Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связь полиморфных аллелей, определенных методами полимеразной цепной реакции и рестрикции ДНК, с атерогенными показателями липидного обмена и риском развития атеросклероза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Связь полиморфных аллелей, определенных методами полимеразной цепной реакции и рестрикции ДНК, с атерогенными показателями липидного обмена и риском развития атеросклероза"

.-1-0 ? > <с. • I -

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

На правах рукописи

Берлова Анжела Леонидовна

УДК 577.21: С 616.13-004. 6 + 616-008. 939.153 -055. 5/. 7

СВЯЗЬ ПОЛИМОРФНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ МЕТОДАМИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И РЕСТРИКЦИИ ДНК, С АТЕРОГЕННШИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ДИОДНОГО ОБМЕНА И РИСКОМ РАЗВИТИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА.

03.00.04 "Биохимия"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в лаборатории генетики ВНЦ-молекулярной диагностики и лечения, Москва.

Научные руководители: доктор биологических наук В. И. Киселев,

кандидат биологических наук В. В. Сафронов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А. В. Караулов, кандидат химических наук & В. Нэсиков

Ведущая организация: "Институт обШей генетики РАЯ, Москва"

Задата':диссертадии состоится" " 1993 г.

в часов на заседании Специализированного совета Д 074.61.01 по адресуй 113149 Москва,. Симферопольский б-р, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ молекулярной диагностики и лечения, Москва.

Автореферат разослан 1992 г.

17 '

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук Фу О ЕВ.Ограднова

Актуальность тема Заболевания, в основе которых лежит атеросклероз, являются наиболее частыми причинам,, инвалидности и смертности во многих странах мира. Выяснение причин атеросклероза представляется одним из основных вопросов медицины и позволит избежать существенных экономических и социальных потерь.

Изучение организации генов аполипопротеидов, где локализована значительная часть атерогенных мутаций, предртавляется. актуальным как с точки зрения нахождения генетических маркеров атеросклероза, так и для. расшифровки генных механизмов развития атеросклеротических поражений коронарных артерий. В настоящее время одним из подходов к решению этой научной проблемы представляется путь анализа рестрикционного полиморфизма ДНК с целью поиска связи полиморфных аллелей с важными показателями липидно-го обмена, например, такими как обший холестерин, триглицериды, липопротеидн различной плотности и некоторые аполипопротеиды, и т. д., с гиперлипопротеинемиями, а также с атеросклерозом, и его клиническими проявлениями в виде ИБС и инфаркта миокарда. При этом полиморфные аллели выступают в качестве генетических маркеров атеросклероза. С помощью генетических маркеров можно осуществлять оценку повышения риска заболевания для конкретного индви-диуума на очень ранних вплоть до пренатальной, стадиях развития. Такое заболевание, как атеросклероз, может быть гетерогенным с равными полигенными детерминантами, оказывающими действие в разных географических местностях. Поэтому, необходимы широкие исследования в разных мировых популяциях по выявлению полиморфных маркеров атеросклероза, которые могут быть специфичными для каждой конкретной популяции.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выявление в популяции Москвы полиморфных по рестриктазам ЗаЫ, РвМ, РуиП и Шр1 аллелей генного кластера А1-СШ-А1У и поиск их возможной связи с рядоы важных показателей липидного обмена, с гиперлипопротеинемиями и, таким образом, с риском развития атеросклероза. При этом'ставились следующие основные задачи:

- разработать простой метод регистрации полиморфизмов на генном кластере А1-СШ-А1У путем амплификации методом ПНР с последующей рестрикцией;

- провести анализ популяционных частот аллелей изучаемых полиморфных локусов генного кластера А1-СШ-А1У; , .

- исследовать возможную связь рассматриваемых полиморфных аллелей с такими показателями липидного обмена как общий колес-

- г -

терин, триглицериды, ХС ЛПВП, аполипопротеиды AI и В, величина отношения B/AI;

- исследовать, имеется ли корреляция между наличием изучаемых редких полиморфных аллелей и типами гиперлипопротеинемии, при которых наиболее велика вероятность развития атеросклероза;

- провести сравнение частот редких полиморфных аллелей в группе больных атеросклерозом коронарных артерий и контрольной группе.

Научная новизна работы. В ходе данной работы исследована связь полиморфных по рестриктаэам MspI, SacI, Pstl, PvuII аллелей генного кластера AI-CIII-AIV о широким набором липидных показателей в популяции Москвы. Кроме того, произведена оценка корреляции между присутствием редких полиморфных аллелей и наличием гиперлипопротеинемии IIa, 116, IV типов и атеросклероза коронарных ' артерий. ' Разработан ' простой и довольно быстрый метод регистрации полиморфизмов на генном кластере AI-CIII-AIV с использованием полимераэной цепной реакции с последующей рестрикцией. Тем самым, разработан новый способ маркирования 11-той хромосомы по четырем локусам, который может быть использован в разнообразных генетических исследованиях, связанных с изучением сцепления при генетиеском картировании. Предложенный подход иск-' лючает трудоемкие процедуры блот-гибридиэации и изотопного мече-ния, используемые в традиционном подходе, основанном на ЦДРФ.

Практическая ценность работы. Данные, полученные в ходе работы, позволяют оценить вклад определенных аллелей в повышение риска развития атеросклероза. Исследования в этом направлении и обобщение полученных'результатов в перспективе могут привести к нахождению генетических маркеров атеросклероза и обнаружению основных этиологических локусов заболевания. Кроме того, разработанный метод выявления полиморфизмов на генном кластере AI-CIII-AIV с помощью ПЦР, являющийся новым способом маркирования 11-той хромосомы, может быть использован в различных генетических исследованиях. •

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" ( Самарканд, 1991); на межлабораторном семинаре в БНЦ молекулярной диагностики и лечения (Москва, 1992).

. ______________________- 3 - .... ______ -- - - - --------

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для получения ДНК использовали образцы крови людей, предоставленные лабораторией аполипопротеинов (зав.лаб. д. м. н. 11 В. Перова) Института , профилактики неинфекционных эаболевании ВШЦ профилактической медицины МЗ России. ДНК из крови выделяли методом, предложенным 3. бизЬаГэоп и др. Выход ДНК составлял 20-50 мкг на 1 мл крови. . •

Полимеразнуй цепную реакцию проводили при помощи программируемого термоциклера фирмы СеЬиБ с использованием термофильной ДНК-полимеразы Тегтиб ЬегторЬИиБ или термофильной ДНК-полимера-зы Тегтиэ адиаисиэ. ЩР проводили по следующей схеме: 0.5-1.5 мкг геномной ДНК, 0.025 мкг каэдого праймера, 0. 2 мМ каждого де-зоксинуклеозидтрифосфата в 50 мкл однократного буфера для ПЦР прогревали в течении 7-10 минут при 95"С, добавляли 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 30 мкл вазелинового масла и прово-■ дили 18 циклов в подобранных для данной пары праймеров условиях. Затем под в'азелиновое масло добавляли 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы и праймеры до концентрации 0.25 мкг каждого и проводили еще 14 циклов с теми же параметрами и финальную инкубацию при 68* С в течении 8 минут.

Продукты амплификации обрабатывали требуемой рестриктазой и анализировали в агарозном геле.

Статистическая обработка результатов эксперимента проводилась с использованием статистического пакета ЗТАТбРАР и включала в себя такие тесты, как:

- проверка гипотезы о соответствии выборки из генеральной совокупности нормальному закону распределения ( критерий согласия Колмогорова-Смирнова) ;

определение доверительных интервалов с помощью распределения Стьюдента;

- сравнение средних значений показателей липопротеидного

обмена (проверка гипотезы о равенстве двух средних из нормально распределенных генеральных совокупностей);

. . - проверка достоверности различий частот аллелей, генотипов, гаплотипов между группами индивидуумов, имеющих измененные уровни липидных показателей и нормой ( проверка гипотез о вероятное ■ тях из альтернативных генеральных совокупностей ).

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ САЙТОВ, РАСПОЛОЖЕННЫХ НА ГЕННОМ КЛАСТЕРЕ AI-CIII-AIV ПУТЕМ АМПЛИФИКАЦИИ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕСТРИКЦИЕЙ.

В большинстве случаев атеросклеротические сосудистые поражения возникают в результате совместного действия комплекса нас' ледственных факторов и факторов внешней среды. К патологическим процессам наследственной природы относятся в частности, наследственные. нарушения липидного обмена. В связи с этим изучение организации генов, контролирующих липидный обмен, представляется актуальным как с точки зрения нахождения генетических маркеров атеросклероза, так и для расшифровки генных механизмов развития атеросклеротических поражений коронарных артерий.

Большинство, атерогенных мутаций и дефектов локализовано в генах аполипопротеидов, обеспечивающих направленный транспорт холестерина в крови. С этой точки зрения большой интерес представляет комплекс генов, ответственных за синтез апопротеинов AI, CIII и AIV, которые занимают ведущее место в липидном метаболизме. Доведенное нами исследование связано с выявлением полиморфных аллелей генного кластера AI-CIII-A1V с целью поиска их возможной связи с рядом важных показателей липидного обмена и риском атеросклероза. Для поиска возможных генетических маркеров риска атеросклероза в генном кластере AI-CI11-AIV в качестве полиморфных сайтов были выбраны сайты ДНК, узнаваемые рестриктаза-ми Pstl, Sacl, PvuII и Mspl. На рис.1 представлена схема генного . кластера с расположением изучаемых полиморфных сайтов.

Аро AI Аро CHI

— I 1 ■ М-Vv--1 I 11 I-

Mspl PatI Sacl FvuII

__4_*__4_■_•_4.

j——, p |-_j [_, «J

Риси. Полиморфные сайты для Mspl, Pstl, Sacl, И PvuII, исследуемые в нашей работе. "U «-"• - расположение праЯмеров. Черным цветом показаны экзоны, белым - интроны.

Метод выявления полиморфных аллелей в нашей работе основан на амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт, с последующей рестрикцией продукта амплификации. На основании опубликованной нуклеотидной последовательности геномной ДНК, содержащей изучаемый кластер (SenBank HUMAPO All), была проделана

работа- по подбору примерных последовательностей для амплификации районов, несущих указанные выше полиморфные сайты. Результаты исследования по подбору праймеров суммированы в таблице 1, где приведены характеристики праймерных -последовательностей и продуктов амплификации и рестрикции.

Таблица 1. Характеристики праймерных последовательностей и продуктов амплификации и рестрикции.

Сайт рестрикция Нуклеотидная последовательность ОТ 5* К 3' ' концу Длина амплифицированного района и Фрагментов рестрикции (в нуклеотидах)

PatI ctaagaagctcaaoacccagtg caaactccaagcgcttcaottg 569 (372+197)

Pvull gactgatctccgtccagtccag agaggcagctgctccaggtaatg 395 (257+138)

sacl agaaactgaggcccagagactag tgaaagactactggagcaccg 440 (304+136)

Mspl . . agtgaaggacctggccactgtg AGCAGAGGAGGTGGTOAAGAAG 370 (231+139)

После работы по выбору праймерных последовательностей были проведены исследования по подбору условий амплификации. Результаты исследований по оптимизации условий ПЦР для каждой из четырех пар праймеров представлены в таблице 2.

Таблица 2. Оптимальные условия проведения реакции амплификации для пар праймеров, ограничивающих четыре полиморфных сайта для Petl, Sacl, Pvull и,Mspl рестриктаз.

ПраЯ-меры ДЛЯ сайта Температура и время денатурации Температура и время * отжига Температура и время полимеризаций Концентрация MgC] i в реакционном буфере Кол-во циклов реакции

PatI* 94°, 50 с 94°, 50 о 56°,1 мин 65°,1 мин 72°,2 МИН 72°,2.5-МИН 1.5 мМ 2.5 мМ 37 32

Sad 94°. 50 с 65°, 1 мин 72°,2 МИН 1.5 мМ 32

Pvull 94°, 50 с 66°, 1МИН 72°,2 МИН 1.5-2.5 ММ 32 32 ........

Mspl 94°, 50 с 65°, 1 мин 72°,2 МИН 1.5-2.5 мМ

*B зависимости of партии далимеразы и праймеров Онло подобрано два режима проведения реакции.

Стадию элонгации последнего цикла проводили в течение 8 минут, а денатурации первого цикла - 7-10 минут.

Разработанный нами метод выявления полиморфизмов на кластере AI-CIII-A1V 11-той хромосомы методом ПЦР применялся в нашем исследовании для поиска ДЖ-маркеров атеросклероза. Следует, однако, подчеркнуть, что предложенный подход является по существу новым способом маркирования 11-той хромосомы по четырем локусам, который может быть с успехом использован в разнообразных генетических исследованиях, связанных с изучением сцепления при генетическом картировании. Способ исключает трудоемкие процедуры блот-гибридизации и изотопного мечения, используемые в традиционном подходе, основанном на ЦДРФ.

Используя разработанные нами праймеры и результаты работы по оптимизации условий амплификации проводили анализ генотипов конкретных индивидуумов.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОЙ СВЯЗИ ИЗУЧАЕМЫХ РЕДКИХ ПОЛИМОРФНЫХ АЛЛЕЛЕЙ С НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА И ПОИСК ВОЗМОЖНЫХ ДИК-МАРКЕРОВ АТЕРОСКЛЕРОЗА

3.1. Анализ популяционных частот аллелей изучаем« полиморфных доку сов.

Частоты полиморфных аллелей одного и того же маркера могут варьировать в разных популяциях. Необходимы широкие исследования в различных мировых популяциях по выявлению полиморфных маркеров атеросклероза, которые могут Сыть специфичными для каждой конкретной популяции. Такое заболевание, как преждевременный атеросклероз, может быть, в частности, гетерогенным с разными полигенными детерминантами, оказывающими действие в разных географических местностях. С учетом этого наш был проведен анализ распределения полиморфных по рестриктазам Mspl, Pstl, PvuII и SacI аллелей в московской популяции.

Буквой М мы- обозначили полиморфные по рестриктазе Mspl аллели, буквой Т - аллели, полиморфные по рестриктазе F^stl, полиморфные по рестриктазам SacI и PvuII аллели обозначены буквами S и Р. соответственно. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что более 801 хромосом в популяции Москвы содержат сайт для рес-триктаз MspI и Pstl. Частые аллели были обозначены символом 1,

- 7 - - ...... --• - - ----

М1 - для МзрЬполиморфизма и Т1 - для РэН-полиморфизма, а редкие по этим рестриктазам аллели (отсутствие сайта рестрикции) -М2 и Т2. Также более 80% хромосом в указанной популяции не имеют сайта для рестриктаз Зас1 и РуиП. Частые аллели аналогично были обозначены символом 1, - для БаЫ полиморфизма, и Р1 - Рун11 полиморфизм.Редкими являются Б2 и Р2 аллели (наличие сайта рестрикции) .

На рис. 2 приведен типичный результат амплификации и рестрикции Мэр! ДНК 'трех индивидуумов, имевших генотипы МШ (гомозиготы по наличию сайта рестрикции), М2М2 (^омозиготы по отсутствию сайта рестрикции) и М1М2 (гетерозиготы).

М1М1 М2М2 М1М2 . старт ...........................

Рис. 2. Анализ Mepl-полиморфизма путем амплификации с последующей рестрикцией.

Картины рестрикции остальными ферментами (SacI, Pstl, PvuII) аналогичны приведенным.

Исследовав Msp- и Pstl- полиморфизмы и SacI- и Pvuli полиморфизмы и выполнив соответствующую статистическую обработку полученных данных, мы провели анализ, направленный на выявление возможных связей тех или иных аллелей с рядом существенных показателей липидного статуса, таких как общий холестери-i, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды", аполиполроте-ин AI, аполипопротеин В, отношение B/AI и с типами гиперлипопро-теинемии в московской популяции.

3.2. Анализ связи частот встречаемости исследуемых полиморфных аллелей с уровнями общего холестерина.

Показано, что концентрация ХС в плазме крови коррелирует с ИБС и атеросклерозом. В норме уровень общего ХС плазмы варьирует от 4 до 6,5 ммоль/л. Риск ИБС (и атеросклероза, соответственно) ощутимо возрастает, если ХС сыворотки превышает 6,5 ммоль /л

(250 мг/дл) и резко увеличивается при значениях выше 7,8 ммоль/л (300 мг/дл).

В своей работе мы рассмотрели возможную связь редких полиморфных аллелей с повышением уровня общего холестерина. В соответствии с литературными данными исследуемая популяция была разделена нами на 2 группы, характеризуемые уровнем ХС больше 250 мг/дл и меньше 250 мг/дл и дополнительно выделена группа с уровнем общего ХС больше 300 мг/дл. Для каждой группы определяли частоты редких аллелей и генотипов с редкими аллелями. Данные о частотах редких аллелей в группах, различающихся по уровням ХС преставлекй в таблице 3. '

Таблица 3. Частоты редких аллелей в норме и в группах с повышенным уровнем ХС.

"'Х0-,-'" мг/дл Частота М2 аллеля частота S2 аллеля частота Р2 аллеля Частота Т2 аллеля

К п . % N п % N п % N п %

«250 141 17 12 142 6 4.2 137 20 14.6 140 7 5

>250 63 12 19 63 а 12.7 69 19 27.5 64 4 6.3

>300 20 6 30 20 6 30.0 20 7 35. 20 1 5

N - общее число аллелей в груше с рассматриваемым уровнем ХС, п - число редких аллелей.

В 'отношении SacI- и PvuII-полиморфизмов обнаружили, что S2 аллель встречается в 3 раза чаще в группе с Х0250 мг/дл и в 7 раз чаще в группе с Ж>300 мг/дл по сравнению с нормальной по содержанию холестерина группой (Р<0.05); Р2 аллель - в 1.9 р^за (ХС>250 мг/дл) и в 2.4 раза (ХС>300 мг/дл) чаще по сравнению с группой с содержанием' ХС^250 мг/дл (Р<0.05), что указывает на связь этих аллелей с повышением уровня общего холестерина плазмы. Кроме того, на основе имеющихся данных, касающихся ШрЬпо-• лиморфных аллелей, можно сформулировать следующее правило: если уровень холестерина меньше 318 мг/дл, то.это в основном гомозиготы М1М1 (78 из 97 или 80%) по частому алледю (Р<0.05), и, если холестерин больше 318 мг/дл, то это, преимущественно (5 из 7 или 71?) гетерозиготы М1М2 или гомозиготы по наличию редкого аллеля М2М?. Эти данные указывают на то, что наличие аллеля VZ является фактором, ассоциированным с тенденцией к повышению общего холестерина. При анализе Pstl полиморфизма не выявлено различий в

частотах редкого Т2 аллеля в рассматриваемых группах. •

Затем для четырех изучаемых полиморфизмов исследовали возможность повышения частоты редких ' аллелей пропорционально увеличению уровня холестерина. С этой целью для каждого аллеля были специальным образом подобраны группы индивидуумов с сильно повышенными уровнями ХС. Например, для М2 аллеля это была группа с ХС>334. 3 мг/дл, для Б2 аллеля - с ХС>333 мг/дл, для Р2 аллеля - группа с Ж> 342.7 мг/дл и -для Т2 аллеля - группа с Ж>342.5 мг/дл. Установили, что, чем выше уровень Ж, характеризующий рассматриваемую группу, индивидуумов, тем выше частота встречаемости редких М2, 52 и Р2 аллелей. Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод об имеющейся связи между наличием редких 22, Р2, или М2 аллелей с повышением уровня общего холестерина. . '

В соответствии с полученными результатами о связи редких аллелей с повышенным уровнем холестерина, мы предположили наибольшее неблагоЬриятствовакие наличия у индивидуумов двух редких аллелей одновременно. Учитывая литературные данные, мы проанализировали частоту встречаемости шеста возможных редких гаплотипов (сочетаний редких аллелей ) в группах с нормальным и повышенным уровнями -ХС. Результаты анализа свидетельствуют о том, что гап-' лотипы Р252 и Э2Т2 полностью сосредоточены в группах с повышенным уровнем ХС, причем при увеличении уровня холестерина, частота этих гаплотипов статистически достоверно возрастает. Гаплотип Р2МЗ в 8. 4 раза чаще встречается в группе индивидуумов с ХС>250 мг/дл и в 13 раз чаще в группе - с ХОЗОО мг/дл, по сравнению с нормой. Частота индивидуумов с гаплотипом Ш52 достоверно увеличивается в группе с ХС>300 мг/дл по сравнению с норм- й. Полученные результаты позволяют говорить о корреляции между наличием у 'индивидуумов гаплотипов Р232, Б2Тг, Р2М2, или М252 и повышенным уровнем общего хрлестерина.

3.3 Анализ связи частот встречаемости исследуемых полиморфных аллелей с уровнями триглицеридов.

Уровень триглицеридов рассматривается как независимый фактор - риска атеросклероза. Нормальное содержание триглицеридов у взрослых мужчин составляет 0,5-2 ммоль/л, у женщин наибольшее знаг чение равно 1,5 ммоль/л.

В своей работе мы исследовали возможную связь редких полиморфных аллелей с гипертриглицеридемией. Нами рассматривались частоты указанных редких аллелей в группах, характеризующихся уровнем ТГ больше и меньше 200 мг/дл (2.3 ммоль/д). В каждой группе определяли частоты редких аллелей и генотипов с редкими аллелями, а затем проводили сравнение их встречаемости в группах с нормальным и повышенным уровнем ТГ. В таблице 4 показаны частоты редких М2, 32, Р2 и Т2 аллелей в группах, различающихся по уровню ТГ.

Таблица 4. Частоты редких аллелей в норме и в группе с

повышенным уровнем ТГ.

хс, мг/дл Частота мг аллеля Частота 82 аллеля частоте Р2 аллеля частота 12 аллеля

и п % n п % N п % n п %

<200 159 15 9.6 160 8 5.0 150 25 16.7 160 8 5.0

>200 41 15 36.6 37 6 16.2 52 14 26.9 3 8.3

N - общее число аллелей в груше с рассматриваемым уровнем ТГ, п - число редких аллелей.

Обнаружили, что М2 аллель встречается 3.6 раза и Б2 аллель -в 3,2 раза чаще в группе с повышенным уровнем ТГ по сравнении с нормой. Выявленные при анализе РзЬ1~ и Руи II-полиморфизмов различия в частоте Т2 и Р2 аллелей не являются статистически достоверными. Таким образом, с повышенным уровнем триглицеридов ассоциировании М2 и Б2 аллели. С целью дополнительного изучения связи присутствия редкого аллеля и уровня ТГ для четырех изучаемых полиморфизмов исследовали, повышается ли частота редких аллелей вместе с увеличением уровня ТГ. С этой целью для каждого аллеля Сули специальным образом подобраны группы индивидуумов с сильно повышенными уровнями ТГ. Например, для М2 аллеля это была группа с ТГ>282.9 мг/дл, для Б2 аллеля - с ТГ>289.7 мг/дл, для Р2 аллеля - группа с ТГ>321.8 мг/дл. и для Т2 аллеля - группа с ТГ> 292.7 мг/дл. Установили что, чем выше уровень ТГ, характеризующий рассматриваемую группу индивидуумов, тем выше частота встречаемости редких М2 и Б2 аллелей. На основании полученных результатов можно сделать вывод об имеющейся связи' между наличием редких М2 и Б2 аллелей с повышенным уровнем триглицеридов.

На основе имеющиеся данных можно сформулировать правило: если уровень триглицеридов меньше 287 мг/дл, то это в основном го-

. ______ ._____ - 11 - .._________ _______ ________ -

мозиготы ши (79 из 97) ло частому аллелю. Если триглицеридн больше 287 мг/дл, то это преимущественно гетерозиготы М1М2 или гомозиготы по редкому М2 аллелю (5 из 7).

Исходя из связи редких аллелей с повышением уровня триглице-ридов, вероятно предположение об отрицательном эффекте одновременного присутствия у индивидуума двух редких аллелей. На основании этого мы проанализировали частоту встречаемости шести воа -можных редких гаплотилов (возможных парных сочетаний редких аллелей) в группах с нормальным и повышенным уровнями ТГ. Статистически достоверные различия выявлены только в частоте гаплотш/з Р2М2, который в группе индивидуумов, имеющих повышенный уровень триглицеридов, встречается в 5.9 раз чаще, чем в норме.

3.4. Анализ связи частот встречаемости исследуемых полиморфных аллелей с различил« типами гиперлишпротеинемий.

Но классификации Зредриксона с соавторами выделяют пять типов гипердшгопротеинемий. Вероятность развития атеросклероза велика при гиперлипопротеинемиях типа II, III и IV. Однако, III тип гиперлипопротеинемии встречается редко и преимущественно у взрослых. Поэтому, нами была рассмотрена возможная связь редких 52, М2, Р2 и Т2 аллелей с соотношениями ХС и ТГ, характерными для Па, 1Гб и IV типов гиперлипопротеинемии. Данные анализа представлены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнение'частот изучаемых редких аллелей в нормальной и гилерлигшдешчных грушах.

тип гиперлипопротеинемии, мг/дл Частоты М2 аллеля Частоты Б2 аллеля частоты г2 аллеля частоты Т2 аллеля

N п % N п % N п % и п %

1Т хс>250 36 5 13.9 36 5 13.9 36 10 27.8 36 3 8.3

ттй хс>250 ТГ>200 34 9 26.5 34 5 14.7 34 9 26.5 34 3 а.а

т„ хс<250 ТГ>200 18 4 22.2 18 0 0.0 18 2 11 И 18 1 5.6 3.3

нор- ХС<250 ма ТГ<200 120 12 10.0 120 4 з.э 120 18 15.0 120 4

N - общее число аллелей в рассматриваемой груше, п - число

редких аллелей.

Обнаружили, что редкий М2 аллель встречается в группах

■ - 12 -

лиц с типом 116 гиперлипопротеинемии в 2,7 раза чаще, чем в норме, аллель 52 имеет более высокую частоту в группах индивидуумов с типами Па и Пб, в 4,2 раза и .в 4,5. раза, соответственно, . превышающую частоту этого аллеля в нормальной группе. Приведенные здесь различия в частотах встречаемости М2 и Б2 аллелей между группами больны* с указанными типами гиперлипопротеииемий и нормой статистически достоверны (Р<0,05). Исходя из этого можно заключить, что с типом Па гиперлипопротеинемии связан Б2 аллель, с типом Пб гиперлипопротеинемии связаны и Б2 аллели.

Затем было проведено сравнение частот встречаемости возможных гаплотипов, состоящихвиэ изучаемых редких аллелей, между нормальной группой и группами с гиперлипопротеинемией. Обнаружили, что для гиперлипопротеинемии 11а типа характерно статистически достоверное увеличение частот Р232, Р2Т2 и Э2Т2 гаплотипов, а для Пб типа гиперлипопротеинемии - гаплотипов Р2Н2 и Р2Й2 (Р<0,05), что позволяет говорить о связи наличия этих гаплотипов с указанными типами гиперлипопротеинемии.

Статистически значимых различий в' частотах встречаемости рассматриваемых аллелей и гаплотипов между группой лиц с IV типом гиперлипопротеинемии и нормальной группой не установлено.

3. а Анализ связи частот встречаемости исследуешх полиморфных

аллелей с уровнями холестерина ЯШИ

В различных исследованиях показано наличие четкой обратной корреляции меаду холестерином ЛПВП и такими заболеваниями, как атеросклероз и ИБС. Низкие значения ЛПВП были связаны с повышенным риском атеросклероза. По имеющимся литературным данным неко-. торые полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов внутри' генно- ' го кластера А1-СШ-А1У ассоциированы с уменьшением ЛПВП и преждевременным коронарным атеросклерозом. В нашей работе мы изучали возможную связь между наличием какого-либо редкого полиморфного аллеля и понижением уровня ХС ЛПВП. Ш исходили из того, что . концентрация холестерина ЛПВП меньше 35 мг/дл считается фактором риска для развития атеросклерета и ИБС. Изучали частоты редких М2. 52, Р2 и Т2 ьллелей в группах индивидуумов, имеющих холестерин ЛПВП меньше 35 мг/дл и больше 35 мг/дл. Данные о частотах редких аллелей в группах, различающихся по уровням ХС ЛПВП представлены в таблице 6.

Таблица 6. Частоты редких аллелей в норме и в группе с

пониженным уровнем ХС ЛПВП.

ХС ЛПВП мг/дл Частота М2 аллеля частота вг аллеля Частота Р2 аллеля Частота Т2 аллеля

N п % N п % N п * N п %

>35 159 25 15.7 160 10 6.0 156 26 16.7 159 8 в.О

<35 49 5 10.2 50 4 8.0 50 12 24.0 49 3 6.1

■ N - общее число аллелей в группа с рассматриваемым уровнем . ХС ЛПВП, п - число редких аллелей.

Не обнаружили статистически достоверных различий в частотах рассматриваемых редких аллелей между группой гипоальфных индивидуумов (ХС ЛПВЩ35 мг/дл) и нормой. Полученные данные говорят об отсутствии связи рассмотренных полиморфизмов с мутациями,'приводящими к гипоальфалипопротеинемии. '

Была проанализирована связь между одновременным присутствием у отдельных индивидуумов двух редких аллелей и понижением уровня ХС ЛПВП. Установили,- что гаплотип Р252 в 4 раза чаще, гаплотип Р2Т2 в 7 раз чаще встречаются в группе с ХС ЛПВП?35 мг/дл по сравнению с нормальной группой. Гаплотип 52Т2 в нормальной группе не обнаружен. Различия в частоте этих гаплотипов между грул ■ пами с нормальным и пониженным уровнями ХС ЛПВП - статистически достоверны. Таким образом, наличие у пациентов гаплотипов Р2^2, Р2Т2 и 52Т2 связано с гипоальфалипопротеинемией.

3.6. Анализ связи исследуемых полиморфных аллелей с уровнями алоА1.

• Аполипопротеины семейства • А-апоА1 и апоАП - это основнн« белковые компоненты ЛПВП, свыше 90% белка ЛПВП представлены белком А. Уровень ЛПВП отражает не только концентрация ХС ЛПВП, но и концентрация апоА1, понижение которой обусловливает уменьшение содержания ЛПВП, что может привести к развитию преждевременного атеросклероза. С целью установления корреляции мезду по нижением уровня апоА1 и наличием редких полиморфных аллелей в нашей работе сравнивались частоты редких аллелей в- группах,.характеризующихся различным содержанием апоА1. При этом лицз, имеющие уровень апоА1 выше 132 мг/дл и ниже 170 мг/дл с-италиеь нормальными по- апоАК Исследовали также группу с уровнем апоА1

меньшим 116 мг/дл, свойственным больным ИБС и группу с уровнем шюА1, меньшим 106 мг/дл, характерным для гипоалъфных больных* Данные о частотах редких аллелей в группах, различающихся по уровням апоА! представлены в таблице 7.

Таблица 7. Частоты редких аллелей в группах с нормальным и пони-

женным уровнями anoAi.

anöÄT7~ мг/дл Частота U2 аллеля Частота S2 аллеля частота Р2 аллеля Частота Т2 аллеля

N п % N п % N п % N п Ж

>132 <170 100 14 14.0 100 8 8 100 20 20.0 100 7 ' 7.0

<116 ?8 3 10.7 28 2 7.1 28 8 28.6 28 1 3.6

¿106 13 2 15-4 12 0 0.0 11 2 18.2 12 0 0.0

N - общее число аллелей в группе с рассматриваемым уровнем

anoАх, п - число редких аллелей.

Результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации между наличием редких М2, S2, Р2 и Т2 аллелей и пониженным уровнем ano AI, и, соответственно, ЛПВП в сыворотке. Данные об отсутствии связи №2, S2, Р2 и Т2 аллелей с пониженной концентрацией ЛПВП, полученные при изучении ассоциации этих аллелей с пониженным уровнем ХС ЛПВП согласуются с результатами, полученными при анализе корреляции рассмотренных аллелей с уровнем anoAI.

Сайт МзрЬреетриктазы находится в районе anoAI гена, а сайты Sao! и PvuII рестриктаз расположены в области С111 гена. Известно, что большая часть белковой компоненты ЛПВП представлена белком AI, и бело'к С III также входит в его состав. Расположенные в области AI-CI11 генов полиморфизмы, не связаны с понижением уровня ХС ЛПВП и уровня anoAI и, соответственно, уменьшением концентрации ЛПВП, но связаны с другими показателями липидного обмена Поэтому можно говорить только о косвенной связи данных полиморфизмов с атерогенными мутациями в других, например, соседних областях, когда рассматриваемые полиморфизмы являются сцепленными маркерами соседних атерогенных мутаций, но не приводят к образованию мутантных белков.

Исследовали, связано ли присутствие у индивидуумов двух редких аллелей одновременно с пониженным уровнем апоМ. Не обна-

. - _____ - ------■■ --16 - -

ружили статистически значимых различий в частотах гаплл ип< (сочетаний редких аллелей) в группах индивидуумов с нормальным и пониженным уровнями апоА1. Следует отметить, что всех 1:111.4.-типов только для Р2Бг и 32Т2 характерно увеличение частоты н группах лиц с пониженным уровнем апоЛ1 ( 11 в мг'дл1, час-,. , , именно этих гаплотипов повышалась и в группах индивидуум'-в о пи ниженным ХС ЛЮТ. Однако, распределение этих гаплотипов но группам с повышенным и нормальным уро.шями апоА1 в данном случае п.-позволило получить статистически достоверных различий н их чистоте между рассматриваемыми группами. Таким образом, связь рассмотренных гаплотипов с пониженным уровнем апоА1 не установлена.

3.7. Анализ связи частот встречаемости исследуемых полиморфных аллелей с уровнями алоВ.

АпоВ является необходимым белковым компонентом трех классов ' липопротеинов: хиломикронов, ЛПОНП и ЛПШ1 Уровень апоВ соответствует числу частиц Л1ШП в плазме, и повышение уровня гщпП.«?. плазме является фактором риска для атеросклероза и ИЬП. На оен«, ве этих данных представляло интерес изучение встречаемости редких полиморфных аллелей (М2, 32, Р? и Т2) в группе с нормнльнмм и повышенным, уровнями апоВ. Исследуемая популяции были рамделещ на следующие группы: группа с уровнем апоНЛ20 м1'/дл, характер ным для гипоальфных больных; группа с агюВ>129 мг/дл, еоответст вующим уровню апоВ больных ИГ.0; группа с нормальном уровнем апоВ?.И7 мг/дл. Данные о частотах редких аллелей в группах, раз лнчающихся по уровням апоВ представлены в таблице 8.

Таблица 8. Частота редких аллелей в н^рме и в группах с повышен

ним уровнем апоВ.

апоВ, мг/дл Частота Н2 аллоля Частота 82 аллоля Частота Р2 аллеля Частота Фа аллпдя

ы п % N п % М п * N п *

•'117 108 14 11.0 108 4 3.7 те 1? 11.1 1 оя 1.

> ) 20 86 и 16.3 86 9 10.5 86 24 Н1> 6 7.0

>129 60 11 18.3 60 8 13-3 60 16 .76.7 Со г; а. з

М - общее число аллелей в группе с рассматриваемым уровнем апоВ, п -•> число редких аллелей.

- 16 -. '

Статистически значимые различия между группами индивидуумов с нормальным и увеличенным уровнями апоВ обнаружены для S2 и Р2 аллелей. Так, в группе с апоВ»129 мг/дл частота S2 аллеля в 3.6 раз превосходит свое значение в норме, частота F2 аллеля увеличивается в 2.5 раза по сравнению с нормой, • что статистически подтверждено (Р<0.05). Различия в частотах редких М2 и Т2 аллелей в группах с псзвышенным уровнем апоВ и в норме не являются статистически достоверными. Для четырех изучаемых полиморфизмов исследовали, повышается ли частота редких аллелей пропорционально увеличению уровня апоВ. С этой целью были подобраны группы индивидуумов с сильно повышенными уровнями апоВ. Для S2 аллеля' это была группа с уровнем апоВ>179.4 мг/дл, для Р2 - апоВ>175.2 мг/дл, для Т2 - апоВ>176.3 мг/дл, для М2 - апоВ>181 мг/дл. Установили, что, чем выше уровень апоВ, характеризующий рассматриваемую группу индивидуумов, тем выше частота бстречаемости редких S2 и Р2 аллелей. Таким образом, увеличение частот редких S2 и Р2 . аллелей связано с "повышением уровня апоВ.

■ Исследовали, связано ли одновременное присутствие двух редких аллелей с отклонением уровня апоВ от нормы. Обнаружили, что с повышенным уровнем апоВ связан толко P2S2 гаплотип. Этот гап-лотип не встречается в норме, и его частота статистически достоверно увеличивается в группах с повышенным уровнем апаВ.

3. а Анализ связи исследуемых полиморфных аллелей с величиной отношения алоВ/А1.

По имеющимся данным у больных ИБС'отношение апоВ/апоА! выше, чем в контрольной группе лиц. Наиболее высокие цифры такого соотношения наблюдались при низком уровне ХС ЛПВП. Было показано, что величина отношения апоВ/А1, большая или равная 1.0 позволяет выделить больных коронарным атеросклерозом в 90% случаев. • Этот аполипопротеиновый показатель' оказался одинаково высокоин-форматйвным для больных коронарным атеросклерозам из разных ре, гионов мира и не зависел от особенностей липидного спектра населения каждого региона. Мы изучали частоты аллелей в двух группах, характеризующихся величиной отношения алоВ/AI больше 1.0 и меньше 1.0 и исследовали связь редких аллелей с таким важным прогностическим показателем атеросклероза, как B/AI. Результаты исследования представлены в таблице 9.

Таблица 9. Частоты редких аллелей в группах г нормальней и ' вишенной величиной отношения япоР/Ат.

агюВТАГ ЧастотаНг Частота S2 г Частота Р2 ■ Чпетог« 1 t

аллеля аллеля аллеля %..... чллели

К п % м п % N П К ] n I

<1 141 18 12.8 142 7 4.9 141 2?! 5.6 ' 4'!!7 'S,.)

">1 59 11 18.6 S8 7 12.1 69 1ь| 17.1 S91 4 ! Ь .8

N - общее число аллелей в группе с рассматриваемым уровнем airuB/Al, in - число редких аляе.пнй.

Обнаружили, что статистически достоверным является увеличение частоты Р2 аллеля в группе индивидуумов с апоВ/А1>1.0 по сравнению с группой лиц," Имеющих апоВ/А1<1. 0. Различия в часто тах остальных изучаемых полиморфных аллелей (S2, М2 и Т2) и соответствующих генотипов между группами индивидуумов с апоВ/А1>1 и апоВ/АК1 не являются статистически значимыми.

С учетом данных о связи между, возрастанием величины отношения апоВ/А! и атеросклерозом, мы рассмотрели, повышаются ли частоты изучаемых редких аллелей в группах, характеризующихся нни более высокими значениями соотношения ano B/AI. Для анализа специальным образом были подобраны следующие величины шю В/М: дли аллелей - уровень ano В/А1Ч.27, для М2 аллеля В/Л1М.23, для Р2 и Т2 аллелей - ano B/AI больше 1.26 и 1.29, соответствен но. Установили,что статистически достоверным является .увеличение частоты Р? аллеля в группе с ano B/AI> 1. 26 (Р-.0. Ob) по сравнению с группой, где величина отношения ano. B/AI меньше единицы. Таким образом, установлена связь между увеличением частоты полиморфного Р2 аллеля и повышением величины отношения ano B/AI.

Так как одновременное наличие у индивидуумов, двух редких, аллелей предположительно является неблагоприятным признаком, исследовали какие из гаплотипов, содержащих редкие аллели, обнаруживают связь с показателем В/АI, то есть частота каких гаплотипов возрастает в группе с B/Ab 1.0. Не установлено статистически достоверных различий в частоте ни одного' из гаппотипои между группами В/А1>1. О и В/А1<1. О, Предположительно,. в данном случае имеющихся данных недостаточно для получения статистически значи мых различий.

3.9. Определение различий в средних уровнях изучаемых липцдных показателей между индивидуумами, имеющими редкие аллели и индивидуумами без таких аллелей

С целью дополнительного изучения вопроса о влиянии присутствия редкого аллеля на перечисленные выше характеристики липид-ного обмена сравнивали средние уровни того или иного показателя у групп с 'редким аллелем и у групп - без него, а также у групп индивидуумов с генотипами содержащими редкий аллель и у групп -с генотипами без редкого, аллеля.

Данные, полученные в этом случае, подтверждают корреляции между редкими аллелями и измененными уровнями научаемых липидных показателей, установленные путем сравнения частот этих аллелей в нормальных группах и группах, имеющих повышенные или пониженные значения тех или иных липидных показателей.

VI. Исследование рестрющионного полиморфизма генного кластера AI-CI.II-AIV у больных атеросклерозом коронарных артерий.

Было проведено сравнение встречаемости аллелей, полиморфных по сайтам рестриктаз Мзр1, SacI, PvuII и PstI между двумя группами : группой больных атеросклерозом и случайной контрольной группой. Для каждой группы определяли частоты редких аллелей М2, S2, Р2 и Т2 и генотипов с этими аллелями. Данные о частотах редких аллелей в группе больных и контрольной группе представлены в таблице 10.

Таблица ю. Частоты редких аллелей в группе больных атеросклерозом и контрольной группа.

Обследованные Частота М2 аллеля частота S2 аллеля Частота Р2 аллеля Частота Т2 аллеля

N п % N п % N п % К п *

больные 70 13 18.6 70 8 11.4 70 13 18.6 70 б 8.6

контроль 138 17 12.3 138 6 4.3 138 26 18.8 138 5 3.6

N - общее число аллелей в каждой группе, п - число редких аллелей

Обнаружили, что в группе больных статистически достоверно увеличивается частота 32 аллеля, который встречается здесь в 2.7 раза чаще, чем в случайной контрольной группе. При анализе Мзр1,

- --------- ----- 19 - " ' ""

Pst I, PvuII полиморфизмов нами не установлено статистически достоверных различий в частотах редких аллелей между, группой Сольных атеросклерозом коронарных артерий и контрольной труппой. Рассмотрели возможную ассоциацию гаплотипов, образуемых изучаемыми' аллелями, с группой больных атеросклерозом. Установили, что гаплотип M2S2 почти в 5 раз чаще встречается в группе больных, чем в контрольной группе. Статистически значимых различий в частотах остальных рассмотренных гаплотипов между группой больных и случайной контрольной группой не обнаружено. Таким образом, мы установили, что связь с атеросклерозом обнаруживает S2 аллель и M2S2 гаплотип.

Таким образом, в настоящей работе изучены локусы, полиморфные по сайтам узнавания рестриктазами KtepI, PvuII, Pstl и SacI, расположенным на генном кластере AI/CIII/AIV. Показано, что некоторые полиморфные аллелк и гаплотипы связаны с теми или иными важными показателями липидного статуса, с различными видами ги-перлипидемий, что мокоет служить одним из генетических факторов риска развития атеросклероза.

Наблюдаемые различия ДНК. являющиеся причиной рассмотренных полиморфизмов скорее всего не этиологичны для атеросклеротичес-кого процесса, а являются сцепленными маркерами для других ате-рогенных мутаций.

выводи

1. Подобраны праймеры и определены оптимальные условия проведения ПЦР с последующей рестрикцией амплификатов с целью изучения полиморфизмов- в генном кластере AI/СПI/AIV в московской популяции. Тем самым разработан способ выявления полиморфизмов на и-той хромосоме, который может быть использован в генетических исследованиях, связанных с изучением сцепления при генетическом картировании.

2. Определены частоты аллелей, полиморфных по сайтам узнавания рестриктазами Mspl, PvuII, Pstl и Saol, расположенным на генном кластере AI/CI II/AIV, в московской популяции. Показано, что для всех исследованных полиморфных сайтов частоты аллелей в московской популяции близки к таковым в популяциях из различных регионов мира.

3. В результате анализа связи полиморфных по сайтам KfepI,

5л:I, PvutI и Pat! аллелей с важными липидными показателями, являющимися независимыми факторами риска атеросклероза при изучении московской популяции установили, ЧТО:

а) редкий аллель № обнаруживает связь с повышением содержания общего холестерина и триглицеридов, с гиперлипидемией типа 1 ¡6;

б) редкий аллель S2 связан с повышением уровней общего холестерина, триглицеридов, аполипопротеина В, с гиперлипопротеи-немией типов Па и IIC;

в) редкий аллель Р2 ассоциирован с повышенными уровнями общего холестерина, аполипопротеина В, повышением величины отношения апоВ/А1;

г) связи редкого Т2 аллеля с рассмотренными липидными показателями не установлено;

4. В результате анализа связи сочетаний пар редких полиморфных аллелей (гаплотипов) с показателями липидного обмена при изучении московской популяции обнаружили, что:

а) гаплотип P2S2 связан с повышенными уровнями общего холестерина, апоВ, * с пониженным уровнем ХС ЛПВП и с типами 11а и 116 гиперлипидемии;'

б) гаплотип Р2М2 связан с повышенным содержанием общего холестерина и с Пб типом гиперлипидемии;

в) гаплотип М252 ассоциирован с повышением уровня общего холестерина;

г) гаплотип Р2Т2 обнаруживает связь с' пониженным уровнем XD ЛПВП и с типом Па гиперлипидемии;

д) гаплотип S2T2 связан с повышенным уровнем общего холестерина, с пониженным уровнем ХС ЛПВП и с Па типом гиперлипеде-ши.

Б. Выявлена связь S2 аллеля и M2S2 гаплотипа с группой больных атеросклерозом коронарных артерий.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Берлова A. JL , Сафронов В. В. "Поиск ДНК-маркеров риска атеросклероза" // 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991 - тезисы докл., стр. 31

2. Safronov " V. V. / Berlova A. L. , Perova N. V. , Makarov V. B. , Kalinin V. E. "Search for atherosclerosis risk DNA markers m studying the Moscow populations "// Human Gene Mapping 11. Abstracts. -1991, p. 1970.

3. Сафронов В. В., Берлова А. Л., Метельская В. А. "Связь полиморфных аллелей генного кластера AI/C1II/AIV с нарушениями ли-пидного обмена" // Молекулярная биология, (в печати).

t