Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВЯЗЬ ОБМЕНА ПОЛИ-БЕТА -ОКСИБУТИРАТА У BHIZOBIUM С АЗОМИКСАЦИЕЙ И ФОТОСИНТЕЗОМ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СВЯЗЬ ОБМЕНА ПОЛИ-БЕТА -ОКСИБУТИРАТА У BHIZOBIUM С АЗОМИКСАЦИЕЙ И ФОТОСИНТЕЗОМ"

ладгашя ВАТЕ СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ: НЮ1И1ИВ1 шеях 1.Л.ЕШ

На правах рукопдош

«едглптц Наталья 1Ьврмяовва

связь оаши ПОЛЙ-^ -ОКСИБ7ТИРАТА У «Я120ВГ0Ж

С АЭОТФИКСАЦИЕЙ И АОТОСШТВЭОН. 03.00.04. * биологическая

АВТОРЕФЕРАТ джссертвцщ* на оожсмавв учёной ствпваж хандядам бжолотавслжх нау»

Москве - 1930

Работа наполнена в да боре то jm энзялодотжи Ордена Ленала Института йдоттаии лменк А .Е.Баха АН СССР

Научнее руководителя: чден-«орреспондент АН СССР,

профессор ВЛ.Ервтовягс, кандадвт биологдчесмх Еаук В.Н.Ршинов.

Офшвадьшм оппоненты: доктор Оизлоггчеснгг наук

ГЛ.Жшззегская, аавдддат бксиогхческах на ух Р.А.Зэггвдьсаая.

Ведущая организация; кафедра микробиологии

Носшвсзого государственного университете им .М. В Ломоносова.

Защвта состоятся 1980 г.

на заседания сдешаля дарованного совета со 'доисуаденид учёпоЁ стесена кандидата наук /К 002.96.01/ в Институте баахзмид 2».¿.B.£sxa АН СССР AI7Q7I ,Мосзза, B-7I Деаансгип пр. ,33,корп.2/

С í^ccepracaeñ иогло ознакомиться в библиотеке бислогг^есяой литературы АК СССР /ЗеназcsaS ср. ,33,корп.I/

Автореферат разослан "JY* 1380 г.

Учёный секретарь спедвааязЕроБвнного совета * / / каедЕдат баадогжчесетх наук М.Я.Ыолчаноз

оыца ИРАЕТВгаСТЕКА РАБОТЫ

Актуальность проблемн ,. ■ С икса пая молекулярного азота ш-рооргавжэмаяе является одно! из фу ндаые нталыш! проблей современного естествознания, решение которой похет иметь большое народно-хозяйственное гпзчееиа.

Особенно ьахвз дня сельского хозяйства факсацгя азота клу-бевьковиця бактериям я в симбиозе с бобовыми растениями.Согласно современному урсзнв знаний, механизм симбиотическоа азот-факсасги представляет собой процесс ферментативного восстановления молекулярного азота в аммиак, протека шла з бантерааль— снх компонентах клубенька - бактероидах »Для его осуосствдвннн необходима энергия в вида АТР, которая образуется ара диссима-лясаи углеродеы-Т соединений ( Bergereon ,1974; Шюз ,1978, Кретовач,1$79),

Энергетическая обмен бактероидов мало изучен.Одним из неясных вопросов является вопрос о физиологической роля а метаболизме з бактероидах полл-р-оксхмаединой кислоты (сокращённо ШЫ), которая представляет собой запасное вещество у многих микроорганизмов < Dawoe ,Senior t ,1973;Роианов,1977).

■ Даль в задача исследования. Цель данной работа - азуче-нав фазнологаческоа ролл а путей обмена поди-Р-окспмаслянсй fx слоты в бактероидах BfcisoMcn .Была поставлены следу щие задача:

1*На примере нескольких пар эффективных а неэффективных итакмов клубеньковых бактерий латана, гороха я бобов изучить связь мелду содераанаем ШЫ з бактероидах а интенсивностью иг дыхания к азотйвтсасгд.Провеста изучение этих показателей в дросассе вегвтзцзд корыовыг бобоз при эффективном симбиозе, . ¿.Исследовать влияние суточной динамика, а таяае затемнения растений на содерхавие ШИ в бактероидах лхяана в связи с азотфикееааей.

3.Изучать даламяку включения метка в ГШ при ассимиляция - устьями лшана на свету.

^.Установить наличие в экстрактах из бактероидов люпина ферментов, связанных с синтезом а распадом ШЫ.Провести исследование азманания их активности в процессе вегетации растений лхшина, в т&кхе при сравнении бактероидов эффективного

Центр, ваягз! Снйя ;оте«га Моск. (ед, Я;ня*|;а сиш», м«Д. ET.J, К. А, Tsajjaa.-ja

и неэффективного штаммов ЙЬ. laplnl»

¿.Изучить вюшчекаа в ПОМ пра инкубации изолированных бактероидов клубеньков дшива с ГЛЮКОЗОЙ в

евдтатом.

6.5ыявять аакичае фермевтов никла К pe dea в бактероидах Rb.lu-pim и исследовать изменение ях активности в процессе sera теша растений лшшва.

Научная новизна . С яомодью различны! подходов показано, что явление обратной коррелята между содержанием ДОМ в бак* твроздах RMzobJu» л интенсивность» азотфаксацаи широко распространено среда бобовых рествагЛ»

Б оигтах so затемнению растенай люпина, а такие с помощью радиоактивной методика впервые показано« что обыен ДОМ в бактероидах тесно связан с просеесеия азотфидсаттлв а фотоеднтеаа.

5 бактероидах ыгуСаньков дкшша впервые установлено наличие рздз ферлентов синтеза а распада ПОИ .Обнаружено, что ав-TziKosTb 2х зависит от стадии развития pacteiizS, причвы макса-мольная еетизность всех фераентоз ваблцдалась в пераод интенсивной фиксации азота .Доказано, что в этот период синтез и раезад ДОМ.в бактероидах осуществляется одновременно. .

• На основавши полученных результатов сделан обща! вывод о. той, что часть фотоассамиаятов, посту паотвхв бактероида, резервируется в виде BOU я шхет исшип>йоваться доз процесса азотфаксаш».

Роветдчесвая ценность. Изучение обиена ПСЫ в бактероидах как важного свазущего звена мезду процессами авотфаксация ж фстосидтеза имеет большое звачеяив две понимания механизмов энергетического обеспечения оитрогвназы, их расвифровха приведёт к существенному увеличена» продуктивности Собошх рао-теыиг.Краае того, содержание ПОМ в бакгеражжах, по-видиео«з v мохет служить новой дополнительной характеристике! активнос-та симб&отвческоВ азотфвксаош.

дарооадия работы . Основой в тгоягчшшия диссертаций доложены в оосухдены на:

- 17 Всесоюзно« биохимическом съезде .Ленинград, 1979

- '2-ом рабочем совещании по теме "Генетика фигащи^ азота" в рейках многостороннего сотрудничества Академаз ваук сопаалао-тическах стран .Ябдмша, ÍHHP), 1979

-вопмстянх кодяаквяумаглаборатория энземсшогея йЕШ им. A*HJBaxa АН СССР к кафедрі бжохаша х зерзоввдендя КИПЕа.

- Опубликовано 6 работ* отрахавдих основное со дерм аде ддссерташш, 2 работа ваходятся в печати.

0<Нём работе . Двссвргапвя взлохана ва У?І"страшщзх текста я содержат 6 таблиц, 13 рисунков, 3 схемы.Список літературі вкдіяает 224 ваииеновапгя.

иатеншы и ..методі иосвдэашиа

Об^акт исследомядя ♦ Дня инокудягвж растений были использованы следущие еггаыны Елубваьковыж бактерий, получении с яз коддексаи JLeнаяградекого инстатута сельскохозяйственной tat-кробяологив: кмгоЫиа mpioi I шріш» iut«u* l. ) 3S9a к 367а - эффективные, 400 к 365а - неэффективные ;р.мгоЪ1ив euel по ватна ( Viel» ГаЪа L. ) 96 — вффективша, 2426 -неэфф«ктавЕы2 дія кормових бобов, во э^ектизный для растевгй гороха.

Постановка вегетационных огктов. Растеная выращивала в вегетационных сосудах с предоаратальяо отмытым в простеровэоьая-вш кварцевым песком ва питательной смеси Прянианккова, яз которой был жекдгчёв источник азоте (Шкова, 1975) .Вырещиьанае проводили в вегетаагонасм домике, сшаюдд растения в 12 часов ДНЯ.

Определение азотфакеяргшей активности проводила асеталеао-веш методом в модификации Тонга я Эвакса ( vo&g . пш • , 1971). .

■ Удаление бактероидов. ' Клубенька, отделённые от корцеа, помещали в лёд, вся последупаае операция проводили upa температуре О - 4°С.Клубеньки растирала в фарфоровой ступке со средой Бергерсева ( Бегвягяеп , Turner ,1967) .ГоыоГвЕат ОТ— жимади через капроновую ткань в цент рифу гаровади оря ЗООхе 15 шщут.Осадов отбрасывали, а суперна тент центрифугировали 30 маяут ара 540Ctr« для осахденая бактероидов, которые затеи от-иываля 2 раза ОД Ы K-фосфатшл« буфером рЕ 7,0 с Ю-3Н МеС12.

Определение интенсивности дыхания бактероидов проводила полярографическим ввтодшЧШольц,Островский,1365) .Ячейка содержала 2,5 ыл реакционной смеси, сукдашт ка я р-оя сабу тира тва

добавляла в количестве 12 ашыолеЗ.Для работы иедалъзовгли поля— рогрвф КЕ-3266 (фаргы ьКЗ.Шеєшя); часть опатов проведена В.И. Щрамко.

Содержание подч-з-оксабт'тяЕета s бактероидах.определяла а»' методу Лог а Слеаесаа ( tow , siopeckj ,1961), а тахге по разработанному Баш созыестно с З.ИЛИрекг.о методу о прзыеквнием so- -растых стеклянных дисков (Романов и др. ,1980а).

Пэстагэвка о готов до эатемвеаяв паетеяий «. Дня экспериментов отбгралг растгвея, достигла» стадал начала дветеЕия.Затем-hshe« осуцестЕлкла в сдесиадьшд соксэх, куда захатывалд вагонетка с растекайся » период наиболее sktsbhoÜ езотфексадгд (12 часов дня), обретало осерэпзл (ЕккатнванЕе вагонеток на свет) ирсводидд s S часов утра.

Тсхвдуз опвтов зо включению радиоактивной уаткя. оезлйчныс ¿давит глубевзда. Еадз'змвуо "часть растений лташва в стадна активного кветзкгя домекалд в зеландрячвскуэ стакдяннуд Еаиеру oCsôûOm 5,2л (одно се стенде в камеру) о общей. довс2 радпоактив-acera 15 мКа ' (Ва СО3) а екссокирозалд Ера тешерзтуре 20°С а осведёшоста 5000 люкс,ПОИ гадал яла аз бактероидов по методу Coy е Слепеддд ( lx>* , S2epeoicy ,1251) до стадад рестворз ао~ •камера в хлорс^ор^е, аддквоту которого дсдользовали дда опрадв-леЕля 1 чЗ. Б процессэ фрзкшоЕгроЕаогя клубеньков склінеаа« печеного углерода определяли в гомогенате клубеньков, во фраксди далкї бактероров и фрекааи частого ПОМ.

Везли єедє в ПОМ яз слдрова нныни Сактв роадві/д вэучадж в их сусдедэЕд в 0,1 M К-фосфатзои буфере рВ 7,0 (1:5,сыр.вес/обьём). которую аэрдровала воздухом (I ия/кжя на 5 ш сусиавзда) (Роыа-ков к др. ,19806) ,Радиоактивность образцов оцекЕьаля с поносьв жидкостного спдетдлляшонвого счётчека (intertecbaique (

срзЕїая)»

Получение бескзеточнцу,_рредарйтов а» бактогоидов . Дня " разрушеная бактероиды (обычно 5 г) суспендировали s 0,01 U трас^ЗСХ буфере >й 7,0, содержа вдам I íü йєСІ2 <2Ш дьтао-треитол в соотношении 1:2 (вес/объём), добавляли. крдсталлдчес— кус JfëK-азу (0,5«г/г сирого веса дасте) в затеи суспензии пропускала черва пресс типа Іьвза (Л»бгмовДьвов,І908).Суспензию резрупешщд кввтеа центрифугировала ори І200ХВ ЗО канут, осадок аспольэовали для определения активности ПОМ-депсдвмераз»

яли сукпинатдагвдрогвназн, а суперватант пропускала через колонку о сефадексом о-ІО.В полученной препарате определяли актив — ность рвстяортшх ферментов.Ддя определения актявноста сукдинат-двгадрогеназн осздозс тщательно отмывали л суспекдировали в буфере, которыЯ использовался для разрушения клеток*

Опредалеяде активности Фесмеятов проводили, используя спектрофотометр зР-30 фарш " руе цщо«и " .Подбор оптсігадьшіх условий pH г концентраций субстратов дая определения актлЕНОстг всех ферментов проводили на бактероидах, шделенншс из клубеньков в период цветения растений a храндвалхея затеи несколько месяцев при 1-І96°С.

ПОЦ-Есаолимеоазч . Осадок разрусеннаг клеток, содароагшиЭ гранулы пои, дгзглн отаиьали 0,05 Ы трис-GCl буфером pH 8,0 с

3 ыМ %СІ2 , на холоду .Для срвдохронекпя гранул от шханлч скоро повревденая ва дно пентрифузшой пробирка наносили глицерин и затем осторожно наслаивала суспензию ( Kerrick ,Боиdoroff , I9&4) .Откатій осадок суспепдаровали в* том se буфере в соотношении 1:5 (вес/объём) а инкубировали I час при 30°С.Пробы фяяса-ровзлв э"кипящей Бодяшоа Саве, затем сентрлфугаровали nptt 12000 хг 10 минут а в супернатанте определяла /»-оксибутарат.Одредыо-нае проводила ферментативным путём с псмоси>» частично оч гід енного препарата д-гпдроксийутвратдегсдрогена з и, полученного вами из бактероидов (Шкова а др.,19756).

Активность агмтал-СоА-ацетялтсансФерезы (КФ.2.3.1.9.) определяли по реакция тиолаза асатоапетял-СоА, а активность СоД-тюнс^-есаэы 3-«етокислот {КФ.2.8.3.5.) - по реакции образования сурпанил-СоА в едатоасвтата аз ацетоацетол-СоА я сукпината (sealer ,Saves .1973).Активность пзтрат(аі )-синтази (КФ.4.1.3.7.) определяла по скорости образования свободного СоА- sH, измеряя нарастание экстинкшш пра 412 mi за счэт связывания 3»-групп реактивом Эллаааз.Активность сукпкнатдвгия-рогеназы ^КФЛ.3.95.1.\ измеряли по скорости окисления 2,4-ДСі! ( Ve*gar »t «1.1969).Активкостя изосятратдегидрогенази (КФ. IЛ.1.42.) а Р-гидрокслбУткратг.егидрргеказы (КФ.1.1.1.30^ определяла по скорости восстановления MA UP н лав, соответственно, а а к тав кос ти зцетоапетил-СоД-редуктаза (КФЛ.ІЛ.Зб) а малатцегадрогеназы (КФ.ІЛ.1.37. - по скоростям окисления EA0FH а НАэн, соответственно,Активности всех растворимых

ферментов тессчитнвалл по начальной скорости реакции я вкрвіша з ыевду народных єдкнецві йятебеости (U.S.), то есть в кохгчест— ' бэ ыкмолей превращенного субстрата за I канут? на I иг бедка.В расчётах использовала следуте»9 коьффипгэнты нодярнкх skct-jek-сгі (ил-мгыодь-^сыГ1): в&а и кізен - 6,22; ааетоаиеТЕЛ-СоА -

- Г?,2; 5,5*-ддтїознтробенз оат - 13,6; 2.S-дитлорфеналг.п дофевгд

- 21,0.

Бедог озрадвлялг по методу Лоурн ( ір»ту «t al., 1*951).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЙССШЗЗВАБЙ И КГ ОЕСТЗДЗЖБ

І .Тлнашжя ьегетацпе когглогих бо^оп.

К началу напей работы бшга сзьасгпо.' ^то г сраиэссе ьзгагз-пя» раотенай ляааа ара эффэгтЕЕЯэ» симбіозе кейдсээетсй обратная гэрре^гпил соде рипаєм ЕЮ.М в ¿aiwepozjisz, о одеоЗ стороны, а гктезсзБЕогтью ззотфгт.сацаи. з дьпапн, с другс2 (Роь ізнов а др., 197-1).Эта дашхае з-кязавалл на налячав осредалёкнсЗ ззашо-свлз» меяду кетаЗоддгнои ПС13 а пропэссои аэоуфдвсяааз в Йэктеро-мях*3 то i'B rpssis бі^о неясно, иасгсоым характерно вто явгеЕье г*я другдх бзЗовзх pacr«Ez£.3 ешза с згщц эадЕЧэй агшеё рэЗсгк свучскхв дденого вопроса га примере r.cpjostr Соооь,

На йас.Х эглЕО, что в первой часта вегетационного перасда-ло гэчала зегвзія, pscrsiirj! єкт&еность азэтфгксасия нарастает, е сэлерззнгг ЗОЛ - задает.Затем, до «зре старений растений с cof-csasK2£ сєііен оггГЕзэсть аготфкк^анад постепенно снсаавтсЕ, гра-йКЕЗяоь к гули, .а содвргаяав ПОМ, наоборот, возрастает.

Интенсивность дзхйнен бактероидов язнерядя в присутствия суж-EZBSTS, лучшего дыхательного субстрате J.Sfl EblsobllUB (Eers«T-,ISC7;Eei-gar«eti ,1&оЭ), а тгкгв Д-оксвбутарзтв, ПЙСаЗЛЬКУ Oil ЯВЛЯЕТСЯ. CeplSM ПродуктOK ВЛутрЕЕЛеїОЧЕОЇ рЄГрЗД0-цьд eloji ' d&ttst. ,si-nlor ,is?3).e пело» характер жзиснєеел дн-хакгя сгодгі: о харгг.терс» ьзуєеєнпі eзотфгт.сзпая,однако, apt ссвазввяоа ссдер^зееа п0ь£ (в naiosn: е старежзг клуйзньяах) са-кгародда "ав isks-tjk" еэ ¿-ОЕеаоутдрзтв.Згэ ксхе** указывать ке различную ыатвйолаческуи акт2В5осгь flDti 2 онтогенезе растений.

Вое эта даке>в хорозо соетагагт с тек, что Сг^ло сохазако ра-неэ ZZR Оагтерогдоз вьлвріаі (їохааов л др,,15г?4), є также дія ОактерСЕДоз Eh. jepoalouM ( Еіиьав ,1S*74).

Tssjsm образса, liosEo полагать, что обратная корреляция кеіду ■

Дни после послбки рлстений

Ра с.. I .Иатеасяькость азотфаксапяд а дасаная бакт&роядов, е такие содергзяае а ей* солл-р-оксяОутаргта в процессе гегета1^д корйошз: йооов.Данное го дианаа предстаыбЕЫ за внчетои задо-генЕогс.

согграаааеа СОИ э Сактеровдах а антвнсгзкостью азотфихсасгг з сродессс зегетацаа йоСовых растений срезставдкет собой об^еэ яэ--енге»

Tatoma I.

Hht6HCBBH0cti> eaonjjiacaiyui » imaiiuii, a lame co^epraHaa noui-^-catczôjTiipaTa b Castepo-Rnax 3f^eKtiiBi)Hc a iteo^estKsmix ntauvoB Rhiieblum.. .

EBJD psctenai iaaa passa«« pacTeii££ fflTomi lÎHïeaciDnûCTii asoT^JuxaoBii (mjoîfl C2H4/ lac/r oy-OEDIKOE) Ha Tançai HOÛTB w-IûUÎK (mu O2/Mr 6em$/H3c) Coflopianae no-jia-p-oxcECijîi-para (» ot cyi. Bôca tfswapea-SOB)

na cyram-Haie «a ^ok-CBÎJTU-

. lupin us lut«us 1 ïjTomsanefl ZI 5,40 5,95 9,37 19, H 2,16 4,71 5,23 3,29

Haïaio HBe- T6H2H Hesî-psKT.^ 0,00 0,00 0,12 0,42 0,00 -0,49 2G,2û 32,21

Vicia faba l. Eyrouaseuïlji ^eRT. S6 6,70 0,00 ..44,39' 4,57 3,79 2,05 0,69 5,23

Pi sua sativun 1 Ra«î3Jio or-e- TelIKH ^taî. 242(3 4,33 £7,10 13,30 1,48

tlpuMeianyai jaiawe no ¿amiiao npe^oTSMewi 3a BtwaTau omorcHHcro.

2.Сравнительное изучение эффективна* я веэ^ктвзных дтаы-

Н22__г.

Другим подходом в изучения взаваосвяза между процессом азот-факсапад а иетабслязыоы СОМ было сравнительное исследование бактероидов эффективных в неэффективных штаьшов Rhizoblun раз-личннт групл янокуляша.

В Тайд.1 представлена результата опытов по сравнение бактероидов зффеятивныд в неэффективных штаюеоз, выделвНЕНХ из клубеньков растений ляшша, бобов я гороха.Б этих опытах растения внра-шввллн 4-6 недель до стадиа "бутониэашя-начало цветения", гогда азотфгясация "^ффектаЕКьгмз" клубеяьулма достигала своего махса-ьгу1м.Бядно, что садертанда ПОИ в Сактероадад пра эффективном сяыбаоэа значительно (в 5-10 реэ) ките, чей 3 "неэффектгликж'* бактероидах, котор&е не фиксировали азот „В тс же вреггя интенсивность дахакая на р-оксвСутграте была заметно suae у "эффективных" бактероидов. '

Штеим ah.lsEaolcoe »run 2420 был специфична по отнове-езс а е гороху, я ж корюзэа ¿обей, однако з первой случае сн ¿од эффективным, а во второй - солзостьо не эффективным .Пра сраэ-аендд бактероидов этого итакыз, выделенных из клубеньков козловых бобов в гороха моэзо видеть картину, весьма характерную для эффективного в неэффективного симбиоза.Эти дзшше свидетельствуют о ток, что набдхщаеше ваш корреляции обусловлена оюяно процессом снубиотачэской азотфидсапдд.

Тайги обгазом, модно считать, что обратная корреляция кегду содержанием Л011 э бактероидах в интенсивностью ааст&аасадиа представдяет ссбой распространё пноо авленее.

3.Содаргякия пол г-з—окее бутгоэта, вятевсявность дадакая им азотфдксасаи бактероидов в|дневное g ночное время.

Известно, что интенсивность сгмбиотачесяой азотА«ксаца.а заметно меняется в течеша суток, что, по-вадвмоуу, связано о поступлением фотоассгкилятоа в клубенька .Поскольку ПОй синтезируется за счёт продуктов фотосинтеза, било ваяно определять содвр-аанве ПОМ, а тастг яктеясавкость дахакия к азот^нхсадад бактероидов в' разное врекя суток.

В Табд.2 приведены результата опытов со сравнению бактероидов эффективных стамков, виде леших яэ клубеньков бобов а. ляпика в полдень л в полночь.Бедно, что азотфикеярутая активность во всех

Тамма 2.

йятенмвностг мотфисади я даинм, а таи* содарханнв ття-£~с1сяйуп$вха а бактеро-щдах клубеньков бобов 1 лшняа в дневное * ночное вреия.

Бадл растенгЛ —I Фаза резвя-Т1я растений Бремя суток Иятевсявяость аэок{«ксацц (кяшсиш С^/ час/г клу-бешсов) Интвнсишость дыхания (икл 02/иг бели/час} Содерхаше пота [% ог.еух.вв-са бактероидов)

на су «г вина» ва слбунро-те

Т1е1а ГьЬа I» . Начало овзтенхя Цветете Лень Ночь День Ночь 4,36 3,66 3,51 3,04 51,44 46,19 47,80 41,37 4,81 4,19 7,00 1,45 1,22 1,85 1,53 2,96

1ир1виа 1цНаа 1, Б^тоняэа- Ковец цветения День Почь День Ночь 5,95 3,73 3,39 2,08 19,11 17,30 27,05 21,50 4,71 2,52 з.об 2,15 3,20 3,81 2,86 3,84

Рркиачзниа: съём растеиий проводив в 12 часов дая к в 12 часов почв; дяшшв во да-' к нив представлены за нлетсм эвдогвиного.

случаи: э дневное время_Онла its 20-50^ Бшпе, чем нэчыиСодержа-Н2в GOM, наоборот, s rex хз зредехазс было ataie у "нстенх* Саи-теродлоэ.Бажзо отыетлть, что ecxz "суЕйЕнатвое* Е£ииаяв э этах осытах колебалось незначительно, го лахзкзв да ,ч~05сдЗутираге заметно умгкъоалось з ночзсе вреая.

4.0СУТН по ЗЯГеМНРНЯО ГЙСТОКЗЙ.

Время ОТ НАЧАЛА алтемнения (ЧАСЫ)

Рас.г.Изменендв гятенслзаоста азотфихсэиаа я ccsecsasizs пола-> сксдйутирзта срз згтеияеягг рэстенгй.Сгрелкой стмвчеа момент, когда часть растека2 гкстаЕлядд as езет, лаккав для заставленных ка- свет г-асгенлЗ погззаЕН сунктЕром.

1

Кзк ггЕБО из Рис.2, в первые яе чэси после "ШКЛЕЧекаЯ" фо-тосентеза найлвдзлссь резкое енджекае азотфгкеа рудсей активности клубеньков лшина,Одновременно происходило значительное узе-лхченае содержания в Оактэрогдах ПОМ.К концу опытов (60 - 100 часов} содержание G01! вачгнало уменьшаться»

Если псале затемазкия растенья злобь выставляли па свет, то азотфексаиан ара этом сразу se резко возрастала, достигая через 8-10 часов G0-65Í от первоначального уровня, в то время жак со-деряаиве ДОМ стремительно задало.Скорость я степень восстановления активности заЕзседз от теьшеретуры s от того, насколько длительным был период затемнааия.Еами бадо поставлено несколько пэдоСеых опытов и все они дали сходнее результата.

Йзьестно, что з первый аврсод затагшакая потек продуктов фо-ТОСЛКТЗЗ» ИЗ ЛПСТЬеЭ Т. ГЛуОЧКдКЗК ежз ДОВОЛЬНО ГЫСОК С LoTrie,

¡íheel->? ,IS?3; aiaebliv , Pa-e ' .1973; Ceraос , J>ate2,IS7£).3epoHTHO, upa "ваклвчекии" фотосинтеза а разком сндгзЕхн интенсивности йзстфянсегхз происходят д^мввенге соот-«¿иеяня w.r^zs скорость» постуялекгя фотоассЕкглятов в баг.терок-

ды к с"с рсстьс их йспс1льгов£ккя, что приводит к шеоплвки) по-

ЛЗУврт .КОГДЭ яе ПРОИСХОДИТ включение света, то для бистро го воо-.^тлкоБленЕл интенсивности азотф^саяаг требуется дополнительный источник вь* -ргдг а углерода, зеле детва е чего ка на&пшем pao— ледова няе

£ целок згкты по затемнению растение показали, что азотфик-сгрусхая активность г содержание ПОИ в бактероидах связаны между еобэЗ обратной завгсиыостьв, причём фотосинтез окззквает ре-садаае влияние га изменение этих показателей.

б.Ьклдчснке в дола-^оксибртярзт ^С. ассЕУДлированзото -лге^ьяид дг^ккя э итопессе Фотоскктеза .

йг Рас.З представлены результаты ознтов, э которих растения лхчхика, активно фиксировавшие азот, экспонировались в атмосфере ^СС2 на сзету-Видно, что за время экспоa anas { от Z5 шщут до I? часов) ьтлзченне метки в ЕдуОглэс, бактероида а ПОИ возрастало очесь значительно и в целом параллельно.Из этого следует, что часть продуктов фотосинтеза, псступаякид в кхубеньни в в бактероида, постоянно используется на синтез СОЫ.Учитывая, од-шко, тот факт, что общее содергание полимера за время опыта пгактическа не кеЕяаоаъ (показано столбиками,Рас.З), мн приходим к заклЕчепис, что в период активной азотфаксаиии в б&ктеро-niax люсина одновременно идёт как синтез, так и распад ПОМ.Иначе говоря, »то соединение находится в бактероидах в состоянии динамического равновесия, которое в период активной азотфиксв-

З

= 4,0 £

о 3,0 1-1

-Ij-

НА иГ П0АЦ-р~СКШ5иТНРАТА

o

fi

5

£ з

1 ip 30 ie_s____

0 i 2 * ' 19 „

Время инкуолции РАСТЄНИЙ б Атмосфере СОг

(часы)

Рис.3. Динамика включения ассЕккларэьавкого ягсгьгалл лта-

иа в пропассє фотосинтеза в клубенька, бактароиды к солв-^-ок-сиОутират.

пив (когда содержание ЛОМ мяпемасько),по-вкдсиг>цу, сдвинуто в сторону ero утихизаапд.

Как показывай расчёты, после 13-ти часов зкенозгщш количество ^С, включившегося з дадииер, составляло S-7Í от количества поступиваего в бактероиды.Поскольку процент ^С, вюшадваегося в ПСН (5-7Í) близок к проценту содержания полдмэ-ра от сухого seca бактероидов (6,0-6,69?),м оіао думать, что обогащение ошю довольно высоким.

6.Изучение ¿>едіентов обмена поля-<wjkc3бтти рата в бактероа-

Лдтеретупаые дйннує о баохзмачасг.дх механизмах синтеза в рае-дада COU ; ЕЫгоМса весьма ограничены, поэтому одной из задач вазой реботн Єїіло гзучанао фераентоа обмена ПСЫ ыа примере аь. labial

5 Сактэроадаг аз клубеньков лтлядд бы^о соказано задачие вы- . сояой активности как фвріектов сактеза еслдвиврз, (ацетал-СоА--йцаталтрансфарвгы 3 ацвтсапетал-СоД-редзктазы), так а фермеz-тов ато сасззда (ПОУ -двполгиераза, ^-гидрсксдбутаратдеггдро-resasH з СэА-трансфвразн З-кетокаглот) .Все фераенти била раст-зораук, крсиа ССіЇ-дедслдмеразї, которая балг связана с меыбра-есй, екрухазадей гранула ПСЫ.Калдчде високої актазностй пяте ас-сдодсванныг фаргентсв oCxssa СОМ з бактероидах пь. ітірілі позволяет предположить, что иеханагм баосантвэа и катзбоддэзла атого ссддм':^ в нааеы объекте сходен с таковым у других бак-терай ( sa»«« , seaioy ,1973).

Ахтизаость феріентсв обмана далахарэ должна быть связана с его содйрзаЕаем з бактероидах с с его иетабодсческаа состоящем .Поэтому следук;е2 напеЯ задачей было изучение ферментов обмена ПСУ s процессе ьегетапад растений, когда интенсивность азотфансапдд а содержание полимера в бактероидах заметно ые-нягтея.

Как видно из Рас.4. в нерва! парзод вегетации, до качала Езетевая растений содерхзние COU в бактероидах заметно умень-халось*Одповре»евво а оактероадах Еэблюдадось увеличение ак-талзостд феріентоа как сявтезз, так и распада П0ВІ.З дальнейшем, со мере стареная растений , снихендя интенсдвноста азот-фигсапаи и,соответственно, увеличения содержания Cûii активность всех »тих ферментов снижалась-7ровень активности £-гад-роксабутаратдегвдрог єназы «здо менялся з течение всего периода 2еГ8Таядд«Необходзіо отметить, что данные по активносте ПОЫ-даполимеразы представлены в мюкїлях ¿-оксабутярата, образовавшегося в течение одного часа из I иг ПОМ, поскольку мы считаем, что такав единицы наидучашм образом отражают "скорость пвревараваемостя" COU.

Bazao подчеркнуть, что актяввость всех ферментов обмена ШІ1 была наибольшей в тот момент, когда содержание её было

ЬиеташетЛ--СоД-Рв9цгстдз* 0,2

06

0,2

I

е

¿'- И

•ч

■о

£

£ ю

о

б .

.1 ^ т. I.- I

^ОН-деполи-нерш

"'ъй-трдно-

010 тркчсщ

3,0

Лцетил-СоА-

АЦеТИЛТРАНС-2,0 ФеРАЗА

30 50 70 90 «о Дни после ПХАдкИ РАСТеныЙ

Рве .4 .Содержание палд-/-оксв(5утярвта я активность ферментов его обмена (мкыои-мак • мг белка"1) в Оокгероадах клуОеньков лтодяа в процессе вегеташш рвстзяай»

- -

шЕималгьзо, а интенсивность азотфадсаша бактероидов достигала ваивисаого уровня.Это еще раз свидетельствует в пользу того, что в бактероидах одновременно происходит а синтез, и распад ПОИ, и что интенсивность его обмена тесвайшш образом связана с 'процессом факсакля азота.

Что касается сактвроадоэ неэффективного штсмыа Rb.lupini, то удэльгая активность в них ферментов обмена ПОЫ тзкхе бола доголено знссда Í дзлкпэ представлены в диссертация), но в данном случае это связано не с фиксасией азота, а, по-Еад?иону, с необходимостью подазрдивать в динамическом равновесии болыпуп аассу полимера, содерг^цэгоея э клетке.

в.бгхдтгчйш'.е яз сст по уя gekm я бяктд^оядам»| rmtnbluw

матта в ибзи-з-оксибутдгат из wrerax çoi дглеооду глруозя я а штата >

Ло агстоягего зсемеяи недостаточно ясно, в вида аакнх ямепно сседгненай продукта фотосинтеза поступает в бактероида, но од-НЕм зэ Еаяболее вероятна* "природних су Остра гов" для бактероидов в клубеньках яэляетсятлгжоэа.Оозтону ерь изучении метабо-

. Тайласа 3.

Ехлзченаа * С язоллрованныш бактероидами RMzoMua ïuplni з оога-о-океабутграт из ¡X-I4cJ-, [г-1^:] глшозы a [2-i4cj едз-тата«*

Субстраты Количество ямс7дьсов а кинуту са I мг HOU

Опат £1 Сзамороггшше СактероЕду) Одат Ä2 (езегогадегек-нае Ca кто ро аду)

(х-Г4с}гдж«)за 82 4Ô4

(2-I4C¡ гдсЕОза 95 593

{г-14с] адетат 576 5986

лдзма ПОМ в связи о взстфад сашей д фотосинтезом ,'шо ваяно определить, способны ли бактероида, выделенные из клубеньков, ис-

пользовать глшозу для синтеза пслж-^-оксиоутарото, для сравне-нхя использовали также 14С-адатат*

Из.Табл.3.видно, что йантероады, хранившиеся несколько месяцев в жидком азоте, включали С в НОУ ваметно духе, чей csexs-выделейные.Важно подчеркнуть, что два поставленных опыта дали сходную картину до соотношении вклшившвгося в поли-^-ок-сибутират за 15 минут инкубации из [j-I4ç]-, [2-I4CJ глюкозы в [¡2-*4cJ ацетата .Из еаатата включение было заметно висе, чей гэ глюкозы, что, по-ждкыомуестественно, так как апетяд-СоА слу-гат исходным соедднендвм для синтеза ПОМ ( senior , Dawe» , IS73; oedme . s«hi.g«i ti.97?]*, г T* л

Включение метка в ООН із [l-I4CJ- в [2-I4çj глюкозы в обоих опытах было Слигкдм.Ба наш взгляд, этот факт является насколько неохиданнш.Объяснхть его модно, если предполохать в бактероидах наличие активных карбоксхдирупаах систем, которое позволяют рвутнлизироватъ- .часть ^4С0г, выделившегося в процессе дыхания я вернуть его, прегде всего, в систему обкева органических кислот - предшественников синтезе HOU (Романов Я др.,18806).

Э.Нокотоиые федааягы цикла Кребса в бактероидах клубеньков лпгчтга .

Из литературы известно, что обмен ВОЙ у шкроорганизмов тео-не&тии обрезом связан с функционированием цикла трикарбоноьыд кислот, через, котоїкй и происходит окисление шетил-СоА, обр&-зухцагося при распаде ООН ( Senior ,I973;oedltg,

еоы«в«1 ,1973) .Наличие этого цикла в бактероидах выжомии не было показано, поэтому одной из задач настоящей работы сало выяснить, имеется ли цикл Кребса в бактероидах ru. inpmi в связано ли «го ЗУ гадаондровеняе о процессом аэотфвксасии.

В бактероидах нл. îupmi вами были обнаружены высоки» активности штрат(«1)-сангазн, а также азоцитрат-. малат- і сук-цинатдегядрогеиаз.Важпо отметить, что, как ведпо аз Гес.5, уровень активности всех ферментов в процессе Бегетзсжи растений положительво коррелирует с интенсивностью процесса азотфнксапии. Одновременно на атом же материале в совместное работе с сотрудниками кафедри биохимии Воронежского университета было доказано, что все метаболита цикла араоса активно метились из различных 14С-редиоактввных предшественников (Романов к д; .,19606).

Из всех втих данных был сделан вывод о том* что шш трдоар-бововых кислот функционирует в бактероидах Нй.іиріпі .Это

Дни после ПОСАдКИ РАстений

Віс.5.Интенсивность азотілксасаа а активность фврааятоз пекла Кребса {иккода■кж^-^мг белка"1) э бактероида* клубеньков лшдва в процессе разнятая растений; !4ДГ - мадатдегадрогеназа.

позволяет bsh связать Обмен COU с пвмом Кребса, ксторк2, по--видиыому, играет вахвейвув роль в энергетическом обеспечено* процесса фдксацвд азоте.

ЗАШЯЕКИЕ

Spa. изучения вопроса о взаимосвязи между процессом азотфдк-сапии в сбивной SOU в бактероидах разлачные подход» дели результаты, которые хоропо согласуется между собой.Во всех cryчаях Сало показано, что содержание ПОК в бактеровдад везначвтель-по именно тогда, когда клетке дагболее активно фиксирует азот, а,значит, а потребности её в внергж* л лоточниках углерода осо-

U {,itiûino5«Ht

ШК UMA КРЕ6СА )

^^ NAÙ(Р)H

р^Р < ^ (_ X (?)

XI

\

ч

И И ТРОГЕ НА ЗА

\

\

Uj 1

Л ' ^ /

/

У

Pac.e.Cxeiia взаимосвязи сбаава пслх-д-оксибутирата ж Свтл роадах Riiscbiitx . с аазтфиксааией s фотосинтезом.

бенно велики.В »тот хз момент о смен ПОЗ! происходят наиболее ан-тонсивно, что свидетельствует о его Еахной рола как запасного вещества бактероидов,-которое является источником энергии в углерода.

Результата ошто& по затеинешш растений а данные по Екдлче-ши> С в ОСЫ указывав? на то, что синтез поламера осуществляется за счёт фотоассшшдятов а оба ев его тесно связав с процессом фотосинтеза.

На Рнс.6 сгеиатяческя представлена взаимосвязь обмена НОУ с процессами asoTíaxcacaa н фотосинтеза в бобовом растении.На основа над подученных результатов мы считаем, что часть фотоасси-кздятов, поступивши в бартережды, резервируется г виде ПОМ я затем используется по пере надобности, причём метаболазм этого . поиаера тесно связав с паклен трекарбоновых кислот.

Известно, что ддя аортального функционирования ватрогенаэы необходимо обледенив pasa условий, среда которых важнейшим являются вадачзе восстановителей и 'энергия в виде ДТР.Йз схеки . ÍPne.6) видно, что при распаде ПОМ может образоваться как RDÍPJH (асточнак электронов), так и АТР.

Ш11 явджг.са уникальных запасный веществом бактероидов ам-хоЭДяз, поскольку а пзриод интенсивной азэтфвксасни полдаер находится э состоянаа ектавного обаена.Его содерланде зависит от реэнлеу ыезду скорости) поетушэвжя углеродных субстратов в клетку, что определяется, прежде всего, штенсавностьо фого-ехдтеэя^н скорость» их использования - то есть ивтенсивпостьо дыхаяжя а азотфиссасия .Ло-вщдавому» роль ПОМ зашгшается в регуляции потока фотоассдмядятов, поступагоих в бактероида.

Uh считаем, что поди-^-океябутарат в бактероидах SiUoMun является вахной составной частыэ активного метаболического фонда углеродннх субстратов я.такгм образом, служат одним гз звеньев пепа, сЕязыващей процесса азотфидеащи в фотосинтеза j бобовых рестенлЗ.

В Н 3 О Д Ы

1.££зрэботан ыетод определение поли-%Р-оксибутарата в клетках клубеньковых бактеркг с использована ем дористих стеклянных дзсков.Кетод позволяет определять полимер одновременно в Сольгом количестве образцов с кишшальшма затратами реактивов.

2 Л становлено, что при эффективной симбиоза в процесса вегетация корловнх бобов, а также пря сравнения эффективны! и неэффективных бактероидов клубеньков драйва, бобов и гороха соблюдается явление обратной корреляции мехду снтенсивностью азотфик-оащи в дяхдния бактероидов, о одной сторона, и содержанием в них долз-р-оксишсдяной кислоты, с другой,

3.Интенсивность адотфихсапдд л длхпнжя на ^-оксдбутирвте бактероидов бффеитввных нтацмоэ бобов и -ктстича в полночь била аа 20-50% неге, чей в полдееь.Со деріанде поли-^-оксибутирата, наоборот, было вкша » "ночных* бактероидах.

4.Б опытах по затемнених» растений ігтаилч показано, что Ера "шклшении", а затем возобновлении зропесса фотосЕнтеэа интенсивность аэотфкксвпяи а содержание доли-£-окслбутирата в бакте-роядах связаны иегду собой обратной зависішостьа, причём фотосинтез оказывает репащее влияние на гзиевение этах сог-аза гелей.

5Ліра экспозиции сеетунах растений дшина в атмосфере 14С02 на свету за 19 часов вкаггаенвв метки в клубеньки, бактероида .и ПОЫ возрастало значительно и почти пареллельно, при этом содержание додимера практически нв~ менялось за врекя эеслозегши.Из этого следует, что в период активной азотфиксашг в бактероидах происходит одновременно в синтез Д0Ї£, в его распад.

6.В бактероидах йі. іорісі , установлена высокзя активность ферментов .синтеза и распали ПОМ: ацетид-СоА-апетилтраяо-феразн, а де тоа це тил-СоА-редуктэ зы, ПОМ-де полимера за, ¿-гидрок-свбутиретдегидрогеназа и СоА-тренсферазы З-катокасдот.Показано, что в процессе вегетаспл растений ляшша активность всех перечисленных ферментов быка максимальной в период снтансаваой аэотфяксапии, когда содерхаше поля-^-оксибутирата в бактероидах било мддицадьно. >

7 Лра инкубации изолированных бактероидов елективного штамма рь. іиріпі с мечеными по гдекозой в ацетатом обнаружено, что метка включалась в пшш-р-оксибутират, причём из адета-та иишченае ело намного актлваев.

8.Показано, что в бактероидах клубеньков лпиша активность ряда ферментов цикла Кребса (цитрет(в1)-сиытазы, вэопитрет-, сукшнат- и ыалатдегядромназ) в процессе вегетации растений

волох&тшьво коррелировала о яятоисввяостьо авотфяхсац&и.

9,На основания полученных результатов мохяо заклшагь, что часть фотсоесяивлятов, поступавших в бактероида, резервируется в вмд® солж-^-оксабутярата к затеи жсяолъэуется на обеспечение процеоса азотфвжсапия»

Список габст* опубликованных со мяте реалам диссертация.

I. романов В.И..Шрамзо В.И..«едудова Н.Г..Крвтович ВЛ.,1976. Азотфкксаятя х содерханве поли-^-оксаяасляыоЗ кислоты в бвКТвроидЗХ ВЫмМш lupial В ВМмМот legunlcoaeru«.-

Швзаол.рвствниЗ,т.23,*6,II49-II53.

2» tr»tOTiei> H.L.,Kom»nor V.I..Yuehlcora L.Д. ,Shram*о V. I. ».Pedal«»* Л.С. , 1977.lTlt.rcc»n fixation *пй pol y-JJ-hydroxytutj-yie «old contact In becterolde of Rhlzobiun luplnl jund Rhl-

3. Рсюаноз В.Й..Свдудовз Н.Г..Шреико В.И.,Ыодчанов М.И.Дрето-IX* В Л. ,1978. Метаболизм полг-£-оксацаслявоЗ кислоты в бяхтврогшх клубеяысоа лгсяяа л его связь с пропзссамя ааотфиксадак а фотосиятеза.-Сазисыирастениа,т.25>*4,с.72б-730. *

•4. Романов ВЛ*,Шрвкш1 В.И.,Федулова Н.Г.,1980, Модифицированный метод определения волл-^-оксимасляноЯ кислоты*- В / сб.«ето;ыЛ!осхва*Нау*а,кн.2»сЛ21-124.

5. Оедулова Н.Г. Зеленская И.Е.,Романов В.И.Дретовет B.JJ., 1980* Фермата обмена пала-£-оксябутврйта в бактероидах аМгсМшгП luplnl.- Сгзийа.рвстеЕдЗ,т.2б,КЗ,с.544-548.

. 6. Рсуанса ВЛ.,Седудова Н.Г..Чераепсаан И.Б.,197Э.Поли-^-оксибутарат - »«очник энергии к углеродных субс-

гратов в бактероидах Bhisobiua lupini.-Тезисы стендового доклада ва U Всесоюзном биохимическом съезде Дениигред. Москва,Вагка,с.262.

7V Рока нов В.И., Иванов Б.Ш. »Федулова В.Г.,ййх1:;штегн Ы.В., Чермвскаи И.Е. ,3е»4лянухяв Л.А.,Кретович В Л.,1900. О fine fl глюкоза в изолированных бактероидах клубеньков juqok-аа.-Еиохиыия.тИб (в печати).

В* Важ»оо»-Т.І*,Твао1оУв H.О,,TehtreaBakaya I.E. (Shj-eako T.I., Kolcbanor Ж.І.,Kreto*icb W.I.. ,1900. S»ta^ôlies of polj-р-hyüraxjbntTTi« »et« In baot*r«iûe of ВМгоМет leplnl la «cmneetion «ith nitroeen fixation май phate»7ath»ela.-•Flut tsí Sell, /tu ргааа/.

ЗАКЛ79. ТИР, ISO. ВЦ ВНИИКОі. Т—00553.ОТ ІЗ.О4.10вОг.