,4 0,5
Кол-во телят, гол. 20 20 20 20 20
Заболело, гол. 3 -- _ 5
Пало, гол. 3 _ - 5
Среднесуточный прирост, г 130 142 146 150 120
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,26 0,39 0,52 0,65 0,80
Затраты на профилактику, сомони 52 78 104 130 160
Профилактическая эффективность, % 85 100 100 100 75
Результаты экспериментального изучения профилактической эффективности Субтилбена в форме таблеток
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 1 2 I 3 | 4
Доза, г/кг массы тела
0,2 0,3 0,4 0,5
Кол-во телят, гол. 20 20 20 20 20
Заболело, гол. 3 1 1 1 4
Пало. гол. 1 - - - 2
Среднесуточный прирост, г 125 130 130 135 120
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,28 0,42 0,56 0,70 0,80
Затраты на профилактику, сомони 56 84 112 140 160
Профилактическая эффективность, % 85 95 95 95 80
Таблица 7
Результаты изучения в эксперименте профилактической эффективности Лаксубтила в форме суспензии
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 I 2 | 3 1 4
Доза, г/кг массы тела
3,0 5,0 10,0 15,0
Кол-во телят, гол. 20 20 20 20 20
Заболело, гол. 2 - - - 6
Пало, гол. 1 - - - 3
С рс л^у^уто чн ы ипр прост, г 135 150 150 160 125
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,16 0,24 0,32 0,40 0,80
Затраты на профилактику, сомони 32 48 64 80 160
Профилактическая эффективность, % 90 100 100 100 70
Прирост живой массы животных в опытных группах при применении Субтилбена в формах гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии был соответственно на 7,7 - 20%; 4,0 - 11,1 и 7,5 - 17,7% выше, чем в контрольной (соответственно по 120 и 125 г).
Таким образом, профилактическая эффективность пробиотиков Суб-тилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии превышает соответствующий показатель у препарата-аналога (Биоспорин) на 5 - 30%.
При производственном испытании Субтилбена в форме гранул и таблеток и Лаксубтила в форме суспензии на 175 телятах в 5 хозяйствах РРП и Согдийской области в 2009 - 2011 гг. профилактическая эффективность препаратов соответственно составила 95,0; 91,4 и 97,0% (табл. 8 - 10).
Профилактическая эффективность Субтилбена в форме гранул в производственных условиях
Показатель Группа животных
опытная контроль (Биоспорин)
Количество телят, гол. 40 40
Заболело, гол. 2 (5,0) 5 (12,5)
Пало, гол. 0 2 (5,0)
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,39 0,80
Затраты на профилактику, сомони 156,0 320,0
Профилактическая эффективность, % 95,0 87,5
Примечание. В скобках указано процентное значение.
Таблица 9
Производственные испытания профилактической эффективности Субтилбена в форме таблеток
Показатель Группа животных
опытная контроль (Биоспорин)
Количество телят, гол. 35 35
Заболело, гол. 3 (8,6) 8 (22,9)
Пало, гол. 0 3 (8,6)
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,42 0,80
Затраты на профилактику, сомони 147,0 280,0
Профилактическая эффективность, % 91,4 77,1
Примечание. В скобках указано процентное значение.
Таблица 10
Профилактическая эффективность Лаксубтила в форме суспензии в производственных условиях
Показатель Группа животных
опытная контроль (Биоспорин)
Количество телят, гол. 100 86
Заболело, гол. 3 (3,0) 10(11,6)
Пало. гол. 0 1 (1,2)
Стоимость 1 дозы препарата, сомони 0,24 0,80
Затраты на профилактику, сомони 240,0 688,0
Профилактическая эффективность, % 97,0 88,4
Примечание. В скобках указано процентное значение.
Профилактические мероприятия, проводившиеся по схемам, принятым в хозяйствах с применением пробиотика Биоспорин, предотвращали инфекционные энтериты телят (161 гол.) в 77,1 - 88,4%.
Таким образом, профилактическая эффективность пробиотиков Суб-тилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии в производственных условиях выше соответствующих показателей применяемого в хозяйствах Таджикистана пробиотического препарата Биоспорин, что обусловливает введение разработанных нами пробиотиков в комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий.
6.2. Терапевтическая эффективность
Терапевтическую эффективность пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии экспериментально изучили (в сравнении с Биоспорином, который применяли в соответствии с наставлением по применению) на телятах в возрасте 1-6 сут с клиникой инфекционной диареи, у которых до применения препаратов отмечали угнетение общего состояния, анорексию, учащение пульса и увеличение интенсивности дыхания. На внешние раздражители животные реагировали слабо, были малоподвижными, больше лежали. В первые сутки заболевания наблюдали выделение жидких каловых масс с примесью хлопьев казеина, на 2 - 3 сут - профузный понос с примесью крови и пузырьков газа. При бактериологическом исследовании выделены moho- и ассоциированные патогенные возбудители - Е. coli, S. dublin и Рг. vulgaris.
За животными вели клиническое наблюдение, учитывая длительность болезни, выздоровление, сохранность поголовья.
Для определения оптимальных лечебных доз пробиотиков Субтилбен в форме гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии 4 группам (п=20) телят (для каждой лекарственной формы препаратов) с клиникой диареи внутрь с молоком вводили Субтилбен в дозах 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 г/кг массы тела и Лаксубтил - 3,0; 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела 2 раза в сут до выздоровления.
Экспериментально установлено, что лечебная эффективность пробиотика Субтилбен в форме гранул (табл. 11) и таблеток (табл. 12) в дозе 0,2 г/кг массы тела составляет соответственно 85,0 и 90,0%. Наиболее эффективным (100,0%) препарат был в дозах 0,3; 0,4 и 0,5 г/кг массы тела. Препарат сравнения Биоспорин был эффективен в 75,0 и 90,0% случаев.
Функции органов пищеварения при применении Субтилбена в форме гранул у телят 1-ой опытной группы нормализовались на 5,0 сут, 2 - 4-ой - на 4 день, контрольной - 6,2 сут. Субтилбен в форме таблеток нормализовал работу ЖКТ телят 1-ой группы через 5,5 днй> 2-ой - 4,2 сут, 3-ей и 4-ой - 4 дня. В кон-'-трольной группе соответствующий показатель составил 6,2 дня.
Более высокий лечебный эффект отмечен в группе телят, получавших Лаксубтил, применение которого способствовало улучшению общего состояния животных, повышению аппетита, нормализации температуры тела.
Результаты изучения в эксперименте терапевтической эффективности Субтилбена в форме гранул
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 | 2 | 3 | 4
Доза, г/кг массы тела
0,2 0,3 0,4 0,5
Кол-во больных телят, гол. 20 20 20 20 20
Выздоровело, гол. 17 20 20 20 15
Пало, гол. 3 - - - 5
Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол. 2 - - - 3
Продолжительность терапии, сут 5,0 4,0 4,0 4,0 6,2
Терапевтическая эффективность, % 85 100 100 100 75
Таблица 12
Результаты экспериментального изучения лечебной эффективности Субтилбена в форме таблеток
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 \ г \ ъ \ л
Доза, г/кг массы тела
0,2 0,3 0,4 0,5
Кол-во больных телят, гол. 20 20 20 20 20
Выздоровело, гол. 18 20 20 20 18
Пало, гол. 2 - - - 2
Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол. 1 — - - 3
Продолжительность терапии, сут 5,5 4,2 4,0 4,0 6,2
Терапевтическая эффективность, % 90 100 100 100 90
Терапевтическая эффективность Лаксубтила в дозе 3,0 мл/кг массы тела -95,0%, а в дозах 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела - 100%. В контроле (Биоспо-рин) соответствующий показатель - 85%. Продолжительность лечения Лаксуб-тилом в дозе 3,0 г/кг массы тела составила 6,0, в дозах 5,0; 10,0 и 15,0 мл/кг массы тела - 4,0, в контрольной группе (Биоспорин) - 6,2 дня (табл. 13).
Таким образом, результаты эксперимертального изучения терапевтической эффективности свидетельствуют о целесообразности применения пробио-тиков Субтилбен в форме гранул и таблеток в дозе 0,3 г/кг массы тела и Лак-субтил в форме суспензии в дозе 5,0 мл/кг массы тела в производственных условиях для лечения инфекционных энтеритов телят.
Таблица 13
Результаты изучения в эксперименте терапевтической эффективности Лаксубтила в форме суспензии
Показатель Группа животных Контроль (Биоспорин)
1 | 2 | 3 | 4
Доза, мл/кг массы тела
3,0 5,0 10,0 15,0
Кол-во больных телят, гол. 20 20 20 20 20
Выздоровело, гол. 19 20 20 20 17
Пало, гол. J_ — — — 3
Кол-во телят с повторными заболеваниями, гол. 2 - - - 3
Продолжительность терапии, сут 5,0 4,0 4,0 4,0 6,2
Терапевтическая эффективность, % 95 100 100 100 85
Производственную проверку пробиотиков Субтилбен в формах гранул и таблеток и Лаксубтил в форме суспензии провели в 11 хозяйствах РТ на соответственно 542, 527 и 240 больных диареей телятах, которым препараты выпаивали с молозивом (молоком) в дозах 0,3 г/кг массы тела (Субтилбен в форме гранул и таблеток) и 5,0 мл/кг массы тела (Лаксубтил в форме суспензии) 2 раза в сут до выздоровления.
За подопытными животными вели клиническое наблюдение: учитывали длительность болезни, выздоровление, сохранность поголовья.
Применение пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил способствовало улучшению общего состояния животных, повышению аппетита, нормализации температуры тела. Более высокий терапевтический эффект отмечен в группах телят, получавших разработанные нами пробиотики (Субтилбен в форме гранул -90,0 - 94,8%, Субтилбен в форме таблеток - 91,3 - 93,0%, Лаксубтил в форме суспензии — 90,9 - 92,9%). Биоспорин был эффективен в 80,0 - 83,3% случаев.
Таким образом, результаты производсвенных испытаний свидетельствуют о высокой лечебной эффективности пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил при инфекционных энтеритах телят. Пероральное применение этих препаратов в комплексе с ветеринарно-санитарными мероприятиями обеспечивает сохранность 90,0 - 94,8% больных животных.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что инфекционные энтериты телят широко распространены в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан и в возникновении этих болезней большую роль играют Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris как в отдельности, так и в ассоциации.
2. Отобраны штаммы Вас. subtilis BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 для изготовления пробиотиков и изучены их морфологические, культуральные и биологические свойства.
3. Разработана эффективная питательная среда для выращивания Вас. subtilis, состоящая из 0,25% пептона, 0,25% картофельного крахмала, 0,125% глюкозы, 0,01% хлорида натрия и 10% бентонита.
4. Установлено, что модифицированый контактно-сорбционный метод обезвоживания является эффективным способом получения сухой биомассы штаммов Вас. subtilis для изготовления пробиотиков.
5. Разработанный пробиотик Субтилбен на основе штаммов Вас. subtilis BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 обладает высоким антибактериальным действием: бактериостатическая и бактерицидная активность Субтилбена в отношении возбудителей инфекционных энтеритов проявляется в концентрациях соответственно 0,3 - 0,6 и 0,6 - 1,2 мг/мл.
6. Разработанный пробиотик Лаксубтил на основе штаммов Вас. subtilis BS TJ 09 и BS TJ Д 26 в отношении Е. coli, S. dublin и Pr. vulgaris проявлял высокую бактериостатическую (75 - 150 мкл/мл) и бактерицидную активность (150-300 мкл/мл).
7. Показано, что бактерицидная активность пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил в отношении моновозбудителей проявлялась в концентрациях соответственно 0,6 - 1,2 мг/мл и 150 - 300 мкл/мл, тогда как в отношении ассоциаций возбудителей инфекционных энтеритов телят - 2,4 мг/мл и 600 мкл/мл.
8. Воспроизводимость разработанных технологий подтверждена предложенными методами качественного и количественного определения физико-химических и биологических свойств пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил.
9. Установлено, что пробиотики Субтилбен и Лаксубтил относятся к нетоксическим лекарственным средствам и в 10-кратных терапевтических дозах не оказывают отрицательного действия на организм животных. При воздействии разработанных пробиотиков на культуры инфузории Colpoda steinii свыше 80% стилохоний остаются активными.
10. Пробиотики Субтилбен и Лаксубтил не оказывают существенного влияния на гематологические и биохимические показтели крови телят.
11. Наилучший профилактический эффект достигается при однократном пероральном применении пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил в дозах соответственно 0,3 г/кг и 5 мл/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 10 дней. Результаты производственных испытаний показали, что профилактическая эффективность этих пробиотиков составляет 95 — 97%.
12. Отработан рациональный способ применения пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил при лечении инфекционных энтеритов телят и показано, что перо-ральное их применение в дозах 0,3 г/кг и 5 мл/кг массы тела 2 раза в день до выздоровления обеспечивает сохранность 94,8% телят.
13. Экономическая эффективность пробиотиков Субтилбен и Лаксубтил в расчете на один сомони затрат при профилактике и лечении инфекционных энетритов телят составила 4,8 сомони, что в 1,5 раза больше, чем соответствующий показатель препарата-аналога.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Инструкция по изготовлению и контролю иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
2. Технические условия на иммунобиотик Субтилбен (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
3. Наставление по применению иммунобиотика Субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);
4. Решение 26-го заседания Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ от 24.11.2004 г. (Душанбе) о практическом использования препарата Субтилбен в ветеринарной практике СНГ;
5. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации колибакте-риоза новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
6. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации ротави-русной инфекции телят (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
7. Инструкция о мероприятиях по борьбе с сальмонеллезом новорожденных животных (утв. СГВН МСХ РТ, 2009 г.);
8. Научно-обоснованная система получения здорового молодняка и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.);
9. Рекомендации по применению пробиотиков для профилактики и лечения пневмоэнтеритов телят (утв. СГВН МСХ РТ, 11.09.2012 г.);
10. Инструкция по изготовлению и контролю пробиотического препарата Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г.);
11. Технические условия на пробиотик Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г);
12. Наставление по применению пробиотика Лаксубтил (утв. СГВН МСХ РТ 11.09.2012 г.).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Физико-химические и биологические особенности координационного соединения дибаферол / И.Т. Сатторов, К.Б. Махмудов, Н.Р. Сатгоров, З.Н. Юсупов, У.Р. Раджабов, Р.Б. Имомов // Актуальные проблемы болезней животных в еовременных условиях: матер. Междунар. йауч.-практ. конф., посвящ. 60-летию ТаджНИВИ - Душанбе, 2003. - С. 145 - 146.
Л. Способ определения состава и получения противомикробных препаратов / И.Т. Сатторов, Н.Р. Сатторов, Ш.А. Турдиев, З.Н. Юсупов, У. Раджабов // Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных: матер. И Междунар. науч. конф. - Самарканд, 2004. - С. 200 - 201.
3. Подбор штаммов Вас. subtilis для изготовления пробиотиков / И.Т. Сат-торов, Н.Р. Хасанов, З.С. Каландаров, Н. Сатгоров, А. Сафаралиев // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе, 2006. - №4. - С. 29 - 31.
4. Саггори И. Рациональный способ сушки иммунобиотика Субтилбен на минеральных и растительных адсорбентах / И. Сатгори, Н.Р. Сатгоров, Н.Р. Хасанов // Матер, науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзо-да. - Душанбе 2006. - С. 40 - 41.
5. Сатгоров И.Т. Антимикробная активность препарата Шодмон / И.Т. Сатгоров, Н.Р. Хасанов, Н. Сатгоров // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе 2006 -№4.-С. 31
6. Сатгоров Н.Р. Эффективность препарата «Шодмон» при лечении инфекционных энтеритов телят / Н.Р. Сатгоров // Ветеринария. - Душанбе 2006 -№2.-С. 37-38.
7. Токсичность комплексного антибиотика Шодмон / И.Т. Сатгоров, Н.Р. Хасанов, З.С. Каландаров, Н. Сатгоров // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе 2006 -№3.-С. 15.
8. Хасанов Н.Р. Усули бо эътимоди пешгирии колибактериози гусолахои навзод / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатгоров // Матер, науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. - Душанбе, 2006. - С. 36 - 37.
9. Хасанов Н.Р.Усули самарабахши парвариши Вас. subtilis / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатгоров // Матер, науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. - Душанбе, 2006. - С. 37.
10. Хасанов Н.Р. Этиологияи беморихои омехтаи узвхои хозима ва нафас-кашии гусолахо / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатгоров // Матер, науч.-производ. конф. молодых ученых, посвящ. 15-летию независимости РТ, 2700-летию г. Куляба, 75-летию ТАУ и 100-летию У. Рахматзода. - Душанбе, 2006. - С. 38 - 39.
11. Хасанов Н.Р. Смешанное течение эндометритов и маститов у коров на молочно-товарных фермах республики / Н.Р. Хасанов, Т.М. Давлатмуродов, Н.Р. Сатгоров // Пути устойчивого развития сельского хозяйства: Междунар! науч. конф. - Душанбе, 2007. - С. 32 - 34.
12. Сравнительная оценка эффективности разных методов лечения маститов и эндометритов у дойных коров / Н.Р. Хасанов, Т. Давлатмуродов, Н. Сат-торов, С. Баротов // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе, 2009. - №4 (44). С. 21.'
13. Истифодаи штаммхои мухталифи Bacillus subtilis барои тайёр намуда-ни пробиотики Субтилбен / И.Т. Сатгори, Н.Р. Сатгоров, Н.Р. Хасанов, А. Сафаралиев // Кишоварз / ТАУ. - 2008. - №1. - С. 12 - 13.
14. Комплексные антибактериальные препараты и их эффективность при болезнях животных / И. Сатгори, Н.Р. Хасанов, Ш.А. Турдиев, Н.Р. Сатгоров // Доклады ТАСХН. - Душанбе, 2009. - №1 (19). - С. 40 - 43.
15. Сатгори И. Изучение противомикробных свойств пробиотика Лаксуб-тил / И. Сатгори, Н.Р. Сатгоров, М.М. Каримов // Овцы, козы и шерстяное дело - М„ 2009. - №4. - С. 78 - 80.
16. Саттори И. Профилактическая эффективность пробиотика Лаксубтил при желудочно-кишечных болезнях телят / И. Саттори, Н.Р. Сатторов, М.М. Каримов // Биобезопасность и зоонозные инфекции: матер. I ежегод. конф. Ассоциации Биологической Безопасности Центральной Азии. - Алматы, 2009. -С. 65.-66.
17. Сатторов Н.Р. Распространение мастита и эндометрита КРС в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан / Н.Р. Сатторов, С.Т. Баротов // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе, 2009. - №3. - С. 16 -18.
18. Хасанов Н.Р. Эффективность разных методов лечения при острых маститах и эндометритах у дойных коров / Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатторов, Т. Давлатмуродов // Кишоварз / ТАУ. - Душанбе, 2009. - №4 (44). С. 21 - 23.
19. Координационное соединение меди (II) с дибазолом, проявляющее противомикробную активность / Н.Р. Хасанов, И. Саттори, Н.Р. Сатторов, Н.Ф. Шеров, З.Н. Юсупов, У.Р. Раджабов, Р.Б. Имомов // Вестн. Таджикского национального университета. - №3 (59).-Душанбе, 2010.-С. 200-204.
20. Сатторов Н.Р. Изменение морфологических и биохимических показателей крови коров в зависимости от применения оптимального способа и дозы пробиотика при лечении субклинического мастита / Н.Р. Сатторов, Н.Р. Хасанов, С.Т. Баротов // Кишоварз / ТАУ. - 2010. - №3. - С. 29 - 31.
21. Сатторов Н.Р. Применение пробиотика Лаксубтил при пневмоэнтери-те телят / Н.Р. Сатторов, Ш.А. Турдиев, М. Каримов // Тр. Сумского национального аграрного университета. — Сумы, 2010. - С. 33 - 34.
22. Сатторов Н.Р. Эффективность Лактовита при лечении мастита коров в сухостойном периоде / Н.Р. Сатторов, С.Т. Баротов // Чавонон ва илми муосир. - Душанбе, 2010. - С. 358 - 361.
23. Каримов М.М. Применение нового препарата Лаксубтил для лечения респираторных заболеваний телят / М.М. Каримов, Ш.А. Турдиев, Н.Р. Сатторов // Актуал. пробл. болез. жив. в соврем, усл.: матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Сумы, 2010. - С. 65 - 70.
24. Саттори И. Изучение параметров острой токсичности пробиотичекого препарата Лаксубтил / И. Сатгори, Н.Р. Сатторов, М.М. Каримов // Науч.-техн. бюлл. - Львов, 2011.
25. Синтез, идентификация и биологические свойства координационных соединений Fe (II) и Cu (И) с азолами / И. Саттори, Н.Р. Сатторов, З.Н. Юсупов, У. Раджабов // Естественные и технические науки. - М., 2011. - №3. - С. 52 -56.
26. Сатторов Н.Р. Рациональный способ сушки культуры Вас. subtilis кон-тактно-сорбционным методом / Н.Р. Сатторов // Всстьч Сумского национального аграрного университета.- Сумы, 2011.-№1 (28).-С. 66-68.
27. Sattori I. Application of useful microorganisms for correction of natural microflora / I. Sattori, N.R. Sattorov // Research and Clinical Application of Traditional Medicine in Xinjiang and Neighboring Countries in Past and Present: Material Conference: abstracts. - Xinjiang, 2011. - P. 30 - 34.
28. Sattorov N.R. Etiological role of bacterial agents in the occurrence of infectious pnevmoenteridies calves / N.R. Sattorov // International Scientific-Practical
Conference «Veterinary Problems of Central Asia-Food Security: The Use of Modern Ways of Diagnostics and Prophylaxis of Infectious Diseases of Animals», devoted to the 20 anniversary of the Independence of the Republic of Tajikistan and the 80th anniversary of Tajik Agrarian University named after Shirinsho Shotemur. -Dushanbe, 2011. - P. 23 - 24.
29. Сатгоров H.P. Изучение острой токсичности пробиотического препарата Лаксубтил / Н.Р. Сатгоров, Н.Р. Хасанов, М. Каримов // Кишоварз / ТАУ. -2012.-№3. — С. 22-23.
30. Сатгоров Н.Р. Изучение хронической токсичности препарата Лаксубтил / Н.Р. Сатгоров, Н.Р. Хасанов // Кишоварз / ТАУ. - 2012. - №3. - С. 28 - 29.
31. Сатгоров Н.Р. Доклиническое исследование пробиотика Лаксубтил / Н.Р. Сатгоров // Кишоварз / ТАУ. - 2012. - №4. - С. 22 - 23.
32. Технология изготовления Субтилбена в форме таблеток / Ш.Х. Саи-дов, И. Сатгоров, Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатгоров // Кишоварз / ТАУ. - 2012. - №3. -С. 85-86.
33. Эффективность микробных препаратов при сальмонеллезе телят / И. Саттори, Ш.Х. Саидов, Н.Р. Хасанов, Н.Р. Сатгоров // Кишоварз / ТАУ. - 2012. -№3.-С. 31 -32.
34. Пат. TJ 386 Республика Таджикистан, МПК 7 А 61 К 39/295, 35/14, А 61 Р 31/00. Способ профилактики рота-, коронавирусного энтерита и колибак-териоза телят, протекающих в ассоциации / Сатгоров И.Т., Махмудов К.Б., Хамдамов А.Ш., Сатгоров Н.Р., Коромыслов Г.Ф., Гоголев М.М., Соколова Н.Л.; заявитель и патентообладатель — Таджикский научно-исследовательский ветеринарный институт; заявл. 02.09.2000; опубл. 2002, Бюл. №2 (26).
35. Пат. TJ 403 Республика Таджикистан. Дибаферол, проявляющий про-тивомикробную активность / Рачабов У., Юсупов З.Н., Сатгоров И.Т., Махмудов К.Б., Турдиев Ш.А., Сатторов Н.Р., Имомов Р.Б., Болтаев С.П.; заявитель и патентообладатель - Таджикский государственный национальный университет, Таджикский научно-исследовательский ветеринарный институт; заявл. 04.04.2003; опубл. 2005, Бюл. №37.
36. Пат. TJ 404 Республика Таджикистан. Дибакупрол, проявляющий антибактериальную и антигрибковую активность / Юсупов З.Н., Рачабов У., Сатторов И.Т., Имомов Р.Б., Турдиев Ш.А., Махмудов К.Б., Сатгоров Н., Давлат-муродов Т., Зухуров А.; заявитель и патентообладатель - Таджикский государственный национальный университет, Таджикский научно-исследовательский ветеринарный институт; заявл. 12.03.2004; опубл. 2005, Бюл. №37.
37. Пат. TJ 405 Республика Таджикистан. Препарат Витагин для лечения эндометритов у коров / Сатгоров И.Т., Мирзахметов Ш.Р., Юсупов З.Н., Турдиев Ш., Сатгоров Н., Давлатмуродов Т., Раджабов У., Хасанов Н.Р.; заявитель и патентообладатель - Сатгоров И.Т.; заявл. 13.08.2004; опубл. 2005, Бюл. №37.
38. Пат. TJ 406 Республика Таджикистан. Препарат Лактовит для лечения маститов у коров / Сатгоров И.Т., Мирзахметов Ш.Р., Юсупов З.Н., Турдиев Ш., Сатгоров Н., Давлатмуродов Т., Раджабов У., Хасанов Н.Р.; заявитель и патентообладатель - Сатгоров И.Т.; заявл. 13.08.2004; опубл. 2005, Бюл. №37.
39. Пат. "П 531 Республика Таджикистан, МПК (2012.01) А 01 N 163/00; С 12 N 1/2. Способ получения биопрепарата Лаксубтил / Саттори И., Сатгоров Н.Р., Турдиев Ш.А., Хасанов Н.Р., Каримов М.М., Сафаралиев А.Р., Баротов С.Т., Юсупов М.М.; заявитель и патентообладатель - Сатгори И.; заявл. 18.04.2012; опубл. 2012, Бюл. №79.
Сдано в набор 7.11.2012 г. Подл. кпеч. 27.11.2012 г. Формат бум. 60x84 |/16. Зак. 144. Тираж 100 экз. Объем 1 1/4 ел. Типография Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура. Душанбе, пр. Рудаки, 146.
-
Сатторов, Носирчон Расулович
-
доктора ветеринарных наук
-
Душанбе, 2012
-
ВАК 06.02.02
- Разработка технологии производства пробиотиков на основе Bacillus subtilis и их эффективность при инфекционных энтеритах телят
- Способ получения пробиотика Субтилбен в форме таблеток и его профилактическая эффективность при сальмонеллезе телят
- Лечебно-профилактическая эффективность пробиотика лаксубтил при колибактериозе телят
- Жидкая форма пробиотика Биод-5 и его эффективность при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят
- Разработка нового препарата-пробиотика "Витаспорин" и изучение его биологических свойств
