Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1

Пустовалова, Ольга Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1"

На правах рукописи

ПУСТОВАЛОВА Ольга Леонидовна

00349456Б

свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2010

003494566

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета (МГУ) имени М.В.Ломоносова, в ФГУ "Федеральный Научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научные руководители:

доктор биологических наук Агапов Игорь Иванович

Федеральный Научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова

кандидат биологических наук Мойсенович Михаил Михайлович

МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва;

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович ФГУП «ГосНИИгенетика»

кандидат биологических наук Демина Ирина Андреевна

ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится «/,'» апреля 2010 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545 Россия, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика». Реферат разослан « ^ » марта 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук

Воюшина Т. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молекулярной биологии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Основой искусственных тканей становятся носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства медицинского изделия. В наше время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и более того, могут служить высокоэффективными биостимуляторами. Уникальным материалом, сочетающим высокую прочность и эластичность, является шелк паутинной нити. Эти свойства, наряду с хорошей биологической совместимостью, делают шелк перспективным материалом для использования в тканевой инженерии. Однако получение природного паутинного шелка связано со значительными трудностями и обычно нерентабельно, а количество шелка недостаточно для широкого практического применения. Успехи в расшифровке генов паутинных белков и создание их рекомбинантных аналогов позволило получить материалы, подобные природному шелку. В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а также возможность их практического использования. В ГосНИИгенетика ранее был получен белок 1F9 - аналог спидроина 1 Nephila clavipes [Богуш В.Г. и др., 2006; Bogush V.G. et al., 2009], который может стать основой при создании матриксов для тканевой инженерии

Цель работы: получить и исследовать биологические свойства трехмерных матриксов из рекомбинатного аналога спидроина 1 для применения в тканевой инженерии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать методику получения искусственных матриксов, изучить их физические, морфологические, топографические свойства и скорость деградации в модельной системе.

• Изучить способность искусственных матриксов поддерживать адгезию, пролиферацию и жизнеспособность культивируемых эукариотических клеток.

• Изучить местное действие матриксов после имплантации в ткани животных.

макро- и микроструктурные особенности эти конструкций, их механические свойства и способность к деградации, а также возможности химической модификации. Мы показали, что матриксы из аналога спидроина 1 способны поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток in vitro. Впервые было изучено местное действие матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации в ткани животных. Показано, что после имплантации материал подвергается биодеградации и замещается васкуляризованной новообразованной тканью.

Практическая значимость. Спидроины, обладают уникальным сочетанием механических свойств, являются биосовместимым, биоинертным материалом, способным к биодеградации. Разработка методов получения рекомбинантных аналогов этих белков расширила возможности практического применения спидроинов. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 можно использовать для создания конструкций медицинского назначения, таких как имплантаты для замещения дефектов ткани, целостность которых не может быть восстановлена естественной физиологической репарацией. Матриксы могут служить основой для создания трехмерных клеточных культур in vitro для моделирования различных биологических процессов, например, для изучения процессов репарации и клеточной миграции. Культивирование клеток в трехмерной среде расширяет возможности исследования нормальных физиологических функций клеток и влияния на эти функции микроокружения и топографии субстрата. Внедрение новых медицинских технологий и создание новых моделей для исследований в клеточной биологии позволяет серьезно продвинуться в области восстановительной медицины и решить ряд значительных медицинских проблем биотехнологическими методами.

Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на X Китайско-Российском Симпозиуме «Новые материалы и технологии» (г. Дзясин, 2009). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ от 23 октября 2009 г и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» от 25 февраля 2010 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и 2 таблицы. Библиография включает 173 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 ФИЗИЧЕСКИЕ, МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТОПОГРАФИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1

1.1 МАКРОСТРУКТУРА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ

Пористые матрицы из спидроина 1 получали методом выщелачивания, с использованием NaCl в качестве порообразующего агента. Структуру полученных матриц изучали методами световой и электронной микроскопии. На рисунке 1А представлено изображение среза пористой матрицы из спидроина I с макропорами диаметром до 400 мкм, что соответствует размеру порообразующих частиц. Также мы изучили структуру матриц в водной среде, которая способствует изменению конформации макромолекул полимера [Vehoff T. et al., 2007]. Было выявлено, что в водной среде не происходит деформации макропор и изменения их диаметра (рисунок 1Б). Диаметр макропор влияет на механические свойства матрицы, скорость биодеградации, взаимодействие клеток с ее поверхностью [Lee J.J. et al., 2007; Ma P.X. and Langer R., 1999; O'Brien F.J. et al., 2007] и тканевый ответ после имплантации [Wang Y. et al., 2008]. Предпочтительным для создания имплантатов является большой диаметр макропор, как в полученных матриксах.

Макропоры матрикса представляют собой незамкнутые полости, соединенные каналами и отверстиями и такая структура сохраняется в водной среде (рисунок 1).

Рисунок 1. Макропористая структура матриц из аналога спидроина 1.

Макропоры имеют незамкнутое строение и соединены каналами и отверстиями, что показано методами (А) сканирующей электронной микроскопии, (Б) сканирующей лазерной конфокальной микроскопии. Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов слоя матрицы (45 мкм). выполненных с интервалом 0,9 мкм. Материал матрицы визуализирован ТИТС.

Соединенность пор матрицы также подтверждена тестом на проницаемость пористых конструкций для суспендированных окрашенных

частиц (тушь) [Gellynck К. et al., 2008Ь]. Незамкнутая структура матрицы способствует миграции клеток во внутренние слои искусственного матрикса, обеспечивает обмен питательной среды и удаление продуктов метаболизма. Такое строение необходимо для трехмерного культивирования клеток и создания гомогенной среды внутри матриц.

1.2 МИКРОСТРУКТУРА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ

Стенки макропор матрикса имеют микропористую структуру, которую при агрегации рекомбинантный спидроин 1 формирует спонтанно (рисунок 2).

Рнсунок 2. Микропористая структура матриц из аналога спидроина 1. (А)

Структура показана методом электронной микроскопии. (Б) Микропористое строение матрикса в водной среде показано методом лазерной конфокальной микроскопии. Матрикс визуализировали конъюгацией с TR1TC

Поверхность макропор матрикса пронизана отверстиями малого диаметра (2-10 мкм). Наблюдать такую структуру можно как в дегидратированном матриксе (рисунок 2А), так и в водной среде (рисунок 2Б). Ранее было показано, что пленки [Bogush V.G. et al., 2009] и фибриллы [Соколова О.С. и др., 2009] из рекомбинантного аналога спидроина 1 также имеют микропористое строение. Однако такая микроструктура не является характерной особенностью полимеров других видов шелка. Натуральные паутинные нити обычно имеют гомогенную структуру, как показано для нитей каркасной нити паугины Nephila senegalensis [VehofFT. et al., 2007]. Образование микропористой структуры может быть свойственно другим аналогам паутинного шелка, и этот вопрос требует дальнейшего изучения. Однако было показано, что гомогенное строение без микропор свойственно нитям из рекомбинантного миниатюрного аналога спидроина Euprosthenops aiistralis [Stark М. et al., 2007] и из аналога спидроина Araneiis diadematus [Lazaris A. et al., 2002].

Микроструктура поверхности матрицы влияет на адгезию клеток и на взаимодействие с окружающей тканью после имплантации [Bacakova L. et al., 2004а; Cai Q. et al., 2002; Campbell C.E. and von Recum A.F., 1989; Lampin M. et al., 1997; Mata A. et

al., 2003; Singhvi R. et al., 1994; Von Recum Andreas F et al., 1996]. Значение уникальной микропористой структуры полученных нами матриксов может быть выяснено при изучении роста и пролиферации в них эукариотических клеток in vitro и ответа со стороны реципиента при имплантации матриц.

1.3 ДЕСТРУКЦИЯ МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1

Мы изучили деградацию матриксов из рекомбинантного спидроина 1 при продолжительной инкубации в нейтральной и окисляющей средах. Искусственные матриксы были стабильны в нейтральной среде. В течение 11 недель их масса изменялась не более чем на 20 % (рисунок 3).

Рисунок 3. Деструкция матриксов из аналога спидроина 1 в фосфатио-солсвом буфере (ФСБ) и в реактиве Феитоиа.

После имплантации таких матриксов в ткани животных, они могут подвергнуться воздействию агрессивной окисляющей среды, которая формируется при развитии реакции на инородное тело. Химия реакций клеточного ответа может описываться реакцией Фентона [Winyard P.G. et al., 2009].

Мы смоделировали такие агрессивные условия in vitro и изучили скорость деструкции матриц из аналога спидроина 1 в реактиве Фентона. Под воздействием гидроксильных радикалов реактива Фентона матрикс из рекомбинантного спидроина 1 разрушается на 73 % к 4-й неделе и полностью разрушается к 11-й неделе. Быстрая деградация материала предполагает и биорезорбцию тканеинженерной конструкции из спидроина 1 в условиях выраженного клеточного ответа.

Для повышения устойчивости к действию окисляющей среды, мы использовали метод ковалентной перешивки полимеров матрицы глутаральдегидом. Деградация обработанного матрикса в реактиве Фентона после перешивки была значительно менее интенсивной в сравнении с деградацией необработанного матрикса (рисунок 4).

I ФСБ

1 РеактивФентона

80 60 40

01234567 11 Время инкубации, недели

Рисунок 4. Деструкция перешитых глутаральдегидом матриц из аналога спидроина 1 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и в реактиве Фентона.

Реактив Фентона разрушает

модифицированный матрикс через 4 недели на 27 %, и только к 14-й неделе масса уменьшается на 42 % (рисунок 4). Медленная деградация матрикса, перешитого глутаральдегидом, будет способствовать его значительной устойчивости и стабильности.

1.4 МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МАТРИКСОВ

Природные спидроины сочетают высокую прочность и эластичность [Cunniff P.M. et al., 1994]. Мы изучили механические свойства пористых матриц, изготовленных в форме брусков из рекомбинтного аналога спидроина 1. Значения предела прочности и растяжимости матриксов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Механические свойства матриц из рекомбинантного аналога спидроина 1

Тип матрикса Предел прочности на разрыв Растяжимость

Матрикс из спидроина 1 9,8±0,8 Н/см2 275±20%

Модифицированный глутаральдегидом матрикс 16±0,7 Н/см2 350±34 %

Полученные данные предполагают, что исследуемые трехмерные пористые матрицы могут быть хорошими кандидатами для имитации физико-механических свойств эластичных тканей. Однако значения механической прочности полученных матриксов меньше, чем ожидалось, исходя из известных из литературы данных о прочности природного спидроина. Однако другие аналоги спидроинов 1 Nephila clavipes, которые были получены разными исследовательскими группами, также уступают в прочности природным белкам [Fahnestock SR, 1994; Seidel A. et al., 2009b]. Такая разница может быть связана со сравнительно небольшим размером макромолекул полученных белков-аналогов и отличиями в аминокислотной последовательности [Candelas G.C. and Cintran J., 1981; Jackson С. and Obrien J.P., 1995; Sponner A. et al., 2005].

Метод ковалентной перешивки матриксов улучшает показатели механической прочности и растяжимости матриксов из аналога спидроина 1 (таблица 1). Возможность модификации свойств матриксов из аналога

спидроина 1 в будущем позволит разработать тканеинженерные конструкции, обладающие широким спектром характеристик, удовлетворяющих потребностям разных направлений тканевой инженерии.

2 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТИОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА1

2.1 ВЛИЯНИЕ МАТЕРИАЛА ИЗ РЕКОМБИНАНТИОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК

Мы изучили возможность использования рекомбинантного аналога спидроина 1 в качестве субстрата для адгезии эукариотических клеток. Для изучения способности к адгезии и пролиферации клеток к матриксу нами был использован метод количественного подсчета прикрепившихся клеток. Для этого использовали неинвазивный метод сканирующей лазерной конфокальной микроскопии, позволяющий изучать препараты значительной толщины без нарушения их трехмерной архитектуры. В качестве контролей были выбраны хорошо изученные адгезионные поверхности - стекло и регенерированный фиброин ВотЫх топ. Последний является наиболее изученным типом шелка в тканевой инженерии.

Способность фибробластов к адгезии на поверхности пленок из спидроина 1 оказалась выше, чем на стекле. Количество клеток на поверхности пленок из спидроина 1 и фиброина было сопоставимым, что указывает на хорошие адгезивные свойства исследуемого материала (рисунок 5).

Рисунок 5. Динамика роста культуры эукариотических клеток на поверхности полимерных пленок.

Для изучения влияния материала на динамику роста, фибробласты ЗТЗ культивировали в течение 4 дней после их адгезии на поверхности пленок и сравнивали количество клеток на поверхности площадью 1 мм2. В первые сутки культивирования количество прикрепившихся клеток изменилось незначительно. На 4-е сутки на поверхности пленок из аналога спидроина был сформирован монослой клеток. Спидроин 1 по способности поддерживать рост и адгезию эукариотических клеток не уступал регенерированному фиброину, и количество клеток на поверхности пленок из этих полимеров на протяжении всего времени культивирования было сопоставимым (рисунок 5). Поскольку изделия из регенерированного шелка шелкопряда ВотЫх топ оказывают некоторое стимулирующее действие на рост стволовых мезенхимальных клеток

_____ ......

350

Спидроин1 В Фиброин ,-„™8125

■

* 300 П Контроль 270±К> го

* 250 о

Е 200

§ 150 С

50 „^213 36+33812 И

40минут 1день 4дня Время культивирования

[Мете1 Ь. & а1., 2005Ь], субстрат из спидроина 1, вероятно, также может эффективно стимулировать клеточный рост.

2.2 ВЛИЯНИЕ АРХИТЕКТУРЫ ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК

Способность трехмерных матриц поддерживать рост и адгезию эукариотических клеток также определяется их микроархитектурой [Васакоуа Ь. е1 а1., 2004а]. Было изучено влияние архитектуры матриксов из спидроина 1 на адгезию мышиных фибробластов. Клетки фибробластов ЗТЗ прикрепляются к поверхности матрицы в течение первых 2 часов после инокуляции. Морфотип клеток на поверхности матрицы (рисунок 6) типичен для фибробластов, что предполагает формирование хороших условий для адгезии.

Рисунок 6. Морфология фибробластов ЗТЗ на поверхности пористой матрицы из аналога спидроина 1. Изображение получено методом сканирующей электронной

микроскопии. Представлен срез глубоких слоев матрицы с мигрировавшими в них клетками.

Для оценки роста и адгезии эукариотических клеток определяли количество клеток в искусственных матриксах после инокуляции и в процессе культивирования (рисунок 7).

После инокуляции количество прикрепившихся клеток было сопоставимым на поверхности матриц из спидроина и матриц из регенерированного фиброина / с в качестве контроля адгезии и роста клеток).

Рисунок 7. Изображение,

использовавшееся для подсчета клеток. Представлена горизонтальная проекция серии из 100 оптических срезов от поверхности на глубину до 99 мкм, полученных методом конфокальной микроскопии. Метрике выявлен ТШТС (показан красным), ядра фибробластов ЗТЗ выявлены БУТОХ (показаны зеленым).

Мы наблюдали увеличение количества фибробластов на 3-ий и 14-ый день культивирования, свидетельствующее об активной пролиферации (рисунок 8).

5000 I 4500 и 4000

0 3500

1 3000

4105±320

Хдень 3 дня 14 дней Время культивирования

Рисунок 8. Динамика роста популяции мышиных фнбробластов ЗТЗ в пористых матриксах.

На поверхности матриц из спидроина I через сутки после инокуляции и на протяжении всего времени

культивирования были обнаружены делящиеся клетки. Присутствие таких клеток характерно для клеточной популяции, находящейся в стадии роста.

2.3 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК В МАТРИЦЕ

Для создания искусственных тканей и органов на основе искусственных матриксов необходимо равномерное распределение в нем клеток и однородное прорастание тканью [Ma Р.Х. and Langer R., 1999; Rose F.R. et al., 2004; Silva M.M. et al., 2006]. Мы изучили распределение клеток при культивировании их в пористых матриксах.

Было показано, что фибробласты располагаются на поверхности макропор матрицы, и единичные клетки углублены в стенки макропор (рисунок

9)._

Рисунок 9. Фибробласты ЗТЗ на стенках макропоры матрицы. Оптический срез в 50 мкм от поверхности матрицы. Матрикс выявлен TRITC (показан красным), ядра фибробластов выявлены SYTOX (показаны зеленым).

•Г

ft \

Была изучена динамика изменения распределения клеток в трехмерной матрице в процессе двухнедельного культивирования при поверхностной инокуляции, усредненного по всем слоям матрицы. При культивировании было показано увеличение общего количества клеток (рисунок 10)

ï ш О

S61±11S i

Рисунок 10. Увеличение общего количества клеток ЗТЗ в 1 мм3 матрицы при культивировании в течение 14 дней.

Через 24 часа после инокуляции распределение клеток было крайне неравномерным по толщине матрицы. Прикрепившиеся клетки были

преимущественно расположены на той же поверхности, на которую были инокулированы. На глубине более 200 мкм от поверхности были выявлены лишь

Время культивирования ■ 1день а4день П14день

единичные ядра клеток. Через две недели культивирования при общем увеличении количества клеток, их распределение по толщине стало более однородным, и плотность клеток в глубоких и наружных слоях матрицы стала сопоставимой (рисунок 11).

Рисунок 11. Изменение распределения фибробластов ЗТЗ в матрице из спидроина 1 при культивировании.

100 90

70 60

11*

I §5°

Ï 5 40 S « зо

S 20 Ï ю

о о

5 Время культивирования

1день 14день

□ 1-150 мкм от поверхности

□ 150-300 мкм от поверхности ■ 300-450 мкм от поверхности

Увеличение общего количества клеток через 14 дней в наружном и внутреннем слоях было неравномерным: на глубине до 150 мкм количество клеток возрастало в 2,5 раза, а на глубине более 300 мкм в 11 раз. Наблюдаемая однородность распределения клеток могла быть достигнута благодаря активной миграции клеток во внутренние слои искусственного

матрикса [Mandai В.В. and Kundu S.C., 2009b; Raeber G.P, et al., 2007], чему способствует соединенность макропор. Интенсивное увеличение количества клеток во внутренних слоях матрицы также может объясняться большей скоростью пролиферации, чем на поверхности.

2.4 ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1

Длительное поддержание жизнеспособности клеток необходимо для успешного применения матрицы в качестве субстрата для создания трехмерных клеточных культур. Мы культивировали фибробласты в матрицах из спидроина 1 в течение 7 дней и наблюдали за изменением соотношения живых и мертвых клеток в культуре. В это время также проявляется токсическое действие, влияющее на жизнеспособность клеток, которое могут оказывать компоненты материала. Для дифференцирования живых и мертвых клеток применили метод, основанный на избирательной проницаемости целостных и

поврежденных мембран клеток для пропидиум йоднда (визуализирует ядра мертвых клеток) и БУТО 9 (визуализирует ядра живых клеток) (рисунок 12).

« ■* 4 М

• 4 * % „ • • «

* -• • ... * V*

« П --- • • • .Л-* « * . : * • п V »

Ш 50 ^т и

Рисунок 12. Жизнеспособность популяции клеток при культивировании фибробластов в матрице из снидроина 1. (А) Через сутки культивирования на поверхности матрицы присутствовали живые клетки, выявленные БУТО 9 (показаны зеленым), мертвые клетки, ядра которых выявляли пропидиум йодидом. не обнаружены. (Б) Через 7 суток культивирования количество фибробластов возросло, выявлены мертвые клеши (показаны красным).

В первый день инкубации все клетки, прикрепившиеся к поверхности, были жизнеспособны. При культивировании общее количество клеток увеличивалось, но появлялись мертвые клетки. В популяции присутствует значительное количество делящихся клеток, выявляемых по наличию веретена деления (рисунок 12). Увеличение количества клеток сопровождалось инфильтрацией фибробластами глубоких слоев матрицы. При культивировании клеток в тех же условиях на поверхности стекла происходило снижение количества жизнеспособных клеток (рисунок 13), но при этом клетки достигали стадии монослоя, что является пределом роста адгезионных культур на плоскости.

Рисунок 13. Жизнеспособность фибробластов ЗТЗ при культивировании в матрице из аналога спидроина 1 или на плоской поверхности. Жизнеспособность выявляли по количеству живых клеток в культуре, ядра которых визуализированы БУТО 9.

Высокая степень жизнеспособности клеток при культивировании их в матрице подтверждает отсутствие токсического действия спидроина 1 на культивируемые эукариотические клетки. Возможность длительного поддержания жизнеспособности

I В матрице □ На плоской поверхности

100 % 100 %

П 40

80%

1день 7 дней

Время культивирования

культивируемых клеток в матрице связывают с большей площадью поверхности в трехмерном пространстве. Но жизнеспособность культуры на поверхности и в глубине матрицы может существенно отличаться. Было показано, что количество мертвых клеток на внешней поверхности матрицы значительно превышает количество мертвых клеток на глубине более 60 мкм (рисунок 14).

Рисунок 14. Жизнеспособность клеток в поверхностных и глубоких слоях матрицы через 7 дней культивирования. Показаны клетки (А) в поверхностных слоях и (Б) на глубине 20-120 мкм. Ядра живых клеток выявлены SYTO 9 (показаны зеленым).. Ядра мертвых клеток выявлены пропидиум йодидом (показаны красным). Представлены горизонтальные проекции серии оптических срезов матрицы на глубине до 20 мкм и на глубине 20-120 мкм общей площадью 0.6 мм2

На поверхности соотношение живых и мертвых клеток достигало 3:1, а на глубине более 60 мкм было менее 8:1. Таким образом, даже при однородном распределении клеток в толщине матрикса, в глубоких слоях популяция более жизнеспособна, чем на поверхности. Таким образом, поддержание адгезии, пролиферации и жизнеспособности клеток в матриксе из спидроина 1 свидетельствуют о формировании благоприятного микроокружения в глубоких слоях матрицы.

2.5 АДГЕЗИЯ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК В МОДИФИЦИРОВАННЫХ МАТРИКСАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1

Выше было показано, что ковалентная перешивка матриксов глутаральдегидом замедляет деградацию матриц и повышает их механическую прочность. Для изучения влияния ковалентной перешивки матриц на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток, мы культивировали на перешитых матрицах фибробласты ЗТЗ в течение двух недель. В качестве положительного контроля были использованы немодифицированные образцы. После инокуляции количество клеток на поверхности матриксов, перешитых глутаральдегидом, было значительно меньше, чем в контроле, что предполагает формирование менее благоприятных условий для адгезии. При двухнедельной инкубации общее количество клеток в матриксе, модифицированном глутаральдегидом, было в среднем в 20 раз меньше, чем в необработанном (рисунок 15). Применение других агентов для перешивки может улучшить

физические характеристики матриксов из рекомбинантного спидроина I без негативного влияния на рост эукариотических клеток.

Структура рекомбинантного шелка значительно отличается от макромолекул межклеточного матрикса животных тканей [Craig C.L. and Riekel С., 2002], и трехмерные искусственные матриксы, изготовленные из полимеров шелка, не могут создать естественное микроокружение для культивирования клеток. Поскольку к свойствам материалов, служащих субстратом для создания трехмерных клеточных культур, предъявляются повышенные требования, используются различные методы модификации поверхности полимеров, призванные повысить их биосовместимость. Одним из методов является обработка культуральной поверхности веществами, такими как коллаген, облегчающими адгезию клеток. Через сутки на поверхности матриксов обработанных коллагеном и не обработанных было сравнимое количество клеток (рисунок 15).

В первые три дня культивирования количество клеток в матриксах, обработанных коллагеном, возросло в 2,5 раза и было больше, чем в контроле. Через 2 недели количество клеток возросло в 7,8 раз, и было сопоставимо с количеством клеток в контроле (рисунок 15).

5000 4338±384 4500±195 Рисунок 15. Рост и адгезия

■ Немодифицированный .

............р- мышиных фибробластов ЗТЗ в

матрицах с модифицированной поверхностью.

В Функционалиэированный

коллагеном □ Модифицированный глутаральдегидом

Таким образом, обработка коллагеном матриксов из спидроина 1 существенно не повлияла на адгезию и клеточный 1 день здня 14 дней Рост ПРИ двухнедельном

Время культивирования КуЛЬТИВИрОВаНИИ. СтЭТИСТИЧеСКИ

значимое отличие в количестве клеток наблюдалось на третий день культивирования, когда в функционализированном коллагеном матриксе было в 1,5 раза больше клеток, чем в контроле.

Отсутствие значительного преимущества культивирования клеток в матриксах. обработанных коллагеном, может быть связано с неравномерным или недостаточным распределением молекул коллагена в пористой структуре. Так, согласно литературным данным, обработка материала коллагеном может влиять на адгезию клеток, но, как и в нашем эксперименте, не влияет на пролиферацию при долговременном культивировании [1л X. е1: а1., 2008].

2.6 ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛИМЕРА ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ МАТРИЦ ИЗ СПИДРОИНА I НА АДГЕЗИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Плотность материала и структура матрицы определяется условиями ее изготовления, и концентрация раствора полимера, из которого формируется матрикс, играет немаловажную роль. Поскольку структура искусственного матрикса влияет на адгезию и рост клеток, уменьшение концентрации полимера повлечет за собой изменения в способности поддерживать клетки в культуре. Для изучения влияния на биологические свойства концентрации полимера при изготовлении искусственных матриксов, получили пористые матрицы из растворов полимера 300 мг/мл, 100 мкг/мл и 60 мкг/мл (рисунок 16). 11олученные матрицы были использованы для культивирования клеток. Через сутки после инокуляции, количество фибробластов на поверхности матриц, изготовленных из раствора с концентрацией полимера 300 мг/мл, было в 3 раза больше, чем в матрицах из раствора с концентрацией 60 мкг/мл. Последнее позволяет заключить, что в матрицах, изготовленных из растворов с меньшей концентрацией, формируются менее благоприятные условия для адгезии клеток. При двухнедельном культивировании разница в количестве клеток

Рисунок 16. Динамика роста фибробластов ЗТЗ в матрицах, изготовленных из аналога спидроина 1 с концентрацией 60, 100 и 300 мг/мл.

В матрицах из раствора с меньшей концентрацией прирост количества клеток был более интенсивным. Это может быть связано с меньшей площадью поверхности

культивирования, которая

формируется в матриксах,

изготовленных из концентрированных растворов. Меньшая площадь поверхности культивирования сокращает период времени, необходимый клеткам для формирования монослоя, после чего их пролиферативная активность уменьшается за счет контактного торможения.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ МАТРИКСОВ ИЗ АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ

Было изучено местное действие трехмерных матриксов в экспериментальной модели in vivo для выявления возможного негативного влияния материала на ткани реципиента, способности матриксов поддерживать ангиогенез и новообразования ткани. Матрицы были имплантированы под кожу лабораторным мышам и через два месяца после имплантации матриксы извлекли. Для изучения были использованы традиционный анализ

2 SC00

гН 7000

СО

X 6000

<и ег 5000

2¿

О со 4С00

J 40

§ 30

V 20

3 10

ю О 0

□ бОмгДм S! 100 мг/мл «300 мг/мл

470SÍ227

¿558+38

r-hjJ

1день 14 дней

Время культивирования

гистологических срезов имплантата и новообразованной ткани и in situ выявление сосудов флуоресцентными красителями для трехмерной реконструкции сосудистого дерева методом конфокальной микроскопии. Работа проводилась совместно с к.б.н., ст.н.с. кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ Васильевой Т.В.

3.1 ИНТЕГРАЦИЯ В ОКРУЖАЮЩИЕ ТКАНИ МАТРИЦЫ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ

Процесс формирования новой ткани вокруг и внутри матрикса и прорастание её сосудами является признаками хорошей интеграции имплантата. На процессы интеграции в значительной степени влияют особенности макро- и микроархитектуры имплантируемого матрикса [Campbell С.Е. and von Recum А.F., 1989; Sharkawy A.A. et al., 1997]. Через два месяца после имплантации вокруг пористого имплантата из аналога спидроина 1 образовалась тонкая (до 40 мкм) соединительнотканная (фиброзная) капсула, что является естественной реакцией ткани на внедрение инородного тела (рисунок 17).

Рисунок 17. Соединительнотканная

жировая ткань, в некоторых участках замещающая тонкую фиброзную капсулу. Наблюдается прорастание кровеносных сосудов в соединительнотканную капсулу (рисунок 17). Таким образом, капсула вокруг имплантата не приводит к его изоляции, в отличие от капсулы плотного аваскулярного типа [Sieminski A.L. and Gooch K.J., 2000].

Соединительная ткань прорастает внутрь матрикса через отверстия макропор. Прорастающая соединительная ткань также имеет вид тяжей с ориентированными вдоль них вытянутыми фибробластоподобными клетками. Клетки новообразованной ткани контактируют с поверхностью макропор матрикса (рисунок 18), которая обладает хорошими адгезивными свойствами. Обнаружены сайты активного замещения матрикса молодыми фибробластами. Последние выявлены по морфологическим признакам, таким как рыхлвый хроматин ядра (эухроматин и каличие 1 -2 ядрышек) (рисунок 18).

капсула вокруг импланта из аналога спидроина 1 пронизана сосудами (показаны стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином.

Волокна межклеточного вещества соединительной ткани, окружающей матрикс, ориентированы параллельно поверхности имплантата или расположены рыхло. Вокруг имплантата также обнаружена

Рисунок 18. Прорастание новообразованной ткани в искусственный матрикс из спидроина 1. (А) Фибробластоподобные клетки и (Б) клетки жировой ткани прорастают в искусственный матрикс. Молодые фибробласты показаны стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином.

3.2 КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ НА ИМПЛАНТАЦИЮ МАТРИЦЫ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO

Клеточный ответ на инородное тело развивается в рамках естественного ответа ткани на внедрение инородного материала [Anderson J.M. et al., 2008]. Внедрению иммунных клеток в имплантированный материал способствует микропористая текстура поверхности [Campbell С.Е. and von Recum A.F., 1989; Padera R.F. and Colton C.K., 1996]. Изготовленный нами матрикс с микропористой поверхностью способствовал проникновению и адгезии макрофагов (рисунок 19).

Рисунок 19. Клеточный ответ на имплантацию матрицы из аналога спидроина 1.

Среди клеточных элементов, прорастающих в макропоры обнаружены (А) макрофаги (показаны синими стрелками) и (Б) единичные гигантские клетки инородных тел (показана оранжевой стрелкой). Окрашен гематоксилином и эозином.

На поверхности макропор имплантированного матрикса, а также в толще материала обнаружены макрофаги и гигантские клетки инородных тел. Они участвуют в разрушении инородного материала и способствуют миграции, пролиферации и дифференцировки клеток, обеспечивая васкуляризацию соединительной ткани вокруг имплантата [Moldovan L. and Moldovan N.I., 2005; Padera R.F. and Colton C.K., 1996].

3.2.1 АНГИОГЕНЕЗ И НЕЙРОГЕНЕЗ В МАТРИЦАХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO

Активные процессы ангиогенеза необходимы для успешного новообразования ткани [Kaully Т. et al., 2009]. Было показано прорастание кровеносных сосудов в имплантированный матрикс из рекомбинантного аналога спидроина 1 (рисунок 20).

Рисунок 20. Ангиогенез в новообразованной ткани и деградация матрикса из аналога спидроина 1. Через 2 месяца после имплантации пористого матрикса из аналога спидроина 1

происходит прорастание новообразованной ткани в имплантат и частичная его деструкция. В новообразованной ткани (А), окружающей и (Б-Е) прорастающей в матрикс, выявлены сосуды (показаны желтыми стрелками) разного диаметра и нервные волокна (показаны зелеными стрелками). Деградация матрикса происходит неравномерно. По всей толщине материала стенок матрицы в результате его разрушения (Б, В, Г, Е) образовались многочисленные отверстия разного диаметра. Отдельные участки стенок макропор (Д) разрушены в меньшей степени, сохраняя исходную структуру матрицы. Окраска гематоксилином и эозином.

Среди сосудов, прорастающих в имплантат, можно различить капилляры, артериолы и венулы. Кровеносные сосуды полнокровны, что свидетельствует о соединенности сосудов с кровеносным руслом. Признаки деградации васкулярной ткани отсутствуют. Были обнаружены как хорошо оформленные сосуды, так и вновь образовавшиеся (32 %), которые отличаются структурой эндотелия с крупными ядрами ("высокий эндотелий"), имеющими в зрелом сосуде более уплощенную форму. Большое количество новообразованных сосудов свидетельствует об активных процессах ангиогенеза и тканеобразования, продолжающихся в матриксе даже через 2 месяца после имплантации. Присутствие сосудов разного типа и диаметра (рисунок 20) свойственно естественной сосудистой архитектуре ткани [Sieminski A.L. and Gooch K.J., 2000].

Большой интерес представляют выявленные нервные волокна в прорастающей искусственные матриксы из аналога спидроина 1 ткани (рисунок 20Б, 20Г и 20Д). Прорастание нервов в имплантированный матрикс отмечается сравнительно редко. Например, это было показано при имплантации силикатного синтетического имплантата Actifuse и при восстановлении роговицы имплантатом на основе кополимера коллагена [Li F. et al., 2003]. Врастание нервной ткани в имплантат может быть связано с аккумуляцией макрофагов и ангиогенезом, поскольку рост нервных волокон регулируется факторами роста, секретируемыми макрофагами [Miyauchi A. et al., 1997] и эндотелиальными клетками [GibranN.S. et al., 2003].

При исследовании трехмерной архитектуры сосудистого русла в имплантированной пористой матрице, было показано, что сосуды равномерно прорастают трехмерный искусственный матрикс (рисунок 21). Прорастание сосудов сопровождает рост соединительной ткани, и, поскольку не было обнаружено аваскулярных областей в имплантате, подтверждается равномерное заполнение внутреннего пространства имплантата новообразованной тканью. Отсутствие аваскулярной капсулы вокруг имплантата, васкуляризация окружающих матрикс тканей и прорастание сосудов и соединительной ткани в имплантированную матрицу подтверждает возможность применения в тканевой инженерии матриц с описанной структурной конфигурацией: большой диаметр макропор с микропористой поверхностью.

Рисунок 21. Сосуды прорастают сквозь имплантированную матрицу из спидроина 1.

Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов. Сосуды выявлены Evans Blue (показаны красным).

3.2.2 ДЕГРАДАЦИЯ МАТРИЦ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА СПИДРОИНА 1 IN VIVO

Деградация матрикеов после имплантации in vivo способствует замещению искусственного имплантата новообразованной тканью и происходит под воздействием химических компонентов межклеточной среды и при активном участии клеток-деструкторов [Mano J.F. et al., 2007; Sachlos E. and Czernuszka J.T., 2003]. Биодеградации при участии клеток иммунного ответа подвергаются изделия из разных видов щелка [Wang Y. et al., 2008; Fredriksson С. et al., 2009].

Макрофаги и гигантские клетки инородных тел, обнаруженные в контакте с поверхностью имплантата, способны к фагоцитозу и секретируют в окружающую среду свободные радикалы кислорода, ферменты и кислоты [Anderson J.M. et al., 2008]. В экспериментах in vivo через два месяца после имплантации, нативная структура имплантата из аналога спидроина 1 значительно разрушается и лишь отчасти сохраняет нативную структуру (рисунки 19 и 20). Макропоры деформированы прорастающей тканью, перегородки между порами разрушены и в отдельных участках трехмерный матрикс представлен изолированными фрагментами. Поверхность макропор матрикса имеет неровный рельеф, и в сайтах нарушения структуры их поверхности обнаруживаются макрофаги и единичные гигантские клетки инородных тел (рисунок 22).

Рисунок 22. Иммунные клетки принимают участие в резорбции

имплантированного матрикса. Гигантская клетка инородных тел показана стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином.

В цитоплазме макрофагов с признаками активного фагоцитоза (зернистость цитоплазмы) наблюдаются фрагменты фагоцитированного материала матрикса. При разрушении стенок матрицы образовались многочисленные отверстия

разного диаметра (от нескольких микрометров до сопоставимых по диаметру с толщиной стенок). Отверстия в стенках макропор также инфильтрированы макрофагами (рисунок 19). Внедрившиеся в поверхность материала клетки являются признаком деградации структур искусственного матрикса в процессе тканевого ответа на инородное тело. Разрушение материала матрицы через два месяца после имплантации, а также активное участие клеток в этом процессе, позволяет предположить быструю биорезорбцию имплантата и его полное замещение новообразованной тканью. Однако следует отметить, что через два месяца матрикс разрушен неравномерно и, кроме описанных деградирующих фрагментов, встречаются участки, сохранившие структуру, близкую к нативной (рисунок 19, 20). Такая деградация является характерной особенностью изделий из шелка разных видов.

3.3 ОТСУТСТВИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАТРИЦ IN VIVO

Эффективному замещению имплантата новообразованной тканью может препятствовать токсичность компонентов материала, из которого он изготовлен. Однако, есть данные о токсичном действии in vitro очищенного по стандартной методике шелка шелкопрядов (Bombix morí и Antheraea pernyi), также как и очищенного натурального шелка паука Nephila edulis [Hakimi О. et al., 2009]. Токсичностью обладают компоненты натуральной нити шелка, которые не удаляются стандартными методами очистки. Мы показали, что материал из рекомбинантного аналога спидроина 1 не оказывает токсического действия на эукариотические клетки в экспериментах in vitro. Гистологическое изучение имплантатов не показало никаких фенотипических изменений прорастающих в имплантат тканей, которые могли бы свидетельствовать о нарушениях физиологии контактирующих с матрицей клеток: адипоциты и фибробласты имеют характерные для клеток этого типа морфологию и размер. Высокий уровень васкуляризации подтверждает отсутствие токсического действия на эндотелиальные клетки. Таким образом, в отличие от природных регенерированных типов шелка, спидроин 1 нетоксичен по отношению к разным типам клеток in vivo, что является его несомненным преимуществом.

Продукты деградации нетоксичных материалов, таких как полигликолиевая кислота (PGA), полимолочная кислота (PLA) и полиортоэфир (РОЕ), обладают токсическим или ингибирующим действием за счет снижения уровня pH среды [Sachlos Е. and Czernuszka J.T., 2003; Taylor M.S. et al., 1994]. Такие изменения могут оказывать негативное действие на формирование новой ткани в месте имплантации. При разрушении белковых полимеров, таких как аналог спидроина 1, образуются аминокислоты, не оказывающие токсического действия на клетки. Признаков формирования неблагоприятных условий для роста клеток в местах активной деструкции имплантата не обнаружено. Наоборот, как было отмечено выше, в местах разрушения матрикса происходит активный рост ткани и обнаруживаются молодые фибробласты.

выводы

1. Трехмерные матриксы из рекомбинантиого аналога спидроина 1 получены методом выщелачивания. Матриксы имеют характерную незамкнутую макропористую структуру с уникальным микропористым строением стенок макропор, характеризуются высокими показателями растяжимости и прочности на разрыв, демонстрируют стабильность in vitro в нейтральной среде и разлагаются при окислении. Механическая прочность и стабильность матриксов увеличивается после химической перешивки.

2. Матриксы из рекомбинантиого аналога спидроина 1 могут быть использованы для долговременного культивирования эукариотических клеток. Модификация структуры и свойств поверхности матриксов химической перешивкой глутаровым альдегидом, а также изменение концентрации полимера при изготовлении матрикса может влиять на рост клеток.

3. Матриксы из аналога спидроина 1 не вызывают отторжения при имплантации, происходит биорезорбция матриксов и замещение их новообразованной собственной тканью животного, что сопровождается активными процессами неоваскуляризации и нейрогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пустовалова О.Л., Агапов И.И., Мойсенович М.М., Еремин П.С., Казюлина A.A., Архипова А.Ю., Рамонова A.A., Богуш В.Г., Севастьянов В. И., Кирпичников М.П. Использование метода конфокальной микроскопии для изучения биологических свойств матрикса из рекомбинантной паутины. / Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - Т. 11, №2. - С. 54-59

2. Пустовалова O.JI., Мойсенович М.М., Еремин П.С., Архипова А.10., Рамонова A.A., Соколова О.С., Богуш В.Г., Агапов И.И., Кирпичников М.П. Культивирование клеток на трехмерной матрице из рекомбинантиого спидроина 1. / Российский иммунологический журнал. - 2009. -Т.3(12), № 2. -С. 139-146

3. Агапов И.И., Пустовалова O.JI., Мойсенович М.М., Богуш В.Г., Соколова О.С., Севастьянов В.И., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Трехмерный матрикс из рекомбинантиого белка паутины для тканевой инженерии. / Доклады академии наук. - 2009. -Т.426, №1. -С. 115-118

4. Коньков A.C., Пустовалова O.JI., Агапов И.И. Биосовместимые материалы из регенерированного шелка для тканевой инженерии и лекарственной терапии. / Биотехнология. - 2010, №1

5. Agapov I.I., Pustovalova О. L., Moisenovich М. М., Bogush V. G., Sokolova О. S., Sevastyanov V. I., Debabov V. G., Gotye S.V., Kirpichnikov M. P. Recombinant spider silk scaffold for tissue engineering. / Rare metals. - 2009. -V.28, P. 84-87.

ПУСТОВАЛОВА ОЛЬГА ЛЕОНИДОВНА

СВОЙСТВА ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО СПИДРОИНА 1

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени 1 кандидата биологических наук

Усл.п. л. - 1.5 Заказ №01314 Тираж: ЮОэкз.

Копиценгр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пустовалова, Ольга Леонидовна

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Характеристика каркасного паутинного шелка Nephila sp.

2.1.1 Строение каркасного шелка Nephila sp.

2.1.1.1 Первичная структура спидроинов Nephila sp.

2.1.1.2 . Вторичная и третичная структуры спидроинов Nephila sp.

2.1.1.3 Строение паутинной нити Nephila sp.

2.1.2 Физические свойства спидроинов каркасной нити паутины Nephila sp.

2.1.3 Конформационный переход и его влияние на свойства спидроинов Nephila sp.

2.2 Рекомбинантные белки и белки-аналоги спидроинов: получение, свойства и возможности применения.

2.2.1 Получение рекомбинантных аналогов паутинных белков.

2.2.1.1 Синтез в бактериальных и дрожжевых клетках.

2.2.1.2 Использование культурклеток животных в качестве продуцентов.

2.2.1.3 Трансгенные растения.

2.2.1.4 Трансгенные животные.

2.2.2 Свойства рекомбинантных аналогов спидроинов.

2.2.2.1 Модификация свойств рекомбинантных спидроинов.

2.2.2.2 Генетическая модификация рекомбинантных белков и аналогов введением дополнителных последовательностей и создание кополимеров.

2.2.3 Создание, получение и свойства белка 1F9 - аналога спидроина 1 Nephila clavipes.

2.3 Использование шелка в биоинженерии.

2.3.1. Природный паутинный шелк в биоинженерии.

2.3.1 .1 Паутинный шелк естественного происхождения.

2.3.1.2 Регенерированный паутинный шелк.

2.3.2 Возможности биоинженерного применения рекомбинантных аналогов спидроинов.

3 Материалы и методы.

3.1 Материалы.

3.1.2 Клеточные линии.

3.2 Методы.

3.2.1. Методы изготовления и модификации трехмерных матриксов и пленок

3.2.1 .1 Изготовление полимерных пленок и матриц.

3.2.1.2 Модификация матриксов глутаровым альдегидом.

3.2.1.3 Обработка полимерных матриксов коллагеном.

3.2.2 Исследование физических, морфологических и топографических свойств матриксов.

3.2.2 .1 Изучение структуры поверхности матриксов.

3.2.2.2 Тест на соединенность пор матрицы.

3.2.2.3 Сканирующая электронная микроскопия.

3.2.2.4 Лазерная конфокальная микроскопия.

3.2.2.5 Испытание деструкции матриксов.

3.2.2.6 Изучение механических свойств пористых матриксов

3.2.3 Изучение влияния топографии матрикса на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток.

3.2.3.1 Культивирование клеток.

3.2.3.2 Изучение адгезии и роста клеток в трехмерных матриксах и на поверхности полимерных пленок.

3.2.3.3 Изучение распределения клеток в матрице.

3.2.3.4 Определение жизнеспособности клеток при культивировании в матриксе из спидроина 1.

3.2.3.5 Анализ количества клеток.

3.2.4 Имплантация матриксов в подкожную ткань.

3.2.4.1 Условия хирургического вмешательства и эксперимента

3.2.5 Извлечение имплантата и подготовка образцов тканей.

3.2.5.1 Фиксация образцов и подготовка к микроскопическим исследованиям.

3.2.5.2 Подготовка срезов для гистологических исследований

3.2.5.3 Окраска срезов гематоксилином и эозином.

3.2.6 Микроскопические исследованияимплантата.

3.2.6.1 Световая микроскопия.

3.2.6.2 Витальное окрашивание сосудов в имплантатах.

4 Результаты и обсуждение.

4.1 Физические, морфологические и топографические свойства матриксов из аналога спидроина 1.

4.1.1 Макроструктура трехмерных матриксов.

4.1.2 Микроструктура трехмерных матриксов.

4.1.3 Деструкция матриксов из аналога спидроина 1.

4.1.4 Механические свойства матриксов.

4.2 Культивирование клеток в матрицах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

4.2.1 Влияние материала из рекомбинантного аналога спидроина 1 на адгезию и пролиферацию клеток.

4.2.2 Влияние архитектуры трехмерных матриксов из рекомбинантного аналога спидроина 1 на адгезию и пролиферацию клеток

4.2.3 Распределение клеток в матрице.

3.2.4 Жизнеспособность клеток при культивировании в матрицах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

3.2.5 Адгезия и пролиферация клеток в модифицированных матриксах из рекомбинантного аналога спидроина 1.

3.2.6 Влияние концентрации полимера при изготовлении матриц из спидроина 1 на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток.

4.3 Исследования местного действия матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации.

4.3.1 Интеграция в окружающие ткани матрицы из рекомбинантного аналога спидроина 1 после имплантации.

4.3.2 Клеточный ответ на имплантацию матрицы из рекомбинантного аналога спидроина 1 in vivo.

4.3.2.1 Ангиогенез и нейрогенез в матрицах из рекомбинантного спидроина 1 in vivo.

4.3.2.2Деградация матриц из рекомбинантного спидроина 1 in vivo

4.3.3 Отсутствие токсического действия матриц in vivo.

5 Выводы.

6 Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1"

Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молукулярной биологии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Конструированием аналогов естественных тканей занимается новое синтетическое направление, возникшее на стыке биологии, медицины и технических наук — тканевая инженерия. Основой искусственных тканей становятся носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства медицинского изделия. Выбор материала для изготовления матриксов определяется физическими свойствами и биологической совместимостью. В наше время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и более того, могут служить высокоэффективными биостимулярами. Например, для создания матриксов были использованы альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения [Dawson Е. et al., 2008; Lee J. et al., 2008a; Ma P., 2004; Ma P.X., 2008; Sachlos E. and Czernuszka J.T., 2003].

Уникальным материалом, сочетающим высокую прочность и эластичность, является шелк паутинной нити. Эти свойства, наряду с хорошей биологической совместимотью, делают шелк перспективным материалом для использования в тканевой инженерии. Однако получение природного паутинного шелка связано со значительными трудностями и обычно нерентабельно, а количество шелка недостаточно для широкого 6 практического применения. Успехи в расшифровке генов паутинных белков и создание их рекомбинантных аналогов позволило получить материалы, подобные природному шелку. В настоящее время исследуются свойства этих материалов, а также возможность их практического использования. В ГосНИИгенетика был получен 1F9 - аналог белка паутины Nephila clavipes [Богуш В.Г. и др., 2006; Bogush V.G. et al., 2009].

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить местное действие матриксов после имплантации в ткани животных.

Научная новизна работы. Разработанный в ГосНИИгенетика рекомбинантный аналог природного спидроина Nephila clavipes был впервые использован для изготовления пористых трехмерных матриксов. Были изучены макро- и микроструктурные особенности эти конструкций, их механические свойства и способность к деградации, а также возможности химической модификации этих свойств. Мы показали, что матриксы из аналога спидроина 1 способны поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток in vitro. Впервые было изучено местное действие матриксов из аналога спидроина 1 после имплантации в ткани животных.

Показано, что после имплантации материал подвергается биодеградации и замещается васкуляризованной новообразованной тканью.

Практическая значимость. Спидроины, обладают уникальным сочетанием механических свойств, являются биосовместимым, биоинертным материалом, способным к биодеградации. Разработка методов получения рекомбинантных аналогов этих белков расширила возможности практического применения спидроинов. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 можно использовать для создания конструкций медицинского назначения, таких как имплантаты для замещения значительных дефектов ткани, целостность которых не может быть восстановлена естественной физиологической репарацией. Матриксы могут служить основой для создания трехмерых клеточных культур in vitro для моделирования различных биологических процессов. Например, такие модели позволяют изучать процессы репарации и клеточной миграции. Культивирование клеток в трехмерной среде расширяет возможности исследования нормальных физиологические функций клеток и влияния на эти функции микроокружения и топографии субстрата. Внедрение новых медицинских технологий и создание новых моделей для исследований в клеточной биологии позволяет серьезно продвинуться в области восстановительной медицины и решить ряд значительных медицинских проблем биотехнологическими методами.

2 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пустовалова, Ольга Леонидовна

5 Выводы

1. Трехмерные матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 получены методом выщелачивания. Матриксы имеют характерную незамкнутую макропористую структуру с уникальным микропористым строением стенок макропор, характеризуются высокими показателями растяжимости и прочности на разрыв, демонстрируют стабильность in vitro в нейтральной среде и разлагаются при окислении. Механическая прочность и стабильность матриксов увеличивается после химической перешивки

2. Матриксы из рекомбинантного аналога спидроина 1 могут быть использованы для долговременного культивирования эукариотических клеток. Модификация структуры и свойств поверхности матриксов химической перешивкой глутаровым альдегидом, а также изменение концентрации полимера при изготовлении матрикса может влиять на рост клеток.

1. 6 Благодарности

Выражаю глубокую благодарность за постоянную и неоценимую помощь в проведении данной работы, важные рекомендации, поддержку и критику моему научному руководителю Мойсеновичу Михаилу Михайловичу.

Я искренне признательна моему научному руководителю профессору Агапову Игорю Ивановичу за идейное вдохновение, помощь и участие в обсуждении полученных данных.

Сердечно благодарю Васильеву Тамару Викторовну за помощь в проведении гистологического анализа и оценке полученных результатов.

Выражаю глубокую благодарю своим коллегам А.А. Рамоновой, А.Ю. Архиповой за помощь в проведении ряда экспериментов.

Выражаю признательность всем сотрудникам кафедры физиологии микроорганизмов за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы.

Благодарю своих родных за веру, терпение и помощь, оказанную при подготовке работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пустовалова, Ольга Леонидовна, Москва

1. Богуш В.Г., Сазыкин А.Ю., Давыдова ЛИ., Мартиросян В.В., Сидорук К.В., Глазунов А.В., Акашина Р.И., Шматченко Н.А., Дебабов В.Г. Получение, очистка и прядение рекомбинантного аналога спидроина 1. / Биотехнология. 2006. - С.3-12.

2. Соколова О.С., Богуш В.Г., Давыдова Л.И., Полевова С.В., Антонов С.А., Неретина Т.В., Клинов Д.В., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Формирование четвертичной структуры рекомбинантными аналогами белков паутины. / Молекулярная биология. 2009. - Т.6.

3. Acharya С., Ghosh S.K., Kundu S.C. Silk fibroin protein from mulberry and non-mulberry silkworms: cytotoxicity, biocompatibility and kinetics of L929 murine fibroblast adhesion. / J Mater Sci Mater Med. 2008. - V.19, P.2827-2836.

4. Agnarsson I., Boutry C., Blackledge T.A. Spider silk aging: initial improvement in a high performance material followed by slow degradation. / J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 2008. - V.309, P.494-504.

5. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kali S., Choi C.Y., Brandes G., Kasper C., Scheper Т., Guggenheim M., Vogt P.M.

6. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration. / Cell Prolif. 2008a. - V.41, P.408-420.

7. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kail S., Choi C.Y., Brandes G., Kasper C., Scheper Т., Guggenheim M., Vogt P.M. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration. / Cell Prolif. 2008b. - V.41, P.408-420.

8. Altaian G.H., Diaz F., Jakuba C, Calabro T., Horan R.L., Chen J., Lu H., Richmond J., Kaplan D.L. Silk-based biomaterials. / Biomaterials. -2003.- V.24,P.401-416.

9. Anderson J.M., Rodriguez A., Chang D.T. Foreign body reaction to biomaterials. / Semin Immunol. 2008. - V.20, P.86-100.

10. Arcidiacono S., Mello C., Kaplan D., Cheley S., Bayley H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. / Appl Microbiol Biotechnol. 1998. - V.49, P.31-38.

11. Arcidiacono S., Mello C.M., Butler M., Welsh E., Soares J.W., Allen A., Ziegler D., Laue Т., Chase S. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. / Macromolecules. 2002. - V.35, P.1262-1266.

12. Bacakova L., Filova E., Rypacek F.f Svorcik V., Stary V. Cell adhesion on artificial materials for tissue engineering. / Physiol Res. 2004a.- V.53 Suppl 1, P.S35-S45.

13. Bacakova L., Filova E., Rypacek F., Svorcik, V., Stary V. Cell adhesion on artificial materials for tissue engineering. / Physiol Res. -2004b. V.53 Suppl 1, P.S35-S45.

14. Barr L.A., Fahnestock S.R., Yang J.J. Production and purification of recombinant DP IB silk-like protein in plants. / Molecular Breeding. 2004.- V.13,P.345-356.

15. Bates R.C., Lincz L.F., Burns G.F. Involvement of integrins in cell survival. / Cancer Metastasis Rev. 1995. - V.14, P.191-203.

16. Beckwitt R., Arcidiacono S. Sequence conservation in the C-terminal region of spider silk proteins (Spidroin) from Nephila clavipes (Tetragnathidae) and Araneus bicentenarius (Araneidae). / J Biol Chem. -1994. V.269, P.6661-6663.

17. Bini E., FooC.W., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel В., Kaplan D.L. RGD-functionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial. / Вiomacromolecules. 2006. - V.7, P.3139-3145.

18. Brauker J.H., Carr-Brendel V.E., Martinson L.A., Crudele J., Johnston W.D. , Johnson R.C. Neovascularization of synthetic membranes directed by membrane microarchitecture. / J Biomed Mater Res. 1995. -V.29, P.1517-1524.

19. Cai Q., Yang J., BeiJ., Wang S. A novel porous cells scaffold made of polylactide-dextran blend by combining phase-separation and particle-leaching techniques. / Biomaterials. 2002. - V.23, P.4483-4492.

20. Campbell C.E., von Recum A.F. Microtopography and soft tissue response. / J Invest Surg. 1989. - V.2, P.51-74.

21. Candelas G.C., Cintron J. A Spider Fibroin and Its Synthesis. / Journal of Experimental Zoology. 1981. - V.216, P.l-6.

22. Chen X., ShaoZ., Marinkovic N.S., Miller L.M., Zhou P., Chance M.R. Conformation transition kinetics of regenerated Bombyx mori silk fibroin membrane monitored by time-resolved FTIR spectroscopy. / Biophys Chem. 2001. - V.89, P.25-34.

23. Craig C.L., Riekel C. Comparative architecture of silks, fibrous proteins and their encoding genes in insects and spiders. / Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. 2002. - V.133, P.493-507.

24. Curtis A., Wilkinson C. Topographical control of cells. / Biomaterials. -1997.-V.18, P.1573-1583.

25. Dal P, I, Freddi G., Minic J., Chiarini A., Armato U. De novo engineering of reticular connective tissue in vivo by silk fibroin nonwoven materials. / Biomaterials. 2005. - V.26, P.l987-1999.

26. Dash R., Ghosh S.K., Kaplan D.L., Kundu S.C. Purification and biochemical characterization of a 70 kDa sericin from tropical tasar silkworm, Antheraea mylitta. / Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. 2007. - V.147, P. 129-134.

27. Daws on E., Mapili G., Erickson K., Taqvi S., Roy K. Biomaterials for stem cell differentiation. / Adv Drug Deliv Rev. 2008. - V.60, P.215-228.

28. Dicko C., Kenney J.M., Knight D., Yollrath F. Transition to a beta-sheet-rich structure in spidroin in viti'o: the effects of pH and cations. / Biochemistry. 2004a. - V.43, P. 14080-14087.

29. Dicko С., Vollrath F., Kenney J.M. Spider silk protein refolding is controlled by changing pH. / Biomacromolecules. 2004b. - V.5, P.704-710.

30. Edwards S.L., Mitchell W., Matthews J.B., Ingham E., Russell S J. Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior cruciate ligament. / AUTEX Research Journal. 2004. - V.4, P.86-94.

31. Exler J.H., Hummerich D., Scheibel T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. / Angew Chem Int Ed Engl. 2007. -V.46, P.3559-3562.

32. Fahnestock SR. Novel, recombinantly produced spider silk analogs. Internal Application number PCT/US94/06689, Internal Publication number WO 94/29450

33. Fahnestock S.R., Bedzyk L.A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. / Appl Microbiol Biotechnol. 1997. - V.47, P.33-39.

34. Fahnestock S.R., Irwin S.L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. / Appl Microbiol Biotechnol. 1997. -V.47, P.23-32.

35. Fahnestock S.R., Yao Z., Bedzyk L.A. Microbial production of spider silk proteins. / J Biotechnol. 2000. - V.74, P.105-119.

36. Foo C.W.P., Bini E., Huang J., Lee S.Y., Kaplan D.L. Solution behavior of synthetic silk peptides and modified recombinant silk proteins. / Applied Physics A-Materials Science & Processing. 2006. - V.82, P.193-203.

37. Foschi D., Corsi F., Cellerino P., Rizzi A., Morandi E., Trabucchi E. Angiogenic effects of suture biomaterials. An experimental study in rats. / Eur Surg Res. 2001. - V.33, P.16-20.

38. Fredriksson С., Hedhammar M., Feinstein R., Nordling K., Kratz G., Johansson J., Huss F., Rising A. Tissue Response to Subcutaneously Implanted Recombinant Spider Silk: An in vivo Study. / Materials. 2009. -V.2, P. 1908-1922.

39. Fukushima Y. Genetically engineered syntheses of tandem repetitive polypeptides consisting of glycine-rich sequence of spider dragline silk. / Biopolymers. 1998. - V.45, P.269-279.

40. Gao J., Crapo P.M., Wang Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. / Tissue Eng. 2006. -V.12, P.917-925.

41. Gellynck K., Verdonk P., Forsyth R., Almqvist K.F., Van N.E., Gheysens Т., Mertens J., Van L.L., Kiekens P., Verbruggen G. Biocompatibility and biodegradability of spider egg sac silk. / J Mater Sci Mater Med. 2008a. - V.19, P.2963-2970.

42. Gellynck K., Verdonk P.C., Van N.E., Almqvist K.F., Gheysens T., Schoukens G., Van L.L., Kiekens P., Mertens J., Verbruggen G. Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support. / J Mater Sci Mater Med. 2008b. - V.19, P.3399-3409.

43. Gellynck K., Verdonk P.C.M., Almqvist K.F., Van Nimmen E., Gheysens Т., Mertens J., Van Langenhove L., Kiekens P., Verbruggen G. Chondrocyte Growth in Porous Spider Silk 3D-Scaffolds. / European Cells and Materials. 2005. - V.10, P.45.

44. Georgakoudi I., Rice W.L., Hronik-Tupaj M., Kaplan D.L. Optical spectroscopy and imaging for the noninvasive evaluation of engineered tissues. / Tissue Eng Part В Rev. 2008. - V.14, P.321-340.

45. Georgakoudi I., Tsai I., Greiner C., Wong C., Defelice J., Kaplan D. Intrinsic fluorescence changes associated with the conformational state ofsilk fibroin in biomaterial matrices. / Opt Express. 2007. - V.15, P. 10431053.

46. Gibran N.S., Tamura R., Tsou R., Isik F.F. Human dermal microvascular endothelial cells produce nerve growth factor: implications for wound repair. / Shock. 2003. - V.19, P. 127-130.

47. Gosline J.M., Guerette P.A., Ortlepp C.S., Savage K.N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. / J Exp Biol. 1999. - V.202, P.3295-3303.

48. Grip S., Johansson J., Hedhammar M. Engineered disulfides improve mechanical properties of recombinant spider silk. / Protein Sci. 2009. -V.18, P.1012-1022.

49. Guerette P.A., Ginzinger D.G., Weber B.H., Gosline J.M. Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family. / Science. 1996. - V.272, P.l 12-115.

50. Hakimi O., Grahn M.F., Knight D P., Vadgama P. Interaction of myofibroblasts with silk scaffolds 1. / European Cells and Materials. 2005. - V.10,P.5146.

51. Hakimi O., Gheysens Т., Vollrath F., Grahn M.F., Knight D.P., Vadgama P. Modulation of cell growth on exposure to silkworm and spider silk fibers. / J Biomed Mater Res A. 2009. -.

52. Heim M., Ackerschott C.B., Scheibel T. Characterization of recombinantly produced spider flagelliform silk domains. / J Struct Biol. -2010. -.

53. Heim M., Keerl D., Scheibel T. Spider silk: from soluble protein to extraordinary fiber. / Angew Chem Int Ed Engl. 2009. - V.48, P.3584-3596.

54. Helmus M.N., Gibbons D.F., Cebon D. Biocompatibility: meeting a key functional requirement of next-generation medical devices. / Toxicol Pathol. 2008. - V.36, P.70-80.

55. Hermanson K.D., Harasim M.B., Scheibel Т., Bausch A.R. Permeability of silk microcapsules made by the interfacial adsorption of protein. / Phys Chem Chem Phys. 2007a. - V.9, P.6442-6446.

56. Hermanson K.D., Huemmerich D., Scheibel Т., Bausch A.R. Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk. / Advanced Materials. 2007b. - V.19, P.1810-+.

57. Hermes A.C., Davies R.J., Greiff S., Kutzke H., Lahlil S., Wyeth P., Riekel C. Characterizing the decay of ancient Chinese silk fabrics by microbeam synchrotron radiation diffraction. / Biomacromolecules. 2006. -V.7, P.777-783.

58. Hersel U., Dahmen C., Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. / Biomaterials. 2003. - V.24, P.4385-4415.

59. Howe A., Aplin A.E., Alahari S.K., Juliano R.L. Integrin signaling and cell growth control. / Curr Opin Cell Biol. 1998. - V.10, P.220-231.

60. Huang J., WongC., George A., Kaplan D.L. The effect of genetically engineered spider silk-dentin matrix protein 1 chimeric protein on hydroxyapatite nucleation. / Biomaterials. 2007. - V.28, P.2358-2367.

61. Huemmerich D., Helsen C.W., Quedzuweit S., Oschmann J., Rudolph R., Scheibel T. Primary structure elements of spider dragline silksand their contribution to protein solubility. / Biochemistry. 2004a. - V.43, P.13604-13612.

62. Jackson C., Obrien J.P. Molecular-Weight Distribution of Nephila-Clavipes Dragline Silk. / Macromolecules. 1995. - V.28, P.5975-5977.

63. Kaplan D.L. Silk. / Encyclopedia of Polymer Science and Technology. -2004.-V.ll,P.841-850.

64. Karatzas C.N. Production of recombinant spider silk (BiosteelTM) in the milk of transgenic animals. / Transgenic Research. 1999. - V.8, P.463-498.

65. Kasoju N., Bhonde R.R., Bora U. Preparation and characterization of Antheraea assama silk fibroin based novel non-woven scaffold for tissue engineering applications. / J Tissue Eng Regen Med. 2009. - V.3, P.539-552.

66. Kaully Т., Kaufman-Francis K., Lesman A., Levenberg S. Vascularization-the conduit to viable engineered tissues. / Tissue Eng Part В Rev. 2009. - V.15, P. 159-169.

67. Kim U.J., Park J., Kim H.J., Wada M., Kaplan D.L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. / Biomaterials. 2005. - V.26, P.2775-2785.

68. Kluge J.A., Rabotyagova O., Leisk G.G., Kaplan D.L. Spider silks and their applications. / Trends Biotechnol. 2008. - Y.26, P.244-251.

69. Knight D.P., Vollrath F. Changes in element composition along the spinning duct in a Nephila spider. / Naturwissenschaften. 2001. - V.88, P.179-182.

70. Kohn D.H., SarmadiM., HelmanJ.I., Krebsbach P.H. Effects of pH on human bone marrow stromal cells in vitro: implications for tissue engineering of bone. / J Biomed Mater Res. 2002. - V.60, P.292-299.

71. Kweon H., Park Y.H. Dissolution and characterization of regenerated Antheraea pernyi silk fibroin. / Journal of Applied Polymer Science. 2001. - V.82, P.750-758.

72. Lamalice L., Le B.F., Huot J. Endothelial cell migration during angiogenesis. / Circ Res. 2007. - V.100, P.782-794.

73. Lampin M., Warocquier C., Legris C., Degrange M., Sigot-Luizard M.F. Correlation between substratum roughness and wettability, cell adhesion, and cell migration. / J Biomed Mater Res. 1997. - V.36, P.99-108.

74. Lawrence B.D., Marchant J.K., Pindrus M.A., Omenetto F.G., Kaplan D.L. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. / Biomaterials. 2009. -V.30, P.1299-1308.

75. Lazaris A., Arcidiacono S., Huang Y., Zhou J.F., Duguay F., Chretien N., Welsh E.A., Soares J.W., Karatzas C.N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. / Science. 2002. - V.295, P.472-476.

76. Lee J., Cuddihy M.J., Kotov N.A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. / Tissue Eng Part В Rev. 2008a. - V.14, P.61-86.

77. Lee J., Cuddihy M.J., Kotov N.A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. / Tissue Eng Part В Rev. 2008b. - V.14, P.61-86.

78. Lee J.H., Lee S.J., Khang G., Lee H.B. Interaction of fibroblasts on polycarbonate membrane surfaces with different micropore sizes and hydrophilicity. / J Biomater Sci Polym Ed. 1999. - V.10, P.283-294.

79. Lee J.J., Lee S.-G., Park J.C., Yang Y.I., Kim J.K. Investigation on biodegradable PLGA scaffold with various pore size structure for skin tissue engineering. / Current Applied Physics. 2007. - P.e37-e40.

80. Lefevre Т., Boudreault S., Cloutier C., Pezolet M. Conformational and orientational transformation of silk proteins in the major ampullate gland of Nephila clavipes spiders. / Вiomacromolecules. 2008. - V.9, P.2399-2407.

81. Lewis R. Unraveling the weave of spider silk. / Bioscience. 1996. - V.46, P.636-638.

82. Lewis R.V., Hinman M., Kothakota S., Fournier M.J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. / Protein Expr Pur if. 1996. - V.7, P.400-406.

83. Li M., Tao W., Lu S., Zhao C. Porous 3-D scaffolds from regenerated Antheraea pernyi silk fibroin. / Polymers for Advanced Technologies. -2008. -V.19, P.207-212.

84. LI X., YAO J., YANG X., TIAN W., LIU L. Surface modification with fibronectin or collagen to improve the cell adhesion. / Applied Surface Science. 2008. - V.255, P.459-461.

85. Ma P. Scaffolds for tissue fabrication. / Materials Today. 2004. - V.7, P.30-40.

86. MacIntosh A.C., Kearns V.R., Crawford A., Hatton P.V. Skeletal tissue engineering using silk biomaterials. / J Tissue Eng Regen Med. 2008. -V.2, P.71-80.

87. Mandal B.B., Kundu S.C. Biospinning by silkworms: Silk fiber matrices for tissue engineering applications. / Acta Biomater. 2009a.

88. Mandal B.B., Kundu S.C. Cell proliferation and migration in silk fibroin 3D scaffolds. / Biomaterials. 2009b. - V.30, P.2956-2965.

89. Mandal B.B., Kundu S.C. Osteogenic and adipogenic differentiation of rat bone marrow cells on non-mulbeny and mulberry silk gland fibroin 3D scaffolds. / Biomaterials. 2009c. - V.30, P.5019-5030.

90. Mata A., Kim E.J., Boehm C.A., Fleischman A J., Muschler G.F., Roy S. A three-dimensional scaffold with precise micro-architecture and surface micro-textures. / Biomaterials. 2009. - V.30, P.4610-4617.

91. Mata A., Su X., Fleischman A.J., Roy S., Banks B.A., Miller S.K., Midura R.J. Osteoblast attachment to a textured surface in the absence of exogenous adhesion proteins. / IEEE Trans Nanobioscience. 2003. - V.2, P.287-294.

92. Mehta N., Hede S. Spider Silk Calcite Composite. / Hypothesis. -2005. -V.3,P.21-25.

93. Meinel L., Fajardo R., Hofmann S., Langer R., Chen J., Snyder В., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D. Silk implants for the healing of critical size bone defects. / Bone. 2005a. - V.37, P.688-698.

94. Meinel L., Hofmann S., Karageorgiou V., Kirker-Head C., McCool J., Gronowicz G., Zichner L., Langer R., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. / Biomaterials. -2005b. V.26,P.147-155.

95. Mello C.M., Soares J.W., Arcidiacono S., Butler M.M. Acid extraction and purification of recombinant spider silk proteins. / Biomacromolecules. 2004. - V.5, P. 1849-1852.

96. Menassa R., Zhu H., Karatzas C.N., Lazaris A., Richman A., Brandle J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. / Plant Biotechnol J. 2004. - V.2, P.431-438.

97. Miller G.E. Artificial Organs. / Synthesis Lectures on Biomedical Engineering. 2006. - V.l, P. 1-72.

98. Moldovan L, Moldovan N.I. Role of monocytes and macrophages in angiogenesis. / EXS. 2005. - P.127-146.

99. Morgan A.W, Roskov K.E, Lin-Gibson S, Kaplan D.L, Becker M.L, Simon C.G, Jr. Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. / Biomaterials. 2008a. -V.29, P.2556-2563.

100. Morgan A.W, Roskov K.E, Lin-Gibson S, Kaplan D.L, Becker M.L, Simon C.G, Jr. Characterization and optimization of RGD-containing silk blends to support osteoblastic differentiation. / Biomaterials. 2008b. -V.29, P.2556-2563.

101. Nakazawa Y, Asakura T. Structure determination of a peptide model of the repeated helical domain in Samia cynthia ricini silk fibroin before spinning by a combination of advanced solid-state NMR methods. / J Am Chem Soc. 2003. - V.125, P.7230-7237.

102. Nazarov R, Jin H.J, Kaplan D.L. Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin. / Biomacromolecules. 2004. - V.5, P.718-726.

103. O'Brien F.J, Harley В .A, Waller M.A, Yannas I.V, Gibson L.J, Prendergast P.J. The effect of pore size on permeability and cell attachmentin collagen scaffolds for tissue engineering. / Technol Health Care. 2007. -V.15, P.3-17.

104. Osaki S., Yamamoto K., Kajiwara A., Murata M. Evaluation of the resistance of spider silk to ultraviolet irradiation. / Polymer Journal. -2004. V.36, P.623-627.

105. Padera R.F., Colton C.K. Time course of membrane microarchitecture-driven neovascularization. / Biomaterials. 1996. - V.17, P.277-284.

106. Pan Z.J., DiaoJ.Y., Shi J. Morphology and Cell Compatibility of Regenerated Ornithoctonus Huwenna Spider Silk by Electrospinning. / Journal of Fiber Bioengineering and Informatics. 2008. - V.l, P.157-164.

107. Pan Z.J., Li C.P., Xu Q. Active control on molecular conformations and tensile properties of spider silk. / Journal of Applied Polymer Science. 2004. - V.92, P.901-905.

108. Perez-Rigueiro J., Elices M., Plaza G.R., Rueda J., Guinea G.V. Fracture surfaces and tensile properties of UV-irradiated spider silk fibers. / Journal of Polymer Science Part B-Polymer Physics. 2007. - V.45, P.786-793.

109. Prince J.T., McGrath K.P., DiGirolamo C.M., Kaplan D.L. Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk. / Biochemistry. 1995. - V.34, P.10879-10885.

110. Rabotyagova O.S., Cebe P., Kaplan D.L. Self-assembly of genetically engineered spider silk block copolymers. / Biomacromolecules. -2009. V.10, P.229-236.

111. Raeber G.P., Lutolf M.P., Hubbell J.A. Mechanisms of 3-D migration and matrix remodeling of fibroblasts within artificial ECMs. / ActaBiomater. 2007. - V.3, P.615-629.

112. Rammensee S., Huemmerich D., Hermanson K.D., Scheibel T., Bausch A.R. Rheological characterization of hydrogels formed by recombinantly produced spider silk. / Applied Physics A-Materials Science & Processing. 2006. - V.82, P.261-264.

113. Rammensee S., Slotta U., Scheibel Т., Bausch A.R. Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins. / Proc Natl Acad Sci USA. -2008.-V.105,P.6590-6595.

114. Rose F.R., CysterL.A., Grant D.M., Scotchford C.A., Howdle S.M., Shakesheff K.M. In vitro assessment of cell penetration into porous hydroxyapatite scaffolds with a central aligned channel. / Biomaterials. -2004. V.25, P.5507-5514.

115. Rousseau M.E., Lefevre Т., Pezolet M. Conformation and orientation of proteins in various types of silk fibers produced by Nephila clavipes spiders. / Biomacromolecules. 2009. - V.10, P.2945-2953.

116. Sachlos E., Czernuszka J.T. Making tissue engineering scaffolds work. Review: the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. / Eur Cell Mater. 2003. -V.5, P.29-39.

117. Saltzman MW. Cell interactions with polymers.Principles of tissue engineering. 2000. - P.221-235.

118. SapedeD., SeydelT., Forsyth V.T., Koza M.A., SchweinsR., Vollrath F., Riekel C. Nanofibrillar structure and molecular mobility in spider dragline silk. / Macromolecules. 2005. - V.38, P.8447-8453.

119. Scheller J., Guhrs K.H., Grosse F., Conrad U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. / Nat Biotechnol. 2001. - V.19, P.573-577.

120. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. / Transgenic Res. 2004. - V.13, P.51-57.

121. Seidel A., Liivak O., Calve S., Adaska J., Ji G., Yang Z., Grubb D., Zax D.B., Jelinski L.W. Regenerated Spider Silk: Processing, Properties, and Structure. / Macromolecules. 2009a. - V.33, P.775-780.

122. Seidel A., Liivak O., Calve S., Adaska J., Ji G., Yang Z., Grubb D., Zax D.B., Jelinski L.W. Regenerated Spider Silk: Processing, Properties, and Structure. / Macromolecules. 2009b. - V.33, P.775-780.

123. Sharkawy A.A., Klitzman В., Truskey G.A., Reichert W.M. Engineering the tissue which encapsulates subcutaneous implants. I. Diffusion properties. / J Biomed Mater Res. 1997. - V.37, P.401-412.

124. Sieminski A.L., Gooch K.J. Biomaterial-microvasculature interactions. / Biomaterials. 2000. - V.21, P.2232-2241.

125. Simmons A.H., Michal C.A., Jelinski L.W. Molecular orientation and two-component nature of the crystalline fraction of spider dragline silk. / Science. 1996. - V.271, P.84-87.

126. Singhvi R., Stephanopoulos G., Wang D.I. Effects of substratum morphology on cell physiology. / Biotechnol Bioeng. 1994. - V.43, P.764-771.

127. Slotta U., Tammer M., Kremer F., Koelsch P., Scheibel T. Structural analysis of spider silk films. / Supramolecular Chemistry. 2006. - V.18, P.465-471.

128. Sponner A., Schlott В., Vollrath F., Unger E., Grosse F., Weisshart K. Characterization of the protein components of Nephila clavipes dragline silk. I Biochemistry. 2005. - V.44, P.4727-4736.

129. Stark M., Grip S., Rising A., Hedhammar M., Engstrom W., Hjalm G., Johansson J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. / Biomacromolecules. 2007. -V.8, P.1695-1701.

130. Streuli C.H., Bissell M.J. Expression of extracellular matrix components is regulated by substratum. / J Cell Biol. 1990. - V.110, P.1405-1415.

131. Szela S., Avtges P., Valluzzi R., Winkler S.r Wilson D., Kirschner D., Kaplan D.L. Reduction-oxidation control of beta-sheet assembly in genetically engineered silk. / Biomacromolecules. - 2000. - V.l, P.534-542.

132. Taylor M.S., Daniels A.U., Andriano K.P., Heller J. Six bioabsorbable polymers: in vitro acute toxicity of accumulated degradation products. / J Appl Biomater. 1994. - V.5, P. 151-157.

133. TeuleF., Cooper A.R., FurinW.A., Bittencourt D., RechE.L., Brooks A., Lewis R.V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. / Nat Protoc. 2009. -V.4, P.341-355.

134. Thevenot P., Nair A., Dey J., Yang J., Tang L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. /Tissue Eng Part С Methods. 2008. - V.14, P.319-331.

135. Thiel B.L., Guess K.B., Viney C. Non-periodic lattice crystals in the hierarchical microstructure of spider (major ampullate) silk. / Biopolymers. 1997. - V.41, P.703-719.

136. VehoffT., Glisovic A., Schollmeyer H., Zippelius A., Salditt T. Mechanical properties of spider dragline silk: humidity, hysteresis, and relaxation. / Biophys J. 2007. - V.93, P.4425-4432.

137. Vendrely C., Scheibel T. Biotechnological production of spider-silk proteins enables new applications. / Macromol Biosci. 2007. - V.7, P.401-409.

138. Von Recum Andreas F, Shannon Clare E., Cannon Carolyn E., Long Kenwyn J., Van Kooten Theo G., Meyle Jorg. Surface Roughness, Porosity, and Texture as Modifiers of Cellular Adhesion. / Tissue Engineering. 1996. - V.2, P.241-253.

139. Wang Y., Kim H.J., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. / Biomaterials. 2006. -V.27, P.6064-6082.

140. Wang Y., Rudym D.D., Walsh A., Abrahamsen L., Kim H.J., Kim H.S., Kirker-Head C., Kaplan D.L. In vivo degradation of threedimensional silk fibroin scaffolds. / Biomaterials. 2008. - V.29, P.3415-3428.

141. Wen H., LanX., Zhang Y., Zhao Т., Wang Y., KajiuraZ., Nakagaki M. Transgenic silkworms (Bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons. / Mol Biol Rep. 2009.

142. Williams D.F. On the mechanisms of biocompatibility. / Biomaterials. -2008.-V.29, P.2941-2953.

143. Winkler S., Wilson D., Kaplan D.L. Controlling beta-sheet assembly in genetically engineered silk by enzymatic Phosphorylation/Dephosphorylation, by. / Biochemistry. 2000. - V.39, P.14002.

144. Winyard P.G, Perret D, Harris G, Blake D.R. Thy role of toxic oxygen species in inflammation with special reference to DNA damage. / Whitcher J., Evans S. // Biochemistry of inflammation. 2009. - V.18, P.P. 112.

145. Wong Po F.C., Patwardhan S.V., Belton D.J., Kitchel В., Anastasiades D., Huang J., Naik R.R., Perry C.C., Kaplan D.L. Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins. / Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. V.103, P.9428-9433.

146. Work R.W., Emerson P.D. An Apparatus and Technique for the Forcible Silking of Spiders. / Journal of Arachnology. 1982. - V.10, P.l-10.

147. Wu M.H., Urban J.P., Cui Z.F., Cui Z.r Xu X. Effect of extracellular ph on matrix synthesis by chondrocytes in 3D agarose gel. / Biotechnol Prog. 2007. - V.23, P.430-434.

148. Xiang Wu, Xiang-Yang Liu, Ning Du, Gang-Qin Xu, Bao-Wen Li. Molecular spring: -from spider silk to silkworm silk. / Biological Physics. 2009.

149. Xu M., Lewis R.Y. Structure of a protein superfiber: spider dragline silk. / Proc Natl Acad Sci USA.- 1990. V.87, P.7120-7124.

150. Yaltirik M., Dedeoglu K., Bilgic В., Koray M., Ersev H., Issever H., Dulger O., Soley S. Comparison of four different suture materials in soft tissues of rats. / Oral Dis. 2003. - V.9, P.284-286.

151. Yang J.J., Barr L.A., Fahnestock S.R., Liu Z.B. High yield recombinant silk-like protein production in transgenic plants through protein targeting. / Transgenic Research. 2005. - V.14, P.313-324.

152. Zhang X., Reagan M.R., Kaplan D.L. Electrospun silk biomaterial scaffolds for regenerative medicine. / Adv Drug Deliv Rev. 2009. - V.61, P.988-1006.

153. Zhou S., Peng H., YuX., Zheng X., Cui W., Zhang Z., Li X./ Wang J., Weng J., Jia W., Li F. Preparation and characterizationof a novel electrospun spider silk fibroin/poly(D,L-lactide) composite fiber. / JPhys ChemB. -2008. -V.l 12, P.l 1209-11216.

154. Zhou Y., Wu S., Conticello V.P. Genetically directed synthesis and spectroscopic analysis of a protein polymer derived from a flagelliform silk sequence. / Biomacromolecules. 2001. - V.2, P.l 11-125.

Информация о работе

Пустовалова, Ольга Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы