Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Таксономия и идентификация холерных и других вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Таксономия и идентификация холерных и других вибрионов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ

"МИКРОБ"

ПРИЧЕРНОМОРСКАЯ ПРОТИВОЧУМНАЯ СТАНЦИЯ

рг6 од

\ 3 ' ' '¡1 На ПРаВаХ рукописи

ГАЛЬЦЕВА Галина Васильевна

ТАКСОНОМИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХОЛЕРНЫХ И ДРУГИХ ВИБРИОНОВ -

03.00.07 - микробиология .

*

Диссертация-, в виде научного- доклада на соискание ученой степени доктора- медицинских- наук.

Саратов. 1995

Научный консультант:

Чхен-корр. АЕИ, доктор медицинских наук, профессор А. Е.Наумов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор А. В. Липгащкий.

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.И.Смирнова

Доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Зыкин ■

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится «ЗА» 1995 года

в ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации ( 410071 г.Саратов, ул. Университетская. 46):

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб". '

Диссертация в виде -научного, доклада разослана "{?" <^4^1995 года.

Ученый секретарь . Диссертационного Совета.

доктор биологических наук, Г.А.Корнеев

профессор

1. (ЩЯЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЯ50ТН

1.1. Актуальность проблема. Проблема классификации вибрионов имеет вавное не только теоретическое, но и практическое значение. Наличие четких таксономических признаков в значительной степени облегчает идентификация микроорганизмов и способствует своевременной бактериологической диагностике заболеваний, обусловленных различная« вибрионами.

Касаясь истории вопроса таксономии холерных и других вибрионов, следует отметить, что их систематика, полояение отдельных таксономических групп не являются стабильными, постоянно пополняются новыми данными и обсуадаится. Бактериологи и систематики пользуются несколькими классификационными схемами,- которые демонстрируют различный подход как к группировке, так и к введению бактерий в сем. Uibrionaceae. что нередко приводит к таксономической путанице, Происходит это по причине несоблюдения правил и принципов систематики и классификации-бактерий. Систематика -научное исследование многообразия организмов, их опигание и рас-полояение по определенным группам с объяснением этого распределения. Классификация- располояение организмов по группам на основе определенных критериев или общности происхоадения. Наука о биологической классификации известна как таксономия, включавдая теории, правила, методы и приложения. Ортодоксальная таксономия за основу классификации принимала лииь один из признаков (у вибрионов - морфологический), бдонсоновская или нумернческая таксономия признавала все фенотипические признаки равноценными; это позволяет количественно выразить таксономические дистанции меяду организмами. Молекулярная таксономия с использованием ь^тодов определения нуклеотидного состава ДНК и изучения химической гибридизации нуклеиновых кислот оказала влияние на систематику вибрионов. Основной единицей признан таксон - любая таксономическая группа, получаемая в результате применения определенного аетода классификации,.

В соответствии с основными положениями "Зеядународногр Кодекса номенклатуры бактерий" (Яаукй,19?8) таксономические категории подразделяштся на обязательные и необязательнее- Обязательнее категории - вид. род, секейство, порядок, класс и царство; необязательные - подрод, подтриба, триба, иодпорядок, подкласс в латинской транскрипции. Основным такссном в систематике бактерий слугит род. Характеристика видов бактерий слизкой нечувствительно переходит в описание-'особенностей зтйммов-. В пределах, сем. tfibrionaceae определен типовой род tfibrio Pacini 1854. Ь пределах рода Vibrio - типовым видом является Uibrio сПаГегае Pacini 1854 и определены типовые втаммы сftTCC,NCTCЗамена или прина-

- з -

тие новых типовых штаммов, изменение названий- типовых штаммов, предложение неотиповых штлымов взамен утраченного или резко изме нившего свои свойства в процессе длительного хранения,-проводится в строгой соответствии с требованиями "Международного Кодекса по номенклатуре бактерий",1978. Неотиповой штамм . мовет быть признан официально после двух лет опубликования его описания в Международном журнале по систематике бактерий (Intern.3.Syst.Вас teriol) и утверждения Юридической Комиссией по номенклатуре бактерий. Следовательно, вид - это группа штаммов, обнаруживающая высокую степень общего, фенотипического сходства и отличавшаяся от родственных групп штаммов по многим независимый признакам. Распознавание видов было бы невозможным, если бы существовала не прерывная изменчивость природных форм. В пределах каждой совокупности бактерий вида обнаруживается некоторая степень внутреннего фенотипического разнообразия, обусловленного генетической изменчивостью. И совериенствование таксономии состоит в том, чтобы с учетом изменчивости, вопервых, как можно полнее описать и иден тифицировать основные таксономические единицы или виды, во-вторых, разработать удобный способ расположения и систематического перечисления этих единиц.

В идеальном случае виды должны быть охарактеризованы, по фенотипу и генотипу. Но практическая таксономия уступает этому иде алу.так как генотипические характеристики при выделении и идентификации вибрионов практически отсутствуют.

Реклассификация-представителей ceM.Vibrionaceae и рода üib-rio длится более SO лет; Исследования с использованием методов и принципов современной систематики не вносят полной ясности в классификацию и идентификацию вибрионов. Благодаря Davis и Park Í1962), Sebald и Ueront 19.63), славилось новое представление об основных таксономических.признаках вибрионов. Подкомитет по таксономии вибрионов Невдународной ассоциации микробиологических ■обществ (JftMS). в 1972 г.. дал новое описание рода Uíbrio - грам-отрицательные аспорогенные палочки с одним постоянным изгибом или пряные, с одним полярно расположенным кгутикои, индофенолок-сидазополовительные, образцвщие.кислоту без газа из d-глвкозы, с учетом предложений ¿akázakií1967) дополнить описание сведениями о налички декарбокеилаз лизина и орнитина, отсутствии аргиникди-гидролазы, расщеплении желатины, восстановлении нитратов и неспо собности образовывать сероводород. Такое определение значительно сузило границу рода.и позволило, исключить из него больоую часть видов, классифицированных ранее как вибрионы.

В Index Bergeyana( 1966):в сем.Uibrionaceae входил род fiero. monas, PIesíoBonas и Ulbrio, в котором было 207 видов вибрионов. В 8-м издании Bertfey's.Manual of Deterffiinatiue Bacteriology

: - 4 -

: 1974 5 к сем. Uibrionaceae отнесли не только род (Jibrto Pacini, 1854; fleroaouas Kluyver, fflce, 1Э36; Plesiosonas Habs, Shubert. 1982; но и Photobacteriua Bsijerinc и Lucibacteriua, 1839; 'riend-?ic, Hodgkiss Shevan,1970. В пределах рода Uibrio оставили 5 зи-^ов: U.cholerae, U.parahaenolyticus .U.angui 1 laru;n, U.fisheri, ií.costicola. По лрэдлояенив lièrent 3955 ), к вида U.cholerae отнесли 4 биотипа: choleras С Pacini, 1854 ). eltor (Pribun, 1Э i 3 ), Proteus (Buchner), albensis (Lehnann, Neuaann, 1227 ). Одновременно с выделением возбудителя азиатской холеры С Koch.1383 ) описали КоштаЬасПlus tier choierae nostras (Finkier. Prior.1834), отличающийся от холерных вибрионов тем, что они не агглютинировались холерными О-сыворотками. Saka'.aki et al.(1967) с позиций ортодоксальной, нунерической и молекулярной таксономии отнесли кх к зи-ду U.cholerae и предложили дифференцировать по серотипан. 0 8-н издании определителя бактерий Берги (1974) эта многочисленная группа вибрионов осталась вне классификации, тигда как бактерии, не имеющие ничего общего с холерными вибрионами. были вкличены в биотип .Proteus с типовым штаммом 8363, который по своим характеристикам не соответствовал описанию U.cholerae, Пародо.чсально, что к биотипу proteus отнесли атаыин U.metschikovii и отоядестви-ли с ХоиваЬасi 1lus der Cnolera nostras (Finkler.Prior,1884), то есть U.finklerprior синоним-"U.proteus".

ß 1979 году" научная рабочая-Группа ВОЗ приняла решение называть вибрионы,-не агглптинирущиеса О-холерными- сывороткаки-U. cholerae non.1 01. Й.Н.Блохина и Г.ф.Ливанова ( 1976 ) рекоиендова- ' ли в семейство Uibrionaceae включить пять родов: Uibrio, PIsíobo-nás, Benenkea, Marínovibrio, fteroaonas. ñ.K. Адамов--:!-M.C.Ha-умаина ( 1984 ) поддеряали зту ракоиендациш'и предлозили подразделить род 'dibrio на три вида: U.chalèrae, ü.enter-itidis CU.cholerae non 0.1 ) и U:alhensis.'В 3-й. издании определителя бактерий Берги (1984) из сем. Uibrionaceae искЛбчен род Lucibacteriusb Из зи- ■ да U.cholerae исключен биотип Proteus. Но к роду Uibrio- стали относить 34 вида морских вибрионов-, когда были опубликованы "Одобренные списки названий бактерий" fSkèraaii et al."Approved lists of bacteriae nanes",1980), вклв^аа^яенаййвнаванда Таксонов ; отобранные из огромного ко'личестйа сущбствовазиих до этого времени -синонимов и узаконенные критической Кйаиссиёй. Международного Комитета по систематике бактерий. Традиционней классификация, огнован-ная на изучении морфологических, культуралвных,биохимических признаков получила название фенотипической систематики - феносистема-тики (Иайр.192-1: Заварзин, 1974), При зтом опзрационной,таксанои1:-. ' чоской единицей (OTE) лвлаютса штаммы. В'пссяедкив^гвд!». для сопоставления всех OTE по совокупности-эакодирозапгщг признаков ясно-

льзувтса с noMotjbB компьютеров, ЭВМ алгоритмы с применением различных мер близости таких как коэффициента подобия (Ks) или коэффициента сходства (К). Коэффициент сходства с использованием варианта алгоритма позволяет не только выявить группы сходных организмов, но и проследить, в какой последовательности объединяются втамыы ыезду собой на основе их феноткпического сходства. U.ei-tor, U.cholerae и U.cholerae non 01 сформировались при высоком коэффициенте подобия К=48. При К=4? объединились И.eltor и U. cholerae non 0Í: при К=4? к ним присоединились не сгруппировавшиеся ранге штаммы U.cholerae и U.chol.non 01 (Блохина и соавт., 1992). Если проанализировать получаемые результаты, то видно, что мьтоды нимерической таксономии позволяет определять феноны и строить матрицы, в которых идет распределение штаммов по группам и нет информации для практической таксономии, то-есть по.идентификации. хотя постоянно происходит перестановка фенонов. Заслугой нумеркческой таксономии является разработка способа отбора признаков для идентификации и дифференциации, которые позволяют уменьаить овибки, определяемые штанвовой вариабельностью. Следует учитывать, что схема идентификации и классификации не .являются совершенно тождественными.

Б Мекдународном Кодексе предусмотрены правила восстановлений названий тех таксонов, которые упущены в "Одобренных списках" и правила действительного опубликования вновь предлагаемых таксонов. Издание вкдзчает'не только названия новых видов, родов и се-ыейств, но и характеристику по нуклеотидному составу ДНК.

Гекосистеиатика как новое направление возникла в 50-х годах. Было установлено, что нуклеотиднкй состав ДНК и степень сходства нуклеотид.мых последовательностей (токология ЛНК) связаны с поло-кениец видов в системе к могут использоваться в качестве существенных таксономических признаков (Белозерский.1970; Блохина и соавт. .1976;- Palloroní.1383). Известно, что в гигантской молекуле (ДНК, геноме) содервится инсаество генов, ответственных за проявление фенотипических.признаков. Нам se доступно для исследований iö-20/i Фенотипа от закодированных в геноме. Для выявления геномного родства на уровне рода и вида введено в таксономической практике понятие коэффициента ыасЕтабности (л -дельта X ГЦ) в таксоне. Коэффициент-касвтабности - это степень втаиновых различий по фенотипачзскин признакам, то. есть - чем ыеньве этот коэффициент, твй более-однородная группавтакков в пределах одного таксона.

В пределах рода Uíbrío. по данный разных авторов, этот коэффициент равен i 1—13, так как 7. ГЦ- пар. для представителей почти 34 видов колеблется ст 39 до 51 кольХ. Предпочтительность терми- . «а "Г£;го>4«эг" родства лоред "геизгичаскни" была отнечвна OoneS

;t al.,1970; Bradley,1980. Авторы отмечают. что геномная гомология определяет сходство последовательностей нуклеотидов з молеку iax ДНК, тогда как генетическая гомология говорит, о сходстве рас шлонения генов. В основном, при молекулярной гибридизации срав-шваштся целые геномы, но строго говоря, не генотипы. Главным 1ля таксономии является выявление степени корреляции геномного юдства с его фенотипическиы выраяением. По генсмн_м характеристикам от вибрионов отличаются представители рода flerononas (56-•ЪУ. ГЦ). Промеяуточное положение занимает род Plesiononas (31-27. ГЦ). Состава ДНК Photobacteriua и Lucibacteriun 39-43"/. и 45-дХ. что характерно и для рода Uibrio. к(з приведенных данных зи-но, что коэффициент масштабности для них значительно меньве (7-), чем для рода Uibrio (11-13). Однако, Coluell et al.(198S) редлоаил к сем. Uibrionaceae относить роды: Uibrio. Pbotobacte-ium, Lucibacteriuu, Listonella, Sheuanella, fllterovibrio, Pseu-оаегошопаз, что привело CHOBai к таксономической путанице. Веро-тно. эта классификация .такаэ не выдеряит испытания.

Постоянная реклассификация вибрионов, изменения таксономиче-Ш критериев значительно ослоаняет идентификацию вибрионов, цепку зколого-географического распространения зибриофлоры, ее эль в патологии гидробионтов и диагностику заболеваний челове-з, обусловленных этими вибрионами. Поэтому совераенствование 5Ксономии и идентификации вибрионов актуально.

1.2. Цель и задачи исследования. Цель работы - совервенст-)вание таксономии и идентификации холерных и других вибрионов, ¡лающихся возбудителями не только диарейных. но и системных задеваний человека. Для дости1ения поставленной цели пр.дполага-)сь резить следующие задачи:

обозначить основы внутривидовой и межвидой-ой таксономии г пределах вида U.'cho-lerae и U.species рода Uibrio с ем. Uibr-ionaceae изучить диагностическую ценность нуклеотидного состава. ДНК и молекулярной гибридизации ДНК-ДНК хслеоных. и других вибрионсв и определить их соответствие" фенотипическим характеристикам; разработать современную вкутриеидоеуп классификация вида U.cbo lerae выделив L'.chol.non 01 и U.albensis з самостоятельные б;ю типы;

провести анализ эколого-гесграфического распространения вйсри-онов некоторых таксонов и определить перспеяттаа их серотипи-рорания;

изучить и оцените диагностический значимость феномена биолюминесценции таксона U.alber.sis:

зыдзлить и изучить фаги вибрионов некоторых"таксэств и определить перспектива ^аготипироканизи^ектафйкации вмОрионоэ и

эпидемиологического анализа вызываеных ими заболеваний;

- определить особенности пигыентообразования у вибрионов различных таксонов для совервёнствования лабораторных методов исследований;

- определить состав высших вирных кислот свободно экстрагируемых липидов у вибрионов для использования хематаксономических прин ципов при идентификации различных таксонов;

- проанализировать диапазон изменчивости холерных и других вибрионов и определить методы идентификации измененных вибрионов;

- обосновать проблемы, таксономии и идентификации некоторых U.species, патогенных для человека;

--' согериенствовать диагностические препараты и методические приемы для обеспечения этапов лабораторных исследований на вкбри-офлору.

1.3. Научная и практическая значимость результатов исследований.

- Использование современных методов геносистематики позволило выявить основы внутривидовой и межвидовой таксономии холерных к других вибрионов. Выявлена корреляция генотипических и фе-нотипических характеристик для большинства изученных таксонов вибрионов. По нуклеотидному составу ДНК (в пределах 47-49 моль? ГЦ) !' результатам молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (гомология 72-1002) доказана высокая степень геномного родства всех представителей вида U.cholerae (cholerae. eltor, chol.non 01, alben-sis, в том числе U.chohHetschnikovii 251, Gamaleia 1868). .

- С цельв определения таксономического статуса U.chol.non' 01 обосновано введение в вид U.cholerae самостоятельного биотипа finklerprior, к которому следует относить U.chol.02-083...0139. Предлагается неотиповой итавм U.finklerprior 15 (Finkier. Prior .1884;.

- Разработай и внедрен в практику перспективный метод серо-типирования (J.chol.non 01 (finklerprior). Депонированы типовые штаммы на серотипы 045,048,049,050,051,052,053,055, защищенные авторскими свидетельствами и приоритетными справками. Совместно со специалистами Саратовского НИПЧИ "Микроб" и Ростовского НИЙЧИ разработана технология изготовления и контроля вибрионных аггяь-тинируешнх диагностических сывороток для идентификации V.chol. поп 01 различных серовароЕ. ■

- Обосновано существование самостоятельного биотипа alben-sis в пределах вида U.cholerae. Показано их широкое эколого-гео-графическое распространение и роль в этиологии 0SK3. Выявлена .впервые перспективность метода серологической идентификаци U.al-bensis. Депонированы итаммы-продуценты диагностических агглвтини-

рувщих сывороток к 02-012 сероварам. Для ликвидации таксономической путаницч предлагается неотиповой атамм U.albensis 7102 il": -bar.1893) s исждународные коллекции с характеристиками в соответствии с требованиями по номенклатуре бактерий, а ятамк НСТС 24ЛЗ изъять как н9соотэетствуш!?ий виду U.caolsrae. Заявлено серологическое родстзо мезду U.albensis и O'.cnoisrae 06.08.09.018.033. 039 сероваров коллекций Sakazaki. Неписана документация на типовые агглптинируищиз сыворотки.

- Впервые выделены фаги U.älbensis 3 и 4 морфогруппз. J целью совершенствования идентификаии:«. U.älbensis и расиифроэки диарейних заболеваний, обусловленных этими виорионами, перспективно создание набора диагностических альбензис фагсв i№¡¡}.

- Зпервые выделен ферментный белок лэцифераза из зтамиов ¡J,aibensl3 Пие+) и показано его участие в биолюминесцентных реакциях светящихся вибрионов. 5иодвмлнесцевция основной тест ференциации U.aLbensis от U.chol.non 0Í, При утрате биолнминес-ценцшт - дополнительный« могут слукить только методы серотиггиро-зания и фаготипирования.

« Впервые доказано, что у а-алмов вида U.cholerae и некоторых U.species имеется ген(ы), детернинируиций синтез фермента ти-розиназы (tye+) и пигмента меланина (рдп+). Написаны методические указания по выделении и изучения! пигментообразуяших штаммов. Депонирован тест-яганм Staph.saprophytics 221 а ГИС1! им.Тарасовича для определения tys-активности вибрионов я пигментообразо-зания.

- Подтвержден таксономический статус биотипов вида U.cho-lerae отсутствием принципиальных различий состава анрнаи кисззт :уныарных липидов, тогда как есть различия у таксоноа 0,species. ]ри изучении фосфсляпидов - различия зы'язлены по диглнцерида* и г^иглицеридаа..

- Выявлена закономерность изменчивости вибрионов по згглэ-:ияабельносги, особенно RO-варйантов холерных вибрионов, фаголи-(абрльности, вирулентности, биоихияических свойств. Дле повизэ-та эффективности результатов лабораторных исследованг.й кооб;соди-!о внедрить а практику холерные ОН-сыэоротки и холерные ¡<0 р-з?е-'енс-атамин для контроля результатов адсорбции пс Kaste Hani мйунопреципитации по. Ouchterloni,

- Показана необходимость дальнвйиего сйзерзенстноо.зд^я чч-одев выделения некоторых U.specie:» эбогнаванич четких кп'таз;;-э идентификации и диффаоенциацни ч их тлксоноии"ac.ar-i ".-л-уле-ич. Перспзктивннни является метод:» молекулярной 5исл&-и:;. с»::-ипапзззнкя и фаготилирсеонкя. Получено 20 двйгнсвтйч«:«::; к

"г." лнтпгзнэк arr.T'j'HKKpyffiíi.'x счю^'Л!:, '"-'Ymaiu^ wwa» - -

лофильных вибрионов. Выделены фаги галофильных вибрионов. Получено авторское свидетельство_на фаг (ф 139/155). Перспективно создание набора диагностических фагов, йетодами геносистематики доказано, что Етаммы коллекции Sakazaki 012,023,026 сероваров является типичными U.fiuvialis. Обосновано несовврпенство таксономических критериев U.Betschnikovii, в tgm числе U.eetschnikovii 115. Предлагается вывести индофенолоксидазонегативкые микроорганизмы "pseudonetschnikouii" из рода Uibrio, приведя описание рода Uibrio в соответствие с описанием Ваишап et al.,1974,.а не. Shubert et al.С 1984). С целью совервенствованиз лабораторных исследований по выделению и идентификации вибрионов, патогенных для человека, необходимо практическим лабораториям иметь коллекций типовых втаммов V.species с полной генотипкческой и феноти-пической характеристикой в качестве ¿талонных.

- С цельи созервенствования лабораторной диагностики холеры в соавторстве разработаны и внедрены питательные среды, на которые написана и утверадена техническая документация, утверндены методические указания на тест-итанм Р-9741 для контроля качества сред, разработаны методы изготовления иммуносуспензионных препаратов. на которые получены авторские свидетельства и модифицированы некоторые методические приемы для выделения и идентификации холердых и других вибрионов.

1.4. Основные гишшвтм, взноеинае на защиту:

- -Таксономическое пол'озение U.chol.non 01 и U.albensis и их геномное родствэ с U.cbolerae и U.eltor. .

- Необходимость введения в вид U.choierae биотипа finklerprior к которому относить U.chol.02-083..г0133 сероваров,

- Неотиповые Етааыы биотипов вида U.chglerae.

- Перспектива серотипироьаниз U.chol.non 01, U.albensis, U.para-■ haenolyticus, U.fluvialis и других вибрионов.

- Перспективы фаготяпироЕания представителей U.albensis, U.para-haecclyticus и U.alsínolyticus.

- Значение биолюминесценции при идентификации культур вида U. cholerae.

- Пигментообразование холерныаи и вибрионами других таксономических групп.

- Характеристика-аирнокислотных профилей вибрионов различных таксонов к их"значение для внутривидовой и меавидовой дифференциации.

- Диапазон изменчивости холерных к других вибрионов и методы их идентификации.

- Значение некоторых ДКspecies в патологии человека и их генотк-пическая и фенотипическая характеристика.

- Необходимость заведения вида l'.aetb'chfiiKovi : :;з рода UibriJ. как несоотвчтстэув-дего.

- Совершенствование диагностических препаратов и иетодов исс^--дования холерных и других вибрионов.

1.5. Апробация и реализация научных исследований. Qchov.-V" полояения диссертационной работы были долоаенм на чон®вр»я!;к . съездах, симпозиумах, пленумах РАМН, совещаниях, щ.;йянних ииссиях по холере, конференциях обчестаа эпидемиологов, тки . * • логов, паразитологоз в Ро^тове-на-Донч. Краснодаре, Новороссийске: но Российской конференции иммунологов. Махачкала, i981, г.? • -снодар,1983; на V съе?дз BMG, Краснодар.1985: на конференции : лодых ученых. Кафан,Î386; симпозиуме по 5ио ч хё!»ияваинес.ц?н«и,л. Красноярск, '385; симпозиуме АСл по биолюминесценции в медицине и сельском хозяйства. Тазкент,198§: Комитете яо таксономии и номенклатуре патогенных бактерий, цростеизих и грибов, йосква, 1985.1989; на пленуме РйНН по зоонозным инфекциям, Новороссийск. 193?; на Всесоюзной зкояе-семинаре по био-термо-хемил-минесцен-ции Йосква-Суздаль. ÎS90 ;на Российское 'лкоде-сеаянзре по патогенным вибрионам. Новороссийск. 1334 ; на научной конференции na 00:i. Ставрополь, 1994. на обществе эпидемиологов...Краснодар,1995.

Материалу диссертации отражена з 33 научных работах. 23 аз-горских свидетельствах, 18 научных огчзтах по плановым темам НИР за период 1Э72 по 1994гг. при участии автора з качестзе рукороди-геля или ответственного исполнителя (1151 .1973;. 2.35,(975; L 1 . 1975; 7502545/ 1; 75.02545/2; 3,0.03451?;- 73.033606: 22.2.40, ¡79.843; 315.10.07.90; 2.77.575.343.1; 579.843.1; оформлено 3 лн-;труктивно-методическ-их документа, утвержденных ГЬ'КИ, ГГгГЭН Мсск-а; 3 - утверждениях Нчекаи Советом Ростовского ННП'Ш. Состзкле-а и утверждена КВС 2 ведомости изменений, к TJ-42 и лаборатерно-Ч регламенту на'питательные среды и нормативно-техническая доку-ентация по изготовлений а контроля аибриокннх О-аггяатинкрчзгщу. «агностических сывороток,

2. результаты исгжйштт

2.1. Геносксте*атива и $еносистс»атика иибриайо* зида U.cho-згае. При обедадении классификации рода Uibrlo, нельзя не обоз-пь внимание на таксономии типового вида U.cholerse, поедстав-îhhuh s 9-м издевки ;<huberi et al.,( t384) чз уровне 50-х годов м.шя-биевграки choierai и ¿Ног. что следует статат^ '.загса Hais s сравнении с 5-м изданием определителя эакгеряй дергч ч?4). Кроме, £ого. не г ан<5орнзш'ц rn ii. tinflerprlor . ,нз?ср*з кэазакгоно зтяоеялн ч "U.proteui'1 и нет ~зксол:- •

и 'J. л 1 о е г: s i sФенотигячески* хйр$,ч1ЖГ«ст;даг'1ТрвдстагИ7зл;?а

- il -

да U.choierae, изучали в соответствии с инструктивно-методическими материалами по проблеме "Холера". Чтобы надехно судить о таксономическое пологении вибрионов различного происхогдения и о степени геномного родства мекду ними, мы определяли ДНК у 28 птзйноь вида U,choler?e различных биотипоь (choicrae.eltor.chol. поп 01. alhensis) навей коллекции и типовых втакмов коллекции Сйй, Англии. Японии-

ДНК выделяли из фиксированных этанолом клеток по методу firich et al..1968. Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) определяли" модифицированным методом тепловой денатурации. Модификация основана на способности формальдегида блокировать аминогруппы азотистых оснований освобоЕдавдихся при тепловой денатурации ДНК. и тем самым.предзтврацзть ренатурациа разоведаихся участкоЕ двойной спирали при охлаждении. Опиты по реассоциации ДНК осуществляли в регистрирующем двулучевок спектрофотометре типа ИИИКйИ 1750 (Англия), снаовеннок термостатируе^ей приставкой. Содергание ГЦ пар в ДНК вычисляли по формуле при 3-5 повторностях:% ГЦ-£ Т—53,9 ï х 2,44 +д% ГЦ, Б качестве контроля для коррекции результатов включали пробирки с растворов ДНК кивечной палочки й-1?, имеющей состав ДНК 51,3% ГЦ при определении классическим методом хроматографии на бумаге. Молекулярнун гибридизации ДНК-ДНК осуществляли с использованием безизотопного спектрофотометрического метода, основанного на изучении скорости реассоциации двух сопоставляемых денатурированных ДНК (Леванова.1970,1981) в сравнении с изотопным методом.

- Результаты нукяеотидного состава и молекулярной гибридизации ДНК-ДНК некоторых итакмов представлены'в таблице 1.

Сравнительный анализ данных литературы (йнтонов и соавт,, 1Э?4; Блохина и соавт.,1974: Турова и соавт.,1977,1979) и полученных нами результатов показал, что у U.choierae. U.eltor со-дервание ГЦ-пар в ДНК в пределах 47-49% ГЦ (М+ - 48+0,5). В опытах по молекулярной гибридизации ДНК-ДНК в трех-пяти повторнос-тяк выявлен высокий уровень гомологии у втаммов классической холеры 86-100%, отмечается гетерогенность втаммов биовара зльтор (74-100% токологии ДНК). Вариации почти не выявлены в нуклеотид-ных последовательностях ДНК U.choierae поп 01 (47-47.2%). Во всех случаях обнарувено родство U.chol.nori 01 с U.choierae и U. eltor 82-88% гомологии ДНК (но литературе 73-100%). Следовательно, по геномной характеристике правомерно включение U.chol.non 01 в вид U.choierae.

Навими исследованиями доказано, что U.finklerprior 15 по фе-нотипическии характеристикам не отличаптся от U.chol. non 01, .U.choieras и U.eltor. U.fiRklerprior идентифицированы как предЬ-

Таблица t

Нчклеотидний состап и иоля:Чляриая ri'.'.'pi"Л-г;a va ДЖ-ДН1£ представителей вида V»choîerae

SîïDTHn Cepo-ТИП MU ОТЗЯЯйВ ?ц Гомология ДНК ьзтаииоз ~A.ï

V. cho!етае АТСС i4035 V.eltor» АТСС 14033

ЛТСС

choleras 01 14035 47,2 — 100,0 —

АТС С

ei tor 01 1 '033 48,5 100,0 —

HuTC

chai-non 01 02 471 1 47,2 _ 03, loo.о

NCTC

chol-non Ol 03 4715 47,1 32,0 - —

r i Tîk lei1-

pr*iar< chol -

-non 01 ) 047 15 47,0 - 90,О 39, О

Обозначения не мэдчали.

таеители 047 серовара по отечественной классификации.

Установлено, что штамм U.finklerpricr 15 по нуклеотиднону составу ДНК и"Ц-4? мольХ) полностью соответствовал виду U.chole-гае (ГЦ 47-4S моль/i). Аналогичные результаты получены для типового зтамма U.choleras ftTCC 14035 (ГЦ-47.2Х) и для вибрионов не 01 группы Sakazaki - fiCTC 471Í и NCTC 4715 (ГЦ 47,2 и 47,17-). '

Результаты молекулярной гибридизации ДКК-ДКК такзе сзиде-тельствозали о высокой степени родства меаду У,fínkierprior 15 и ü.cholerae "!ТСС 14035 ( 902 гомологии), U.finklerprior 15 и ктаа-аом NCTC 4711 (892 гомологии). При гибридизации ДНК этаниов ?íuГС 4711. НСТС 4715 и U.cholsrae ñTCC 14035 был такне установлен-высокий уровень сходства их геномов (¿8 и 52х гомологии). Результаты сразкительного изучения гэноаов U,íínkierprior 15, штаммов Sakazaki NCTC 4711, NCTC 4715 и У.choleras ftTCC 14035'свидетельствуют о прииадлзнности зсех перечисленных'вибрионов не 01 пуг,-пи к виду U.choleras. ••

Коэффициент насэтзонссти д ХГЦ-l или 2 говорит об однородности представителей вида U.choleras. Возникает вопрос, почяк-; • среди U.choJerae различают два биогппз и нет информация к какому биотипу относить ll.chol.non 0i, в том числе и 'J.finklerpricr.

Вызывает удивление тот факт, что внбрионы-дзойнкки възо'до-телей холерн, описанные более 100 лэт томд назад, да сих пор н? нашли своего места в классификации, -несмотря к. убедительные доказательства их тесного родства с холерными вибрионами. Richarde 1380) считал возмсаным-выделать 0',chol.поп 01 в г..?.>»_ .?--лтельный биотип, но нет конкретных предлозений о вридичесись- •: -э-рал%нии таксономического статуса этих вибрионов . Иастоязег -ставление о U-.choi.non 01 определило особенности лаборатерн: - ■ •:— следований по ядентнфичации этих аякроорган .зьев, основу 'ко" .г. составляют микробиологические и серологические метода.

'Серотипкрование не эквивалентно виду или.биотипу и не учитывается при научной классификации и таксономии вибрионов, такке как 'с позиций геноскстематики токсигенность не монет считаться существенны« таксономическим признаком классификации. Бактериальной ей; как систематическая категорий мовет состоять как из ток-::игенних, тан к нетоксигенных микроорганизмам, содеркаадх соматический антиген 01 группа или не 0! группы. И совервенствование методов серотипирования имеет основное значение в диагностической работе для практического здравоохранения, что необходимо не только для постановки диагноза, ко и для эпидемиологического анализа заболеваний, вызываемых этими микроорганизмами.

йольшой вклад в разработку серотипирования внесли зарубежные (Sakazaki et al.,1970; Shimada et al.,19??; Smith,1979) и отечественные исследователи (Гальцева.1972; йдамов и соавт.,1974: Киятханов и соавт.,1975: Сомова и соавт.,1976; Воронежская и со-авт.,1980). Многолетними исследованиями при идентификации вибрионов более 3000 втаыиов нами также показано широкое зколого-геогра-фическое распространение U.chol.non 01 на территории навей страны, определена частота встречаемости отдельных сероваров в различных регионах, доказана роль отдельных сероваров в патологии человека. Выявлена возмовность некоторых сероваров (2,5,6,7,10,13,22,34,46, 47; ьазывать групповые заболевания (Хайтович и соавт.,1983; Воронежская, 1994).

Для совераенствования методов серологического типироьания нами предлоаены новые серовары и типовые штаммц: 045,048,049,050, 051,052,053,055. Доказана перспективность серотипирования штаммов U.chol.noji 01. В нашей стране предложено 83 серовара: 02-033 Sakazaki et al,,(1970), 040-044 ВНИПЧИ- "Микроб", 045-055 РПЧЙ, 056 Туркменская ПЧС, 057 Крымская ПЧС, 056-062 ШПЧЙ "Микроб", ■063-064 РПЧК, 055 ЕНИР.ЧЙ "Кикроб", 066 РПЧИ, 067-068 ВНИПЧИ "Микроб", 081-083 РПЧК и 0139 РПЧИ. Б 1982г. при проведении японо-американских исследований 2-х систем серотипирования, Sakazaki с соавт. и Smith, серотипы отечественных исследователей во внимание приняты нк были. Для создания действительно международной классификации необходимо провести сравнение трех систем серотипирования, а вопрос о соавторстве решать в зависимости от зарегистрированного приоритета. .

Необходимо определить таксономическое половение обвирной группы U.chol.non 01 путем создания специального биовара вида U,cholerae. Предлагаем ввести биовар finkier-prior, названный так в честь ученых, открывших первого представителя этого биовара: Coaaabacillus der Cholera nostras, Finkier und Prior,1884. Б качестве неотипа признать .втамм U.finklerprior 15 из коллекции

РПЧЙ, который был получен в 1943 г. лз института "Микроб", ti а ятаам finklerpríor 15 имеются все характеристики в соответствии с требованиями по номенклатуре бактерий. В описании этого биовара деляны быть приведены современные серологические классификации. Принятие такого предложения позволит избегать устрашавшего действия видового эпитета "cholerae", который необходим употреблять только по отношения к истинным возбудителям холеры, а остальные эиб^ноны казыв^ гь з соответствии с наименование:", биовара.

Осооого внимания заслуживает история становления таксономического половениа вибрионов Мечникова. Исходный штамм выделен П.Ф.Гамалеей от домааней птицы, погибшей от повального холеропо-добного гастроэнтерита в 1888 году и назван в честь выдающегося русского ученого И.И.Мечникова. Гамалея передал гтамй в английскую коллекций под номером НСТС 262. который з процессе хранения утерян. Неотшозой итамм U .aetschnikovi i ÍJCTC 8443, гироко рас-просгранизоийся в научных лабораториях мира, оказался по феноти-пическим свойствам и строении генока отличным от исходного.

На. протяаении вековой истории вибрионы Мечникова рассматривали как типичные классические холерные вибрионы, которые вызывали заболевание и гибель голубей, морских свинок., пос.^е г.ассааей*-кроликов и обезьян (Гамалея,1888,1921,1958). В дальнейшем в Берлине, Париже было убедительно показано, что эти вибрионы утрачивали "ядовитость" и становились непатогеннкми для еивсгных. Голуби и цыплята, иммунизированные вибрионами Мечникова были устойчивы к вибрионам азиатской холеры.- Голуби, вакцинированные против азиатской' холеры, оказались устойчивыми к вибрионам Мечникова. -8 контроле неимкунизированные аивотные погибли как от азиатской холеры, так и от вибрионов Мечникова. И Гамалея делает завод, что вибрионы Мечникова и азиатской холера должны быть признаки двумя физиологическими разновидностями 0.cholerae.

Совершенно очевидно, что в определителе бактерий Берги!1974) и в работе Lee"et al.,(1973) под названием ü.aetschnikovíi описан новый.микроорганизм, н^, имеющий ничего обшлго с. тек, 5?оторо-ку Гамалея в 1888г. присвоил это ика. Предложений Lee.se ограничились изменением описания ü.aetschníkovii, было такжв рекомендовано пересмотреть его таксономическое положэние и выделить в самостоятельный вид. В связи с тем. что игами НСТС 8443. предложенный в качестве лектстипа U.eetschnikovii отличался от других представителей рода Uibrio» было ревено изменить описание и рода Ui-brío таким образом, мтобы оно соответствовало свойствам нового типового атамма. Эти предл^аення qií^í реализована Shübert-et ai.* !384. 'J.raetschnikovii стал первым индоф8ноло..сидазокегативныь ли-дсм родз üibrio. Заблуждения, связанные с таксономическим-полоне-

нием ü.netschnikovii, зашли достаточно далеко, и в настоящее время доминирует точка зрения Lee et al.,С1375) на природу этого вибриона. йльдовой с соавт,11981), международной рабочей научной группы БОЗС19Р0).

Существование различных по фенотипу штаммов вибрионов Мечникова имеет место и у нас в стране (.Зырянов и соавт.,1963; Турова. 1979i Дибинзон и соавт.,1981). Турова с использованием методов геносистематики установила высокую степень сходства геномов холерных вибрионов и штамма U.óeschnikovi1 23, но происхождение этого штамма неизвестно. Ми изучили зтаммы U.aeschnikovii с различными фенотипическикк характеристиками, определили их нуклеотид-ный состав и выявили различную степень родства с типовым штаммом холерных вибргонов ЙТЕС 14035. Итамм U.meschnikovii 251 был получен из Одесского НИИ эпидемиологии и микробилогии в 1357г. Шта^м U.aeschnikovií 115 получен из института им.Тарасевича в 1962 г., куда он поступил в 1958 г. из института "Микроб",

Гю нуклеотидноыу составу ДНК эти итаммы отличались друг от друга: содервание ГЦ в ДНК штамма 251 составило 48,3 иоль/а и соответствовало нуклеотидному составу ДНК холерных вибрионов с ГЦ 47-497.1 к л % ГЦ - 2. Для U-.aeschnikovii 115 этот показатель составил 43.2Z,a7. ГЦ - 4-5. йналагичный нуклеотидный состав ДНК (43,1%) был установлен у втанма U.aeschnikovií 35/780, выделенного Йльдовой с- соавт. в 1981 г. в ЧССР. В наиих исследованиях результата молекулярной гибридизации ДНК-ДНК выявили высокую степень сходства геномов ü.aeschnikovii 251 и типового штамма U.cho-lerae АТСС 14035 (952 гомологии). .При гибридизации U.neschniko-vii 115 с ДЙК втаына U.choler-ae ЙТСС 14035 был выявлен невысокий уровень гомологии - 23%, свидетельствующий о принадлежности этих бактерий к другому роду.

Такии образом, по результатам исследования геномов 2-х штаммов U.meschnikovii 251 и 115, втамм U.jseschnikovii 251 является типичным холерным вибрионом, что соответствует взглядам Гамалеи ( 1888). Происхоядение штамма l'.aeschnikovii 2Ы или 23 ^Турова, Í9?9) моано оспаривать, но в соответствии со взглядами Гамалеи и результатами вавих исследований, а такве е соответствии с. правилами 18 fi глава 3 Международного кодекса номенклатуры бактерий (1978) мы предлагаем в качестзе лектотипа U.aeschnikovii 251 сс свойствами холерных вибрионов классического биотипа; втамм хранится в коллекции Ростовского НИПЧИ. Признание такого таксономического подозвана вибрионов Мечникова позволит исправить допушек-ныб оаибки: ликвидировать вид U.Beschnikovii - индофенолоксвдазо-нвгативных,. лизинсгтрицательных с характеристикой генома по ГЦ-43,2 "¿, и восстановить прежнее описание рода Uibrio.

- 16 -

Обращает на сепя внимание протокол ? заседания подкомитета по таксономии вибрионов от 07.08.S2r., на котором обсуядались трудности, возникшие при составлении точного определения рода üi-brio. Одной из основных причин этих затруднений было включение в род Oibrio оксидазонегативных вибрионов а самостоятельный вид U.meschnikovii. Принимая во внимание факт, что типовой этамм '{CIC 3443 не является вибрионом Мечникова, учитывая широкое распространение в окр5,,:аацей среде аналогичных ему микг- организмов, считаем целесообразным поддержать предложение figa.uul et al., (1983!, 5лохичсй с соавт.,( 1332 ) о выведении If.ieschnikovi i из рода üibrio и создании ноеого рода икдофенолоксидазонегатизных Зактеоий fllterovibrin с типовым видом fllterovibrio "pseudouesch-nikovii" NCTC 6443.

Продолжая критический раэбор классификации вида U.cholerae неооходимо обратить внимание на таксономическое положение и номенклатурное обозначение светящихся вибрионов - tfibrio cholerae biotype aibensis. Первый его представитель был выделен Dunbar в 1893 г. из реки Эльбы как "Uibrionenart aus 1er Elbestrooa". В дальнейшем в определителях бактерий их стали обозначать Uibrio aibensis Lehiann and Nenian, 1836; Microspira aibensis Migula. 1900; Photospiri1ium dunbari (Migula) Miguel and Caabler.1302; üibrio phos^narescens Matzuschita.1902; Spirillum phosphorescent (Matzuschita) Mace,1913; Photobactsriua dunbari (Migula) Ford, 1927. 3 основном во всех определителях, в том числе Sergey's.'.. ■ С 1957,1974,1984) доминирует название соетяшихся вибрионов "U.aibensis" (ai-ben-sis, относящийся к реке Эльбе). Основной отличительный признак этих вибрионов - способность- светиться, которая выявляется при адаптации зрения в темноте в течение 3-5 *ин. Светящиеся вибрионы, выделяли не тэлько от больных, "еибрисноносите-лей.. но л из гидробионтов. водных, объектов внешней среди i Ермольева, 1924; Штуцер, 1929; Чибрякова и соавт.,1373; Адамов и соавт.. 1976; Галъцева и соавт.,1977; Хайтович и соавт..1933 и др.). Следует отметить, что в практических лаборатогчях при-выделении вибрионы не изучаются по Феномену свечения и их идентифицируют-как ü.chci.non 01.. Чтобы идентифицировать V.aibensis необходимо выделенные культуры, засеянные на щелочной агар или в 17. п.в., после культивирования при 35-37®С в течение 15-24 часов, просматривать в темноте.

Светящиеся вибрионы обнарузиёали в скрузащзй прзцз и у ладей, где проводились целенаправленные исследования на территории Сибири и Дальнего Востока, Узбекистана, йзербайдаана, Зкраинн. Молдавии, Дагестана. Крика, с Краснодарском .рае, Астраханской. Ростовской областях, на Урале. 3 период 1972-1992 гг. кдентивици-

ровано более 2000 штаммов. Не выявлено принципиальных различий ненду U.albensis, U.cholerae, U.eltor и U.choi.non 01 по феноти-пическик характеристикам. Установлено, что U.albensis кап к U. chol.non 01 вызыаают спорадические и иногда групповые заболевания, хотя частота вс-речаемости низкая С Ь.У/.-i ,РУ.). В 1970-1872 гг. было выделено 167 штаммов U.albensis, из которых от людей -41 (22%). Особенно-следует отметить, что штаммы от больных били выделены в очагах холеры. (Астрахань, Махачкала, Мданоь). Клини-ксэпидемиологические данные при острых кишечных заболеваниях, вызываемых U.albensis, сходны с данными по U.choi.non 01. Механизм заражения и пути передачи - типичные для кииечных инфекций.

Несмотря на то, что U.albensis выделяет более 100 лет, их TaKC0HCM¡i42Chje положение остается неопределенным, так как предложенный типовой атаим U.albensis НСИВ 41. ЙТСС 14547 по своим характеристикам не соответствует описанию вида U.cholerae. Произошло это по той причине, что Shewan и Ueron в 8-м издании определителя Берги (1974) описали всего лишь один штамм и не сопоставили его признаки с описанными в литературе. Типовой итамм NCMB 41, АТСС 14547 иьеет один и более жгутиков (хотя авторы описали только один), не декарбоксилирует лизин, не ферментирует ааннозу, не образует индол, нитрозоиндоловая реакция отрицательная, гемолизнегативный, не растет в отсутствии натрия. Известно, что подкомитет по таксономии вибрионов принял ревеиие не относить такие бактерии к виду U.cholerae. Поэтому, описанный.штамм не моает быть принят в качестве типового, новые - не предложена.

Результаты кавих исследований свидетельствуют, что штампы U.albensis rio фенотипичаским признака« отличаются от вибрионов других биотипов вида U.cholerae только там, что не агглютинируются холерными саворотками-01 и обладашт феноменом свечения.

Результаты изучения серологических свойств U.albensis указывают на перспективность разработки схемы серологического типк-розаняя, что позволяет совершенствовать идентификациями.albensis. Нами выявлено 1D серсваров U.albensis (02-09,011-012) с типовыми втамаами .7402, 7401, 6373, 9504, 3510, 9506, 9499, 10034, 10035, 10188, соответственно. Среди зтаимов, выделенных-на территории Азербайджана выявлено еще 5 новых сероваров. Лтаамы переданы в институт "Микроб" для подтверждения "оригинальных" свойств и депонирования. Агглютинирующими сыворотками типируется 37-517. итаккоЕ, выделенных в разные годы. Анализ результатов серотипи-рования показывает, что в различных регионах циркулируют U.albensis различных сероваров. При зтоа наблюдается смена сероваров U.albensis fio годам. На территории Молдавии мы выявляли U.albensis сероааров 01,02,ОБ,0.' ,08,09,011,012,013. Серавар -0.13 с типо-

вым пгтаммов U.albensis 14083 выделен специалистами Крымской ПЧС, а серавар 01 Адамовым с соавт.С 1976). В Ростовской области среди U.albensis. выделенных в период 1974-1978 гг. обнаружены серова-ры 01.02.Об.07,011,012,03,05.

Среди штаммов, выделенных в 70-- годы в Астраханской области. Дагестане выявляли U.albensis 02.04,06,07 сероваров. Из 157 штаммов профилировалось сывороткой к 'J.albensis "1299"-67. что составляет 377. и из :оллекции 430 атамиов - 6.5У.. 8 ? поронской области обнаружены серовары 02.04,010,011, в Севастополе - 02, 05: з Днепропетровской области - 011; в Херсонской - 05. Среди штаммов, выделенных на Урале, заявлены представители 03,06,08, 011.012 сероЕаров. При использовании метода серотипирования сыворотками к типовым штаммам U.albensis 01-012 сероваров в коллекции из 764 штаммов U.chol.non 0! протипкровано 92, что составило 10.92, при этом у 1,3% штаммов выявлен феномен св°чения. В коллекции штаммов U.chol.non 01.выделенных на территории Северного Кавказа и Азербайджана из 321 штамма протипировалось сыворотками к U.albensis 21Z. Из 374 штаммов, выделенных в различных регионах страны протипировалось 267. и из 78, выделенных на Урале, протипировалось 23%. Из полученных результатов-следует, что к U.chol.non 01 нередко относят штаммы U-.albensis с утраченной или слабой пункцией свечения. Нами выявлено антигенное родство менду штаммами U.albensis и сероварами U.chol.non 01 коллекции •Sakazaki. 06,08,09,018,038 и 039.

Полученные результаты показывают, что использование методов серологической'идентификации более перспективно, чем определение феномена свечения. Серотипирозакие поззоляет идентифицировать кэ только типичные U.albensis, но и с утраченной функцией свечения, котсрые, как правило, идентифицируют как ü.choi.'npn 01.

Анализ'результатов исследований указывает на тесную связь . U.albensis и U.chol.non 01. С цельв уточнения таксономического полояення U.albensis и подтЕеркдения родства с представителями U.cholerae изучили нуклеотрный состав ДНК а гэовели молекулар-нуа гибридизация ДНК-ДНК штаммов U.albensis 01—012 сероваров, штаклов U.cholerae 01 и U.chol.non 01 из коллекции SakazakiCАТСС 14035, NCTC 4515 - 03 серовара).

Из таблицы 2 видна, что нуклеотидный состав штаммов U.albensis составляет 47-48,62 ГЦ, то естьл ^ГЦ=1-1,6. Представители 010 ее-розара еыяблли S3Z ГЦ и, следовательно, штамм 3515 не хсяет относиться к виду U.cholerae. Использование метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК позволило установить зЕсокуя стопень сходства геномов U.albsnsis и U.cholerae С1 tftTCC 14С~5), гомология которых 01-837. и. с U.chJi.non С1 СНСТС 4715). гомология которых ?2-[

- JJ -

Таблица 2

Нукдеотилнын состав к иолекулярная гибридизация ДНК-ДНК сероеаров V - а 1bensis

Серс.ьари V.a Ibensis NN йггакиоЁ К Гсшрлот-ия ДНК штаякоЕ (б % *>

V-cholerae АТСС 14035 V.chcl - non "Ч ЫЦТС 4711 V « а 1 bens i s 9499(08)

0*. 474 47,0 88,0 100,0

02 7402 37,0 " 83,0 93,0 95,0

03 7401 10Û.0

04 6377 lé;? - 100,0 100,0

05 9509 47,5 79,0 71 ,0

Об 9510 48,0 81 ,0" 94,0 100,0

07 9506 47,4 ai ,о 71 ,0 100,0

08 9499 47,4 82,0 86,0 Iö0,0

09 10034 47,7 72,0 100,0

010 9515 63,0 «е определяли юо,о

Oll 1O035 47,1 • 79,0

012 10188 47,7 100,0 100,0

10ÛZ. Высокая :тепень гомологии (71-100%) выявлена в пределах биотипа V.albensis различных серовароЕ. Эти показатели свидетельствуют о геномной родстве на уровне вида U.cholerae всех его представителей, в том числе и биотипа U.albensis.

По результатам исследований считаем необходимым изменить описание биотипа albensis в соответствии с описанием Есех представителей вида U.cholerae, то есть, U.albensis - это полярные монотрихи, индофенолоксидазоподонительние, 1 и П групп Хейберга, декарбоксилируацие лизин.

.Б качестве иеотипа предлагается включить' в мездународные коллекции Етамм 0.albensis 7402 с соответствувщим описанием его свойств. Следует отметить, что в микробиологической практике только в навей стране проведен саный больвой объем исследований на коллекции втамнов 13.albensis. .

Таким образом, на основании генотапических и ¡ренотипи-чгских характеристик в соответствии с правилами и принципами Номенклатурного Кодекса бактерий (1978) по результатам анализа данных литературы и материалов собственных исследований предлагаем следующую классифнкацис вида U.cholerae: вид U.cholerae Pacini 1854. биовары U.cholerae cholerae (Pacini 1854)

L'.cholerae eltor (Pribrass 1919) U.cholerae finkierprior (Finkler und Prior 1984) . с неотиповым атам.мом V.finklerprior 15(02-082-0139.. .сероваров )

U.cholerae albensis (öunbar 1893 1 с неотиповым штаммом U.albensis 7402( 01-013 и др.сероваров) и лектотип U.Eetschnikovil Êacalela I860 свтамм 251).

2.2. ЕиолЕМинесцснциа светачихся вибрионов вида U.cholerae. Как отмечаат Чумакова и Гиуельзон (1975) светящиеся бактерии, стояние Hi: разных ступенях эволюционной легтницн. имевт одинаковую природу свечения. 5 ос'лоь-с биолюминесценции все:-; бактерий ле-

вит ферментативная химическая реакция, сопровоядаацаяся излучением квантоз видимого сзета. определяемого физическими методами. По классификации Непаг1е <?1 а!..(197') эсе светящиеся бактерии были отнесены к :ем.и;Ьг1оп.аеэае оодам РЬо^оЬассегила, 1ис1Ьа^е-г!иа и пресноводный вид светящихся бактерии к роду 1ЛЬг1о. Если сравнить их генотипичэские характеристики, то для У.Г1зЬег1 ГЦ в пределах 39-40.5 мольХ. Рпо1оЬас1ег¿иа рИозрИогеиз 41,2-41,8 моль/:, РЬо^Ьае1ег1и1! ЫодпаШ 42,8-43,«%, и.(шгуеу^ 45.045,9% и был олпсзн только один представитель и.аЗпепз1з (Наз-

Гц которсгс 47,8 моль?., по в результате реклассифи-' нации и.Пгпег! и У.Ьзг'.'еуг. и. зр 1 еп Л1 с!из и и. 2 оде £. излучапцих голубовато-зеленоватый свет отнесли к роду 1>1Ьг1о.

оиолЕмннесцентные реакции этих микроорганизмов представляют особый класс хемилвминесцекткых реакций, отллчанцихса тем. что реакции катзлнзируатся ферментом лицкферазой. Продуктов являются свзтовые кванты в видимом спектре сзета. Это свойство создает ■ удобный способ контроля за ходом реакции путзм регистрации интенсивности излучаемой эмиссии. Если в реакции не участзует лвцифз-раза, хемилзминесценция, как правило, имеет крайне низкую эффективность. .Фермент лвцифераза катализирует окисление «убстрата лнь-циферина с выделением большого количества энецгии (40-80 ккал/ * моль), которая переводит промезуточный продукт реакции, в возбужденное состояние. Термины люциферин к лицифераза употреблявт как 'функциональное понятие безотносительно к химической структуре этих веществ. Субстратами бактериальной лвциферазы авляатся МЙБЙ.РУЙН..Они слуаат основой широкого применения бактериальной лЕциферазы в аналитических целях. Сродство лсциферазы с субстратами высоко и обусловливает высокун чувствительность и избирательность биолвминесцентного анализа, й 197Э году была предложена гипотеза-,' которая конкретизирует строение лвциферазы как цито-хронной монооксигеназы. Согласно этой модели (Данилов,1979) лв-' цифераза сложный трехчонпонентный комплекс, содерващий флазопро-теид, аелезссодерхаций бел^ и цитохром 450, Е¿ктериальнаа лаци-фераза катализирует светоизлучакцуЕ реакции окисления ©лавин-мо- ■ нонуклеотида (РйН^) и длинноцепочечнах (С/д-С/^.) алифатических альдегидов (ИСНОкислородоа воздуха. По классической схеме реакция идет з два этапа: . '{йОРН + Г!1.Я- + Н окидоредтч'ктаза НйРР + РМЙг ?&Ж1 + КСНО 4- 0? лвцифесзза гКЙ + -ШМН +■ Н20' + сват 4ля научных и приклг. .ных целей применяются ферментные прэяаоата, . содеггадне зместэ с ляцифзразной ¡1 С40(рЗг1:гКН-оксиредукт<:зкун1 активноегь. Ксррзктис? определение такой системы ?5ЯФС*- - бизяп-• зерменткз.ч с ¡-стека ми лш;иферин-лваи?еразныЛ нот—7

леке. Чаше зт-а система называется просто лвциферазой. При небольших межвидовых различиях лицифераза представляет собой гетероди-мер с молекулярной массой 80000 и состоит из £>s и ¿3 единии с МН 42000 il 3B00Û. Активный центр фермента локализован в ос -субъединице. Раздельно субъединицы неактивны. Успешно ресаится вопросы приборного обеспечения биолюминесцентного анализа путем автоматизации процессов измерения без программ и с программами для обработки результатов измерений с последующим вводом в ЭВМ (.LKB 1250 . 1251 и др.).

С цельв изучения люминесценции у U.aibensis использовали типовые итаммк, а такве около 500 штаммов.выделенных из объектов внешней среды. . -

Светящиеся вибрионы культивировали на ккдких и плотных питательных средах, используемых при диагностике холеры. Отмечали феномен лшминесценции, а затем отбирали штаммы с интенсивной люминесценцией, слабой и "темновие", т.е. lus+ и lue-. Культивирование этих штаммов продолгалк ка синтетических средах разного состава с добавлением солей магния, железа, глицерина, бактопептона, различных аминокислот (аспарагин, пролин, аргинин, глутамин, фе-нилаланин и др.), фенобарбитала, использовали перекись водорода при учете люминесценции и другие индукторы или ингибиторы свечения. Анализ результатов исследования показывает, что лвминесцен-ция у итаммов U.aibensis учитывается как б еидких так и на плотных питательных средах (1 У. п.в.. МПБ, ¡ЗА, МПА, среды с желтком и другие) визуально в период.накопления бакмассы (суммарные импульсы света). Это соответствует стационарной фазе роста. Изолированные колонии светятся лучое по периферии, 6 центре наблюдается га-пение свечения. Доказано, что люминесценция - это функция живых клеток. При добавлении в период люминесценции в жидкую среду перекиси водорода отмечается "всплеск'' свечения с последующим угасанием. L-опытах количество люциферазы не изменилось, а уменьшение свечения можно объяснить тем, что при добавлении перекиси водорода кенявтея окислительно-восстановительные процессы в среде к скигается скорость поступления суостратов в люминесцентную систему. Кроме того, идет реакция смешанной ферментной системы, когда проявляется активность не только лнциферазк, но и кзталазы, происходит увеличение концентрации кислорода, который 'оказывает на клетки бактерицидное действие. В период культивирования при обильной аэрации на полноценных средах интенсивнее светится пленка, в которой наибольшее количество аиьы:: клеток. Установлено фо-тоингибируащве действие света на люминесцентную систему вибрионов. Отмечено ослабление люминесценции на Средах с Пенициллином вплоть до полного гапения.*В иазках при ыикрос.копиробании обнару-

вивали большое количество сферопластов и протопластов. При пасса-яах У.г1£»епз1з с яакициллиновых сред ка полноценных - Функция свечения восстанавливается. Учитывая упроаз.чнув схему даминесцен-тной системы, мехно считать, что и у У.а1Ьвп515 ген. детвсйини- • руечий лвыи.чесценпию, локализован в цитопдазматической аемсоане.

Фанпбаобитал является индуктором монооксигеназ высзих организмов. бактгрии, др<з«з8й'С¿гнилоа,1383). Однако, нами получена противоречивые результаты у различных штаммов и.а1Ьеп£'.з. У нека-тосых штаммов узе через 6 часов набкацали лааинесц^нцив. у других - через 12-!8 часов и солее интенсивную з сравнении с контролем. При повышении-концентрации фенобарбитала С Ю'^-Ю"^ Ч) свечения утрачивалось за счет ингибиции роста зибрионов. При добавлении аргинина и пролина з V/. п.з, отмечали увеличение свечения з сравнении с контролем и уменьшение свечения при добавлении фекил-аланмна. Однако, результаты исследований не всегда воспроизводились. Это говорит о том, что в процессе культивирования У.а1Ьеп-Э1'з очень трудно определить влияние индукторов яонооксигэназ, т.к. неизвестно и невозмояно быяснить, какие продукта метаболизма и.а1Ьепз15 являвтсз аутоинзукторами. от которых, з основной, и зависит Функция свечения зибрионов при культивировании. Отаече- . но, что биосинтез лвциферазн начинается на сразу после засеза ви-. брионов а полноценные питательные среды. Время начала биосинтеза фермента и учета.биолюминесценции не коррелирует с фазами ростз популяции вибрионов, но зависит от состава среды.- Иногда чэрез 4-5 часов можно зарегистрировать свечение в зидких средах и нельзя, через 8-12 часов на плотных-средах, Бозмояно,; когда/клетки не светятся, образуется и накапливается з сре-де-метаболит, являвшийся индуктором лвцифераэы, зозмоано, что' аутоинауктрр днффундяру-зт з толщу среды и необходимо §ольэе времени'.' чтобы, заработала люминесцентная система, вибрионов. Считают,.что аутоиндуктор -это низкомолекулярное вещество-неизвестной природы.'.К соавриеачс на- -понятна полная, утрата свечения ятаммааи- и>аЦЬеп51з-й-невозаоа-.. ность восстановления этой 'функции независимо от -моделирования условий культивирования. Для регистрации квантов света: и выделения лвцифераэы ззяли зтазаы. и.аНЬёпзгз 10133 и -.22312,. которые про- -. являли очень яркое свечение й-темноте. • ...

Определили кривда бноламинвеценции во вренени для-данных -штаммов. Как гшазило, при инокуляции бактерий ъ свеауи питатель- ; муз сведу синтез лвии®евазы, а-зкесте с ним и свечения прекраза- . зтея и возобновляете0 только после, достижения-культурой опрене.-.-ленного коэффициента зкстзкции, характерного для яалдого «таима.-Кривая развития биолЕниь'есиениия при зцргщиз_нин вгаммез. на. дан--ннх средах оказалась различней. Определение вели .на ляииноаехре-с

1.КВ-1250. На бульоне Мартена почти у всех изучаемых штаммов был длинный латентный период свечения, чего ке наблюдалось при выра-ииваник -на IX п.в. Вероятно, в бульоне Мартена содержится ингибитор люминесцентной системы, а в 17. п.в. отсутствовал. Могно считать, что лвцифераза является индуцибельным ферментом, который появляется после накопления'в среде аутоиндуктора. Но у некоторых штаммов и.а!Ьеп5»5 латентный период свечения как на V/. п.в., ■так и на бульоне Мартена отсутствовал. То есть не всегда синтез лициферазы зависит от аутоиндуктора. Свечение регистрируется практически сразу хе после инокуляции культуры в среды; отдельные втаммы, вероятно, обладаит конститутивным ферментом (1ие+). Сам факт существования таких вариантов доказывает, что .в клетках имеется и репре:сор лициферазной активности.

Отмечено, что аутоиндуктор и репрессор синтеза люциферазы не оказывает никакого влияния на^скорость роста светящихся бактерий. Они связаны специфически только с яшинесцентной системой. Для выделения белка, смытую культуру и.а1Ьеп515 центрифугировали, десуспендировали в дистиллированной воде, однократно замораживали и оттаивали при ~1701>С, с последующим разрувеиием на Х-прессе и НЗДП-2Г с частотой 22 КГЦ трииды по 40 -секунд. Измеряли фоновую активность суммарного белка 168 вн по белку 86 икг, определенного по Брудфорд. После осаждения сульфатом аммония сохранилось ливь 6-?Х активности от начальной. При ионнообменной хроматографии на ШшМшап де-52 лвцифераза злиировалась линейным градиентом КС1 и сходила с колонки при 0,22 И КС1. После гель-фильтрации лвциферазная активность проявлялась в нисходящем плече первого пика и составила 110 ву - по белке 14 икг.'(рис,).

>>ас- Брофшъ звцш £алка У.а1Ьепг)в 22312 к активности „лцифсразы

йсследоьания проводили при комнатной температуре в фосфатном к трис-НС1 буфере при рН-7,0, в интервале времени 20-30 се-

¿¿•РР

; - 24 -

кунд. Все реагенты реакции хранили в темноте и работу на приборе вели в условиях защиты от солнечного света. Растворяли 1 мг дека-наля в 0,5 мл изопропанола. Для (ШРН испсльзоЕали фосфатный буфер 0,1 М рН-7,0. К раствору лицисресазного белка (53; 23; 14мкг) в дистиллированной воде (20 мкл) добавляли 20 мкл раствора дека-наля, 20 мкл FMN. К NADH или HflDPH добавляли 5 нл дистиллированной зоды, тщательно перемешивали. При этом концентрация KADi р ЗН составляла 5-10 5М. То время опытов стандарт NAQPH хртнили на льду. После добавления каждого реагента измеряли .иу) световой поток. Соотношение NflDPH к ферментному белку 1:1 (20 мкл). На счетчике учитывали показатели. Принтер выписывал результаты высвечивания в динамике з nU.

При использовании ингибиторов реакции наблпдали гаиение биолюминесценции. Расчет активности ингибитора осуществляется с использованием калибровочнсй кривой "концентрация - остаточная активность". В опытах с экстрактами атаммов U.aibensis кинетика, эмиссии света представляет собой нарастающую крквуя, выходящую на стационарный уровень. При добавлении субстрата в результате взаимодействия с ферментной системой наблюдается "всплеск" с последующим затуханием свечения в результате окисления^ субстрата кислородом воздуха. Так, если для штамма-U.aibensis 10188 joho-вое свечение через 4 часа культивирования з 1% п.в. 1,2/11 aU, на бульоне Мартена 0,1/01. бульоне Хотткнгера 0.4/14-, в ИПБ .2,5/35, казеиновом бульоне. 1,3/15,3 (первая цифра - Фон» через дробь - после инициации субстратом). К 24 часам культивирования ,'. на этих зе'средах, фоновое свечение и с инициацией составляло 9^4/41,4-13,9/71,6-3-,7/13.3-1,1/11,7-3,5/10,5. Слабое свечение ; . было на сахарных предах и не. регистрировалось на соленых и 1злч— них. Следует отметить, что выявлены различный, кйиетические профили у штаммов.различных сероткпоЕ,-Отмечена.линейная зависимость' максимума биолимннесцентного-стяета от-концентрации субстрата. (10Е-10Е®Ч) в' определенный отрезок времени- .., .'•

йнализ результатов исследований показал; что люминесценция \ U.aibensis моает быть имеет значение для биологии и экодо'гйи1' • , :< све/лщихса бактерий. Для самих. U.aibensis этот феномен.не имеет^ . вааного функционального значения, ке является четким таксонами- ,," ческим признаком и не-имеет значения дла. зтглдеаиалогий' 0КЧ. , ^ U.aibensis являвтея-перспективной моделья,. в- основяог, для бко-• лояинесцентного анализа,. - . " ;

иыявлены гиперпподуценты феркента лицифгрс^и из.-гппозах . . штаммов U.albonsis. йетоды зкделени^ фйрйента-лпц:1фераз1Г.рпзраб1: таны и общедоступны. Для автоматизации лечин.метрических' метпдов представляется пзссаектизныа стабилизировать-екдглгниуь,

bensis лицифецазу путем связывания с белками или твердыни носителями. На модели ü.albensis, с использованием люциферин-лшифераз-ного комплекса коено будет решать вопросы не только по кинетике лсцифзразной активности етэммое различного происхождения, получать не только физико-химические характеристики г того фермента, но и ввеэть некоторые вопросы вирулентности и токскгенности возбудителей OQli, изучать в динамике функцию клеток при продуцировании метаболитов, изучать стимуляторы или ингибиторы полезных признаков микробных клеток. Яркая экспрессия гена лициферазы делает U.albensis удобным объектов генетических к инженерно-генетичес- . ких исследований. Этот ген буквально говорит о себе языком света и множество заключений при остроумной постановке опытов может оыть сделано б=.з применения какого-либо инструмента, т.к. свечение видно невооруженным глазом.

2.3. 1&аги U.albensis. Фаговые методы идентификации, дифференциации двух биоваооЕ- холеры используктся и для диагностики атипичных штанмоБ при определении степени их вирулентности и для ткпирования мтакмоЕ, выделенных из различных экосистем. С теоретических позиций фаги характеризуют генотип и фенотип своего хозяина и по диапазону литической активности выявляет ктаимо-вые различия в пределах вида и биотипа (Быстрый, 1.974: Остроумова, 1981), Успеэный опыт фагодиагностикк холерных вибрионов, а также использование-ЯД© и ТЗПБ для U.chol.non 01 указывает на перспективность фагодиагностики и U.albensis (Коровника.1966).

Целенаправленный поиск лизогеннкх культур, носителей фагов U.albensis, проводили при изучении, коллекции из 516 ктаммов ойще-принятыми методами с использованием хлзроформатов. Б результате было обнарукено 30.индикаторных культур и выделен фаг из 51 итам-ка (phagus Uibrionis albensisi) при посеве в -двухслойном агаре у оагов 51 расы отмечен полиморфизм негативных колоний; различия выявлены по форме, прозрачности и величине (от очечных до 1,32,0 мм ъ диаметре). Ври изучении фагов с помоеье электронной микроскопии установлена их принадлежность к 3, 4. мороогруппе по Ти-хоненко (табл. 3). В некоторых препаратах обнаружены нитчатые, не идентифициооранные неыкг-формы. По данным Кудряковок и соавт. (1331) нитчатые фаги .U.albensis относятся кморфогруппе.

. Фаги U.albensis хорошо репоодуцкр.овались при культивировании штаммов в бульоне Мартена СрН 7,7-7,В), При посевной дозе П'Ю^иа мл и множественности инфекции 7.-11 через 5-6 часов инкубации пои 3?еС накапливалось б*105 -5-10^ вирионов. Латентный период, для многих фагов-был 20-30 минут. Среднее число негативных колоний & течение латентного пеокода составляло 83-25. Период нарастания фаговых корпускул составлял 37-45 минут, среднее число'

Таблнча 3

Результаты электронно-пккроскопичесйсст-о исследования iaros V-ai Ъепзis

Фаги V.aiben-sie Морф rrr р un пы по Тнхонекко Разяеры в ня и характеристика

Капсид Отросток

. 41 3 75 X 95 округлой фаркыч вытянутый с Оаков 50 i 22 керопенй ) несократаэд- ЧИИСЯ

251 4 B1 I % неправильная, округлом 1>Ор1*Ъ1 105 длинный н. DOKpawa»- 14НЙСЯ

260 3 63 правильной,округ-леи Фарта 19,5 короткий

344 4 91 I 52 ияеет т-ексого-нальнтло форич 116 длинный 9 несокрашаю— щийся

фаговых частиц после окончания периода роста било 28-33, концентрация фаговых частиц достигала 2800-3100. Чооаайность'больаинст-ва фагов составила 27-41 корпускулу. Изучение спектра литическо-го действия выделенных фагов 51 расы показало их специфичность з отноаении штаммов U.albensis. но не-выявлен избирательный лизис штаммов какого-либо определенного свровара. Специфичность фагов подтверадена отсутствием лизиса при использовании итаммов других таксономических групп сем. Vibrionaceae и Enterobacfarlaceae.

С цель" получения очищенных концентрированных препаратов для фагодиагностики, длз иммунизации-животных и-получения антифаговых сывороток,' для. выявления структур антигенной специфичности изучили белковый спектр на осноЕЗ.хроматограшических и электрофо-ретических-методов фракционирования фагового лиза7а. Б работе использовали ааги стерилизованные мёртиолатом натрии при 3-х часовой экспозиции в разведении дс 1:10000.. В качестве носителя для разделения компонентов фагового лизата апробировано мелкопорис- ■-тсе стекло СйПС)- Очистку фагов на '¿ПС проводили в.объеме с по-следуищей фильтрацией материала через ниллипоровнв фильтры (0.45 мкм). ,При элдцйи трис-Н-хлор буфером рН 7,4 и рН. 7,4.с Q.SSX sa--трия хлорида в процессе адсорбции -дисорбции составляЕКих-.фаго-вого дизата.выделены три п^обь. Для определения: белкового спектра -.ЛЕатов проведен, электрофорез в ПЙПГ с DDS.B качестве конгро-ла гомогенности фаговых элиатов использовали Л1 ,аты индикаторных кьльтур, 'инактивйроьаннах такае иертиолатом натрия,, йелекулярнуа массу проявленных на злектрсфореграыие: белксв, определяли по калибровочной кривой, построенной д^я белкоя с известной молекулярной кассой и экспериментально, установленной относительной: элект-]' рофорйтичег.каЛ-подвуяностьа (ОЗСЮ.^В качестве маркера? брали овальбуаиь. - 43 кД. альбумин - 67 кд, ганма- лобулин человека--. 150 кД, траксфзрршг -- 77' кД„ протеин - 2S. хД» : ■'.--''/ ■

1 чект; песретичвскр* ввяаяей» .иадп&икд^ям^.^е-'-:

нтичные белковые линии фагов во втором и третьем злюате. Характерно, что иелковые спектры фагов 2 к 3-го злшата специфичны как по набора белков, так к по их характеристике. К примеру. ОЭФП полипептидов фага 251 (индикаторный штамм U.albensis 1078) лежит в интервале значений 0,45-0,72, что соответствует молекулярной массе 67600-47500, в от.пичие от фага 261 (индикаторный штамм 1028 ), для которого, диапазон подвивности белковых компонентов составля- , ет 0,58-0,78 и соответствует молекулярной массе 53700-28900. При сравнительном электрофоретическок анализе вести фагов отмечено, что каЕДЫй кз них имел индивидуальные белковые спектры (детерминанты), которые определяли их специфическую литическув активность.

Анализ результатов исследования показал, что хроыатографиче-ские матрицы могут быть использованы для очистки и концентрации бактериофагов. Изучение белковых спектров позволяет выявить белковые детерминанты литической активности не только у фагов различных морфогрупп, но и в пределах одной морфогруппы. Для иммунизации использовали 2 и 3-й злюаты шести фагов с концентрацией корпускул 1.105-10« Активность сывороток проверяли в РНФ (1:801:160) и РИД (1:64-1:128). Выявлены антитела к гомологичным и родственным в серологическом стновении фагам U.albensis.

Исследователями (Остроумова и соаЕТ. ,1378,1.984.; Голковский и соавт.,1983; Ганин и соавт.,1983; Кудрякова и соавт.;1988 и др.) -показано значение фагов U.chol.non 01 для целей таксономии и выявления генетического родства между отдельными серогруппами. Нами лизогеннне втаымы среди U.albensis обнарувены в 5,0-11,07..-.ДДФ, составленный из монофагов (78,32„Х11,182/154) лизирует 100% втаммов U.chol.01, U.albensis,98% - U.eltor,82%, .U.chol.non 0.1. По нагим данным ДДФ не лизирует до 12-18% U.albensis и U.chol. .non 01. Эти результаты свидетельствуют о том, что некоторые холерные фаги адсорбируется и размнокавтея на штаммах U.albensis. Нами выявлено, что к некоторым фагам U.albensis проявляют чувствительность отдельные штаммы U.ckolerae (Т-2), U.eltor С.Р—6532 и 4 .втаака из 40, а такас до 182 втааиов U.chol.non 01. Некоторые втаммы U.albensis проявляли чувствительность к цельному диагностическому холерному фагу "С" (втамм 1159 лизировался до ДРТ-3), к фагу зльтор чувствительны U.albensis до 7/3% и до 2,6% U.chol. non 01; единичные втаммн были чувствительны к ХДФ-3,4; U.albensis как-и U.chol.non 01 проявляет чувствительность к ХДФ5 (25,2-H4,3Z, соответственно),, который, как известно, используется для выявления вероховатнх или измененных вариантов холерных -зибрио-лов. Все данные свидетельствуют в пользу генетической близости специфических-антигенов, выполнявших функции фаговых рецепторов

- 28 -

у фагасенсибельных итоммав вида U.choierae.

Следует отметить, что к ттдельнич фагдн Т311В С Быстрый и со-азт.,1984) были чувствительны не только U.chol.non 01 (74,fi?.';. Из коллекции U.albensis до 31.8% атаммо^ были чузствительны к фагу ТЭП5-1.2,3,4,7, в том числе около [?'/. к шап; ГЭЛВ-5. Следовательно данные по фагочувствительности пор.тверядаит высокуа степень генетического родства представителей вида U.cholerae и позболявт рекомендовать с цельв совершенствования диагностики диарейных за-болезаний конструироьание диагностических препаратов , тя выявления и идентификации ке только U.cholerae чЛ, U.ctKl.non 01, но и U.albensis, Перспективно создание насора диагностических альбен-зис фагов (ДйФ).

2.4. Пигментогенез холерных и вибрионов других таксонов. С давних времен известна способность многих микроорганизмов продуцировать пигменты различных цветов и оттенков. Меланины занимают особое положение по способу синтеза, по структуре и по свойствам. йелсниногенез - явление общабиологическое. Мелаии.ны -от свз-тло-коричневого до почти черного (от греческого Mêlas - черный) встречаются у организмов всех филогенетических уровней и является очень распространенными пигментами. Появление .пигмента в культурах вибрионов отмечали Carbone (19Û7), Гооовиц (1911). Околов (1923), Котельников (1932), Коробкова (1953), Уартиневский и со-авт.('9?3), йауаяина и соавт. ( 1975), Гальцеза и соавт'. ,1979; Ку-дрякова и соавт.( 1932). Однако условия образования пигментов не были изучены,-0 бактериальных меланинах известно, что возникавi ■они как ответ на введение э среду тирозина или тирозннсодерзащих белков. При этом образуются внутриклеточные или внеклетичные пигменты - так называемая "тирозиназная реакция", рассматриваема? . • как результат окисления тирозина,.свободного или связанного, в пептидных цепях, энзимой тирозиназой. В пигментробразованки зк-тиномицетов принимает участие « лакказа.' Оба. эти--фермента яблчзт-ся Си-оксицазой. фенолазнм о типа действия, не'ланказу легко отличить.от -тирозиназы по субстратной "специфичности-( Küster,i955 ).

Многие исследователи рассматривают меланины как высокомолекулярные полимеры, которые образуатся при энзииатическом.окислении не только тирозина, но^и 314. диоксифек&паланича ( ДОСЙпирокатехин*. 5.G диоксииндо.ш и других "меланогенных" субстратов (Ля;.,1930). Клмчеваии моментами синтеза, яеляэтся окисление тирс-зина в дОФА и-восстановление ДОФД в дофа-хинон а затем окислительная полимеризация индол-5,Ё-хинона в меланин. Полагагг, ч.тс промежуточны« продуктом неяет быть ДЗФй, связанный с; энзимом; Тк-розиназа соаыр'аенно необходима для пеозых двух .этапов меланогеке-за. остальных реакциях она действует" как катализатор» реакции : идут спонтанно. Ген тичеекп обусловленная способность збразозы-

- 23 - :" ~ '

вать тирозиназу и меланиновые пигменты у бактерий довольно устойчива, ко дла ее выявления нужны определенные условия. Отмечены большие штаммовые различия по этому признаку и значительное модифицирующее влияние факторов среды. О роли меланинов (и тирозина-зы) в аизни самих бактерий пока ут.вергдать что-тибо аргументировано трудно. Иногда образование клеточных меланинов представляется связанным с "дг,градационным метаболизмом", например, при старении культуры. В некоторых случаях синтез пигментов осуществляв ется как реакция дгтоксикации фенолов,присутствующих в среде или возникающих в результате измененного метаболизма внутри клетки. Предположение об антибиотической функции некоторых меланинов оспаривается. На грибках определена зацита клеток от электромагнитных излачени^. Нирчик с соавт.(1970) указываит на фотопротектор-нуи функцию меланинов, т.е. защиту клеток от повышенной радиации (ультрафиолетовой, световой, тепловой, кокизирувщей). Несомненный интерес представляют свободнорадикальные свойства меланинов. Лях (1970 ) показала, что меланины Radsoniella nigra обеспечивает защиту ктеток от экстремальных окислительных и восстановительных условий, которые в противном случае генерируют в клетках свободные радикалы, способные наруиать их нормальный метаболизм.

Изучение тирозиназы и . меланинов вибрионов имеет не только теоретическое, но и практическое значение для улучиения лабораторных методов исследования, так как.едё в 70-80 годы пигментообра-эувчие колонии не отбирали для изучения, поскольку во всех определителях микробов и методических материалах по проблеме "холера" указывалось,-что вибрионы пигменты не синтезируют. Нами пигменто-образувцие штаммы вибрионов были выявлены в результате спонтанных мутаций Cü.eltcr 9183,9313,9207,2679,9254,-3119,2044,5879, 9832, U.albensis 3891.1426, U.alginolytlcus 143,375,629,764,651 , 48? и U.parahaeBolyticus 886,723), индуцированных мутаций под действием пенициллина, налидиксовой кислоты, НИМ (U.chol.145,569, U.ch.non 01 - 10511,9832). В опытах при изучении состава популяций беспигкентннхвтаммов ü.eltor 6691 и 8556 методом реплик колонии переносились на агар Мартена со стрептомицином и инкубировались при 37еС. Через четверо суток появились пигментные колонии. Выделены пигментообразуадие итаамы от больных и вибрионоси-телей, а такне из обгектов внешней среды. Пигментированные куль-тщ>н вибрионов выделяли от кроликов, зараиенных беспигментными иакмаки в желчный пузырь. При сравнительном изучении пигменто-образув^их и беспигнентных втаммов вибрионов не выявлено различий по основным признакам. Обработка данных экспериментального материала показала, что кривая роста численности пигментообразу-«ших втамиов в сравнении.с беспигменткыми соответствовала обце-

; -зо-

принятык представлениям о развитии микробной популяции в зидких питательных средах.

При злектронномикроскопическом ;;сследоаании морфологии клеток вибрионов беспигнентного и пигментного лтаммов выявлено, что популяция беспигкентных клеток характеризуется по мере "старения" культуры полиморфизмом по величине и форме, но в пределах общеизвестных. 3 популяции пигменто'Эбразупших зи.1риочоз обнаруяиваятся не только обычные пр.,аые или изогнутые, короткие или длинные палочки, зстречаитса делящиеся клетки путем перетяни, а такяе "экзотические" формы: колбообразные, длинные нити, осколочные обрывки и т.д. Эта форма клеток, вероятно, появляется вследствие внутриклеточного накопления пигмента на различных стадиях, роста. Отмечено, что плгчзнт легко диффундирует в культуральнуш среду. По результатам зысезаемости пигментных и беспигментных вариантов зи-дно, что пигмент не является летальным агентом для клеток.

Сравнительное изучение ультраструктуры пигментообразушвих. зтаммев показало, что клетки все деформированы как продольно, так и поперечно срезанные, впечатление, что они пустые. Нигде не определяются гранулы или какие-либо пигментные образования, вероятно, вследствие низкой электронной плотности самого пигмента. Четко видны нередко рыхлая клеточная стенка и цитоплазмагическая мембрана. 3 цитоплазме у части клеток нуклеоид обычный, у част" -гранулированный или фрагментированный. В пигмзнтных клетках чаще встречается гомогенное уплотнений, чем в обычных. Четко Еыражён полиморфизм. Располояение нуклеоида центральное. 3 четырехсуточ-ной культуре клетки еце более деформирована, почти асе они или "пустые", или переполнены "незидямыа" пигментом^ Сегментирование нуклеоидов вырагено не очень четка. Отмечается стслаизаниз и истончение клеточной стенки такяе как и у беспигаентных вариантов.

Прк. изучении тирозкназнай активности и синтеза пигмента- отмечено модйфицчруадзе влияние сред, температуры, значений рй. Зыблены индукторы и ингибитора пигмектообраэования. Отмечено сти-¡аулирулдее влияние солнечного, света. Тирозина?чая активность и пигмент появляется у активно расТуцих клеток в аэробных условиях..

Пигмент выделяли в результате щелочной, кислотной экстракции и оеаядешш ацетонов из культуралъной аидкь^ти вибрионов л идентифицировали по общепринятых тестам СЛях,1£6Я;' Методические указания по. Ецнпленич и изучении пигмептообразув^их еибрионой. ¡394) .

Нами проведен с-ектргльняй анализ на лотзнетрлческой си:.-;-' мй "$иИн-Тс5р5'оп 4.05" и выпалены различия у меланиноз, еккт??;: ■•.;--емнх Ейбриснга^ г сравнении. с аеланинг&и, пс.,ученкыаи-1и и!гг при ?ермв!»тати2й05£ акледзчии- ДСФА а дкапазоне сгектрз 'ЬЗО-на.--'

Идентифицированы мономерные единицы, которые характерны для различных классов меланинов (Нагорный и соавт.,1994). Перспективно дальнейвае изучение меланинов, синтезируемых вибрионами.

Нами разработан экспресс-метод определения tye-активности (Нагорный,1993) с использованием специфического субстрата тирозиназы L-ДОФА у большого количества штаммов в течение 1-1,5 часов.

Для выявления tye-активности и способности вибрионов к пиг-ментообразованивз нами предлоаен тест-штамм, который был выделен из внешней среды, идентифицирован как Staphylococcus cohnii по Kloos и Shleifer (1975). Штамм депонирован в коллекции Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Тарасевича 26.12.91г. за номером 221.

Staph.safoph. 221 индуцирует в ЮОХ случаев интенсивную пигментации холерных 01, холерных не 01 группы, светящихся вибрионов, а такве некоторых представителей Ü.species через 24-48 часов инкубироваииз посевов (U.vulnificus, U.Eimicus, V.anguil-laruB, U.fluvialis, U.Eetschnikouii).

Для выявления пигмектообразования у вибрионов тест-втамм Staph.saproph,221 засевали на щелочной агар в центре или полосой по диагонали чаики, а испытуемые культуры вибрионов бляшками вдоль посева на расстоянии не более 0,5 см (как при определении токсигенности дифтерийных микроорганизмов). Тест-втамм при культивировании образует из "пептидного" тирозина среды дифенольные лредвественники меланина, а дифенолы являится субстратами для клеточных ферментных систем меланиногенеза. В соответствии с классической гипотетической схемой образования меланина по Реперу-Мезону мовно считать, что тест-втакк стафилококка образует при культивировании промежуточный продукт L-ДОФЙ, Диффундируя в среду, субстрат конкурентно ассимилируется вибрионами. В дальнейшем образование пигмента-меланина осуществляется ферментными системами клеток вибрионов.

Анализ результатов исследования позволил сделать вывод, что ген, контролирующий синтез тирозиназы, присутствует в геномах всех представителей вида Uibrio cholerae и некоторых представителей üibrlo species.

На втаммы продуценты фермента тирозиназы и пигмента меланина U.eltor 9183,'U.chol.nonOi 9832, U.alginolyticus 9831 получены авт.свид. ¡¡уркиной с соавт.(1992) такие предлокен итамм бактерий Uibrio cholerae - продуцент меланина, используемый в качестве тест-объекта для отбора меланинопродуцирупщих штаммов холерных вибрионов.

Изучение тирозиназной активности и меланинообразования вибрионов достойно внимания биохимиков, генетиков, интересующихся

проблемами молекулярных механизмов реализации генетической информации и путяаи её ■ренотнплческзго выражения. Использование различных систем скр-зцивания позволит получать рекоыбинанты с различными ма'ркйоами. Зт'-i данные полезны паи построении генетической карты холерных вибрионов. Генетика 'ирозиназ представляет раздел проблемы генетического регулирогания синтеза белка, з котором этот энэмм рассматривается как модельная система.

С цельл получения физико-химической характеристики фермента' и изучения кинетики процессов с участием бактериальк я тирозина-зк клетки меланинпродуцирунцего штамма а,.брионов зльтор ооЗ 1 разрушали замораживанием и оттаиваниен в сочетании с ферментативным гидролизом лизоиимом. ¿¡а.тькейзие ?тапн выделения и очистки Фермента зклячачи последовательно хронатэграфическоэ фракциорч-занне на Милселекте Г-25, солевое псахдение энзимсодерааиих фракций. ионообменную хроматография ферментного раствора на катач-ните Севвацел КМ ч гель-фильтрации на еефалексе F-100 f Стс-р-яантова и соаат., Ш4). Тестон д^я обкаруяеная Фермента тирози-назн в хроиатографичеггшх Фракциях слугила катализируемая тиро-зиназой реакция окисления альфа-3.4-диоксифэнилаланина (i* -ДСОГ!) зо< -фенилаланин-3,4-хикон -ДОФЯ-хинон) с последу сшил синтезом меланина. Контроль за ходом ферментативного окисления и «е-ланлнообразозгния проводили на СО-40 при длине золн_480 п 5ti5 ни. фракции с выракенной тирозиназной -зктизясстьв ьыли внязлеиы ь первом и третьем пике хооматограммы. При этом отмечена высокая активность катал-ззы. контролируемая перекисным тестом. Па результатам изучения интенсивности пигнантосбразоБания устаиозлено. что беспигчентные или слабо лигкентирувцие штаммы вибрионов обладали более зыраякнной натзлазной активностью. Эти данные поз- . золяпт предположить, что в-присутствии каталазн сдергивается механизм шткентообразования. Отмечена меньшая. каталазная активность у пигментированных штампов; вероятно., пиг.мент лимитирует доступ п'ерекксного субстрата внутриклеточной каталазе. Исследуемые оеомент-субстратные системы без перекиси водорода ойнеруги-зали реакции восстановления с< -ДОФн а с*'-цОСй-хинон, кэтализиру-еаца типпзиназой и окислитзлънчч полимеризацию- икдол-З.й-хинопа з меланин. Основная часть белка_ идзнткфициррчанкая по субстратной суспензии специфичности эляшровалась при ort 3.2. 3 результате последовательных стадий очистки получили ферментный белок с мслекплзрной массой 43__кЛа и кинетической конг 'антой (Км) с ■:<равнзй 2,'2-!0"М. Подученный препарат использовали для" получения ^нтчтнрозчназной слЕоротки. .

?.5.-^аококислоткий состав ниОризнзв различных таксонов. Рзсг-тие juxo -хльачс-счях и молекуляркс-биологичесхих азт^доз:

- 33 - :

привело к появлении нового направления ь бактериологии - хемота-ксономии. Открытие газовидкостной хромотографии обеспечило воз-монность быстрой и точной информации о кирнокислотном составе бактерий. В связи с этий появился принципиально новый метод дифференциации микроорганизмов. Накоплен значительный материал, свидетельствующий об определенных различиях в гирнокислотном профиле бактерий таких таксономических групп, как светящиеся бактерии (Калачева и .соавт.,1981), знтеробактерии и вибрионы (Васюренко, •« 1982,1985:Воронова,1980)* возбудители туляремии (Мещерякова, 19G7), чумы (Шеремет и соавт.,1994). Известно, что вирные кислоты содерватся. в основном, в антигенных детерминантах клеточной стенки, рецепторах для адсорбции бактериофагов (Родионова,1987), входят в состав мембран и являются модуляторами ферментных систем. О бактериях рода Uibrio имеются данные, не охватывавшие представителей всех таксоно.Б (Блохина и соавт. ,1992).

Нами было проведено изучение качественного состава вирных кислот суммарных липидов стаммоь U.albensis с целью определения перспектив-использования полученных данных при ревении таксономических задач (Лебедев и соавт.,1990). Для изучения общего вирно-кислотного составе использовали типовые втаммы 01—012 сероваров U.albensis. втаммы U.eltor 2278 и U.chol.поп 01-4007. Итаммы выращивали в течение 20-22 часов при 37ДС на МПА, рН 7,4. Липиды извлекали изклеток по методу Folch.et al..(1957). Экстракты липидов в хлороформе подвергали щелочному гидролизу 0,5 Н NflOH с последующей этеряфикацией жирных кислот до метиловых зфиров 14Z . BF^ СК30Н. Яирнокислотный состав липидов определяли на газовом-хроматографе "Uarian Model 3700".*Идентификацию жирных кислот проводили сравнением времени удерживания их с имеющимися стандартами. .

Исследования доказали, что жирные кислоты U.albensis, U.el-tor, U.chol.поп 01 имеют от 14 до 18 углеродных атомов (миристи-новая, миристолеиновая, пентадекановая, пентадеценовая, пальмитиновая. пальнитолеиновая, гептадекановая, Су? -циклопропановая, стеариновая, линолевая) с отчетливым преобладанием iie-.o, ^isu и Cfg.-y кислот./Липиды JJ.aibensis преимуиественно состоят из не-наснщенных жирных кислот (от 55,2 до 71.0%), где основную часть составляют пальмитолеиновая я.олеиновая кислоты.. ЗроЕень насыщенных жирных кислот значительно ниве, варьирует от 27,0 до 43,12 и представлен преимущественно пальмитиновой кислотой 128,42), остальные насыщенные кислоты определяются в незначительных количествах. Brian el al.,(1367) отмечал, что у R-^вариан-тов холерных .вибрионов при неблагоприятных условиях резко увеличиваются циклопропановые ¿жирные кислоты и ..

- 34 - .' -

Особенностью является преобладание жирных кислот, с 16 атомами углерода - пальмитолеиновой и пальнитиновой. от 43,9 до 67,0% от общего количества. Содервание жирных кислот с 18 атомами углерода колебалось от 17,3. до &0,0%, что подтверждают данные • Ка)'аш1гап е! а1.,( 1990).- Исследователи отмечавт, что при повыве-нии токсигенности штаммов С/^.-д повыиается, а при снижении Сц-.д сминается, что подтверждает данные Рапе е1 а1.,( 1990). Жирные кислоты с нечетным числом углеродных атомов и С^? ) определялись в незначительных количествах. Содервание циклопропановой (С./?) кислоты составляет от 0.6 до 5,2%.

Клеточные липиды не содередликороткоцепочечных жирных кислот с числом углеродных атомов меньве 14, иногда их обнаруживали в_ следовых количествах.

Вариабельность наблкдалась у втаимов преимущественно по содержании С/з;/. Однако, варьирувзие результаты не влиявт на основные отличительные признаки кирнокислотного профиля липидов этого вида бактерий. Изучен жирнокислотный состав втаммов У.е1-1ог и и.с1зо1.Т1оп. 01. Результаты указывавт «а отсутствие принципиальных различий в качественном составе жирных кислот. Для атам-мов характерен тот же жирнокислотный спектр с до с преобладанием Сц-.о , С«,-/ и С/д;/. Ненасщенность вирных кислот составила 62,7 и 63,5%. Отмечается некоторое увеличение от : средних данных для \i.albensis и незначительное уменьшение С^:/?

И С/5;/.

Анализ результатов исследований показывает, что качественный состав жирных кислот обчих липидов не позволяет использовать их для дифференциации в пределах вида и.сЬо1егае. Сходство жир-нокислотных профилей обвих липидов'втаммов и.а1Ьепз1з, и.еНог, и.сЬо1.поп 01 может, свидетельствовать об их филогенетическом родстве и может быть использовано в качестве дополнительных таксономических характеристик.

Нами проведено изучение отдельных классов липидов и их вир-нокислотного состава у представителей вида и,сЬо1егае (Лебедев и соавт.. 1991). Изучили и.а1Ьепз1£ «таимы 22312, 10188, li.chol.non 01 штамм 4007 и и.еНог 2278. Липиды из клеток выделяли как описана выже. Фракционный состав обеих липидов исследовали методой тонкослойной хроматографии (ТСХ.) на стеклянных пластинках 6x9 см с силикагелем марки "Ное1в". Фосфолипиды разделяли в системе растворителей хлорофори-ацетон-иетанол-уксусная кислота-вода 5:2: 1:1:0,5 (Лестровая и соавт.,1981). Нейтральные липиды разгоняли в системе растворителей петролейннй зфир - ацетон 85:15 (СЬг151о-ре et а!..1Э67). Пластинки проявляли.в камерах парали йода. Зоны веществ снимали с пластин, липидн элвировали спесью хлороформа .с

метанолом (2:1 К Экстракт липидов подвергали щелочному гидролизу 0,5 н. NaOH с последующей зтерификацией вирных.кислот до метиловых эфиров 142 раствором BF3CH3OH. Идентификации отдельных классов фосц,олипидов проводили по значениям сразнивая относительная скорость миграции образцов со стандартами, в качестве которых использовали фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфгтидилинозит (ФИ) и дифосфатидилглицерин (кардиолипин - КЛ). В качестве свидетелей нейтральных липидов применяли аоноглицериды, свободные жирные кислоты, диглицериды, триглицериды, эфир холестерина. Методы анализа метиловых зфиров жирных' кислот и идентификации мирных кислот описаны выше.

На 1-м этапе работы путем разделения обаих липидов методом ТСХ во фракции полярных липидов были идентифицированы 3 класса фосфолипидов: ФИ. ФЭ и КЛ. Выявлено такие 2 класса неидентифици-. рованных, слабоокрааенных липидов. располагающихся между ФИ, ФЭ и у финиша хроматографии. Из-за отсутствия свидетеля мы не смогли идентифицировать одну позицию, однако по Я-*.она близка к ФХ. Исследованиями Radiuddin et al.,(1Э76, 1977) показано, что жирные кислоты в ФИ U.cholerae 5690 представлены, з основном, пальмитиновой С/¿-.у , С i£:f кислотами. Во фракции нейтральных липидов идентифицированы моноглицериды, свободные жирные кислоты, дигли-цериды, триглицериды и эфиры стеринов. Обнаружен класс неиден-тифйцироваиных липидов, располагавшихся на хроматограмме несколько ниже глицеридов,-Качественный состав фосфолипидов виЬрионов практически идентичен. У обеих групп проявились неидентифицирс-ванные классы липидов. Во фракции нейтральных липидов обнаружены • как сходство между етаинами, тан и различия. Надо отметить пол-йуп идентичность нейтральных липидов тстаммов U.albensis 22312 и 10158 в отличии от штаммов U.chol.non 01-4007-и U.eltor 227fi, которне были схожи между собой тем, что не имели триглицеридов. 9 U.eltor 2278 отсутствовали диглицери^л. * табл. 4 представлены данные по жирнокислотнокц составу класса монсглицеридов и свободных жирных кислот. Мирные кислоты содеояали от 14 до 22 углеродных 'токов. S светящихся вибрионоа и У.Choi.поп 01-400? преобладали *, Суз:^. однако, у U.eltor 22?& значительно снижено со-дзриание С10,52) и рёэко позывег.л полинекасшзекных.нирнах кислот Сгг-4 и Г(соответственно ft,8 и"22.?Х), а также суммарное количество ненасыщенных жирных кислот.

В яирнокислотном спектре сьободных яирных кислот характерно преобладание Чм-.в . i-ita и . U.chol.non Ql-iOQ? отличает-са от других атаамов псБыженним содержанием С {6--0 (3?,6£), нали-. чнем Z-12-.oполным отсутствие». 1гОЧ; и С^г.-У .а также более низки* содаржанием сдемарных ненасыщенных яирных кислот. У U.eltor

Жирна-кислоткьш состав фракций кпноглицеридсв и своёоднмх жирных кислот вибрионов

Таблица -I

Жирные кислоты, '/I

12:0

14:0

15:0

15И

1&:1

1710

17'.0

1в:о

из: 1

10!2

1в:з 2о:о

20 !1

го: 2

22:0

22:1

22:4

22 1

суппэ нпаа-пьшугн-пых

ширрих

КИСЛОТ

У.31Ьеп51£ 22112 У.а1Ьвп513 10100 У.сЬо1.пап 01 4007 У-вНзг 2270

1,2

4,6*

ы

н

6,4

5,8 2,7

4,3 2,0 2 1 1,7

3:1

1,1

ьо

Ь2

га,о

30.2

19.5

30.6

26.3 37,6 21,5 30,1

8,1

25,0 5,4

Ч:?

0,6

2,3 0,9 2,5 1,0 2,В 2,2

\'Л

2,6 Н !

ь, 1

29,6 5,9 213,6 12,В 10,5 11,2

11,0 21,0 13,0 20,4

0,5 12,4

О, о 1,4 0,4 1,2 2,8 1,1 7,0 2,4

6Ц 2 0

ы 1,2

2,0

1,2

2^3

1,7

2,1 0,5 1,2

1,7

В числителе - »ирнкч кислоты ми тглицеридов, в онапенателе - свободные «ирннв кислоты

14 0,6 6,3 0,5 0,3

4:3

0,7 0,5 2,5 0,4 1,2

Н 2,1

6.7

?>8 1 и

1.8 1,6

8,3

2,6 М

3,4

22,7 10,9

<-"3 , 4

55,3 33,2

55.5 27 9

32.6 55,1

45.7

Таблица 5

Жирно-кислотный ссстзп Фракиий диглицеридов,тригличеридс8 и фракции неидентифкцирсваннцз нейтральных липидои

Цтапгтн вибрионов

</*а]Ьст>з15 22312 У.в1Ьвп5(з 101ВВ У.сЬоЬпст 01 4007 У.вПог 2278

12!0

1,2»

Ширине кислоты, %

14:0 15:0 15!1 16 :о 16:1 17!0 17 = 0 из:о 10:1 1(3! 2 1в:з 20:0 20:1 20!2 22!0 22:1 22:4 22:5 суппа НРНй- СЫЩРН- НЫХ жирных кислот

4.2 2,8 2,8 3.0 5.3 5,2 5.1 3.6 1:3 М 2,9 2.7 1,2 1 ,б 29,0 30,6 31,6 30,3 35,2 32,5 ^КЦИ! 29,0 Ь7- 9,0 7,4 Р,0 . ,2 лиг 3,8 1,6 2,0 2,0 2,3 1ИЦРР1 1,0 2,0 2,5 2И 2,0 1/ЮВ 4,8 17,В 22,8 14,1 21,9 14,7 1 <5,1.3 *а тс: 15,0 т 15,4 14,0 отс 10,2 з,в 4,6 Г5ТВ' 1,6 1:3 1:2 0,9 П,7 1,5 щ 1:1 2,7 0,7 0^6 1,4 1,2 0,7 1,3 3,1 0,13 3,5 й 2 0,3 1,0 1,1 ъз 0,6 1 ,4 1,1 0,6 0,7, ь? 1 ,ь 1,7 1,5 1,4 2,0 5,1 2,2 1.3 2,3 1:3 2,9 В,5 7>Ы щ : 30,5

# В чиалигрле - .'»ирге-н кислятн диглицеридпо, в. эняпенатрле - триглицеридав и неидентифицирпваннн.е нейтральных липилов

2278 и «гамма 4007 в 2 раза снияено содержание С/^:)г,а у и.еНог 2278 в 3 раза - по сравнении со светящимися вибрионами.

Вместе , тем у и.еНог" 2278 отмечается более высокое содержание С ¿о и С¿г в сравнении с и.а1Ье1шз (,10.9%). Фракция дигли-церидов (табл. 5) представлена жирными кислотами.с числом углеродных атомов от С/4 до Сзг с преобладанием-С/м , и С /¿.у. Существенных «тамиовкх различий не отмечено. Я lJ.chQl.non 01-4007 несколько снижено по-сравнении с другими жтаммами содержание ненасыщенных вирных кислот. Фракция диглицеридов у У.еНог 2278 на ТСХ не идентифицирована.

Изучен жирнокислотный состав триглицеридов и.а1Ьег.з15, а также негдентифицированных .липидов и.сЬо1.поп 01-4007 и Ч.еИаг 2278. В этом профиле превалировали С/(¡-.д, С и С/$.-/. В качестве отличительной особенности можно отметить более высокое со-деряание С¿¿и и . У и.еНог 2278 по ср^зненив с 1'.сЬо1.

пеп 01-4007 и и.а'Ьепз15, как это уже наблюдалось во фракциях моноглицеридов и свободных жирных кислот, а также наличие у штаммов ll.elt.or незначительного количества Суг-^.

. Во фракции зфиров стеринав доминировали Ъцга и

9 1'.а1Ьеп$15 значение ниже, а С ¿од., и Сгг^ в"ве в сравне-

нии с другими жтаммами. Н и.еНог 2278 отаечается незначительное количество Си снижено общее содержание ненасыщенных жирных кислот. Анализ жирнокислотного состава липидов отдельных втамнов позволяет отметить, что липиды и.а1Ьепз1з не содержали Сфа н Су^-.у , хотя во фракции свободных жирных кислот регистриовалось - незначительное количество С,уг/С10%), Сходство этих итаммов обна-, ^уживается в отсутствии у триглицеридов 17:0 и Сг^-г-

Бо фракции свободных жирных кислот у и.а1Ьепз1э 22312 повышено содержание С/$.•/-е 2,5-4,5 раза (24,82) и 2,8-12,3 раза, у штамма . 10188 (25,8%). На Фоне примерно одинак. вог, содержания для

всех нейтральных липидоз имеет места резкое снижение Сдо 5.1 и 5.9% соответственно. Ь этой фракции у обоих втаммов несколько повыиено количество С/д.-/. Суммарное содержание ненасыщенных жирный кислит повнщено в сравнении с другими нейтральными ля-видами (55,й и 55^%). Та.-им образом при анализе нейтральных липидов наблюдается не только относительное/сходство втакмов и.а1-Ъеп$~ш, ко и абсолиглое па количественному содеркаяив тех или иных жионых кислот, йиркокислотйый.спстаз нейтральных липидов li.chol.uon 01-4007 и ll.slt.or 227Б за многом сходен. Во фракции свободных ирных кислот также каб^адается повывенкоз содержание -С. ч азсколька сниженное С/,^ эта ,1В фракция содержит незначи-; Тйлчиов. каличесао .' Общим такжё является отсутствие у ноно-

■ - 38 - . * .

глицеридов, диглицеридов и эфиров стеринов Zws и . Вместе с тем этим втаммам присущи другие признаки, отсутствуйте у U.ai-bensis. Во фракции ыоноглицеридов повышено содержание Сгг-^ f5,4 и 22,?%).. Фракция триглицеридоБ в отличие от. аналогичной у U.а 1 -bensis содержала .вирные-кислоты С /г = <?• . Сум-

ма ненасыщенных жирных кислот U.chol.поп 01-400? превалировала у д:тлицеридов (42,2%), а у U.eltor 2278 - у моноглицеридоз (55,1%).

Установлено, что 'типовые штаммы U.albensis, а также U.chol. поп 01 и U.eltor содержат общие фосфолипиды: ФИ, 03 и КЛ. Отмечена полная идентичность нейтральных липидов у штаммов U.albensis и отсутствие диглицеридов, ■ч'риглицеридов у изученных ятакмов U.chol.поп 01 и U.eltor. Различия в мирно-кислотном составе отдельных классов липидов. вероятно, позволят дифференцировать вибрионы в пределах рода Uibrio,

Следует отметить, что-Oliwer et а 1 .. ( 1973), Rajiandran et al.,( 1990),•Urbaci et al.,( 1990 ), изучив 51 штамм 22 видов U.species на основе качественных характеристик-распределения жирных кислот составили схему идентификации видов рода Uibrio. При "том авторы выявили около 20-30 жирных кислот и показали, что 30-58% составляшт жирные кислоты с четным числом атомов углерода, разветвленные жирные кислоты составляшт 0,1-12%, от 30 до 68% составляли ненасыщенные вирные кислоты, обнаружены и оксикислоты • (3 ОН - С 12:о и ЗОН - СВыявлена близость U.cholerae к типовым нтаммам U.uimicus и v.anguillarua.

В результате изучения штаг:ов U.species нами выявлены как сходство, так и определенные различия между вибрионами, йирноки-слотный спектр представлен кислотами с числом углеродных атомов от С ^¡q до - миристиновой, миристолеиновой, пептадекановой, пептадеценовой, пальмитиновой, пальмитолеиновой, гептадекансвой, С//#-циклопропановой. стеариновой, олеиновой, линолевой.

Липиды в-сех вкбрионоч. состоят преимущественно из ненасыарн-ных кислот с преобладанием и t/31/ (97,3-89,2%). Кислоты с

15 углеродными атомами - пальмитиновая и пальнитолеиновая в сунне доставили от66,5 до 54,2%. Исключением были лиеь штаммы U.vulnificus и U.fluvialis (27,2-32,5%) за счет снижения в 6-8 раз содержания Cfc-.f . Вирные кислоты с 18 углеродными атомами колебались от 19,6 до 33,3%, однако, у U.vulnificus и U.fluvialis более высокий уровень этих кислот (57,3 и 48,8 соответственно) за счет увеличения олеиновой кислоты в два и более раз. Другие жирные кислоты содержатся в меныих количествах и распределены с незначительными отклонениями. Тем не аенее U/vulnificus имели более высокий уровень (11,8%), a U.fluvialis - £/4,/ Л • однако у этих вибрионов снижено содержание if?,о и никло-

пропановойХл^ф кислот. 9 U.parahaemolyticus и U.alginolyti-cus наблюдалось некоторое уменьшение С&.-д и увеличение-С^.^ и <■ что подтверждают данные Urbaci et .al., ,1990 .■ Таким образом, в результате исследования установлены различия в жирнокиелотном профиле общих клеточных липидов. Изучение Еирнокислотного состава отдельных классов липидов, е т.ч. и фос-фолипидов на болыем количестве штаммов, позволит получить информацию для целей идентификации и упорядочения таксономического положения некоторых видов U.species.

2.0. Изменчивость вибрионов и их идентификация. Йнализ многолетних исследований показал, что-холэрные вибрионы обладают генетической изменчивостью спонтанно или в результате направленного воздействия, приводящей к значительной гетерогенности их популяций по ряду признаков с различной частотой мутирования. . Эта неоднородность обеспечивает холерным вибрионам широкие адаптационные возможности в различных экосистемах: способствует их персистенции и поддержанию спорадической заболеваемости в межэпидемические периоды.

Все многообразие изменчивости вибрионов имеет место в макроорганизме, в объектах внешней среды, в экспериментах in vivo, in vitro и указывает на закономерность изменчивости с определенным диапозоном: агглютинабсльности, вирулентности, фагочувстви-телькостк и различных биохимических характеристик. Подтверждением является серия' проведенных нами экспериментов по изучению иммунологических сдвигов в организме экспериментальных животных, инфицированных слабо и авирулентными дикими штаммами вибрионов эльтор (Лнбинзон ií саавг. ,1983).

' Кроликов заражали вибрионами 10? КОЕ в желчный пузырь, где они размножались и проникали в кивечник.' Для-сравнения изучали иммунологические сдвиги у животных, инфицированных вирулентными атаммами. ИммуногенНне свойства опредь^яль'По; результатам контрольного заражения четырьмя вирулентными птамнами холерных вибрионов оо'оих биотипов и серотипов в перевязанные петли тонкого ки-яечнгка. Изучали, степень- накопления жидкости в петлях и величину петлевого индекса (отновение объема жидкости в петле-в ил к длине петли в cmJ; Отсутствие жидкости j перевязанной петле свидетельствовало о наличии антитоксического "иамунигета. Я'ннтактных иивоткых, заоаженннх теми же штаммами в перевязанных петлях накапливалось ег 10 до ¿4 .мл жидкости и.петлевые индексы колеоа-лись oí 1 до 2.4, в больвинстве случаев >1. Через 3-4 недели после первичного- инзчцировашш кроликов-вирулентными зтаммами они были-не чувстзительнн.; к действии, холерного токсина, сбразовывав-вш ося" s петляя после введения в них токсигенных вибрионов. В

- 40 - . '

837. петель жидкость полностьв отсутствовала и петлевые индексы равнялись нули, в 11,8% - в них скапливалось небольшое количество жидкости (индексы 0,3-0,5).и только в 5,2% они были >1.

Аналогичные результаты были получены после первичного инфицирования кроликов тремя авирулентными и слабовирулентныьш ¡стам-мами, которые вызывали наработку антитоксического иммунитета. П. :ле контрольного заражения кидкость в подавляющем большинстве в петлях отсутствовала (82,4%, 83,4%, 87,0%), Второй авирулент-ный стамм обладал менее выраженным защитным действием и нулевые петлевые индексы были зарегистрированы только в 57%.

Об иммунологической перестройке судили также по наличию з слизистой кишечника специфических антител, которые определяли с помощью РНИФ. Изученные штаммы, независимо от их вирулентности, вызывали выработку специфических антител в слизистой кипечника; у контрольных животных антитела обнаружены не были. Помимо прояв лений местного иммунитета у всех инфицированных животных было ус тановлено наличие в сыворотке крови вибриоцидных антител (ВА) и агглютининов (Аг). Титры ВА (Ю^-Ю7 ) появлялись на. 5-6 дегь после заражения и достигали максимума к 1С дни; у 57% животных титры ВА составили 10^ - Спустя 30 дней (срок наблюдения)

титры ВА сохранялись на уровне 10** -106 . йгглптинины в разведениях 1:40 - 1:80 .появлялись только к 7 днш, к 10 дне титры колебались от'1:40 до 1:640, причем корреляции с вирулентностью вио-рионов не наблюдалось. В 29% антитела в сыворотке крови обнаруживали на 15-16, иногда 25-30 сутки.

Анализ результатов показывает, что среди слабовирулентных и авирулентных и.еИ,ог встречаются штаммы, способные вызывать пост инфекционный, иммунитет к гоыологичным и гетерологичным серотиг.ак холерных вибрионов. Возояно, что вирулентные и слабовирулентннп вибрионы, циркулирующие на территории свободной от заболеваний холерой, могут обусловливать проэпидемичивание населения зтих регионов,

Вирулентными и измененными 14 штаммами вибрионов эльтор 'иммунизировали 78 кроликов. Статистическая обработка результаток по иммунным сывороткам показала, что как вирулентные, так и пененные штаммы способны вызывать образование антнтел л для вт<м-мов йнаб-а "И" титров составляла 1:3916, а "взвеиенная" - -1:321:; , а для втаммов Огава "К" - 1:4800, а средняя "взвепенная" -1:4556. Статистические данные и результаты,перекрестных реакц:;-. свидетельствовали об относительно большой оаибке метода определения антител в сыворотках, как показателе качЛтва препарата и -зк тигенных свойств штаммов. Не выявлено'существенных различий в РВА, которые обнаруживали в разведениях Ю"^- 10~/о. Различия ъ

Pft и PBft были связаны с индивидуальным ответом организма кролика на антигенное раздражение. Метод иммунопреципитации в геле с ОН-сыворотками, в отличие от 0-сывороток позволял выявить штам-мовые различия в антигенной структуре в зависимости от серотипа. вирулентности и источника выделения холерных вибрионов.

Для изучения влияния иммунного организма на изменчивость основных свойств холерных вибрионов испо/.ьзовали в качестве экспериментальной модели кроликов иммунизированных и интактных, которых заражали-в желчный пузырь вибрионами эльтор Огава 2044 и Инаба 9183.8556,5879. Материал для исследования брали с 5 по 50 день через фистулы в кишечнике. Всего было изучено 8445 субкультур: 4826 - от опытных кроликов и 3619 - от контрольных. Среди вибрионе, выделенных от иммунизированных жиботных, измененные варианты были обнаружены в 50%, от контрольных в 16%. йт кроликов. иммунизированных и зараженных штаммом 5879, нзходивяинея з стабильной S-форне было выделено 33,3/. измень-лных субкультур, от контрольных - 2,37- От кроликов, иммунизированных и зараженных штаммом 2044. находившемся в 0-форме, измененные вибрионы были выделены в 91%, а от контрольных животных з 22,8%. От кроликов, - иммунизированных' и зараженных штаммами 9183,8556 - в 18% и 25%, а от контрольных - 6,3% и 15%. Изменчивость вибрионов в иммунном организме затрагивала вирулентность, антигенные свойства, фаголи-забелъногль, морфология колоний. Из 20 изученных субкультур штамма 5879 по признаку холерогенноети, выделенных от иммунных животных, 8 были нехолерогенными. Субкультуры от контрольных животных оставались холерогенннми. Аналогичные результаты были получе-• ны у итамков 2044; 3119,- 9183. 9254 й др^ 1 . Следует обратить внимание на тот факт, что? изменение холе-рогенных свойств наблюдали g вибрионов эльтор,/выделяемых длительное время от больных. От больного'"Ч" былР выделено 45 культур. При этом 1,7,12 были холерогенныкл при внутрикинечном заражении 10-100 КОЕ, 15,19 и 27 вызывали накопление жидкости при введении 10s-107 КОЕ, 42,45 были нехолерогенными. От больной "Чур" одновременно выделили типичные холерогенные штампы и фаго-иувстьитедьные, типичные RQ-варианты нехолерогенные и Ü.chol. 050 серовара..Следовательно, е сргаг.,зме больных под влиянием антибиотиков,"а у борного "Ч".к фагов, "прежде всего у вибрионов утратилась детерминанта вирулентности:.- -/•

Пребывание вибрионов в икмунном организме кро.пиков приводило к утрате О-агглвтинайельности в 9-15.7% Сзтаммы. 5879 и 2044), к гчи1ёнип„Е_0-33%. утрате агглютинг&ельности типсспецифически-. ...--ми сназроткани в 2Й,5%, снихекив в 4>7-26%, появление агглатша-

бельности сыворотками гетврологичных сероваров в 1,59%, КО сывороткой в 17,5-77,5%. Изменение антигенов сопровоадалось изменением чувствительности к фагам, как диагностическим так и вирулентности: мксгие субкультуры после пребывания е иммунном организме перестали лизиро'ьаться фагом эльтор, ХДФ-3 и ХЗФ-4, сохранив чувствительность к ХДФ-5. С этой точки зрения нельзя считать ли-сзбьльность одним фагом ХДФ-5 - признаком вирулентности для вибрионов серовара Инаба. Выявлены варианты, устойчивые ко всем фагам. была выявлена изменчивость вибрионов не агглвтинцрувцихск "О" холерной сывороткой и отнссяшихся к 50 серовару, В результате пребывания в иммунном органйзме часть суокультур утратила аг-глютинабельность гомологичной сывороткой и приобрела спосойкость агглютинироваться холерными 0 и ¡30 сыворотками и лизироватьса ХДФ-3 и ХДФ-5. ■

Общеизвестно значение бессимптомного вибрионносительства как фактора,, способствующего распространении холеры. В большинстве случаев оно непродолжительно (.7-14 дней), редко до года и известен случай косительства в течение многих лет "холерная Долорес". йами установлен факт носительства вибрионе? зльтор типичных и измененных в течение 225 дней после перенесенной гаст-рознтэретической форкы холеры средней тяжести. Эпидемическая ситуация в период каблвдения за переболееией позволила исключить повторное инфицирование холерными вибрионами. В стационаре вкбри-онскосителв была проведена антибиотккотерзпиа тетрациклином, ле-вокицетином; проведено фзгирование с последующей санацией эритромицином, От носителя выделили 16 штаммов холерных вибрионов из испражнений. 3 из дуоденального содержимого, Однй культура выделена из содержимого выгребного туалета по месту жительства.

Сравнительное изучение исходной культуры, выделенной в период болезни, двадцати семи изолированных в период носительства и одной - из содерникгго туалета, выявило штаммовые различия пои .изучении серологических свойстб. Один штамм в момент выделения не агглютинкрогался вило- и тнпоспецифическнии сыворотками, агглвтикиоовался холерной ЯО-сывор'откой:. нзолЕйалось гавение свечение при обрзботке.лютинесцирувиики холерными антителами. При пассажах на питательных средах .агглйт-ина&е'льность'холерными сыворотками восстановилась. Из 29 итаайОЕ холерной 0-сыворсткой до титра агглштинировались 18, до; полутктра - II. Сывороткой Кнайе-до титре 25, до полутитра - 1: один из ккх дал положительные результаты г сывороткой Огзза 1:100,-а с йнаба до титра. Эти данные позволили выявить типичные йтаыьгк вибриыйга зльтор: исходный. 13 втаУков и? исправ'нений, 3 - из желчи и 6 кзвененкых из туалета и из иепр*'*неййй Носителя» Бее и»*енет«е ктажев -агглвтикиво-

■ - 43 - • " '

вались RO-сывороткой до титра, В качестве контроля использовали референс штаммы холерных вибрионов обоих.сероваров С-66, С-71. Получены совпадавшие результаты. Измененные штаммы обладали признаками диссоциации в пробах с трипафлавином, реактивом Нилона, в реакции бактериолиза с комплементом. Наличие шероховатых антигенов у всех измененных и RO-референс штаммов было подтверядено в реакции истощения RO-агглютининов из холерных RO-сывороток по Kastellani. В контрольном опыте типичные варианты холерных вибрионов на адсорбировали агглютинины из RO-сывороток и измененные штаммы агглвтинировались до титра. R.RQ антигены обнаружены такав в реакции преципитации в геле по Ouchterloni. С неадсорбиро-ванными RO-сыворотками измененные штаммы как и RO-референс штаммы образовали по одной четкой широкой линии преципитации. Отмечено, что несколько итаммов, как и исходный, относились к 13 фаго-типу, несколько штаммов были 16 фаготипа и один И фаготипа. Типичные штаммы из яэлчи и из испражнений были г.олерогенными в дозах Í03- 10? КОЕ, 'змененные,. в том числе и из туалета - нехоле-рогенными. S-вариантЫ холерных вибрионов линий преципитаций с RO-сыворотками не образовавши. Реакция преципитации в гелз измененных штаммов с RG-саворотками, адсорбированными RO-референс и измененными штаммами была отрицательной. Различия выявлены по чувствительности ятаммов к (рагу зльтор, а также ХДФ 3,4,5. Одни итамаы визировались тремя фагами^ другие были чувствительны к двум, третьи,- к одному. Культуры, агглютинирующиеся КО-сыворот-кай, в основном, были-чувствительны к.ХДФ-5. Некоторые Мтаммн.не лизировалйсь фагами. .

Анализ результатов'исследований-доказывает« что изменчивость холерных: вибрионов обусловлена разнообразием экологических систем обитания. Механизм этой изменчивости не'раскрыт и менее всего псвещен вопрос, по антигенной структуре ЙС-вариантов холерных вибрионов. Известно, что л лаборагарньА практике изучение атипнчных мтаммов;вибрионов ограничивается постановкой объемной Pfl (г типо- и видоспецифическими. RQ-скворотнами. Появление R-ан-тигеиов з клетках холерных вибрионов не всегда предшествует изменение морфологии крдоний. Чаще колонки бывают a S0-RG форме^ Наибольнаа стабильность изменённых из морфологии колоний, отмечалась у Р.О-референс Етаммов.,Однако, в практических лабораториях SO-сывороткн использует.только при изучейки уже выделенных культур к не использувг при отборе подозрительных колоний. v; Прж воздействие itr witrc и in vivó антибиотиками¿ УФ „ злек-> трическим с&емн. температурой' 42 -44°,С и другими мутагенами у с-■ танавмн»,'* что RÜ,-вариант» о б нар у шиваит с якакс р е д и ! чассических,

'-та:; м'зяьтср вябраоноа cepoTiraoB йнаса и Огава. Отмечена много.. ___ -....-'«;...- ¿ . • •• " - i-/ •

ступенчатость в изменении антигенной структуры: наличие соматического видо-, типоспецифического и R-антигена; изменение О-антиге-на,.сохранение агглютинабельностк сыворотками Инаба, Огава, RQ; утрата видо- и типоспецифических антигенов, наличие' RO-антигенно-го комплекса. Как'правило, измененные варианты холернкх вибрионов в реакции иммунодифадзии образуют линии преципитации с R0 ре-ференс-сыворотками. Главным, на наи взгляд, является сохранение во всех случаях агглвтинабельности холерными ОН-сыворотками. Это позволяет считать, что в атипичных штаммах обнарунивается не чистый R-антиген, а ROH-антигенннй комплекс. Появление RO-антигенно-го комплекса ведет к сапрофитизсщии холерных вибрионов. С целью совершенствования лабораторной диагностики, необходимо использовать не только КО-холерные сыворотки, но и снова внедрить в практику ОН-снворотки, что позволит выявлять различные формы измененных холерных вибрионов не только среди подозрительных S.S0, но и гетероморфных RQ-R колоний. Кроме того, необходимо в лабораториях холеры иметь не только итамм U.cholerae 145 для контроля качества питательных сред, но и референс RO-ятамм для контроля адсорбции по Kastellani, имыунопреципитации по Ouchterloni.

При идентификации вибрионов не только вида U.cholerae, но и других таксономических групп имеет значение полная характеристика штаммов. Принято считать, что вибрионы не образуют сероводород. Однако, в работах !туцепа(192Я), втибина и Бабича С1955), Брида (1957), Бичуля (1969), Тихомировой (1937), Сардар (1969) показано, что образование холерными вибрионами сероводорода наблюдается в средах с определенным аминокислотным составом, йедин-ский и соавтД1978) выявили, что холерные вибрионы, выделенные из сульфидных вод, образовывали сероводород от 26,62 до 78,6%. Считывая данные Атаровой и соавт.(1977), Наумвиной и соавт. (1988) о наличии у холерных вибрионов 01 и не 01 группы активного фермента цистин- и цистеин-дигидролазы, мы поставили.задачу выяснить при каких условиях вибрионы образуют сероводород и значение этого теста при идентификации,

В работе использовали 314 атамиов вибрионов: U.chol.non 01 60 втаммов, U.alberisis 120, в дальнейвем изучали и вибрионы других таксономических групп: (J.parahaeBoHticus 8,-из них типов-:? 17802, U.alelnolyticus 3, U.vulnificus 5, из них 13586, 25562 -типовые, U.aiaicus 3, из них 9838 - типовой, U.ansulllaruB 3, U.fluvialis 17, из них 13587/7-85, 33809 - типовые и типовой втамм "U.aetschnikovii" 6914. Определение сероводорода вели на синтетических средах с добавлением серосодержащих аминокислот цнстеина, цистяна и нетионина; в качёстве контроля среды без •аминокислот. Для галофильных вибрионов в среды.добавляли 2Z нат-

рия хлорида. Кроме того, вибрионы засевали в-среды Клиглера, Олькеницкого, !% п.в., НПБ, бульон Мартена, Хоттингера. а также в 0,3а щелочной агар в которые добавляли 0,52-0,001% цистеина или «истина, которые предварительно растворяли в щелочи.

При многократных посевах вибрионов в 1% п.в. - сероводород не регистрировали. На упомянутых средах без «минскислот сероводород такзэ не образовывался. Однако .было замечено, что на бульоне йартена при больэей посевной дозе и при инкубации посевов более 48 часов некоторые штамма образовывали сероводород. Пред- . положили, что это происходит в результате отмирания и автолиза клеток и накопления цистеина или цистина в культуральной среде. Но непонятна причина зтамаовых различий к иногда невоспроизводимость результатов.

Добавлений с среды серосодержащих аминокислот 1-0,25% тор- . мозчло размножение вибрионов, тогда как сероводород был зарегистрирован и всех штаммов на средах с цистеином •л цистином. но не метионином. При уменьшении концентрации аминокислот до 5-10 мг отмечали обильный рост вибрионоз и-образование сероводорода. Пояснительные результаты, хотя и подтверждают данные других исследователей, не позволяет утверждать, что вибрионы в 100% случаев образуют сероводород', так как в жидких средах без посевов с добавлением цистина и цистеина (контроль 1! был зарегистрирован сероводород, В средах без добавления аминокислот при посеве вибрионов сероводород не зарегистрирован (контроль 2). Чем можно объяснить "положительные" результаты при добавлении цистеина и цистина. Известно, что функциональными группами являются сулъзь • гидрильнне группы остатков цистеина и дисульзшдные группы цистита. При этом, дисульфидный мостик образуется из(судьфгидрильнах . групп двух, остатков цистеина. Продуктом является остаток цистеина С Страйер,1984?. В процессе метаболизма микроорганизмов-под . влиянием метаболитов-восстановителей, а та;.же прн повышении активности цистеиндисульфгидразы, вероятно, и происходит образование -сероводорода, который мы регистрируем,; Особенно следует обратить внимание на способность вибрионов образовывать сероводород з 100% случаев в 0,3% щелочном агаро. Сероводород легко учитывается по почернению индикаторных ¿некой-, помещенных на поверхность среды после посева уколом, з-толщу среды. Следует думать, что на поверхности средк в условиях лучшей аэрации идет как у&а- • личение Ьакмассы, так и использование субстратов полноценней среды, а также отмираввих клеток. Тот факт1, что сероводород учитыва-- згея и'-в-контрольных средах.с цисгекном, циеттшом без посева вн-~

брконов, Нкьа? метионином, говорит во-первых с.там, что только г'- цистий-» цистн-гвда&тса субстратами для образования сероводо-

- 45 - г

рода, во-вторых, что вибрионы потенциально способны образовывать сероводород, т.к. имеют фермент цистеинсульфгидразу. Лоенополо-кительные результаты в контрольных^средах, вероятно, объясняется нестойкостью и особенностями химической структуры серосодержащих аминокислот', когда появляются в активных средах взаимодей-етвуицие "концевые группы", которые дзет реакцию на сероводород. Следовательно, признак образования сероводорода у вибрионов зависит от особенностей среды культивирования, признак не постоянный, он дополняет характеристику изучаемых штаммов и не имеет таксономического значения.

Нами доказано, что лецитиназная активность вибрионоз вида U.cholerae коррелирует с окендазной активностью и является на-декнык таксономическим тестом (Гальцева.1972). Отсутствие лецк-тиназной активности у единичных ггтаммов, как правило, наблюдается при изменчивости свойств в результате различных факторов воздействия или мутационного процесса (Фецайлова,1981). Лецитиназная активность изучена как на средах с нелтком, так и с добавлением лецитозителлина. Получены совпадающие результаты. Использование лецитовителина позволяет применять этот тест во всех лабораториях (Дегтярева,1994). Определение фермента лецитиназы проводили и по наличию кристаллов холин-периодида при микроскопи-ровании, высвобоадаицегося из лецитина.

Считается, что расцепление лецитина в средах происходит ле-цитиназами ft, В, Си что лецитиназы Д и С обладает гемолитическим действием, т.к. расцепляют как лецитин плазмы крови, так и эритроцитов, вызывая их лизис, что представляет интерес при изучении фактооов вирулентности вибрионов и их гемолитической активности (Донская,!978,1381. Бугоркова, 1933 ). Анализ результатов изучения более 2000 штаммов вибрионос позволил нам выявить различия по степени лецитиназной активности как у штаммов ьида U.cnoierae, так и U.specks (fluvialis. parahasnolyticus, alpi-nolylicus. angui 1 lams и др.). Установлено, что итаммы bhophlhoe отрицательные в пробе Грейга по гемолизу, потенциально гемолти-чны. гак на!; лизируст эритроциты на плотных и в видких питательных средах при дооавлении желтка или лецитовителина - при отрицательных контролг.х, 3anagase 1 1970"> указывает, что вибрионы называют лизис эритроцитов за счет фосфолипазы ft и лизофосфолипа?г(. Перспективно дальнейвер изучение степени корреляции леиитиказной и гемолитической активности у итаммов 0.species.

Изучение счльфатазной активности проводили не только для дифференциации-к таксономии вибрионов, но и с целью выявления различий кегду вирулентными я не вирулентными штаммами. Изучено 24? итаммов вибрионов 10 таксономических групп на модифицирован-

- 47 - '

ной нами агаровой среде (Лебедев и соавт.,1994). В состав среди вклвчили один,из 7-и субстратов: SDS, D0X. "прогресс", твин-20, 60,80, тритон' Х-100 в количестве 0,1 на 100 мл. Среда имеет сине-фиолетовый цвет, а при наличии у вибрионов сульфатазы - желтеет. На одну пластину можно засеять бляшками до 30-40 штаммов (качественный метод). Нчет результатов вели через 24-48 часов. Для выявления количественных различий использовали двуслойный метод агаоовых пластин и по размеру зоны судили о степени сульфатазней активности.

Установлена неоднородность ферментативной активности у виб-рионоЕ различных таксонов и показано, что среди вибрионов имеются активные деструкторы алкйлсульфатов. что подтверждает данные Kitaura е'ь al., 1983; Гриаебовского и соавт., 1992.

В изменчивости холерных вибрионов не последняя роль принад-лез'лт нейраиинедазе; которая, как известно, имеет значение в патогенезе холеры. В процесса '-зучения нейранинидазной активности вибрионов выявлены количественные колебания фермента в результате обитания в различных экосистемах и под влиянием, неблагоприятных факторов. _

В наюих исследованиях, холерогенные штаммы вибрионов, выделе. нные от больных продуцировали нейраминидазу в больвих количествах, чем втаммц из объектов внешней среды и от гидробионтов. В условиях in vivo и in vitro мы попытались выявить' влияние нейра-минидазы и антинейракитдазной сыворотки на холерсгенность. Для проведения исследований- использовали коммерческий препарат нейра-минидазы фирмы CalbiocheB с 500 ед. активности з 1 мл. йндинейра-минидазнул сыворотку получили после иммунизации кроликов в подколенные лимфатические узлы с адъввантом Фрейнда 0:1) по ОД мл, спустя 30 дней по ОД мл внутриковно в. 2-3 точки в подсвву лапок и по" 0,5 ыл внутривенно. Содержание в сывопотке крови антинейра-минидазных антител определяли -в реакции нейтрализации по методу, списадноиу Соловьевыми соавт.'(19'72), определение остаточной активности фермента по методу HarrendSSS). Определяли активность нейоа-инидаза в ходержимом кивечника кроликов-сосунков, оаразел-ных холерог.енныии штаммами U.eltor, 2044 и 2037 и слабо выраженным дейсгвием-и.еИог1,851. fi опытах использовали холероген (ин-т "Йккрой'). который содержал 6000.ед/кя нейраминидазы. Строгой корреляции между степенью холерогенкости и количеством придуиируё-чаЯ н^йрамашдазы в опытах на. сосунках ii на перевязанных петлях не отмечено. Однако выгвлеяо, что при заражении животных сдабохс-лерзгенныки ятаммаан вместе с чейолаинидазэй (25-150 ед.) разви-гастсл холерпггнный сичдром и кроаик» гибнут' (при страдательны:: кон;ролах). Кроне' гпго. стмзчено. чт" in у1Ьгоснсйрсминидаза об-

- 58 - г

наругизается спустя 4-5 часов культивирования холерных вибрионов, a in vivo через 0-8 часов. При заражении иммунизированных нейра-нинидазой животных (.титр 1:150) происходила нейтрализация продуцируемой нейраминидаза и холерогенный синдром развивался слабо или отсутствовал.- Ни нейраминидаза, ни аитинёйраминидззная сыворотка не оказывали влияние на холеооген яри внутрикииечном зара-LiH'.ti;. Предположили, что нейраминидаза, действительно облегчает клеткам холерных вибрионов прикрепляться к ворсинкам слизистой кишечника, о чем сообщали ранее Leitch ( 1972)' и Hologren et al.-, (197?). Анализ результатов позволяет считать, что влияние нейраминидаза проявляется на ранних'стадиях патологического процесса.

Исследованиями проведенными в различных очагах холеры была определена диагностическая ценность не только бактериологических методов, но и реакции вибриоцидных антител С РВА).

С цельЕ ретроспективной диагностики холеры, выявления больных со стертыми формами заболеваний и вибриононосителей, для определения иммунной прослойки населения в очаге холеры, а также при изучении иммунитета у привитых изучили вибриоциднуп активность сывороток крови и по результатам исследования определили возможность использования РВА при эпидемиологическом обследовании. Высокочувствительную комплкментзавксикуз реакции ставили не только по классической методике Finkelstein,1952 и Sack et al.. 1966, но и в модификации Доиарадского с соавт.,1971. Диагностическая ценность этой реакции подтверждена многими исследователями (Ермольева и соавт.,1970: Семиотричев,1970: Зайденов и соавт.,1375; Савельев и соавт., 1392). По классической методике вибриоиидным титром считали наизысвее разведение сыворотки, ооеспечквапвее гибель не менее 50% вибрионов на пластинах-щелочного агара по сравнение с контролем, а индексом - отрицательный логарифм Десятикратных раззедений сыворотки. В модификации Домарадского(1371 ) диагностическим считали титрг сывороток с индексом 3 к выва.

. При обследовании больных вибрноцидные антитела (ВА) в диагностических титрах обнаруживали в 62-65.5%, иногда 91.8-97.4%. Средние геометрические титров колебались в пределах 3.08-4.5. Среди 347 вибриононосителей, постуг.ивсих ь стационар без клинических проявлений заболеваний, РВ'й была положительной в 42-44,3;'.. :ре.дняя геометрическая составляла 2,58. 9 58 вакцинированных корпускулярной холерной вакциной положительные результаты обнаружена у 90,5%. средняя геометрическая титра - 4.52. При пологитель-'.и>: результатах в РВА агглютинины в Рй обнаружены з титрах 1:40. :12В0. Е- парных сыворотках от больных и виСр'иононосйтелей наблп-ia.it: как г.свааение титров, так и снижение. Знсохие титра Bfi ино-д-э обнаруаивели не только на 2.10,15 день, но и на 22-2?.

- 43 -

Иногда у больных и вибриононосителей Bft не обиаруаивали. Очень ванные с эпидемиологической то':ки зрения .были получены результаты при обследовании контактных с больными.холерой и Еибрн-ононосит :лями. В 33 случаях результаты бактериологического обследования были отрицательные, но у 14 человек выявлены Bfl с индексом 3-5 и агглютинины (1:80-1:640). Среди 1558'контактных частота обнаружения Bfl колебалась от 6.7 до ¿7,37.. Повторные целенаправленные бактериологические исследования иногда позволяли выделить холерные вибрионы. При обследовании переболевших ОКИ с невыясненной этиологией положительное результаты отмечали редко. В очагах холеры от больных и носителей выделяли также U.cholerae non С1 и U.ulbensis. В PBfi с гомологичными атаммами и в РЯ получали полоунельные результаты с индексом 2-4 и в титрах 1:401:320. При исследовании парных сывороток от больных нарастание титров отмечено а 40,37.. Исследования проведенные в различных регионах страны заболеваний, обусловленных U,choi4¿-rae поп 01 или U.albensis такае подтвердили диагностическут ценность и перспективность реакции вибриоцидных антител, так как PBfi позволяет получить дополнительные' сведения о невыявленных своевременно больных и бибриононосителях, а также дает дополнительную информацию о свойствах изучаемых этаымов.

2.7. Геносистематика и феносистематика Ü.species. С 80-х годов изменилось' описание фзнотипических признаков представителей рода Uibrio. И роду Uibrio стали относить не только индофе-нолоксидазопозитивные, но и индофенолоксидазонегативные микроорганизмы U.aetsctmikovti -"päeudooetschnikovii, зргининотрицатель-ные U.cholerae и аргининположительные U.fluvíalis, U.furnissi,. Ujanguillarua, U.daisela, с одним U.cholerae или несколькими полярно располояеннымИ или латеральными ггутиками U.íisheri; U.lo-ßei, U.harveyi, U.caEpbelli, солелюбивые" и не солелшбивые. И. главное - к роду Uibrio почему-то отнесли г^зооиразувщие микроорганизмы gazogenes, logei, daasela, furnissi.

Кроме вида U.cholerae к роду Uibrio отнесли более 30 видов микроорганизмов, которые обозначили U.species или U.spp - specialis plural Ts. Состав ДНК колеблется от 38 до-51 нсльХ.ТЦ (Tis-son et al., 19843. В ^писках" названий в.:овь предложенных таксоноз бактерий (Елохина и соавт,,1986) приведен состав ДНК.в мольХ ГЦ для U.caapbelli Заилаг. et al. ,1961 (46-48 ),' U.carcharías Griaes et al. ,lS85, U.crdaei Schieue et al-. .198?. не охарактеризованы, U.daasela Lore et al..1981(44), U.diazotróphicus Guerinot et al., _ 1982(46-471, U, fluvial is Lee eí. al., 198U 49-51). U.furnissi i Brenner. et alr. 1383(50-51 ), U.gazogenes-Bauaan et ai. ,10-31(47), 'J.(Bepeckea) harveyi Bauaan et al. ,'(46-48). U.hoLlise Hickoann

et ái.,1382(49-51 ), U.(Beneckea) logei Baunan et a 119 £ i (4042), U.narinus Baumann et. al., 1984( 33-43 ), U.aimicus Davis et al_,1982(47-49 ), U.natriepens fiaun^n et al.Л98К46-47). U.nereis Bauiarr et al,, 1981С 46-47 ). V.nigripulchritudo Baucan et ah. 1981 ( 46-47 ), U.oriental is Vang et al..1983(45-46 ). U.pelagius Bauman et ah , 198K 45-4-? ). U.spleendidvs Баишап et ah,138! (45-■J), 'J.tubiashi Hada et ah.1981(43-45), ü.vulnificus Faraer. 1980( 46-43).

Фенотипические признаки U.spp. представлены в методическом руководстве по лабораторной диагностике (Dodin et ah,1992, Парик). По даннык West et ah,(1387) 11 видов являются патогенным-ми для человека. С 1988г. мы постоянно выделяем представителей У.species: единичные штаммы от лвдей и от 167 до 517 штаммов из морской воды ежегодно. В основном, идентифицированы вибрионы: ра-rahaemolyticus, alginolyticus, fluvialis, anguillarum, vulnificus, ¡üísiicus, harveyi, campbel 1 i i, pelagius, splendidus и 2 штамма "pseudoraetschnikovii". В летнее время в пробах воды НВЧ (наиболее вероятное число) по формуле Томаса было >161, зийой .не превышало 1.

При исследовании нуклеотидного состава ДНК выделенных нами и типовых штаммов вибрионов получены следующие результаты: у штампов O.parahaeaolyticus 112, V,alginolyticus 18255 процент ГЦ пэр составил 46,8-45,2-45,5, соответственно. Сравнительное изучение типового штамма из Парижской коллекции U.díeícus 3338 и штаммов 236,206 из нашей коллекции, не выявило различий и составило 46,3-46,7-48,0. У U.vulnificus 27562Íтиповое) и 347 процент ГЦ был 46,8-46,9. Штамм U.vulnificus 284, несмотря на ?.е~ нотипическое сходство с типовым, показал процент ГЦ пар 69,3 и, следовательно, должен быть исключенным из вида U.vulnificus как несоответствующий по-генотипу. Для штамма U.fluvialis НО, выделенного от больной с ди;и нозом холерный гастроэнтерит, процент ГЦ был 48.4, для U.harveyi lt¡2 был 44,8. т.е. несколько ниеп чек по данным литературы (46-45). В настоящее время колебания б пределах 0,3-1,2 не позволили нам найти фенотипические признаки, некоторым эти штаммы не соответствовали бы упомянутым таксогномкче-скии группа«, вероятно, это допустимый интервал для характеристики. нтамнов в пределах одного вида по большому количеству Фенс-типнческих признаков.

(/'.vulnificus (Faraer, 1 380 ) имевт ГЦ пар 46-48 моль% и являются. этиологическим факторов заболеваний мягких тканей, сепсиса 'и тякетых,диарей с .зксокин процентом летальных исходов. Нами с тистоанс^ом .наделяются U.vulnificus из морской воды. Выделены этими из ран больных. По фенотипическим характеристикам они от-

- 51 - ,,

носятся к 5 группе Хейберга. Но среди ,U.vulnificus приходится выявлять штаммы с различной степенью ферментации лактозы в аэробных и анаэробных условиях. И тогда возникает вопрос- в чем отличие U.vulnificus от (J.ainicus. Ведь это основной дифференциальный признак. Если лактоза ферментируется - то U.vulnificus, если нет - то U.uimicus..Другие признаки дифференциации не предложены.

По геномной характеристике U.siaicus (Davis et ai.,1384) co-дернат ГЦ пар 48-49 мсяь% и по пагогенности схожи с U.choleras. Особенностью штаммов U.vulnificus. U.mimicus является способность к диссоциации по кулътуральным свойствам. На среде 'rfagatsu-ша при типичном росте U.parahaemolyticus, alginolyticus. anguii-larua почти не растут V.vulnificus и U.nioicus. Колонии типа точечных или мелких росинок- не дают роста при пересеве на полноценные среды. При этом отмечено, что типичные колонии гемолизполови-тельные, росинки - нет. В штаммах U.vulnificus обнаружены вибрио-цикы. Возможно, что изменчивпсть U.vulnificus'и U.milieus характеризует так называемые некультивируеьше формы и подтверждает данные Heichart et al.,(1992) и 01iver( 1992).

На наш взгляд особого внимания заслуживает вид U.anguiila-гив, котор'ый впервые был описан в 1909- году и представляет в первую очередь опасность для всех экологически важных и промысловых рыб и здоровья человека. Таксономическое положение,их также меняется. Их предложили объединить с V.pisciui, U.echtyodernis в един фенон. Еде более непонятно предложение исследователей ввести в ceM.-Uibrionaceae Listonella и Sbewanella и к роду Listonel-1а отнести U.anguiliarur, U.daESela, 'J.pelaginus (цит. Блохина и соавт.,1992). Описаны типовые втаммы U.anguillarum ЙТСС 14181, Со1ке11(1970) й ЙТСС 19264 Ваииап( 1978). ГЦ пар 44-45 ноль'/, и го-иолигич ДНК-ДНК в пределах Еида описана от SO до 100% в 'разных коллекциях,. Анализ схем биотипирования показал наличие А,В,С биотипов. Нами изучено 164 втамма U.anguiilarui от ладей, из морской воды, гидробионтов. Выявлены различия по сероварам. По фено-типическим свойствам не выявлено приниципиальных различий, но трищ.з определить их принадлежность к биотипу,' т.к. идут споры какой биотип признать официально А,В или С . По генотипу у изученных нами штампов ГЦ пар 42,'8 мольЛ, что соответствует данным Grossa et al.С1977).. - ■ '

В результате анализа данных литературы и собственных исследований возникает вопрос - вид (.Canguillarum однороден по фенотипу или состоит; из биотипов. 'J. angui Пагии считать те вибрионы, у которых ацетилметилкарбинол + или -, индол + или -, ^з-галак-гозидаза + иль -„ салицин + или -. Ведь все эти варианты выявлены у вибрионов- 1 труппы Хейберга. гргининполертэяьных. Кроме

- 52 - -

того, как идентифицировать такие штаммы, если арабиноза "-", т.е. другой группы Хеиберга. Решение этих вопросов и определит перспективу идентификации и.ап£иП]агии.

Выделен к очищен гемолизин и.апеш Пагив 153. Во Фракции осажденной сульфатом аммония гемолитическая активность по белку составила 19 мкг: После-ионообменной хромотографии фракции 3-х ¡.лков по результатам злектрофоретического контроля были неоднородны с молекулярной массой 74.69 и 54 кДэ. Геколкзинактивннки оказались фракции первого пика и составили по белку 14 мкг. После гель-фильтраиии на матрице ЙСЙ34 гемолитическая активность проявилась во фракциях ЕТорого'Ъика и составляла 15 мкг, т.е. пыла б 13 раз выше от начальной. Как показал электрофоретически;'-анализ и данные хроматографической разгонки на сефэдексе С—200 выделенный гемолизин был однороден. При относительной электроао-ретической подвижности по отношению к оромфеноловому синему 0,31 м по данным калибровочного графика молекулярная масса составила 63 кДа.

Анализ результатов по идентификация и.апгиШагиа по изучении генома этих ктаммаз позволяет считать неправомерным выведение этой таксономической группы из рода (ЛЬгхо. Перспективно дальнейшее изучение гемолитической активности и других фактороЕ патогенности и.апеи!I1агиа.

Бесспорно доказана -роль галофильных вибрионов в этиологии пищевых токсикоинфекций. которые зарегистрированы на всех конти--нентах и стали международной проблемой. Вспннкн ПТИ "зарегистрированы и у нас в стране: в Новороссийске, Одессе. Керчи, Ялте, Бердянске, Мариуполе (Дибинзак с соавт.,1972,1574,1955). Нами выделено 151 штамм от больных и >700 штаммов из объектов внегке;: среды.

С помощью японских 0 и К-сывороток 57-и типов проведено серологическое типирозание и.рагаЬаено^'Исиз. Установлено, что • Новороссийске и Крыму чаще всего выделяли вибрионы серовара 04:К:12 (55,8 и 50,2%, соответственно), на втором месте - серо-Еары 0:4К8 (37,? к 15,8%). Кроме того, были выделены виорнонк сероварое 01:К32. 02:К28. иЗ:КоЗ. 03:К57, 05:К1 ?. 05:К47, 06:К: 06:К46, О10:К52. Среди вибрионов из морской воды- и от гидрбиоь тов дополнительно к упомянутым были идентифицированы и дрчгке серовары - 04:К8, 04:К12. 05:К17 и др. Представители разнил сыроваров выделены и из воды Азовского мора. В Красновсдске у лг--дей выявлены вибрионы сериваров 0б:К18 (33%). 04:К55 и 0Б:К45 '.по 15%), а также 0!:К25. ОЗгКЗО. 03:833, 04:К13 (Лкбинзон и соавт.. 1394).

На поберв»ье Азовского норз возбудителем заболеваний (шля

вибрионы серовара 05:Кí5 концентрация (í.parahaeBQlyticus в морской воде и гидробиоктах была высокой. На литр воды приходилось до 4200 клеток, а в рыбе достигала JO*-105 на 1г. Частота выделения, вирулентных штаммов из воды составила 66,6%, из гидроби-онтов - 85,7% и от людей - 67,8-99%, В настоящее время, ввиду отсутствия отечественного набора типовых сывороток, мы приготовили 0 и К антигены и получили к ним кроличьи сыворотки л 22 сероварам: к К-антигенам; 01:К32, 0б:К46, 04:К8, ОН, 07, 02;К28. 010:К52 , 05:К47, 04:К12, 05:К17, 05:КЗЗ,- 03: KS7, 0 5: К i 5; к 0-ан-тигекам: Ü?,0S:K1S, 011,01:К12, OiO:K52, 02:К28, 04:К12, G5:KÍ5, 03:К33. Сыворотками протипировали не только штаммы из внешней среды, ко и 98 штаммов U.parahaeBmlyticus. выделенные в 1988г. во врекй гспыикк ПТИ в г.Бердянске. На первом месте по частоте обнаружения были 58 ятамков серотипа 05:К15, которые лизировались 5<агой !39 ( 155), !4 btsmüob серогипа 04;К12, остальные ти-пировались сыворо1ками 02;К28, 03:К57, Н-33, '>3;К46, K-Í8, 01 ü:К52 и 0Í1. йна.'из результатов указывает на.мозаичность антигенной структуры морских галофильных вибрионов и на. их этиологическую роль при ОЯКЗ.

3 изучении галофильных вибрионов перспективный является совершенствование не тслько серотипирования. но и фагодиагногликк для идентификации штаммов, для проведения эпидемиологического анализа ПТИ и при надзоре за состоянием окружающей среды.

Есть единичные сообщения о выделении фагов парагемояитичес-ккх вибрионов (Nakanishi,1966; Barros, 1378; Навдия,1981). Либин-зон и соавт,,(1984) фаги выделены из крабов и мидий и депонированы в Тбилисском НИИ вакцин и сывороток. Кудрякова[ и соавт".,(1992) 'выделили фаги из лизогенных штаммов К:í5 и К: 18, сероваров í/.para-haenolyticus. Для'поиска типирувщих шагов проверена активность 49 фагов галофильных вибрионов в отношении штаммов различных "К" и "0" сероваров. Процент лизируемых культу;/варьировал 1,7-62, Нами выделено 5 фагов в 1983г.,. 40 в 1986г., 10 в 1389г. на 3 индикаторных культурах U.parahaeaolyticus и U.aleinolyticus. На зтзмм U.parahaeaolyticus Ф139/155 получено -авторское свидетельство. Впервые выделен фаг парагемолитичаских"вибриоиов, относящийся к 1V .морфогруппе 'ло Тйхонснк.. Фаг139 отличается от известных специфической литической активностью по отношению к вирулентным штаммам U.parahaeiaolyticus самого распространенного в стране серологического типа 05;К15 по японской классификации. Фаг 139 рекомендуется использовать длй бидоеой к типовой идентификаций ü.parahaeaolyticus (Либинзон с соавт..1991;.

.Изучение негативных колоний новых фагов выявило полиморфизм по величине, .форм? и прозрачности. Методом селекиик выделены чи-

с.'.че лини;:. Специфичность, диапазон литической активности изуче-нн нб коллекции из 500 итамнов и штаммоЕ других таксономических групп Стабл, 6). Коллекция из 500 штакмон и 9 индикаторных куль-

Таблица <2

Злектронно-нккросжопинескаа , нор<?алогическая характеристика фагов галофильных в»5рионов

Пиринга- торьые штапик Фаг к Морфо-группа по Ти-ханен-ко Капсид Отросток L Drnax Dm ¿55.

Dmax нк dœiti кк Длина ьки Диаме-гр Ф на Disax Ч> Dn > TI

V . s 1 g i - tldl v — t "i ГЛДЗ 18 106,4",66. 43П. lOi ,8Г: 31П.11,2вП ют, i ion 5 48,0 44,3 80, В 15,6 1,6S 3,07 1 ,оэ

V.рага-hat?no~ lyti -cus 480 96,44,102, 43,40,30, fe,41,31, 170,Q3,45, 49 5 48,0 44,3 80,8 15,6 1 ,68 3,07 1,08

V.algí- tio 3 y— tícus.18 9П,10,24, 23,7 5 78,3 68,8 9J ,6 16,В 1,16 4,6 1,13

V.para-haeraö-J yti -cus 112 171,146, 136,157, 155 4 7в,1 43,4 140,2 10,6 1,8 7-, 1 1,75

V.alai-no] yt- i -cus Э73 40,39,9, 157 5 78,3 68,Я 91,в 16,8 1,16 4,6 1,13

тур передана в Центр по патогенным вибрионам. На модели галофи-льных фагов (итаммы 155 и 102; отработана'схема очистки и концентрирования фагового лизата с использованием на начальном этапе в качестве носителя МПС, а затем переходили на колоночный вариант очистки. Хромзтографив проводили на колонке низкого давления с проточным спектрофотометром при длине волны 254 нм. Зрение вели трис-КС1 буфером. Белок определяли при длине волны 280 им на СФ-4и, Для иммунизации использовали 2 и 3-й злнаты с концентрацией фагов -до п 10 . Титры сыворотег: оыли I г i ñ О (РНФ) и в РИД -1:64. Ь нмкун'йэлектрофореэе выявлены ?. линии преципитации с гомологичными ùHTUCUBOpOTU-itUl.

При хромотографии не- сефарозе, :<дсор6цив фагового лизата регистрировали Увикордог. 11 с проточкой камерой на ьо.пг: 254 ьн. 1рофиль алоцик фагового ."изата был представлен двумя пикачи Стервантова и соавт., 15ГЧ !. Для концентрирования фракций знали-Ihme трубички обрабатывали 4У. раствором бычьего сывороточного 1ль6умина. заполняли полтиленгликолем (.6 тыс.) и опускали ь рооирку с фагом. Дзухчс .овой диализ дакал увеличение корпускул ara б 3,4 раза. Этот м^тсд когет быть использован для очистки и онцентрирования фаговых лизатов.

U. fluvialis впервые описаны Lee et al С1981), ранее их о^но--

сили к роду Дегсшопан. Автора подчеркивали трудности фенотипиче-ской дифференциации U.fluvial is от представителей fleromonas. И из-за таксономической путаницы, отсутствия четких рекомендаций по идентификации и дифференциации U.fluviaiis от аэромонад, недооценивается их значение в патологии человека. Так называемые аэромонады мы с постоянством выделяли из морской, речной воды, ила, гидробионтов, от больных. Впервые азромонадная инфекция описана йайвС1971 ),когда произошло заболевание в детском коллективе б Прибалтике, В 89-е годы создалась чрезвычайная ситуация в Бангладеш при вспышке диарей. Рвота отмечалась у 97% больных, дегидратация - 67%, абдоминальный синдром - 75%, температура была у 35% больных. Описаны поражения мочевыводящих путей. Было выделено более 500 штаммов U.fluvialIs. Вспышки заболеваний описаны з С1АС 1982 ), йзииС1383 ), диарея новорожденных в Бразилии ( 1990 ), во ФлоридеС1990). в ГазайиС1991 ). Поэтому, еще в 1986г. во время работы 14-го Международного конгресса микробиологов в Манчестере было проведено совещание по этим инфекциям. Результаты.эпидемиологических и экологических исследований показали, что ■j.fluviaiis является возбудителями не только диарейных. но и системных заболеваний человека (Taen'la et al., 1980).

Нами было .изучено 384 штамма, многие из которых ранее идентифицировали как fleroQonas. Выявлено 17 0-сероваров. Все штаммы были индофенолсксидазпполовительные, Ш группы Хейберга, дигидро-лизовали аргинин, индолотрицательные, не образовывали ацетилме-тилкарбинол и не ферментировали салицин -- ретроспективно их мов-но отнести к '0.fluvialis'.

1 Для окончательного решения вопроса о таксономическом положении зткх микроорганизмов проЕвли изучение"куклеотидног'о состава ДНК и молекулярную гибридизации ДНК-ДНК 12 атаммое 'атипичных" бактерий (Гальцева и ссавт.,1974), а такие атаман из зарубежных коллекций: U.cholerae АТСС 14035 (01): U.choierae Sakamaki НСТС х 4715(03 ), .370-68(012), 180-88( 023), 173-63( 026 ) 'J.flu >ialis flTCC 33809(1), АТСС 33812(П), три штамма, выделенные ъ Бангладе! (26177,26595,27915) и штамм 7-85 из коллекции института Пастера а Парике, Для более обоснованного рзлвния вопроса о таксономическом положении этих микроорганизмов изучили нуклеоти-дный состав £НК и провели молекулярную гибридизации ДНК-ДНК. Содержание ГП в ДНК атамыоЕ колебалось в пределах от 49,3 .дс 51 коль%,.Зти показатели были существенно нияе; чем у азромонад (57-, 03%) и несколько, вкие. чем у холерных вибрионов (47.0-49.0 моль%). Различия нуклеотидных показателей 12 "атипичных" итаммов позволили идентифицировать их как U.;la"ialis. Результаты гомо-

- 55 - _ "

логин и.ПтчаНЕ со втаммзнтг вида и.сПспегае гастезляли 23-261. Нами обнаружено, что в коллекции Еакагакх и. сйпГ..С12,023,026 се-ровароь не соотпетствуяг виду и,сЬс!егае. Результаты свидетельствует о высокой степени эенотпттического сходства изученных" итам-мов 012.023,026 со итакааыи иЛ1тЛаИг. Содержание ГII составило 51 нольГ^. что позволила „чдгнтиФгигазЗБать их как и.Г11№1а<Л£Г.

Нами Еперзне среди атаммаз. вздаленых от больных,, из аоъ&к-тоз внешней среды и обладаниях фекптипической' характеристикой рода йегоаопав, выявлена вибрионы, ГЦ которых 49-51' нальЗ. Разли-• чия выявлены и методом молекулярной- гибридизации ДНК-ДНК.. Следовательно, фенотипические таксокг-двойтгки и ..£11шга11г и бвгогго— паз могут быть обнзругени только при научении састааа ДНК.. Невон-вожность обнарунения таксонов-двойников мегодгни традиционной классификации свидетельствует о ее несовервенсхзв- и нгпбходииис-тк внедрения в таксономия вибрионов методом. геноснстематики,.

В Краснодарском крае в период эпндослоененнй.. в апгустз 1995г., в Анапский ЦГСЗН поступило экстренное саобценне- о< подаз-ренки на холеру у больной 58 лет. работницы водоканала' г„йнггщ-Её состояние оценено как крайне тязглое.. Трехкратное исследование материала на холеру не дало положительных результатов.. На средах рост чистой культуры и.Пи'ЛаНг. В сыворотке-крови аг— глитинины в титре 1:40-1:80, впбриоцкдные антитела- 1::Ш0„ при' отрицательном контроле с халеряыки станками. Выявление и учет заболеваний, вызванных и.ПшЛаНг основаны гслька на выделении возбудителя, а эффективность лабораторных исследований - от. повсеместного внедрения в практику методов идентификации, и дифференциации вибрионов.

Информация о патогенных вибрионах лабораторной. с^тугбе,. эпидемиологам и клиницистам необходима для сЕаеврененной- диагностики. контроля лечения.заболеваний, вызванных и.ПшЛаИз.. так как и эти возбудители могут ездать чрезвычайнуЕ ситуация,. как это случилось с и.с6о1егае 0139.

В последние годы'снизилась использование зритрсцитарных диа-гностикумов при лабораторной диагностике холеры из-за наличия ли-»неположительных реакций и несоответствия результатов едновроаен-ного использования серологического и бактериологического метадгш.. Иы попытались приготовить иазуиосуспензионные антигенные и антн-тельные диагностикумы на основе полизкролеиксвых частиц. Метод латексной агглшинацик более перспективен. При использовании ди~ агностикумов меньпе неспецифических реакцрй. они белее чувствительны в сочетании с экспресностьи и простотой метода постановки реакции. Получены обкадеяивазцяе результата. Чувствительность метода для антительного диагностикума составляла 50-75 тысяч и.к

; - 37 -

и для антигенного 5-10 нг'холерных иммуноглобулинов. На способ приготовления инмуносуспензионных диагностлкумов получены авторские свидетельства: 1536747, 1596926.

С цельш совершенствования лабораторных исследований ибъек-тов внешней среды на вибриофлору в период эпидблагополучия использовали три пептонных роды (Либинзон и соавт.,1975). ? 1-а и 3-й добавляли 0,2% "прогресса" и посевы инкубировали при комнатной тзпературё 16-18 часов. Выявлено преимущество забора проб в две емкости по 500 мл. Проведено сравнительное изучение высевае-мости вибрионив из 1% п.в. с высоким значением рНСЭ,0-3.5) в соответствии с рекомендациями (Савельев и соавт.,1585). В качесгзе контроля использовали 1% п.в. рН 7,8-8,5, МОБ. бульон лопингера, среды с теллуоитом калия и "лрогресса". По результатам исследо-ааний 200 проб вода из 43 точек забора выделено 23 штамма холео-ных и более 400 штаммов других вибрионов: из них И по классической методике и 18 из V/. п.в. с рй-9,5. Совпадающие результаты только в 4 случаях,т.е. на 50% увеличено положительных результатов. Несовпадение результатов указывает на необходимость отработки методе» и сроков пересевов. Использование "прогресса", пеп-тонной зоды с рН 9.5 позволяет вести работу в одну смену. При выделении первой культуры исследования ведутся круглосуточно по классической методике.

Приготовление доступных стандартных сред такае является актуальной задачей совершенствования бактериологической диагностики холеры. Готовили сухие среды Хьы и Лейфсона для СПЭБ. На основе кормовых дрожаей в-соавторстве разработана технология изготовления питательного агара Милютин и соавт.,1980. Написана техническая документация. Предлоаен тест-штамм для контроля качества питательных сред Получены.авторские свидетельства. В настоящее Время, ввиду дефицита питательных сред, мы разработали среду для исследований на вибрпофлору взамен среды Касаткина, ТСВБ.. Среда не требует стерилизации, проста в изготовлении. На литр среды необходимы: -агар КД-ЗС г (гидролизат кормовых дроажей 12, натрия хлооид 5,?, агар-агар 12,5), молибденовый кислый аммоний 0,3г, бромтимоловай синий 30 мг. калий теллуристокислый 5 мг, углекислый кислый натрий 1г». сахароза 5г, стиральный порошок "динсан" 1г. Добавить дистиллированной водя.до 1 литра, размешать, кипятить 3-5 минут, рН-8,2, разлить в чашки. Вибрионы, вырастают в

виде ьелтозатнх колоний на фоне-светлоголубой среды.

* * *

Результаты проведенных исследований иневт -значение не только для совершенствования таксономии и идентификации вибрионов

- 58 - • .

различных систематических групп, но и для совершенствования лабораторной.диагностики заболеваний человека, обусловленных этими вибрионами.

Широкое эколого-географическое распространения холерных 01, холерных не 01, светящихся вибрионов, представителей У.species создает потенциальную опасность возникновения эпидемических осложнений, В системе эпидемиологического надзора ванная роль принадлежит лабораторной диагностике, эффективность которой ззвисит от наличия качественных высокочувствительных питательных сред, диагностических препаратов, совершенных приемов и методов по выделению вибрионов, а.также от наличия четких и надеиных таксономических критериев, позволявших идентифицировать и дифференцировать вибрионы не только в пределах рода и вида. Для эпидемиологического анализа необходимы и более частные характеристики по сероЕарлм, по фаготипированив, вирулентности, особенно при выделении измененных штаммов вибрионов. Полученные результаты позволяют оценивать степень загрязнения и контаминации объектов внешней среды, прогнозировать степень опасности таких объектов. Роль вибриофлоры U.species в патологии человека еще недостаточно- изучена и долина оцениваться дифференцированно. Наибольшую опасность, в том числе н эпидемическую, по-прегнему составляют вирулентные штаммы U.cholerae 01 и 0139, Другие виды вибрионов хотя и могут вызывать тянелые диарейные и системные заболевания, в эпидемическом отношении менее опасны. Исключение составляют U.parahaenolyticus и U.chol.non 01, обусловливавшие-как споради-ческув заболеваемость, так и пищевые вспывки.

?

В И В G Д H

1. Методы геносистематики необходимы для идентификации и классификации вибрионов различных таксономических групп. На основании данных по нуклеотндному составу ДНК (4.7-49 моль У. ГЦ) результатов молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (72-100%). данных традиционной классификации и анализа фенотипнческих свойств нами доказана высокая степень родстеэ U.chol.non 01, U.albe^sïs с U.cholerae и U.eltor. Вариабельность штаммов вибрионов по фено-типичесним признакам позволяет дифференцировать .в пределах вид?. U.cholerae биовары: cholerae. eltor, albensis. U.chol.non 01.

2. С целью официального признания таксономического статуса U.chol.non 01 в соответствии с правилами и принципами Internal on code of nomenclature of bacteria J 1975) предлагается бковар U.chol.non 01 обозначать как биовар firiklerprlor, по имени авторов, впервые описавших эти вибрионы. В качестве неотипового=8тем-ма предлагается U.finklerprior 15 (Finkler, Prior 1884). К био-

- 59 -

типа finklerprior относить 02-083...0139 серовары,

3. Обосновано таксономическое положение биовара albensis в . пределах вида U.choleras и предлагается неотиповой втаим U.al-bensis 7402 (DunLár 1893) для международных коллекций, а штамм НСТС 8443 следует изъять как не соответствующий еиду U.cholerae, К биовару U.albensis откосить 01-013 серовары.

4. Классификация вида U.cholerae и номенклатура таксонов U.cholerae приведена в соответствии с правилами International code of aoaenclature of bacterid (1975) к могет получить официальный меадународний статус:

вид U.cholerae Pacini 1854

биовары: U.cholerae cholerae (Pacini 1854) U.cholerae eltor (Pribram 1919) ■ U.cholerae finklerprior Tinkler. Prior 1884) U.cholerae albensis (Dunoar 1893)

5. Для совершенствования лабораторных исследований перспективными пзляатся методы серологической идентификации вибрионов различных таксонов. Нами предложены'серовары U.choi.non 01 (finklerprior) 045,04S.049.050,051,Ü52,053,055, U.albensis 02-09, 011-012 сероваров. Получено 22 типа агглютинирующих сывороток к О, Н-антигекаы U.parahaeaolyticus. 8 пределах вида U.fiuvialis определено 1? ,0-сероваров.

6. Впервые выделены фаги U.albensis 3 и 4 морфогруппы. Выделены фаги U.parahaemoíyticus и U.alginolyticus. Перспективно создание набора диагностических альбензисфагов (ДАФ) и галофиль-ных фагоз' (ДГФ) для идентификации .вибрионов и эпидемиологического анализа', ьызываемых ими заболеваний. •

7. Впервые выгелен ферментный белок-лшцифераза из 'итаымоз U.albensis (1ие+) и установлено его участие в биолкшине-центных реакциях. Показан? изменчивость биолншинесценции U.albensis, приводяв^я к таксономической.путанице.. При утрате феномена свечения згтаммы. U.albensis идентифицирует как U.ctol.ncn 01.

8. Впервые доказано, что в геноме всех представителей u.cholerae имеется ген(ы), детерминирувщий синтез фермента ти-разиназы (t.ye+) и пигмента меланина (Pgm+), Для выявления реактивности и-пигментообразованкя штаммами, вида U.cholerae и некоторыми U.species предлоаен и депонирован т:ст-штам._ Staph, saprophytics 221. _

9. Таксономический статус биоваров вида. U.cholerae подтвержден отсутствие* принципиальных различий сост:ва 2иг'чых кислот суамармкх липндоз t С^ - С^), тогда как сна выявлены у ь-'тзммог

U species. При изучении- состава фосфолипидез оинаругены ФЭ. ФИ, '-'it и ФХ. Мсноглиаеридк содерклк - Различия бзсзлзнн ли

- 60 • -дкглицерилам и триглицеридам.

10. Выделена закономерность изменчивости холерных и других et прнсн г с определенным диапазоном: агглштинзбельности,-фгголи-Зййелън;' ти, вирулентности и различных раохймических характеристик , С целъв соБераекстбования лабораторных исследований па выделение и изучению измененных вибрионов рекомендуется внедрить в практику хилерные ОН-сыворотки, холерные RO-референс ¡гтаммы для контроля адсорбции по Kastellani и иммунопреципитации по OuchterloEi.

11. Изучение таксонов U.species (paranaeuolyticus, alsino-iyticu?. aneuiliaruE, f-luviaHs., vulnificus, üinneus, "pseudo-Eetschnikovi:"Ï показывает, что их нуклеотидный состав ДНК ри-роспецифичен, что подтверждено молекулярной гибридизацией ДНК-ДНК и выявляет гетерогенность различных таксонов, идентифицированных г;о фенотипнческим признакам. На основании фенотипических и генотипических признаков предлагается вывести индофенолоксида-зоотрицательный вид U.uetschnikovii из рода Ujbrio и привести -описание рода Uibrio в соответствие с 8-м изданием Bergey'S Manual of Determinative Bacter-iologii,1974.

Инструкции и Нетодипеские рекомендации

1. Методические указания по серологическом^' тнпиговагаю вибрионов не аг-ГЛСПаиГУКШОЖЯ O-SI-лернСН сывороткой/ ВЗШ "КМСРОб". гост, я/а шливочунн. ин-Т! Сост. а. к. Аааков и др. - Саратов, 19э0. - 5с.

г. методические указания пс испаиьгоБани» авирулентаого сложа наг-цй-

рионов р-9741 при кг.ь-ггс'ле гостоеье свойств пигатслшк сред дач -хаигаосии! хапет' Рост. н-'Д пготазочумн. ин-т: Сост. В a «истин к ДР- - Ростов н/Д, 1930. - kr.. " >

3. Иетоянчоские указания по к^рлеи^ h изученп» гстметооеразуизг: в№-рноч vnnwrHcwoP'-кая пгепэзочумвая стзнгач. сост. г. Б гальцева и др. - Ново-РСССИГ1С. 1994 - 19С.

4. Методические рекомендации по лабораторной аагуостмке патогенных для чед-овгк* нновикв/ рост. н/£ прспзк-чумнык ш-т; Сост. оюяшква и гг. - Ростов

Н/Д 199-^.

■ ь. программа усс5^ив?в.-:хьа»аи прстивсчуимх учр«?:»е.?тай.

nRRcWîOUf-rtivi«» пм1юч5ии,>. станим Сое Г. В Гамлеш к яг. // в.ч:кгл, -главк* 'iiv? педготов м и ист»>льзсвз.чн нювшйнсие кадров" и сссг.

1909. - С. 1«

б. пстсллческле укаг-авя Ктсгкдеои пгмы-семинара биэтегногемикнин«.-:-oewo« »tu -чтсвач биология).' Москва 1990. - c.oo-eî; 65-&6:

т. н.чг>аи?гк1е рок one: папы по впедляв iaroo парагеи.яшчесюто ри?-piK'Hon/i'ocT. прсшвочуш. ш-т; Сост. т. к кторякою и ср. -Ростов н/д, 199?.

Нормативно-техническая докуимггапия '

а. Я'рокежскля л г., сомою а. г., Гальоева г. е ', Смолкобз л m избиения ¡* 19 ч ТУ-Ч: КЕС 7476 кз СЫЮРС-ТН; иил^стачесвде виегмон'ые ТКЛ^ЧЁ» о--«ггягяийуча^ aw ссро,г-оги'-<ескои изентквнсэди 43 сек-тяпов патг.геншх вио-рион •i'rp.ertsaeiik' ПРед.с. КЕС КЗ ОХР El, 06. j976.

9. Воронежская Л Г., Сомова А Г., Гальнева Г. 3., Смсшикова Л !í Измеье-ния rf 1 к лабораторному регламенту Я 60, утвержденному 22. 04. 7бг. hd сыворотки диатосщчесюге вибшонные типовые о-агтасгшнкрукиие прэтш 43 ceFonnoE патогенкьк вибрионов - Утверждены* преде. квс КЗ ОХР 21. Об. 7б.

ю. нижтан В Е . воронежская л г.. подосиншкова л а. гальаева Г. В -Ханумьян т. А Изменения к ТУ-42 и лабораторному регламенту на прмдеодство сухого щелочного агзра (МНИИВа, сухого основного пептона (ННИгеС) л питательного сухого агара (Иркутский НИМ). - УгЕер*дены преде. КЕС ¡3 СССР, 1960.

Авторские свидетельства

11. а-с. 314892 ост, кки С12к 1/04. Штамк бактерий Vibrio phosphcres-cens 6373 серотипа 55/ гальдева Г. а. 'бич/ль К. Г. - 2108232; Заявлено 25.02.75. зарегистрировано 28.01. 76,

1с. а. с. 515354 СССР, мки С1-1к 1/04. -штамм бактерий vibrio шояйюгез-cens 7401 серотии 50/ гальпева г. а , еичуль к. г. - к 2103231; заявлено ?5. 02. 75. Зарегистрировано 26. 01. 76.

13. А. с. 516963 СССР, ¡53! С12К 1/04. ¡МЭММ бакТОРИЙ Vibrio 1Ш 9!2 сб'ро-тина 45/ гальпева г. в , /ибинзон а, е ' - rf ci Ю500; заявлено з. оз. 75. Зарегистрировано 27. 02. 76.

14. А. с. 516964 СССР, МКИ С12К 1/04, Штамм баэтерш Vibrio has 2302 се-ропша 52/ гальдева г. в , Сомова А. г.. лпеиюон А. е. - к 2и0503; заявлено 3. 03. 75. Зарегистрировано 27. 02. 76.

15. А. С. 520398 СОСР, ККИ С12К 1/04. Итаы-f бактерий Vibrio Pfcosífiores-cens 7402 серотапа 49/ Гальмева Г. Е , Сомова А. Г. - tt 2105233; заявлено

25. 02. 75. Зарегистрировано 15. 03. 76.

16. а. с. -520779 СССР. НКИ С1?к 1/04. штамм бактерий Vibrio пае 1422 серотапа 51/ гальиева г. в . Сомава а. г. - к 2U0186; заявлено з. оз. 75. зарегистрировано 15. оз. 76.

17. а. с. 522232 СССР, жи С12к 1/04. Игзж .бактерия vibrio 1ВВ 93& серо-тапа 53/ Гальнева. г. & . Сомова а г. - * 2110496; Заявлено 3. оз. 75. Зарегистрировано 29. 03. 7(5.

18. А. с. 522233 СССР. ккк С12к 1/04. штамм бактегш Vibrio лаз 6071 серег,ша 43/ Галыива г. в , еичуль к. г. - № 21Ю502; заявлено з оз. 75. -ззреги-ститовачо 29." оз. те.

I . 19. а с. 58Г159 ОХР, МКИ С12к 1/04. штач! Vibrio Has 9507 для таенпйи-капии Еибрионов 1 гр. Хелбергз/ Галыкьа Г. В ■ Сомова А Г.. Всронежг-'ля л Г., Кутьи?ва КВ. - tf 239043С; Заявлено 21. Сб. 75. • Зарегистрировано 14. 09. 77.

го", ас. 561139 етт, нки С12к 1/ш. спаи vibrio яда S845 для получения ■пек-вой зггдотан51рукйей cheopotwi/ Гальнева Г. а ■ Сомова А Г. ■ Бзронежяая Л Г Куд^ва И. а - к 2390429; Заявлено 21'. Об. 76. Зарегистрирован^ 28.06 77.

21. А с. 537158 СШ>, ККИ с12к 1/04. зтгаим vibrio Has 9506 для '.шентай!-хадии ийшонов I гр. Хейперга' Гальдева г. В., Сскова А г., Юро^ежская л Г. ■ Клы>ева и. в - !f 2390423; заявлено ги Об. 76. зарегистрировано 14. 09. 74.

22. А с. 63-4337 сот. нки С12К 1/0Ч-. Й13Ж серотип 5 - продупент типовой агглотуниругаеп оеоротки/ Голъсева г. Е , Сомова А г. - «■ 2476237; Заявлено 4.04. тт. ¿акгисчифоеаео 26. 08. 78.

• 23. л. с. 535333 СССР. МКИ С12К 1/04. ¡ffrJHW Vibrio tttósphoresv-ens Р-9506 секстет 7 - прсоуценг типовой агг.'гя^иршпей сивойлки/ Галшева Г. а. £с«о-ьа А Г. - » 2'r"«e3; заяикпо 4.04, тт. зарегистрировано 23. ог 76.

, 24. ас. 634750 ссср, жч clck 1/0*. ггзкч Vibrio l^rtifncrescera f-?510 сс-к/пп 6 - цр&тгаент типовой агт.^тг slípvux-h сыеоготки/ Гсизхе. : Г. 3 , Sopo-Ксхжад л Г. - tf 2476283; заявлено 4. 04-. /7, Зарегиетк ковано г. Сб. 78.

гь. А.С. 6637Í6.CEGP; ЮИ С12Л Was« Vibrio <?Ilor 9183 - ЗООТРОТ КИТ-

мента меланина/ Гальцева Г. В , Саянов Р. и.. Линникова Л а . Нишяькин В н. -(f 2573525; заявлено 25. 01. 78. Зарегистрирована 29. 01. 79. .

26. д. с. 664990 охр. ики С12К. ктамм v. на« 9632 - продуцент пигмента неланина-* гальдева Г. В . либиизон А. Е . Сая№?в- Р М , лмшкова л В . Мдаанъ-кинБ. ¡i - jf 2573527; заявлено 25. о 1. 79. зарегистрировано е. ог. 75.

27. А. с. 68931? СССР, мкз С1£к 1/04. Способ КОНТРОЛЯ ростовых свойств питательных сред для диагностики холеры/ нилкяин В. н. ■ Воронежская Я г. ■ под-осинниксва Л С.. гальнева. Г. н . ханжьян Т. А. - ff 2649339; заявлено £7. 07. 7í ЗНХ^ПКТРИРОЕЭНО 7, 06. 7?.

25. А. с. 755773 СССР. ЯКИ С12К 1/04. етзмм Vibrio aibeilSlS 10035 г продуцент моноспешймеской згглетинирзтапей сыворопсн/ гзлшева Г. В . Воронежская Л Г. - ff 2737557; Заявлено 19.03.7?. Зарегисти-^с-р-ано 28. 04. 80.

29. А. с. 770185 'СССР, МКИ С12К 1/04. итзмм Vibrio albensis 94-99 - продуцент моноспещитескса агтактиникюлей сыворотки/ гадыхева. г. в - » 2737560; заявлено 19.03.79. зарегистрировано 13.06.80. -

го. а. с. 770185 охр. яки С12»' 1/04; итамм vibrio aibensis Р-10034 -продуцент моноспехмфшескои аткганируюшек сыворотки/ Гальцева Г- К -tí 2737559; • Заявлено 19.03.79. Зарегисли1Ровано 13.05.80.

31. V С. 772222 СССР. !КЙ С12К 1/04. Штамм Vibrio albOOSlS P-1013S 12 ceporana продувеиг »юноспешФическои агглсяимруивея сыворотки.' гальцева г. R . Воронежская Я Г. - if 27337558; заявлено 19.03. 79. зарегистрировано 20. об. ео. '

~г. А. с. 64767? СССР, мж ciac штамм vibrio aieinemicus 9831 - продуцент пигмента мелзнша/ гзлшева Г. В . Либшзон А. Е - tf 2562259; Заявлено 25.12.79. ЗаРеГИСЧИИРОБЭНО 13.03.81.

зз. а. с. 167190 сспр. нки С12к штамм Фага vibrionis parahaemmici для Фагодиагаостаки памгемолкхических вибрионов серотапа 05:К15/ /¡ибкнзон А. Е. Ус 3. И., Гальнева Г. В . Дегтярев Б. И - ff 4729980; Заявлено 16. 08. 85. зарегистрировано 22. 04, 91. •

Список основннх работ, опубликованных по теме дйссартацнт 34, Алексеева Я П. , Голубкнский Е П., Гальцева Г. В. и др.. Сйтавн-ггелы'.о-:-изучение окисления ианнозы неггтэт-ширукпихся и зльтор вибиюнами// Пробл. ОСИ. - Саратов. 197?.-1(53). с. 35-37.

75. Воронежская л Г. и др. Использования непрямого 1инУнол»а5-:е?иентнс'Го метода для серодиагностики // Проьл. ста. - Саратов. 1973, - 3.- С 88-91.

Воронежская Л Г.. Гальдева Г. В „ Бабичев 3. А. и др. диареГске заболевания, вызванные клг. галсяюкндаи, светящийся Еибишзки, их профадатог.? // оел. нзучн. практ. конФ. • по пробд. холера - Ростов н/Д 1984. - с. 93-102.

37. юронеаская л Г.. Сомова А. Г.. мединсим Г. к. и др. Экологъ-геоге«-<5ическое распространение НАГ-ш&рнонов различных сероваров// -Зотнежап. и зпиг-сЪтол. чумы - Саратов. 19во. - с. 74-~о.

зс. гальцева ПВО гене-шческон связи холеных и НАГ-нгагион"®'/ про&л. СОЙ. - Саратов, 1972. - 3. - С. 54-56.

39. гальнева г. в нелаю ¡необразован?» у холерного вибриона// га-кробиол. генет. и нмнунол. чумы и хедаш. - Саратов. ¡983. - с 69-74.. •

40. га.ьнева Г. В Сеетяз«ся вибрионы// Натер, у нзучн. кои^ер. по бактог-ин4еки и имнунол. : Тгуш научн. работ. - Вэгна. 1950,

41. гальнева г. а , Анисимова т. к. ю-ваншта хопетк нйрионсв// Те:-, обл научн. пра.\т. конф. врачей. - Брянск. ¡982. - С 86-88.

42. гальаева г. а, адаль к г., домарааский к к и др. Зибриоаигаая ПШНОГТЬ С1В0ЮТОК КРОВЛ ЛСЯ9Й// Сб. НЗУЧН. тр. 4 1. - íjO¿»PCCCmCK. 1994. - с S4&-150.

47. Гальае&а Г. 3., вика Р.А.. Каяазкков И. А. и sp. Завоз ?.слет«;: 'э

: - S3 -

Краснодарский" край//сб. научн. тр. Тан же - с 106-1 ю.

44." Гапьоева Г. В. ■ ГольдберГ А. И. Влияние антабакгериальчых препаратов на нелининообразуипие вибрионы// Книга: Акгуал. вопр. иммунол. ,' аллергол. и молекулят биол. - Краснодар, 1983. - с 220-221. ■

45. Гальдева г. в. ■ Гсльдберг а. и. , кижплова е н. динамика образования холерных антител при иммунизации вм5рж>нами// Вопросы иммунол. ' и колэкул. би-

. ОЛ. - Нальчик. 1981. - 1. - С "31-52.

46- гальдева г. в ■ гриднева н. и., воронежская л. г. и др. технология производственного изготовления модифицированной сухой среды хью-ЛейФеонэ// Тех-нол. произе сух. дшгност. пит, сред. Махачкала. 1974. -5. - а 97-юо.

47. Гальдева Г.'В.. Дерлят- С К. Гемолитическая активность вибрионов патогенных спя человека//Генет. и биохим. Еирулентн. возбУД.СШ: Мат. Росс, на-тчн. конф, - Волгоград. 1992. - С. 86..

43. Гальиева Г. В , Ермольева 3. В > саямов Р. М. и др. о таксономическом положении ФосФоресиирукших вибрионов// Пробл, OOii - Саратов, 1977. - 4. - с. 44-46. "

49. Гальдева Г. 3 . ерохин е е , Ерудный р. а. и др. Ямунесуспрнзионше грепараты для диагностики пшродно-очагошх и других инфекций// Организация зпиднадзора .при чуме и меры ее проф. : Натер, межгосуд. научи прак. конф. 1 - Алма-Ата, 1992. - С. 91-94. "

50. гальдеза г. в.. заияенов а. м. , Ерудный р. а.- и др. знтерс патогенная вибриофлор! как компонент водных экосистем в 'зонах рекреадии черноморского побарежья// Эюлог. состояние рекреашон., зоны ста Европейск. части ссср. Все-со)сен. конФ- Тез. докл. - Тбилиси- 1990. - с, 89-90. .

51. Гальдева г. е , Заяденов а. м.. Ерудный и др. йймоФлога рекреааюн-. ных зон черноморского побережья и ее роль в патологии человека// юта. микро-

биол.. эиидениол,. ииммун06и0д. , 1594. - б. - с. 48-50. .

52. галыква Г. Е . заяденов а. н. . Лебедев к. К и др. проблемы изучения V. species, вызывающих заболевания человека// соврем, асп. проф. зоонозв инф. : Тез. докл. научн. конф. - Огаврополь. 1991. - С 233^235.

53. гальдева-Г. Е. заяденов А. н.. Черноусова э. Я и др. холероподобный гастроэнтерит, обусловленный вибкю. Фяовиалис// Сб. науча .тр. 4 1. - Новороссийск. 1994." ~ С. 129-133.

54. Гальпегз г.а, Лебедев к.к. Перспективы аюлкнинесаешнс-го анализа ) при диагност® «Ж// Натер, регион совет протизочума учрежд. по зпидеиийл.,

эпизоогол. и п^.оси.--куйбыоев. 1990. - а 40-42.

55. Гальдева F. R, Леванова Г. Ф.. /ибинзон А. Ё " и др. о генетт.-¡еской . связи представителей ви5кк> холере// Сонр. асп. шяродн. очагов, эшшемиол. и проф. ОСИ болезней: теадскл. научн. конф. ; окск. 1993. - с 187-189.

56." rijibuesa г. Е. Леванова гт ф; , Лйинзон А. Е. Генссистематжа представителей хояешьк вибрионов/7 Сб. научат ч. 1- - Новороссийск, 19г4. - с 159-. 162. .

57. гальдева г. а", леванова г. Ф., нагорный с и. генотапиче. кая и Феноти-пическая харакгегмсткка v. species. // Аетульа вопросы ттрофилакшки чумы и дру-гах инФбкпйгнньк заболевали Ставрополь, 199%. - С 121-122.;

. 53. галыеза г. в, ЦбинзонА. Е , леванова г. Ф. гстогкя становления так- сояомического прдоокная жбишов Мечникова// Сб. научн. тр. ч. 1. - йоворлс-СЯЙЖ. 1994. - С 163-16©; • .

59- Гаяьвева г. Е . люинзон А. Е, Саяноз р. и. пигие1гторбраэугаие инамны шблкдак// зшпемюд. .клин.,днагн. и антаюпоноз. и зсоноз. инф. -Астрахань. 1932. - С. 194-196.

^ ей гальдева г. в , /иегеьси к Е . vc з. и. и др. жадогоге^^аФическ^е . рзсцрострйненнь шю4кяьвыц виШптв// натер. X й;есоюзн. конФ. ч 1. Гигие-

,-шч. асп. изучения биояогич. загрязнения объектов окружэшей среды. - Москва, 1988. - С. 57-58.

61. гальдева г. В . Нагорный С. И. Тирозиназная активность еи6рионов//Созр. асп. прс!-. зоонозн. инф. : тез. докл. научн. конФ. - Ставрополь, 1991. - с 235-235,

5Е- Гальдева Г. В., Нагорный С и. Качественный метод определения tispjsi;-назной активности шбтонов//йно4от бюл. Ростов-дон, 1993.

63. Гальдева Г. В . Саямов Р. М ■ Либинзон а. е. и др. о возмсошк ошибка:: :трм бактериологической диагностике холеры// /1аб. дело., И.. 1974. -6. - С. 356-358.

64. гальдева г. а , саямов р. м.. либинзон А. е. и др. о синтезе меланинов вибгионами// Цитохим. и биохим. исслед. в эксперим. и клинике. Сб. научн. работ. -чзльчик. 1979. - 8. - с 165-166.

65. ГальдеЕа Г. R , Сомова А. г., Воронежская Л г. Возможности идентификации бактерий родов Vibrio, Aerorronas и Pleslaronas серологическт методом// ПРОбД.СШ, 1977, - 6(58). - С 45-48..

66. Гальдева Г. В , Стержантова Л В , Ус з. И. Очистка бакгешосвгов мето- ■ дом хроматографии// журн. клин. лао. диага (в печати).

67. Гальдева Г. В . Стержантова Л В, Ус 3. И. Фаги светящихся вибрионов//" Сб. НЭУЧН. Тр. 4 1. - НОВОРОССИЙСК. 1994. - С. 155-158. ...

. 68. Гальдева Г. В , СУхнова Г. И Выделение V. vulnificus на территории СССР// Натер. У научн. конпрес. по бактериальн. инФекд и иммунол. : Труш изучи. работ - Ваша, 1990. - ' - "

69. Гальдева г. В . сухнова г. м., Дерлятко с. к. Образование сероводорода вибрионами//Сб.. научн. тр. Ч 1. - Новороссийск, 1994. - С. 184-167.

70. Гальдева Г. В , Ус 3. И.. Либинзон А. Е ГалоФипьные вибрионы и их Фа-, ги/Акт. вопр. эпшемиол., проф. и шага оси: Тез. докл. итоговой научн." конФ. 21-гг декабря 1989г. - Ставрополь. 1989. - а 57-59.

71. Гальдева Г. В. Усз. И,-. Р.ябченкойА и др. дологические свойства гапоммьньк вибрионов, выделенных пш сякз в г. Бердянске// совр. асп. пгиродн. очагов, эпидемиол.. й проф. СОИ болезней: тез. докл. научн. конФ. - Огск, 1993. -С

■ 190-191.

72. Гальдева Г. В . Ус з. И.. нагорный С И. и др. Перспективы изучения v. anguiilanjnv/ актузл. вопр. профилэкг. чумы и др. инФекцион. Заболевания -Ставрополь, 1994. - С. 123-124.

73. ГальдеЕа г. в . хаитович л. к. ГЪлковскип г. м Светящиеся е-^йкш и их этиологическая роль при острых кшечных инФекшях// Тез. докл. У .Бсерес. .съезда микробиоя и эпидемией. - М . 1985. - С 185-187.

74. гальдева г.в. ханумьян т. а', иестиалтановз Н.С. поп>'ляш«нная изменчивость холерных вибрионов//- Натер, регион, совет протавоч. учрежп. но эпшемиол. , эпизоотол.-. и БроФ. ,'ССИ - Куиалпев. 1990. - С 42-431

75. Ганин в В . Урбанорич Д А... .сомош А Г. и др. серологическое типиро-взние не агглетидарупшкея О-холерной сывоюткой вибрионов, выделенных на территории СССР// ЖНЭИ. - 1С79. -4, - С. 4°-53.

76. Дертева н. и.. Огнег-а н. с., Хрулева р. В и др. Характегас.-гоа чувствительности и специфичности диагрогтмчест! холерной о-сыворотки для реакции агглотинадии на стекле// ПроФ. СОИ., - Саратов, 1974. - 4. - С 31-37.

77. Егмольева з. В , Сомова А. Г.. Воронежская, д Г. и др. Серолопмеск-г-е изучение "..еагглкяинирукшихгя вибрионов// ЖШ, 1974. - 6. - С 12-15. -.

те. ерохин е п. и др. Опыт пгдаенения реакции непрямой гемагглотичадии в очаге холеш// Пробл. ОСИ. - Саратов. 1973. - 3, - с. 94-96.

79. Зайденов А а . Гальдева Г. В . Ерудный Р. А. и др.- Характер и степень контаминаши холерньми вибрионами 01 группы водных объектов в рекреадаонныя зона;: Черноморского побережья Краснодарского края// севр. асп. прЬф, зоонозн. инФ.: Тез. докл. научн. конФ. - Ставрополь. 1991. ■ - с. 243-244.

во. зайденов ан.. Гальпева г.в. Трудный р.а ида .Холевав Аваискок *

райэне Краснодарского края - завоз авиатранспортом или проявление местного эпидемического процесса// Сб. научн. тр. 4.1. - Новороссийск. 1994. - С. 110114.

81. Зайденов а. н.. ггаденко а. н.. Дэмарадсжй к. а и др. о диагностической ценности реакции определения Еибриопидных антител// 1К?К , 1975. - 3. -

С. 145-146.

82. Зайденов а. H , Налай В И., галмею г. В и др. Оценка потенциальной эпидемической опасности распространения холега водньм путем в случае савоза ее в г. Новороссийск// Собр. асг. природн. очагов. зпидемиол. и проф. сш болезней: Тез. докл. научн. конФ. - емск. 1993. - С 47-46.

83. Зайденов А. И., малай F. К.. Козина.Я В. и др. Этиежолсгаеская оценка условий водопользования в г. Новороссийске для обоснования нер профилактики инфекций. распространяющихся водным путем/'/ ссвр. аспееты клип и згеше-миол. инф. бол. С5. научн. труд мед ин-га - Краснодар,' 19<н. - с. 199-гсл.

64. Зайденов А. И.. саяиов Р. М.. Малолетков И. С. и др. ¿Тигельное переливание холерных вибрионов в естественно инфицированной сточной воле// SKai. 1978. - 12. - С 61.

55. Козырева л А.. терновой в я . -Кобрина да г. д . гальцева г. н роль нейраминидазы в прилипании вибрионов к шиечному эпителж// природн. очагоа , эпидемией., проф. со болезней. Te?. IV краевой конФ. • Ставрополь. 1978. -С ЗЕТ-369.

ее. кудрякова т. д., дудкина р. а . какедонова л д и др. поиск тшшрур-ших Фагов гапо-мпьных вибРионоЕ// совр. асп. природн очагоа эшоемиол. и проф. ста болезней: тез. докл. научн. конФ. - Омск. 1993. - с 219-220.

37. Лебедев К. К.. гальдева Г. в особенности жишокпелотаого состава некоторые видов шбшонов, обусловливагаих заболевания человека// Совр. асп. "> . проф. зооноза инФ. : Тез. докл. научн. конФ. - Ставрополь. 1991: - С £47-246.

' 68. Лебедев к. к., гальдева г. в , дерлятао с. к вирулентность некоторых представителей рода vibrio// Сб. научн. тр. Ч. 1. -Новороссийск. 1994. -с. 140-145.

69. Лебедев к. к., гальдева г. в . ленсович А. А. и др. циркуляция вибрионов в поверхностных водоемах Краснодарского края// собр. аса природн. очагов. эшкеми'зл. и проф. ОСИ болезней: Тез. докл. научн. конФ.. 1993. - С. 75-76.

90. Лебедев К. К. ■ Гальдева Г. В . нихайгаск Н. И. Деструкеивная активность '. вибиюнов// jksí - 1995.: - г. - с92-93.

, -91. /Кбедев К. К . Гальдева г. в . ккькович А. к лхиды светлпихся бакге-1 гяй vibrio álbensls// ш.- 1991. - il. - с. 11-13."

92. Лебедев К. К., Гальдева Г. В. Юськоеич а. К- зирноюклотаьа. состав суимзршк липишв vibrio aibensls// хгои - 1992. - 1. - с и-',з.

'. 93 либинэон А. К . ■ гальдева Г. В современное представление о таксономии холершх нчбриснов// Прогресс в познании микробного мира - Рига, 1980. - 1.

94. Либинзон А. Е . гальцева Г. В О таксономическое положении некоторых ■ представителей шда v, choierae // жкзи. 1991. - п. - а 41-44. .

53. /Ибшзон Л. Е., Гальсева г. R О таксономии холерных биг5°ионов// . Обл. яауч. праотч конФ по пробл. холера - Ростов н/д 1984. - с 34-?б.

9&. Либинзон А Е . ггльиева Г. В Совершенствование классификации Еида V. choierae// Совр. аспекты систематики микроорганизмов. нов« Фое*ы к коллекция -Алма-Ата. 1965. - а 31.

' '97. /№инзйн А. Е . /йвашва Г. Ф.. Гальиеса Г. В О выделении vibrio fluvial 13 на теритгоим ОХР // ХКЗН. 1991. - ff 2. - С20-гз. ^

96. /1еiliHÜOH А. е , Саяиов р. И. , еиуль ¡c г. и др. влияние иммунчотс' 0p-raiscHî на изменчивость «опорных вибргюноз// Акт. вопр. иммунсл. , аллеггел. и Mvieyyn 6¡s.vl - Краснодар. 193Т. - с 23П-239.

99. Лйикзой А. Е , Ve 3. Я , Гальпева Г. В и др. Фаги галоФильных шорко-НОЗ- // IE!. 1995. - ' 1. - С 15-19. '

:оа лййвзсн к Е., Ус. Э. И.. нагс-рная А. о.. Гдлыкаа г. В и др. звкдо-

- 5G - . ■

гическая структура шиевых токсикоинФекиий, вызванных морскими гало4ипьили ■ ВК5РИ0КЭМИ// ЗКЗй, 1994 - 6. - С. 20-21.

101. либинзон а. е . Шестиэшшова и. с., вкуль К. г. и др. Усовеизенство-вэние методики исследования воды ка шбрирфлору// Сб. научно/технич. прогресс в медицине и медтехнике. - Ростов н/Д, 1979, - с. St'-6S.

102. /мхвзрь н а.. Рялолова Р. и.. Кирова н. е к др. зьачечие прочности студня различных агакв для получения качествеш;ьк твтгателькых сред/ б ik. : теаш. производства с:-о-;. диагаост. пит. сред. - нахачкала, 1974, -5.-е

юз. Лукин ю. е , Ерожн Е п., Авдеев дн и др. Кжунодисперсионные те-гт-системы для яиапнос'шкй ¡яФекшй/ 1 Всесошн. съезд нммунол. : Тез. докп.. -.Косква, 19S9. - Т. 1. - С £29.

104. Мединский Г. м , зайденов А. М. СаямовР. К., галшева г. В . и др. случаи пишевьк токсикоинФекиий, вызванных НАГ-вкбРиокани 5 и 54 серотшов-'/ ЛЕИ, 1976. - 7. - С. 131-154.

105. Мшиотш В. R . Ешсова Д К . Дрожевкина К. с. и др. Применение дрож-жевык сред для выделения холенных вибрионов из объектов внишей среды// проол. оой. - Саратов, 1976. - г. - с. бб-бь.

! Об. Нагорный с. К , Гадьдева Г. Е . Кирдеев Е К. нэрфслогия и гльтаастау-¡ггура пигментообРазушЕ вибрионов// Совр. асп. природе очаг., эпидемиол. и проф. оси болезней: Тез. докл. нзучн. конФ. - сиск. 1993. - с 247-245.

107. нагорный С. И. ■ Гальяева г. к . Сгерясантова Л В спе;аральный аналю меланина холерных шбшонов//Сб. научн. тр. 4.1. - Новороссийск, 1994. - С. 197-200. ' - •

ics. Савельев В. н., закутинская r а.. Тепляков s а. и др. Разработка методики исследования на вибрионы, без шестичасовых' пересевов шттонньж вод// Акт. вопр. иикроьиол.. лаб. диагн. и проф. холеш: Тез. Всесаогн. науч. конФ. - Ростов Н/Д 1983. - С. 176-176.

109. Сомова А. Г., Воронежская Л. Г., Гальпева Г. в. и др. ДМ-Ференшация НАГ-вибрионов методом серологического типирования // Проб. СШ - Саратов, ^б. - 2. - С. 55-57.

1Ю. Соловьев Е Д-. кобимский Г. Д . Докарадскип и. н и до. измени? действия рецептор разрушавшего энзима 4шьтт>атъв культур холерных ыбрионов на эригрошггы и возможностей его использования для диагностики холеры,.-'/ ли, 1972. - 10. - С. 42-46.

Hi. соловьев Е Д , Кобринский Г. Д . 'Тальиева Г. Е о роли неирамил^азь-хслерш:: кибвдонов е патогенезе хопегы// ПИ?. 1974. - с. 94-100.

112. Хайтович А Б. ■ гальсева Г. В Роль некоторых микроорганизмов родов Еибрио и аэроконас при диарейных заболеваниях// ЕНИИ мед и мед -техн. rotf. к? ОХР. Д-5342 НРЖ. 1982. И.Ш.

из. хайтович а. Б.. Гальц^ва г. Е; Серодазгностака диареи, вызываемой не-котедьми представителями радов Vibrio и Aeramnas. // журя, гашены, зпид. , микз\ и иммун. - Прага. 1983. -2. - с. 215-225,

114. Х-аитошч А.В.. Галызева Г.В , Голковский ПН. диагностика и биологические свойства светашкся вибрионов в связи с к: ролью при диареях// Лзо. дело. - м , 1983. - 6. - а ез-64.

115. хайтович А- Б., К-шевич Г. Ф. ■ Голковский Г. П ■ и дя Распространение НАГ-виорионов различных сероваров среди людей и в объектах внешен среды г Крьискон облаем// ШЖ. 19S0. - 6. - с. 69-91.

116. Шелохович А. И.. Воронежская Л Г. ■ Епчуль К. Г. и др. Опиг использ»-

• вания модифицированного стетмомикроскопа НБС-1 для отеора колоний вибшонов в косом луче света//Пробл.оси. - Саратов. 1973. - з.-.с.91-94.