Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы формирования B-структуры в фибриллярных и глобулярных белках

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Процессы формирования B-структуры в фибриллярных и глобулярных белках"

на правах рукописи

УДК 577 322 4

РАГУЛИНА ЛАРИСА ЕВГЕНЬЕВНА

Процессы формирования [3-структуры в фибриллярных и глобулярных белках

03 00 02 - биофизика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

□ОЗ158793

Москва 2007

003158793

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН на кафедре Молекулярной биофизики Факультета молекулярной и биологической физики Московского физико-технического института (государственного университета)

Научные руководители

доктор физико-математических наук, профессор Владимир Гайевич Туманян

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, профессор Владимир Абрамович Намиот доктор физико-математических наук Нечипуренко Юрий Дмитриевич

Ведущая организация

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г Пущино

Защита состоится 25 октября 2007 г в 10 час 00 мин на заседании диссертационного совета К 212 156 03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл , г Долгопрудный, Институтский пер 9, МФТИ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

В Е Брагин

Общая характеристика работы

Введение. Актуальность проблемы

В связи с акцентированием интересов в области молекулярной биофизики на нанотехнологиях и наноматериалах важная роль отводится фибриллярным биополимерам как носителям особых физических характеристик Источником этих характеристик являются физико-химические свойства макромолекул, которые определяются последовательностью их химических единиц В настоящее время в мире активно ведутся исследования свойств и структур биополимеров, поскольку они являются основой новых уникальных материалов Знание структуры биополимера, понимание ее связи с последовательностью химических символов и процессов фибриллогенеза позволит создавать искусственные волокна с заданными свойствами

Весьма перспективными биополимерами для получения новых материалов считаются белки, образующие паутину Паук выделяет до пяти типов нитей шелка для различных целей, но особый интерес представляет основная нить паутины, поскольку именно она обладает уникальными свойствами Например, ее прочность более, чем в три раза превышает прочность кевлара (синтетического волокна, соперничающего со сталью) Кроме того, волокна паучьего шелка обладают высокой биосовместимостью с организмом человека что открывает большие возможности для использования их в медицине

Получать нить паутины в промышленных масштабах подобно шелку шелкопряда невозможно из-за биологических особенностей пауков, но такую возможность может предоставить генная инженерия, хотя здесь тоже имеются свои трудности Гены белков паутины очень длинны, как и сами белки, а потому процесс их воспроизведения сложен и дорог В связи с этим встает задача упрощения белковой цепи и конструирования искусственного гена, а для этого необходимо знать характерные особенности таких цепей

Фибрилла основной нити паука состоит из белков двух типов - спидроинов 1 и 2 Хотя исследованию структуры и физико-химических свойств нитей паутины посвящено достаточно много работ, а ее механические свойства изучены достаточно хорошо, к настоящему времени известно всего несколько полных аминокислотных последовательностей белков шелка пауков Немногое известно и о структуре фибрилл, образующих паутину Это связано с тем, что экспериментальные методы исследования структуры фибриллярных белков, такие как ЯМР, рентгенография и другие, не дают полного представления об их атомном строении На данный момент известно, что структуры одиночных макромолекул фибриллярных белков, в том числе и спидроинов, изменяются в

процессе фибриллогенеза Установлено, что на заключительной стадии формирования белки основной нити паутины содержат Р-структуру, но не известно, какие части последовательности их образуют, так же не известно строение тех частей белка, которые не свернуты в Р-структуру

На сегодняшний день достаточно хорошо умеют предсказывать вторичную структуру белков по их аминокислотной последовательности статистическими методами Но нет достаточно надежного метода расчета третичной структуры и, в частности, Р-листов В связи с этим развитие подходов к расчету пространственной структуры белков, в том числе и спидроинов, по их аминокислотным последовательностям является важной прикладной задачей биоинформатики

Цель и задачи исследования.

Главной целью проведенной работы было установление связей между последовательностью аминокислот в белках основной нити паутины - спидроинах первого и второго типов - и особенностями формирования их пространственных структур В задачи работы входило

• анализ локальных и нелокальных особенностей последовательности аминокислот в белках основной нити паутины,

• проведение Фурье-анализа последовательностей спидроина первого и второго типов для поиска тех элементов аминокислотных последовательностей, которые связаны с генезисом структур и возникновением необычных физико-химических свойств паутины,

• предсказание вторичной структуры спидроинов 1 и 2 по их аминокислотной последовательности,

• разработка нового метода расчета антипараллельных Р-структур в белках различных типов по их аминокислотной последовательности и его применение к белкам паутины,

• экспериментальный анализ мономолекулярных растворов спидроинов и сухих пленок методами ИК- и КД-спектроскопии

Научная новизна.

Впервые установлена полная картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов, принадлежащих паукам различных видов

Впервые показано, что предсказываемые по последовательности аминокислот вторичные структуры содержат очень мало участков Р-структуры В основном они представляют собой сочетание а-спиралей и левых спиралей типа поли-!-пролин II Экспериментальное исследование водных растворов спидроина 1 и его генно-инженерных аналогов подтвердило результаты проведенного предсказания Оно позволило также сделать вывод, что на последнем этапе фибриллогенеза в спидроинах происходит переход левая спираль типа поли-1-пролин II - (5-структура

Выделены последовательности аминокислот, отражающие основные черты периодичностей спидроинов 1 и 2 Соответствующие формулы

• (F)„- для спидроина 1,

• ABA СА [D В CD А А] [ D BCD Е Е ] DDB - для спидроина 2

Показано, что в спидроинах первого и второго типов наблюдаются одинаковые периоды - это 1 и 14 Такие периоды характерны для распределения аминокислот на участках Р-структуры По-видимому именно аминокислоты, образующие эту периодичность, ответственны за образование (1-слоев в паутине

Периодичности распределения аминокислот, определяющие этапы формирования индивидуальных пространственных структур белков-спидроинов, различны и не свойственны таковым для Р-структур Это и определяет существование квазиглобулярных этапов в фибриллогенезе паутины

Построена модель процессинга белков паутины на разных этапах ее формирования

Практическое значение работы.

Полученные в результате исследований аминокислотных последовательностей структурные формулы спидроинов 1 и 2, лежат в основе отбора последовательностей для синтеза спидроино-подобных белков с заданными свойствами генно-инженерными методами Это позволит получать искусственные волокна шелка паука в количестве, необходимом для получения новых материалов с уникальными свойствами Использовать такой материал можно будет в различных сферах деятельности человека, в том числе и в области медицины

Разработанный метод расчета антипараплельной Р-структуры может быть применен для определения пространственной структуры белков, топологию которых сложно или невозможно установить с помощью известных экспериментальных методов

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертации были представлены на ХЬУ научной конференции МФТИ (2002 г), на Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (ВОЯ5'02, Новосибирск), на Международной московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (МССМВ'ОЗ), на международной конференции ВСЯв (Новосибирск, 2004 г ), на Х1Л V научной конференции МФТИ (2006 г )

По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе две статьи в реферируемых журналах

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована рисунками и содержит таблиц, список литературы включает ссылку Диссертация состоит из введения, шести глав, включая обзор литературы, выводов, списка цитированной литературы и приложения

Краткое содержание работы

Введение

Введение содержит обоснование актуальности темы диссертации, ее научной новизны и практической значимости, приведены положения, выносимые на защиту

Первая глава. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматриваются

- физико-химические свойства основной нити паутины,

- структуры волокон шелка паука и составляющих их белков, методы предсказания Р-структуры в белках

Различные типы паутины обладают необычайными свойствами Например, основная нить паутины имеет прочность, превышающую прочность стали, и способность сильно сжиматься при большой влажности, а липкая нить обладает высокой растяжимостью, превосходящей растяжимость резины Понимание строения шелка пауков приведет к созданию новых искусственных материалов с заданными свойствами

Работы по исследованию пространственной структуры белков шелка пауков в основном относятся к белкам, образующим основную нить паутины, обладающей высокой прочностью К сожалению, экспериментальные методы исследования структуры белков такие, как ЯМР, рентгенография и другие, не дают значительных результатов Предполагается, что в белках, находящихся в фибриллах, присутствует Р-струюгура, образованная аланиновыми блоками, остальная структура неизвестна Тем не менее, хотя короткие участки структур спидроинов первого и второго типов, встроенные в простые полимеры, а так же структуры образованных из них фибрилл и пленок исследуются весьма интенсивно, до сих пор представления о пространственной структуре белков основной нити паутины достаточно туманны Процесс фибриллогенеза паутины очень сложен, а структуры входящих в нее белков претерпевают сильные изменения с момента их выделения в прядильную железу до момента выхода готового волокна

В обзоре литературы подробно анализируются также работы, связанные с предсказанием структур, типа р-лист Такая структура стабилизируется дальними взаимодействиями, а точность их предсказания невелика - примерно 30 % верных предсказаний

Делается вывод о необходимости развития новых подходов к расчету и анализу Р-структур в фибриллярных и глобулярных белках

Вторая глава. Материалы и методы.

Эта глава содержит описание методов анализа аминокислотных последовательностей спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов и их вторичных структур Также приводится описание инструментов, использованных для разработки метода расчета антипараллельной р-структуры в белках по их аминокислотной последовательности

Выборка белков и методы ее анализа

Создана выборка аминокислотных последовательностей спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов из базы данных ЫСВ1 и обоснован способ их выравнивания

Подробно описан метод поиска периодических закономерностей в распределении аминокислот полипептидной цепи ЭушТоиг, разработанный В Ю Макеевым и В Г Туманяном Метод позволяет легко интерпретировать результаты, дает возможность выбора различных численных представлений в любых символьных последовательностях и

возможность поиска в коротких последовательностях периодичностей, повторяющихся на длине последовательности небольшое число раз

Для более полного понимания картины распределения периодов по длине последовательностей была разработана и применена методика Фурье-сканирования с использованием инструмента SymFour. Результаты методики позволяют достаточно точно определять большие периоды и характер их распределения по полипептидной цепи

Программы для предсказания вторичной структуры белков по их аминокислотной последовательности.

Здесь достаточно подробно описан статистический метод предсказания вторичной структуры белка по его аминокислотной последовательности OLIGON Этот инструмент разработан в нашей лаборатории Власовым ПК В этой главе также перечислены другие методы, применявшиеся для предсказания вторичной структуры спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов по их аминокислотным последовательностям

Выбор инструментов для разработки нового метода расчета антипараллельной J5-структуры в белках

Обоснован выбор поля, метода учета воды и стартовых структур Это важно при построении и оптимизации по энергии антипараллельной p-структуры в белках Моделирование проведено в среде TINKER 4 2

Выбор поля и метода учета воды существенен для молекулярного моделирования, так как от параметров поля и водного континуума сильно зависит энергия взаимодействия атомов главной цепи Проведена серия экспериментов по молекулярному моделированию нескольких небольших белков с известной структурой с целью выявления оптимальных параметров среды Выбрано приближение для корректных расчетов как а-спирали так и антипараллельной (3-структуры поле OPLS-UA и неявный метод учета воды STILL В этом приближении удалось построить модель для небольшого белка, для которого среднеквадратичное отклонение полученных координат атомов основной цепи от координат атомов, установленных экспериментально, составило всего 1,26 А

Для молекулярного моделирования выбор начального приближения координат атомов основной цепи так же важен, как и выбор параметров среды В качестве модели анти параллельной Р-структуры мы использовали антипараллельный Р-лист, состоящий из трех тяжей, конформационные углы q>, у и <а которого рассчитали с помощью метода молекулярного моделирования Использованная нами конструкция позволяет сильнее стабилизировать центральный тяж и, таким образом, точнее находить участки

антипараллельной Р-структуры в белках, чем при использовании в качестве начального приближения модели р-шпильки При формировании начального приближения конформации атомов основной цепи была применена предоставленная Филатовым И В редуцированная библиотека коыформаций боковых радикалов

Третья глава Анализ аминокислотной последовательности спидроинов первого и второго типов пауков различных видов

Представленные в этой Главе результаты относятся к изучению регулярных структур, образуемых в белковых цепях различными наборами аминокислотных остатков

Выравнивание аминокислотных последовательностей спидроинов. Сходства и различия.

С помощью анализа аминокислотных последовательностей из различных белков-спидроинов первого и второго типов удалось выявить ряд особенностей, характерных как для каждого из типов в отдельности, так и общих для обоих типов

Основная часть полипептидной цепи любого из белков - спидроинов имеет ботьшую длину (более 3000 аминокислотных остатков) Она расположена между небольшими (примерно по 60 аминокислотных остатков) нерегулярными N- и С-концевыми участками Выравнивание этих частей позволило выявить наличие характерных сочетаний аминокислот, которые повторяются большое число раз (Рис 1)

АААААА GPG GY GPG QQ GPG GPG ААААААА

AAAААААА GPG QQ GPG GY GPG QQ GPG GY GPG QQ GPS GPG SAАААААА

Рис 1 Пример участков последовательности спидроииа 1-го типа

Характерной чертой последовательностей аминокислот основных частей спидроинов обоих типов является сочетание полиаланиновых блоков с участками, богатыми глицинами (Рис 1) Аминокислотный состав спидроинов практически одинаков, за исключением отсутствия пролина в спидроинах первого типа, а также лейцина в спидроинах второго типа (таблица 1)

Вид Аминокислотный состав, %

А С V Ь I N о Е о К Я Б Т с м р У УУ р н

Л/ер/и/а тададазсалеляю 29 46 1 3 0 0 0 0 10 0 1 4 1 0 0 0 5 0 0 0

ЫврМа с/аирев 29 47 1 5 0 0 0 0 10 0 2 3 0 0 0 0 3 0 0 0

Л/ер/и/а вепейга/елвю 32 46 2 4 1 0 0 0 8 0 2 2 0 0 0 0 4 0 0 0

Агдюре аигапЬа 30 46 0 4 0 0 0 1 10 0 2 3 0 0 0 1 4 0 0 0

Агдюре /л/авс/а/а 29 45 0 3 0 0 0 1 11 0 1 5 0 0 0 0 4 0 0 0

¿.а/гос/ес/ия деотеШсиэ 33 46 0 0 0 0 0 0 12 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0

Ьа1гос1ес1и5 Ьеярегиз 34 46 0 0 0 0 0 0 12 0 2 0 0 0 0 0 5 0 0 0

Те(гадпа/а каигепзя 30 43 0 5 0 0 0 0 14 0 0 5 0 0 0 0 2 0 0 0

Агапеия иетога 28 43 2 3 0 0 0 0 9 0 1 6 0 0 0 1 4 0 0 0

Таблица 16 Аминокислотный состав спидроинов второго типа из пауков различных видов

Вид Аминокислотный состав, %

А С V ь I N о Е 9 К и в Т с м р У р Н

ШрЫа табадазсапепэя 23 35 0 0 0 0 0 0 13 0 0 7 0 0 0 0 5 0 17 0

Мер/н/а с/ау/рея 22 35 0 0 0 0 0 0 13 0 0 8 0 0 0 0 5 0 15 0

ЫврМа зепеца1еп51в 29 26 2 2 0 1 1 0 6 0 2 13 1 0 0 0 4 0 14 0

Агдюре аигапЬа 23 31 1 1 0 0 0 0 19 0 1 6 0 0 0 0 4 0 14 0

Агдюре Мазепа 20 38 0 0 0 0 0 0 15 0 1 7 0 0 0 0 4 0 15 0

/.а/гос/ес/ив деотекюив 29 35 0 0 0 1 0 0 5 0 1 11 0 0 0 0 5 0 10 0

Шгос!ВСШ8 /юврешв 32 36 1 0 0 0 0 0 7 0 2 6 1 0 0 0 5 0 9 0

Агапеиэ ЫсеМепапив 23 35 1 0 0 0 0 0 17 0 0 4 0 0 0 0 6 0 14 0

ваз/егасал/Ла таттоза 20 38 1 0 0 0 0 0 14 0 2 6 0 0 0 0 5 0 14 0

Анализ аминокислотных последовательностей спидроинов показал наличие в них больших периодов Для более подробного их изучения и установления полноты картины периодичностей был использован Фурье-анализ

Фурье-анализ аминокислотных последовательностей спидроинов Был выполнен Фурье-анализ всех отобранных последовательностей спидроинов первого и второго типов (длиной более 200 аминокислотных остатков) из пауков различных видов Поскольку длины некоторых из этих аминокислотных последовательностей не превышают 300, то мы рассматривали периоды от 2 до 100

Фурье-анализ последовательностей был выполнен как для всех аминокислот, входящих в последовательность, так и отдельно для каждой Результаты занесены в таблицы и отражены на графиках, приведенных в третьей главе диссертации

Сравнение Фурье-спектров аминокислотных последовательностей спидроинов типа 1 из пауков различных видов показало, что большинство из них имеют спектральные

максимумы на периодах 2, 7, 11, 14, 39-40 Периоды, имеющие максимальную спектральную мощность, лежат в интервале 18-40 (Рис 2) Эти периоды соответствуют средней длине последовательности между соседними полиаланиновыми блоками

801--:-1—----1---

о1--'-1-

0 20 40 60 80 100 120

Периоды

Рис 2 Усредненный Фурье-спектр всех обработанных аминокислотных последовательностей спидроинов 1 из пауков различных видов Анализируя Фурье-спектры последовательностей спидроинов I из пауков различных видов, рассчитанные для отдельных аминокислот, можно сделать выводы о том, какие периоды характерны для той или иной аминокислоты

Сравнение Фурье-спектров аминокислотных последовательностей спидроинов 2 из пауков различных видов показало, что большинство из них имеет спектральные максимумы на периодах 2, 10, 14, 21, 27 Периоды, имеющие максимальную спектральную мощность, лежат в интервале 22 - 46 (Рис 3) Эти периоды, как и для спидроина 1, связаны со средним расстоянием между соседними полиаланиновыми блоками вдоль аминокислотной последовательности Средняя длина участка аминокислотной последовательности между полиаланиновыми блоками в спироине 2 больше, чем в спидроине 1

250

л

& 200 о

X

3 о

к 150

ш

X

л с со

0)

0

0 20 40 60 80 100 120

Периоды

Рис 3 Усредненный Фурье-спектр всех обработанных аминокислотных последовательностей спидроинов 2 из пауков различных видов

Общими же для большинства аминокислотных последовательностей спидроинов первого и второго типа пауков различных видов являются периоды два и четырнадцать Теоретическое конструирование рекомбинантных аналогов спидроинов Возможности современной генной инженерии позволяют получать протяженные последовательности рекомбинантных белков исключительно за счет полимеризации более коротких олигопептидов, которые в дальнейшем мы будем называть «мономерами» Существуют технологические ограничения как на длину каждого мономера, так и на количество различных типов мономеров В нашем случае решено было использовать не более четырех типов мономеров, причем длина мономера каждого из типов не должна превышать 169 аминокислот Нашей целью являлось создание модельной последовательности (из мономеров, удовлетворяющих вышеуказанным требованиям), сохраняющей возможно более близкую к природной последовательности периодическую структуру

На сегодняшний день известны только две полные последовательности аминокислот спидроина 1 и спидроина 2 из паука Ьа/гос/есш Незрегия Еще известна примерно половина аминокислотной последовательности спидроина 2 из паука ЫерЪйа madagascanens^s Именно

эти последовательности мы использовали для создания последовательности искусственного бел ка.

Основываясь на да ниык, полученных в предыдущих разделах, из поли пептидных цепей спидроинов были выделены большие участки последовательности, которые повторяются ца всей длине цепи. Эти участки и стали искомыми мономерами. Они были выстроены таким образом, чтобы как можно ближе воспроизвести исходную последовательность. Из сравнения О урье-спектров искусственной и природной последовательностей следует высокое сходство их основных черт (Рис. 4).

Периоды

Рис. 4 Фурье-спектры аминокислотных последовательностей искусственного и натурального спидроинов 2.

С учетом пернодичн остей разных частей макромолекул и консервативности последовательностей М- и С-концевых участков спидроинов мы получили оптимальные формулы для рскомбинантных белков основной нити паутины. Например, формула аналога спидроина 2 N.madaguscariensis выглядит следующим образом: А К А СА |0 В СО А ЛЦ Г> ВСБ Е Е | ОШ(.

Четвёртая глава. Предсказание вторичных структур

Предсказание вторичной структуры было проведено тремя независимыми способами* I, с использованием программы NNPREDICT (www cmpharm ucsf edu/~nomi/nnpredict htm), II, с помощью сервера JPRED (www compbio dundee ас uk/~www-jpred/), III, с использованием программы OLIGON

Предсказание вторичной структуры спидроинов.

С помощью программы NNPREDICT (www cmpharm ucsf edu/~nomi/nnpredict htm) получены следующие результаты

• В последовательностях аминокислот QGYG, AGRGGLGA, RGEL спидроинов 1 остатки L, Е, Q и Y находятся в форме ß-структуры, а все аланины в полиаланиновых блоках - в а-спиральной конформации

• В регулярной части белков из группы спидроинов 2 не встретилось аминокислот, находящихся в ß-структурной форме, предсказывается только а-спираль для полиаланиновых блоков

• В С-концевых участках спидроинов обоих типов предсказываются участки а-спирали и левой спирали типа поли-1-пролин Ii, есть даже довольно длинные участки с предсказанной структурой

Применение программы OLIGON, разработанной в нашей лаборатории, к аминокислотным последовательностям спидроинов дает следующие результаты

• Все аланины в последовательностях спидроинов I, кроме одного последнего, в полиаланиновых блоках находятся в а-спиральной конформации, а все пролины - в форме левой спирали типа поли-1-пролин II

• В последовательностях спидроина И встречаются такие сочетания аминокислот QGPS, GYGP, PGQQ - где S, Р, Y и Q находятся в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II, GYGQ, где Y имеет ß-структурную конформацию, и PRQQ, где Р и Q находятся в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II, a R имеет а-спиральную конформацию

• В С-концевых участках спидроинов есть довольно длинные (18 аминокислотных остатков) фрагменты с а-спиралями и левыми спиралями типа поли-1-пролин II Предсказание вторичной структуры по последовательности аминокислот для белков

спидроин I и спидроин 2 из пауков разных видов, сделанное с помощью сервера JPRED

( www compbio dundee ас uk/~www-ipred/ ) дает сведения о регулярных вторичных структурах для концевых частей последовательностей

Все методы предсказания вторичной структуры белков по аминокислотной последовательности показывают, что полиаланиновые блоки должны были бы находиться в a-спиральной конформации, если бы белок был мономолекулярным В концевых частях последовательностей есть похожие друг на друга участки, структура которых предсказывается всеми тремя методами как одинаковая

Экспериментальные исследования.

Теоретический анализ последовательностей белков паутины показал, что ¡3-структурная конформация не характерна для последовательностей тех аминокислот, которые свойственны одиночным полипептидным цепям спидроинов двух рассмотренных типов Нашей задачей было понять, являются ли реальными и образуются ли хотя бы на каком-нибудь из этапов формирования паутины те вторичные структуры, которые предсказаны для последовательностей аминокислот рекомбинантных белков, аналогичных спидроинам двух разных типов

Мы провели анализ конформационного состояния двух рекомбинантных белков-аналогов спидроинов I и 2 методом кругового дихроизма (КД), с использованием кинетических и термодинамических подходов

Спектры КД снимали в зависимости от концентрации белков, чтобы найти условия анализа внутримолекулярных локальных конформационных состояний С помощью метода кругового дихроизма (КД) были исследованы растворы рекомбинантных белков 1F9 и 2Е12 в низких концентрациях и подвергнутых различным физическим воздействиям

Раствор белка в концентрации 1 мг/мл разбавляли до различных концентраций, спектры КД снимали на приборе Jasco J718 (Рис 5 и Рис 6 ) Из анализа полученных спектров следует, что набор конформаций в макромолекулах меняется в зависимости от концентрации при концентрациях 0,1 мг/мл и 1 мг/мл наблюдается спектр, характерный для молекул со следующей вторичной структурой а-спираль (-15%), левая спираль типа поли-1-пролин II (в дальнейшем PPII) (-20%) и р-структура (-10%), при концентрации 0,5 мг/мл макромолекулы приобретают в основном (3-структурную конформацию с примесью левой спирали типа PPII и a-спирали Таким образом, по крайней мере в нескольких средах, мы сумели показать, что состояние вторичных структур анализируемых рекомбинантных белков в растворе соответствует тому, что предсказано по последовательности Изменение

содержания вторичных структур при изменениях концентрации подтверждает представление о белках паутины в растворе как о нативно-развернутых,

С целью моделирования процессов, приводящих к фибриллообразованию из молекул белка, находящихся в растворенном состоянии, мы провели изучение влияния механического встряхивания и обработки ультразвуком на конформзционнос состояние макромолекул. Встряхивание раствора белка на вортексе является аналогом деформаций гидродинамического сдвига, происходящих в прядильной железе паука в процессе формирования нити. Для этого снимали спектры КД растворов рекомбинантных спидроинов с концентрациями 0,1; 0,5 и ¡,0 мг/мл до и после встряхивания на вортексе в течение 10 минут (Рис. 6) или обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10 мннуг. После встряхивания КД-спектр раствора ре ком б и пакт но го белка существенно изменяется. Появление спектрального минимума на длине волны

Wavelength, [пгп]

Линии: сплошная - 0.1 мг/мл; прерывистая - 0.5 мг/мл; пунктир - I мг/мл

Рис, 5 Спектры кругового дихроизма реко мбинанттго белка ¡F9 в различных концентрациях

190 нм н максимума - на 220 нм свидетельствуют о том, что значительная часть молекулы ре ком б и на нтн о го белка в растворе с концентрацией 0,1 мг/мЛ принимает вторичную структуру типа РР И; в растворе с концентрацией 0,5 мг/мл - смесь p-структуры и PP1I; при

концентрации 1 мг/мл наблюдается переход большей части молекул в ¡5-структурную конформацню. При этом сохраняются изобестическая точка и ее положение. Такое повеление кривых характерно для систем, в которых все переходы происходят между двумя состояниями. В данном случае промежуточным состоянием является левая спираль типа Г'Р11 Таким образом, можно говорить о переходе из левой спирали типа РРП в {З-структуру

Wavelength[nm]

Линии: сплошная - 0.1 мг/мл; прерывистая - 0.5 мг/мл; пунктир - I мг/мл

Рис. 6 Спектры кругового дихроизма раствора 6елка IF9 в различных концентрациях после встряхивания

Известно, что топология карт Рамачандрана с нанесенными на них областями а-слирали, ¡^структуры и структуры типа поли~|-пролин И такова, что для перехода из а-спирали в левую спирали типа PP1I достаточно изменения только одного угла iff. Аналогично переходы между РРП и Р-структурой сводятся к изменению единственного угла ф. Таким образом, и по этой причине естественно предположить, что вторичная структура промежуточного состояния — это левая спираль типа PPIJ.

Похожая картина, с различиями, определяемыми особенностями Последовательности аминокислот, наблюдалась и для второго из изученных рскомбинантных белков - белка 2Е12, исследования которого подробно описаны в данной главе диссертации.

Хорошо известно, что конформация типа РРН стабилизируется взаимодействиями с водой. А это означает, что именно дегидратация остова поли пептидной цепи коррелирует с

процессом перехода из конформации типа РР II в конформацию р-структур Наши эксперименты показывают, что процессы формирования иативно-подобной структуры белков паутины как при внутримолекулярных процессах, так и при межмолекулярных взаимодействиях, требуют дегидратации остова полипептидной цепи

Сам переход инициируется следующими обстоятельствами изменением концентрации белка, изменением гидродинамических условий системы, в которой происходит процесс формообразования, и изменением физико-химических условий среды Этим он похож на те конформационные изменения, которые имеют место при образовании фиброина шелка ВотЫх топ, амилоида или структур, возникающих после конформационного перехода нормального приона РгРс в патогенный РгРэе и дальнейшей организации нерастворимых фибрилл

Таким образом, спидроины могут быть отнесены к так называемым нативно-развернутым белкам, тек таким белкам, которые в нативном состоянии не обладают уникальной глобулярной структурой, но приобретают ее при различных межмолекулярных взаимодействиях Мноючисленные экспериментальные данные показывают, что Р-структуры образуются в конце процессинга в железе паутины

Глава пятая. Предсказание антнпараллельной Р - структуры в белках по их аминокислотной последовательности.

В этой главе изложен метод расчета антипараллельной Р-структуры в белках по их аминокислотным последовательностям Метод основан на предположении, что фрагмент полипептидной цепи принимает ту конформацию, в которой имеет минимальную энергию Последовательность действий, определяемая методом, такова

1 В качестве начального приближения строится модель р-листа из трех полиаланиновых цепей с глицинами на поворотах (Рис 7а)

2 В среднюю цепь р-листа последовательно включаются тетрапептиды из полипептидной цепи аминокислот анализируемого белка (Рис 76 и 7в)

3 Минимизируется энергия р-листа, при использовании в качестве начального приближения координат атомов полиаланиновых участков главной цепи и конформации боковых радикалов из редуцированной библиотеки конформеров

4 Вычисляется энергия а-спирали для последовательности вытянутого р-листа

5 Энергия р-листа сравнивается с таковой для последовательности Р-листа, вытянутой в а-спираль

Рис 7а Модель /¡-листа из трех тяжей Рис 7в Модель [¡-листа, где

последовательность среднего тяжа заменена на один из тетрапептидов (РУСР)

2 4 1 3

Рис 76 Цепь анализируемого белка, из которой последовательно выбираются

тетрапептиды

Описанной процедуре подвергают все последовательные тетрапептиды полипептидной цепи белка

Участки последовательности, которые склонны к образованию Р-структуры, определяются после нормировки энергии антипараллельной Р-структуры на энергию а-спирали Проводится проверка качества предсказания мест расположения участков Р-структуры в белке Процент верно рассчитанных участков оказался достаточно высоким (таблица 2)

Следующий этап расчетов проделывается для того, чтобы находить дальние контакты между Р-структурными участками полипептидной цепи Необходимо установить пептидные группы тех взаимодействующих аминокислотных остатков, которые формируют антипараллельную Р-структуру Для достижения этого мы модифицируем модель из Рис 7а в центральную и третью нить последовательно помещаются тетрапептиды из реальной полипептидной цепи белка Таким образом, модель предполагает движение окном в четыре

название длина,

белка a o. Q2 Q3

1edm В 38 0,9 0,77

1fre 38 0,8 0,47

1tpn 49 0,71 0,73

1vie 59 0,58 0,72

1apq 52 1 00 0,7

1cro 66 0,5 0,51

1ctf 68 0,83 0,6

1erg 69 0,4 0,58

1pdg A 86 0,6 0,6

1pft 49 0,92 0,57

1tgx A 59 0,63 0,52

1wap A 67 0,56 0,72

1wkt 87 0,76 0,68

2ayh 214 0,5 0,57

2nbt A 59 0,57 0,54

2xbd 86 0,7 0,66

betanova 19 0,66 0,65

Таблица 2 Процент верно предсказанных ¡¡-структурных участков в различных белках аминокислоты вдоль всей цепи и минимизацию энергии получаемой трехнитевой структуры Реально для уменьшения времени расчетов достаточно испытывать только те тетрапептиды, которые на первом этапе анализа предсказаны как р-структурные Оказалось, что при такой стратегии время расчетов меньше на порядок при небольшой потере точности

Проведение описанных процедур дает возможность (после соответствующих минимизации и нормировки на а-спираль) понять, какие участки цепи анализируемого белка взаимодействуют друг с другом

Для проверки метода была взята выборка белков из работы, авторы которой предсказывали антипараллельную и параллельную Р-структуры одним из статистических методов Сравнение процента корректно рассчитанных участков нашим методом и статистическим, свидетельствует в пользу нашего метода - в среднем 31,3 % из статистического метода против 45,5% по методу молекулярного моделирования

Глава шестая Обсуждение результатов

Проведенный анализ распределения аминокислот в последовательностях спидроинов позволил выявить черты сходства и отличия между спидроинами первого и второго типов из пауков различных видов Интересно, что между спидроинами разных типов из пауков одного вида наблюдается больше сходства, чем между спидроинами одного типа из пауков разных

видов Это совершенно не характерно для большинства глобулярных белков Выявление характерных аминокислотных мотивов и особенностей распределения аминокислот по последовательности - это необходимые шаги, ведущие к пониманию пространственной структуры белков паутины, а значит и к получению их искусственных аналогов

В нашей работе наиболее полную картину распределения характерных аминокислотных мотивов по последовательностям спидроинов дал метод Фурье-сканирования Примененная методика позволила выделить как большие, так и малые периоды и их распределение по длине полипептидной цепи Эти исследования позволили создать искусственные аналоги спидроинов первого и второго типов из разных пауков

Анализируя результаты проведенного предсказания вторичной структуры спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов по их аминокислотной последовательности, пришлось заключить, что в одиночной полипептидной цепи белков паутины должны возникать а-спирали и левые спирали типа поли-1-пролин II Экспериментальные исследования вторичных структур спидроинов 1 и 2 показали правильность проведенного теоретического анализа и подтвердили правильность вывода о нативно-развернутом состоянии одиночных молекул спидроинов обоих типов Это позволило объяснить последовательность конформационных изменений при генезисе паутины на основе механизма межмолекулярных взаимодействий между нативно-развернутыми в мономолекулярном состоянии макромолекулами

Приведем несколько показательных экспериментальных фактов Проведенные нами

<

исследования структуры молекул спидроина 1 и его генно-инженерного аналога в растворе, показывают наличие а-спиралей и левых спиралей типа поли-1-пролин II Образование Р-структуры происходило после встряхивании раствора Таким образом, по крайней времени одна из стадий процесса фибриллогенеза молекул паутины состоит в организации термодинамически устойчивой квазиглобулярной формы одиночных макромолекул спидроинов На этой стадии структура молекулы содержит а-спирали и левые спирали типа поли-1-пролин II В фибриллярной стадии происходит образование Р-структуры Эти данные согласуются и с процессом прядения паутины

Разработанный нами новый метод предсказания антипараллельной Р-структуры в белках по их аминокислотным последовательностям основан не на статистическом анализе, а на применении физических принципов формирования пространственных структур белков Точность метода превышает точность описанного в литературе метода, и дает надежд\ на ее

Выводы

1 Показаны принципиальные черты сходства и отличия в распределении аминокислот в последовательностях спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов

2 Впервые установлена картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов

3 На основании проведенных исследований распределения периодичностей в последовательностях аминокислот и их характерных особенностей построены искусственные аналоги спидроинов 1 и 2

4 Проведенные оценки вероятностей распределения вторичных структур вдоль полипептидных цепей спидроинов первого и второго типов свидетельствует о значительном содержании а-спирали и левой спирали типа поли-1-пролин II Это соответствует квази-глобулярному состоянию макромолекулы с малым процентом содержания р-структуры

5 Проведены экспериментальные исследования спидроина 1 и его генно-инженерного аналога Установлено, что в растворе существует термодинамически устойчивая форма, вторичная структура которой соответствует предсказанной

6 Доказано, что процедура образования пространственной структуры основной нити паутины включает несколько этапов, в ходе которой реализуются по крайней мере две термодинамически устойчивые формы

7 Разработан метод расчета антипараллельной Р-структуры в белках Показано, что его точность превышает точность известных методов расчета аналогичных структур

Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1 Рагулина JI Е , Макеев В Ю , Есипова H I , Туманян В Г , Никитин A M , Богуш В Г , Дебабов В Г Исследование периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов Биофизика, 2004, т 49, с 1053-1060

2 Рагулина Л Е, Макеев В Ю , Есипова H Г, Туманян В Г, Власов П К, Богуш В Г, Дебабов В Г Анализ вторичных структур спидроинов первого и второго типов из пауков, принадлежащих различным видам Биофизика, 2004, т 49, с 1147-1149

3 Рагулина J1 Е, Макеев В Ю , Туманян В Г, Есипова H Г , Богуш В Г Анализ периодических закономерностей в первичных структурах спидроинов и построение модельной последовательности рекомбинантпого белка XLV научная конференция МФТИ, 2002, с 73

4 Ragulina L Е, Makeev V Ju , Esipova N G , Tumanian V G , Bogush V G , Sidoruk К S , Debabov V G Spider silk fibrous protein p structure and largeperiodical patterns BGRS Новосибирск, 2002, v 3, pp 128-130

5 Ragulina L E , Makeev V Ju , Esipova N G , Tumanian V G , Bogush V G , Sidoruk К S , Debabov V G Intermolecular large-scale segmental duplications in the sequence of spider-web protein Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2003, с 196-197

6 Ragulina L E, Makeev V Ju , Esipova N G , Tumanian V G , Vlasov P К, Bogush V G , Debabov V G Periodikal patterns m sequences of SPIDROINSI and II and secondary structure prediction, BGRS Новосибирск 2004,, v l,pp 343-346

Рагулина Лариса Евгеньевна

Процессы формирования (3-структуры в фибриллярных и глобулярных белках

Автореферат

Подписано в печать 12 09 2007 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Уел печ л 1,0 Уч-изд л 1,0 Тираж 70 экз Заказ № ф-346

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских сиск «ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ» 141700, Московскаяобл , г Долгопрудный, Институтский пер,9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Рагулина, Лариса Евгеньевна

Введение.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Практическое значение работы.

Первая

глава. Обзор литературы.

Вторая

глава. Материалы и методы.

Выборка белков и методы ее анализа.

Программы для предсказания вторичной структуры белков по их аминокислотной последовательности.

Выбор инструментов для разработки нового метода расчета антипараллельной p-структуры в белках.

Третья

глава. Анализ аминокислотной последовательности спидроинов первого и второго типов пауков различных видов.37 Выравнивание аминокислотных последовательностей спидроинов.

Сходства и различия.

Фурье-анализ аминокислотных последовательностей спидроинов.45 Теоретическое конструирование рекомбинантных аналогов спидроинов.

Четвёртая

глава. Предсказание вторичных структур.

Предсказание вторичной структуры спидроинов.

Экспериментальные исследования.

Глава пятая. Предсказание антипараллельной J3 - структуры в белках по их аминокислотной последовательности.

Глава шестая. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Процессы формирования B-структуры в фибриллярных и глобулярных белках"

В связи с акцептированием интересов в области молекулярной биофизики на нанотехнологиях и наноматериалах важная роль отводится фибриллярным биополимерам как носителям особых физических характеристик. Источником этих характеристик являются физико-химические свойства макромолекул, которые определяются последовательностью их химических единиц. В настоящее время в мире активно ведутся исследования свойств и структур биополимеров, поскольку они являются основой новых уникальных материалов. Знание структуры биополимера, понимание ее связи с последовательностью химических символов и процессами фибриллогенеза позволит создавать искусственные волокна с заданными свойствами.

Весьма перспективными биополимерами для получения новых материалов считаются белки, образующие паутину. Паук выделяет до пяти типов нитей шелка для различных целей, но особый интерес представляет основная нить паутины, поскольку именно она обладает уникальными свойствами. Например, ее прочность более, чем в три раза превышает прочность кевлара (синтетического волокна, соперничающего со сталью). Кроме того, волокна паучьего шелка обладают высокой биосовместимостью с организмом человека, что открывает большие возможности для использования их в медицине.

Получать нить паутины в промышленных масштабах подобно шелку шелкопряда невозможно из-за биологических особенностей пауков, но такую возможность может предоставить генная инженерия, хотя здесь тоже имеются свои трудности. Гены белков паутины очень длинны, как и сами белки, а потому процесс их воспроизведения сложен и дорог. В связи с этим встает задача упрощения белковой цепи и конструирования искусственного гена, а для этого необходимо знать характерные особенности таких цепей.

Фибрилла основной нити паука состоит из белков двух типов - спидроинов 1 и 2. Хотя исследованию структуры и физико-химических свойств нитей паутины посвящено достаточно много работ, а ее механические свойства изучены достаточно хорошо, к настоящему времени известно всего несколько полных аминокислотных последовательностей белков шелка пауков. Немногое известно и о структуре фибрилл, образующих паутину. Это связано с тем, что экспериментальные методы исследования структуры фибриллярных белков, такие как ЯМР, рентгенография и другие, не дают полного представления об их атомном строении. На данный момент известно, что структуры одиночных макромолекул фибриллярных белков, в том числе и спидроинов, изменяются в процессе фибриллогенеза. Установлено, что на заключительной стадии формирования белки основной нити паутины содержат p-структуру, но не известно, какие части последовательности их образуют; так же не известно строение тех частей белка, которые не свернуты в p-структуру.

На сегодняшний день достаточно хорошо умеют предсказывать вторичную структуру белков по их аминокислотной последовательности статистическими методами. Но нет достаточно надежного метода расчета третичной структуры и, в частности, Р-слоев. В связи с этим развитие подходов к расчету пространственной структуры белков, в том числе и спидроинов, по их аминокислотным последовательностям является важной прикладной задачей биоинформатики.

Цель и задачи исследования.

Главной целью проведённой работы было установление связей между последовательностью аминокислот в белках основной нити паутины - спидроинах первого и второго типов - и особенностями формирования их пространственных структур. В задачи работы входило:

• анализ локальных и нелокальных особенностей последовательности аминокислот в белках основной нити паутины;

• проведение Фурье-анализа последовательностей спидроинов первого и второго типов для поиска тех элементов аминокислотных последовательностей, которые связаны с генезисом структур и возникновением необычных физико-химических свойств паутины;

• предсказание вторичной структуры спидроинов 1 и 2 по их ам и нокислотной последовател ьности;

• разработка нового метода расчета антипараллельных Р-структур в белках различных типов по их аминокислотной последовательности и его применение к белкам паутины;

• экспериментальный анализ мономолекулярных растворов спидроинов и сухих пленок методами ИК- и КД-спектроскопии.

Научная новизна.

Впервые установлена полная картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов, принадлежащих паукам различных видов.

Впервые показано, что предсказываемые по последовательности аминокислот вторичные структуры содержат очень мало участков (3-структуры. В основном они представляют собой сочетание а-спиралей и левых спиралей типа поли-1-пролин II. Экспериментальное исследование водных растворов спидроина 1 и его генно-инженерных аналогов подтвердило результаты проведенного предсказания. Оно позволило также сделать вывод, что на последнем этапе фибриллогенеза в спидроинах происходит переход: левая спираль типа поли-1-пролин II - р-структура.

Выделены последовательности аминокислот, отражающие основные черты периодичностей спидроинов 1 и 2. Соответствующие формулы:

• (F)„ - для спидроина 1;

• ABA СА [D В CD А А] [ D BCD Е Е ] DDB - для спидроина 2.

Показано, что в спидроинах первого и второго типов наблюдаются одинаковые периоды - это 2 и 14. Такие периоды характерны для распределения аминокислот на участках p-структуры. По-видимому именно аминокислоты, образующие эту периодичность, ответственны за образование р-слоев в паутине.

Периодичности распределения аминокислот, определяющие этапы формирования индивидуальных пространственных структур белков-спидроинов, различны и не свойственны таковым для Р-структур. Это и определяет существование квазиглобулярных этапов в фибриллогенезе паутины.

Построена модель процессинга белков паутины на разных этапах ее формирования.

Практическое значение работы.

Полученные в результате анализа аминокислотных последовательностей структурные формулы спидроинов 1 и 2, лежат в основе отбора последовательностей для синтеза спидроино-подобных белков с заданными свойствами генно-инженерными методами. Это позволит получать искусственные волокна шелка паука в количестве, необходимом для получения новых материалов с уникальными свойствами. Использовать такой материал можно будет в различных сферах деятельности человека, в том числе и в области медицины.

Разработанный метод расчета антипараллельной p-структуры может быть применен для определения пространственной структуры белков, топологию которых сложно или невозможно установить с помощью известных экспериментальных методов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рагулина, Лариса Евгеньевна

Выводы

1. Показаны принципиальные черты сходства и отличия в распределении аминокислот в последовательностях спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.

2. Впервые установлена картина распределения периодичностей в последовательностях аминокислот спидроинов первого и второго типов из пауков различных видов.

3. На основании проведенных исследований распределения периодичностей в последовательностях аминокислот и их характерных особенностей построены искусственные аналоги спидроинов 1 и 2.

4. Проведенные оценки вероятностей распределения вторичных структур вдоль полипептидных цепей спидроинов первого и второго типов свидетельствует о значительном содержании а-спирали и левой спирали типа поли-1-пролин II. Это соответствует квази-глобулярному состоянию макромолекулы с малым процентом содержания Р-структуры.

5. Проведены экспериментальные исследования спидроина 1 и его генно-инженерного аналога. Установлено, что в растворе существует термодинамически устойчивая форма, вторичная структура которой соответствует предсказанной.

6. Доказано, что процедура образования пространственной структуры основной нити паутины включает несколько этапов, в ходе которой реализуются по крайней мере две термодинамически устойчивые формы.

7. Разработан метод расчета антипараллельной Р-структуры в белках. Показано, что его точность превышает точность известных методов расчета аналогичных структур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Рагулина, Лариса Евгеньевна, Москва

1. Фриц Фольрат. Паучьи сети и шелк. // Ж. В мире науки 1992; 5,46-53.

2. S. Tasman, P. R. Shewry. Elastomeric proteins: biologycal roles, structure andmecanisms. // TIBS 2000.

3. M. Berenbaum. Spin control. //Science 1995; Sept./Oct.: 13-15.

4. Gosline J. M., et al. The mechanical design of spider silk: from fibroin sequence to mechanical function. // J. Exp. Biol. 1999; 202: 3295 3303.

5. Cheryl Y. and a.e. Hypotheses that correlate thesequence, structure, and mechanical properties of spider silk protein. //J. Biol. Macromol. 1999; 24: 271-275.

6. Z. Shao, F. Vollrath. Surprising strength of silkworm silk. // Nature 2002; 418: 741.

7. Bo Madsen and a.e. Variability in the mechanical properties of spider silks on three levels: interspecific, inttraspecific and intraindividual. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 301-306.

8. Anne M. F. Moore, Kimly Tran. Material properties of cobweb silk from the black widow spider Latrodectus hesperus. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 277-282.

9. Denny, M., et al. The physical properties of spider's silk and their role in the design of orb webs. // J. Exp. Biol. 1976; 65:483 - 506.

10. Fritz Vollrath. Biology of spider silk. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 81-88.

11. Work R. W. Dimensions, birefringence and force elongation behaviour of major and minor ampullate silk fibres from orb - web spinning spiders. // Text. Res. J. 1977; 47: 650 -662.

12. Lynn W. Jelinski et al. Orientation, structure, wet spinning, and molecular basis for supercontraction of spider dragline silk. // J. Biol. Macromol. 1999; 24: 197 - 201.

13. Michael, В., et al. Synthetic spider silk: a modular fiber. // J. Science 2000; 18: 374 379.

14. J. Gatesy and a.e. Extreme diversity, conservatin, and convergence of spider silk fibroin sequences. // Science 2001; 291: 2603-2605.

15. Simmons, A. H. et al. Molecular orientation and two component nature of the crystalline fraction of spider dragline silk. // J. Science 1996; 271: 84 - 87.

16. D. A. Tirrell. Putting a new on spider silk. // Science 1996; 271:39-40.

17. E. Oroudjev and a.e. Segmented nanofibers of spider dragline silk: Atomic force microscopy and single-molecule force spectroscopy. // Natl. Acad. Sci. USA 2002; 199: 6460-6465.

18. J. D. Van Beek and a.e. The molecula structure of spider dragline silk: folding and oroentation of the protein backbone. // PNAS 2002; vol 99, no. 16,10266-10271.

19. Michael, В., et al. Synthetic spider silk: a modular fiber. // J. Science 2000; 18: 374 379.

20. Rathore О. and Sogah D. Self-assembly of -sheets into nanostructures by poly(alanine) segments incorporated in multiblock copolymers inspired by spider. // J. Am. Chem. Soc. 2001; 123:5231 -5239.

21. Cheril Y., Randolph V. L. Evidence from flagelleform silk cDNA for the structural basia of elasticity and modular nature of spider silk. // J. Mol. Biol. 1998; 275: 773-784.

22. Liang Ding, Cang Chen and a.e. The pentapeptide GGAGG has P|| conformation. // J. Am. Chem. 2003; 125: 8092 8093.

23. Hyoung-Joon Jin, David L. Caplan. Mechanism of silk processing in insects and spiders. //Nature 2003; 424:1057-1061.

24. Fritz Vollrath, David P.Kinght. Liquid crystalline spinning of spider silk. //Nature 2001; 1410: 541-548.

25. E. K. Tillinghast, M. A. Townley. Silk glands of Araneid spiders. Selected morfological and Physiological aspects. // Silk polymers: materials science and biotechnology 1994; 29-44.

26. M. Elices. (2000) Structural Biological Materials Design and structure-property relationships.

27. Makeev, V. Ju. and Tumanyan, V.G. Search of periodicities in primary structure of biopolymers: ageneral Fourier approach. //J. Cabios 1996; 12:49 54.

28. A. Lazaris and a.e. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in Mammalian cells. // Science 2002; 295:472-476.

29. S.R. Fahnestock & L. A. Bedzyk. Production of sinthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. //Mocrobiol. Biotecnol. 1997; 47: 33-39.

30. Vollrath F., Kinght D.P. Liquid crystalline spinning of spider silk. // Nature. 2001. V. 410. P.541.

31. Xu M., Lewis R.V. Structure of a protein superfiber: spider dragline silk. //Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87(18). P. 7120.

32. Финкельштейн A.B. Введение в физику белка. 2002.

33. Pedersen J.T. & Moult J. Protein folding simulation with genetic algorithms and a detailed molecular description. // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 240.

34. Mohanty D., Elber R. Kinetics of peptide folding: computer simulations of SYPFDV and peptide varians in water. // J.Mol. Biol. 1997. V. 272. P.423.

35. Koehl P. & Levitt M. De novo protein design. I. In search of stability and specificity. // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. P.1161.

36. Chipot C. Free energy calculation in biological systems. How useful are they in practice? // Free energy calculation. P. 183.

37. Kollman P.A. Free energy calculations: Applications to chemical and biochemical phenomena // Chem. Rev. 1993. V. 93. P. 2395.

38. Gosline J.M., DeMont M.E., Denny M.W. The structure and properties of spider silk. // Endeavour 1986;10:37-43.

39. Blackledge T.A., Hayashi C.Y. Silken toolkits: biomechanics of silk fibers spun by the orb web spider Argiope argentata (Fabricius 1775). // J Exp Biol 2006; 209:2452-2461.

40. Hayashi C.Y., Shipley N.H., Lewis R.V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. // Int J Biol Macromol 1999; 24:271-275.

41. Hayashi C.Y., Blackledge T.A., Lewis R.V. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. // Mol Biol Evol 2004; 21: 1950-1959.

42. Sponner A., Schlott В., Vollrath F., Unger E., Grosse F., et al. Characterization of the protein components of Nephila clavipes dragline silk. // Biochemistry 2005; 44: 47274736.

43. Zhao A., Zhao Т., Nakagaki K., Zhang Y-S, SiMa Y., et al. Novel molecular and mechanical properties of egg case silk from wasp spider, Argiope bruennichi. // Biochemistry-US 2006; 45: 3348-3356.

44. Nadia A. Ayoub, Jessica E. Garb, Robin M. Tinghitella, Matthew A. Collin, Cheryl Y. Hayashi. Blueprint for a High-Performance Biomaterial: Full- Length Spider Dragline Silk Genes. // PLoS ONE 2007; Issue 6, e 514.

45. Blackledge T.A., Hayashi C.Y. Silken toolkits: biomechanics of silk fibers spun by the orb web spider Argiope argentata (Fabricius 1775). // J Exp Biol 2006; 209:2452-2461.

46. O'Brien J.P., Fahnestock S.R., Termonia Y., Gardner K.H. Nylons from nature: synthetic analogs to spider silk. // Adv Mater 1998; 10:1185-1195.

47. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silkelastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation. // Transgenic Res. 2004; 13: 51-57.

48. Bini E., Foo C.W.P., Huang J., Karageorgiou V., Kitchel В., et al. RGDfunctionalized bioengineered spider dragline silk biomaterial // Biomacromolecules 2006; 7: 3139— 3145.

49. Scheller J., Gu'hrs K-H, Grosse F., Conrad U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. // Nat Biotechnol 2001; 19: 573-577.

50. Foo C.W.P., Bini E., Huang J., Lee S.Y., Kaplan D.L. Solution behavior of synthetic silk peptides and modified recombinant silk proteins. // Appl. Phys. 2006; 82: 193-203.

51. Ittah S., Cohen S., Garty S., Cohn D., Gat U. An essential role for the Cterminal domain of a dragline spider silk protein in directing fiber formation. // Biomacromolecules 2006; 7: 1790-1795.

52. Sprague K.U. The Bombyx mori silk proteins: characterization of large polypeptides. // Biochemistry 1975; 14: 925-931.

53. Sponner A., Vater W., Rommerskirch W., Vollrath F., Unger E., et al. The conserved C-termini contribute to the properties of spider silk fibroins. // Biochem Biophys. Res. Commun. 2005; 338: 897-902.

54. Motriuk-Smith D., Smith A., Hayashi C.Y., Lewis R.V. Analysis of the conserved N-terminal domains in major ampullate spider silk proteins. // Biomacromolecules 2005; 6: 3152-3159.

55. Rising A., Hja" lm G., Engstro'm W., Johansson J. N-terminal nonrepetitive domain common to dragline, flagelliform, and cylindriform spider silk proteins. // Biomacromolecules 2006; 7:3120-3124.

56. Sakharkar M.K., Kangueane P. Genome SEGE: A database for 'intronless' genes in eukaryotic genomes. // BMC Bioinformatics 2004; 5: 67.

57. Guerette P.A., Ginzinger D.G., Weber B.H.F., Gosline J.M. Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family. // Science 1996; 272: 112115.

58. Beckwitt R., Arcidiacono S. Sequence conservation in the C-terminal region of spider silk proteins (spidroin) from Nephila clavipes (Tetragnathidae) and Araneus bicentenarius (Araneidae). // J. Biol. Chem. 1994; 269: 6661-6663.

59. Garb JE, DiMauro T, Vo V, Hayashi CY Silk genes support the single origin of orb webs. // Science 2006; 312:1762.

60. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K., Kail S., Peter M. Vogt Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit. // J. Cell. Mol. Med. 2006; Vol 10, No 3, pp. 770-777.

61. Murzin A.G., Brenner S.E., Hubbard Т., Chothia C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. // J. Mol. Biol. 1995; 247: 536-540.

62. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on positionspecific scoring matrices. // J. Mol. Biol. 1999; 292:195-202.

63. Rost B, Sander C. Third generation prediction of secondary structures. // Methods Mol. Biol. 2000;143:71-95.

64. Wolf Y.I., Grishin N.V., Koonin E.V. Estimating the number of protein folds and families from complete genome data. // J. Mol. Biol. 2000; 299: 897-905.

65. Sternberg M.J., Thornton J.M. On the conformation of proteins: the handedness of the connection between parallel beta-strands. // J. Mol. Biol. 1977;110:269-283.

66. Woolfson D.N., Evans P.A., Hutchinson E.G., Thornton J.M. Topological and stereochemical restrictions in beta-sandwich protein structures. // Protein. Eng. 1993; 6: 461-470.

67. Salem G.M., Hutchinson E.G., Orengo C.A., Thornton J.M. Correlation of observed fold frequency with the occurrence of local structural motifs. // J. Mol. Biol. 1999; 287: 969981.

68. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Res. 2000; 28:235-242.

69. Taylor W.R. Towards protein tertiary fold prediction using distance and motif constraints. // Protein Eng. 1991; 4: 853-870.

70. Karplus K., Barrett C., Hughey R. Hidden Markov models for detecting remote protein homologies. // Bioinformatics 1998; 14: 846-856.

71. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z. Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. //Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402.

72. Shi J., Blundell T.L., Mizuguchi K. Fugue: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. // J. Mol. Biol. 2001; 310:243-257.

73. Lindahl E., Elofsson A. Identification of related proteins on family, superfamily and fold level. // J. Mol. Biol. 2000; 295:613-625.

74. Robert E. Steward, Janet M. Thornton. Prediction of Strand Pairing in Antiparallel and Parallel P-Sheets Using Information Theory. // PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 2002;48:178-191.

75. Minor D.L. Jr, Kim P.S. Measurement of the beta-sheet-forming propensities of amino acids. //Nature 1994; 367:660-663.

76. Minor D.L. Jr, Kim P.S. Context-dependent secondary structure formation of a designed protein sequence. //Nature 1996; 380: 730-734.

77. Cootes A.P., Curmi P.M., Cunningham R., Donnelly C., Torda A.E. The dependence of amino acid pair correlations on structural environment. // Proteins 1998; 32 :175-189.

78. Merkel J.S., Regan L. Aromatic rescue of glycine in beta sheets. // Fold. Des. 1998; 3: 449-455.

79. Hutchinson E.G., Sessions R.B., Thornton J.M., Woolfson D.N. Determinants of strand register in antiparallel beta-sheets of proteins. //Protein Sci. 1998; 7:2287-2300.

80. Mandel-Gutfreund Y., Zaremba S.M., Gregoret L.M. Contributions of residue pairing to beta-sheet formation: conservat // J. Mol. Biol. 2001; 305:1145-1159.

81. Merkel J.S., Sturtevant J.M., Regan L. Sidechain interactions in parallel beta sheets: the energetics of cross-strand pairings. // Struct. Fold. Des. 1999; 7:1333-1343.

82. Smith C.K., Regan L. Guidelines for protein design: the energetics of beta sheet side chain interactions. // Science 1995; 270: 980-982.

83. Zaremba S.M., Gregoret L.M. Context-dependence of amino acid residue pairing in antiparallel beta-sheets. // J. Mol. Biol. 1999; 291:463^179.

84. Hubbard T.J. Use of beta-strand interaction pseudo-potentials in protein structure prediction and modelling. // In: Lathrop RH, editor. Protein structure prediction minitrack of the 27th HICSS. New York: IEEE Computer Society Press 1994; p 336-354.

85. Hubbard T.J., Park J. Fold recognition and ab initio structure predictions using hidden Markov models and beta-strand pair potentials. // Proteins 1995; 23:398-402.

86. Bochicchio B, Pepe A, Tamburro AM. On (GGLGY) synthetic repeating sequences of lamprin and analogous sequences. // Matrix Biol. 2001; 20(4):243-250