Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства лигнинолитических и гидролитических мультиферментных систем дереворазрушающих базидиомицетов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства лигнинолитических и гидролитических мультиферментных систем дереворазрушающих базидиомицетов"

од

ЧЕРНГВЕЦЬКИЙ ДЕР1ЙВНИИ НН1ВЕРСИТЕТ 1М. И.ФЕДЬКОВИЧА

на правах рукопису

Домбровська О^ена Чикола1вна

ВЛЙСТИВ0СТ1 ЛIГН1НОЛIТИЧНИХ ТА Г1ДРОЛ1ТИЧНИХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНИХ СИСТЕМ 'ДЕРЕВОРЗИЙУВЧИХ БАЗИД10М1ЦЕТ1В.

03.00.04 - Б1ох1«1я'х

Автореферат дисертаци на здобу'ття науковоГ-о ступеня кандидата б1олог!чних наук

Черн1вц1 1994

Дисертац1ев е рукопис.

Робота виконана на кафедр! 61ох1м1 1 та експериментально! екологП Черн1вецького дериун1верситету 1м. Я.Федьковича

Наровий кер1вник: доктор б!олог!чних наук, професор Костишин Степан Степанович

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б1олог!чних наук, професор Мецишен 1ван Федорович доктор б1олог!чних наук, професор Терек Ольга 1штван!вна

П^овЦна орган!зац!я: 1нститут б1ох!мП 1м, О.В. Паллад1на АН !/кра1ни, и. Ки1в.

'Захист дисертац!I в1дбудеться 25 грудня 1934 року о 15 год. на зас!данн! спец1ал1зовано'1 ради К 07.01 .03 по присцдяен-нв наукового ступеня кандидата б!олог!чних наук в Черн1-вецькому дер«ун!верситет! (274012, м. Черн!вц!, Коцюбинсь-кого, 2).

3 дисертац!ею мохна ознайомигнсь • у науков!й б! бл 1 отец! Черн^ецького деркун1верситету (274012, м. Черн1вц1, Л.Украинки, 23).

Автореферат роз!сланий листопада 1994 року.

Вчений секретар

спец!ал1зовано'1 вчено!' ради *

кандидат б!олог!чних наук Копильчук Г.П.

ЗАГОЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА■РОБОТН.

Йктуальн1сть проблеми. Одним з пров!дних напрямк!в су-часно1 ензимояогН е вивчення законон1рностей прот!каина та регуляц!1 ферментативного катал!зу в системах з р1зним р£внем структурно! орган1зацП. Детально вивчен1 механ!зми дН багатьох 1ндив1дуальних фермент!в на низькомолекулярн! субстрати. Однак б1ль«1стъ ферментативних процес1в е ян пол1ферментними, так I пол1субстратними. Так, б!одеградац1я рослинних пол!субстрат1в в!дбуваеться п!д д1ега багатокомпо-нентних ферментних систем макро- та м!кром1цет1в, де ваяливу роль в!д1гравть регуляторн! стосунки як м1я ферментом та компонентами пгол!субстрату, так 1 м!я окре'мими ферментами (ШдЫеу, 1987). До найб1льа повно! б!одеградэцП рослинних пол1субстрат!в здатн! дереворуйнуюч! базид!альн! гриби, Ефективна деструкц!я рослинних ё!опол1мер1в значно усклад-нюеться тим, що б1лыи!сть базид!ом1цет1в волод!е низькик.; активностями л1гн!нол1тичних та г!дрол1тичних фермент!в, що зумовлено незбалансованктю ферментних комплекс!в за компо-нентним-вкладом, низькога б1осйнтетичною йктивнктв окремих Фер'Мент 1 в та неоптимальними умовами самого процесу культиву-вання (ПаМа. 1983 ).

Нпдостатньо . вивчен! динам1чи! аспекти регуляцП активностей даних пол!ферментних комплекс!в. Одним з найвав-ливш1х спрсоб1в регуляцН катал1тично! активност1 фермент1в е варшвання м1крооточення в м1це-лярних системах поверхне-во-активних речовин (ПАР), Проте, в л1тератур! практично в1дсутн! дан1 про використання ПАР при ферментативних проце-сах розкладу рослинних багатокомпонентних субстрат!в.

Мета та ззвдання дослЦиення. Метою робо-ти було: досл1-дити властивост!, законом1'рност1 регуляцП активностей 1"

одеркати активн! препарати л!гн!нол!тичних та г!дрол!тичних ферментних комплекс!в базид!ом1чет!в, для чого застосовува-лись ПЙР, препарати л!гн!ну та р1зн1 умови культивування. Конкретно ставились завдання:

- , визначити оптимальн! умови ферментоутворення та одеряати активн! г1дрол!тичн1 та л!гн!нол!тичн! мультиферментн! комп-лекси при твердофазн!й ферментацП вищих 6азид1ом1цет1в на рослинних полкубстратах;

- селективно нЩбрати вищ! базид!ом!цети- активн! продуцен-ти л1гн1Иол1тичних фермент!в, дослЦити компонентний склад ix л!Гн1нол1тичних комплексов при р!зних способах ФерментацП та оптимальн! умови культивування, що забезпечуйть висок! piBHi активностей даних фермент 1 в;

- вивчити вплив ПАР р1зноi ioHHoi природи та конЦентрац1й на л1гн!нолгтичн1 ферменти грибб i л о i гнил!;

- одержати гомогенний препарат Kni11j-зйлеиноi пероксидази та вигначити И 6ioxlwiMHi характеристики.

Положения, що виносяться на захист:

- селективний вплив поверхнево-активних речовин рiз^зоi i он-ноЗ природи на компоненти л!гн1нол!тичних ферментних комп-лекс!в грибов б!ло! гнил! Phellinus igniarlus ! Pleurotus florldae;

- азот-залекна регуляц!я активностей фенолоксидаз при твер-дофаз!пй ферментацП гриб!в бIлоi гнил! нгГ.поб!чних - продуктах переробки ол!йних культур;

- !ндукуичий вплив препарат!в л!r-niny Пндул!ну ПТ га це-лол!гн!ну) .на л!гн!нол!тичний ферментний комплекс гриба Ci/ioi гнил! Pleurotus floridae та залежнкть активностей Ип(П)- зплf-кно 1 пероксидази та лакк.ли сiд. ^озпод^лу висо-ко-- тл ни ||,<:(1молеку.пярних Фракций i препаратах лтпну.

Наукова новизна. Вперше очинена Mn( II Ьзалеина пероксида-за Í3 гриба 61ло! гнил! Ganoderma colossun; визначен! П 6ioxiHi4Hi характеристики, субстратна специф!чн!сть.

Вперие в умовах твердофазно! ферментацП гриб!в б!ло1 гнил! на рослинних полкубстратах показана азот-залежна р.е-гуляц1я активностей фенолоксидаз.

. Новизною роботи е вивчення впливу поверхнево-активних ре-човин pÍ3Hoi ioHHoi природи га концентрац1й на л!гн!нол1тич-Hi ферыентн! комплекси гриб!в 61Л01 гнил! (Phelllnus ignia-rius та Plearotus floridae). Встановлено, цо HeioHoreHHi ПАР Tbíh-80, Tbíh-40 i ан1онна ПАР сульфонол стимулювали актив-ностI л!гн1нол1тичних Фермент1в, кат!онна ПАР_, етон!й д!яла на них селективно. Знайдена б!льша ефективнкть дП ПАР сто-совно п!двищення активност! лаккази в 1,8, a Mn(II)-залекно! пероксидази - в 1,6 разов для твердофазного культивування Р. floridae пор1вняно 1з культивуванням на синтетичному середо-вищ!.

• Теопетичне та практичне значения результат1в дисер-тац1йно1 роботи. Науково обгрунтовано способи одернання ак-тивних препарапв л1гн!нолпичних та г1дрол!тичних фермент!в грив!в б!ло! гнилi. Результати досл!джень дозволяють конст-ругавати рецептури поживних сереДовищ з нетою рогуляцй активностей л1гн1нол1тичних фермент1в. з р!зним сп!вв!дношенням компонент i в в комплекс! для вирошення конкретних завдань по ферментол!зу природних рослинних ррсурс!в.

Показана моялив!сть рационального використання поб1чних. продукт i в переройки. ол!йнмх культур (нерозчинного залишку соевого шроту, лушпнння imciHHa соняшнику та оболонок нас1ння coi ) як огновних компонентов поживних середовищ для тпордофазного культипування -доревпруйнугачих базид!ом1цет1в.

Оптим1зовано процеси ферментоутворення г1дрол!тичних та л!гн!нол1тичних ферменПв при твердофазн!й фернентацП ба-зид1альних/ гриб!в на запропонованих повивних середовичах.

Реал1зац1я результат!в роботи. Одержан! в робот! фер-ментн! комплекси та очищений препарат Мп( ID-залевно! перок-сидази мовуть бути застосован1 в б!отехнолог!чних препаратах для б1олог1чнб! дел!гн1ф1кац1 i, виб!лювання та ыодиф!кацй волокон пульпи, а такоя в якост1 неспециф!чних окисник!в при розклад1 токсичних ароматичних сполук, цо забруднюють оточу-пче середовице (хлорФенол1в, барвник!в, д1оксину, ДДТ1. для очистки ст1чних вод та в!дб!лення паперу.

Особистий внесок у розробку наукових результат^, вдо ви-носяться на захист. Вивчено вплив ПАР р!зно1 Iohhoi природи, -препарат!в л1гн!ну на л!гн1нол1тичн! ферменти гриб!в б1ло! гнил!; очищена MnUI )-зале«на пероксидаза. 1з Q. colossim; "оптим!зовано процеси ферментоутворення Ндролаз та фенолок-сидаз при твердофазн1й ферментацП базид!ом1цет1в, проведено сирин!нг активних продуцент^ фенолоксидаз, вивчено компо-нентний склад в!дселектованих штам1в.

_Йпробац!я роботи. OchobhI результати роботи викладен! на Uli Int. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Prague, Czech Republic, 1994); VI Чкратськону б1ох1«1чному з'1зд! ,(Ки1в. 1992); Всесоюзной конференции "Проблемы культивирования съедобных грибов в СССР" (Пуйино, 1991); Всесоюзной конференции "Достикения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991); Всесоюзной конференции "Ферменты - народному хозяйству" .(Черновцы, 1990).

Публ1кацН. По тем! дисертацП опубликовано 8 роб!т.

Структура дисертацй. Дисертац1я складаеться з вступу, л1тературного огляду (3 розд1ли), oG'eKTie i метод1в дослЦ-

вень, результате та ix обговорення (5 розд!л1в), рекомен-дац!й до впровадження у виробництво, висновк!в, списку викб-ристано! л!тератури, що м!стить 298 посилань, пом1в них 243 роботи 1ноземних автор1в". Дисертац1я викладена на 165

rroplHtfax, м1стить 13 таблиць, 32 малганки, *

МЕТОДОЛОГИ, МЕТОДЙ Д0С1ИД1ЕННЯ'ПРЕДМЕТУ I ОБ'ЕКТЙ.

, Об'ектами дослЦження були культури 21 виду вищих дерево-руйнугачих базид!ом1цет1 в. Основн! компоценти середовищ. для твердофазного кудьтивування базид!ом1цет!в - нерозчинний за-литок соевого шроту. (H3I), оболонки нас!ння coi (Glycine soja L.) та луипиння нас!ння сонявнику (/И!£). С Не 1 ianthus annuus L,), отриманг на Чернявенькому олЯйно-лировому комб!нат1.

Визначення вмкту загального, белкового та неб!лкового азоту в субстратах проводили за методом К'ельдала, Bmíct л!гн1нц И целюлози в субстратах визначали методом титрування (Починок, 1976); * '

Занурене кудьтивування базид!ом!цет!в проводили у середо-вичИ Kiрка (Kirk et'al, 1988) з модиф1кац!ями (Muhelm, 1991). У pTiбот! використовували таю ПАР: звонку ПАР сульфонол • (Na- алк!лбензолсцдьфонат), не1оногенн! ПАР Tbíu—80 та Тв1н-40 (сорб?тан 6icfпол!оксиетилен) монолеати), кат1онну ПАР ■eroHÍfi [1,2 -С Н, W*-б! cf д 1метил )-N, N*-6i с( децилацетат)). етилен д!амон!й д1хлприд].у к!нцевих кокцентрац! ях у середовищ! 0,1; 0,025; 0.01 та 0,0012. У робот! використовували таю прпплрати л 1 гн i ну: кокррц!йний препарат крафт-л!гн1"ну i нд'хл i я fiT (Keslvaco Corp,, Charleston, CS, CIJA), тирсу де-реви'ни corrin, цололтп'н fпобтчний продукт виро^ництва фур-Фирггпу). Гель-г}|1льтрац!ю пррплрлпр л! гн i ну проводили на се-

-Фадекс! С-75 (РЬагвас1а, Ивец1я) за методом Хаемерл! (Наев-вегП еЬ а1, 1986).

Методи визначення ферментативних активностей. Визначення протеолИично! активност! проводили за модиф1кованим методом Ансона (ГОСТ 20264. 2-74); загально! целюлазно* та загальноЗ ксиланазно1 активностей - за модиф!кованим методом Иомод1-Нельсона (Клесов и др., 1980); ендоглюканазно! активност1 -вискозиметрично (Клесов и др., 1982). 0ктивн1сть лакка?и визначали за окисления« о-д{ан1з1динц (КИап еЬ а1, 1990) або сирингальдазину (Нагк1п еЬ а1, 1973). Октивнкть пероксидази визначали як р!зниц» м!ж швидк1стю окисления о-д1ан\з1динц або сирингальдазину в лрисутност! та вЦсутност! Н^' в реакций сум1и1. Активн1сть Мп(11 )-залекноI пероксидази (МрП) визначали за швидк1стю окисления сирингальдазину (flndeг еЬ а1, 1987) або 2,6-диметоксиФенолу < ЯЬиНЛемогЬЬ

- . л

а1, 1986) в присут^ост 1 та висутносп Нп та п^О^в ре-акц!йн1й сум1шк Активност1 целоб1озох1нонооксидоредуктази (целоб1озодег!дрогенази, ЦБХО) та глюкозооксидази визначали за швидк1стю окисления 3,5-ди-терт-бутилбензох1нону в при-сутност! в!дпов1дно целоб1ози (Нез1егшагк а1, 1974) або глскози ( Gc.uk/-А1агсоп еЬ а 1, 1989).

Активносп ферменпв вйм!рювали за допомогою рег!струючо-го спектрофотометру Зресогб М-40 (Шмеччина) та СФ-46. Активное^ ферменпв виражали в м1лнородних'одиницях - одиниця активност1 в!дпов1дала к1льност1 ферменту, необх!дн!й дла окислення 1 мкМ субстрату або утворення Г мкМ продукту за 1 ' хв. на 1 л (г) ферментного препарату в отимальних умовах. Вм1ст б1лка в ферментних препаратах вит'рювали за методом Лоур! (Ьоигу е1 а!. 1951).

Метиди »чистки Ферментов. Аф]ннц хроматограф1ю пдрол1тич-

них ферментов проводили з використанияы паперового пилу (Cheuarol, Чех1я) в якост1 сорбенту. Гель-ф1льтрац1и препарате г1дрол!тичних фермент1в проводили на сефадекс! G- 100 (Phariacla, 0вец1я). Високоефективну рЦинну хроматограф1ю МрП проводили на ан!оноо.бм1нних колонках "Q-cartridge" (Bio-Rad, СИ) та Mono 8 (H/R 5/5), (Pharmacia, Ивец1я), Контроль за BHiCTOM б1лка зд!йснювали спектрофотометрично при 280 нм, МрП- 40? нм за допомогою Bio-Dimension Detector UU/UIS Monitor (Bio-Rad, CM).

Субстратну специф!чн1сть МрП визначали при використанн! наступних субстрат!в: ЙБТС (2>2'-азияо-д1-3-етилбелзот1азо-л!н-6-сульфокислоти, Sigma, США); сирингальдазину Í4-гiдрок-си-3,5-диметоксибензальдег1дазину, Sigma, CIA); фенолу чер-воного (Sigma, СШ, 2,6-диметоксифенолу (Sigma, CHA), NADH (Boehrlngejj, Шмеччина), вератрилового (3,4-диметоксибензи-лового) спирту (fildrich, Cfflfi), ван1л1нового спирту (Aldrlch, CIA). ван1л!ну (Sigma, CIA) та гомовератрово!' кислоти (3,4-диметоксифен1лоцтово) кислоти, Signa. США). Активн1сть .МрП визначали спектрофотометрично за тавидкктв окисления ви-щезазначених , субстрат 1в на початкових д!лянках кшетичних кривих на р1зних довмнах хвиль (значения коефЗц|ент!в молярное екст1нкцИ надан! в табл. 4).

Електрофоретичний анал!3 препарат1в л!гн1нол1тичних Фермент 1в проводили в 10г, а такой в 8-18% град!ентному ППАГ в нативних -умовах за методом Дев1са (Davis, 1954). ВЗзу-ал]'зац1ю смуг фенолоксидаз проводили 4-хлоро-1-нафтолп>< (Sigma, CIA), (Kern, 1903). Електрофорез в денатуруичих умп-вах проводили за методой Аемл! (Laesmll, 1970).

ОСНОВНИЙ 3KICT ДИСЕРТЙЦП. i. Властиворт! г!дрол!тичних та л!гн1нол!тичних мцльтифермен-тних комплексов в умовах твердофазно! ферментацП 6a3pioMi-цет!в.

В деградацП рослинних пол!субстрат1В вир1шальну роль се. ред г!дрол1тичних Фернент1в вЩграють níuho адсорбован! це-лвлази, а саке ендогликанази (Klyosov et al. 1986).

Для селективного вид!лення фракцП ендоглюканаз продуиен-ту г1дрол!тйчних фермент!в Bjerkandera adusta (fi/c N 38094, НРБ) застосовано аф!нну хроматограф!ю на паперовому пилу. На дан!й стад!! ступ!нь очистки ендоглюканаз досягав 15,7-раз!в при виход1 Ж/, (табл. 1). Методом SDS-електрофорезу встанов-лена, ¡цо аф!нний препарат м!стив 9 б!лкових компонент^ з. молекулярними масами 35-67 кДа та один - 12 кДа. На заключ-

Та&л. 1 Очистка г1дрол1тичног« комплексу В. adugta* M¿a, п=5

■ - йктивност! С од/г 6iлка)

Етап очистки Протеаза Ксиланаза Целюлаза Ендоглюк,

Культур, екстракт 11, 7i 1,5 420*12,2 49,5i3,8 2,3i0,l

П10Х:

осадяення етанолом 7,0*0,2 6 i 2±16,4 39,6i2,7 2,1+0,1

осарення ацетоном 6,7+0,2 624±10,1 38,3±5,1 не вим!р.

осадкення (NH^)¿S0i, Йф1нна хроматогр,: 6, 2±0,5 180±8,7 9,1±2,2 не вим iр,

2,1

вих1дний препарат 2,4 • 570 23

ФракцЗЗ fl. 2.3 660 . 24 0,83

Б 2-, 2 53,0 •' 4 4,6

В - 201 78 33,0 .

Гель-ф1льтрац1я:

вих1дний препарат 2,2 551,0 101,0 »

ФракцП I — 164,3 28,6

II — 140,0 33,3

III 3,5 1344,8 158,6

IV 6,4 574,5 251,Л —

и 71.1 28 Д;

.VI — — —

номц eiani очистки (концентрування компоненте гЦролпйчно-го комплексу за допомогою гель~ф!льтрацП на сефадекс1 G-100) ступ1нь очистки досягав по: целюлазам -2,5; ксиланазам -2,4; протеазам- 2,9 раз1в (табл. 1), Для одеркання високоактивно-го ферментного комплексу г!Дролаз найб1льи актива фракцП об'еднували, осадиували та л!оф!л1зували. Методом SDS-елект-рофорезу встановлено, що отриманий препарат mícthb 16 61лко-вих компоненте з молекулярними «асами в i д 20 до 65 кДа.

Таким чином, одеряан! результати дозволявть запропонувати схему посл1довно! очистки г1дрол!тичного комплексу Bjerkan-dera adusta, що передбачае осадяення б!лк1в !з екстракту (отримання препарат!в ПЮХ), аф1нне в!дд1лення фракцП м1ц-ноадсорбованих ендоглюканаз та концентрування г1дрол1тичного комплексу за допомогою гель-ф!льтрац1i,

Серед л!гн!нол1тичних фермент1в ключова роль.в деградацП рослинних пол1субстрат!в. выводиться л1гн!наз1 та фенолокси-дазам (Gold et al, 1989; finder et al, 1977). Вивчення зако-ном1рностей регуляцП активностей фенолоксидаз проводили при використанн! 6 вид1в базид!ом1цет1в з р1зною еколог!чною пристосован1с,тю. Кореляц1йний анал!з залеяност! значень фер-мвлтативних активностей в iд вм!сту загального' азоту в сере-довищ! св!дчив про '1снування зворотньо! кореляц1йнй! залеяност! м!ж bm'íctom азоту в середовищ! та величинами активностей Фенолокислюючих Ферментов (табл. 2), Поява активностей л!гн!нол1тичних ферменпв в умовах л!м!тування складу сере-довища за bmíctom азоту в!дома: у випадках культивування гриб1в б i л о i гни-ni на синт.етичних середовищах (Jeffrie? et al, 1981; Leisola et al, 1988). Нами в умовах твердофазного культивування грибов б i ло i гнил! на рослинних пол i сь'бстрат^к показана азот-залежна регуляцгя активностей фенолоксидаз.

Табл. 2. Значения коеф!ц!енту кореляцП м1ж активностями пе-роксидази (ПРО), монофенолмонооксигенази <ЫФМ.з та вм!стом эагального азотц в середовищ!.* Н=Б

В|егкап<1ега айивЬа вт. 1 Р1еиго1и5 оз1геа1из шт. 1300 СогIо1иэ иеггкокг ВКМР 462

ПРО -0,97 ИФИ ПРО -0,94 МФМ -0,83 ПРО -0,96 МФМ -0,82

СоНориЬегсепз ВКМР 115 БЫ 2орЬу11ии соииц- пе ВШ 2408 - Гоше? ГоиепЬагкй ВКМР 3202

ПРО -0,90 МФМ -0,70 ПРО -0,99 МФМ -0,73 ПРО МФМ -0,79

0,Й1<р<0,05

* середовище м1стило поб1чн! продукти переробки олШшх культур (НЗШ 1 ЛНС) в р1зних сп1вв1дношеннях.

9 результат! скрин!нгу 3? штам!в-вищих базид!ом!цет!в, що викликавть деструктивний та короз!йний ксилол!з деревини, селективно в!д!бран! штами РЬеШпиз 1еп1аг!ыб, ВКМР 386. та Р1еиго1из Иог!<!ае, ИБК 338 - активн! продуценти фвнолокси-даз. Подальи! дослЦкення л!гн1нол1тичних комплексов ба-зид!оы1цет!в проводились з використанням даних селективно п!д1браних «там!в.

Головним фактором, що визначае ступ!нь ферментативное конверсП л!гноцелюлозних субстратов, е р1вень Х1М1"чо1 мо-диф!кацП л1гн!ну (Мануковский и-др, 1990). Для кш.ккногп визначення л1гн1н - деградац!йно! здатност1 грибгв викорис-говували коеф1ц!ент л!гн!нол1з!су К1 (ЕПяагЬуШ е1 а!, 1988): для РЬе1Ипиз 1дп1аг1из в!н дор1внював 0,3-1, а для Р1еиго1;и5 ПогЧйае - 0,57.

-112. Л!гн!нол!тичн! комплекси гриб1в б!ло! гнил! в умовах за-нуреного кулнивування.

В1домо, ко для прояву активностей окреыих л!гн!нол!тичних фермент!в необх1дн1 р!зн! Ф!з!олог1чн! умови (Kirk, 1978; Huheia, 1991). U зв'язку з цин вивчення компонентного складу л!гн!нол1тичних комплексов проводили в 3 модиф!кованих сере-довинах К!рка; л1м!тованону за вм!стом азоту, лМтованому за вм1стон. вуглецю та середовищ!, л!ы!тованому за bmJctom обох компоненте (мал. 1). Одерианi нами результати св!дчили про 1снування зворотньо! кореляц!йно! залешност) м!а концец-трац!ев азоту в середовиц! та активн!стш УрП (г--0,91); прямо! кореляц1йно1 залеяност! uis концентрацией азоту в середовиц! та активн!стю Ц6Х0 (г-0,99); зворотньо! кореляц!йно! эалекност1 ы1> концентрацией глюкози в середовиц! та ак-тивн!стю лаккази (Г--0.62).

Мал. 1. Динам!ка активностей л!гн!нол1тичних фермент!в при культивуванн! P. floridae в гтац!онарних умовах по ИЗрку.

К±я, п-4

■ - середовиче. л!м1товане за-вм!с том С (13 кМ С; ?,2иИ N) • - середовице, л!м!товане за вмктоы N (55 вИ С; 2,4мМ N) 4 - середовице. л1м!товане за вм!стои N. С (13 мМ С; 1,2 мМ N)

Застосоване нами занурене культивування Р. Пог1с1ае в умовах 1ыоб1л1зац11 м1цел!ю на пол!уретанових нос!ях дозволило зб1лыши активн!сть лаккази в 2 рази пор!вняно з куль-тивуванням в стаи'онарних умовах по'К!рку (мал. 2, А, контт роль), а також запровадити нап!впер1одичний спос!б культивування. НеобхЦно в1дм!тити, що недостатня аерац!я в товстому ■ар! середовища пор!вняно з культивуванням у передовиц! К1рка з високии вм!стом молекулярного кисню обумовлювала I в1дсутн1сть активност! МрП (нал. 2, В, контроль).

3. 1ндукц1я л1гн!нол!тично1 системи Р1 еигоЬив Пог1йае.

Грунтуючись на пов!доыленнях про здатн1сть прьпарат1в л1гн!ну 1ндйкувати л!гн!.нол!тичн1 ферыенти (Ье15о1с1 еЬ а 1, ~ 1989; 1)1«ег е1 а1, 1984) нами проведено досл!дкенна по вив-•ченню впливу препарат!в л!гн!ну Стирси деревинк сосни, 1ндул!ну ИТ та целол!гн!ну) на активност! фермент!в л1гн1но-л1тичного комплексу Р1еиго1и5 Г}©г^ае (мал. 2),

Встановлено, що в присутност! вс!х вивчених препарат!в л1гн!ну в1дбувалась 1ндукч1я активност1 лаккази. При цьому еле«трофоретичн1 досл!д«ення показали, що зростанкя активност! лаккази в присутност! препарат!в л!гн!ну було результатом 1'кдукцП констйтутивних 1зоформ (РГ=0,6 та 0,63). Кр!м того, - в присутност!. 1ндуктор!в сп'остер!галась поява 2 п1к!в активност1: на 5 та 10 добу. Даний б!модальний розпод!л лк-тивно.стI лаккази в присутност! !ндуктор!в л!гн!но,'чгично1 си'стеми пов'язуеться з явищами непрямо! фенольно] 5ндш;цП внасл1док 1снування, лакказо-целоб1озо-х1нон-оксидоредуктаз-ного та лакказо-глвкозо-х1нон-оксидоредуктазного цикл!в (Бовег-Й1агсоп г1 а1, 1987; НезЬегаагк е1 а!, 1974). Якщо в контрольних препаратах, що не м!стили препарат!в л!гн!ну * та

лаккази, Б- ЦБХО, В- МрП, Г- глгакозооксидазЮ в присутност1 пр.епарат!в л!гноооу. ■ п=4-

контроль: х- тир^з сосни; »- целол!гн1н; о- 1ндул1н йТ.

препаратах, що м1стили .тирсу, спостер1галась незначна ак-тивнкть МрП (1зоформа МрП 1, И^О.Н), то в присутност! це-лол!гн1ну та ондулону йТ в!дбувалась 1кдукц1я ¡зоформи МрП2 (1^=0,41). В присутносто' цело*л1гн1ну та 1ндул1ну ЙТ вобралась також 1ндукц1я активност1 ЦБХО.'Присутн1сгь препаратов л!гн!нц не валивала на активн!сть глюкозооксидази (мал. 2).

Таким чином, встанавлено селективний вплив дослЦиених препаратов логнону на л1гн!нол1тичиий комплекс Р. ИоН&'.е.

Нал. 3.

Геяь-ф!льтрац1я препарат!в л1гн!ну на сефадекс! 6-75. 1- !ндул!н АТ:

I- целол!гн!н. у

чо То ¿о т ио т Ц-»*-

Гель-ф!л1>трац1а препарат!в л 1 гн!ну св!дчила про ,р!эне

сП!вв1дношення високо- та низькомолекулярних фракц!й в 1ндул!н1 АТ та целол!гн!н! (мал. 3), В 1ндул!н! АТ перевава-ла високомолекулярна фракц!я, тод! як целол!гн!н характери-•зувався б!львою пол1дисперсн!ств в напрямку до перевавання середньо- та низькомолекулярних фракц!й. Встановлено, цо р!-вень активност! НрП та лаккази в присутност! даних препарат^ л!гн!ну залевав в!д розпод!лу в них високо- та низькомолекулярних фракц!й та був б!львий в присутност! ¡ндул!ну АТ. де вм!ст високомолекулярних фракц!й вищий.

4. Вплив поверхнево-активних речовин (ПАР) на л!гн1нол1-тичн1 комплекси гриб-1в б1ло! гнил!..

КаталНичн! властивост! л!гн!нол1тичних фермент!в, щи е мембраноактивними, в значн!й ы1р1 визначаються природою 1х м!крооточення (Клячко и др., 1988). 9 зв'язку з цим вивчено вплив ПАР р!зно! !онно1 прирсди та концентрац!й в середовкщ! на л1гн!нол!тичн1 комплекси гриб!в б!ло! гнил1 РЬеШпиэ 1дп1аг1иэ (мал, 4, I) 1 РЬигоШ ПоНйае (мал. 4, И). Встановлено, що в присутност! не!оногенних ПНР Тв1Н->10,

TßiH-40 га ан1онно1 ПйР сульфонолу спостеркалось зб1лы»ення активностей лаккази, пероксидази та МрП. Оптимальними вияви-лись "низьк1" концентрацП ПйР О.ОГ/ та 0.001%. Кат1онна ПАР етон!й стииулювала активн1сть пероксидази, 1нг1бувчи ак-тивн!сть лаккази на 20-70'/. в залевностf Bin концентрацП ПйР, та МрП (1з Pleurotus floridae - на 58,8^10,32, МрП 1з Phellinus igniarius - на 15j.4% в ycix досл1д»ених концентратах ПЙР). Дан! результат« монна пояснити негативним впли-вом етон!ю на актмвност! лаккази та МрП у зв'язку з" його дестабШзугачою flien на нативну структуру ферменту та/або фермент-субстратну взаемод!ю. Встановлена зм!на !зофермент-ного спектра МрП !з Р..igniarius Сз'являлась ¡зоформа МрП2, Rf=0,43) за дН сульфонолу, В1дсутн1 сть !зоформи МрП2 в кон-трольних препаратах (що не м1стили ПЙР) пЦтвердиено елект-рофорезом в умовах перевантакення гелей.

ВIдома, що деяк! ПЙР здатн! до модиф!кац!i проникливост! плазматичноё мембрани, що викликае в!дпов!дн! зм!ни секрецП метабрл!т1в, у тому числ! б!лкзв в оточуюче середовище (Reese, 1969). Нами, проведено анал!з впливу дослгдяуваних ПЙР на секрец!ю позаклпинних 61лк!в грибами ' Ph. igniarius та Р. floridae (мал. 4, I-a, II-а). Показано зб1льиення секрецП позаклНиннт? 6uk!b за дП ПЙР максимально на 35%, тод! як активносп лкнпшлНичних фермент!в зростали в 0,3-3.& pasiB залеяно вiд ioHHoi природи ПЙР та П концентрац!i,

Таким чином, !з пор!вняльного анал!зу впливу ПЙР на сек-рец!кз позаклИинних б 1 лкiв та активност! л(гн!нол1тичних ферментов випливае, що 'обЧльшення активностей' л1гн1Иол1 тич-них фермент!в не обмежуеться зрпстанням секрецП лозаклНин-них б г лк1 в в прису'тног.т! ПАР.

а о кмфом

- £50р

Мал.4.

Вплив ПАР на секрец1ю позакл!-тинних б5лк!в (а); активност1*150 пероксидази (б); МрП (в); лак-кази (г) при твердофазному изо! культивуванн! РЬЛвп1аг1иг (П 1 Р.ИогМае СП), й- Тв!н-80, 50 /Б- Тв1н-40, В- сульфонол, Г-етон!й), * активн!сть в!дносно 0 контролю, '/..

<

o,<m

Мал.5,

Вплив ПАР на активности лак-до казн.(а); пероксидази (б); Mpil (в) при культивуванн! Р.150 floridae на синтетичному се- юо редовиц1. й- Тв1н~80, Е-Тв1н 40. В- сульфонол. Г- етон1й. *активн1сть вЦносно контролю. У...

0,00r-i

мнТроъ

ПАР мають здатнкть солиб!л1зувати субстрати, то призво-дить до перекоду ран!ие нерозчинних сполук у розчин (Hiroshi. et al, 1986). 3 метою оц!нки рол! солюбШзац!i рослинного пол!субстрату в сумарн!й зм!н! ферментативних активностей в п[ГИсутност! ПАР нами вивчено вплив ПАР на л!гн!нол!тичний комплекс при культивуванн1 P. floridae на синтетичному середовищ! (мал. 5). Проведено пор!вняльний анал!з в1дносно1 зм!ни ферментативних активностей P. floridae п!д впливом ПАР при двох методах культивування. Встановлено, що в присут-ност! досл!дмуваних не1оногенних та ан!онно! ПАР активнкть МрП при твердофазному культивуванн! пор!вняно 1з культиву-ванням на синтетичному середовищ! а середньому зростала в 1,6 раз1в, в присутност! не!оногенних ПАР Тв!н-80 та Твiм-40 активность лаккази зростала в 1.35-1,63 раз!в, ан!пнна ПйР

сульфонол у Bcix доел!диених концентрац!ях викликала однако-ве (в 1.86±0,14 раз!в) зростання активност! лаккази при твердофазному культивувамп пор!вняно з культивуванням на синтетичному сереловини. Зростання активностей фермент1в в присутност1 ПАР при твердофазному cnoco6i культивування П0р1внян0' з культивуванням на синтетичному середовищ1, 1мов1рно, пояснюеться як солюбШзац1ею субстрату, що приводить до розкладу ран1ше недоступних для дП ферменту структур субстрату, так I викликаник ПАР прискоренням десорбцН адсорбованих л1гн1нол1тичних фермент1в з поверхн! субстрату, «о сприяе IX вступу в новий катал!тичний цикл (Измайлова и др, 1988). Солюб1л1зац1я субстрату не вшшвала на зм!ну активност! пероксидази при двох методах культивування в при-сутност! ПАР.

Отриман! результати свЦчать про активац1ю л!гн1нол1 тич-них фермент!в в присутност1- досл1днених не!оногениих та ан1онно! ПАР, селективну регуляц!ю активностей л!гн1нол!тич-них фермент1в нат!онною ПАР етоюем, а так'ож п1дкреслюють вавлив^сть наявност! навколо ферменту специф!чно д1ючого на нього м!целярного м1крооточення та моиив1сть регуляцН ак-тивност! ферменту иляхом вар!ювання даного м1крооточення.

Z+-

5. Очистка та характеристика Мп-залежно! пероксидази 1з гриба б1ло1 г^нил! Ganoderma colossum..

Вважають, що ключовим ферментом в л!гн!нол1тичниг комплексах, в яких в1дсутня л1гн1наза, е Mn( 11 )-залема перокси-даза (Леонтьевский и др, 1990).

•На перш!й стадН очистки МрП 1з л!гн!нол1тичнгл к'рьтури .гриба G. colossum використана високоефективна риинлл хрока-тограф!я (HPLC) на ан1онообм!нн1й колонц! "(1- c<"iv-ti ><iс*",

завдяки чомц вдалося в1дд!лити п1гменти та лакказу, вих!д МрП.склав 39 Л И за активнктю (та'бл. 3). Наступна стад1я очистки, призначена для бIльи тонкого розд!лення препарату МрП, включала ивидку б1лкову р!динну хроматограф!® (FPLC) на сильному ан1онообм!ннику Mono Q (HR 5/5), Остаточно 277. вих!дно1 ■ активност! було одеряано як чистий фермент (табл. 3). SDS - електрофорез св!дчив про гомогенн!сть ферменту, який мав. молекулярну масу 47 кДа., 1зоелектрична точка ферменту дор!внювала 3,0. Табл. 3,

Схема очистки Нп-зале»но1 пероксидази 1з Ganoderna colossim.-*

Об'ем, Акт., ,-Акт., Вих1д,

Етап очистки мл од/л од 7.

Культуральний екстракт 900 258 232,2 100

Ультраф!льтрац1я,

Anicon, РМ-10 (10 кДа) 1.8 85500 153 65,9

1онообм1нна хроматогр.

Q-cartrldge (Bio-Rad) 1.5 00487 90.7 39,1

Диультраф1льтрац1я,

flralcon, РМ-30 (30 нДа) 0,1 798000 71.8 30,9

1онообм!нна хроматогр,,

Mono Q (Pharmacia) 0,08 ? 912*5 0 63,3 27,3

* активн!сть МрП вим1рювали по окислению 2,6-диметоксифенолу

Дасл1джвнря субстратно! специФ1чност! МрП проводили на типових субстратах МрП, лаккази та л!гн!нази (табл. 4). Фермент проявляв абсолютну залекнкть вгд Нп , як 1 вс! вид!лен! ран!ше МрП i3 л!гн!нол!тичних культур гриб!в б1ло* гнил! (Johansson et al, 1997; Forrester -et ai; 1990). МрП окислввала фенол червоний, АБТС, сирингальдазин, 2,6-диме-токсифенол лише в присутност! «о пЦтверднуе перокси-

дазну природу ферменту, не вимагався як ко-субстрат

при окисленн! NßDH. В данiй реакцП проявляются оксидазна та HiQx- генеруюча властивогт! Ферменту (Беккер, 1993). Го-мовератрова кислота, вератриловий та ванШнбвий спирти (типов! субстрати л!гн!нази) не окислювались Mn( II Ьзалеяною аероксидазов.

Табл. 4 Субстратна специф1чн!сть Мп-залекно! пероксидази 1з Ganoderua colossum. Или, п=5

субстрат нм -г -f .Г, М см йя хв л Активн!сть, -1. -1 шН хв л

В'ДН. од

flETC, 420 36000 58,5i2,5 12973*549

сирингальдазин 525 65000 83,2il,6 10233±190

Фенол червоний * 610 нев!дом 13,9±0,1

2,6-диметоксифенол 470 10500 48,2i0,1 38560±20

mm 340 6220 90,3t4,2 119900+5270

вератриловий спирт . 310 9300 ------

ванШновий спирт 310 9300

гомовератрова кислота 310 9300

Реакц!йна сдм!и (0,8 мл) мктила 0,? мМ MriSO^, 0,1 шН субстрат, 50 шН Иа-лактатний Буфер. рН4,7 та 0(1 мл МрП. Реакт'ю починали додаванням 1 нМ Н^та проводили при 20"С на заз-начених в таблиц! довкинах хвиль.

* реакц1ю припиняли через 5 хв додаванням 5 ^пл 5н каОН (Glenn et. al, 1985).

-21-

0С110ВН1 РЕЗУЛЬТАТА I вишвки.

1. Одержан! активн! мультяферментн1 комплекси г1дрол!тичних та л!гн!нол!тичних фермент!в та визначен! оптимальн! умови ферментоутворення при твердофазна ФерментацН вищих ба-зид!алвних гриб!в на рослинних пол!субстратах.

2. Вперие в умовах твердофазно! ферментацП гриб!в б 1 ло! гнил! на л!гноцелюлозних пол!субстратах показана азот-залеяна регуляц1я активностей фенолоксидаз. .

3. У результат! скрин!нгу 37 штам1в вищих базид!ом!цет!в селективно в1д!бран! штами РЬеШпм 1дп!аг!из, ВКНГ 386 та Р1еиго1ий ПогЫае, ЙБК 338, яким властив! висок! активност! Фенолоксидаз; визначений компонентний склад ¡х л!гн!нол!тич-них ферментних комплекс!в при р!зних способах культивування та ступ!нь деградацП рослинного пол!субстату.

4. Встановлено 1ндукугачий вплив препарат1в л!гн!ну Пндулзну АТ 1 целол!гн!ну) на л!гн!нол!тичний ферментний комплекс Р1 еиго1и£; Иопйае. При цьому р!вн1 активностей Нп(П)-за-лежно! пероксидази та лаккази залетали в1д розпод!лу високо-га низькомолекулярних фракций в препаратах л!гн!ну.

5. Вперие вивчено вплив поверхнево-актйвних речовин (ПАР) р!з'но1 !онно 1 природи та концентрац1й в середовищ! на активное^ л)гн!но.П)тичних Фермент!в гриб! в П1 ло 1 гнил! (РЬеШпиз 1 йгпаИиз та РТеигоЬиз Пог!(1ае). Встановлено, що некногеннз ПАР Тгпн-80,' Тв1н-40 \ ан1опна ПАР сульфонол стимулювали яктирнлгт! л!гн!нол!тичних Фврмент!е, кат!онна ПАР етон!й д{яла нл них селрктивно, Показанл зб^ьиення секрет'¡' ппзшштинних б! л к 1 в за дП ПАР максимально на 35%, ! октивног.тсй л 1 гн!пол!тичних фпрменп'в - в 0,3- 3,6 раз!р за-лекио с5 д ¡онио* природи ПАР та п нонцентраг11. Виявлено, вплир сульфпнолу на !зоферментний спектр Мп(П )-залекно! пе-

-22-

роксидааи i3 Phellinus igniarius.

6. Знайдена б!льва ефективн!сть дй ПйР стосовно п1двищення активност! лаккази в 1,8, а Мп(II )-залекно! пероксидази - в 1,6 раз!в для твердофазного кулътивування Pleurotus floridae пор1вняно i3 культивуваниям на синтетичному середовииЦ, що не п!дтвердяено для пероксидази.

t

7. Вперше Ьчищена Hn(II )-зале»на пероксидаза 1з гриба Ganoderma соlossum; визначен1 ii бioxiMlчнi характеристики, субстратна специф1чн1сть.

8. Показана мокливкть рац!онального^використання поб1чних продукт!в переробки ол!йних культур (нерозчинного заливку соевого ироту, лувпиння нас!ння соняшнику та оболонок нас!ння соП в якост1 основних компоненпв поживних середо-вищ для твердофазного культивування дереворуйнуючих ба-3HflioHiyeTiB.

СПИСОК РОБ IT, Н.АДРУШЙНИХ ПО TEMI ДИСЕРТйЦП.

1. Мошкович Ф.С., Костыиин С.С., Домбровская E.H., Копыльчук Г.П., Мурадов П.З., Ганбаров К.Г. Получение и характеристика гидролаз базидиомицета Bjerkandera adusta; I. Оптимизация фчрментообразования.// . Биотехнология.- 1991,- N

^ 6.- с.44-46.

2. Копыльчук Т.П.. Костыиин С.С., Мошкович Ф.С., Горичан У.П., Домбровская E.H. Получение и характеристика гидролаз базидиомицета Bjerkandera adusta. П. Очистка Ферментного комплекса.// Биотехнология.- 1992'.- К 2,- с.16-10.

3.. Костишин. С. С.. Мошкович Ф.С., Домбровская E.H., Оплачко Л.Т. Фенолоксидазные активности некоторых высших базидио-мицетпв. ]. Оптимизация ферментообразовлнчя и скрининг продуцентов.// Биотехнология.- ПП2.- N 6,- с.46- 49.

-234. Копыльчук Г.П., Ганбаров Х.Г., Мурадов П.З., Пендерецкая У.П., Моикович Ф.С., Домбровская E.H. Биосинтез и компонентный состав гидролаз дереворазруюавщих грибов Bjerkan-. dera adusta.// Труды Всес.'научно-практ. конф. "Ферментн-

народному хозяйству", Черновцы. 1990,- 1990,- с.74. 5. Осовик ft.-И., Костывин С,С., Моикович Ф.С., Домбровская E.H., Пупашко В.Й., Дербина И.И. Культивирование Pleuro-tus ostreatus на обходах переработки масличных культур.// Сб.тез.III Всес.сов. "Проблемы культивирования сьедобных грибов в СССР, Пущино-на-Оке, 1991.- 1991,- с.37. S. Домбровская E.H., Моикович Ф.'С., Оплачко Л.Т. Оптимизация ферментообразования пероксидаз и фенолокс^геназ базидио-мицетами.// Труды Всес, конф. "Достижения биотехнологии-агропромыиленному комплексу", Черновцы, 1991,- 1991.-с. 127. ,

7. Домбровська О.М., Оплачко Л.Т., Йошкович Ф.С. 1зофермент-ний склад пероксидаз I монофенолмонооксигеназ вищих дере-воруйнугачих гриб!в.// Тези допов. UI Укр. б1ох1м1чного зМзду. Khíb, 1992.- 1992.- т.З, с. 79.

8. Dombrovskaya Н., Horuath Е.-М., Kostyshyn S.S., Messner К. Manganese peroxidase from the ligninolytlc basidlomycete Ganoderma nolor.sum: purification and characterization.// Proc. 7-th Int. 11TMS Congress, Prague, Duly 3-8, 1994.~

5 934.- U.2- p. MSi 4.

* Домбровская E.H. Свойства лигнинолитических и гидролитических мультиферментных систем дереворазруща.гацих базидиоми-

Руколись диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических чаук по специальности 03.00.04 - "Биохимия", Черновицкий госуниверситет,.г. Черновцы, 1394,

Защищается 8 научных работ, содержащих исследования лиг-нинолитических и гидролитических мультиферментных комплексов при твердофазной и погруженной Ферментации дереворазруваюцих базидиомицетов, Впервые очищена Мп( ID-зависимая пероксидаза из гриба белой гнили Ganoderna colossum; определены её биохимические характеристики, субстратная специфичность. Установлено, что поверхностно-активные вещества различной ионной природы селективно влияют на лигнинолитические ферментные комплексы селективно отобранных грибов белой гнили (Phellinus igniaHus и Pleurotus floridae). Показана большая эффективность действия ПАВ относительно повывения активности лаккази в 1,8, а Нп-зависимой пероксидазн - в 1,6 раз для твердофазного культивирования Pleurotus floridae по. сравнении с культивированием на синтетической средо, что не подт-верндено для пероксидазы. В условиях твердофазной ферментации грибов белой гнили на лигноцеллюлозных полисубстратах-показана азот-зависимая регуляция активностей Фенолоксидаз, Helen N. Dombrovsk'aya Properties of ligninolytic and hydrolytic ииШепгуие systems of uocd-rottirig fungi.

A dissertation submitted for the degree of Candidate of Biologtcal Sciences, specialization 03.00.04 - Biochemistry, Chernovtsy State University, Chernovtsy, 1994.

8 scientific publications are defended, containing the research of ligninolytic and hydrolytic multienzyme complexes under solid-state and submerged fermentation of wood-rotting fungi. For the first time the Mn(11^dependent peroxidase from tne uhite-rot fungus Ganoderisa colossum has been purified; its biochemical properties 'ind substrate specificity have been determined. The selective influence of different ion'c nature surfactant? on ligninolytic enzyne complexes of . selected-white-rot fungi (Phellinus igniarlus and Pleurotus floridae) has been shown. Higher efficiency of surfactants' influence in relation to increasing activity of laccase by 1,8 tines; Mn-dependent peroxidase - by 1,6'times during solid-state fermentation comparing to Pleurotus floridae cultivation on synthetic mediufc has been shoun, uhich has not been proved for. peroxidase activity. Nitrogen-dependent regulation of phenoloxidaSe activities during solid-state fermentation of uhite-rot fung'i on by- products of cll-hearing crops processing has been shoun.

Илдчор! тлова: гриби бйо! гнил!, л1ппнол1тичн* фериен ти, лакк1,-.ча, Нп( 1! )-залекна пероксидаза, чонпфенолмонппкея-геназз, иелоб1озох1нонооксидоредуктаза, гюбiчнi продукти пе-рсробки опiйних -культур, б1одр.грлдац1я, rripnitiнг продч-?|ент1в, препарати л1гн!ну, 1ндукц!я, ппвпрхнрво-активн! рё-'JOr.j'Hll, 1)1СЙ1л!элц1я М5ЦРЛiW, rtnnnni тмин! гт^рпмгити.

цетов

Щдпиеано до другу I8.lt.94. Формат 60x84/16.' Пап!р друкарський. Друк офсетний. Ум. друк. арк. 1,3. Обл.- вид. арк. 1,4. Тираж 100. Зам. 100

Друкарня видавниитва "Рута" ЧернЮецького держун!верситету 274012, Черк)вц!, вул. Коцсбинського, 2