Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВЯЗЬ ТРАНСМЕМБРАННОГО ГРАДИЕНТА ИОНОВ КАЛИЯ, НАТРИЯ, КАЛЬЦИЯ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТЬЮ СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "СВЯЗЬ ТРАНСМЕМБРАННОГО ГРАДИЕНТА ИОНОВ КАЛИЯ, НАТРИЯ, КАЛЬЦИЯ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТЬЮ СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ"

А-ЗОЗЗЗ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-НООЕДОВАТЕЯЪСКИЙ > ИНСТИТУТ ЖИВОТНОеОДСТВА

/ ... : (ВИЖ) . ■ .Г

На правах рукописи

;'. Мамбетадиев Марат Сейталневич

... . ■ ■ I ■ ■ ■ .

СВЮЬ ТРАНСЫОДОАННДО НАТРИЯ,

КАЛЬЦИЯ С ВИОЯОГИЧЕСгаЛ 1КШЮВДШХЛ1Л сш^тоэсщое БЫКОВ

03.00.13.- Фиакояогия человека и животных

: А ВТО РЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени 'кандидата биологических наук

■. \

п.Дубровицы Московской области .'.: . - 1994 > ' .\

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ЙССЯЕДСвАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЮШОТНОВСЩСТВА (ВИИ)

На правах рукописи

Маыбеталиев Марат Сейталиевич

СВЯЗЬ ТРАНСКЕЫБРАННОГО ГРАДИЕНТА ИОНОВ КАЛИЯ, НАТРИЯ, КАЛЬЦИЯ С ВИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТЫО СШШТО0ОИДОВ БЫКОВ

ОЗ.00.13.- Фивиология чедовека и животных ■■■■'■

А ВТ О РЕ»ЕРАТ '

диссертации на соискание ученой степени > кандидата биологических наук

, . ЦЕНТРАЛЬНАЯ. ' -

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Г/юск. соль:,'.охоз академии

шзь*

Инв. №

п. дубровицы Московской области' ■'■ . • 1994 .'■;■''.■■

- Робот« выполнена в отделе биологии »оспроиоведеикя Все рос- ; сийского научно-исследовательского института животноводства. .

Научный руководитель . ; V ,"" доктор биологических наук.

'Т: : Профессор. '

• ;'..,.. .'',*•' . "7'.'V; В.П.Кононов .'у

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

■ ; профессор

■ . Ю.Д.Каинский' •

'Л; л- кандидат биологическим ;".-v '■■'■'-" '•'■"■■■ ч ■■-:■'■': '.V' наук '.-у'1'-" ^,y■-;'

. • • .. . В.В.Еаьчанинов ■v'

. Ведущее учреждение ; - . Всероссийский научно- ис- :

следовательский институт племенного дела

Защита состоится "¿¿С"г. в 10 часов на заседании спеякажимфовагаогб то^ Все- V;

российском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, it. Дубровтм, Подольского района, [МОСКОВСКОЙ 0власти^\^ Г ;. ' -

СджхертациеймсянЬ ознакомиться в библиотеке института. ■:

Автореферат равослан ffr^feffi.fo* г. L й'

Ученыйсекретарь :■■-'.'у ' ■ !

■ специализированного Совета' V -. „ кандидат биологических наук И.И.ПЬвд-ин

1. ОБЩАЯ/характеристика работы .

у 1.1. Актуальность. Несмотря на высокую эффективность "и широкое 'распространение метода искусственного осеменения резервы его ещедалеконе иечерпаныи болеегого существуют* проблемы/ требующие рагрешения.1Ь дашшм Гордона (1988) результаты осеменения . »фиоконсервированным семенем быков часто бывает ниже по сравнению с результатами от естественного спаривания. Свести до минимума эти различия - является важнейшей задачей науки. Один из путей. ,. решения' состоит в разработке более» точных методов оценки биологи. ческой полноценности семени и'соответственно потенциала воевроиэ-водительных ; возможностей отдельных быкоц. Несовершенства современных методов оценки семени подтверждают . данные, ; показывающие, что от вабракованного семени результаты осеменения могу! быть выше, чем от признанного пригодным (Ñegoita V, et al,. 1686). Известно, что биологическая полноценность клеток, г в том числе и сперматозоидов, в значительной степени определяется структурной и функциональной полноценностью плазматических мембран; осуществляющих многие жизненно важные процессы (В.А.Наук,^"95).;Это в свою ; очередь зависит от Трансмембранного потенциала, создаваемого работой мембранных насосов. К*-На+-зависимой ATfl-азой, постоянно закачивающих К* ■ внутрь ^иетки;*" a íla+выкачи^ из нее против градиентов концентраций. Величина создаваемого ими трансмеыбран-ного градиента этих ионов достаточно высоко отражает состояние плазматическихмембран сперматозоидов . (В.Г.Семаков, Т.Ф.Рыжков, 1976). Современные средства экспресс-анализов с помощью ионосе-лективкых электродов позволяют быстро улавливать изменения ионного состаьа ;в. семени и таким образом'судить о состоянии мембра сперматозоидов. В связи с зтим мы.сочли возможным с использованием этих средств и других методов разработать более точный тест оценки биологической полноценности сперматозоидов и соответственно воспроизводительного потенциала быков, позволяющий ! целесооб-■ ; равнее отбирать зякуляты и производителей в: интересах результативности осеменений. -•' ■

: 1,g. Еель и задачи исследований. Цель' наших'исследований состояла в разработке нового теста оценки семени, более точно отра-

- 4 - •

жающего биологическую полноценность сперматоеоидов и потенциал репродуктивных качеств быков-производителей* Для достижения цеди необходимо было решить;следующие задача: ■■'

- изучитьтрансмембраншге переходы К\ Ка+, Са++ в сперматозоидах кз свежевзятого семени быков;

- выяснить свявь трансиеыбрашшх перемещений основных катионов с последующей устойчивостью сперматозоидов при технологической обработке я способностью сохранять биологическую полноценность семени;

- разработать математическую модель оценки семени и соответственно потенциала репродуктивных качеств отдельных быков* ■'.■■.' ■.'.

1.3. Научная новизна« Впервые выяскзно, что в условиях племенных хозяйств результативность осеменения': криоконсервированным семенем быков в большей степени зависит от его индивидуальной принадлежности, чем от других факторов, не связанных с качеством семени. С биологической полноценностью семени, определяемой результативностью осеменения, больше других показателей оценки эя-кулятов сопряжен трансмембранный градиент К"1". Этот показатель на протяжении длительного периода (2 дет) высоко устойчив у .отдельных индивидов. у.у у' '■"■'■' ,

1.4. Практическая значимость. Разработанная математическая модель прогноза результативности осеменения, позволяет наиболее' точно оценивать биологическую полноценность семени ; и соответс-

. твенно потенциал воспроиэводительной способности отдельных; быков, что дает вовможность точнее отбирать их в интересах :. реэультатив-' ности осеменения. /у у -,;:.-.у у *;.улл'

1.5. Апробация работы. - Основные, положения диссертации долот-: Кены на:; ■' у ■',.. ' ^у.:"-:' :'у* У;.

- 45-й научно-методической конференции аспирантови молодых "ученых "Проблемы интенсификации животноводства" (п. Дубросииы,

Московской области, 17-18 иона 1992 г). • у■}.''•

- 1-й Международной научной конференции "ЬЬдовановские чтения" (п. Быково, Московской области, 21-21 алрел» 1993 г).

- научной конференции Отделов биологии воспроизведения.к энт;

. v,:.- 5 Г ■" докринологии ВИЯа (27-29 октября 1993 г).

1,6. Объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы, и 3 рисунка. Состоит иэ Введения,, обзора литература и результатов собственных исследований, выводов и практических предложений. Список литературы вклю- . чает 81 источников отечественных и 86 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

. Научно-исследовательская работа выполнена в Отделе биологии воспроизведения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства (ВИЯ), на Центральной станции . искусственного осеменения (ЦСИО), в племенных хозяйствах: ГШ "Коммунарка", ПЗ "Ленинский луч", с-з "Варыбино", учхоз ?Михайловское", к-а "Владимира Ильича", с-в "Заря Подмосковья" Московской области и в Ш "Петровский" и с-з "Ручьи" Ленинградской области.

В опытах использовали семя 100 быков молочных пород, принадлежащих ПСИО. Быки имели заводскую упитанность, живая маоса их в среднем составила - 911,5±28,7 кг. Кормление быков,осуществлялось по рациону, сбалансированному по основным питательным ве-' ществам по нормам ВИН. Быкам ежедневно предоставляли моцион, в течении двух часов после взятия семени. Семя у быков брали в сле-: дующем режиме: - в течение двух недель три раза по три эякулята. Учитывали количественные и качественные показатели : спермопродук-

Свежевеятое семя оценивали' по общепринятой методике: на цвет) запах, консистенцию; объем эякулята, концентрацию сперматозоидов, , подвижность, а после замораживания"оттаивания - на под- ' ■ важность сразу после оттаивания ' и через 5 часов инкубации при 38°С (выживаемость), Кроме того, оценка оттаянного семени дополнительно - включала s, морфологическую ' сохранность акросом (R.Q.Saacke, 1970) и показатель фертильности по Van Duijn (А.П.Еськов и соавт., 1988). . .-" ..: .'■-'.'■■■;■■■".'

Обработку и замораживание семени ' производили . по Литовской технологии (П.И.Пакенас и др. 1930). ■ ;

- Исследования проводились по приведенной схеме. Они включали два аспекта поисков: разработку методши измерения трансмембран-

I—--;--—1—:——:—-—•—-)

I Разработка теста воспроизводительной 1 . Схема исследовании I 1 способности быков ■ . |

|Методика измерения концентра-1 |Изучение! ; | Изучение связи результативности |

|ций и трансмембранного града-1 |давления!" | осеменения с отдельнымии физиологи-|

. ; ¡ента ионов К, На, Са в семени| |на рев- I I ческими характеристиками быков .4 |

. 1—г— ."■'".I ." ■ | • • |ультаты | 1 1—г—-;■■ . 1 - """ '.. 1—1

г-1—I I -1—и I .. '—п |осемёне-| г-1 11 ,' : т 1 ' : 1 ' 1—1—1

|Калиб- [Подбор| {Способ изме| ■| ния. от- ( • |Концев| (Харак-| |Ре- ( |Воз- |

(ровка ^|разба-| Iрения разни| Iдельных | |трации1 |терис-| (зуль- | (раст |

(ионо- |вите- | |вд концент-| [быков и | |ионов | (тики ;1 (тага | ; (произ|

| селек- |лей ; | |раций ионов|' (хозяйств) |К, Ка,| (эяку- | |осеме-| ]води-|

тивных |семени] |К, N3, Са; | !_• - :-1 |Са •. | |дятов ( (нения |' (телей!

(элект- (для | (в спермато-| : «-1 |-г-1 I—' ' i—J

1 родов ;|изме- .1 |воидах и | ' * - " г , ; , ■ ' ' ... ? - —1

1 ;|рения | (плазме се- |. . I Разработка уравнений прогноза |

1 1 ¡мени быков | | результатов осеменения | '.,■

■ " . - 7 -

ного градиента К+, Na+, Са++ с помощью ионоселективных электродов и разработку теста оценки семени по величине трансмембранного градиента К+, На+, Са^.

Для намерений концентраций ионов были использованы электроды, изготовленные научно-производственным. центром "СЕНСОР", и милливольтметр рН-150. ■ Предварительно электроды были откалиброва-ны для перевода показаний электрического потенциала (ЭДС) в** значения концентраций ионов, для чего были построены калибровочные графики и выведены соответствующие регрессионные уравнения.

Иэ смеси трех эякулятов одного взятия от каждого быка брали пробу - 0,1 мл, и в 100 раз разбавляли специальным не содержащим исследуемых ионов разбавителем. При этом Для разбавления семени были проведены сравнительные испытания двух изотонических (разбавителей: 6% раствор глюкозы и специально разработанный трис-цит-ратный разбавитель следующего состава: трис(оксиметил)аминометан (основание) - 2,42 г;:лимонная кислота - 1,34. г; глюкоза - 0,1 г; дистиллированная вода 100;мл;

Ионоселективными.электродами в разбавленном семени измеряли ЭДС и по нему находили соответствующую концентраюто. Затем к раз бавленному семени для разрушения мембран сперматозоидов добавляли несколько капель 6Z водной суспензии дигитонина, перемешивали и вновь проводили измерение■ ЗДС, по значению которой определяли концентрацию соответствуют* ионов.

■ Наша рабочая гипотеза состояла в следующем. Известно, что . K+-Na+-зависимая АТФ-аза'биологически полноценных мембран выкачивает из экдоцеллюлярного пространства во внешнюю среду На* и, наоборот, закачивает;, в сперматозоидов К* против градиентов кокцент-.рацяй. Точно, также работает Са^-зависимая АТФ-аза, постоянно выкачивая из'сперматозоидов Cat* (A.Karagiannldis, 1976). Дигитонин сбладает свойстаад блокировать работу мембранных насосов, а также свяеывать холестерин мембран и таким образом нарушать их целостность, что приводит к утечкам ионов" и соответственно к выравниванию их эндо- и зкзоцеллшярных'концентраций.■ Соответственно этим манипуляциям первое определение должно было отражать концентрацию ионов в жидкой части семени, второе- суммарную концентрацию в плазме и сперматозоидах, после их выравнивания. Таким образом, по разнице концентрации можно было судить о трансмембрзкном градиен-;.те ио?ггг. и соответственно о функциональном состоянии

- : ■■ - е-' .";.■-■

Чтобы выяснить насколько ' возможно судить о биологической полноценности семени отдельных быков ва длительный период использования по отдельным эякулятам, был проведен биометрический анализ. У каждого из- 28 быков была измерена концентрация ионов в четырех г-з^улятах,- взятых на протяжении двухлетнего периода.. Быки были (м- ^аты на 7 трупп (по 4 в каждой) и в каждой группе были сопоставлены параметры вариабельности среди быков и среди эякуля-тов. Затем эти параметры были сведены к усредненным показателям.

Известно, что существует зависимость потенциала оплодотворяющей способности семени быков от возраста. Наилучшая устойчивость сперматозоидов бывает у быков до 5-летнего возраста (Л.МоггЬ1п, 0.2о11ек, 1985). В связи с этим неизбежные возрастные изменения биологической полноценности сперматозоидов были сопоставлены с результатами измерений трансмембранного градиента отдельных ионов в семени. Для этого в связи с возрастом быки были разбиты на 3 группы: 1 гр.~ от 2 до 5 лет, 2 гр,- от 6 до 7 дет, 3 гр.- 8 и стерве: 24, ' 44, 32 быка соответственно. Непосредственно после взятия семя оценивали по описанным выше биологическим тестам. Выесте с тем для оценки трансмембранного градиента ионов была измерена концентрация К*, На+ м Са++ по вышеописанной методике до и , после добавки дигитонина.

И, накбнец, результаты измерений трансмембранного градиента ионов были сопоставлены с фактическими результатами осеменения семенем этих быков. Для этого в 8 племенных хозяйствах Московской и Лениь/радской областей были проанализированы результаты первичных осеменений 3241 коров по данным ректальных исследований. После "чего результаты осеменений были сопоставлены с разными тестами-оценки семени, в том числе и с данными измерений трансмембранного градиента ионов калия, натрия,' кальция,

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И-ОБСУЖДЕНИЯ.--

3.1. Разработка методики оценки репродуктивного потенциала быков.

3.1.1, Вариабельность характеристик семени среди эякулятов и в связи с его индивидуальной принадлежность».

Разрабатываемый нами метод оценки семени базируется, на структурной и функциональной устойчивости мембран, поэтому одной

4 - 9

из первоочередных задач было выяснить насколько постоянны показатели юс состояния для отдельных индивидов и для'отдельных эякуля-тов^у одного индивида. В этой связи были проведены исследования * по изучению изменчивости, концентраций основных ионов в семени.

Как показывают данные таблицы 1,' вариабельность концентраций основных ионов между быками во много раз превышает вариабельность этих' же характеристик у одного и. того же быка, где данные достаточно стабильны, хотя эякуляты были взяты с очень большими интервалами на протяжении двух дет. Это значит, что по отдельным эякулятам без большой ошибки можно судить о потенциале воспроизводительной способности того или иного быка.

3.1.2. Доля влияния индивидуальной принадлежности семени на результаты осеменений.

На результаты осеменения, получаемые в отдельных хозяйствах, влияет.огромное количество самых различных факторов. В связи с этим прямая оценка репродуктивных качеств быков, . по результатам осеменения, 'очень затруднительна, если не сказать невозможна. Пег этому используемая до настоящего времени методика такой оценки не дает однозначных ответов - от семени отдельных быков в разных хозяйствах могут быть-получены совершенно разные результаты.

: Чтобы выяснить влияние отдельный быков на результативность осеменения, мы провели соответствующий биометрический анализ сравнения зависимости результативности осеменения от репродуктивного потенциала отдельных быков и других факторов, не связанных с качеством семени (таблица 2).

Данные таблицы 2 показывают, что вариабельность результатов осеменения больше зависит от индивидуальной принадлежности семе-: ни, чем от условий в хозяйствах, где использовалось семя. Об этом говорит более высокие дисперсия и коэффициент вариабельности результатов между, отдельными быками, чем между .отдельными хозяйствами. Хотя крайние пределы вариабельности в связи с воздействующими факторами не различаются на статистически достоверную величину , (Хт~9±4,5; 1<3-С). *-.

■ Существенное воздействие на результаты осеменения, не свя- ' тайных с быками факторов, даже в этих передовых хозяйствах делает маловероитным нахождение достаточно объективной-оценки репродуктивного потенциала отдельных бмков, • что требует для этого г>азра-

- 10 -

Таблица 1 - -, Степень изменчивости концентраций ионов кадия, натрия и кальция в свежевзятом семени в отдельных : эякулятах

быков и у отдельных индивидов

После- .Показатель В плазме семени ( В сперматозоидах

дуемые, вариабельности -—:——-------------—,—:———;-----

ионы Медду отдельными | Между отдельными

быками эякулятами {быками эякулятами

Калий Дисперсия (б2) 81,8+10,3 12,7±1,3 81,2+10,9 12,7±1,3 Коэффициент вариабельности ■ ■

(Су, X) - 0,70x0.05 0,28+0,02 0,70x0,05 0,29+0,02

■ Разница между.

лимитами 19.5+1,5 7,6*0,4 19,Е±1,5 7,610,4

Натрий Дисперсия (б2)' , 13,7x2,3 3,2^.0,4 13,0x2.3 3,210,4

Коэффициент ва- .>-.- ' V

риабельности:'.. .. .. . ' "■■

.'. • (СУ, X). 0,23x0,02 0,12x0,07 0.2310.02 0,1210,07

Разница между ■ ■ '•[.■,'■ ;.

лимитами ' 7,110,7 3,7x0,2 . 7,0x0,6 3,7x0,2

Кальций Дисперсия (б2) 15.5x2,5 6,5x0,7 12,6x1,8 0,4+1,1 Коэффициент ва- 'чу.--;...у /7\',л-.;

":-.-риабельности ■■ . /у'--^. ; 'У■■■У: ''гУуУ:\

■ " (Су, X) 0,28X0,02 0,19x0,01 0.25x0,01 0,16x3.01

■ Разница между ■ г. '-:у ; ' /■'■■ у.-'::-:у' ... г лимитами 7,6x0,0 5,5X0,3 7.4x0,5 4,0+0,5

ботки специальных, тестов, не говоря уже о других ■■ хозяйствах, . с более низким уровнем культуры-производства. ' - -

■■. : -.u -: . . ' ,■ \ .

■ Э.1.3. Связь воспроизводительной способности быков с их воз. растом.

' ■ Поскольку одним из факторов, существенно влияющих на биологическую полноценность сперматозоидов, является возраст быков, на ■ - Таблица Z ' ^ *■ . '

Действие отдельных быков и хозяйств

на результативность 'осеменения _-*■■■'

-Показатель '. Между отдельными

: вариабельности " - —:—------:-—•————,—г—-------.

■ ; ■.: быками (л-31) ' хозяйствами (л-9)

Дисперсия (б2) 127 ' 51

Коэффициент вариа- •

бельиости (Cv, X) ' 24 • 15

Разница между,'/': .

лимитами - 11±2 20±4

следующем этапе исследований мы проанализировали.влияние возраста быков ка ttx воспроизводительные качества.' ■ Предварительно были - исследованы основные биологические характеристики эякулятов, что- . бы можно было судить о потенциале оплодотворяющей способности по этим показателям в связи с возрастом быков. • Результаты приведены В таблице 3. -■- .

Как ввдно из таблицы 3, в связи с возрастом быков особых отклонений в основных характеристиках семени не наблюдается. Можно. отметить лкеь снижения в оттаянном семени процентаморфологи-.ческн.нориалышкакросом(Р<0,03) в эякулятах быков 6-7 летнего ; возраста в ; сравнении ç более- молодыми. Обозначившиеся снижения объемов эякулятов,'. концентрации сперматозоидов в них и соответственно общего числа сперматозоидов/выделяемых ва одно взятие, не подтверждаются биометрическим 'критериями разности и могут быть истолкованы как' следствие обычной статистической вариабельности. Что касается повсеместно используемого теста подвижности, то в связи со старением быков отмечается даже тенденция ее повышения.

Нельзя не заметить, что тенденция снижения характеристик кя чества оттаянного семени наблюдается не у самых старых, а в возрасте 0-7 лет, т.е. после пятилетнего возраста действительно

; Таблица 3 *

Основные биологические характеристики семени в связи с возрастом быков ! >

Воз- ■ Основные биологические характеристик» эякулятов

раст-----.——7---------—г—-----------.----------—-—

(дет) Свежев з ятог о Поел е от таив ания

Объем Концентра-Под- Нормаль- Полупёрод Показатель

трех ция спер- виж- ных акро- падения ■ фертиль--,

: эякуля- матоаоидов ность сом (Ж) подвижности ности по

тов (мл) (млрд/мл) (X) (мин) 4 Van DulJn

2-5 12±0,6 1,4±0,0б 73±2 8112 84,5l2.4 599117 6-7 1Э±0,5 1,3+0,04 - 76*1 7512 79,5±1,9 578Ц6 .8 И < 11±0,4 1,210,06 75±1 77±1 84,311,9 598+16

наступает некоторое ухудшение качественных характеристик семени, ко спустя последующие два года происходит их частичное восстанов-л?ние. ' ''■; V/ ' ■ ' .■■"'

В сравнении с этими характеристиками эякулятов были исследованы перемещения исследуемых ионов между плазмой и эндоцеллюляр-. ным , пространствомI' сперматозоидов при. различных воздействиях в V свяви с возрастом быков (таблица 4). А

Как видно из данных таблицы 4, после пятилетнего возраста в эякулят;.; быков намечается тенденция снижения концентрации К*, но ' повышения концентраций На+ и Са**. Обработка семени " дигитонином повывает концентрацию . всех трех. ионов в жидкой части семени. Представляет интерес обнаружившийся факт, что изменения концёнг-. ■раций К+ и Na+ в связи с возрастом вполне отражают'динамику.ха- ' рактеристик оттаянного семени. Самая низкая концентрация Кг и самая высокая Ма+ были в семени не самых старых и не.самых молодых. быков, а у животных средней возрастной группы б-7.'летнего'воэрэе-'..

. Возрастание концентрации К*" в жидкой части семени г.од воздействием дигитонина'ие является неожиданностью, Лигитонин разру- ; шил мембраны и произошло. выравнивание эндо- и экзоцеллшярных , концентраций этого иона за счет его утечки из сперматозоидов. Од- ;

Таблица 4 ■''-;■.-■'.'

Концентрация основных катионов в семени в связи с возрастом быков (иг/мл)

Исследуемый катион Воэ-рвет \ быков (лет) Концентрация " » ' -' До добавки < ,.■ дигитонина ионов в семени . После добавки дигитонина . Прирост концентрации от добавки дигитонина

Калий 2-5 6-7 ; 8 й < 2,0510,24 1.8CttÖ,i7 2,27.10,20 2,5810,21 * . 2,17±0,17 2,6210,19 Q,5310,16 (26Z) 0,3?л0,07 (21S) 0,3610,09 (152)

Натрий 2-5 6-7 . ■ 8 я < 1,6210,09 ; 2,оа±о,об 2,0310,08 1,9910,08 , „V- 2,3010,06 2,2210,08. 0,1810,03 (9Х) 0,2210,04 (112) 0,1910,03 ( 9S)

Кальций- 2-5 6-7 ' -8 И < 0,1910,СО ■> Г.0,2710,03 =' -0,3110.03 0,23*0,02 У 0,3010,03 -.0,3410,04 0,0410,009 (21Х) 0,0310,005 (ИХ) .0,0310,006 (ЮГ)

нако увеличение в жишэдй части семени концентрации Ма* и Са** обгяснтъ в тш хе ключе эатруднительно, поскольку в .эотивопо* ложность калию эти ионы мембранными насосами биологически полноценныхсперматозоидов.постоянно откачкваютсяво, внешнюю среду против градиента концентрации несоответственно разрушение целост-' ности мембран не мрхет привести к нарастанию их во внешней среде. :Видимо мы имеем дело с более сложными процессии, чем представляется' на першй взгляд. ---"У/ 'V'.-..V , .'■ ■ ;

Чтоби '•.. лети ясность в этот феномен, был проведен корреляционный анализ,' результаты которого^приведены в.таблице,5. .■'■■ V: Как.видно из данных таблицы 5, очень высокая' корреляция,' .почти линейная гависимость; наблюдается между-концентрациями всех ионов жидкой части семени до и после добавки дигитонинз. Это оз-.'начает, что в том и другом случае источник ионов один и тот .же -сперматозоиды. . ' • '■■'.'■■ '.'';■-■'■

■■■'■ : Следовательно} при; первоначальном измерении концентрация ионов ■ в кидкой части семени и в сперматозоидах уже Снла выравнена.

Таблица 5' •

Корреляционные вза^-юотнршения между изменениями концентрации ионов в семени быков в связи с обработкой дигитонином .

Сопоставляв- Пока- Сопряженность между концентрациями ионов до мые концент- вате- и после добавки дигитонина в эякулятах быков рации ионов ли возрастных групп (лет), .

■ корреляции 2-5 ■ 6-7 8 и более Всех-возрастов

Кадия г ■' 0,76 0.91 0,90 ■; 0,88

Натрия . г ,. 0,92 . 0,83 0,91 0,88

Кальция ■ " Г 0,94 0,99 0,98 V ; 0,98

Во всех случаях Р< 0,0000

Очевидно это следствие того, что уже само разбавление семени мо-жег. вызвать гак называемый dllution shock - блокировать мембран-; - ные насосы и вызывать выравнивание эндо-иг зкаоцелшолярных концентраций ионов (L.Robertson et al.. 1986). Очевидна последующая добавка дигитонина не иницирует, а лишь усиливает разрушение' мембран, делая доступным проникновение довольно крупного катиояа из разбавителя - трис-иона. Последний диффундируя в сторону меньшей- его концентрации вытесняет иэ сперматозоидов более подвижные ионы калия, натрия и кальция. .■ / -'■

Между тем статистический анализ ие выявил ни в одном из случаев корреляции между, концентрациями ионов и-сперматозоидов." ' Это означает, что изначально содержание ионов в сперматозоидах от-, дельных эякулятов было неодинаковым 'и это 'различие' возможно так или иначе отражает состояние плазматических мембран сперматоэои-, .К®*'-' ■■ .' ■ .■'■'"■■■.'■■ V:

Следовательно, о биологической полноценности плазматических мембран сперматозоидов - можно * судить.уже по первоначальной концентрации ионов калия в жидкой частя.сильно разбавленного семени.

■ Эти данные даот основание для 1^ода, что биаиюгическая полноценность семени не может быть достаточно полно представлена-ка-г-сл-^/Лоодкой xaf«тасристит<ой. Очевидно из всего 7 множества.

Таблица б

Влияние возраста быков на результаты осеменений, оцениваемых по данным ректальных исследований

N пл Возраст быков (лет) Осеменено коров Оказалось ( стельных (Доверительный интервал

Число , X Группы сравнения Р

1. 2-5 иго ;■- 568 51±1,Ь

2. 6-7 1191 510 4311,4 3,8 1-2 3,8 <0,0001

3. 8 И < 930 427 4611,6 2,3 1-3 2,3 <0,05

тестов; каждый - оценивает лишь, одну сторону ' Физиологического состояния, а не в целом. Для более точней оценки очевидно необходим многосторонний. подход, учитывающий по возможности множество аспектов физиологического состояния сперматозоидов.

Чтобы узнать какой из тестов лучше других отражает ее, были учтены результаты осеменений семенем изучаемых нами быков в в племенных хозяйствах: Московской и Ленинградской областей, в связи с их возрастом. Результаты приведены в таблице б.

Как видно из данных таблицы б, . от семени быков 2-й группы (возраст.6-7 лет) результаты осеменения снижаются на статистически высокодостоверную величину, а от семени быков третьей группы (возраст 8 лет и старше) они несколько повышаются.. Эти.результаты согласуются с данными изучения семени этих групп биков. Синхронно ■ с результативностью, осеменения . наблюдается - тенденция: изменения таких характеристик семени, как сохранность а»фосом в прсц'-солх замораживания-оттаивания," /показательфертильности Уап-Ьи^па, а также динамики концентраций ионов кадия и натрия.

,'..' 3.1.4, разработка математических моделей связи воспроизсоди-- ■ тельной способности Сыкоз с характеристиками'сеиени.

Лля разработки методики оценки воспроизводительной способности- отдельных^ быков, выясненные нами .отдельные характеристики зякулягов были ; сопоставлены с:результативностью осеменений семенем отдельных быков, которая была взята в пределах одного хозяйства,: ГПЗ "Коммунарка",^ чтебы^до минимума свести неспецнфические. влияния на эти результаты, ... .

Таблица 7

Коррелятивная и регрессионная свявь отдельных характеристик семени быков о соответствующей результативностью осеменения (ГШ "Коммунарка")

Характеристики | Сопряженность с результатами осеменения

. эякулятов -----------------------—---------------

(■Корреляция 1 Регрессия (Y - а + Ь-Х)

I г I Р I а . 1 b

Свежеваятое семя

Объем '---

Концентрация сперматозоидов (млрд/мл)

Число-сперматозоидов в эякуляте (млрд)

После замораживания Сохранность акросоы -0,07' - — Полупериод снижения ' ь подвижности . -0,01 . - . ■ • . -

Показатель фертильности

по Van Dujin -0.09 - , —. '■ ' -

Как видно из данных таблицы 7, при сопоставлении результатов осеменений с характеристиками семени быков в пределах одного хозяйства близкая.к статистически достоверной положительная корреляция обнаруживается лишь с одним показателем - объемом'эякулятов. Следовательно,, лишь этот показатель"может в какой-то мере характеризовать репродуктивный потенциал отдельных быков.

Вместе с тем сопоставление с результатами осеменений характеристик, связанных с концентрациями исследуемых нами ионов даго Scaee обнадеживающие результаты (таблица 8).

Среди отдельных катионов в семени быков,(таблица 8) статистически достоверная корреляция с результатами осеменения обнару-.М1раеп;я лишь с трансмембранным отношением концентраций К*, а

0,5 0,07 15,7' 6,5© •

-0,32 ' --'..:-;

-0,29 ; - -

Таблица 8

Коррелятивная и регрессионная связь концентраций К+, На+и Са++' в семени быков с результативностью осеменения

Концентрация | Сопряженность с результатами осеменения

ионов в семени | Корреляция-1 Регрессия (У - а + Ь-Х)

1 г | Р "Г" а .) ь

Що добавки дигитонина (1): калия натрия кальция -0,43 0,29 -0,12 - - -

После добавки дигитонина (2): . кадия натрия кальция -0,29 0.25 -0,06 - - -

Разница между 2 и 1 измерениями калия ■. натрия . ' кальция í ¡ООО 1 » М Я-| М 0,07 38,71 0,18

Отношение:результатов 2:1 измерений калия натрия кальция 0.58 0,11 0,24 0,04 12,2 26,65

именно с отношением концентрации'в цельном семсни (после добавки дигитонина) к концентрации в плазме семени (до добавки дигитони-иа). Кроме того, близкая к статистически достоверной сопряженность воспроизводительного потенциала быков выявляется с концент-

рацией К+ в сперматозоидах (разность между концентрациями К* до и после добавки дигитонина).

На основании полученных корреляций можно составить следующие уравнения прогноза результативности искусственного осеменения:

(1) По объему эякулята (г-0,5; Р<0,07):

У - 15,7 + 6,6-03 , где ОЭ - объем одного эякулята (мл).

(2) По концентрации , ионов калия в сперматозоидах (г-0,52;

Р<0,07): -

У - 33,7 + 0,18-КЗ , где КЗ - разность между концентра' циями ионов кадия в семени до и после добавки дигитонина: КЗ-К2-К1, (мгХ).

(3) По отношению концентрации ионов кадия в цельном семени к

концентрации в плазме (г-0,58; Р<0,04):

У - 12,2 + 26,9-К4, где К4 - отношение концентрации ка. лия в семени после добавки дигитонина к концентрации до добавки:

К4-К2:К1. ' ;

(4) По всем трем показателям:

I-:-1

| У - 21,9 + 2,1-ОЭ + 0,06'КЗ + 9.8-К41 ;

«_;____ • ■ *

3.2. Сравнение фактических и прогнозируемых по отдельным уравнениям результатов осеменений.

Разработанные нами уравнения необходимо было проверить на точность оценки воспроизводительной способности.отдельных' быков. Для этого вычисленная результативность была сопоставлена с фактической.

Как видно {таблица 9), при анализе сопряженности результатов, прогнозируемых по индивидуальным различиям воспроизводительного потенциала быков и фактических результатов в одном, хозяйстве, когда в меньшей степени, влияют на результаты факторы, не зависящие'от быков, выявлена более высокая корреляция, которая наблюдается при вычислении прогноза по использеванным уравнениям.

Таким' образом, среди множества факторовJ сопряженных- с ре-

Таблица 9 '

Степень сопряженности результатов осеменения, Гпрогнсдаируемыхпо регрессионным уравнениям

Уравнение,' по которому Использованная в 'Корреляция вычислен-вычислены результаты уравнении харАк- ной результативности осеменения теристика семени с Фактической

г - Р ■

(1) у - 15,7 + б.б-ОЭ Объем эякулята 0,6 <0,07

(2) У - 30,7 ♦ 0,18-КЗ По концентрации ионов кадия в сперматозоидах , 0,5 <0,08

(3) У - 12,2 + 26,9-К4 Отношение концентрации калия в цельном семени к концентрации в плазме 0,58 <0.03

(4) V - 21,9+2,1-ОЭ " С +0,06-КЗ+0,8-К4 • . По всем трем показате-■■ телям - 0,62 <0,001

зультативностью осеменения, для ее прогноза могут быть использованы концентрация * К* в сперматозоидах,. а■также отношени* концентрации К* в цельном семени к концентрации в плазме.• По этим отдельным характеристикам зякулятов можно с удовлетворительной точностью оценивать '.потенциал воспроизводительной способности iбыкoБ.,' Однако более точная оценка может быть получено при расчетах по. уравнению, обобщающему три характеристики зякулятов: : его объем, концентрацию ,ионов калия'в сперматозоидах и отношение концентрации этого и?.на к концентрации его в плазме семени. ;; ■ - V ■

В таблице 10 приведено сопоставление результатов, вычислен- : ных по уравнению (4) с фактическими данными.

Как показывают, данные'таблицы 10, разница меаду прогнозом и фактической результативностью осеменения в"целом не ■ ^существенна, хотя абсолютного совпадения не наблюдается. Отклонения эти вполне понятны, поскольку в каждом конкретном случае на результаты осеменений действовало множество факторов, не связанных с качеством семени и воспроизводительной способностью быков. Вместе тем, судя

- 20 -

Таблица 10 . .■

Степень сопряженности прогнозируемых и фактических результатов осеменения

К Клички Результативность осеменения (X) Уровень

ГШ быков корреляции

прогно- факти- Разница ; прогноз:

зируемая ческая :.'■"• ■ фактический.

1. Гелиос 41 . 41 .: 0 '

2. Геракл 39 . 46 ■' -7

3. Девон 40 31 ■. ' 9 ■ ; г - 0,82

4. Джулъ ." 39 29 10 , Р - 0,004 •

5, Зотилас 41 " 40

6. Зуппи 38 , 32

7. Лидо ."■'■ 51 '.• . . 56 -5

8. Мильтон 43 . 49

9. Свет 42 38 ; ■ .. .4 '

10.Эксперт 42 ■ 43 .."

В среднем ■ 42г1 г 41±3 ■

Минимум : за '.'■■■ 29

Максимум ' Б1 . 56

по корреляции между фактическими и прогнозируемыми результатами оценка по нашему методу семени и воспроизводительной способности отдельных быков вполне реальна.

' ■ . 4. выводы

На основании проведенных нами исследований и полученных ре. зультатов можно сделать следующие выводы: -

4.1. В условиях племенных хозяйств с относительно . высокой культурой производства результаты осеменений коров в большой степени зависят от индивидуальной принадлежности семени, чем от факторов, не связанных с характеристиками эякулятов.

4.2. В связи с возрастом быков волнообразно изменяется результативность осеменения, она статистически достоверно снижается после достижения 6-7 лет, ко снова повышается после 8 лет и старше. Однако эти изменения воспроизводительной способности быков не сопровождаются. соответствующими изменениями основных характеристик оценки эякулятов.

4.3. С результативностью осеменения семенем отдельных быков .сопряжены такие характеристики его оценки как объем эякулята

(г-0,Б, Р<0,07); концентрации ионов калия в сперматозоидах (г-0,52, Р<0,07); отношения концентрации ионов калия в цельном ' ; семени к концентрациив плазме (г-0,58, Р<0,04).

4^4. Наиболее точный прогноз результатов. осеменений может , быть получен при использовании регрессионного уравнения, построенного на базе нескольких характеристик семени: объема эякулята, концентрации ионов калия в.сперматозоидах и отношения концентрации ионов калия в цельном семени к концентрации их в плазме, в -этом случае получена самая высокая корреляция вычисленной резуль- | тативности осеменений с фактической - (г-0,62, Р<0,001).

4.5. Индивидуальные различия концентраций и градиенты концентраций ионов калия, натрия, кальция в сек ни быков достаточно \ ,устойчивы в течение длительного времени, минимум два года. Это \ означает, что состояние плазматических мембран сперматозоидов яв-. .:"■;'■■-, ляется врожденным качеством и мало подвержено изменениям под воздействием внешних и внутренних факторов.' 1 .

"у. ; ' Ч у; ':- "Ч ■"-.; - "5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛаТОШ. У

. , • •. Для оценки. качества семени предлагаем метод измерения трансмембранного градиента концентрации ионов калия; в .семени. Метод состоит в следующем;.свежевэятое семя.в количестве 0,1 мл разбавляют в 10 мл трис-цитратном разбавителе следующего состава: тр:!с ■ .. * (с'ксиметил) аминометан (основание), - 2,42 г; лимонная кислота -1,34 г; глюкоза - 0,1 г. . дистиллированная вода 100 мл. При этом температура : разбавителя должна быть одинакова с температурой се-

мени (20°С). . : ГГ ' V-.'.-

В разбавленное семена погружают ионоселективкый электрод для измерения ионов калия и хлорсеребрякый влектрод сравнения, С по- ; мощью' милливольтметра измеряют разностъпотенциалов на электродах (ЭЯС). Затем в семя добавляют несколько капель БХ вещной суспен- ,'■■ . зии дититонина и измерение ЭДС повторяют. В том и другом случае концентрацию ионов калия находят по соответствующей калибровочной кривой или уравнению У-(0,03*ЭДС - 34,9)-100, где У - концентра-. цня ионов калия в семени в мгХ»: а ЗДС - в микровольтах..

Оценкуэякулятов и соответственно репродуктивного потенциала' отдельных быков производят по следующему уравнению:; Л:

. > У - 21,9 + 2,1*03 * 0.06-КЗ + 9,8«К4|

* где 0Э— объем одного эякулята (мл);

КЗ - разность моадуконцентрациямл ионов калия

в семени до и после добавки дигитогоша (мгХ); • : К4 - отношение концентрации калия в семени после 'Л:;-1 добавки дигитоииза к концентрации до. .- . ■'■'■'.■■■ ■ Добавки; '■ ■:■ "V^'^-г^:/;';':-

/'V - прогнозируемый процент стельных коров через ■ ; 'Л;'.- 2 месяца послеосемеиениа. ;; ; ' ^ /"й -

■, Основные положения диссертацки опубликованы в следующих ра-■. ботах: -" л." Т'-: '

1. М.С.Шыбеталлев. Связь отдельных характеристик семеюГ с возрастом быков //1-я Мелэдувародвая научная конференция ,*Шлора-, цовские чтения", апрель, 1993 г. (в печати).: %

2. В.П.Кононов, М.С.Мамбеталиев, В.Ф.Ту^ин. Трансмеыбрапные перемещения ионов К, На, Са в сперматовоедвх быкоз как показателя их биологической полноценности. // С.-х. биология. - 1993. - №4. -с. 47-52.

ЛПодписано к геччун 12 01 г.- • : V; ' Яакяч .Síв -•••''•

; .! у ; Х )/'• ^ ;' ir-irièv"Л 0 уч л,. ""