Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Т-элемент - новый тип гетерохроматин-теломерных повторов DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Т-элемент - новый тип гетерохроматин-теломерных повторов DROSOPHILA MELANOGASTER"

gil GR 9 1

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На права* рукописи УДК 575.577

ПАВЛОВА Мария Николаовна

ТЭЛЕМЕНТ - НОВЫЙ ТИП ГЕТЕРОХРОМАТШ1-ТЕЛОМЕРНЫХ ПОВТОРОВ DROSOPHILA MELANOGASTER

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН Научный руководитель: кандидат биологических наук

■ О. Н. Даяилевокал

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ', К А. Чуриков

,кандидат химических наук Г. О. Монаотырокая

Ведущая организациях Кафедра генетики и селекции

Биологического факультета МГУ

Ваи>*та состоится " " 1992г. в чао

на сасодании Опециаливироваиного ученого оовета Д. ОБЭ. ОБ. 70 при ЬЬоковоком гооудоротвенно:.г университете им. М. В Ломоносова

О диооертацией.можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

российская i от m

ОСУДЛуСТВ^П jo] )&!38;рщг5 БИБЛИОТЕКА ~ -

Awry tua поста текя. Теломеры - концы эукариотичеоких

а

хромооом - являются одним ив необходимых алекеигов, обеспечивающих стабильность хромооом. Изучение телом«рных районов хромооом ряда низших и высших эугсариот выявило коноервативм организации теломср: на концах эукариотичеоких хромооом расположены проатые повторы типа A/T(l-S)G(l-8), проксимально по отношению • к которым лелит более олокные повторяющиеся последовательности (Blackburn,19В9). Тем не менее, в теломер-ных облаогях хромооом некоторых эукериот, ь т. ч. дровофилы, не вьивлены "теломерные" проотые повторы. Однако у дровофилы описано семейство слотнх повторов, локализованных в теломерах, приденгромврном гетерохроматине и У-хромосоме, - гетерохрома-тин-теломерное (НеТ) семейотво (Young et el, 19ВЗ; Traverse and Perdue, 1989). Шказано (Biessmann et el, 1990, 1998), что определенная последовательность НеТ-оемейотва, названная НеТ-А -элементом, восстанавливает стабильность хромосом. Авторы обнаружили, что хромосомы, липеиные теломер, иногда становились стабильными, причем вое "»влеченные" яромооомы содержали определенную последовательность НеТ-оемейства, названную ими НеТ-А -элементом, присоединенную к поврежденному концу через полис А). НеТ-А-элемент обладает свойствами ретропоэонов, но не содержит открытых рамок считывания; авторы предполагают, что его ретропооиции обеспечиваются другими участками генома. Поэтому изучение последовательности НеТ-оемейства, названной Î -элементом, содержащей две перекрываххцнеоя открытые рамки считывания и кодирующей полипептид, способный участвовать в белок -нуклеиновых и белок-белковых веаимодейотвиях, может служить важным шагом в исследовании структуры и функционирования тело-мер у дровофилы.

Задачи исследования. Целью настоящей работы было определение и анализ нуклеотидной последовательности Т-элемента, изучение его транскрипции, a также изучение организации копий î-влемеята в геноме D. meloiiogaster.

Научная новизна реоультагов исследования. Среди последовательностей гетерохроматин-теломерного семейства D. melanogoater обнаружены кодирующие последовательности, назван-и"9 Т-элементами. Т-элемент содержит две перекрывающиеся открытые рамки очитывапия (0Р0). ОРС1 содержит мотив GTP-свяэыэа-ющнх факторов элонгации; 0PG2 содержит цистейновые мотивы, ха-

роктерлыз для GAG-белков ретроповонов и указывающие на опоеоб-нооть полипептида овявьтаться о нуклеиновыми кислотами, в также мотив "лойциновая молния", обеопечивающай формирование бе-док-белковых контактов. В геноме дрозофилы выявлено два типа копий Т-элемента: маморные копии, локализованные d юломерах аутоосм и X— лроиооомы и в Y-кромооомв, 'и Y-специфические копии, расположенные в основном в концевых сегментах Y-хромосомы. Показано, что копии Т-элемента воегда окружены другими лооледовательноетямн НеТ-оемейотва.

Практическая ценность. Клонированные фрагменты ДНК D.melanogester могут быть иопольеованы в' качестве еондов при иооледоваши теломер и оцепленных о ними грнов, а такие в работах по физическому картированию генома дрозофилы. Протяженные клонированные фрагменты ДНК дрозофилы (100 и ЗБОтпи), происходящие иэ Y-хромооомы, могут быть иопольеованы при научении Y-хромосомы D. melanogeus'ter.

Апробация работы. Реэультаты работы были предотавлены на II оимпозиуме 000Р-США "Структура зукариотического генома и регуляция огсопреооии" (Тбилиои,19в9), III Воеооюэной конференции по генетида и цитологии мейоэа (Новосибирск, 1990) и 33 ежегодной конференции по дрозофиле (Philadelphia, USA, 199й).

Объем диссертации. Материал диссертации изложен на _

страницах машинописного текста, содержит _ рисунков и _

таблиц. Описок цитированной литературы состоит иэ _ работ.

Ооновные результаты получены автором самостоятельно. Определение нуклеотидиой последовательности Т-элемента проводили оовмеотно о Е. В. Куреновой, А. Г. Веоелковым и А. Koga (США).

Материалы и методы.

Плазмиды и микроорганизмы. Для клонирования были иопольеованы векторы pUOlö и pUG19 и бактериальные штаммы НВ101, JM93, K80S.

Традиционные манипуляции о нуклеиновыми кислотами (субклонирование, Оауаерн-гибридиэация, определение нуклеотидиой последовательности и др. ) проводили по общепринятым методикам (Sombrook et а.1, 1989) о модификациями.

Компьютерный анализ нуклсотидных и вминокиолотис« пооле-)Вательноотей выполняли о помощью пакетов программ PC/GENE, IA SUN и GeneBee (ИМГ РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЙ

Глава 1. Онродоленж» иутедеотидной последовательности

Т-элемента н ее акализ.

X

Исходный фрагмент Dnv4668 был отобран иэ клонотеки ДНК melanogaster (Oregon RO) в pER322 по гибридизации в теломерн ишгвнньи хромооом дрооофилы. Реотркктно-гибридизационный [алио Dm4668 показал, что он состоит ив двух оубфрагмонтос Ш- фрагмента DtrS201, гомологичного ранее изученной поол^до-юельнооти НеТ-семейства - Dm66B (Doni1evskaya et al, 1991), фрагмента Dm2103, не гомологичного Dm665 (Рио. 1) и гибрнди-чощегооя исключительно в теломеры политенных хромосом. От-totbhô гомологии Dm2103 о ранее изученными теломерными поо-|доаателыюотями позволило предположить, что обнаружена новая тоне у пая последовательность ДНК D. nwloiiogoster. Для проверки •ого предположения была определена иуклеотидная пооледова-¡льиооть фрагмента D.tSIOO.

Анализ нуклеоткдной последовательности Dm3103 выявил на-гчие открытой рамки очитквання (0Р0). Сравнение нуклеотидной юледовательнооти ЬггйЮЗ и кодируемой им аминокислотной поо->довательнооти о базами данных DMA SUN (1091г) и GeneBee S9ir) не выявило протяженных областей гомологии Dm2103 о юлетовательноотями баа данных. Однако фрагмент DmS103 гомо-»гичен фрагменгу ДТ-А (Young et al, 1903), содержащему иоклю-геедько гетерохроматин-теломерные последовательности. Следо-1тельно, Dm2103 относится к семейству гетерохроматин-теломер-к последовательностей D. melanogoater, но в отличие от всех «ее описанных по.второв НеТ-семейства содержит ОРО.

0Р0 Dm2103 начинается почти от границы Dm2103, поэтому мы >едположили, что ■ Drr2103 является 3'-честью более протяженной пирующей последовательности.

8,7тлн

- л -

ГЬ£МПЯ п-2£С1

1,ББтпн 1,2тпн

газ

11,7тпи

«Ю [

13, Этпн

-ПвЙЗ-ЗЗ-

Б, 7-гпк ЙР Р Р Р

Р Р

тштЫш

р р

В 2,6 В

Рио. 1. Фрагменты ДНК О. т»1апоеазЬег, содержащие копии Т-элемента. Указано название фрагмента и его размер. Стрелками обозначены ОРО. Сайты рестрикции: Б-ВатН1 , Р~Рз(Л, й- ЕоойК Для фага 36 указаны только оайты РзЫ, расположенные внутри ВотН1-фрагментов. Штриховкой обооначены области гомологии о Б'частью Т-алемента, черным цветом - о его 3' частью, белым -области гомологии о НеТ-последовательностями. Указаны размеры ВвтН1-копий Т-элемента (в тпн).

Полную копию кодирующей последовательности искали во фрагментах ДНК дроэофилы, клонированных в векторах на основе фага "лямбда" и содержащих районы гомологии о 0т8103. Фаг Г2Э содержал последовательности, . гомологичные РпйЮЗ и ОтббБ, и последовательности, не гомологичные ранее изученным (расположенные в Б'-районе от района гомологии с 0т2103) (Рио. 1), что

повволило предположить наличие в нем полнораомерной копии кодирующей последовательности. Фрагмент 0ш23-33 (б, 7тпн), представляющий собой ЕооГ?1-субклон фага 23, оодержаший предполагаемую полную копию кодирующей последовательности, был попользован для дальнейшей работы.

1.1. Определение н анализ нуклоотидиой последовательности Т-элемента. Выла ' определена нуклеотидная последовательность клона ЮгпгЗ-ЗЗ. Для сравнительного аналиеа попользовали нуклео-тидную последовательность походного клона ОЫБ68. Анализ этих последовательностей выявил следующее.

1. 0т4Б68 гомологичен З'-чаоти ЕпЙЗ-ЗЗ (74% гомологии).

3. ОпЙЮЗ и ОггйЗ-ЗЗ содержат открытые ремки считывания (ОРО). ОгйЮЗ содержит ОРО длиной 11Б8пн, кодирующую полипептид размером 386 аминокислот. ОтйЗ-33 содержит 3 ОРО длиной 1440 и 1614пн, перекрываюциеоя на £00пн (сдвиг рамки считывания '1) и кодирующие полипептиды размером 476 и БЗб аминокио-лот. Полилептид, кодируемый ОРО 0т2103, соответствует О-району полипептида, кодируемого 0РС2 РггЯЗ-ЗЗ.

Последовательность из РпйЗ-ЗЗ, включающая 8 перекрывающиеся ОРО и окружающие последовательности, была яаавана нами Т -элементом (от "теломерный"). Нуклеотидная последовательность Т-элемента и кодируемые им аминокислотные последовательности приведены на Рио. 8.

'3. Район, содержащий две ОРО в 0т23-33, не фланкирован протякенкши прямыми или инвертированными повторами. В 3'-районе от ОРС2 расположен элиго(<1А) ((с!А)£3), которому предшествует сигнал полиаденилировання ААТААА. Наличие в РтЗЗ-ЗЗ двух перекрывающихся ОРО и олиго(йА) в 3'-районе от ОРС2 и отсутствие фланкирукщих открытые рамки считывания протяженных повторов позволяют предположить, что Г-.элемент относится к классу ЫНЕ-подобных ретротранспоэонов. Мы не располагаем нукяеотид-ной последовательностью мишени без интегрировавшей в нее коп-и Т-элемента, а такие нуклеотидной последовательностью второй полной копии Т-элемента, поэтому не можем одноеначно определить размер Т-элемента и его границы. Однако можно предположить, что последовательности АААААТТ и ААААТТТ, расположенные

AAAGTTTААААЛГГСТОТССЭЗССеаAAAATTTGAACGGGGACGATAAAAAGATTTAATT 600 GAGAAAC3AAAAAGCGAACAATTATTCAGTGAACTATTTGTGCAAAATTGACAAGOAQAOS 660 CCATAATTAAAAGGAGAAGAAGCCAAAAGACGAAGAGAAGAAAGOAAGCAGAAGAACTCA ?20 AAGAAGAAAAGGAGGAAAGCCCAAT TAAAGAAAGCCAGGGT AT T T AT ACCT T ACACTT AT 780

CâTTTAATATAACAAAAACOCAAOATGTOCATGTGCGAOAACGTTTTTTGTGACGATGAG 040 ---GlnLysRroAsnKETSerbiETSerAspAsnLeuPheSerAapAspGlu 1С

GTACTTTOAATTTCCTÍCAAGGCOAGAAGA№G.í.TCTTGTCCGTTOTaO(JTGAATATATCG 900 V=lLí L^rîleSerberSerProGluGlnArgSerSerProPheTyrLeuAanlleSer Эб

CCCATGTCCCACGGATCAGACAATTCTCAGATTAATACAGTCATOATTAATTCGAAGAAA 960 ProMETSe rH i sGlySerAspA3nSerGlnIleAsnThrValIleIleAsnSerLysLys £6

TTGGGCTGAAATGMGGAGACATAAGTTTAAAAAAGTCTTGTGGGGGTGCTATAAAAATT 1021 LeuProSerAsnGlnAloAapIleSôrLeuLyaAsnSerSerGlyAlaAlûIleLysIle PO

GTTAATTCCCTTTCAGACAAGMGAAAGAGAAaACAAACGTTAATAATGCCOAAAAAGAO 10в< Val AsaSerLe uSerH i sLysLysLysGl u ^snfhr AanVal АзпАзпЛ1 e£!l nLys Азр 06

GCCCTGTGAGTGAGGAATAGTACTGGAAGGACTTGTGGCGCCAAAAGGAGCATCrTGAGAG 114* ProLeu5erLeuThrAsnThrThrAlaSerThrCy3GlyAlaLysSerSerIleSerGlu lit

GGGAAATTGTCTTCTCCTOCGTOCACOTCACAOACATATGAGGGGAAATTAOTCACAAAA 120( GlyLysLeuSerSerProProSerThrSerHi sThrTyrGluGlyLyaLeuLeuThrLys J3¡

OTTACTCACACACACAOAGAOTTTAGAGGCGCOAAAACGAGCGATGCAATGGGAAGTTTO 126C l^uThrHis'IhrHiaThrAspPheArgGlyAleLyaThrSerAapAleiiETGlySerPhe i«

CCCTCTCTCTCGCACAGCGACAATAGCATAGAGAAAAATCTGAGTTCTTCCACGAAAATT 13S( ProSorLeuSerHisSerAapAsnSer HeGluLy3A3nLeuSerSerSerThrLy3l le ÍFS

GGACOAAAOGOTTOTTCCCOTCCTTCTCATGCACACACTCACAOTAGCAAATOOAOTGAT 139( GlyProAsnAl eSerSerProProSerHi зА1,аНi sThrH : :ThrSerLysSerThrAsp 1Ш

ATAAGOTTAGAAAGGOGGTCAAAACATCCOGCGOTTGOOAATACGGACGGACGCTCTATA 144C IleSerLeuGluSerArgSerLysHisProAlaLeuAlaAsnThrAapAlaArgSerIle Sit

AAAGCCAATGCTAATGAOAATGGGGAAATTTrÓTCCTCACTTATACAAATTGACGAACGC 1БОС LyaAl оАзпА1аАзпАзр AñnGl yGl u I lePheSerSerLeu IleGl n I leAgpGluArs S3t

AAGCAAGAGGAAAGGCOTTGGACAACTATCAACGCTTTTTGGTCTATTTTTAAACGGAAG 1Б6С LygGlnGIuGluArgProCysThrThr IleAanAlaPheTrpSerI lePheLyaProLya JS6l

GCGGACGTTACTAAACTAAGTCTAAAGAGGAAACCCACCAATCCGACTAAAAAOACTGGG 16£C ProAspValThrLysLeuSerLeuLysArgLysProThrAsnProThrLyaAsnThrGl y f&t

AAAAAATGCAT CTCCCGTCATAAAAAGAGOGCTT ATTTATGCCOTTCCGCTCAGGATGAT 168C Lv3LysOygI lcSorProHloLyaLyaiSerAIaryrLeutJygF'roSerAlaGI nAapAap B9í

TTAAATTTAAATTTAAACCCCAAATCTAGCGOGAAGCGCACTGTGGTGAATTTACGAGCT 1 ?4C LeuA3nLeuA3nLeuAsr)ProLy3SerSerAlaLysProThrVal Val AsnLeuProAla 3íí

GCCCGCATCCTAAGGCGOOCTGCAGCCAAGCGGGATTTATTTAAATCATCATCCTCCCGA 1Ö0C AloArglieLeuSe rArgProAloAlaLysArgAspLe uPheLyaSe rSe rSe rSe гArg 33t

AGCCCAGACGAGCAGCOTATGAGTTTTTCG0AAGTGGTCGCTGGCACGGGTTCAATTTTT 186C SerProAspGl aG 1 nPr-oMETSe r Phe Ge rG 1 uVal Val Al &G1 yThrGl ySer 11 ePhe 3Bt

GCGGCACCCTGTGTCaCGGCACOTTTAACGAAAACTCCAGGCAAGCGGACAAACGACGAT 1920 AlaAlaProCysVelProAlaProLeuThrLysThrProGlyLysArgThrAsnAspAsp 376

CfTGGACTGCTCCAACTTTAAGACGCCCAATAAAAAATTATGCGCGACÎTCCAACTTTGTA 1980 LeuAapCyaSe гАзпРЬе LyaThrProAsnLyaLysLeuCysAJaThrScrAsnPhcVol 306

---Ly3lie METArgAspPheGlnLeuCysAsn 10

AOTCCCAGCATTTTTCCGCCGGTCATCACTCCCGTTrTCAAGAGCAAGGCAGCTCAATCT 2040 ThrProSerl lePheProProLcu IleThrProValPheLysScrLysAlaAlaGlnSar 416 SerGlnHisPheSerAlaAloH isHisSerArgPheGlnGluGlnGlySerSerl1еСуз 30

GTTTACGAGGAATCCAAAGCCAGAAATGGACCCCCCCCGCCGGCCOTCGCCTGOAGCATC 2100 ValTyrQluGluSerLysAloArgAsnGl yProProProProAledjeuAlaCysSerlJe 436 LeuArgGl y I leGl nSerGlnLyaTrpThrProPro/U oGl yProArgLeuGl nHi sGl n БО

AATGCCTCrGCTCGCAGCGGACGGCGCCACCCGGGATCGCCCCCCTACCCCCTCATAATA £160 AsnAlaSerAl¿¡ArgSerAloArgArgHi sProGl ySerProProTyrProLcuIlello 4Б6 CysLeuCysScrGlnArgThrAlaProProGlyUcAlaProLeuProProHisAsnThr 70

CAGATGOAGAGCTGCCTCGATGGAAAATCGTGCCCCAGAGCCGTAGAGCACCTCOTATAO 2220 Gl 11 hi ET Gl nSc rCvsLeuHi sGl yLysSc-rCysPnoArgAl aValG 1 uH i aLeuLe uTyr 476 AspA1aGlиLeиProProTrpLysIlcValProGlnSerArgArgAlaProPro11eLeu 90

TCGTCAATGATGTAAAGGAAATTGTACCTCTACTGGAAAAGCTGAACTACACAGCAG3AG SSG0 SerSerMETMET--- 400

ValAsnAspValLvaGluI 1 eVeilPi'oLeuLeuGluLyaLeuAsnTyrThrAlaGlyVal llO

TGTCCAGCTATACTACTAGGGCTATAGAAGGAAACGGGGTCAGGATACAGGCAAAGGACA 2340 SerSerTyrThrThrArgAlal leGluGlyA-enül yValArgIleGlnAlaLysAspMET ISO

TGACCGCCTATAACAAAATTAAAGAAGTCCTGGTGGOOAACGGACTTCCTTTATTCACCA 2400 ThrAlaTyrAsnLyal leLysGluValLeuValAlaAanGlyLeuProLeuPheThrAsn IJjO

AGCAGGCOAAGTCGGAGAGAGGOTTCCGAGTCATCATCAGAGATCTCCACCACTCCACAC 2460 Gl nProLvsScrG 1 uAr gGlyPheArgVal 11 e 11 e-Ar gH i aLeuH i зН i sSerThrPro 170

CATGCTCGTGGATAGTCGAGGAACTGCTGAAGCTCGGATTCCAAGCGGGATTCGTCAGAA 26S0 CyaSerTrp!leValGluGluLeuLeuLysLeuGlyPheGlnAlaArgPheValArgAsn lOO

ATATGACGAATCCGGCTAOAGGTGGCCCCATGCGAATGTrTGAAGTGGAGATCGTGATGG 2БВ0 METThrAsnProAlaThrGlyGl yProMETArgMETPheGluValGluIleValMETAla S10

CCAAAGACGGCAGTCATGACAAAATACTCTCACTCAAACAAATCGGTGGGCAAAGGGTGG 2640 LysAapGlySerHiзAspLya11e LeuSerLeuLysGlnÎleGlyGlyGlnArgValАзр S30

ACATTGAAAGGAAAAAGAGGACACGGGAGOGAGTCCAGTGCrACAGATGGCAAGGGTTCA 2700 I leGluArgLyjA^iiArgThrArgGluProValGlnCyaTyrArgCyaGlnGIyPhcArf; SEO

GGCATGCCAAAAACTCTTGCATGAGGCCGCCAAGATGCATGAAATCGGCTGGCGAACACC 2760 Шг^1^уаАзг^г<^аЦЕТАгкРгоРгоАгеСуЫЖ^уадегЛ1еД1уС1иН1г»Ьеи ZPO

TGTCTTGCTGTTGCACCAAACCAAGAACCACCCCCGCCACGTGCGTAAAÏTGCTCTGGGC 2820 SorSerCy^aThrLyaProArgThrThrProAlaThrCVaValAgnCygsSerGlyGln SOO

AGGATATTAGCGCGTAQAAAGGATGCCCTGCATATAAGGCGGAAAAACAAAAGCTGGCGG 2000 HiallcScrAlaTyrLyg^lyOyaProAloTyrLyaAlaGluLyaGlnLyaLeuAlaAla .410

CAAACAACGTTGACATAAACAAAATAAGAACAATCAAAGACGCAACAAATAAOTTTTATA 29-10 АзпАзпУл! Asp I leAsnLysIleArgThr I leLysAapAlaThrA^nArJnPIwTyrLys ОЗО

. - в -

ААСОТСАЛСаСОССССТСТАС(ЗСААСА/.САОСССГГСОаСТЛСС60АСАаЗТСАОаААТСО зооо Агеа1 па1уРгоРгоЬеиАгеАзп^пТЬгРгоАгеЬ»иРгоН 1 зЗегЗегА1 о11еЬеи 31

ТОАССАААТСААТтеССаААаЛСОСОАаеАОССАСССАНАААВТССАТйТТАААТССАТ 3060 ЗегЬузЗег11еА1йШиА1йАге61пВ1иА1аА1аАгеЬузЗегШТЬеиАзпРгоРЬе 37

ТССйАСААААТ А7ЛААСС>АС А&ААС1АСС АС01АТТ СТССГССС АСйАС АСвСЗССАТ ТС А(ЗА 3180 АгеййпАзпI1вАзпАзрАгеАгеРгоАгеРЬвЗвгЗегН1эАзрТЬгА1аПев1п1уэ 3£

АШЗТСТСААТ АААТОССаЗСОАААСАСЯЗААСААААТ АСССАААААОвОТ АОЗАТ АЭССТ 3160 Аг&ЬеиАзпЬузГгрАгеАгеАзпТЬгАзпЬуз11оР>гоЬузиузв1уАге11вА1аЬви -41

ТАААОбАТААТбСАААССХ/АССАОООООАСАТАвОАСААСТААСССАвСООАААСАОАТС 324С ЬузАзрАзлА1аЬузРгоАгеРгоА1аН 1 зАгйТЬг5«гАзг.РгоА1 е^ХпАгвН 1 зЬеи -И

ГвОАввАОТАСаАа^САТ<^<ХОААВХААА(^А5ТвААвААМааАСаАавШС7в ЗЗОС GluAí5pTyгGlllAзpMETLвцArвAre<31uArgSerGluGluAзnlAзpGlnQluSвrGlu 41

АСААООаЗАСССХЗСААТАССААОСАСеТСаЗСААТСАСАОССОТССаАССАССАОСАСАе Э36С Ьуэ61уТЬгРгоАзпТЬгиузВ1пУаШ1уАзпАзрЗегРгоРгоТЬгТЬгЗвгАгеА1а

САйОСА(ЗА6ССА(ЗСТТТААСССААСААТСАТТСАСОАТАССАССССАТСОССАААААТСТ Э42С А1аАгеА1аЗегРЬоиузРгоАгеПвПеАзрАз'рТЬгТЬгРгсЗегРгоЬуз11вСуз

ВОААТСХЗСААОТОАСАААААЗвОСЯОТТСОАССАОСССАСААСААаСТТАООТААТ АСАЙ 348С АзпРгоАзп5огС1гй.уз31уЬеи1еиАзрАзрРгоТЬгТЬгЗе^еиА1аАзг)АгкУа1 61

ТСНАСААТТТАЙААААВААААТТСАСАТТТТААТОСЗССТТААТСАТ АСААСХЗААЗЛААТА ЗБ4С АзрАзпЬгиОЫЬузЬуз! 1еАзр11еЫиШТА1аЬои11о11е01п01 уАгеАзпАзл К

АОААТСТТОАСАТСвАТАСАТССААТТААТСПТАСААСТАСТТАТАТАТТСТТТААТААА ЗбОС АзпЬвиАзрМЕТАзрТЬгЗегАзп------&

ТАТАТССААТАСААААССвСЗАССЗТСеОТСГГССТТТТААААТССТТСАССаТСАТСАССТТ Э66С ССТСВАСбОАОССТААТТТАТТСООАААААТАААТСААТТАТАТСТТООСАСАААААТбТ 372С АААСАСАСАОТСАССТАААСОСАСССССАСОААСААваСТАТаАСААСОСАСТССАОСТб 3?вС АТСТВТААаАААС?ААААМТАТвААТАеАТАСАТСаАТАТСАААвСАТАСТОСеаСАаАА 384С САТвАТеаСАААООССАСТСССТ6САОСААСТТАТССАСААС0ТСАСТТАССТвАААТТТ 390С САААТТТСТТСССЗТАС0АТСТССТСТА5ТАТССТТАТСАСА(ЗСТССААТСТАСТТвСАА 396С ТС0Г0СА0Т0СААГ>АА0аТАСТА0ААА50ТССАТАСЗТТТТСАТСА0САСЛССТСаТСС 402С ООАЗОТОСТААААААААТТТССТТССТОСТССТСТТАТТСАСЙСТААААССТТ ААААСС'Г 406С

Рмо.В. Нуклеотидная последовательность Т-элемента ШпЕЗ-ЗЗ) и кодируемые км аминокислотные последовательности. Цифры обозначают номера нуклеотидов (обычный шрифт) и аминокислот (куроив). Предполагаемые дупликации мишени выделены жирным шрифтом. Сигнеи полиаденилирования и олиго( dA) подчеркнуты. В полипептидах цисте-иновые мотивы выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, мотиш (ЗТР-овяоывающих факторов элонгации и "лейциновоя молния" подчеркнуты, богатые пролинами участки выделены курсивом.

IteTA () An Hot —.......5-

OPOl -

OPCB

EF

•е-

су»

_I_

Pro

Pro

Oya

JUL

"7Ш"

Leu

Рио.З. Схема строения T-элемента (А) н ооновные мотивы,' оо-держакиеоя в кодируемых им полипептидах (Б). Обозначены: А: НеТА

- НеТ-А-боко, НвТ - НеТ-последовательности, () и An - сигнал по-лиаденидироваяия и олиго(с!Л); стрелками обозначены ОРС и треугольниками - дупликации мишени. Б: Суз - циотеиновые мотивы, Pro

- богатые пролинамн участки, Leu - мотив "лойциновая молния", EF

- мотив GTP-овяоьшаюших фактсроэ алонгацин.

Т-алеман® НоТ

OPOl

ОРС2

R 23-11 И

I i

У/////////Л»

В 2103 P 2201 В

1.4

Б*

i. ее

3'

1.2 НоТ

Рио. 4. Гибридиаационные вонды, содержащие части Т-элемента и НеТ-пооледовательности. Под каждым фрагментом укаваны его размеры (в тпн). фрагменты клонированы по рестриктаэам: R-EooRI, Н -Hindi 11, B-BnmHI, P-Patl. '

на границе олкго(<1А) и в 6'-районе от начала OPOi в DmS3-33 (Рио. 2), являются дупликациями ДНК мишени. В этом одучае рае-мер Т-алемента - около ЗБООпн, и Т-олемент включает в себя около ЕБОпн Б'нетранолируемой области, йвООпн, содержащих й перекрывающиеоя ОРО, и около БООпн 3'нетранолируемой области (Рио. ЗА).

4. Т-олемент соседствует о другими последовательностями НеТ-оемейотва, в т. ч. о НеТ-А-елементом. На расстоянии около БООпн от Б'-граница Т-олемента расположен НеТ-А-боко - высококонсервативный Э'-конец НеТ-А-алемента, участвующего в "вале-чивании" раворванных концов хромосом дрооофилы (Bieasmann et al, 1960, 1692).

3'-район Т-элемента также граничит о последовательностями НеТ-оемейотва. Оравнеиие иуклеотидных ; последовательностей Dm£3 -33 и Dnvl668 покавало, что гомология между ними обрываетон вбливи расположения олиго(<ЗА) Dm23-33, и последовательности, лежащие около предполагаемых 3*границ этих копий Т-елемента, не гомологичны друг другу. В олучае способности Т-влемента к ретроповкциям ато свидетельствует о специфичности интеграции Т -элемента по отношению к оемейотву гетерохроматик-теломерных последовательностей. Однако нельея исключить, что отсутствие гомологии между 3'флангами двух копий Т-едемента может быть выевано перестройками окружающих Т-влемент последовательное-тей.

Ш-видимому, сооедотво Т-алемента о другими последовательностями НеТ-оомейогва являетоя обявательиым для большинства копий Т-элемента (ом. Гл. 3). Возможно, что в олучае способности Т-элемента к ретропооициям НеТ-яооледовательности являютоя местами его интеграции.

1. g. Aikupct открытых рамок очитьршрст Т-эламяигга. Аналив иуклеотидных последовательностей Dw2103 и Dm23-33 выявил наличие одной открытой рамки считывания (ОРО) в Dm2l03 и двух перекрывающихся ОРО в DmS3-33. Dtn2103 оодержит ОРО, кодирующую полипедтид размером 386 аминокислот. DmE3-33 оодержит две ОРО длиной 1440 и 1614пн, перекрывающиеся на 880пн (сдвиг рамки считывания -1) и кодирующие полипептиды размером 476 и 636

аминокиолот (Рис. 2). ОРО Dm2103 соответствует 3'-части ОР02 Drtß3-33 (64,6% гомологии между лолилептидами)»

Аналио открытых рамок считывания Dnri23-G3 повволяет предположить возможность трансляции обеих ОРО: в начале 0Р01 и 0Р02 расположены инициаторные кодоны, которым предшествует пурин (А) в положении -3, причем окружение инициаторного кодона 0Р01 соответствует коноеноус/ отарта трансляции, • выведенному для дровофилы (Cavener, 1987).

Перекрывание открытых рамок считывания оо одвигом г мки -1 объединяет Т-элемент о ретровирусамн и ретропотраноповонами и поэволяет предположить для Т-элемента трансляцию со одвигом рамки, приводящую к образованию Гизюп-полипептида, как это показано для регровируоов (Jooks et al, 1987,1088).

Полипептиды, кодируемые VPC1 и ОРОЭ Dm23-33 (полипептиды 1 и Э), имеют следующие оообенности .

1. 0Р01 и OPOS кодируют основные белки.

2. Для полияептидов 1 и 2 характерно высокое содержание пролиноВ (9,1% и соответственно). С-кон©ц полипептнда 1 и N-кокец полипептиде. 2 особенно обогащены пролинами и содермат 16% и 28Х пролиновых остатков соответственно (Рис. 2, ЗВ).

3. Центральная часть полипептида 1 ^содержит мотив GTP-овяэьшающих факторов элонгации, предположительно обеспечивающий взаимодействие факторов элонгации о пептидил-тРНК или о рибооомой (Kohno et al, 1906} Grinblod et al, 1969).

4. G-конец полипепгида 2 содержит "лейцнновую молнию", указывающую на способность полипептида взаимодействовать о белками и встречающуюся в белках-регуляторах транскрипции (Landaohula et al, 1989; Turner and Tjian, 1689), а также в белках, овяэываюшлхся о теломерными районами хромооом инфузорий (Fang and Cheoh, 1991).

Б. Полипептид 2 оодержит цистеиновые мотивы, характерные для GAG-белков ретроповонов и указывающие на способность полипептида к овявыванию о нуклеиновыми кислотами (во 2-м мотиве 2 -й циотеик оаменен на оерин, X - лхбел аыкяокиолота): СХ2СХ41Ш0 Х4 0X2SX3HK40 Х9 СХ2СХЗНХ60.

В районе цистеиновых мотивов наблюдаетоя выоокая гомология (42%) между полипептидом 2 Т-елемента я GAG-белком, коди-

руемым ОЮ1 ретроповона дроеофилы jockey (PrUrnagi et al, 10вб), В центрально/, чаоти полипептида 1 расположен такаю неполный цлотекловый мотив О'АЗНХ&О. Дпличие циотеиновых мотивов объединяет Т-алемон? о ретропоэонеми. Полипептиды, кодируемые ретропоеонами, оодержат такие район гомологии с обратными -ршюгсриптавоми ретровируоов (Pooh et al, 10в9), однако нам ив удалось выявить в полипептидах 1 и 2 Т-злемента обдаотей гомологии о обратной транокрилтазой.

Таким образом, анализ лугслеотидной последовательности Т-элемеита и |аддируемых им омкнокиолотных последовательностей показал, что Т-элемент обладает свойствами LINE-подобмых рет-ротранопоеонов. Об этом свидетельствует наличие двух перекрывающихся ->Р0 и отсутствие фланкирующих их протяженных повторов, наличие олиго( dA) на З'конце Т-влемента, а также наличие в одном ие лолипелтядов циотеиновш мотивов и богатого проливами района, характерных для GAS-белков ретропоеонов. Однако отоутотвие в полипептидах Т-эломента областей гомологии о обратной транокриптаэой не позволяет отнести Т-алемент к "классическим" оетротранопозонам типа LINE.

Глада 2. Мвучетю TpcurcitpMtoWK Г-вломэята.

Наличие открыть« рамок очитывалия поеврляет предположить, что Т-элемент должен быть траиокрипционио активен. Однако Northern-гибридизация суммарной РНК и полиА+ РНК куколок _и имаго дрозофилы на Ш2103 (З'чоогь Т-элемента) не выявляет гомологичной Т-олемвнту РШ ( О. К Данилевокая, личное оообвр-ние).

В нашем распоряжении имелиоь библиотеки кДНК, подученные ив мРНК D. melanogaster на различных отадиях развития. Библиотеки кДНК эмбрионов, личинок, куколок и имаго (самки) линии Oregon R были любезно предоставлены сотрудником Вашингтоново-кого Универоитета г. Оент-Луио (США) D. Smoller, библиотека кДНК куколок линии Canton S была ¿цобевно предоставлена сотрудником ИМГ РАН В. Е. Алаторцевым.

О помощью скрининга на еонды, содержащие части Т-элемен-

та, мы анализировали библиотеки кДНК на наличие гомологичных Т -олементу клонов. В качеогво гибридивациояных вондов иопольоо-валн клоны DmS3-ll (оубклон фрагмента Dm33-33), содержащий Б' чаоть OPOl, и DmS103, содержащий 3* чаоть 0РС8 и 3'нетранолиру-емую область Т-влемента (Рио. 4). Библиотеки кДНК, при конструировании которых ис..ольоовали мРНК эмбрионов, личинок и имаго (оамки), не содержали гомологичных Т-оломенту клонов (было проаналиоировано не менее вБООО клонов ив каждой библиотеки). Ив 8 библиотек кДНК, приготовленных и» мРНК куколок (линии Oregon й и Oanton S), было отобрано 10 гомологичных Dm2103 (З'чаотн Т-элемента) клонов. Отобранные клоны гибридивовали также на вонд Diti220i, граничащий. о Т-элементом в иоходном фрагменте ОЫБбв и содержащий НеТ-пооледовательнооти (Рио. 4). Ив 10 отобранных клонов, гомологичных З'чаоти Т-елемента, 2 клона гибридивовалиоь также о Dir5201. По-видимому, ни одна библиотека не содержала клонов, гомологичных Б'чаоти Т-елемента (Din23~ll).

Были определены и проанализированы нуклеоткдные последовательности двух клонов, гомологичных З'чаоти Т-злемента (клоны 03 и Р9), и клона, гомоло!кчного З'чаоти Т-олемента и DmggOl (клон 0612). Анализ нуклеотидньк пооледовательноотей отих клонов выявил следующее (Рио.6).

1. Клоны не содержат протяженных ОРО; в клоне 03 аминокио-лотная последовательность, гомологичная полнпептиду 8 Drr23-33, прерван^ отоп-кодонамн; клоны РЭ и 0612 оодержат район ДНК, кодирующий последние 22 (С612) или 25 (P8) аминокиолот полипептида 2 DmS3-33.

Наличие клонов кДНК, содержащих только-3'чаоть некодирую-щих копий Т-элемента, может быть объяснено, по-видимому, преобладанием в геноме нефункциональных копий Т-элемента о усеченным Б'районом, что свойственно LINE-подобным ретротранс о-»онам (Sohwara-Sonroer et al, 19В7-, Hutchison III et ol, 1969).

2. Клон СЗ содержит делецию (9пн) в кодирующей области Т-елемента (0PC2)-, клоны P8 и С618 содержат делеции в З'нет-ранолируемой области Т-элемента (относительно изученных геномных копий).

3. Клен Р8 не содержит поли( А) на 3'конце, т.е. предотав-

- 14 -.

Ап КоГ

Юмгз-зз

ороа

сз С

061Е

РО

Рио. Б. Организация клонов кДШ, гомологичных Т-элементу. От23-ЭЭ приведен не полноо1ью. Указана ОР02. Ап - олиго(А). НеТ - НеТ-последовательности. Разрывы в 03, 061В и Р8 обозначают челеции относительно геномных копий ^-элемента.

ляет ообой, по-видимому, "оборванную" поолвдовател1нооть гсДНК. Клоны 03 и 0618 оканчиваются лоли( А), расположение которого соответствует направлению транокрипции , Т-злемента. Полис А)-блок в клоне СЗ расположен в районе 3'нетраноляруемой области Т-елвмента, поли(А)-блок в клоне 0612 - в райоце 3'фланкирующих КеТ-последовательностей. Оигнал полиаденилиро-вания ААТААА отсутствует перед поли(А) в клонах 03 и 0612. Это может быть объяснено как присутствием необычного сигнала поли-аденилирования, так и присутствием поли(А) в иоходных геномных копиях, т.к. и не транслируемая область Т-злемента, и НеТ-поо-ледовательности содержат блоки (<1А)п.

Таким образом, НогЪЬегп-гибридизация и анализ библиотек кДНК не выявили транокрипции полноразмерных копий Т-элемента. Отсутствие гомологичных Т-элементу клонов кДНК в библиотеках кДНК эмбрионов, личинок и имаго и их наличие в двух библиотеках кДНК куколок позволяет -предположить, что транокрипция

Ап

НеТ Ап

«■шивав иштм

СИ I

Т-вломента регулируется в развитии дрозофилы, и Т-элемент транокрисируется в куколках.

Можно предположить, что отоутотвие клонов кДШ, содержащих полноразмерные функциональные копии Т-элемента, овявано как о малым чиолом функциональные копий Т-злемента в геноме, так и о их олг.бой транскрипцией. По-видимому, дальнейшее изучение транокрипции Т-элемента требует применения более чувствительных методов регистрации РНК.

Глава 3. Научение организации копий Т- элемента в геномо P. aolartogastcr.

Одной из оадач исследования* было изучение организации гомологичных Т-злементу последовательностей ДНК в геноме D. melanogaater. Для этого использовали два ооновшпе метода; Сауаерн-гибридизация геномной ДИК дрозофилы'о часами Т-элемента и реотриктно-гибридиаацнонный анализ протяженных фрагментов ДНК дровофилы, клонированные в различных векторах: векторах на оонове фагов "лямбда" и Р1 и искусственных дрожжевых хромосомах. Выбор ферментов для рестрикции геномной ДШ определялся наличием сайтов рестрикции в клонированных копиях ?-элемента (Рис. 1,4). Геномную ДНК обрабатывали реотриктаэами EooRI, BarrHI, Pstl, Hindi II.

Гибридизация 3'части Т-элемента (Din2103) о политенными хромосомами слюнных жедеэ личинок дровофилы (Oregon КО) свидетельствует о локализации Т-злемента в теломерах X, SR, SL, 3R, 4. Рибридиэация in situ не позволяет ответить на вопроо о ло-каливации Т-элемента в У-хромосоме, т.к. У-хромосома не реплицируется в слюнных »»левах личинок дрозофилы и не видна на препаратах политенных хромооом. Однако Y-хромосома, содержит последовательности НеТ-оемейотаа (Danilovskaya et al, 1091), и поэтому локализация Т-злемента, относящегося к НеТ-семейотву и встречающегося в окружении других НеТ-пооЛедовательностей, в У -хромосоме была одной ив вадач исследования. Для локализации копий Т-элемента в Y-яромоооме мы ноло&ызоволи Оаузерн-гибри-диеацию геномной ДНК, выделенной отдельно из оамок и самцов

дрозофилы, о роадичнымк чаотямк Т-влемекта (наличие полоаы гибридка&щш только в-ДНК иэ оамцов свидетельствует о локализации данного реоурикционного фрагмента в У-яромооомэ).

В качеотве гибриднооциониых зондов нопольвовади следующие клонированные фрагменты (ом.Рио. 4)i

1) Dm23-ll, оодераюодй 6' часть OPOi Т-злемента.;

В) Dm2103, содержащий 3' чаоть OPOfc^ и 3'нетранолируемую обдаоть Т-адемонта;

3) DmSEOl, гроничагдай о Т-адоыонтом в исходном фрагмент© Dm4S6e н оод^рладий Ш'Г-поодедсвателыюотн.

!

i ■

8.1. Поучонго оргелпдеэд;;и у&зяорюяг копий Т-алоызк?чг и геР. Bz>lenofiaxt«r. Блоттияг - гиб р идиоация ДНК дрозофилы (Oregon ЙО), обработанной EooRI, на чаоти Т-олемента выявляет в reHowe дровофилы около 20 EaoRI-фрагментов, гомологичных Т-вдеыанту. Три фрагмента размером около бтпн (один из которых соответствует ¡изолированной копии Т-злемента Dm23-33), гибри-дизуюгся о Б' и 3'-частями Т-эяемента. Эти EooRI- фрагменты присутствуют в ДНК оамок и оамцов, что позволяет предположить i;x локализацию в аутсоомах (одначс' еозмоянооть локализации чаоти капьл этих ЕоойI-фрагментов в У-хромоооыв так*» ие молот быть исключена). Таким образом, фрагмент Dm23-S3 не подлетов наиболее повторенной ("мажорной") копией Т-элемента в геноме и, по-видимому, имеет аутооомное происхождение, ;'

Ш выполняли также Оаузерн-гибридизацию ДНК

D. melanogaster, обработанной BamHI, о зондаки, содержащими Б' и 3*чаоти Т-ояемент i и НеТ-последовательности. РееультатЫ приведены на Рио, 6. Видно, что гомологичные кллдему войду последовательности ДНК представлены в геномах оамок и оамцов сходным набором фрагментов, что свидетельствует об отсутствии полиморфизма копий Т-злемента по реотриктозе ВаггШ между cim-ками и оамцами и позволяет предположить, что большинство копий Т-злемента, содержащих сайты BamHI, локализовано в аутооомах и К-хромоооме. Локализация Т-элеыента в Х-хромоооме следует из данных по гибридизации in situ (см. выше).

В геноме дрозофилы выявляется около 16 BamHI-фрагментов.

*

и.*.«*. -*

£

Н»Т

9 *

4Б68

ЙВ» 1

5Г - -.л

©а - - <

Л—» 4В* I

.«г

■5,0

-3,0

V

Си

Риг». 6. Радиоавтографы Сауверн-гибридизации геномной ДИК О. гл91апогазЬйг на ча^ти Т-злемеято. ДНК обработана ВатгШ. Вверху у;М1ван источник ДНК (оамки -ф, оамцы -с?) и зонды: 83-11 (Б'), 8103 (Э') и 8801 (НеТ). Оправа укаваны равмеры фрагментов (в тпн). Показано подомэние 0т4669. Количеотва ДНК оамок и оамцов не выровнены.

содержащих Б'-чаоть Т-злемента. Фрагмент размером около Этпн представлен наибольшим чиолом копий.

Последовательности ДНК, гомологичные Э'чаоти Т-элемента и 0тй201, предотавлены в геноме дрозофилы тремя мажорными ВаяйI-фрагментами размером около Зтпн, Одинаковый характер

гибридизации ДНК о 3*частью Т-элемента и 0тЕ201 свидетельствует о том, что большинство копий 3*части Т-элемента объединены в геноме дрозофилы о НеТ-последовательностями. Действительно, 0т4Б68, клонированный по ВаггШ, совпадает по размеру о одним ив мажорньк геномных фрагментов (2, ?тпн) и оодержит 3'чаоть Т-элемента и НеТ-последовательности.

Примером организации гомологичных 'Т~ элементу пооледова-тельностей, содержащих консервативные оайты ВатН1, в геноме является фрагмент ДНК, клонированный в фаге 36 (Рис. 1). Полная копия Т-элем^нта, окруженного НеТ-пооледовательноотями, расположена в двуу граничащих ВаюН1-фрагментах размером 3,0 и 2,7тли. Фрагмент размером З.Огпн соответствует мажорному фрагменту геномной ДНК, гомологичному Б'части Т-злемента; фрагмент размером 2,7тпн соответствует одному иэ трех мешэрных фрагментов, содержащих 3' чаоть Т-элемента и НеТ-пооледовательнооти. К фрагменту размером 2,7тпн прилежит фрагмент размером й.Бтнн, содержащий 3"чаоть Т-злемента н НеТ-пооледовательнооти. Реет-риктные карты 3'частей 2,7 тпн и 2,Бтпн-фрагментов идентичны, что повволяет оделзть вывод о наличии прямого повтора 3'-чаоти Т-злемента в фаге 36.

Таким образом, гомологичные Т-алементу последовательности предотавлены в геноме Б. гт1влоеазЬег несколькими вариантами повторов, воэн"кших, вероятно, в результате амплификации. Наши данные свидетельствуют о том, что по крайней мере часть таких "ма;юрных" копий Т-элемента нефункциональна. Так, копия Т-эле-' мента из фага 36 не содержит протяженных 0Р0 (Е. В. Куренова, личное сообщение), а фрагмент СпАБ&& содержит делеции и вотав-ки цуклеотидов (отн оительно СггйЗ-ЗЗ), приводящие к наличию стоп-ко донов перед 0Р0.

Другая использованная . для анализа реотриктоэа, РзЬI, подтверждает еутосомную локализацию большинства копий Т-элемента. Однако несколько РзЫ-фрагментов, гомологичных Б'чаоти Т-элемента, содержатся только в ДНИ самцов; кроме того, ДНК самцов оодержнг большее чиоло копий ыажорного РзЫ-фрагмента, гомологичного 3'част" Т-элемента. Этк данные говорят о локализации чаоти копий Т-элемента, содержащих оайты РзЬ!, на У-хро-моооме.

3. а. Логсалиаацмя копий Т-элемента, и Y-хромосомс Четкий полиморфном между ДНК самок и самцов по длине реотриктных фрагментов, гомологичных Т-эле менту, удалось обнаружить о помов»» рестриктаоы HindIII. На Рко. 7, где предотавлены результаты Оаузерн-гибридизации ДНК оамок и оаыцов, обработанной HindiII, видно, что несколько фрагментов присутствуют только в ДНК оаыцо» (фрагмент размером около 8,?тпн предотавлен наибольшим чиодом копий). Это свидетельствует о наличии Y-опецн-фичеоких копий Т-элемента.

Для картирования Y-специфических копий Т-злемента на Y-хромсооме мы попользовали линии дрозофилы о Я-Y транолокаци-ями, pf оделяющими Y-хромооому на 7 сегментов (Kennison, 1981). Влотт шt г - г нб рвдн sация ДНК, выделенной из оамок, оодержащих сегменты Y-хромооомы, позволяет картировать У-опецифичеокий фрагмент Т-олемента в одном иэ сегментов У-хромосомы.

Мы проводили блоттинг-гибридизацию ДНК оамок линий о транолокациями, обработанной HindlII, на З'чаоть Т-элемента (Рио. ?). Видно, что почти вое Y-опецифичеокие копии Т- .лемента прноутствутуг в ДНК линий V24 и N18, содержащих концевые сегменты Y-хромооомы, и количество этих копий, по-видимому, возрастает в линиях ElБ и W19, отличающихся от других линий наличием О и F-сегментов Y-хромооомы. Кроме того, в ДНК линии FIS появляются минорные Y-опецифичеокие Hindi П-фр&гменты размером 4,0тпн и 1,1тпн, а в ДНК линии V6 - минорный Hindi11-фрагмент размером 1,Бгпн, что позволяет оделать вывод о локализации первых двух фрагментов в оегменте Оно локализации фрагмента размером 1,Бтпя в оегменте G У-хромооомы. По-видимому, полученные результаты свидетельствуют о том, что Y-опецифичеокие копии Т-элемента локализованы в ооновном в концевых оегментах Y-хромооомы, но некоторая их часть присутствует во внутренних районах У. Присутствие У-опецифичеоких копий Т-элемента в концевых оегментах Y-хромооомы позволяет предположить локализацию копий Т-элемента в теломерных областях Y-хромосомы.

Наличие четкого полиморфизма по длине HindiП-фрагментов, гомологичных Т-элементу, позволило локализовать в У-хромосоме

3 из 8 протяженных фрагментов ДНК дрозофилы, клонированных в

*

векторе на основе фага Р1 и искусственных дрожжевых хромосо-

- so -

§ о Ш Ц. & >

а» ft:

• " * ** $>• и» «р

Ци чмг ч*» .

•X '

'.Ьь

>К>

— 5,i -tt

-2,0

-1,0 -0,8

-0,6

Л

А В О D G24 VS4 VS? Е1Б F12

1 . .1 .....\......,1-----U

£

V

F Q

vie va ius : I i

Рио. V. Локализация и картирование копий Т-элемента на У-хромооомо дрозофилы. ДНК обработана HindiII. Вверху обозначен, иоточн нк ДШ - самки (О) и оамцы (<Г) Oregon RC, самки линий о Х-У-траиолокациями (V24, Е1Б и тд). Оправа указаны размеры фрагментов в тпн. Внизу изображено деление Y-хромооомы на сегменты, обозначаемые A-G. Горизонтальными линиями о точкой на конце обозначены оегменты У-хромосомы, содержащиеся в ДНК о ямок о транологсацилми. Эонд - Dm2103. Стрелками указаны У-опецифические фрагменты.

-Si-

мая- Для этого выполняли Сауэерн-гибридноацию ДНК оамок и самцов и ДНК клонов, обработанной Hindi И, о чаотями Т-элемента (радиоавтографы не приведены). Клоны Р1 14-13 (ок. 100тпн), Р1 18-10'(ок. 100тпн) и У АО G81 (ок. ЗбОтпи) содержат У-опецифичео-кне фрагменты ДНК, гомологичные Т-элементу, что докавывает их происхождение из У-хромосомы. Два клона, Р1 14-13 ч YAC SGI, оодержат также копии Т-элемента, BamHI- и PatI-фрагменты которых соответствуют мажорным копиям. Таким образом, едаеишэ протяженных клонированных фрагментов ДНК дрозофилы подтверждает ранее оделенный вывод о том, что мажорные копии Т-элемента ло-калиеованы не только в аутооомах и К-хромосоме, но и в Y-хромосоме, причем мажорные и Y-специфические копии Т-элемента могут быть расположены рядом в пределах 100 тпн. Клон Р1 18-10, происходящий иа У-хромосомы, не содержит мажорных копий Т-элемента. Это свидетельствует о наличии на Y-хромосоме протяженных районов (ок.100тпн), содержащих только У-специфические копии Т-элемента.

Вое три клона, содержащие Y-специфические копии Т-элемен-та, гибридиэуются также о фрагментом Drrt366, т.е. в У-хромоооме Т-элемент тоже соседствует с другими последовательностями НеТ-оемейства. Б других клонов, содержащих аутосомные копии Т-элемента, таю» содержат гомологичные Dm66B последовательности. По-видимому, наличие НеТ-последовательностей во всех протяженных клонированных фрагментах ДНК дрозофилы, отобранных из библиотек гибридизацией на Т-элемент ( Dm2103), свидетельствует об обязательности соседства Т-элемента о другими последовательностями НеТ-семейства.

Таким образом, иа анализа организации копий Т-элемента в геноме D. melanogaster можно сделать следующие выводы:

1 большинство копий Т-элемента представлено в геноме D.melanogaater повторами, локализованными как в аутооомах, так и в половых хромосомах; по крайней мере часть мажорных копий Т -элемента нефункционешьна; •

S)Y-хромосома содержит как мажорные, так и У-опецифичео-кие копии Т-элемента. Y-специфические копии расположены в основном в концевых сегментах Y-хромооомы и огут соседствовать о мажорными копиями в пределах 100 тпн;

- es -

S)копии Т-элемонта воегда окружены другими последовательностями НеГ-оемойотва.

Глава. 4. Коиосрвадиам Т-элемента jr близких видов дроаоф;-

■вы.

Раопроотраненке последовательностей у близких видов позволяет оудить о функциональной еначимооти и эволюции последовательностей. Приоуготвке гомологичных Т-алементу поолодова-тельноотей "было изучено у близкого вида D. simulare и отдаленного вида D. virilis.

На Рис. в предотавлек.радиоавтограф гибридизации тотальной ДНК D. irielanogaater, D.simularis и D. virilis, обработанной Pstl, на З'чаать Т-злемента. Видно, что гомологичные Т-злементу последовательности присутствуют в геномах D. nie lonogoster и D.simulons, являющихся близкими видами, и отсутствуют в геноме отдаленного вида D. virilis. В геномах D. melanogoster и D. a i nul ans гомологичные 3'части Т-алемента последователь нооти имеют оходную организацию по сайтам реотрикции Pst I; большинство копий Г-алемента предотавлено одним РзЫ-фрагментом, но у D.simulaos его раамер чуть меньше (около 1,?тпн вместо 1,8тпн у D, melonogaster).

Влоттинг-гибридизаинп ДНК D. simulai«, обработанной Pst I, на Б'чаогь Т-элемекта выявляет наличие в геноме D. simularía пооледователькостей, гомологичных Б*части Т-злемента (радиоавтограф не приведен). Однако гибридизация ДНК D. snmulana на Б'чаоть Т-злемента гораздо слабее, чем на его 3'часть, что может свидетельствовать как о меньшем числе копий Б'части Т-эле-мента по оравнению с его 3' частью, так и о меньшей степени гç>-мологик меледу Б' частью Т-элемента и аналогичными

последовательностями D. simulons.

Таким образом, мы показали, что гомологичные Т-злементу последовательности ДНК присутствуют в геноме вида, близкого D. melanogoster, - О. simulons, и отсутствуют у отдаленного вида D. virilia.

- еэ -

cal ala vir N_I /

О — 5И ; —4,5

1-5

¡m

— λt — 2,5 -2,0 -U

-il

Pîîo. Ol Локаливация копий Т-элемента в геномах. D. ai mu 1 ana и D. virilis. ДНК обработаны РзЫ и нанесены ю равных количествах. Эонд - DnßlOS. Вверху укаеан иоточяик ДНК (mal, зim, vir). Оправа указаны раэмеры фрагментов в тпн.

- ¡24 -ВКШДЫ

1. В гетерохроматии-тедомерном оемейотве последовательное-той ДШ D. roalanogoster обнаружена кодирующая последователь нооть, названная Т-элементом. Т-элемент обладает рядом свойотв LIНЕ-подобных ретротраяопозонов, в г. ч. содержит й перекрывающиеся открытые рамки считывания (0Р0).

Ё. Полилептид, кодируемый 0Р01 Т-алемента, оодержит мотив GTP-связывающих факторов элонгации. Полипептид, кодируемый OPOS, оодержит циотеиновые мотивы, характерные для QAG-белков ретропооонов, и мотив "лейциновая молния", которые свидетельствуют о способности полипептида участвовать в белок-нуклеиновых и белок-белковых воаимодейотвипх. Полипептиды, кодируемые Т-олементом, не содержат консервативных доменов, характерных для обратной транскриптаеы.

9, Т-злемент обладает ниеким уровнем транскрипционной активности, Анализ библиотек кДНК дрозофилы позволяет предполагать, что 7-элемепт транокрибируетоя в куколках дрозофилы.

4. В геноме D. melonogoster выявлено два типа копий ' Т-оле-мента; мажорные копии, локализованные в теломерах аутооом, Х-хромооомы и в У-хромосоме, и У-опецифичеокие копии, расположенные в основном в концевых сегментах У-хромооомы. Показано, что копии Т-элемента встречаются только в окружении других последовательностей НеТ-оемейатва, в т. ч. НеТ-А-элемзнтов.

Б. Показано, что гомологичные Т-элементу последовательное ти ДНК присутствуют » геноме близкого вида D. stmulona и отоутотвуот у отдаленного вида D. virilis.

- 26 -

Опиоок работ, опубликованных по том» диссертации.

1. Данилевская О. Н. , Нуренова Е. В. , Лейбович В. А. , Ваоо И. А. , Павлова М. Н. Семейство повторяюдахоя последовательностей генома дрозофилы, имеющее теломерную локализещию: овойотва и полиморфивм. Генетика, 1990, т. 26 , 474-484.

8. Куреиова В, В. , Лейбович В. А. , Баоо К. А,. Еебихов Д. В. , Павлова М. Н. , Данилевокая 0. It Hoppol - оемейотво мобильных ¡элементов Drosophila melanognater, фланкированное короткими инвертированными повторами и имеющее предпочтительную локализацию в гетерохроматиновых областях генома. Генетика, 1990, т. 26, 1701-1712.

3. Do/iilevskaya О. N. , Kurenova Е. V. , Pavlova М, N. , Bebihov D. V. , Link A. J. , Koga А. , Vellek А. , Hartl D. L. He-T fanily DMA sequenoes in the Y chromosome of D. melanogaster share homology with the X-linked Stellate genes. Chromosoma, 1691, v. 100, p. 119-124.

4. Danilevskoya O.N. , Petrov D. A. , Pavlova M. N. , Koga A. , Kurenovo E. V. , Hartl D. L. A novel repetitive DNA element associated with telomerio sequences in D. wlenogaster. Chromosoma, submitted.