Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ионных каналов внутриклеточных мембран методом встраивания в бислойную липидную мембрану

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ионных каналов внутриклеточных мембран методом встраивания в бислойную липидную мембрану"

'У О 3 -ЯП

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЛ\ИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.352.26:577.352.465

БЕЗПРОЗВАННЫЙ Илья Борисович

ИССЛЕДОВАНИЕ ИОННЫХ КАНАЛОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МЕТОДОМ ВСТРАИВАНИЯ В БИСЛОЙНУЮ ЛИПИДНУЮ МЕМБРАНУ

03.00.25 —КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Диссертационная работа выполнена в лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института Цитологии РАН и в Медицинском Центре Университета штата Конненктикут (США).

Научный руководитель — доктор биологических наук А. П. НАУМОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Я. Ю. БАГРОВ доктор биологических наук Л. В. ЩАГИНА

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

а

Защита состоится » марта ,1992 года в « » часов на

заседании специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: '194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Автореферат разослан «^^ г"

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук Л. Н. ПИСАРЕВА

© — Институт цитологии РАН.

.. \ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' 7-^Актуальность темы. Исследования в области клеточной '--сигнализации показали важность выброса ионов кальция из внутрикулеточных депо для жизнедеятельности клетки. Во многих случаях эффект физиологически активных веществ на клетки-мишени опосредован через инозитолтрифосфат(ИТФ)-индуцированный выброс кальция из внутриклеточных мембранных структур CBerrldge,19891. Мышечное сокращение запускается выбросом кальция из саркоплазматического ретикулума (CP) благодаря активации кофеин-чувствительных каналов (рианодиновых рецепторов) tsmith

et al., 1986; Lai et al., 1988]. МОЖНО ПреДПОЛОЖИТЬ, ЧТО ВЫбрОС

кальция из .внутриклеточных запасов во многих типах клеток происходит при участии специализированных ионных каналов, локализованных во внутриклеточных мембранах. Изучение проводящих свойств и механизмов регуляции этих ионных каналов представляет поэтому большой интерес.

Различные методические подходы могут быть использованы для изучения ионных каналов. Значительный прогресс в понимании структуры, функции и механизмов регуляции ионных каналов был достигнут за последние годы благодаря развитию методики "пэтч-клампа" [Sakmarin and Meher, 1983].. Будучи ОЧеНЬ МОЩНЫМ орудием исследования, эта методика однако имеет ряд ограничений. В частности, "традиционным" пэтч-клампом могут быть исследованы только ионные каналы плазматической мембраны.

На сегодняшний день встраивание ионных каналов в бислойную липидную мембрану (БЛМ) представляется наиболее перспективным путем изучения ионных каналов внутриклеточных мембран. Методика формирования БЛМ была Епервые разработана более 20 лет назад

Сокращения, используемые в тексте: ИТФ - (1,4,5) инозитол-трифосфат, БЛМ - бислойная липидная мембрана, ЭР эндоплазматический ретикулум, CP - саркоплазматический ретикулум, АМФ - аденозинмонофосфат, АТФ - аденозинтрифосфат, АМФ-ФЦФ - зденилилметилендифосфонат (негидролизуемый АТФ аналог), пСм - пикосименс, мВ - милливолт, пА - пикоампер

tHuller and Rudin, 1SS9], КО С Тех ПОр ГфИМеНЯЛЗСЬ ШИрОКО В

основном для изучения механизмов действия ионофоров и каналоформеров. Лишь сравнительно недавно Сила разработана методологическая база для встраивания "еивых" белковых каналов в БЛМ tmiier, 19861 путем слияния везикул, содержащих каналы, с предварительно сформированной мембраной.

Для исследования ИТФ-активируемых кальциевых каналов была выбрана микросомальная фракция, изолированная из мозжечка собаки. Из биохимических исследований было известно iworiey et ai, 1987], что эта фракция содержит большое количество ИТФ-рецепторов. Этот ке объект был использован для выделения ИТФ-рецептора на уровне индивидуального белка методом аффиной хроматографии tSupattapone et al., 1988; Maeda et al., 1990] и последующего клонирования гена рецептора tFuruichi et ai., 1909; Mlgnery et al., 1989]. хотя всв эти исслвдовзния позволили

создать представление о структуре белка рецептора, но все еще очень мало известно об его функциональных особенностях и путях регуляции. Исследования транспорта кальция в липосомах сс встроенным рецептором [Ferris et al., 1990] ПОКаЗВЛИ, что ИТФ-рецептор является функциональным кальциевым каналом, а использование фракции CP гладких мышц аорты в опытах по встраиванию в БЛМ lEhrllch and Watras, 1988] ДЗЛИ предварительное представление о характеристиках этого канала. Дальнейшее изучение функциональных свойств ИТФ-активируемых кальциевых каналов необходимо для лучшего понимания механизма гормональной регуляции уровня кальция в клетке. Дели и задачи исследования. Целью работы было исследование сеойств ионных каналов внутриклеточных мембран. Наибольшее внимание было уделено изучению функциональных характеристик ИТФ-активируемых кальциевых каналов. Соответственно были поставлены следующие задачи.

1. Отработать методику формирования бислойной липидной мембраны (БЛМ) и встраивания в нее различных типов ионных каналов из внутриклеточных мембран. Исследовать свойства калиевых каналов из мембран CP гладких мышц аорты собаки.

2. Изучить проводящие свойства инозитолтрифосфат(ИТФ)-

активируемых кальциевых каналов из мембран эндоплазматического ретикулума (ЭР) ргозкечка собаки. Исследовать зависимость вероятности открытого состояния этих каналов от концентрации ИТФ с цитоплазматической стороны. Изучить влияние изменения цитоплазматической концентрации кальция и аденкноЕЫХ нуллеотвдов на активность канала.

3. Ответить на вопрос о наличии другого типа кальциевых каналов в той г:е кикросомалыюй фракции.

"Научная новизна работы. Впервые описаны свойства- калиевых каналов из СР гладок мыищ: проводимость, селективность и индуцируемый барием блок. Продемонстрирован эффект

"возникновения проводящих подсостояний калиевых каналов при действии бария. Описаны свойства ИТФ-активируемых кальциевых каналов из микросом мозкечка собаки и показано наличие у этих каналов четырех кратных проводящих подсостояний. Количественно изучены зависимости вероятности открытого состояния ИТФ-активируемого кальциевого канала внутриклеточных мембран от цитоплазматических концентраций■ИТФ и различных типов адешшовых нуклеотидов. Впервые показана колоколообразная зависимость активности ИТФ-активируемых каналов от концентрации цитоплазматического кальция, что позволило предположить существование положительной и отрицательной обратных связей в процессе выброса кальция из ЭР на уровне регуляции воротного механизма канала. Впервые показано сосуществование |

ИТФ-активируемых и кальций-активируемых кальциевых каналов в ; мембранах ЭР, изолированных из одного объекта, и описаны" свойства кальций-активируемых каналов из немышечной ткани. Научно-практическое значение работы. Полученные в работе данные о свойствах ИТФ-активируемого кальциевого канала вакны для понимания функциональных связей в системе передачи сигнала в клетке при помощи вторичных посредников. Эта система является объектом действия разнообразных фармакологических агентов. Мишенью большого количества различных фармакологических агентов и лекарственных препаратов являются белки ионных каналов. Описанная в работе методика встраивания ионных каналов в БЛМ

может быть использована для тестирования этих веществ и изучения механизма их действия.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Пущино, 1989); на 10 конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1989); на Ежегодной научной конференции Морской Биологической Лаборатории (Еудс-Холе, США, 1990); на 35 Ежегодном Съезде Американского Биофизического Общества (Сан-Франциско, США, 1991). Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего источника. Работа

изложена на страницах и содержит рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Изоляция микросомальной фракции мембран CP гладких мышц аорты собаки и ЭР мозжечка собаки. Микросомальная фракция, содержащая главным образом мембранные везикулы CP гладких мышц аорты или ЭР мозжечка собаки, была выделена методом градиентного центрифугирования гомогената ткани^ [Watras and Benevolensky, 1987] с небольшими модификациями. Полученную фракцию хранинили в жидком азоте до использования.

Формирование бислойной липидной мембраны (БЛМ). БЛМ были сформированы по методу Мюллера-Рудина на отверстии диаметром 100-150 мкм в тефлоновой пленке толщиной 60 мкм, разделяющей две камеры объемом 2 мл каждая (экспериментальная ячейка схематически изображена на рис. I). Для формирования БЛМ использовали раствор смеси фосфолипидов (70% фосфатидилзтаноламин, 15% фосфатидилхолин, 15% фосфатидилсерин) в декане е концентрации 20 мг/мл. В рзботе были использованы как синтетические (Avanti Polar lipids Inc., Birmingham, AL), так и изолированные из мозга быка (Дальневосточный Государственный Университет, Владивосток) фосфолипиды. Чистота

Рис. I Экспериментальная ячейка для формирования БЛМ. На вставке схематически показано бимолекулярное строение мембраны. ММ - магнитные мешалки. ОПУ -операционный усилитель входного каскада. V м -командный потенциал. Ус - усилитель сигнала. МЗ - устройство магнитной записи.

липидов контролировалась методом тонкослойной хроматографии в хлороформ/метанол/Еодной'смеси (Кейтс, 1978). В некоторых экспериментах в состав мембраны добавляли 5% холестерина ccaibiocheno. За формированием мембраны следили визуально и по изменении электрической емкости, используя тестовый сигнал треугольной форш частотой 30 Гц.

Встраивание ионных каналов в БЛМ. Для встраивания ионных каналов в БЛМ был применен метод, оснозанный на слиянии изолированных микросом (см. выше) с предварительно сформированной липиднсй мембраной. Слияние происходило под действием осмотического градиента на мембране с mi u er , 1986;

Smith et al., 1986; Ehrlich and Watras, 19885. Та

экспериментальная камера, куда добавляли везикулы, называлась "цис" камерой, а камера с противоположной стороны мембраны -"транс" камерой (см. рис. I). Осмотический градиент на мембране, достигавший 1000 мОсм, создавался путем добавления концентрированного раствора kci с цис стороны. После добавления везикул с цис стороны до конечной концентрации 50 мкг белка/мл и последующего перемешивания магнитной мешалкой происходило слияние везикул с БЛМ под действием осмотического градиента.

"Индикатором" этого слияния было появление калиеЕых или хлорных каналов в до этого "молчащей" мембране. Если эксперимент ставился ради изучения кальциевых каналов, то цис-раствор заменялся на гэо тм Tris^HEPEs без разрушения мембраны с помощью системы для перфузии. Последняя процедура позволяла исключить конные токи через калиевые и хлорные каналы. В этих экспериментах транс камера заполнялась раствором эошм са^гэотм pepes (рН 7.35) и ток через мембрану переносился ионам кальция по электрохимическому градиенту.

Регистрация токов через одиночные ионные каналы и последующая обработка. Активность каналов в БЖ регистрировалась при фиксированном трансмембранном потенциала с помощью пары хлорсеребрянных электродов, соединенных с цис и транс растворами через агарозяые солевые мостики (рис. I). Для усиления тока через одиночный канал использовался либо самодельный усилитель (собранный в соответствии с рекомендациями

ИЗ КНИГИ Sakmann and Neher, 19333 , ЛИбО КОММерЧеСКИ ДОСТУПНЫЙ усилитель ДЛЯ ПЭТЧ-КЛаМПа(¥а1е model МК-5, Warner Instruments,

Hamden, стэ. В обоих случаях сопротивление в цепи обратной связи входного каскада (к)составляло ю go. После усиления и фильтрации ФНЧ с полосой 5 КГц сигнал записывался на магнитограф и в дальнейшем обрабатывался на персональном компьютере ibm at с

помощью программы pCLAMP 5.5 CAxori Instruments, СА, USAD.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Калиевые каналы в CP гладких мышц аорты собаки: проводимость, селективность, индуцированный барием блок й" проводящие подсостояния. Метод встраивания в ИМ был применен для изучения свойств калиевых каналов в мембранах CP гладких мышц аорты собаки. На рис. 2,А показаны записи токов через эти калиевые каналы при различных трансмембранных потенциалах. Проводимость одиночного канала была оценена по зависимости тока через канал от напряжения на мембране (рис. 2,В) и оказалась равной 210 пСм. Потенциал реверсии тока через канал, равный -31 мВ (рис. 2,В), достаточно близок к Нернстовскому потенциалу для

+ * _______JJ______

(OílA j_

ХОМЖК .

Рис. 2 Калиевые каналы CP гладких мышц аорты, встроенные в ЕЛМ. (А) Записи ионных токов через каналы. Концентрации ионов калия составляют 400 мМ в цис камере и 100 мМ в транс камере-. Трансмембранный потенциал указан с левой стороны от кавдой записи тока в мВ. "Нулевая линия" показана пунктиром. (В) Зависимость величины тока через одиночный канал от трансмембранного потенциала.

калия в используемых ионных условиях (100 мМ kci транс/400 мМ KCl цис). При замене раствора в цис камере на 400 мМ Nací потенциал реверсии тока через канал оказался равен +21 мВ. Используя уравнение Голдмана-Ходчкина-Катца, отношение проницаемости каналов для калия к проницаемости для натрия (PK/PNa) было оценено в 7.7 по разнице в потенциалах реверсии между этими двумя сериями экспериментов, равной 52 мВ. Таким образом, калий/натриевая селективность калиевых каналов в CP гладких мышц аорты намного выше, чем селективность аналогичных каналов В скелетном [Coronado et al., 1980] или сердечном IH111 et al., 19891 СР. ПрОВОДИМОСТЬ КЭЛИвВЫХ КЭНаЛОВ ИЗ CP рЭЗЛИЧНЫХ

типов мышц при этом практически не различается.

При добавлении миллимолярных концентраций бария с любой стороны от мембраны происходит блок калиевого канала, причем при

1 — T^l

Av-n

lOnAl

аоомсяк

ИИ» пА

-50

2+

ВО«

L-S

© 4 а n А

Рис. 3 Эффект ионов ва*1, на калиевые каналы CP мышц аорты.. (А) Записи тока через канал (AI) и амплитудная гистограмма (А2) в контрольных условиях. Гистограмма А2 может быть описана тремя гаус-совскими кривыми со средними значениями 0.0 пА (оба канала закрыты), 6.0 пА (один канал открыт) и 12.0 пА (оба канала открыты). (В) Записи тока через канал (BI) и амплитудная гистограмма (В2) после добавления 5 мМ васлг с цис стороны. Гистограмма В2 может быть описана пятью гауссовскими кривыми со средними значениями 0.0 пА (оба канала закрыты или заблокированы), 3.4 пА (один канал в проводящем подсостояши), 5.6 пА (один канал полностью открыт), 9.0 пА (один канал полностью открыт и второй в проводящем подсостоянии) и II.2 пА (оба канала полностью открыты). (С) Зависимость тока через канал от напряжения на мембране для полностью ( О ) и частично ( Д ) открытого калиевого канала после добавления 5 мМ Baci£ с цис стороны. Соответствующие значения проводимости канала 180 пСм и 100 пСм.

добавлении бария с цис стороны этот блок носит явный потенциалзависимый характер. Для количественного описания этой зависимости была использована классическая модель »ооаьаи (19731. Применение этой модели позволило оценить, что эффективное "электрическое расстояние" до барий-связыванцего участка в поре канала составляет 0.86 с цитоплазматической (цис) стороны.

Кроме описанного медленного блока, ионы бария также вызывают появление у канала дополнительного проводящего подсостояния. В контрольных условиях только два проводящих состояния канала были зарегестрированы: закрытое и открытое (рис. 3,А1 и 3, А2). В присутствии бария появилось еще одно, промежуточное подсостояние с проводимостью около 60% от основного открытого состояния (рис. 3,В1 и 3,В2). По гистограмме 3,В2 видно, что канал проводит приблизительно 30% от общего открытого времени в этом подсостоянии. Зависимость тока через канал от напряжения на мембране для "полностью" и "частично" открытого состояния канала в присутствии бария показана на рис. 3,С. Механизм возникновения проводящего подсостояния неясен. По нашему предположению, канал каким то образом "запоминает" пребывание бария в связывающем участке и в результате вероятность принятия аномальной конформации с меньшей проводимостью возрастает по сравнению с контрольными условиями. Из рис. 3 видно, что даже "полностью" открытое состояние канала в присутствии бария имеет несколько меньшую проводимость, по видимому благодаря быстрому блоку калиевых каналов ионами бария.

После выполнения работы по изучению сеойств калиевых каналов в СР гладких мышц аорты стало ясно, что методика встраивания ионных каналов в БМ находится у нас "в руках" и может быть использована для решения более сложной, но интересной задачи - для поиска и изучения ИТФ-активируемого кальциевого канала. Первоначально для этих экспериментов была использована фракция СР гладких мышц аорты, но в ходе работы возникли серьезные трудности, главным образом связанные с редкостью встраивания ИТФ-канала в БЛМ. Гораздо более успешными оказались

эксперименты с микросомальной фракцией мозжечка собаки. 2. ИТФ-актиЕируемые кальциевые каналы в ЭР мозжечка собаки: наличие проводящих подсостояний. Как уже указывалось выше в разделе "Актуальность темы", микросомальная фракция мозжечка собаки была выбрана из-за очень высокой плотности ИТФ-рецепторов в этом препарате. Измерения транспорта кальция с использованием кальциевого индикатора антипирилазо 3 показали наличие ИТФ-индуцированного кальциевого выброса в этой фракции. Эти данные позволили предположить, что ИТФ-рецептор в этой фракции является функциональным кальциевым каналом. При использовании везикул этой фракции в экспериментах по встраиванию в ЕЛМ в контрольных условиях никакой активности каналов не было заметно, но после добавления 2 мкМ ИТФ с цис (цитоплазматической) стороны была получена активация кальциевых каналов (рис. 4,А). На рис 4,В записи токов через одиночный ИТФ-активируемый канал при трансмембранном потенциале -50 мВ показаны в более растянутом временном масштабе. На обеих панелях рис. 4 легко можно заметить наличие нескольких проводящих подсостояний канала. Амплитудная гистограмма тока через ИТФ-активируемый канал при напряжении на мембране -50 мВ показана на рис. 5,А. Количественный анализ полученных данных показывает невозможность описания распределения вероятностей появления различных подсостояний с.помощью биномиального распределения, как можно было бы ожидать в случае нескольких каналов в мембране, работающих независима. Отсюда мы сделали еывод, что имеем дело с набором подсостояний одного канала. Следует отметить, что четвертое проводящее подсостояние канала наблюдается сравнительно редко (рис. 5,А).

Измерение зависимости тока через ИТФ-активируемый канал от напряжения на мембране (рис. 5,В) позволило оценить проводимости различных подсостояний канала в 20, 40, 60 и 80 пСм. Таким образом, представляется разумной модель, в которой тетрамерной структуре итф-рецептора (Chadwick et al.,1990; Maeda et al.,19911 соответствует четыре проводящих кальций "канала" с проводимостью 20 пСм каздый в составе одного белкового комплекса. Конечно,

КОНТРОЛЬ

+2/Л1Ш ^¿^цуск^ви Ь-т ии

2С0 ИС»К

25

мсск

Рис. 4 ИТФ-активация кальциевых каналов' ЭР мозжечка, встроенных в БЛМ. (А) В контрольных условиях ионный ток через мембрану не идет (верхние три зашей). После добавления 2 мкМ ИТФ с цитоплазматической (цис) стороны от мембраны, открывания канала наблюдаются как отклонения уровня тока вверх от нулевой линии (нижние три записи). АТФ в концентрации 0.5 мМ было добавлено с цис стороны от мембраны для увеличения вероятности открытого состояния канала (см. ниже). Трансмембранный потенциал равен О мВ, ионы кальция движутся по электрохимическому градиенту (концентрация кальция с транс стороны 50 мМ). (В) Записи токов через одиночный ИТФ-активируемый канал при напряжении на мембране -50 мВ в более растянутом временном масштабе. Короткими отрезками с правой стороны от каждой записи показаны уровни тока, соответствующие четырем проводящим подсостояниям ИТФ-канала (см. ниже).

Ь «В

■До -4/0 -30 -20 -40 О

Рис. 5 Проводящие подсостояния ИТФ-активируемого кальциевого канала. (А) Амплитудная гистограмма ИТФ-активируемого канала. Амплитуды токов через открытый канал длительностью более I мсек регистрировались в течение 55 сек при трансмембранном потенциале -50 мВ (350 событий). Первые три пика были описаны гауссовскими кривыми со средними 1.7 пА, 3.5 пА и 4.9 пА. За время наблюдений было только три открывания на уровень 4 со средним значением тока 6.6 пА. (В) Зависимость тока через ИТФ-канал от напряжения на мембране. Четыре уровня тока через канал наблюдаются при кавдом потенциале. Символами обозначены средние значения тока для каждого подсостояния. Сплошная линия была рассчитана по методу наименьших квадратов по точкам, представленным открытыми треугольниками ( А).Пунктирные линии проведены в предположении, что сплошная линия отражает зависимость тока от напряжения для третьего из четырех кратных подсостояний.

альтернативная модель, предполагающая несколько проводящих подсостояний у одного "канала", не может быть еще отброшена на основании существующих в настоящий момент данных.

3. ИТФ-активируемые кальциевые каналы в ЭР мозжечка собаки: зависимость вероятности открытого состояния от концентрации ИТФ и адениновых нуклеотидов (АТФ, АМФ, негидролизуемый АТФ аналог АМФ-ФЦФ). Наличие нескольких проводящих подсостояний Ту ИТФ-активируемого канала говорит в пользу функционального взаимодействия между четырьмя ИТФ-рецепторами, образующими кальциевый канал. В пользу такого взаимодействия свидетельствовали такие опубликованные данные об ИТФ-зависимости выброса кальция из пермеабилизованных клеток [Меуег а1., 19881. По данным этой группы, по меньшей мере 3 молекулы ИТФ должны связаться с белковым комплексом канала для его активации, что приводит к положительной кооперативное™ ИТФ-зависимого кальциевого выброса с коэффициентом Хилла от 3 до 4. Для прямой проверки этого предположения мы еделаж эксперименты по измерению зависимости вероятности открытого состояния кальциевого канала в БЛМ от концентрации ИТФ с цитоплазматической стороны. Результат одного из таких экспериментов показан на рис. 6. Пороговый уровень тока в I пА (при трансмембранном потенциале 0 мВ) был выбран для вычисления

Рис. 6 Зависимость вероятности открытого состояния встроенного в БЛМ ИТФ-актиЕируемого кальциевого канала из ЭР мозжечка от концентрации ИТФ с цитоплазматической (цис) стороны. Данные были нормированы; 1.0 соответствует вероятности открытого состояния канала 14% (максимальной вероятности в данном эксперименте). Эксперименты были сделаны в присутствии 330 мкМ АМФ-ФЦФ и при оптимальной (0.2 мкМ, см ниже) концентрации свободного кальция.

вероятности открытого состояния канала при каждой концентрации ИТФ. При этом все открывания канала на уровни 2, 3 и 4 (см. выше) Орались в расчет как оно "открытое состояние", а уровень I отбрасывался. Это приходилось делать из-за сложности в разделении открываний на первый уровень от шума нулевой линии. Полумаксимальная вероятность открытого состояния наблюдалась при концентрации ИТФ 0.2 мкМ. Коэффициент Хилла для получившейся зависимости оказался равным 1.0. Эти данные позволяют предположить, что связывания одной молекулы ИТФ достаточно для открывания кальциевого канала. Возможные причины получившегося расхождения С группой Meyer et al. будут обсуждаться ниже при рассмотрении данных о зависимости активности ИТФ-каналов от концентрации цитоплазматического кальция.

В согласии с результатами, полученными другими лабораториями tFerris et al., 1990; lino, 1990], НЗМИ была показана аллостерическая регуляция ИТФ-активируемых каналов адениновыми нуклеотидами - ШФ, АТФ и АМФ-ФЦФ (негидролизуемый аналог АТФ). Полученные зависиморти могут быть описанны уравнением Михаелиса-Ментен, что говорит о достаточности связывания одной молекулы аденинового нуклеотида в аллостерическом-участке для активации канала. Полумаксимальный эффект достигался при концентрации АТФ или АМФ-ФЦФ близкой к 20 мкМ, а для А.МФ эта величина составляла около 0.4 мМ. Эти значения хорошо согласуются с „ опубликованными значениями констант связывания ряда адениновых нуклеотидов с выделенным из мозжечка ИТФ-рецептором iMikoshiba et ai., 1991), свидетельствуя о функциональной значимости этого участка связывания. Необходимо подчеркнуть, что ни при каких обстоятельствах адениновые нуклеотида не приводили к активации этого типа каналов в отсутствие ИТФ.

4. ИТФ-активируемые кальциевые каналы в ЭР мозжечка собаки: колоколообразная зависимость вероятности открытого состояния от концентрации кальция в цитоплазме. Пожалуй, наиболее интересные результаты были получены при изучении зависимости активности ИТФ-чувствительных каналов от цитоплазмати^е ской концентрации

кальция в физиологическом диапозоне. На рис. 7, А показаны данные одного из таких экспериментов, в котором активность ИТФ-каналов была измерена при различных концентрациях свободного кальция с цис стороны. Уровень свободного кальция был рассчитан ПО общеизвестной программе (Fabiato and Fabiato, 19/91. ИЗ рИС. 7,А легко можно видеть, что вероятность открытого состояния каналов возрастала при нарастании уровня свободного кальция с 0.01 гжМ до 0.25 мкМ и уменьшалась при дальнейшем увеличении цитоплазматического кальция. После обработки экспериментальных данных нами была получена колоколообразная зависимость вероятности открытого состояния каналов от уровня цитоплазматического кальция (рис. 7,В) в физийлогическом диапозоне. Эта кривая (рис. 7,В) имеет несколько интересных особенностей. Во-первых, полученные данные не могут быть описаны в предположении существования единственного "активирующего" и "ингибирующего" кзлыдай-связываицих участков (пунктирная линия на рис. 7,В показывает результат применения этой простейшей модели). Для удовлетворительного описания результатов эксперимента необходимо было предположить кооперативное связывание кальция в. "+" и "-" участках с коэффициентом Хилла близким к 2. Также адекватной является модель, предполагающая 3 независимых кальций-связывающих участка, регулирующих общий "канал". В дополнение к существованию набора проводящих подсостояний, необходимость применения такого рода моделей является еще одним аргументом в пользу функционального взаимодействия субъединиц белкового комплекса ИТФ-активируемого канала.

Поскольку вся колоколообразная зависимость активности ИТФ-активируемых каналов попадает в даапозсн физиологических концентраций кальция, получившийся результат тлеет очень важный биологический смысл. Уровень кальция в цитоплазме покоящейся клетки близок к 0.1 мкМ, и в соответствии с полученной кривой (рис. 7,В) при начале ИТФ-индуцированного кальциевого выброса существует положительная обратная связь, обусловленная' дополнительной активацией ИТФ-каналов при увеличении

[С«г*] мкМ

си

0.01 »10 <хг5

в

и.

11-

2.6

10с«К |2пА

Рис. 7 Зависимость активности встроерных в БЛМ ИТФ-каналоЕ от цитоплазматической (цис) концентрации кальция в физиологическом диапозоне. (А) Активность ИТФ-каналов в скатом временном масштабе при различных концентрациях свободного кальция была измерена в присутствии 2 мкМ ИТФ и 330 мкМ АМФ-ФЦФ. Свободный кальций варьировался путем добавления аликвот калиброванного 20 мМ раствора хлорида кальция к смеси I мМ ЭГТА и I мМ ХЭДТА. Получающийся уровень свободного кальция указан с правой стороны от каждой записи в мкМ. (В) Зависимость вероятности открытого состояния ИТФ-каналов от уровня цитоплазматического кальция. Вероятность открытого состояния канала была определена е каждой точке из отрезков записи не менее 2.5 минут длиной при пороговом уровне тока I пА. Для сравнения результатов 4 экспериментов, выполненных с двумя различными фракциями микросом мозжечка, вероятность открытого состояния канала в каждом эксперименте была нормирована на максимальную, которая никогда не превышала 15%.

концентрации цитоплазматического кальция (левая ветвь колоколообраз'ной кривой). Однако, когда уровень кальция в клетке достигает 0.2-0.3 мкМ, то вступает в силу отрицательная обратная связь, приводящая к замедлению выброса кальция (правая ветвь кривой). Из рис. 7,В очевидно, что при достижении уровня I мкМ свободного кальция ИТФ-индуцированный кальциевый выброс будет практически полностью заблокирован.

Можно предположить, что существование положительной обратной связи в процессе ИТФ-индуцированного выброса калыцгя при низком уровне кальция в цитоплазме клетки может служить объяснением полученной группой Meyer et al. высокой кооперативное™ в действии ИТФ (см. выше). В проверенных этой группой экспериментах никакие хелаторы кальция, кроме флуоресцентного индикатора фура-2, не были добавлены. Таким образом, концентрация свободного кальция не была жестко фиксирована и изменялась в процессе ИТФ-индуцированного выброса. Вполне возможно, что наблюдаемая этой группой кооперативность в действии ИТФ является отражением активирующего действия нарастащего уровня кальция в цитоплазме клетки на ИТФ-каналы. Конечно, полученные расхождения могут также отражать разницу между различными объектами исследования (мозжечком собаки и лейкемическими клетками крови крысы).

По биохимическим данным связывание ИТФ на рецепторе в мозжечке блокируется кальцием в микромолярном диапозоне [Woriey et ai., 19871, по видимому, благодаря ассоциированному с ИТФ-рецептором кальций-связывающему белку "калмедину" tDanoff et ai., 1988]. Возможно, что ингибирующее действие кальция на ИТФ-канал (правая ветвь кривой на рис. 7,В) опосредовано через изменение ИТФ-связывающих свойств рецептора по этому механизму. Активирующее действие кальция в субмикромолярном диапозоне (левая ветвь кривой 7,В) может быть опосредовано через другой кальций-связывающий белок или же вызвано непосредственным связыванием кальция с белком ИТФ-рецептора.

А

Контроль

О 01 МКМ Са2'

• о 5мм атф

о гм^МСа

ШШШ г

г

• I мкМ рианодин

ь

Ю й8 0.6

0.4

о.г

0.0

ЮОисох

¿3 7 6 5 4 3 р [СаЧ

Рис. 8 Второй тип кальциевых каналов в ЭР микросомах мозжечка. (А) После добавления 0.5 мМ АТФ и увеличения уровня свободного кальция с цитоплазматической (цис) стороны в БЛМ были активированы кальциевые каналы, отличающиеся от ИТФ-каналов. Добавление I мкМ рианодина 'привело к изменению проводимости и кинетики каналов (последняя пара записей ' тока). Стрелками с правой стороны показаны уровни тока для одного и двух открытых каналов (нулевой уровень показан короткой линией). (В) Зависимость вероятности открытого состояния каналов от концентрации кальция с цитоплазматической стороны. Вероятность открытого состояния каналов была нормирована на максимальную в эксперименте.

5. Кальций-активируемые кальциевые каналы (рианодиноЕые рецепторы) в ЭР мозжечка собаки: основные свойства. Как уже указывалось выше, добавление адениновых нуклеотидов не имело эффекта на ИТФ-активируемые каналы в отсутствие ИТФ. Однако в некоторых экспериментах после добавления адениновых нуклеотидов активировался другой тип каналов, отличный по своим проводящим свойствам и фармакологическим характеристикам от ИТФ-каналов (рис.8,А). Наблюдаемые каналы имели проводимость 50 пСм (имелись

также проводящие подсостояния). Эти каналы могли быть такке активированы добавкой 5 глМ кофеина и полностью блокировались 2 мкМ рутениевого красного. Такие фармакологические характеристики позволили предположить, что этот второй тип каналов соответствует рианодиновому рецептору в мозжечке, существование которого было показано нами И другими группами [Ellisraan et al., 1990] биохимически. В поддержу этой гипотезы на*а! был показан прямой зффект I мкМ рианодана на полученные каналы (рис. 8,А), Еыраненный в характерном изменении проводимости и кинетических характеристик канала. Поскольку проводимость каналов 50 пСм отличалась от проводимости каналов этого типа в скелетных и сердечных мышцах (120 пСм и 100 пСм соответственно), то, видаю, мы имеем дело с различны™ изоформами рианодинового рецептора.

Зависимость вероятности открытого состояния для каналов второго типа от концентрации цитоплазматического кальция (рис. 8,В) такке является колоколообразной, но максимальная активность поддерживается в диапозоне между I и 100 мкМ свободного кальция. Таким образом, в Физиологическом диапозоне концентраций кальция эти каналы являются кальций-активируемыми, а ингибирующее действие миллимолярного кальция вряд ли тлеет физиологический смысл. Хотя по биохимическим данным и по относительной частоте встречаемости в БЛМ экспериментах ИТФ-рецепторы превалируют над рианодиновыми в мозжечке, необходвл учет возможного функционального взаимодействия обоих путей выброса кальция, сосуществующих в одном типе клеток.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована методика формирования БЛМ и встраивания в нее различных типов ионных каналов,' что позволило стабилизировать мембрану и удлинить время регистрации активности каналов.

2. При слиянии везикул CP гладких мышц аорты собаки с БЛМ зарегистрирована активность калиевых каналов проводимостью 210 пСм при концентрации калия 400 мМ. При добавлении 5 мМ бария происходит потенциалзависимый блок канала и появляется проводящее подсостояние канала с проводимостью 60% от основного

состояния.

3. При использовании микросомальной фракции, изолированной из мозжечка собаки, удалось зарегистрировать и охарактеризовать ИТФ-активируемые кальциевые каналы. Полученные каналы имели 4 кратных проводящих подсостояния с проводимостями 20, 40, 60 и 80 пСм, что согласуется с тетрамерной структурой белкового комплекса ИТФ-рецептора.

4. По зависимости вероятности открытого состояния канала от концентрации ИТФ был сделан вывод, что для открывания кальциевого канала достаточно связывания одной молекулы ИТФ (отсутствует кооперативность в действии ИТФ). Полумаксимальная вероятность открывания канала наблюдалась при концентрации ИТФ 0.2 мкМ.

5. Была продемонстрирована аллостеричеекая активация ИТФ-чувствительных каналов адениновыми нуклеотидами (АМФ, АТФ, негидролизуемым АТФ аналогом АМФ-ФЦФ). Полумаксимальный эффект достигался при кйнцентрации АТФ или АМФ-^ЗЩФ близкой к 20 мкМ, АМФ - к 0.4 мМ.

6. Был показан колоколоооразный характер зависимости вероятности открытого состояния ИТФ-чувствительного канала от цитоплазматической концентрации кальция в физиологическом диапозоне. Вероятность открытйго состояния каналов была максимальной при концентрации свободного кальция 0.2 мкМ и быстро спадала по обе стороны от максимума. Полученный результат говорит о существовании положительной и отрицательной обратных связей в процессе ИТФ-индуцированного выброса кальция на уровне регуляции воротного механизма канала.

7. Было показано сосуществование ИТФ-каналов и кальций-активируемых кальциевых каналов (рианодиноЕых рецепторов) в микросомальной фракции, изолированной из мозжечка собаки. Проводимость кальций-актиЕируемых кальциевых каналов в ЭР мозжечка оказалась равной 50 пСм. Показано модифицирующее действие мкМ концентрации рианодина на эти каналы и изучена зависимость активности каналов от цитоплазматической концентрации кальция, существенно отличающаяся от аналогичной зависимости для ИТФ-каналов.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. И.Безпрозванный, Ю.Курышев, А.Наумов Калиевые каналы в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. В тезисах симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах", г. Пущино, 1989

2. И.Безпрозванный Ионные каналы в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. В тезисах 10 конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных веществ", г1. Рига, 1989, trf. /"

3 I- Bezprozvanny, D. Benevolensky, A. Naumov Potassium channels in aortic microsomes: conductance, selectivity, barium-induced blockage and subconductance states. Biochimica et Biophysica Acta, 1991, vol. 1004, pp 75-80.

4. I. Bezprozvanny, J. Watras, and B. Ehrlich Calcium-dependence of inositol 1, 4, 5-trisphosphate-gated calcium channels from endoplasmic reticulum of cerebellum is bell-shaped. The Biological Bulletin, 1990, v. 179, p. 228. Abstracts of the General Scientific Meetings of the Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusets, USA in August 20-22, 1990

5. J. Watras, I. Bezprozvanny, B. Ehrlich Inositol 1,4, S-triphosphate-gated channels in cerebellum: presence of multiple conductance states. The Journal of Neuroscience, 1991, vol. 11, pp 3239-3245.

6. I. Bezprozvanny, B. Ehrlich, F. Mkparu, J. Watras. Coexistance of Inositol 1,4,5-trisphosphate-gated and calcium-gated channels in cerebellum: differences in calcium sensitivity. Biophysical Journal, 1991, v. 59, p. 199a. In abstracts of the 35th annual Biophysical Society Meeting, San Francisco, California, USA in February 24-28, 1991.

7. I. Bezprozvanny, J. Watras, B. Ehrlich. Bell-shaped calcium response curves of InsC 1, 4,53P3- and calciifln-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum. Nature, • 1991, vol. 351, pp 751-754.