Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2

Громов, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2"

На правах рукописи

Громов Александр Викторович

ПОВЫШЕНИЕ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ИМПЛАНТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ КОСТНОГО КОЛЛАГЕНА И РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА гИВМР-2

Специальности: 03.01.04 - биохимия 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДЕК т

Москва 2013

005543102

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Карягина-Жулина

химических технологий имени М.В. Ломоносова Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится <М» декабря 2013 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «За ноября 2013 года. Ученый секретарь Диссертационного совета

Анна Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

доктор химических наук, профессор Московского государственного университета тонких

Копылов

Алексей Михайлович

Каплун

Александр Петрович

кандидат химических наук

Сакодынская Инна Карловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Проблема восстановления анатомической целостности и функциональности сегментов опорно-двигательного аппарата при его повреждениях по-прежнему остается весьма актуальной. В случае неудачной фиксации, при большом объеме повреждения, а также в пожилом возрасте собственная регенеративная функция кости может оказаться недостаточной, что приводит к неполному сращению, возникновению ложного сустава, повторным переломам или дефектам кости. Для стимуляции репаративного остеогенеза и восстановления целостности костной ткани используются материалы как природного, так и искусственного происхождения [Janicki, 2011].

Применение аутологичного костного материала, полученного из подвздошного гребня, нижней или верхней челюсти самого пациента, высокоэффективно благодаря наличию собственных клеточных и внеклеточных компонентов пациента [Becker, 1994; Urist, 1974], обеспечивающих регенеративный потенциал. Однако процедура забора материала болезненна и травматична, увеличивает время основной операции, может быть связана с последующими осложнениями [Cricchio, 2003; Joshi, 2004], а также имеет ограничения по допустимому объему забираемой костной ткани. Использование аутотрансплататов нежелательно в детском и пожилом возрасте.

В качестве альтернативы аутологичной кости широко применяются материалы на основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) как аллогенного, так и ксеногенного происхождения [Strates, 1993; Савельев, 1996; Solheim, 1998; Bauer, 2000; Oakes, 2003; Takikawa, 2003]. Костный матрикс, лишенный минеральной основы, быстрее васкуляризируется в организме реципиента и замещается новообразованной костной тканью [Urist, 1971; Yoon, 2002; Булатов, 2005]. ДКМ обладает высокой биосовместимостью, может служить матрицей для остеогенных клеток, проникающих в имплантат (остеокондуктивность), а также стимулировать образование новой костной ткани (остеоиндуктивность). По своему составу ДКМ на 98% представляет собой коллаген I типа. Кроме того, ДКМ содержит комплекс костных морфогенетических белков (bone morphogenetic protein, BMP), обуславливающих его остеоиндукгивные свойства.

Согласно результатам современных исследований, BMP являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. BMP это цитокины, принадлежащие к суперсемейству трансформирующего ростового фактора -р. Они действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют значительную роль в регулировании роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки. К настоящему времени идентифицировано 20 видов BMP, наиболее изученными из которых являются ВМР-2 и ВМР-7.

Активность нативных факторов роста, входящих s состав ДКМ, сильно различается у материалов, полученных по различным методикам [Li, 2000; Wildemann, 2007]. Избыточная деминерализация костного матрикса [Iwata, 2002], использование химических реагентов [Hallfeldt, 1992; Pekkarinen, 2004], термическая обработка [Ни, 1997], высокие дозы гамма-излучения [Howard, 1998], используемые при изготовлении ДКМ, могут существенно снижать активность факторов роста, входящих в его состав, что негативно сказывается на остеиндуктивных свойствах материала [Pietrzak, 2009]. Таким образом, существует необходимость разработки методики получения ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости, определяющих его остеоиндуктивный потенциал.

Помимо оптимизации условий получения ДКМ, регенеративный потенциал разрабатываемого остеопластического материала может быть повышен за счет введения в его состав дополнительных факторов роста кости. С помощью методов генной инженерии разработаны технологии получения рекомбинантных BMP, в том числе рекомбинантного человеческого ВМР-2 (rhBMP-2) [Niederwanger, 1996; Schwartz, 1998]. Данные технологии позволяют синтезировать белок в количестве, достаточном для производства содержащих его остеопластических материалов в промышленных масштабах [Bessho, 2000].

В настоящее время ряд таких материалов активно применяется в США и странах западной Европы при лечении сложных травм и переломов, например, «INFUSE» (Medtronic Biologies, США) и «OSSIGRAFT» ОР-1 (Stryker Biotech, США). Применение этих материалов в России ограничено из-за их крайне высокой стоимости, поэтому разработка остеоиндуктивных костнопластических материалов отечественного производства, более дешевых и доступных, сделает возможным их внедрение в российскую практику здравоохранения.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является разработка и оптимизация методики получения композиционного материала с повышенным регенеративным потенциалом на основе костного коллагена (ДКМ) и рекомбинантного белка человека rhBMP-2 для регенерации костной ткани.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка оптимизированной методики получения высокоочищенного ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости.

2. Определение биологической активности in vitro и in vivo препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli.

3. Разработка методики получения композиционного материала на основе ДКМ с добавлением гиалуроновой кислоты и rhBMP-2, позволяющей сохранить их биологическую активность.

4. Исследование регенеративного потенциала разработанного композиционного материала на моделях дефектов костей животных.

Научная новизна

Разработана оптимальная методика получения высокоочищенного ДКМ в виде крошки, блоков, мембран и стержней различного размера с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости ВМР-2 (160-180 нг/г) и ВМР-7 (100-145 нг/г), включающая стадии контроля готовой продукции по ряду параметров: степень деминерализации, остаточное содержание липидов, нативных факторов роста ВМР-2 и ВМР-7, влажность, pH, микробиологическая обсемененность.

Доказана высокая биологическая активность полученного в лаборатории препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli. Полученный препарат взаимодействует со специфическими антителами к ВМР-2. Остеоиндукгивная активность rhBMP-2 в тестах in vitro и in vivo не уступает активности зарубежных коммерческих препаратов-аналогов.

Разработана методика иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ, позволяющая сохранить их биологическую активность. Для повышения пластичности полученного композиционного материала на основе ДКМ в его состав была добавлена гиалуроновая кислота, было подобрано оптимальное соотношение компонентов.

Показан высокий регенеративный потенциал разработанных остеопластических материалов на моделях ортотопического остеогенеза у

крыс, восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюсти собаки, а также дефектов бедренных и большеберцовых костей у кроликов.

Проведены токсикологическое исследование, а также клиническая апробация разработанных материалов.

Практическая значимость работы

Разработанный в рамках диссертационной работы материал на основе ДКМ в виде крошки был зарегистрирован как ИМН «Крошка костная деминерализованная лиофилизированная для заполнения костных дефектов «Гамалант-крошка»» (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13111) и разрешен для применения на территории Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения. Область применения: травматология, ортопедия, спинальная хирургия, челюстно-лицевая хирургия.

Остеопластические материалы на основе ДКМ в виде блоков, мембран и стержней с добавлением рекомбинантного фактора роста кости гЬВМР-2, полученные по разработанной технологии, могут быть использованы в качестве изделий медицинского назначения и в качестве компонентов при изготовлении других изделий медицинского назначения, применяемых в общей травматологии, хирургии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии.

Препарат г(1ВМР-2, полученный по разработанной методике, может применяться как дополнительный компонент различных композиционных остеопластических материалов с целью улучшения их остеоиндуктивных свойств.

Апробация работы

Результаты работы доложены на IX всероссийском съезде травматологов-ортопедов в г. Саратов 15-17 сентября 2010 года, всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Илизаровские чтения» в г. Курган 8-10 июня 2011 г., всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» в г. Москва 14-15 октября 2011 г., научно-практической конференции с международным участием «Чаклинские чтения» в г. Екатеринбург 26-27 октября 2011 г., международной научно-практической конференции «Фармацевтические и Медицинские Биотехнологии» в г. Москва 20 - 22 марта 2012 г., всероссийской научно-практической конференции «Малоинвазивные технологии в травматологии - ортопедии и нейрохирургии» в г. Саратове 26-27 сентября

2013 г., XVI съезде ортопедов-травматологов Украины в г. Харьков 3-5 октября 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 - в журналах, в том числе в трех, рекомендованных ВАК РФ; 6 - в материалах конференции; получен один патент на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные результаты и их обсуждение, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на 224 источника, из которых 32 отечественных и 192 иностранных. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 68 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка методики получения деминерализованного костного матрикса

Исходный материал для получения ДКМ представлял собой бедренные кости крупного рогатого скота (ООО «КРОСС», Россия). На первой стадии кость фрагментировали и удаляли кровь, костный мозг и мягкие ткани. Были определены условия предварительной обработки костей и оптимальная толщина распила. Далее проводилось двухстадийное обезжиривание детергентом (2% Т\лгееп-80) и органическими растворителями (смесь этанол -диэтиловый эфир). Для определения оптимальной продолжительности обработки костных пластин определяли содержание жира в губчатом веществе в процентах от массы образца. На рис. 1, А приведены объединенные результаты изменения содержания жира в губчатом веществе в процессе двух стадий обезжиривания. Для достижения полной очистки и обезжиривания костных пластин, обработку детергентом следует проводить в течение 72 часов, последующую обработку смесью органических растворителей - в течение 48 часов. Остаточное содержание жира в полученном материале не превышало предел обнаружения.

После обезжиривания костные пластины размалывали и полученную костную крошку подвергали обработке соляной кислотой.

Определение оптимального размера частиц для полной деминерализации крошки проводилось на электронном сканирующем микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, США). Для этого кортикальную пластину подвергали длительной обработке соляной кислотой и определяли элементный состав материала на различном расстоянии от поверхности пластины. При этом глубина деминерализации составила 0,25 мм, что соответствует размеру частиц 0,5 мм.

Оптимизацию стадии деминерализации также проводили по времени обработки и концентрации кислоты (рис. 1, Б). Содержание кальция определялось с помощью качественной реакции с крезолфталеин-комплексоном в золе, образованной после сжигания костного матрикса в муфельной печи. По результатам анализа, для достижения полной деминерализации костной крошки размером 0,5 мм оптимальными условиями являются обработка 10-кратным объемом 0,6 М соляной кислоты в течение 60 минут, что в два раза быстрее по сравнению с литературными данными [Pietrzak, 2009]. Такой эффект может объясняться лучшей степенью очистки ДКМ от липидного компонента на стадии обезжиривания (Рис. 1, А), а также использованием частиц костной ткани оптимального размера.

Далее полученный ДКМ в виде крошки отмывали от кислоты, обрабатывали этиловым спиртом для первичной стерилизации и проводили микробиологический контроль первичной обсемененности. Далее ДКМ высушивали в сушильном вакуумном шкафу, повторно размалывали на мельнице, разделяли на фракции по размеру с помощью виброгрохота и

лиофилизовали для удаления связанной воды. Стадии первичного высушивания и лиофилизации оптимизировались с целью получения продукта с минимальным количеством влаги для увеличения сроков хранения материалов. Влажность лиофилизированного ДКМ не превышала 2 %. Радиационную стерилизацию материала проводили на базе института ФГУП «НИИП» (г. Лыткарино). На рис. 2 приведена обобщенная технологическая схема получения ДКМ в виде крошки по разработанной методике. Весь цикл получения ДКМ, включающий контроль биохимических и микробиологических параметров на каждой стадии, занимает около 1,5 месяцев.

Рис. 2. Обобщенная технологическая схема получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки по разработанной методике.

По литературным данным, существует линейная зависимость между остеоиндуктивными свойствами ДКМ и концентрацией факторов роста, входящих в его состав [Murray, 2007; Marks, 2007]. В процессе получения ДКМ по различным методикам [Iwata, 2002] может происходить снижение концентраций ВМР-2 и ВМР-7 [Hallfeldt, 1992; Howard, 1992, Ни, 1997, Pekkarinen, 2004] вплоть до значений ниже предела обнаружения [Li, 2000], что негативно сказывается на остеоиндуктивных свойствах материала. Для получения материала с улучшенными остеоиндуктивными свойствами было изучено влияние параметров обработки костного матрикса на содержание нативных факторов роста ВМР-2 и ВМР-7. Для экстракции BMP костный матрикс подвергался обработке 4М гуанидин-хлоридом с последующим диализом полученных экстрактов. Содержание ВМР-2 и ВМР-7 в экстрактах определялось с помощью коммерческих наборов ИФА.

Прежде всего, было изучено влияние длительности обработки костной крошки органическими растворителями на концентрацию факторов. По результатам анализа содержание ВМР-2 и ВМР-7 оставалось одинаковым вне зависимости от длительности обработки, что свидетельствует об их устойчивости к длительному воздействию органических растворителей.

Далее было определено остаточное содержание ВМР-2 и ВМР-7 в костной крошке различных размеров. По результатам анализа концентрация этих факторов в деминерализованной костной крошке с различным размером частиц, полученных одинаковым способом, различалась незначительно, что свидетельствует о полной экстракции белковых факторов из исследуемых образцов.

На следующем этапе работы проводили исследования зависимости концентрации ВМР-2 и ВМР-7 в экстрактах костной крошки от времени обработки 0,6 М раствором соляной кислоты. Результаты анализа концентраций ВМР-2 приведены на рис. 3 (для ВМР-7 были получены аналогичные результаты). Для наглядности значения степени минерализации и концентрации ВМР-2 приведены в виде процентов от максимального значения в своей группе. По мере растворения минерального компонента растет количество экстрагируемых нативных факторов роста и их высвобождение, однако избыточная обработка соляной кислотой пагубно сказывается на содержании факторов роста.

OBMP-2 ■ Степень минерализации

Время обработки, минуты

Рис. 3. Зависимость содержания нативного ВМР-2 в экстрактах костной крошки от степени минерализации при разном времени обработки соляной кислотой.

Аналогичные результаты наблюдались при избыточной отмывке ДКМ дистиллированной водой, а затем фосфатным буфером (100 мМ Ма2НР04 -№Н2Р04 рН 6,5). На стадии радиационной стерилизации были подобраны необходимые условия обработки, позволяющие получить стерильный материал без потери специфической активности ВМР-2 и ВМР-7. Обобщенные результаты исследования влияния различных стадий получения ДКМ на содержание факторов роста приведены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние различных стадий получения ДКМ на содержание _ факторов роста ВМР-2 и ВМР-7._

Стадия получения ДКМ Содержание ВМР-2 и ВМР-7 Оптимальная обработка

Обезжиривание Влияния не оказывает на сроках более чем на месяц превышающие необходимые. 2% Tween-80, 3 суток; этанол-диэтиловый эфир, 4 суток

Деминерализация Высвобождение BMP в процессе деминерализации. Негативное влияние при избыточной обработке. 0,6 М HCl на льду, не более 90 минут

Размол Влияния не оказывает (содержание экстрагированных BMP не зависит от размера частиц) Размер частиц: 0,04 - 2,0 мм ( 5 фракций), размол с сухим льдом

Отмывка Негативное влияние при избыточной обработке Последовательная отмывка водой и 100 мМ фосфатным буфером pH 6,5

Стерилизация Негативное влияние при дозах 20 кГр и выше 15 кГр

Таким образом, разработанная методика получения ДКМ позволяет с одной стороны значительно повысить доступность факторов роста, с другой сохранить их содержание на уровне, соответствующем наилучшим результатам, полученным для ДКМ по литературным данным [Pietrzak, 2009]. Высокие значения концентрации BMP косвенно свидетельствует о сохранности других ростовых факторов, входящих в состав ДКМ и определяющих его остеоиндуктивный потенциал.

Ввиду широкого разнообразия клинических случаев, в ходе диссертационной работы были разработаны различные виды исполнения ДКМ: крошка, блоки, мембраны, стержни (рис. 4). Каждый материал имеет свои особенности получения, связанные с его геометрическими параметрами и вещества костной ткани, используемого в изготовлении. При этом в качестве исходной использовалась методика получения ДКМ в виде крошки, описанная ранее.

в ^ гГШИвр ' . ч А". ' ■ «4- ; X *V'1- ,' ' ' " 111 г ^ »«■■■■1Ш1ЯЯш я

Рис. 4. Внешний вид деминерализованного костного матрикса, полученного по разработанной методике в виде крошки 0,25-0,5 мм (А), блоков различного размера (Б), мембран (В) и стержней (Г). 12

Помимо высокого содержания факторов роста в составе ДКМ, другим преимуществом разработанной методики является контроль качества каждой стадии технологического процесса. Отсутствие контроля качества может привести к производству малоэффективных и даже опасных для медицинского применения материалов, обладающих высокой иммуногенностью, недостаточной остеоиндуктивностью. Костная ткань, полученная от разных особей, может обладать различными исходными характеристиками состава и строения, поэтому необходимая продолжительность каждой стадии может варьироваться. Разработанная методика позволяет получать стандартизованный материал вне зависимости от индивидуальных особенностей костной ткани разных особей. Оптимальные значения контролируемых параметров на различных стадиях получения ДКМ приведены в таблице 2.

Таблица 2. Оптимальные значения контролируемых параметров на

различных стадиях получения ДКМ.

Стадия получения Оптимизируемый параметр Оптимальное значение

Обезжиривание содержание липидов не более 1 % по массе

Деминерализация содержание кальция не более 5 мг/г материала

содержание ВМР-2 не менее 160 нг/г материала

содержание ВМР-7 не менее 100 нг/г материала

Отмывка уровень рН от 5,5 до 6,5

Лиофилизация влажность не более 2% по массе

Стерилизация микробиологическая обсемененность 0 колоний

2. Определение биологической активности рекомбинантного фактора роста человека г1лВМР-2

Для улучшения остеоиндуктивности костных имплантатов в качестве дополнительных компонентов используются рекомбинантные костные морфогенетические белки человека. В лаборатории биологически активных наноструктур ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России был разработан способ получения рекомбинантного фактора роста человека гИВМР-2 [Шарапова, 2010]. В настоящей работе стояла задача оценки активности белка, полученного этим способом, и определения степени соответствия его структуры нативной конформации.

О степени соответствия структур рекомбинантного и нативного белка ВМР-2 можно косвенно судить по наличию эпитопов - антигенных детерминант, связывающихся со специфическими антителами. Взаимодействие rhBMP-2 с антителами оценивали методом ИФА, для постановки которого использовали коммерчески доступный набор ВМР-2 (R&D Systems, США), включающий стандартный образец ВМР-2. В виду высокой стоимости коммерческого набора, на основе полученного препарата rhBMP-2 совместно с фирмой ООО «ИМТЕК» (Россия) был разработан набор для определения концентрации rhBMP-2 методом ИФА.

На рис.5 приведены результаты определения концентрации нативного ВМР-2 (экстрагированного из образцов ДКМ), полученные с использованием набора, разработанного совместно с ИМТЕК, и коммерческого набора. Определенные значения концентраций ВМР-2 отличались в среднем в 1,6 раз, что свидетельствует о высоком перекрывании антигенных эпитопов у рекомбинантного rhBMP-2 с нативным ВМР-2. 250

з ИФА ИМТЕК □ ИФА R&D Systems

0,125-0,25 мм 0,25-0,5 мм 0,5-1,0 мм

Размер костной крошки

Рис. 5. Определение концентрации нативного ВМР-2 в экстрактах ДКМ в виде крошки различного размера с помощью набора фирмы ИМТЕК для rhBMP-2 и коммерческого набора R&D Systems.

Существенное влияние на активность препарата оказывает стадия

рефолдинга, в результате которого образуется активная димерная форма

белка. В связи с этим была проведена оптимизация условий рефолдинга. На

рис.6 приведены результаты анализа препаратов ВМР-2, полученных после

рефолдинга в буферах различного состава.

2,5

CVI Ql

CD si

V-

K s zs ro Q. h-

■3

1,5

ЯИФА ИМ ТЕК

□ И ФА R&D Systems

I ■bj

1 i

pH 4,0

pH 5,0

50 mM Ыа-ацетатный буфер

pH 6,0

pH 8,0

50 mM Na-фосфэтный буфер

Рис. 6. Определение концентрации rhBMP-2 с помощью наборов ИФА фирмы ИМТЕК и коммерческого набора R&D Systems после рефолдинга в буферах различного состава.

При рефолдинге в 50 mM Ыа-фосфатном буфере рН 6,0 наблюдалась наименьшее расхождение результатов, полученных на разных наборах. Это позволяет сделать вывод о том, что диализ против этого буфера на стадии рефолдинга позволяет получить белок с конформацией наиболее приближенной к конформации стандартного ВМР-2.

Биологическую активность rhBMP-2 in vitro определяли общепринятым методом, основанным на повышении активности щелочной фосфатазы (ЩФ) клеток линий С2С12 и СЗН10Т1/2 при внесении rhBMP-2 в среду культивирования. Активность ЩФ определялась колориметрически с использованием п-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. По результатам анализа, препарат rhBMP-2 индуцирует синтез ЩФ в клетках обоих линий, при этом активность препарата не уступает активности коммерческого препарата ВМР-2 (BioVision Research Products, США).

Биологическую активность rhBMP-2 in vivo определяли на модели эктопического остеогенеза у крыс (Рис. 7). В качестве носителя использовали лиофилизованные губки из синтетического коллагена I типа, не обладающие собственными остеоиндуктивными свойствами. Имплантация в бедренную группу мышц проводилась 10 крысам линии Wistar с массой тела 300 - 350 г. В правую лапу имплантировали коллагеновую губку, пропитанную rhBMP-2 (опыт) в концентрации 3 мг белка на грамм носителя. В левую лапу имплантировали губку, пропитанную буфером (контроль). Животных

выводили из эксперимента через 30 суток. В извлеченных имплантатах с окружающими тканями проводили определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), являющейся маркером остеогенеза. , 4500

га

а>

в 3

Ё <

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

Эколлагеновая губка, пропитанная rhBMP-2

□ коллагеновая губка

Номер животного в эксперименте

Рис. 7. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в коллагеновых губках, пропитанных rhBMP-2 (опыт) и буфером (контроль) на 30 сутки после операции.

Активность ЩФ в опытных имплантатах достоверно отличалась от контрольных значений (р<0,05). Проведенный анализ свидетельствует об эффективности полученного rhBMP-2 в качестве стимулятора процессов остеогенеза. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием непараметрического критерия (односторонний вариант) Манна-Уитни с применением программы StatSoft Statistica 7.0.

3. Получение композитного остеопластического материала на основе ДКМ с добавлением rhBMP-2 и гиалуроновой кислоты

Оптимизация условий иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ проводилась по следующим параметрам: размер носителя, степень деминерализации ДКМ, состав буфера для иммобилизации, время инкубации, количество отмывок. Благодаря наличию в своем составе гликозаминогликанов, таких как гепарин и гепарансульфат, ДКМ обладает высоким сродством к BMP. Содержание иммобилизованного rhBMP-2 может достигать 20 мкг на грамм матрикса.

Для придания материалу пластических свойств, необходимых для клинического применения использовали гиалуроновую кислоту, являющуюся биосовместимым гликозаминогликаном, входящим в состав костной ткани.

При этом оптимальное соотношение ДКМ - гиалуроновая кислота равнялось 9:1 по массе.

Полученный композиционный материал прошел токсикологическое исследование, проведенное в ФГУ «ВНИИИМТ».

4. Исследование остеогенных свойств разработанного остеопластического материала

Остеопластический композиционный материал, представляющий собой ДКМ в виде крошки, блоков, либо мембран с добавлением гИВМР-2, а также гиалуроновой кислоты (в соотношении 9:1 по массе), тестировался на трех различных моделях.

На модели ортотопического остеогенеза в диафизарной части длинных трубчатых костей конечностей создавались костные дефекты определенного диаметра и глубины, достаточной для сообщения материала с костномозговым каналом. В исследовании, выполненном совместно с Белгородским Государственным Университетом, были использованы 36 лабораторных крыс-самцов линии \ЛЫаг с массой тела 300 - 350 г. Животные случайным образом были поделены на 6 групп по 6 крыс в каждой. Продолжительность эксперимента составляла: для 1 и 2 группы - 1 месяц; для 3 и 4 группы - 2 месяца; для 5 и 6 группы - 3 месяца. Для заполнения костного дефекта использовали два вида композиционных материалов: ДКМ в виде крошки размером 0,125-0,25 мм с добавлением гиалуроновой кислоты (1, 3, 5 группы) и ДКМ в виде крошки размером 0,125-0,25 мм с добавлением гиалуроновой кислоты, а также гИВМР-2 (2, 4, 6 группы). Животных выводили из эксперимента, используя летальную дозу эфирного наркоза, и проводили забор кости с вырезом области дефекта и гистоморфометрическое исследование образцов.

По результатам исследования, все разработанные остеопластические материалы оказывают положительное влияние на регенерацию костной ткани. Формирование первичной (ретикулофиброзной) костной ткани проходило к 1 месяцу после операции, к 3 месяцу наблюдалось образование зрелой (пластинчатой) костной ткани (табл. 3). Наибольшая площадь новообразованной зрелой кости наблюдалась в группах 2, 4, 6, т.е. при заполнении дефекта ДКМ с добавлением гЬВМР-2. При этом происходило прорастание остеогенных клеток внутрь остеопластического материала и увеличение активной поверхности зоны регенерации костной ткани.

Таблица 3. Площадь новообразованной костной ткани и поверхность зоны регенерации.

Морфологический параметр Группа

1 месяц 2 месяца 3 месяца

1 2 3 4 5 6

Относительная площадь первичной костной ткани, % 90+2 85±1 85±1 75+4 15±3 7 ±2

Относительная площадь зрелой костной ткани, % 10±2 15±1 15+1 25±4 85±3 93+2

Активная поверхность зоны регенерации костной ткани, % 5±1 7±2 8±1 10±1 10±2 12±2

Более сложная модель восстановления дефекта челюсти собаки была использована для исследования регенеративного потенциала разработанных материалов на крупных дефектах критического размера. В исследовании, выполненном совместно с Казанской академией ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, использовались 9 беспородных собак в возрасте от 5 до 10 лет (3 экспериментальные группы, в каждой группе по 3 подгруппы, в каждой подгруппе по 3 эксперимента, всего 81 дефект). На данной модели дефект нижней челюсти заполняли остеопластическим материалом в виде крошки, либо порошка, покрывали мембраной, служащей барьером и ушивали (рис. 8).

Рис. 8. Заполнение дефекта челюсти ДКМ в виде крошки гИВМР-2 и гиалуроновой кислоты (А) и ДКМ в виде мембраны (Б). Состояние тканей в области дефекта через 3 месяца после операции (В).

В опытной группе в качестве имплантационных материалов использовали ДКМ в виде крошки с добавлением гИВМР-2 и гиалуроновой кислоты, а также ДКМ в виде мембраны. В качестве положительного контроля использовали порошок и мембраны из никелида титана, разработанные в НИИ медицинских материалов и имплантатов (г. Томск), кроме того, применялась композиция этих двух материалов. Мембраны, выполненные из ДКМ и никелида титана, сохраняли заданную форму, что способствовало достижению необходимого

объема костной ткани. Перед проведением и после каждого этапа эксперимента делали рентгеновские снимки челюстей собак. Забор экспериментального материала проводили через 1, 3, 6 месяцев. Гистологические исследования проведены на кафедре патологической анатомии Казанского государственного медицинского университета.

По результатам исследований, наиболее эффективным методом для заживления костного дефекта челюсти критического размера является применение ДКМ в виде крошки с добавлением гИВМР-2 в комбинации с остеокондуктивным материалом - никелид титановым порошком при одновременном использовании барьерного материала - ДКМ в виде мембраны. При этом ускоряется процесс репаративной регенерации костной ткани, а также практически отсутствуют осложнения в виде воспалительных процессов. Результаты эксперимента позволяют сделать вывод о возможности применения материала на основе ДКМ с добавлением гЬВМР-2 в качестве остеоиндуктивного материала в комбинации с остеокондуктивными нерезорбируемыми материалами при замещении костных дефектов критического размера и наращивании костной ткани в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Далее, совместно с ФГБУ «УНИИТО имени В.Д. Чаклина» Минздрава России было проведено исследование возможности использования разработанного материала для улучшения биосовместимости и остеоиндуктивных свойств биоинертных имплантатов. При этом поры биоинертных титановых имплантатов насыщали разработанными материалами и проводили их имплантацию в дефекты бедренных и большеберцовых костей кроликов. Работа была выполнена на 5 половозрелых кроликах весом 3-4 кг, обоих полов, стадного разведения. Четырем кроликам делали по 4 операции (на бедренных и большеберцовых костях). У пятого кролика оставили не оперированной одну лапу в качестве контроля для тестирования устойчивости костной ткани на разрыв.

Проведено 4 серии опытов:

1. дефект костной ткани (отрицательный контроль) (4 образца);

2. дефект заполнен титановыми имплантатами, насыщенными прилипающей фракцией миелокариоцитов (положительный контроль) (4 образца);

3. дефект заполнен титановыми имплантатами, насыщенными ДКМ в виде крошки размером 0,04-0,125 мм с добавлением гиалуроновой кислоты

(контроль остаточного остеоиндуктивного потенциала носителя) (5 образцов);

4. дефект заполнен титановыми имплантатами, насыщенными ДКМ в виде крошки размером 0,04-0,125 мм с добавлением гиалуроновой кислоты и гИВМР-2 (опытная серия) (5 образцов).

По результатам морфологического и гистоморфометрического исследования в первой серии экспериментов, где костный дефект зарастал без применения имплантата, эффективность процесса регенерации была низкой. Во второй серии, при заполнении костного дефекта имплантатом, насыщенным клетками костного мозга, через 4 недели после операции зрелая костная ткань составляла уже 41% площади новообразованной костной ткани. Третья контрольная серия, в которой дефект был заполнен ДКМ в виде крошки, не содержащим рекомбинантных факторов роста и регенерации костной ткани, характеризуется наличием хорошо сформированного материнского ложа и наличием отдельных зрелых трабекул, внедряющихся в поверхностные поры имплантата, однако в целом площадь зрелых трабекул составила всего лишь 17%. В опытной серии было установлено, что присутствие рекомбинантных факторов роста костной ткани в области дефекта положительно влияет на процессы остеогенеза (площадь новообразованной костной ткани 51%) (Рис. 9, А-В).

Рис. 9. Микрофотографии срезов костной ткани, образованных в порах титановых имплантатов через 4 недели после операции. А. Серия N22 (насыщение миелокариоцитами). Б. Серия №3 (насыщение ДКМ).

В. Серия №4 (насыщение ДКМ с добавлением гЬВМР-2). Окраска гематоксилином и эозином. Титановая матрица вытравлена. Ув. 40 раз.

Прочность новообразованной костной ткани определяли по усилию, которому необходимо применить для отрыва имплантатов от материнского ложа кости. Относительную прочность рассчитывали как соотношение

предела прочности на разрыв на границе «кость - имплантат» к пределу

прочности на разрыв нативной кости (рис. 10).

90 80

Рис. 10. Относительная прочность костной ткани на границе «кость -имплантат» по сравнению с нативной костью (р<0.05).

Через 4 недели после операции достоверное отличие по сравнению с отрицательным контролем (серия № 1) наблюдается для серий № 2-4 (р<0,05) (рис. 10). При использовании титановых имплантатов, насыщенных прилипающей фракцией клеток миелокариоцитов (серия № 2), а также насыщенных ДКМ с добавлением rhBMP-2 и гиалуроновой кислоты (серия № 4) наблюдается максимальная прочность костной ткани, результаты для серий №2 и №4 достоверно не отличаются. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием непараметрического критерия (односторонний вариант) Манна-Уитни с применением программы StatSoft Statistica 7.0.

По результатам анализа, внедрение в поры имплантата разработанных композиционных материалов положительно сказывается на процессах репаративного остеогенеза и приводит к увеличению площади, занятой зрелой костной тканью во внутреннем поровом пространстве имплантата, а также к повышению прочности новообразованной кости.

5. Анализ клинических испытаний разработанного материала

В период с 1 июля 2011 г. по 8 ноября 2012 г. на базе травматологического отделения РКБ им. Г. Г. Куватова, а также 27 Травматологического отделения ГКБ им. С.П. Боткина ДЗ г. Москвы были сделаны операции с применением разработанного композиционного материала на основе ДКМ в виде крошки с добавлением rhBMP-2 и

О с 20 10 0

S Ъ 40

S & 30

Серия №1 Серия №2 Серия №3 Серия №4

гиалуроновой кислоты 33 пациентам с различными патологиями опорно-двигательной системы в возрасте от 18 до 75 лет.

По результатам клинических испытаний, разработанный композиционный материал обладает биосовместимостью, остеоиндуктивностью и эффективно влияет на процессы репаративного остеогенеза.

Разработанный в рамках диссертационной работы материал на основе ДКМ в виде крошки (различного состава и размера) был зарегистрирован как ИМН «Крошка костная деминерализованная лиофилизированная для заполнения костных дефектов «Гамалант-крошка»» (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13111) и разрешен для применения на территории Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения. Область применения: травматология, ортопедия, спинальная хирургия, челюстно-лицевая хирургия.

ВЫВОДЫ

1. Разработана оптимизированная методика получения высокоочищенного деминерализованного костного матрикса (ДКМ), отличающегося высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости ВМР-2 (160-180 нг/г) и ВМР-7 (100-145 нг/г).

2. Получен препарат рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка 2 (rhBMP-2), взаимодействующий со специфическими антителами к BMP. Биологическая активность препарата rhBMP-2 определена на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/2, а также на модели эктопического остеогенеза у крыс. Активность rhBMP-2 в тестах in vitro и in vivo не уступает активности зарубежных коммерческих препаратов-аналогов.

3. Разработана методика получения композиционного материала на основе ДКМ с добавлением гиалуроновой кислоты и rhBMP-2, позволяющая сохранить их биологическую активность.

4. Показан высокий регенеративный потенциал разработанных материалов на моделях ортотопического остеогенеза у крыс, восстановления дефекта челюсти собаки, а также дефектов бедренных и большеберцовых костей кроликов. Репаративный остеогенез проходил наиболее интенсивно при заполнении костного дефекта композиционными материалами, содержащими rhBMP-2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Громов A.B., Никитин К.Е., Карпова Т.А., Бартов М.С., Мишина Д.М., Субботина М.Е., Шевлягина Н.В., Сергиенков М.А., Соболева Л.А., Котнова

A.П., Шарапова Н.Е., Семихин A.C., Диденко Л.В. , Карягина A.C., Лунин

B.Г. Разработка методики получения деминерализованного костного матрикса с максимальным остаточным содержанием нативных факторов роста костной ткани. // Биотехнология, 2012, №5, с.66-75.

2. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева H.H., Тухватуллин А.Э., Семихин A.C., Громов A.B.. Соболева Л А., Ершова A.C., Зайцев В.В., Сергеенко О.В., Лунин В.Г., Карягина A.C. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология, 2010,-Т44, №6,-с. 1036-1044.

3. Федорова М.З., Надеждин C.B., Семихин A.C., Лазебная М.А., Храмов Г.В., Колобов Ю.Р., Громов A.B., Бартов М.С., Лунин В.Г., Карягина A.C., Гундеров Д.В. Экспериментальная оценка композиционного материала на основе белково-минеральных компонентов и рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhBMP-2) в качестве покрытия титановых имплантатов. Травматология и ортопедия России. 2011 - N°2 (60). - с. 101 -106.

4. Бартов М.С., Карягина A.C., Громов A.B., Мишина Д.М., Трунова Г.В., Сидорова Е.И.. Андреева Е.В., Донченко C.B., Мухаметов Ф.Ф., Мухаметов У.Ф., Миргазизов М.З., Миргазизов A.M., Хафизов Р.Г., Лунин В.Г., Филиппова Н.Е., Гинцбург А.Л. Остеопластические препараты нового поколения «Гамалант», содержащие факторы роста и регенерации костной ткани. // Кафедра травматологии и ортопедии, 2012, №2, с.21-25.

5. Лунин В.Г., Карягина-Жулина A.C., Шарапова Н.Е., Ершова A.C., Громов A.B.. Никитин К.Е., Субботина М.Е., Котнова А.П., Лаврова Н.В., Семихин A.C., Соболева Л.А., Грунина Т.М., Овечкина Т.А., Бартов М.С., Мишина Д.М., Гинцбург А.Л. Способ получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки. // Патент на изобретение No.2456003 от 10.03.2011.

6. Громов A.B.. Бартов М.С., Никитин К.Е., Мишина Д.М., Субботина М.Е., Соболева Л.А., Овечкина Т.А., Грунина Т.М., Сергиенков М.А., Лаврова Н.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М., Семихин A.C., Ткачук А.П., Шарапова Н.Е., Карягина A.C., Лунин В.Г. Разработка биокомпозитов нового поколения на основе ксеногенного деминерализованного костного

матрикса с добавлением рекомбинантных костных морфогенетических белков человека rhBMP -2 и rhBMP -7. И Илизаровские чтения: мат. научно-практ. конф., г. Курган, 2011.-е. 474-475.

7. Громов A.B.. Бартов М.С., Никитин К.Е., Мишина Д.М., Субботина М.Е., Соболева Л.А., Овечкина Т.А., Грунина Т.М., Сергиенков М.А., Лаврова Н.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М., Семихин A.C., Ткачук А.П., Шарапова Н.Е., Карягина A.C., Лунин В.Г. Остеопластические материалы нового поколения на основе ксеногенного деминерализованного костного матрикса с добавлением рекомбинантных костных морфогенетических белков человека rhBMP-2 и rhBMP-7. // Чаклинские чтения: мат. научно-практ. конф., Екатеринбург, 2011.-C.159-160.

8. Громов A.B., Бартов М.С., Соболева Л.А., Субботина М.С., Грунина Т.М., Карпова Т.А., Мишина Д.М., Никитин К.Е., Семихин A.C., Галушкина З.М., Сергиенко О.В., Карягина A.C., Лунин В.Г. Остеопластические материалы нового поколения. И Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Сб. тезисов научно-практ. конф., г.Москва, 2012. - с. 226.

9. Зайцев В.В., Карягина A.C., Лунин В.Г., Семихин A.C., ГР°М°В A.B., Лаврова Н.В., Полетаева H.H., Галушкина З.М., Лукина Ю.С., Золотухина М.С., Соболева Л.А., Берченко Г.Н., Фрончек Э.В., Еськин H.A. Экспериментальная оценка остеоиндуктивности имплантатов на основе биологического и синтетического матриксов в качестве носителя и рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhBMP-2) // IX съезд травматологов - ортопедов: Тез. докл.: в 3 т. - Саратов, 2010. - Т.1. - С. 1105-1106.

10. Макарова Э.Б., Захаров Ю.М., Рубштейн А.П., Громов A.B., Бартов М.С., Карягина-Жулина A.C., Лунин В.Г. Экспериментальное обоснование использования биокомпозитных имплантатов из пористого титана, модифицированных алмазоподобными покрытиями для замещения костной ткани // Малоинвазивные технологии в травматологии- ортопедии и нейрохирургии: мат. научно-практ. конф., г. Саратов, 2013.-е. 25-27.

11. Макарова Э.Б., Шлыков И.Л., Близнец Д.Г., Горбунова З.И., Рубштейн А.П., Трахтенберг И.Ш., Громов A.B.. Бартов М.С., Карягина-Жулина A.C. Создание и обоснование применения биоимплантов с использованием нанотехнологий II XVI съезд ортопедов-травматологов Украины: Сб. науч. Трудов, г.Харьков, 2013. - с.39-40.

Подписано в печать:

19.11.2013

Заказ Л'° 9165 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Громов, Александр Викторович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНЗДРАВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201453985 правах рукописи

ГРОМОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

ПОВЫШЕНИЕ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ИМПЛАНТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ КОСТНОГО КОЛЛАГЕНА И РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА гЬВМР-2

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальности: 03.01.04 - биохимия 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук Карягина-Жулина Анна Станиславовна

Москва 2013

Оглавление

ОГЛАВЛЕНИЕ................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................6

I. ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................8

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................12

1. Костная ткань 12

1.1. Состав костной ткани........................................................................................12

1.1.1. Межклеточный матрикс...............................................................................12

1.1.2. Клетки костной ткани..................................................................................23

1.2. Классификация костных тканей.........................................................................25

1.3. Кость как орган....................................................................................................26

1.3.1. Компактное вещество..................................................................................26

1.3.2. Губчатое вещество.......................................................................................27

1.3.3. Надкостница..................................................................................................28

1.3.4. Эндост............................................................................................................28

1.4. Развитие, рост и регенерация костной ткани..................................................29

1.4.1. Развитие костной ткани...............................................................................29

1.4.2. Физиологическая регенерация....................................................................31

1.4.3. Репаративная регенерация...........................................................................31

1.5. Кость как объект трансплантации и тканевой инженерии..........................32

2. ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ 34

2.1. Аутогенные материалы.......................................................................................35

2.2. Аллогенные материалы........................................................................................36

2.3. Ксеногенные материалы......................................................................................37

2.4. Деминерализованный костный матрикс............................................................37

2.5. Минеральный матрикс.........................................................................................40

2.6. Синтетические материалы.................................................................................41

2.7. Костные морфогенетические белки как компоненты остеопластических материалов............................................................................................................43

2.7.1. Получение BMP............................................................................................44

2.7.2. Носители BMP..............................................................................................45

2.7.3. Коммерчески доступные препараты с BMP..............................................51

2.8. Заключение по разделу..........................................................................................53

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................55

3. Материалы, реактивы и оборудование 55

3.1. Клеточные линии...................................................................................................55

3.2. Лабораторные животные...................................................................................55

3.3. Питательные среды.............................................................................................55

3.4. Имплантационные материалы.............................. ...............................................56

3.5. Материалы для иммуноферментного анализа..................................................56

3.6. Медицинские препараты.................................. .....................................................56

3.7. Другие реактивы...................................................................................................56

3.8. Оборудование.........................................................................................................57

Методы 58

4.1. Определение содержания жира в костной ткани................. ............................58

4.2.Двулучевой сканирующий электронный микроскоп...........................................59

4.3. Определение содержания кальция в костной ткани........................................59

4.4. Определение содержания влаги в костной ткани.............................................60

4.5. Определение рН водной вытяжки костной крошки.........................................60

4.6. Определение остаточного содержания нативных ВМР-2 и ВМР-7 в костной ткани.......................................................................................................61

4.7. Определение микробиологической обсемененности полученных материалов............................................................................................................62

4.8. Метод иммуноферментного анализа концентрации рекобинантного rhBMP-2..................................................................................................................62

4.9. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ПААГ-ДСН).................................................63

4.10. Определение биологической активности rhBMP-2 на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/2...............................................................................................64

4.11. Метод определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани крыс.............................................................................................................64

4.12. Метод определения концентрации кальция в образцах мышечной тканей крыс...........................................................................................................65

4.13. Экспериментальная модель эктопического остеогенеза............................66

4.14. Определение количества иммобилизованного на ДКМ rhBMP-2................66

4.15. Экспериментальная модель ортотопического остеогенеза.......................66

4.15.1. Хирургические операции........................................................................66

4.15.2. Гистологическое исследование костного материала............................67

4.16. Экспериментальная модель восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюстей собаки...........................................68

4.16.1. Проведение эксперимента.......................................................................68

4.16.2. Гистологическое исследование костного материала............................69

4.17. Экспериментальная модель дефектов бедренных и большеберцовых костей у кроликов..................................................................................................70

4.17.1. Методика насыщения пористых титановых имплантатов композиционным материалом на основе ДКМ с добавлением rhBMP-2.........................................................................................................70

4.17.2. Методика насыщения пористых титановых имплантатов прилипающей фракцией аутологичных миелокариоцитов......................71

4.17.3. Хирургические операции........................................................................71

4.17.4. Гистологическое исследование костного материала............................72

4.17.5. Определение прочности новообразованной костной ткани................73

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................75

5. Разработка методики получения ксеногенного деминерализованного костного матрикса 75

5.1. Фрагментация кости и грубая очистка.............................................................75

5.2. Обезжиривание.....................................................................................................76

5.3. Первичный размол и деминерализация................................................................78

5.3.1. Определение оптимального размера костной крошки для полной деминерализации..........................................................................................78

5.3.2. Определение оптимальной концентрации кислоты и времени обработки для полной деминерализации костной крошки......................81

5.4. Отмывка и высушивание......................................................................................82

5.5. Вторичный размол и фракционирование............................................................82

5.6.Лиофилизация и радиационная стерилизация...................................................83

5.7. Остаточное содержание нативных факторов роста кости ВМР-2 и

BMP-7 на различных этапах технологического процесса получения ДКМ....84

5.8. Технологическая схема получения ДКМ в виде крошки.....................................88

5.9. Виды исполнения ДКМ..........................................................................................88

5.10. Преимущества разработанной методики получения ДКМ.........................91

6. Получение и определение биологической активности рекомбинантного фактора роста человека RHBMP-2 92

6.1. Определение биологической активности rhBMP-2 in vitro..............................94

6.1.1. Определение концентрации rhBMP-2 с помощью ИФА..........................94

6.1.2. Определение биологической активности рекомбинантного rhBMP-2

на клетках линий С2С12 и СЗН10Т1/2.......................................................97

6.2. Определение биологической активности rhBMP-2 in vivo на модели эктопического остеогенеза.................................................................................98

6.2.1. Оптимизация методики определения активности щелочной фосфатазы в мышечной ткани.....................................................................98

6.2.2. Оптимизация методики определения количества кальция в мышечной ткани...........................................................................................99

6.2.3. Определение активности щелочной фосфатазы и кальция в коллагеновых губках, пропитанных rhBMP-2, на модели эктопического остеогенеза........................................................................100

7. Получение композитного остеопластического материала на основе ДКМ с добавлением RHBMP-2 и гиалуроновой кислоты 103

7.1. Оптимизация условий иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ...............................104

7.2. Определение соотношения компонентов композиционного препарата.......106

7.3. Токсикологическое исследование материала...................................................108

7.3.1. Краткое изложение результатов испытаний............................................108

7.3.2. Выводы по результатам испытаний.........................................................109

8. Исследование остеогенных свойств разработанного остеопластического материала 109

8.1. Исследование остеогенных свойств разработанного материала на модели ортотопического остеогенеза.............................................................110

8.1.2. Результаты гистоморфометрического анализа........................................112

8.1.3. Заключение..................................................................................................115

8.2. Исследование остеогенных свойств разработанного материала при восстановлении сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюстей..............................................................................................................117

8.2.1. Проведение эксперимента.........................................................................118

8.2.2. Результаты морфологического исследования искусственно созданного дефекта челюсти в подгруппах с разным способом восстановления альвеолярного гребня.....................................................121

8.2.3. Результаты гистологического исследования костного регенерата в области искусственно созданного дефекта челюсти..............................125

8.2.4. Заключение..................................................................................................128

8.3. Исследование остеогенных свойств разработанного материала совместно с композитным имплантатом из пористого титанового матрикса на модели дефектов бедренных и болыиеберцовых костей.........129

8.3.1. Результаты морфологического и гистоморфометрического анализа ...130

8.3.2. Определение прочности новобразованной костной ткани....................132

8.3.3. Заключение..................................................................................................133

9. Анализ клинических испытаний разработанного материала 134

9.1. Клинические испытания в РКБ им. Г.Г. Куватова..........................................134

9.2. Клинические испытания в ГКБ имени С. П. Боткина.....................................135

9.3. Заключение по клиническим исследованиям.....................................................136

9.4. Регистрация изделия медицинского назначения «Гамалант-крошка».........137

V. ВЫВОДЫ.................................................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................140

ПРИЛОЖЕНИЯ..........................................................................................................160

Список сокращений

ДКМ - деминерализованный костный матрикс,

BMP - костный морфогенетический белок, bone morphogenetic protein,

rhBMP - рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок,

recombinant human bone morphogenetic protein,

MKM - межклеточный матрикс,

ПГ — протеогликан,

ГАГ - гликоазаминогликан,

сГАГ - сульфатированный гликозаминогликан,

ГАП — гидроксиапатит,

МСК - мезенхимальные стволовые клетки,

ЩФ - щелочная фосфатаза,

АФК - аморфный фосфорнокислый кальций,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

FGF - фактор роста фибробластов, fibroblast growth factor,

IGF - инсулиноподобные факторы роста, insulin-like growth factor,

TGF - трансформирующий фактор роста, transforming growth factor,

PLA-DX-PEG - полилактид - п-диоксанон - полиэтиленгликоль, polylactic acid-p-

dioxanone-polyethylene glycol,

PLGA - полилактогликолевая кислота, polylactic-co-glycolic acid,

PGA - полигликолевая кислота, polyglycolic acid,

PEG - полиэтиленгликоль, polyethylene glycol,

IlTi(a-C) — пористый титан с алмазоподобными плёнками,

ИФА - иммуноферментный анализ,

ПААГ - полиакриламидный гель,

ДСН - додецилсульфат натрия,

кДа — килодальтон,

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан, ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

Для обозначения аминокислотных остатков использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного союза биохимиков (IUB).

I. Введение

Актуальность работы

Согласно результатам современных исследований, BMP являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. BMP это цитокины, принадлежащие к

суперсемейству трансформирующего ростового фактора -ß. Они действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют значительную роль в регулировании роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки. К настоящему времени идентифицировано 20 видов ВМР, наиболее изученными из которых являются ВМР-2 и ВМР-7.

Активность нативных факторов роста, входящих в состав ДКМ, сильно различается у материалов, полученных по различным методикам [Li, 2000; Wildemann, 2007]. Избыточная деминерализация костного матрикса [Iwata, 2002], использование химических реагентов [Hallfeldt, 1992; Pekkarinen, 2004], термическая обработка [Ни, 1997], высокие дозы гамма-излучения [Howard, 1998], используемые при изготовлении ДКМ, могут существенно снижать активность факторов роста, входящих в его состав, что негативно сказывается на остеиндуктивных свойствах материала [Pietrzak, 2009]. Таким образом, существует необходимость разработки методики получения ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости, определяющих его остеоиндуктивный потенциал.

Помимо оптимизации условий получения ДКМ, регенеративный потенциал разрабатываемого остеопластического материала может быть повышен за счет введения в его состав дополнительных факторов роста кости. С помощью методов генной инженерии разработаны технологии получения рекомбинантных ВМР, в том числе рекомбинантного человеческого ВМР-2 (rhBMP-2) [Niederwanger, 1996; Schwartz, 1998]. Данные технологии позволяют синтезировать белок в количестве, достаточном для производства содержащих его остеопластических материалов в промышленных масштабах [Bessho, 2000].

В настоящее время ряд таких материалов активно применяется в США и странах западной Европы при лечении сложных травм и переломов, например, «INFUSE» (Medtronic Biologics, США) и «OSSIGRAFT» ОР-1 (Stryker Biotech, США). Применение этих материалов в России ограничено из-за их крайне высокой стоимости, поэтому разработка остеоиндуктивных костнопластических материалов отечественного производства, более дешевых и доступных, сделает возможным их вн�

Информация о работе

Громов, Александр Викторович
кандидата химических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Повышение регенеративного потенциала имплантационного материала на основе костного коллагена и рекомбинантного белка человека rhBMP-2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы