Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс

Свиридов, Максим Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс"

На правах рукописи

Свиридов Максим Михайлович

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ б-ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В УСЛОВИЯХ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ

ПЕЧЕНИ КРЫС

Специальность 03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2006

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ершова Антонина Николаевна;

доктор биологических наук,

профессор Наквасина Марина Александровна

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится декабря 2006 года в часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 39006 Воронеж, Университетская пл., I, биолого-поч венный факультет, ауд,59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан ноября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Изучение молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию и координацию обмена веществ в клетке, является фундаментальной проблемой биохимии. Исследование саморегулирования обменных процессов на уровне отдельных ферментных систем позволяет приблизиться к глубокому и детальному анализу организации метаболизма в живой клетке с выходом на более высокий ор га низменный уровень. Однако многие аспекты регуляции клеточного метаболизма на ферментативном уровне, особенно, в условиях развития патологии, требуют дальнейших исследований. Это относится, в частности, к 6-фосфоглюконатдегадрогеназе (КФ 1.1.1.44, 6ФГДГ) - ферменту, катализирующему одну из реакций пентозофос-фатного пути (ПФП) - окислительное декарбоксилирование б-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата.

Важность изучения 6ФГДГ определяется физиологическим значением данного фермента, участвующего в образовании NADPH, необходимого для протекания многах биосинтетических реакций. Кроме того, по современным представлениям в основе патогенеза ряда заболеваний лежит дисбаланс между чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) и недостаточностью антиоксидантных систем (АОС) организма (Ланкин В.З., 2000, Stadtman E.R., 2001). Благодаря функционированию гяутатионредуктазной/ глутатионпероксидазной (ГР/ГТ1) АОС в клетках обеспечивается детоксика-ция неорганического и органических пероксидов. Уровень NADPH играет наиболее значимую роль в регуляции интенсивности функционирования данной системы. Показано участие тлюкозо-6-фосфагдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1,1.49) в поставке NADPH в условиях оксидативного стресса (Левенкова MB,, 2004). Данные относительно функционирования 6ФГДГ при развитии патологий, связанных с интенсификацией процессов свободно радикально го окисления (СРО), весьма противоречивы (Hiño Y., 1987, Gordillo Е., 1991). К настоящему времени исследованы физико-химические свойства 6ФГДГ, выделенной из ряда организмов (Moritz В., 2000, Uyama Т., 1998). Однако, такой аспект, как регуляция активности фермента при реорганизации метаболизма при о кем дативном стрессе остается не изученным. Исследования в этом плане могли бы способствовать выяснению роли 6ФГДГ в лимитировании процессов СРО, значительно усиливающихся при патологии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности 6ФГДГ из печени крысы при оксидативном стрессе, вызванном различными гепатотоксинами. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1) сравнительная оценка интенсивности протекания свободнорадикальных (CP) процессов в печени крыс в норме, при интоксикации крыс CClj и сульфатом гидразина; 2) получение высокоочищенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных; 3) исследование кинетических параметров каталитического действия 6ФГДГ в норме и в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением СС14 и сульфата гидразина; 4) изучение регуляции активности фермента в норме и при

введении гепатотоксинов; 5) создание гипотетической модели участия 6ФГДГ в регуляции протекания процессов СРО в пораженной гепатотоксинами печени Крыс.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование особенностей регуляции 6ФГДГ в условиях интенсификации CP процессов, инициированных введением гепатотропных веществ (СС14, сульфат гидразина). Разработаны способы выделения и получены гомогенные препараты 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гештотокоинами животных. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств 6ФГДГ в норме и при токсическом поражении печени. Выявлено, что в условиях охсидативного стресса происходит снижение удельной активности 6ФГДГ, что может быть связано с модификациями механизмов метаболитной регуляции функционирования фермента. На основе полученных результатов сделано заключение, что в условиях интоксикации гепатотоксинами 6ФГДГ, по-видимому, не играет существенной роли в поставке NADPH для ГТ/ПТ-системы, которая может обеспечиваться другими NADPH-генерирующими ферментами - в частности, Г6ФДГ и NADP-изощпратдегидрогеназой. Предложена гипотетическая схема возможного участия 6ФГДГ в лимитировании CP процессов, путем снижения скорости образования короткоцепочечных Сахаров,

Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании 6ФГДГ в условиях нормы и при патологии. Исследование особенностей метаболитной регулящщ 6ФГДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом поражении печени, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научно-исследовательской практике при выделении .других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов ш vivo для изучения кинетики сопряженных реакций в по-лифермептных системах. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете ВГУ университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», а также спецкурсов по аналитической и клинической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Результаты работы использованы при выполнении гранта по научной программе «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук «Университеты России» УР.07,01.004», а также проекта по ведомственной целевой программе Министерства образования и науки РФ - «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП. 2.1.1.4429.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 9-ой и 10-ой Путинской школе-

конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2005, 2006), Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), VIII Международной научной экологической конференция «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005,2006).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

В динамике развития токсического поражения печени крыс гепатотокси-нами (ССЦ, сульфат гидразина), сопровождающегося интенсификацией процессов СРО и увеличением активности Г6ФДГ, наблюдается снижение удельной бФГДГ-активности, указывающее на то, что, по-видимому, данный фермент не играет существенной роли в генерировании NADFH для ГР/ГП АОС.

С использованием гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ показано, что при поражении печени гепатотоксинами происходят изменения кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности фермента под действием ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, метаболитов углеводного обмена и нукпеотидфосфатов. При интоксикации ге-патотоксинами имеет место ряд особенностей регуляции активности 6ФГДГ, которые могут способствовать торможению функционирования фермента: возникновение ингибирующего действия окисленного глутатиона, снятие активирующего эффекта иэоцитрата и NAD.

Предложена гипотетическая схема, отражающая возможное участие 6ФГДГ в регуляции интенсивности протекания свободнорадикальных процессов в клетке, путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроке иацетон, эригроза, рибоза-5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс (Benov L., 1998) и вызывать а по птоз клеток (BarbieriD., 1994).

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 150 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 22 рисунка и 8 таблиц. В приложении содержатся 16 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (Rattus rattus L.), самцов, массой 200 -250 г. Животные содержались на стандартном рационе питания в виварии.

Создание моделей интоксикации крыс. Токсическое повреждение печени моделировали пероральным введением 33% раствора CCL, в вазелиновом масле из расчета 64 мкл CClj на 100 г веса животного (Федорова Н.Ю. 1999). Забой животных производили на 1, 2, 3 и 4 сутки после введения токсического агента. Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту вазелинового масла.

Токсическое повреждение печени сульфатом гидразина моделировали внутрибрюшинном введением вещества в расчете 26 мг на 100 г веса тела (Ray P.D., 1970). Забой животных производили после 3, 6, 12 и 24 часов от момента введения токсического агента. Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту физиологического раствора с Na^SO*. Забор крови осуществляли из сердца. В дальнейших исследованиях использовали печень и сыворотку крови крыс.

Получение субклеточных фракций гепатоцитов. Для разделения цито-плазматической и митохондриальной фракций клеток печени использовали метод дифференциального центрифугирования. Митохондрии разрушали с помощью детергента тритона Х-100. Маркерным ферментом митохондрий служила су кцинат деги дроге наза (СДГ). В качестве маркерного фермента цитоплазмы использовали лактатдегидрогеназу (ЛДГ)- Окраску электрофоре-грамм на специфическую активность 6ФГДГ проводили в присутствии тетра-золиевого нигросинего (Маглыш С.С., 1982).

Оценка оксидативного статуса. Для определения интенсивности сво-боднорадикальных процессов в гомогенате печени и сыворотки крови крыс в норме и при развитии патологии применяли метод индуцированной перокси-дом водорода с сульфатом железа биохемилюминесценции (БХЛ) на биохе-милюминометре БХЛ-006. Протекающий процесс регистрировали в течение 30 с, показателями которого являются значения максимальной интенсивности сигнала От«), светосуммы БХЛ (S) и тангенса угла наклона касательной к нисходящей ветви кривой (tg а2) (Любицкий О.Б., 1996),

Степень спонтанной окислительной модификации белков сыворотки крови и гомогената печени определяли по методу Reznick et al, (Reznick A.Z., 1994) с модификациями (Дубинина Е., 1995), основанному на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динятрофенил-гидразином с образованием 2,4-дннитрофенилгидразонов. Оптическую плотность опытной пробы измеряли при 370 нм на спектрофотометре СФ-56.

Используемый метод определения содержания восстановленного глута-тиона основан на реакции сульфгидрильной группы GSH с 5,5-дитио-бис-(2-тггробензойной) кислотой в результате чего в эквимолярных количествах образуется окрашенный в желтый цвет тионитрофенилькыЙ анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм (Бузлама B.C., 1997).

Определение активности «рерментое. Активность NADP-зависимых ферментов (ГбФДГ, 6ФГДГ) определяли на спекгрофотометре СФ-56 при длине волны 340 нм. О скорости реакций судили по увеличению оптической плотности в результате восстановления NADP, За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25*С. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы материала. О скорости ГР-реакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления NADPH, протекающего за счет осуществления реакции восстановления глутатиона под действием ГР. Об активности ГП судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления NADPH, протекающего за счет осуществления сопряженных ферментативных реакций: образования

GSSG под действием 1II и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением NADPH под действием ГР (1 ед/мл ГР). Активность СДГ определяли при 600 нм (Cooper T.G., 1969); активность ЛДГ — при 340 нм (Кочетов Г.А., 1980), Активность аконитатгидратазы (АО определяли спек-трофотометрнчески при длине волны 233 нм. Определение содержания белка проводили по методу Лоури при длине волны 750 нм (Lovvry О.Н., 1951),

Выделение и очистка 6ФГДГ из печени крыс. В ходе выделения 6ФГДГ после гомогенизации материала проводили фракционирование белков с помощью сульфата аммония. От низкомолекулярных соединений фермент отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для концентрирования фракций фермента использовали ультрафильтрацию на ячейке Amicon, Применяли мембраны, пропускающие буферный раствор с низкомолекулярными белками (до 50 кДа). Завершающий этап очистки представлял собой гель-хроматографию на Toyopearl HW-65. Контроль гомогенности фермента осуществляли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Дэвису (Дэвис Г., 1970). Все операции проводились в холодной камере при0...4'С.

Определение молекулярной массы фермента. Молекулярную массу 6ФГДГ определяли методом гель-фильтрации. Определение субъединичной молекулярной массы проводили с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli U.K., 1970), Белки проявляли путем окрашивания с использованием нитрата серебра (Shevchenko А., 1996).

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства 6ФГДГ в норме и при развитии патологии изучали на высокоочищениых препаратах. Определение Км и К, осуществляли по Диксону и Уэббу (Диксон М, 1982).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-4-х кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повгорностях. Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблицах и рисунках приводятся средние арифметические значения к их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев (р < 0,05).

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНТЕНСИВНОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И АКТИВНОСТИ 6-ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ КРЫС

С целью исследования уровня протекания CP процессов в печени, пораженной ССЦ, в динамике развития патологии нами был использован биохеми-люминесцентный метод. Зарегистрированы параметры интенсивности хемн-люминесцентного сигнала — светосумма вспышки (S) и интенсивность вспышки (I™«), отражающие степень протекания СРО, на 1,2, 3 и 4 сутки развития интоксикации СС14. Соответствующие параметры БХЛ регистрировали через 3, 6, 12, 24 часа после введения сульфата гидразина, метаболизм которого происходит быстрее (Ray P.D., 1970). Полученные нами данные по измене-

нию параметров БХЛ при поражении крыс СС14 согласуются с ранее установленными значениями (Левенкова, 2004). Наибольший рост значений параметров БХЛ наблюдался на четвертые сутки развития токсического гепатита. При этом показатели Б и Тщах гомогената печени и сыворотки крови увеличивались в 2,2 и 2,1 раза, и в 2,1 и 2,3 раза соответственно. Данные изменения позволяют говорить о значительной интенсификации процессов СРО в СС14-пораженном организме.

Метаболизм гидразина клетками печени крыс может проходить или посредством образования конъюгатов с вЗН, или окисления микросомальной оксидазой Р450 до азота (ТгоЬа1а1а Э., 2002; К1епо Т.О., 2004). Оба процесса начинаются с формирования свободного радикала гидразина. Окисление гидразина до азота сопровождается образованием супероксидного анион-радикала и, как следствие активацией процессов ПОЛ. Нами было показано, что достоверные изменения параметров БХЛ при интоксикации крыс сульфатом гидразина происходят в сыворотке крови (табл.1), а в гомогенате печени крыс они меняются незначительно. После б часов воздействия сульфата гидразина происходит увеличение параметров 8 и ¡„и* в 2,1 и 5,6 раза в сыворотке крови, в гомогенате печени возрастает значение 1та!( в 1,3 раза, а 5 только на 10%. К 12 часу развития патологии наблюдается снижение параметров БХЛ до значений в контрольной группе в гомогенате печени крыс, а к 24 часу нормализуются показатели в сыворотке крови.

Поскольку по современным представлешюм АГ является маркером развивающегося оксидативного стресса в клетке, то нами были проведены исследования динамики изменения активности данного фермента при интоксикации крыс в гомогенате печени и сыворотке крови животных. Снижение активности АГ после введения ССЬ наблюдается уже на первые сутки развития СРО. Удельная активность фермента уменьшается в гомогенате печени крыс в 2,5 раза, а в сыворотке крови - в 1,3 раза. Максимальное ингибирование ферментативной активности происходит на 3 сутки после введения токсического агента (13% и 4% от исходного уровня в гомогенате печени и сыворотке крови соответственно). На 4 день интоксикации крыс активность АГ остается значительно ниже величин для контрольных животных (в 2,6 и 2,9 раза по сравнению с нормой), что согласуется с ранее полученными данными (Андреещева Е.М., 2004), Динамика изменений АГ-активности наряду с показателями БХЛ подтверждает интенсификацию СР процессов при интоксикации животных СС14, Выявлено снижение удельной активности АГ к 3 часу развития шпоксикации сульфатом гидразина в 13 раз в гомогенате печени крыс и в 4,6 раза в сыворотке крови. Минимальное значение удельной ферментативной активности в сыворотке крови крыс соответствовало б часу развития патологии и составляло 8,7% от контрольного уровня. В дальнейшем происходило восстановление активности АГ, и к 24 часу развития патологии значения удельной активности в сыворотке крови крыс достоверно не отличались от контрольных величин. В гомогенате печени крыс также наблюдалось увеличение ферментативной активности после 3 часа интоксикации, но она оставалась ниже контрольной на 63%,

Таблица 1

Показатели биохемилюминисценции сыворотки крови и гомогената печени крыс в норме и при интоксикации сульфатом гидразина

Сыворотка крови

час 8, мВс 1, мВ

контроль 31,66*1,62 5,99*0,06 0,99±0,09

3 34,78*3,44 7,41 ±0,61 1,26*0,13

б 67,70*9,3 9* 33,79*2,09* 7,78*1,04*

12 38,47±4,31* 7,49*0,22* 1,33*0,05*

24 33,33*0,95 б,82±0Д7* 1,17*0,04

Гомогенат печени

час Б, мВс I, мВ •раз

контроль 23,54*1,16 4,28*0,06 1,50*0,03

3 24,1б±1,98 4,77*0,21 1,59*0,08

б 25,78*1,19 5,54*0,38* 1,98*0,15*

12 21,70*0,59 4,28*0,08 1,47*0,05

24 25,41*1,12 4,99*0,27 1,61*0,09

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (0,005<р<0,05)

Как известно, новообразованные карбонильные группы в молекулах белков могут быть продуктами окисления некоторых аминокислотных остатков и реакций с альдегидами, возникающими в процессах ПОЛ, или о активными карбонильными производными (51асИпш1 Е.И., 1991; Б^иепа Л.К., 2000). В результате проведенных экспериментов было показано, что при интоксикации крыс СС14 происходит накопление модифицированных белков, как в клетках печени, так и в сыворотке крови животных. Через сутки после введения гепа-тотоксина происходит увеличение содержания карбонильных групп в белках печени в 3,7 раза (рис. 1). Наибольшее увеличение данного параметра отмечалось на 3 сутки развития патологии (в 5 и 6,4 раза соответственно для печени и сыворотки крови крыс) и сохранялось на протяжении 4х суток.

Было показано, что при интоксикации крыс путем введения сульфата гидразина через 3 часа происходит снижение удельного содержания карбонильных групп как в белках сыворотхи крови, так и в белках гомогената печени (в 1,6 и 1,4 раза соответственно), К 6 часу значения исследуемого параметра в гомогенате печени не отличаются от величин в контрольной группе животных (рис. 2), а в сыворотке крови остаются ниже на 20%. На 12 час развития токсического поражения происходит увеличение содержания карбонильных групп в белках сыворотки крови в 1,6 раза, а в гомогенате печени крыс - в 2,9 раза по сравнению со значениями в контрольной группе животных. Максимальное увеличение данного показателя в сыворотке крови (2,2 раза) происходит к 24 часу развития патологии.

В литературе существуют противоречивые сведения о функционировании 6ФГДГ в условиях интенсификации процессов СРО. Следует отметить, что исследования, касающиеся изменения активности 6ФГДГ в динамике инток-

6 12 18 24 время после интоксикации, час

Рис.2. Содержание карбонильных групп в белках (1) и активность де-гидрогеназ пенгозо фосфатного пути (ГбФДГ - 2, 6ФГДГ - 3) в печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина.

12 3 4 время после ннтоксикаиин, сутки

Рис. 1. Содержание карбонильных групп в белках и активность дегид-рогеназ пентозофосфатдаго пути в гепатоцитах крысы при интоксикации СС14: 1 — содержание карбонильных трупп, 2 - активность ГбФДГ, 3 - активность 6ФГДГ.

сикации крыс ССЦ и сульфатом гидразина ранее не проводились. Установлено, что возрастание интенсивности процессов СРО и изменение антиокси-дантного статуса при развитии токсического гепатита были сопряжены с увеличением ферментативной активности ГбФДГ в печени крыс (Левенкова М.В., 2004). Максимальное возрастание активности фермента наблюдалось на четвертые сутки после введения СС14 (в 1,7 раза). Нами проводился контроль изменения ГбФДГ-активности при поражении крыс СС14. Одновременно с этим нами отмечено снижение активности 6ФГДГ в ходе развития интоксикации ССЦ (рис. 1). На первые сутки происходит уменьшение удельной активности фермента на 11%, на вторые - на 28% и на третьи - на 30%. На четвертые сутки она остается ниже исходной на 26%. Возможно, снижение активности 6ФГДГ связано с окислением аминокислотных остатков в молекуле белка.

Динамика активности 6ФГДГ была изучена нами и на модельной системе повреждения печени крыс с помощью сульфата гидразина. Полученные данные о развитии СРО (значения БХЛ, окислительной модификации белков) позволяют сделать вывод о том, что интенсивность СР процессов при интоксикации крыс сульфатом гидразина ниже, чем при введении СС14. Это предположение согласуется с литературными данными, в которых показана преобладающая роль процессов конъюгации при метаболизме производных гидразина в организме (ТгоЬаккл в., 2002). Развитие оксидативного стресса в клетке может происходить из-за уменьшения количества ЭН-со держащих соединений в результате образования конъюгированных продуктов, с одновременной интенсификацией СРО при окислении гидразина до азота. При развитии

данных процессов можно ожидать как увеличение синтеза молекул GSH de novo, так и активацию восстановления глутатиона в ходе ГР-реакции. Действительно, при развитии интоксикации крыс сульфатом гидразина происходит увеличение содержания GSH в печени и сыворотке крови на б час в 1,9 и 2 раза соответственно. Одновременно наблюдалось возрастание активностей ферментов глутатион-зависимой системы. Удельная активность ГП увеличивалась на 47% в сыворотке крови к б часу, а в печени - на 44% через 12 часов развития патологии. Удельная активность TP в печени крыс увеличивалась в 3,1 раза в сыворотке крови к 12 часу после введения сульфата гидразина.

Исследования изменений активностей дегидрогеназ ПФП, поставляющих NADPH для ГР/ГП АОС, показали, что удельные активности Г6ФДГ и 6ФГДГ снижаются через 3 часа после введения токсического агента в 2,1 и 2,3 раза соответственно (рис. 2). К 6 часу развития патологии удельная активность Г6ФДГ остается ниже нормы на 37%, к 12 часу - повышается до контрольных значений, а к 24 часу - снова падает в 2 раза. Удельная активность 6ФГДГ через б, 12, 24 часа сохраняется на сниженном уровне (меньше значений в норме примерно на 32%).

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА 6-ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ CCL, И СУЛЬФАТОМ ГИДРАЗИНА

Изучение субклеточной локализации 6ФГДГ из печени животных проводили методами дифференциального центрифугирования и аналитического гель-электрофореза. Было показано, что 94% от общей активности 6ФГДГ приходится на цигоплазматическую фракцию гепатоцитов. Данные по распределению активности 6ФГДГ между субклеточными фракциями в условиях нормы и патологии представлены в табл.2. Полученные результаты о локализации 6ФГДГ в печени крыс были подтверждены методом электрофореза в ПААГ с последующим проявлением на специфическую активность. Фермент проявляется только в цитозольной фракции в виде одной полосы со значением Rf = 0,35. Полученные результаты согласуются с литературными данными.

Результаты очистки 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс представлены в табл. 3. Очистку фермента проводили по схеме, включающей несколько стадий. На этапе высаливания происходило снижение удельной активности фермеига из печени контрольных животных и крыс, подвергнутых интоксикации сульфатом гидразина (в 1,9 и 2,4 раза) по сравнению со значениями в гомогенате. Однако сульфат аммония не ингиби-рует фермент при фракционировании белков из гомогената печени крыс с токсическим повреждением печени, вызванным СС1Л (табл. 3). Активность 6ФГДГ восстанавливалась после отделения низкомолекулярных примесей с помощью сефадекса G-25. Элюцию фермента с ДЭАЭ-целлюлозы проводили с помощью линейного градиента КС1 0-200 мМ (общий объем 100 мл). Для уменьшения объема полученной фракции использовали метод ультрафильтрации с помощью концентрирующей ячейки Amicon. Полученный ферментный препарат использовали для дальнейшей очистки и определения молекулярной массы с помощью Toyopearl HW-65.

Таблица 2

Субклеточная локализация 6ФГДГ и маркерных ферментов из печени крыс

Опыт Субклеточная фракция Удельная активность 6ФГДГ Е/мг белка % от общей активности 6ФГДГ %отоб-"щей активности сдг % от общей активности дцг

Норма Цитоплазма 0,037±0,002 94±5 6±2 9б±2

Митохондрии 0,002±0,0005* 5±2* 94±2* 4±2*

ссь Цитоплазма 0,025*0,002 95±3 5±2 95±2

Митохондрии 0,001 ±0,0003+ 5±1* 95±2* 5±2*

Сульфат гидразина Цитоплазма 0,027*0,001* 95±3 б±2 96±2

Митохондрии 0,001 ±0,004* 4±2 94±2* 4±2*

Примечание: * - отличия достоверны (0,005<р<0,05)

В результате проведенной очистки были получены препараты 6ФГДГ с 108-, 133- и 81-кратными степенями очистки и удельными активностями 4,0, 3,3 и 2,2 Е/мг белка из печени контрольных животных и подвергнутых интоксикации СС14 и сульфатом гидразина соответственно. Гомогенность ферментных препаратов 6ФГДГ была подтверждена электрофорезом в ПААГ с последующим проявлением на белок. Белок проявлялся в виде одной полосы с одинаковыми значениями Яг (0,35) как в условиях нормы, так и при интоксикации крыс (рис. 3). Значения Иг совпадали при окрашивании гелей на белок и при специфическом проявлении на активность. Было установлено, что фермент из печени контрольных и пораженных гепатотоксинами крыс представлен одной изоформой. Таким образом, при токсическом поражении печени не происходит образование новых изоформ фермента.

Исходя из полученных нами экспериментальных данных молекулярная масса 6ФГДГ, определенная методом гель-фильтрации через Тоуореаг! 65, равна 114,2 ¿5,8 кДа. При развитии токсического гепатита в печени крыс не происходит изменения молекулярной массы фермента.

Методом электрофореза в присутствии ДДС-Иа было получено значение 44±5 кДа, что позволяет сделать заключение о димерной четвертичной структуре 6ФГДГ. Сходные значения величин Кг наблюдались при электрофорезе ферментных препаратов, полученных из печени крыс при развитии токсического повреждения как СО\А, так и сульфатом гидразина (рис. 4), Вероятно, изменения активности фермента, наблюдаемые при интоксикации крыс гепа-тотропными агентами, не сопряжены с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного о изменением субьеди-ничного состава.

Полученные высокоочищенные ферментные препараты были использованы для исследования кинетических параметров каталитического действия и регуляторных свойств 6ФГДГ.

Таблица 3.

Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крые в норме и при интоксикации СС1« и сульфатом гидразина

Стадия очистки Опыт Общая активность Количество белка, мг Удельная активность, Е/мг белка 5ыход, % Степень очистки

норма 7Г2*0,4 195*10 0,037±0,002 100 —

гомогенат ССЦ 5,1*0,3* 205*10 0,025±0,002* 100 —

гидр. 7,33*0,37 267±13,35* 0,027*0,001* 100 —

высаливание (ЫН4)250< норма 1,2*0,1 62,9*3,2 0,019±0,001 — —

CCI, 3,1*0,2* 97,8*4,9* 0,032*0,002* 61,1 1,3

гидр. 1,11*0,06 100,95*5,05* 0,011 ±0,001* — —

хроматография на сефа-дексе й-25 норма 5,8*0,3 40,8*2,1 0,14*0,01 S0,2 3,8

ССЬ 4,4*0,2* 39,5*2,0 0,11*0,01* 85,7 4,4

гидр. 4,51*0,23* 53,72*2,69* 0,084*0,004* 61,5 3,1

хроматография на ДЭ- АЭ-целлюлозе норма 1,9*0,1 1,5±0,1 1,36*0,06 26,0 34,1

СС1„ 2,0*0,1 3,5*0,2* 0,56*0,03* 38,7 22,4

гидр. 2,42*0,12* 3,15*0,16* 0,768*0,038* 33,0 28,4

ультрафильтрация (МПНроге 50 кДа) норма 1,7*0,1 1,0*0,1 1,80*0,09 23,9 48,7

СС14 1,9*0,1 2,5*0,1* 0,77*0,04* 37,7 30,8

ГИДр. 1,58*0,08 0,91 ±0,05 1,736*0,087 21,6 64,30

хроматография на Тоуореаг1 HW-б5 норма 0,16*0,01 0,041 ±0,002 4,00*0,22 2,2 108,1

ССЦ 0,20*0,01* 0,062±0,003* 3,33*0,17* 3,9 133,3

гидр. 0,33 ±0,02* 0,15±0,01* 2,200*0,11* 4,5 81,5

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (0,005<р<0,05)

Проведено исследование зависимости скорости реакции от концентраций субстрата (6-фосфоглюконат) и кофермеига (ЫАОР) в норме и при введении гепатотропных агентов. Установлено, что кинетика ферментативной реакции, катализируемой 6ФГДГ, подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментеи. Определены значения Кт для субстрата и кофермента (табл.4). Выявлено, что при интоксикации ССЦ происходит снижение Кт фермента к субстрату в 1,9 раз и коферменту — в 2,7 раза по сравнению с данными контрольной группы. При интоксикации крыс сульфатом гидразина происходит снижение Кт фермента к субстрату в 2,6 раз по сравнению с данными контрольной группы (0,060 мМ). В отличие от экспериментальной модели с ССЪ при применении сульфата гидразина не происходит достоверного изменения Кт фермента к ЫАОР. Однако, при развитии данной патологии наблюдается ингибирование актив-

ности фермента NADP в концентрациях выше 0,080 мМ. Константа ингиби-рования Кя для ко фермента равна 0,380 мМ.

Рис.3. Электрофореграмма 6ФГДГ в норме (а) и при интоксикации крыс ССЦ (б) сульфатом гидразина (в): 1 - фронт маркера (бромфеноловый синий), 2 - зона локализации 6ФГДГ, стрелкой показано направление движения белка при электрофорезе.

• *■ Î

А Б В Г

- "И

■■-'",■" i

Рис,4. Электрофореграмма 6ФГДГ в присутствии ДДС-Na в норме (А) и при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом (Б) и ï .' J.'ÎHjvÎ сульфатом гидразина (В): б — фронт маркера

¡. .¿¿..«-J—— 1 (бромфеноловый синий), 7 - зона локализа-

г' '!V.f'| ции 6ФГДГ, стрелкой показано направление

движения белка при электрофорезе.

7-j*"-"-1' -ч ,1.. "Т| Маркерные белки (Г): 1 — фосфорилаза b (97

кДа), 2 ~ яичный альбумин (45 кДа), 3 - хар-боангидраза (30 кДа), 4 — ингибитор трипсина (20,1 кДа), 5 - а-лактоальбумин (14,4 кДа).

s. V.

Исследование зависимости активности 6ФГДГ от концентрации ионов водорода показало, что при токсическом гепатите, вызванном введением СС14, наблюдается смещение рН-оптимума в кислую сторону, что, вероятно, связано с развивающимся ацидозом (табл.4), Значения рК функциональных групп фермента из печени крыс контрольной группы, определенных по методу Курганова Б.И, и сотр. (Курганов Б.И., 1992), составили 7,3 и 8,5, что близ-

ко к рК имидазольной группы гистидина и сульфгидрильной группы цистеи-на. Величины рК для фермента из печени крыс с интоксикацией ССЦ были равны 7,2 и 8,4. При интоксикации крыс сульфатом гидразина не наблюдается смещение рН-оптицума (табл.4). Значения рК функциональных групп фермента не отличаются от значений в контрольной группе животных.

Таблица 4

Физико-химические параметры 6ФГДГ в норме и при интоксикации

Опыт Значения Кт мМ Кщ по ИАОР, мМ рНопт

6-фосфо глюконат ЫАОР

Норма 0,155±0,008 0,102*0,005 — 7,9

ССЦ 0,083*0,004* 0,037*0,002* — 7,8

гидразин 0,060±0,004* 0,107*0,060 0,380 7,9

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (0,005<р<0,05) В ходе экспериментальной работы были исследованы зависимости активности 6ФГДГ от концентрации ионов Саг+, Мпг+, Ре.2*, Ре3* и Сиг* в среде. При интоксикации животных сульфатом гидразина ионы активируют 6ФГДГ, тогда как на фермент, выделенный из печени контрольных животных и крыс подвергнутых интоксикации ССЦ, не оказывают влияния. Ингибирую-щий эффект ионов Си1* на активность фермента выражен сильнее при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом, чем в группе контрольных животных и после интоксикации сульфатом гидразина. Ионы Са2+, Мп2+, Ре3*, Ре3+ ингибируют 6ФГДГ в норме и при развитии патологии. Значения констант ингибирования и типы ингибирования приведены в табл.5.

При развитии патологии, вызванной введением ССЦ, наблюдается увеличение значений констант ингибирования для ионов Мп1+ и Ре2+ в 1,1 и 2,7 раз соответственно. Значение константы ингибирования для ионов Ре3* уменьшается в 8,6 раз по сравнению со значениями в контрольной группе. При интоксикации сульфатом гидразина наблюдается увеличение значения константы ингибирования для ионов Те2* в 1,2 раза и уменьшение значений констант ингибирования для ионов Мп2+ и Бе3* в 1,3 и 11,6 раз соответственно.

Характер влияния пероксида водорода на активность 6ФГДГ значительно не изменялся в зависимости от группы животных (рис.5). При 0,02 кМ концентрации Н2С>2 не наблюдалось достоверных отличий значений активности фермента от значений контрольного уровня. Но при увеличении концентрации Н^Оа в два раза происходило резкое падение активности (в 1,7 раза). При воздействии Н2О2 в концентрациях 0,06-0,12 мМ наблюдалось ингибирование действия 6ФГДГ на 45-50% от первоначального уровня. Уменьшение активности ферментативного препарата 6ФГДГ может быть связано с окислением лизиновых и тетидиновых аминокислотных остатков в белке.

Изучение влияния восстановленного глутатиона на активность 6ФГДГ показало, что данный метаболит в концентрациях до 0,4 мМ практически не оказывает воздействия на протекание ферментативной реакции в условиях

Таблица 5

Значения К; 6ФГДГ ионами металлов

Ионы Условия опыта К,, мМ Тип ингибирования

Саг* норма 6,870 смешанное

ссц 6,883 смешанное

гидразин 7,137 смешанное

норма 8,769 смешанное

СС14 9,719* смешанное

гидразин 6,583* смешанное

норма 0,259 неконкурентное

ССЦ 0,706* смешанное

гидразин 0,315* неконкурентное

норма 0,628 смешанное

ссь 0,073* смешанное

гидразин 0,054* смешанное

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (0,005<р<0,05)

нормы (рис.6). При дальнейшем повышении концентрации наблюдается инги-бирование фермента. Так, при концентрации С5Н от 0,6 до 1,0 мМ активность фермента составляет 76% от первоначального уровня. При интоксикациях крыс СС1л и сульфатом гидразина данный метаболит не оказывает существенного влияния на протекание бФГДГ-реакции.

Рис.5. Зависимость скорости реакции, катализируемой 6-фосфоглюконат-дегядрогеназой, выделенной из печени разных групп животных (1 - контрольная, 2 - интоксикация ССЦ, 3 — интоксикация сульфатом гидразина), от концентрации пероксида водорода

0,03

0,06

0,09 0Д2 [Н,су,мМ

Исследование влияния ОББО на активность фермента показало, что данный метаболит может оказывать ингибирующге действие, как в условиях нормы, так и при патологии (рис.7). Что касается воздействия ОЗвй на протекание бФГДГ-реакции в условиях нормы, то показано, что наибольший подавляющий эффект проявляется при концентрации метаболита 0,2 мМ - активность фермента составляет 85% от первоначального уровня. При дальнейшем повышении концентрации ОЭКО ингибирующее воздействие уменьшается. Необходимо отметить, что при экспериментальном токсическом гепатите, вызванном введением ССЦ и сульфата гидразина, максимальный эффект

О 0,2 0,4 0,6 0,8 I LGSHJ, нМ

0 0.2 0.4 0.« 0,8 I [GSSOJ. мМ

Рис.б. Влияние GSH на активность Рис.7. Влияние GSSG на активность

фермента, выделенного из печени фермента, выделенного из печени

различных групп животных: 1 - кон- различных групп животиых: 1 - контрольная, 2 - интоксикация СС14,3 - трольная, 2 - интоксикация CClj, 3 -

интоксикация сульфатом гидразина, интоксикация сульфатом гидразина.

GSSG наблюдается уже при концентрации 0,1 мМ. При этом активность 6ФГДГ составляет 55% от первоначального уровня. При дальнейшем повышении концентрации метаболита ингибирующее влияние сохраняется.

Установлено, что в регуляции активности фермента из печени крысы могут принимать участие некоторые нуклеотиды, Исследование влияния NAD на активность фермента показало, что данный метаболит при определенных концентрациях может оказывать разнонаправленное действие на активность фермента в условиях нормы и при патологии (рис. 8). Так, при концентрации до 0,2 мМ NAD практически не оказывает влияния на функционирование 6ФГДГ, но при более высоких концентрациях наблюдается активация фермента в условиях нормы, которая достигает максимума при 0,8 мМ концентрациях NAD и составляет 145% от первоначального уровня. Данный метаболит в концентрациях, более 0,2 мМ оказывает подавляющее действие на функционирование фермента, выделенного из печени крыс, подвергнутых интоксикации СС14. Так, при 0,6 - 1,0 мМ концентрациях NAD активность 6ФГДГ составляет 66% от первоначального уровня. Показано, что NAD в концентрациях, более 0,4 мМ оказывает тормозящее действие на функционирование фермента, выделенного из печени крыс, подвергнутых интоксикации сульфатом гидразина. Так, при концентрации NAD равной 1,0 мМ активность 6ФГДГ составляет 35% от первоначального уровня.

Поскольку относительные концентрации аденозинфосфатов являются важными факторами, контролирующими метаболические процессы в клетке, то нами было изучено их воздействие на реакцию, катализируемую 6ФГДГ. Исследование показало, что АТР практически не влияет на активность фермента, как в условиях нормы, так и при введении ССЦ. При интоксикации крыс сульфатом гидразина происходит увеличение ферментативной активности в 1,6 раза (0,6 мМ ATP). ADP оказывает стимулирующее действие па активность фермента в большей степени в условиях нормы, в меньшей степени при патологии. Прячем максимальный эффект наблюдается при концентрации

0,8 1 [AMPJ, иМ

Рис.9. Влияние AMP на скорость ферментной реакции в норме (1), при интоксикации ССЦ (2) и сульфатом гидразина (3).

0.8 I [NAD], мМ

Рис.8. Зависимость скорости реакции, катализируемой 6ФГДГ, выделенной из печени контрольных (1) и опытных (2-CClj, 3-сульфат гидразина) животных от концентрации NAD.

ADP 0,4 мМ: активность 6ФГДГ в первом случае возрастает в 1,7 раз, во втором - в 1,2 раза по сравнению с контрольным уровнем. Исследование влияния AMP показало, что данный метаболит приводит к увеличению ферментативной активности в условиях нормы на 37% при концентрации 0,4 мМ (рис.9). При более высоких концентрациях активирующий эффект уменьшается. Необходимо отметить, что при интоксикациях крыс СС14 и сульфатом гидразина данный метаболит практически не влияет на скорость протекания 6ФГДГ-реакции.

Рядом исследователей было показано, что при развитии оксидативного стресса происходит активация ферментов аитиоксидантной защиты клетки (Кения MB., 1993; Szymonik-Lesiuk S., 2003) и ферментов, способствующих работе АОС (Гулак П.В.,1985). Так, наряду с ферментами ПФП восстановительные эквиваленты в клетке могут образовывать изоцитратдегидрогеназа и малатдегидрогеназа (Андреещева Е.М, 2004; Сафонова O.A., 2004). Исходя из этого, было проведено исследование влияния маната, цитрата, изо цитрата и 2-оксоглутарата на активность 6ФГДГ в норме и при развитии токсического повреждения печени крыс.

Активность 6ФГДГ, выделенной из печени крыс контрольной группы, при концентрации маната равной 0,2 мМ увеличивается на 13%, Дальнейшее увеличение концентрации малага в среде приводит к плавному снижению активности фермента до исходного уровня. Подобный характер изменений активности 6ФГДГ наблюдали при оценке влияния изоцитрата и 2-оксоглутарата. Максимальное увеличение ферментативной активности (на 60%) происходило при концентрации изоцитрата 0,6 мМ (рис.10). 2-оксоглутарат при концентрации 0,2 мМ активирует фермент на 14%, при увеличении концентрации метаболита происходит снижение ферментативной активности до исходного уровня. Цитрат не оказывал статистически достоверного влияния на активность 6ФГДГ из печени контрольных животных во

■ к

Рис. 10. Влияние изо цитрата на активность 6ФГДГ в норме (I) и при патологии (СС14 - 2, сульфат гидра-

0 0.2 0,4

0,6 0,8 1 зина-3). [иэоцнтрэт], мМ

всем использованном диапазоне концентраций. Характерно, что исследованные метаболиты цикла трикарбоновых кислот не влияли на активность фермента, полученного из печени крыс при интоксикации ССЦ, что может иметь значение для снижения активности фермента в условиях развития оксидативного стресса, Малат активирует фермент, выделенный из печени крыс при введении сульфата гидразина. При 0,2 мМ концентрации метаболита активность 6ФГДГ увеличивается на 39%. Изоцитрат и 2-оксоглутарат пе оказывали статистически достоверного влияния на активность 6ФГДГ. Цитрат активирует фермент из печени животных при их интоксикации сульфатом гидразина на 30% (0,2 мМ).

Известно, что при развитии оксидативного стресса в организме происходит ингибирование реакций гликолиза, что может иметь адаптационный характер (Colussi С., 2000; Morgan P.E., 2002), Изменение концентраций метаболитов обмена углеводов сказывается на регуляции активности внутриклеточных ферментов. Показано, что глюкоза в концентрациях от 0,1 до 0,8 мМ незначительно (на 14%) активирует 6ФГДГ из печени ко1ггрольных животных. При дальнейшем увеличении концентрации глюкозы наблюдается снижение активности фермента. Галактоза не оказывает существенного влияния на активность 6ФГДГ, Фруктозо-1,6-бисфосфат и рибозо-5-фосфат снижают активность фермента, при концентрациях выше 1 мМ и 0,8 мМ соответственно. Все исследованные метаболиты углеводного обмена не влияют на активность фермента из печени крыс, подвергнутых интоксикации.

Исследования динамики развития процессов СРО и активности ключевых ферментов ПФП показали, что наряду с возрастанием параметров БХЛ, мобилизацией глутатионовой АОС, уменьшением аконитазной активности, активацией Г6ФДГ происходит снижение активности 6ФГДГ, Выявлено также, что токсическое поражение печени сопровождается значительным усилением окислительной модификации белков. Очевидно, этот процесс может затрагивать и 6ФГДГ. В настоящее время в литературе имеются сведения, что возможна модификация л шиповых аминокислотных остатков в молекуле 6ФГДГ при старении, что приводит к потере ферментативной активности на 30% (Оогс1Що Е„ 1991). Таким образом, вероятно, в снижении активности 6ФГДГ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

при развитии окислительного стресса определенную роль играет химическая модификация аминокислотных остатков белка, приводящая к нарушению его конформации.

Выявлено, что при патологии ряд физико-химических свойств фермента не изменяется по сравнению с нормой. Так, значения молекулярной массы и элекхрофоретической подвижности для 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс совпадали. Полученные данные позволяют предполагать, что изменение активности фермента, наблюдаемое при развитии патологии, не сопряжено с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава.

В тоже время при интоксикации крыс наблюдаются изменения как кинетических параметров каталитического действия, так и регуляторных свойств, что было показано нами с использованием очищенных ферментных препаратов. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных ССЦ происходят изменения pH-оптимума и сродства фермента к субстрату и коферменту {уменьшение Км в 1,9 раза по отношению к б-фосфоглюконату и в 2,7 раза по отношению к NADP). Однако при интоксикации крыс сульфатом гидразина не наблюдается сдвига pH-оптимума. Значения Кы по отношению к субстрату уменьшаются в 2,6 раза, а по отношению к коферменту не изменяются. При токсическом поражении сульфатом гидразина происходит ингибирование активности фермента NADP в концентрациях выше 0,080 мМ (К; = 0,380 мМ). Изменение регуляции активности 6ФГДГ, наблюдаемое в условиях интенсификации СРО, по отношению к ионам некоторых металлов, нуклеотидам, интермедиатам цикла Кребса, а также к некоторым интермедиатам углеводного обмена, свидетельствуют о модификациях ряда механизмов метаболитной регуляции при патологии печени.

В качестве основных особенностей регуляции активности 6ФГДГ в патологическом состоянии можно выделить следующие.

Показано, что окисленная форма глутатиона значительно снижает активность фермента, выделенного из печени крыс, подверженных интоксикации гепатотропными веществами. В то время как на фермент из печени контрольных животных данный метаболит не оказывает влияния.

Известно, что при развитии оксидативного стресса возможно ингибирование процессов гликолиза и цикла Кребса в клетках, что связано со снижением интенсивности дыхания (Colussi С., 2000; Morgan P.E., 2002). В этом случае происходит изменение концентраций метаболитов цикла трикарбоновых кислот в клетках. Нами была показана возможность активирования 6ФГДГ изо-цитратом в норме. При развитии патологии изоцитрат не оказывает влияния на активность 6ФГДГ.

Особенности регуляции активности фермента при интоксикации крыс могут иметь определенное значение для сопряжения его функционирования с другими метаболическими путями.

Также было показано активирующее влияние AMP в контрольной группе животных и ее отсутствие при развитии интоксикации гепатотоксинами. NAD в концентрации 0,6 мМ увеличивает активность 6ФГДГ, выделенной из печени контрольных животных, и оказывает значительный ингабирующий эффект

Глюкоза О

СС1,

'Н+ 0>

СС1,

Глюком--

ГВФД?)|

МАОРН+Н'-*^-<{юсфо-глюкомо-лактон

6-фОСфО-' глюкснат МАРР*.

Фруктоз»-. а^фосфат

Ксилулозо-&-фосфат

СФГДГ) Рибулозо- > Рибозо- • КАОРН^ ***** 51°СФЭТ#

Фрукгозо-1 .Б-дифосфат

Интенсификация СРО \

О МАО" и*

Изиенение Оксмдагнвная

проницаемости модификация мембраны бблков

Трансдегидрогеназа /

МАОН+Н"

Пируват +

Ацетил СоА

Цитрат

V О X .

Оксало- ИэоцигратО

Наущение метабопичестх процеооов в тетке,ацета1 ^

Ог-оксоглутараг

развитие алоптоза

О ШлатО

Рис, 11. Гипотетическая схеиа участия вФГДГ в регуляции интенсивности СРО в печени крыс при интоксикации гепатсяоксинамн. Условные обозначения: О {•) - активирующий (ннгабнрующий) эффект в норме;

■ Сукцинэт

□{Я)" актиаир)чищни (яигибирующий) эффекг при лкшкелкаайи крыс СС!« О (в) - аксивируюищй {¡штиирумшдй) чффесг при икчикслишин крыс супьфашм гидразина.

на фермент при патологии. На основании проведенных исследований была предложена гипотетическая модель участия 6ФГДГ в процессах регуляции уровня СРО путем снижения концентраций коротко цепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроксиацетон, эригроза, рибоза - 5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс и вызывать апоптоз клеток (Вепоу Ь., 1998, ВагЫепа, 1994).

Согласно данной схеме, представленной на рисунке 11, гепатотропное вещество, поступая в печень, инициирует развитие СР процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Интенсификация СТО приводит к нарушению структурно-фу нкщюнального состояния биомембран, увеличению их проницаемости и конечном итоге к повреждению печеночной паренхимы (Карташова ОЛ., 1975). Процесс СРО индуцируется увеличением содержания АФК, ионов металлов переменной валентности, активацией ЫАОРН-оксидаз в клетке. СР процессы уравновешены различными механизмами АОС организма. Утилизация АФК осуществляется не ферментативной и ферментативной АОС. Полученные нами данные указывают на мобилизацию акгиоксидантиого потенциала и, в частности, ГР/ГП АОС, для функционирования которой требуются восстановительные эквиваленты в форме 1>1А1)РН. Показано, что в условиях оксидативного стресса происходит увеличение активности ряда ИАОРН-генерирующих ферментов, таких как ГбФДГ, ИАОР-ИДГ, ЫАОР-МДГ (Левенкова, 2004; Сафонова, 2005 Андреещева, 2004). Однако как свидетельствуют полученные нами результаты, при этом наблюдается снижение удельной активности 6ФГДГ. Более того, выявлен ряд особенностей механизмов регуляции ферментативной активности, которые могут обеспечивать торможение функционирования 6ФГДГ. Таким образом, очевидно, что 6ФГДГ не может играть существенной роли в лимитировании интенсивности протекания СР процессов путем поставки восстановительных эквивалентов для ГР/ГП АОС. Вместе с тем нельзя исключить, что снижение скорости бФГДГ-реакции может быть взаимосвязано с необходимостью снижения уровня ряда Сахаров, в частности эритрозы, рибозо-5-фосфата и других, которые, согласно литературным данным, могут являться дополнительным фактором усиления окислительного стресса (Вепоу Ь., 1998),

Таким образом, при оксидативном стрессе, сопровождающем интоксикацию, вызванную различными гепатотоксинами, происходит изменение активности, ряда каталитических и регуляторных свойств 6ФГДГ. Это может быть сопряжено с возрастанием уровня АФК и окислительной модификации белков.

ВЫВОДЫ

1. При токсическом поражении печени гепатотоксинами (СС14, сульфат гидразина) происходит интенсификация процессов СРО, сопровождаемых увеличением накопления окисленных белковых молекул, активацией Г6ФДГ, и снижением активности 6ФГДГ. По-видимому, 6ФГДГ не вносит существенного вклада в генерирование восстановленных эквивалентов для ГР/ГП АОС, активирующейся в условиях окислительного стресса.

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов показано, что

6ГФДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс наряду со сходными физико-химическими свойствами (молекулярная масса Мг=114 кДа, гомодимерная субьединичная структура, электрофоретачеекая подвижность), характеризуется различиями ряда кинетических и ретуляторпых свойств.

3. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных ССЦ происходят изменения рН-оптимума и сродства фермента к субстрату и коферменту (уменьшение Ки в 1,9 раза по отношению к 6-фосфоглюконату и в 2,7 раза по отношеншо к NADP), Однако при интоксикации крыс сульфатом гидразина не наблюдается сдвига рН-оптимума. Значения Ки по отношению к субстрату уменьшаются в 2,6 раза, а по отношению к коферменту не изменяются. При токсическом поражении сульфатом гидразина происходит ингибирование активности фермента NADP в концентрациях выше О,OSO мМ (K¡ = 0,380 мМ).

4. Выявлены особенности воздействия ряда ионов металлов на активность 6ФГДГ в патологическом состоянии. Ионы Mg2* актив1груют 6ФГДГ из печени животных, подвергнутых интоксикации сульфатом гидразина, тогда как не оказывают влияния на активность фермента, выделенного из печени контрольной группы крыс и после введения СС14. При развитии патологии, вызванной СС14, наблюдается увеличение K¡ для ионов Fe1* в 2,7 раза. K¡ для ионов Fe1* уменьшается в 8,6 раз по сравнению со значениями в контрольной группе. При интоксикации сульфатом гидразина наблюдается увеличение величин К, для ионов Fe1* в 1,2 раза и уменьшение K¡ для ионов Mní+ и Fe'* в 1,3 и 11,6 раз соответственно.

5. Показано участие окисленного глутатиона в регуляции скорости протекания бФГДГ-реакции. Установлено, что в норме GSSG не оказывает воздействия на активность 6ФГДГ, тогда как при патологии наблюдается значительное снижение активности фермента под действием данного метаболита. GSH в концентрациях выше 0,6 мМ оказывает ингибирующее действие на активность фермента как в норме, так и в патологическом состоянии.

6. Установлено, что в условиях развития патологического состояния, вызванного введением гепатотоксинов, происходит изменение чувствительности фермента к действию NAD, ATP, ADP, AMP.

7. Выявлены различия в регуляции активности фермента некоторыми метаболитами углеводного обмена (глюкоза, галактоза, фруктоэо-1,6-дифосфагг и рибозо-5-фосфат) и ингермедиатами цикла Кребса в норме и при интоксикации гепатотоксинами.

8. Предложена гипотетическая схема участия 6ФГДГ в процессах регуляции СРО в печени животных при интоксикации гепатотоксинами путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидрок-сиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), способных усиливать оксидативный стресс и вызывать а по птоз клеток.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Свиридов М.М. Изменение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности в условиях интенсификации пероксидного окисления липидов при развитии токсического гепатита у крыс / М.М. Свиридов, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина, Е.М. Андреещева, Т.И. Рахманова // Материалы III Съезда биофизиков России, - Воронеж, 24-29 июня, 2004 г. - С.574-575.

2. Свиридов М. М. Регуляция активности 6-фосфоппококатдегидро-геназы из печени крыс с помощью пероксида водорода и ряда ионов двухвалентных металлов / М.М. Свиридов, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина // VIII Международная экологическая конференция «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем». - Белгород, 27-29 сентября 2004 г. - С. 196-198.

3. Свиридов М. М. Влияние пероксида водорода и ряда ионов двухвалентных металлов на активность б-фоефоглюконатдеги дроге назы из печени крыс / ММ. Свиридов, A.B. Семенихина // IV Международная конференция «Медицинская наука XXI века». - Витебск, 27-29 октября 2004 г. - С. 194,

4. Свиридов М. М. Регуляция активности 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы из печенп крысы под действием ингермедиатов углеводного обмена / М.М. Свиридов, A.B. Семенихина, A.B. Шишов // Сборник трудов 9-Й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века».-Пущино, 17-21 мая 2005 г. - С, 97-98.

5. Свиридов М. М. Очистка я некоторые свойства 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы из печени крысы / М.М. Свиридов, Т.Н. Попова, A.B. Семенихина //Вестник ВГУ - №1, 2005 - С, 149-151.

6. Свиридов М. М. Изменение уровня глутатиона и активности ферментов пентоэофосфатного пути в печени и сыворотке крыс при интоксикации сульфатом гидразина / М.М.Свиридов, AB. Семенихина // Сборник трудов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология. - наука XXI века». - Пущино, 17-21 мая 2006 г. - С. 93.

7. Свиридов М. М. Каталитические свойства 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы из печени крысы в норме и при токсическом гепатите / М.М. Свиридов, A.B. Семенихина, Т.Н. Попова // Биомед. химия - вып. 5, т, 52, 2006 - С.479-488.

8. Свиридов М, М. Развитие свободнорадикальных процесов при интоксикации крыс сульфатом гидразина / MLM Свиридов, A.B. Семенихина // Организация п регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. ВГУ-вып. 8, 2006 - С, 178-182.

Статьи Ñ° 5, 7 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК,

Подписано в печать 17,11.2006. Формат 60x84/16. Усл. .п. л. 1,5. Тираж 100. Заказ 919. Издательско-пол и графический центр Воронежского государственного университета. 394000, г, Воронеж, Университетская площадь, 1, ком .43, те л .208-853 Отпечатано в лаборатории оперативной печати ИПЦ ВГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Свиридов, Максим Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Развитие оксидативного стресса в гепатоцитах

1.1.1. Образование активных форм кислорода в клетках печени

1.1.2. Свободнорадикальное окисление биомолекул

1.1.3. Роль свободных радикалов при патологии

1.2. Антиоксидантная защита организма

1.2.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на свободнорадикальное окисление

1.2.2. Глутатион - регулятор ферментативной антиоксидантной системы

1.2.3. Антиоксидантные ферменты клеток и их роль в регенерации гепатоцитов

1.3. Нарушение процессов метаболизма глюкозы в клетке при оксидативном стрессе

1.4. Функционирование пентозофосфатного пути при оксидативном стрессе

1.5. Токсическое повреждение печени как модель активации свободнорадикальных реакций

1.5.1 Механизм действия четыреххлористого углерода

1.5.2. Механизм действия гидразина 1.6. Общая характеристика 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

1.6.1. Катализируемая реакция

1.6.2. Структура и молекулярная масса фермента

1.6.3. Локализация 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

1.6.4. Методы очистки 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

1.6.5. Кинетические свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и регуляция ее активности

1.6.5.1. Влияние концентрации субстрата и кофермента на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

1.6.5.2. Зависимость 6-фосфоглюконатдегидрогеназной реакции от температуры и рН

1.6.5.3. Активаторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

1.6.5.4. Ингибиторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

ГЛАВА 2 Объект и методы исследования

2.1. Объект исследования

2.2. Создание модели интоксикации крыс четыреххлористым углеродом

2.3. Создание модели интоксикации крыс сульфатом гидразина

2.4. Получение субклеточных фракций гепатоцитов

2.5. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления методом биохемилюминесценции

2.6. Оценка степени окислительной модификации белков

2.7. Определение концентрации восстановленного глутатиона

2.8. Определение активности ферментов

2.9. Определение количества белка

2.10. Выделение и очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс

2.10.1. Экстракция

2.10.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

2.10.3. Гель-фильтрация на сефадексе G

2.10.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.10.5. Концентрирование фракций фермента

2.10.6. Гель-хроматография на Toyopearl HW 2.11. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента

2.12. Аналитический электрофорез

2.13. Определение молекулярной массы фермента

2.14. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. Сравнительная оценка интенсивности свободно-радикальных процессов и активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в динамике развития токсического поражения печени крыс

3.1. Параметры биохемилюминесценции в печени и сыворотке крови крыс в динамике развития интоксикации под действием СС14 и сульфата гидразина

3.2. Изменение активности аконитатгидратазы при развитии токсического поражения

3.3. Определение содержания карбонильных групп в белках при интоксикации крыс гепатотропными агентами

3.4. Изменение активности дегидрогеназ пентозофосфатного пути при развитии оксидативного стресса

ГЛАВА 4. Кинетические и регуляторные свойства 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при интоксикации СС

4.1. Исследование субклеточной локализации 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

4.2. Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс

4.3. Молекулярная масса 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

4.4. Исследование кинетических параметров каталитического действия 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации СС

4.5. Влияние концентрации ионов водорода на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при развитии токсического гепатита

4.6. Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при патологии

4.6.1. Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы

4.6.2. Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода

4.6.3. Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфо-глюконатдегидрогеназной реакции в печени контрольной и опытной групп крыс

4.6.4. Влияния нуклеотидов на активность фермента

4.6.5. Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации крыс

4.6.6. Влияние метаболитов углеводного обмена на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс

ГЛАВА 5. Кинетические и регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина

5.1. Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина

5.2. Исследование кинетических параметров каталитического действия 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации сульфатом гидразина

5.3. Влияние концентрации ионов водорода на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом гидразина

5.4. Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации крыс сульфатом гидразина

5.4.1. Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6ФГДГ

5.4.2. Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода

5.4.3. Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфо-глюконатдегидрогеназной реакции при интоксикации крыс сульфатом гидразина

5.4.4. Влияния нуклеотидов на активность фермента

5.4.5. Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы при интоксикации сульфатом гидразина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс"

Актуальность работы. Изучение молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию и координацию обмена веществ в клетке, является фундаментальной проблемой биохимии. Исследование саморегулирования обменных процессов на уровне отдельных ферментных систем позволяет приблизиться к глубокому и детальному анализу организации метаболизма в живой клетке с выходом на более высокий организменный уровень. Однако многие аспекты регуляции клеточного метаболизма на ферментативном уровне, особенно, в условиях развития патологии, требуют дальнейших исследований. Это относится, в частности, к 6-фосфоглюконатдегидрогеназе (КФ 1.1.1.44, 6ФГДГ) -ферменту, катализирующему одну из реакций пентозофосфатного пути (ПФП) - окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата.

Важность изучения 6ФГДГ определяется физиологическим значением данного фермента, участвующего в образовании NADPH, необходимого для протекания многих биосинтетических реакций. Кроме того, по современным представлениям в основе патогенеза ряда заболеваний лежит дисбаланс между чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) и недостаточностью антиоксидантных систем (АОС) организма [36, 183, 184]. Благодаря функционированию глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП) АОС в клетках обеспечивается детоксикация неорганического и органических пероксидов. Уровень NADPH играет наиболее значимую роль в регуляции интенсивности функционирования данной системы. Показано участие глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) в поставке восстановительных эквивалентов в условиях оксидативного стресса [37, 109]. Данные относительно функционирования 6ФГДГ при развитии патологий, связанных с интенсификацией процессов свободнорадикального окисления (СРО), весьма противоречивы [119, 125, 129]. К настоящему времени исследованы физико-химические свойства 6ФГДГ, выделенной из ряда организмов [66, 78, 139]. Однако, такой аспект, как регуляция активности фермента при реорганизации метаболизма при оксидативном стрессе остается не изученным. Исследования в этом плане могли бы способствовать выяснению роли 6ФГДГ в лимитировании процессов СРО, значительно усиливающихся при патологии.

2) получение высокоочищенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных;

3) исследование кинетических параметров каталитического действия 6ФГДГ в норме и в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением CCI4 и сульфата гидразина; 4) изучение регуляции активности фермента в норме и при введении гепатотоксинов; 5) создание гипотетической модели участия 6ФГДГ в регуляции протекания процессов СРО в пораженной гепатотоксинами печени крыс.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование особенностей регуляции 6ФГДГ в условиях интенсификации CP процессов, инициированных введением гепатотропных веществ (CCI4, сульфат гидразина). Разработаны способы выделения и получены гомогенные препараты 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных. Впервые дана сравнительная характеристика каталитических и регуляторных свойств 6ФГДГ в норме и при токсическом поражении печени. Выявлено, что в условиях оксидативного стресса происходит снижение удельной активности 6ФГДГ, что может быть связано с модификациями механизмов метаболитной регуляции функционирования фермента. На основе полученных результатов сделано заключение, что в условиях интоксикации гепатотоксинами 6ФГДГ, по-видимому, не играет существенной роли в поставке NADPH для ГР/ГП-системы, которая может обеспечиваться другими NADPH-генерирующими ферментами - в частности, Г6ФДГ и NADP-изоцитратдегидрогеназой. Предложена гипотетическая схема возможного участия 6ФГДГ в лимитировании CP процессов, путем снижения скорости образования короткоцепочечных Сахаров.

Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании 6ФГДГ в условиях нормы и при патологии. Исследование особенностей метаболитной регуляции 6ФГДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом поражении печени, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научно-исследовательской практике при выделении других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов in vivo для изучения кинетики сопряженных реакций в полиферментных системах. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», а также спецкурсов по аналитической и клинической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ.

Результаты работы использованы при выполнении гранта по научной программе «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук «Университеты России» УР.07.01.004», а.также проекта по ведомственной целевой программе Министерства образования и науки РФ - «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП. 2.1.1.4429.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 9-ой и 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 го века» (Пущино, 2005, 2006), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005, 2006).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях - в 3 статьях и 5 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

В динамике развития токсического поражения печени крыс гепатотоксинами (СС14, сульфат гидразина), сопровождающегося интенсификацией процессов СРО и увеличением активности Г6ФДГ, наблюдается снижение удельной бФГДГ-активности, указывающее на то, что, по-видимому, данный фермент не играет существенной роли в генерировании NADPH для ГР/ГП АОС.

С использованием гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ показано, что при поражении печени гепатотоксинами происходят изменения кинетических параметров каталитического действия и регуляции активности фермента под действием ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, метаболитов углеводного обмена и нуклеотидфосфатов. При интоксикации гепатотоксинами имеет место ряд особенностей регуляции активности 6ФГДГ, которые могут способствовать торможению функционирования фермента: возникновение ингибирующего действия окисленного глутатиона, снятие активирующего эффекта изоцитрата и NAD.

Предложена гипотетическая схема, отражающая возможное участие 6ФГДГ в регуляции интенсивности протекания свободнорадикальных процессов в клетке, путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроксиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс [76] и вызывать апоптоз клеток [100].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Свиридов, Максим Михайлович

выводы

2. С использованием гомогенных ферментных препаратов показано, что 6ГФДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс наряду со сходными физико-химическими свойствами (молекулярная масса Мг=114 к Да, гомодимерная субъединичная структура, электрофоретическая подвижность), характеризуется различиями ряда кинетических и регуляторных свойств.

3. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных CCI4 происходят изменения рН-оптимума и сродства фермента к субстрату и коферменту (уменьшение Км в 1,9 раза по отношению к 6-фосфоглюконату и в 2,7 раза по отношению к NADP). Однако при интоксикации крыс сульфатом гидразина не наблюдается сдвига рН-оптимума. Значения Км по отношению к субстрату уменьшаются в 2,6 раза, а по отношению к коферменту не изменяются. При токсическом поражении сульфатом гидразина происходит ингибирование активности фермента NADP в концентрациях выше 0,080 мМ (Kj = 0,380 мМ).

4. Выявлены особенности воздействия ряда ионов металлов на активность 6ФГДГ в патологическом состоянии. Ионы Mg2+ активируют 6ФГДГ из печени животных, подвергнутых интоксикации сульфатом гидразина, тогда как не оказывают влияния на активность фермента, выделенного из печени контрольной группы крыс и после введения СС14.

При развитии патологии, вызванной ССЦ, наблюдается увеличение Kj для ионов Fe2+ в 2,7 раза. Kj для ионов Fe3+ уменьшается в 8,6 раз по сравнению со значениями в контрольной группе. При интоксикации сульфатом гидразина наблюдается увеличение величин Ki для ионов Fe в 1,2 раза и уменьшение Kj для ионов Мп2+ и Fe3+ в 1,3 и 11,6 раз соответственно.

6. Установлено, что в условиях развития патологического состояния, вызванного введением гепатотоксинов, происходит изменение чувствительности фермента к действию NAD, АТР, ADP, AMP.

7. Выявлены различия в регуляции активности фермента некоторыми метаболитами углеводного обмена (глюкоза, галактоза, фруктозо-1,6-дифосфат и рибозо-5-фосфат) и интермедиатами цикла Кребса в норме и при интоксиакции гепатотоксинами.

8. Предложена гипотетическая схема участия 6ФГДГ в процессах регуляции СРО в печени животных при интоксикации гепатотоксинами путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроксиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), способных усиливать оксидативный стресс и вызывать апоптоз клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования динамики развития процессов СРО и активности ключевых ферментов ПФП показали, что наряду с возрастанием параметров БХЛ, мобилизацией глутатионовой АОС, уменьшением аконитазной активности, активацией Г6ФДГ происходит снижение активности 6ФГДГ. Выявлено также, что токсическое поражение печени сопровождается значительным усилением окислительной модификации белков. Очевидно, этот процесс может затрагивать и 6ФГДГ. В настоящее время в литературе имеются сведения, что возможна модификация лизиновых аминокислотных остатков в молекуле 6ФГДГ при старении, что приводит к потере ферментативной активности на 30% [129]. Таким образом, вероятно, в снижении активности 6ФГДГ при развитии окислительного стресса определенную роль играет химическая модификация аминокислотных остатков белка, приводящая к нарушению его конформации.

Выявлено, что при патологии ряд физико-химических свойств фермента не изменяется по сравнению с нормой. Так, значения молекулярной массы и электрофоретической подвижности для 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс совпадали. Полученные данные позволяют предполагать, что изменение активности фермента, наблюдаемое при развитии патологии, не сопряжено с реализацией ассоциативно-диссоциативного механизма регуляции, связанного с изменением субъединичного состава.

В тоже время при интоксикации крыс наблюдаются изменения как кинетических параметров каталитического действия, так и регуляторных свойств, что было показано нами с использованием очищенных ферментных препаратов. Обнаружено, что при токсическом поражении экспериментальных животных CCI4 происходят изменения рН-оптимума и сродства фермента к субстрату и коферменту (уменьшение Км в 1,9 раза по отношению к 6-фосфоглюконату и в 2,7 раза по отношению к NADP). Однако при интоксикации крыс сульфатом гидразина не наблюдается сдвига рН-оптимума. Значения Км по отношению к субстрату уменьшаются в 2,6 раза, а по отношению к коферменту не изменяются. При токсическом поражении сульфатом гидразина происходит ингибирование активности фермента NADP в концентрациях выше 0,080 мМ (Kj = 0,380 мМ). Изменение регуляции активности 6ФГДГ, наблюдаемое в условиях интенсификации СРО, по отношению к ионам некоторых металлов, нуклеотидам, интермедиатам цикла Кребса, а также к некоторым интермедиатам углеводного обмена, свидетельствуют о модификациях ряда механизмов метаболитной регуляции при патологии печени.

Известно, что при развитии оксидативного стресса возможно ингибирование процессов гликолиза и цикла Кребса в клетках, что связано со снижением интенсивности дыхания [57, 159]. В этом случае происходит изменение концентраций метаболитов цикла трикарбоновых кислот в клетках. Нами была показана возможность активирования 6ФГДГ изоцитратом в норме. При развитии патологии изоцитрат не оказывает влияния на активность 6ФГДГ. Особенности регуляции активности фермента при интоксикации крыс могут иметь определенное значение для сопряжения его функционирования с другими метаболическими путями.

6ФГДГ, выделенной из печени контрольных животных, и оказывает значительный ингибирующий эффект на фермент при патологии.

На основании проведенных исследований была предложена гипотетическая модель участия 6ФГДГ в процессах регуляции уровня СРО путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроксиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс и вызывать апоптоз клеток [76, 100].

Согласно данной схеме, представленной на рисунке 22, гепатотропное вещество, поступая в печень, инициирует развитие CP процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Интенсификация СРО приводит к нарушению структурно-функционального состояния биомембран, увеличению их проницаемости и конечном итоге к повреждению печеночной паренхимы [24, 189]. Процесс СРО индуцируется увеличением содержания АФК, ионов металлов переменной валентности, активацией NADPH-оксидаз в клетке. CP процессы уравновешены различными механизмами АОС организма. Утилизация АФК осуществляется неферментативной и ферментативной АОС. Полученные нами данные указывают на мобилизацию ан-тиоксидантного потенциала и, в частности, ГР/ГП АОС, для функционирования которой требуются восстановительные эквиваленты в .форме NADPH [16]. Показано, что в условиях оксидативного стресса происходит увеличение активности ряда NADPH-генерирующих ферментов, таких как Г6ФДГ, NADP-ИДГ, NADP-МДГ [4, 37, 55]. Однако как свидетельствуют полученные нами результаты, при этом наблюдается снижение удельной активности 6ФГДГ. Более того, выявлен ряд особенностей механизмов регуляции ферментативной активности, которые могут обеспечивать торможение функционирования 6ФГДГ. Таким образом, очевидно, что 6ФГДГ не может играть существенной роли в лимитировании интенсивности протекания CP процессов путем поставки восстановительных эквивалентов для ГР/ГП АОС. Вместе с тем нельзя исключить, что снижение скорости бФГДГ-реакции может быть взаимосвязано с необходимостью снижения уровня ряда Сахаров, в частности эритрозы, рибозо-5-фосфата и других, которые, согласно литературным данным, могут являться дополнительным фактором усиления окислительного стресса [76].

Глюкоза О

CCL чн+ о;

CCI,

H,N-NH,

О,

HN=NH

Образование конъюгатов

Глюкозо- -Фруктозо- ^ Фруктозо

NADP*—^6-фосфат^ч 6-фосфат 1,6-дифосфат

Г6ФДГ) I н+о: о,

NADPH+И^б-фосфо- \ глюконо- / \ \ лактон / \

GSH GSSG^

ГП

Интенсификация СРО \

Ксилулозо-5-фосфат

ПФП

6-фосфо-\ J глюконат у у NADP+-\

6ФГДГ Рибулозо-^ Рибозо У 5-фосфат 5-фосфат1

О NAD* ■ #

Изменение Оксидативная проницаемости модификация

Трансдегидрогеназа

NADH+ЬГ

Г Л И К о л и 3

Пиру ват Ацетил СоА мембраны белков

ЦТК Цитрат S О

Оксало

Нарушение метаболических процессов в клетке,ацетат развитие апоптоза ^

О МалатО

Рис. 22. Гипотетическая схема участия 6ФГДГ в регуляции интенсивности СРО в печени крыс при интоксикации гепатотоксинами Условные обозначения: О (•) - активирующий (ингибирующий) эффект в норме;

Фумарат

ИзоцитратО \

О 2-оксоглутарат

- Сукцинат (■) " активирующий (ингибирующий) эффект, при интоксикации крыс СС14;

0(#) - активирующий (ингибирующий) эффект при интоксикации крыс сульфатом гидразина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Свиридов, Максим Михайлович, Воронеж

1. Абдулаев Н.Х. Печень при интоксикации гепатотропными ядами / Н.Х.Абдулаев, Х.Я.Каримов. - Ташкент: Медицина УзСССР, 1989.-25с.

2. Абрамова Ж.И. Человек и противоокислительные вещества / Ж.И. Абрамова. СПб.: Наука, 1985. -230с.

3. Азизова О.А. О роли эндогенного свободного железа в ишемическом повреждении печени / О.А. Азизова, А.В. Козлов // Свободные радикалы и биостабилизаторы: 1й болг- сов. симп., София, 23-26 ноября 1987 г.: тез. докл. София, 1987. - С.З.

4. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами: Учеб. пособие / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж ун-та, 2000. - 296с.

5. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учеб. пособие / Ю.Б. Филиппович и др.. М.: Владос, 2005. - 407с.

6. Брайловская И.В. Индукция кальций-зависимой поры в митохондриях печени под действием аскорбата в присутствии низких концентраций ионов железа / И.В. Брайловская, А.А. Старков, Е.Н. Мохова // Биохимия. 2001. - № 8. - С.1117-1121.

7. Бузлама B.C. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных / B.C. Бузлама. Воронеж, 1997. - 35с.

8. Бурлакова Е.Б. Молекулярные механизмы действия антиоксидантов при лечении сердечно-сосудистых заболеваний / Е.Б. Бурлакова // Кардиология. 1980. - № 8. - С.48-52.

9. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. -М.:Наука, 1980.-320с.

10. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного бислоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика. 1987. - Т.32, вып.5. - С.830-844.

11. Влияние глутатиона на активность сфингомиелиназы и содержание продуктов перекисного окисления липидов в печени мышей / А.Н. Цюпко и др. // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып.9. - С. 1263-1270.

12. Влияние железа, цинка, меди на процессы перекисного окисления липидов печени / Е.Н. Кухтина и др. // Биохимия. 1996. Т. 61, вып.6. - С.993-997.

13. Войнова Н.Е. Об отрицательной кооперативности 6-ФГДГ из печени крыс. / Н.Е. Войнова, JI.C. Чеснокова, С.Н. Лызлова // Биохимия. 1996. -Т.61, вып.З,-С.451-454.

14. Галенок В.А. Гипоксия и углеводный обмен / В.А. Галенок. -Новосибирск, 1985. 159с.

15. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства / П.В. Гулак и др. -М.: Наука, 1985. 272с.

16. Диксон Э. Ферменты / Э. Диксон, М. Уэбб. М.: Мир, 1982. -1117с.

17. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот. М: Мир.- 1991.-462с.

18. Дэвис Г. Электрофорез. / Г. Дэвис М.: Мир - 1970. - 56с.

19. Жеребцов Н.А. Биохимия / Н.А. Жеребцов, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. Воронеж: Изд-во Воронеж. Ун-та, 2002. - 693с.

20. Зеленин К.Н. Гидразин: учеб. пособие / К.Н. Зеленин. -СПб.: Элби, 1999.-256с.

21. Изменение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в печени мышей при облучении / JI.C. Вартанян и др. // Биохимия. 2000. - Т.65, вып.4. - С.522-527.

22. Карташова О.Я. Моделирование патологических процессов в печени / О.Я. Карташова; под ред А.Ф. Блюгер. Рига: Звайгзне, 1975. -180с.

23. Кения М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи сов. биол. 1993. -Т.113, вып.4. - С.456-469.

24. Керимов Б.Ф. Интенсивность пентозофосфатного пути метаболизма углеводов в разных отделах мозга и голодавших животных / Б.Ф. Керимов // Вопросы медицинской химии. 2004. -Т.48, № 5. - С. 1681-1687.

25. Кобляков В.А. Цитохром Р-450: функционирование и регуляция / В.А. Кобляков // Биол. мембран. 2003. - Т.20, № 3. -С.265-272.

26. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии / Ю.Н. Кожевников // Вопр. мед. хим. 1985. - № 5.-С.2-7.

27. Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К. Рем; перевод с нем. Л.В. Козлова; под ред. П.Д. Решетова. М.: Мир, 2000. - 469с.

28. Комов В.П. Фармацевтическая биохимия / В.П. Комов. -СПб.: изд-во химико-фармацевт. ин-та, 1992. 76с.

29. Комплекс витаминов-антиоксидантов эффективно подавляет свободнорадикальное окисление фосфолипидов в мембранных структурах печени и миокарда / Г.Г. Коновалова и др. // Бюллетень эксперимент, биол. и мед. -2003. Т.135, вып.2. - С.166-169.

30. Коррелятивные связи между активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени мышей / Х.К. Мурадян и др. // Украинский биохимический журнал. 2003.-Т.75, вып. 1.-C.33-37.

31. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. -М.: Высшая школа, 1980. 272с.

32. Курганов Б.И. Анализ колоколообразных рН-зависимостей скоростей ферментативных реакций / Б.И. Курганов, Е.В. Петушкова // Биохимия. 1992. - Т.57. - С.348-361.

33. Кухтина Е.Н. Влияние железа, цинка, меди на процессы перекисного окисления липидов печени in vivo. / Е.Н. Кухтина, Н.Н. Глущенко // Биохимия. 1996. - Т.61, вып.6. - С.993-997.

34. Ланкин В.З. Ферментативное перекисное окисление липидов (ФПОЛ) / В.З. Ланкин // Укр. биохим. журн. 1984. - Т.54, № 3. -С.317-331.

35. Левенкова М.В. Некоторые регуляторные свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите / М.В. Левенкова, Т.Н. Попова, А.В. Семенихина // Вестник ВГУ. 2004 - № 1. - С. 134-138.

36. Любицкий О.Б. Определение антиоксидантной активности биологических жидкостей хемилюминесцентным методом: автореф. дис. . канд. биол. наук / Любицкий О.Б. Воронеж, 1996. - 25с.

37. Маглыш С.С. Очистка и некоторые свойства молекулярных форм 6-фосфоглюконатдегидрогнеазы из печени крыс / С.С. Маглыш,

38. З.В. Горбач, Ю.М. Островский // Биохимия. 1982. - Т.5., вып.5. -С.2035-2041.

39. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / У. Мак-Мюррей; пер. с англ. В.З. Горкина; под ред. Е.А. Яновской. М.: Мир, 1980.-362с.

40. Марри Р. Биохимия человека: в 2-х т. / Р. Марри; пер. с англ. В.В. Борисова; под ред. Гинодмана. М.: Мир, 1993. - Т.1. - 384с.

41. Мауэр Г. Диск-электрофорез. / Г. Мауэр // М.: Мир, 1971.22с.

42. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.З. Меерсон. М.: Медицина, 1984.-272с.

43. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи сов. биол. 1997. - Т. 117, вып.2. - С.155-169.

44. Монооксигеназная система, перекисное окисление липидов в печени и обмен цианокобаламина при экспериментальном отравлении кроликов фенилгидразином / А.А. Познанская и др. // Биохимия. 1989. -Т.54, вып.8. - С. 1290-1293.

45. Надиров Н.К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве / Н.К. Надиров. М.: Наука, 1971. - 336с.

46. Нейрозащита липоевой кислоты при сахарном диабете / Г. Байдас и др. // Биохимия. 2004. - Т.69, вып.9. - С.1233-1238.

47. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) / Е. Дубинина и др. // Вопросы мед. химии. 1995. - Т.46, № 4. - С.398-410.

48. Особенности обмена углеводов в печени крыс при недостаточности тиамина / З.В. Горбач и др. // Биохимия. 1985. -Т.50, вып.8. -С.1261-1268.

49. Панасенко О.О. Структура и свойства малых белков теплового шока / О.О. Панасенко, М.В. Ким, Н.Б. Гусев // Успехи биол. химии. -2003. Т.43. - С.59-98.

50. Пероксидное окисление липидов и стресс / В.А. Барабой и др.. СПб.: Наука, 1992. - 148с.

51. Покровский А.А. Цитология ферментов / А.А. Покровский. -М.: Мир, 1971.-379с.

52. Романенко Е.Б. Антиоксидантная система мембран печени и сердца млекопитающих в постнатальный период онтогенеза / Е.Б. Романенко, Н.Б. Леонидов, Б.Ф. Ванюшин // Молек. биол. 1995. -Т.29, вып.6. - С.1391-1397.

53. Самнер Д.Б. Химия ферментов и методы их исследования / Д.Б. Самнер, Г.Ф. Сомерс; перевод с англ. А.П. Бархама; под ред. В.А. Энгельгардта. -М.: Изд-во иностранной литературы, 1948. 584с.

54. Сафонова О.А. Свойства и регуляция активности НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ в условиях оксидативного стресса в миокарде крыс при ишемии: автореф. дис. . канд. биол. наук / О.А. Сафонова Воронеж, 2004. - 24 с.

55. Серов О.Л. О чистка и некоторые свойства электрофоретических вариантов 6-фосфоглюконатдегидрогнеазы из эритроцитов крыс / О.Л.Серов, Г.П.Манченко, Т.М.Хлебодарова // Биохимия. 1975. - Т.40, вып.6. - С. 1232-123 8.

56. Скулачёв В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти / В.П. Скулачёв. М.: ИБМХ РАМН, 2000. - 47с.

57. Соколов А.П. Очистка и свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы факультативного метилотрофа Arthrobacter Globiformis / А.П. Соколов // Биохимия. 1985. - Т.50, №8.-С. 1269-1276.

58. Федорова Н.Ю. Состояние системы глутатионпероксидазы-глутатионредуктазы в стимулированном к регенерации органе и еероль в клеточной пролиферации: автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.Ю. Федорова. ВГУ, Воронеж, 1999. - 24с.

59. Ферменты в медицине, пищевой промышлнности и сельском хозяйстве / М.Ф. Гулый и др.. Киев: Наукова думка, 1968. - 251с.

60. Шанин Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике / Ю.Н. Шанин, Е.В. Зиновьев; под ред. Ю.Н. Шанина. СПб.: ЭЛБИ, 2003.-128с.

61. Шаповал Г.С. Механизм антиоксидантной защиты организма при действии активных форм кислорода / Г.С. Шаповал // Украин. биохим. жур. 2003. - Т.75, № 2. - С.5-13.

62. Activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress / Kiffm R. et al. // Mol. Biol. Cell. 2004. - V.15. - P.4829-4840.

63. Age-related changes in oxidized proteins / Oliver C.N. et al. // J. Biol. Chem. 1987. - V.262, No. 12. -P.5488-5491.

64. Alcohol-induced oxidative stress in rat liver / Koch O.R. et al. //Xenobiotica. 1991. - V.21, No.8. - P. 1077-1084.

65. Ayala A. Possible involvement of NADPH requirement in regulation of glucose-6-phosphate and 6-phosphogluconate dehydrogenase levels in rat liver / A. Ayala, I. Fabregat, A. Machado // Mol. Cell Biochem. -1990. V.95, No.2. - P.107-115.

66. Bailey-Serres J. Purification and characterization of cytosolic 6-phosphogluconate dehydrogenase isozymes from maize / J. Bailey-Serres, M.T. Nguyen // Plant Physiol. 1992. - V. 100. - P. 1580-1583.

67. Balance between oxidative damage and proliferative potential in an experimental rat model of CC14-induced cirrhosis: protective role of adenosine administration / Hernandez-Munoz R. et al. // Hepatology. -1997. V.26, No.5. -P.l 100-1110.

68. Barash V. Microsomal hexose-6-phosphate and 6-PGDG in extrahepatic tissues: human placenta and pig kidney cortex / V.Barash, T.Erlich, N. Bashan // Biochem. Int. 1990. - V.20, № 2. - P.267-274.

69. Beitner R. Inhibition of 6-phosphogluconate dehydrogenase (decarboxilating) by glucose 1,6-bisphosphate / R Beitner, J. Nordenberg // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V.583, No.2. -P.266-269.

70. Benov L. Superoxide dependence of the toxity of short chain sugars I L. Benov, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. -P.25741-25744.

71. Benzi G. Changes induced by aging and drug treatment on cerebrae enzymatic antioxidant system / G.Benzi, O.Pastoris // Neurochem. Res. 1980. - V.13, № 5. -P.467-478.

72. Berdis A.J. Overall kinetic mechanism of 6-phosphogluconate dehydrogenase from Candida utilis / A.J. Berdis, P.F. Cook // Biochem. -1993. V.32. - P.2036-2040.

73. Berdis A. J. The 2'-phosphate of NADP is critical for optimum productive binding to the 6-phosphogluconate dehydrogenase from Candida utilis / A.J. Berdis, P.F. Cook // Arch. Biochem. Biophys. 1993. - V.305. -P.551-558.

74. Berdis A.J. Chemical mechanism of 6-phosphgluconate dehydrogenase from Candida utilis from pH studies / A.J. Berdis, P.F. Cook // Bioch. 1993. - V.32. - P.2041-2046.

75. Bergamini M. Inactivation and cleavage of liver 6-PGDG during irradiation in the presence of vanadate / M.Bergamini, M.Kippa // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - V.321, № 1. - P. 1-5.

76. Berlett B.S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress / B.S. Berlett, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1997. - V.272, № 33. -P.20313-20316

77. Bridges R.B. Purification and properties of an NADP-specific 6-phosphogluconate dehydrogenase from Streptococcus faecalis / R.B. Bridges, M.P. Palumbo, C.L. Wittenberger // J. Biol. Chem. 1975. -V.250, No.15. -P.6093-6100.

78. Bublitz C. Physical separation of cytoplasmic and microsomae 6-PGDG from rat liver / C. Bublitz // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1981. V.98, № 3. -P.588-594.

79. Came A. Kinetic properties of the G-6PDG and 6-PGDG from Corynebacterium glutamicum and their application for predicting pentose phosphate pathway flux in vivo / A. Came // Eur. J. Biochem. 2000. -V.267, № 12. -P.3442-3452.

80. Carter N. Interactions of inhibitors of the coenzyme binding site of 6-PGDG / N.Carter // Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V.178, № 1. -P.26-33.

81. Casazza J.P. The interdependence of glycolytic and pentose cycle intermediates in ad libitum fed rats / J. P. Casazza, R. L, Veech // J. Biol. Chem. 1986. - V.261, No.2. - P.690-698.

82. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication / S Szymonik-Lesiuk et al. // J Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2003. - V.10, No.4.-P.309-315.

83. Changes in lipids of rat liver after hydrazine injection / D.A. Clark et al. // Biochem. Pharmacol. 1970. - V.l9, No.5. - P. 1743-1752.

84. Chrungoo V.J. Differential biochemical response of freshly isolated rat hepatocytes to paracetamol, carbon tetrachloride and D-galactosamine toxicity / V.J. Chrungoo, K. Singh, J. Singh // Indian J. Exp. Biol. 1997. - V.35, No.6. - P.603-610.

85. Cloning, expression, purification, and characterization of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from sheep liver / L. Chooback et al. // Prot. Exp. Pur. -1998. -V 13, issue 2. -P.251-258.

86. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm / T.G. Cooper, H. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - V.244, No.13. -P.3507-3513.

87. Crystallographic study of coenzyme, coenzyme analogue and substrate binding in 6-phosphogluconate dehydrogenase: implications for NADP specificity and the enzyme mechanism / Adams M.J. et al. // Structure. 1994. - V.2, No.8. - P.784-790.

88. Cytochemical localization of brain nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (oxidized)-dependent dehydrogenases. Qualitative and quantitative distributions / Sims K.L. et al. // J. Histochem. Cytochem. 1974. - V.22, No.l. -P.7-19.

89. Diagnostic evaluation of carbon tetrachloride-induced rat hepatic cirrhosis model / G.P. Lee, W.I. Jeong, D.H. Jeong et al. // Anticancer Res.- 2005. V.25, No.2A. - P. 1029-1038.

90. Dicker E. Increased oxygen radical-dependent inactivation of metabolic enzymes by liver microsomes after chronic ethanol consumption / E. Dicker, A.I. Cederbaum // FASEB J. 1988. - V.2. - P.2901-2906.

91. Differential synthesis of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase polypeptides in stressed yeast cells / Boucherie H. et al. // FEMS Microbiol. Lett. 1995.-V.125.-P.127-134.

92. D-ribose and deoxy-D-ribose induce apoptosis in human quiescent peripheral blood mononuclear cells / D. Barbieri et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V.201. - P. 1109-1116.

93. Dyson J.E.D. Sheep liver 6-phosphogluconate dehydrogenase. Inhibition by nucleoside phosphates and by other metabolic intermediates / J.E.D. Dyson, R.E. D'Orazio // J. Biol. Chem. 1973. - V.248, No. 15. -P.5428-5435.

94. Early midzonal oxidative stress preceding cell death in hypoperfused rat liver / M. Suematsu et al. // Gastroenterology. 1992. -V.103,No.3. -P.994-1001.

95. Effect of oral dosing vehicles on the subchronic hepatotoxicity of carbon tetrachloride in the rat / Koporec K.P. et al. // J. Toxicol. Environ. Health. 1995. - V.44, No.l. - P.13-27.

96. Effect of route and pattern of exposure on the pharmacokinetics and acute hepatotoxicity of carbon tetrachloride / Sanzgiri U.Y. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1995. - V. 134, No.l. - P. 148-154.

97. Effects of changes in brain metabolism on levels of pentose phosphate pathway intermediates / Kauffman F.C. et al. // J. Biol. Chem. 1969. - V.244, No. 13. - P.3647-3653.

98. Effects of hydrazine, phenelzine, and hydralazine treatment on rat hepatic and renal drug-metabolizing enzyme expression / M. Runge-Morris, et al. // Drug Metab. Dispos. 1996. - V.24. - P.734-737.

99. Effects of some drugs on rat erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase: an in vitro and in vivo study / Ciftci M. et al. // Pol. J. Pharmacol. 2002. - V.54. - P.275-280.

100. Eggleston L.V. Regulation of the pentosephosphate cycle / L.V. Eggleston, H.A. Krebs // Biochem. J. 1974. - V. 138. - P.425-435.

101. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucocose-6-phosphate dehydrogenase expression / Salvemini F. et al. // J. Biol. Chem. 1999. - V.274, No.5. - P.2750-2757.

102. Evaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by carbon tetrachloride in rat liver / Sun F. et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2001. V. 1535, No.2. - P. 186-191.

103. Evidence of Hepatocyte Apoptosis in Rat Liver after the Administration of Carbon Tetrachloride / Shi J. et al. // Am. J. Pathol. -1998. -V.153. -P.515-525.

104. Experimental cirrhosis of the liver and cytoprotective effects of alpha tocopherol / Z Canturk et al. // East. Afr. Med. J. 1999. - V.76, No.4. -P.223-227.

105. Ganea E. Inhibition of 6-phospogluconate dehydrogenase by carbamylation and protection by a-crystallin, a chaperone-like protein / E.Ganea, J.J. Harding // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. -V.222, No.2. - P.626-631.

106. Garcia Martin L.O. Purification and properties of 6-PGDG from Mytilus galloprovincialis digestive gland /L.O. Garcia Martin, M. Abad,

107. J.L. Sanchez // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. - V.79, No.4. - P.599-606.

108. Gardner P.R. Aconitase is a sensitive and critical target of oxygen poisoning in cultured mammalian cells and in rat lungs / P.R. Gardner, D.M. Nguyen, C.W. White // Proc. Nat. Acad. Sci. 1994. -V.91. No.25. - P.12248-12252.

109. Gardner P.R. Superoxide radical and iron modulated aconitase activity in mammalian cells / P.R. Gardner, J. Raineri // J. Biol. Chem. -1995. V.270, No.22. - P. 11399-13405.

110. Glucose-6-phosphate dehydrogenase: a "housekeeping"enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients, and oxidart stress / Letzien R.F. et al. //FASEB J. 1994. - V.l78. - P. 156-167.

111. Glutamic and aminoadipic semialdehydes are the main carbonyl products of metal-catalyzed oxidation of proteins / Requena J.R. et al. // PNAS. 2001. - V.98, No. 1. - P.69-74.

112. Gordillo E. Implication of lysine residues in the loss of 6-phosphogluconate dehydrogenase activity in aging human erythrocytes / E. Gordillo, A. Machado // Mech. Ageing Dev. 1991. - V.59, No.3 - P.291-297.

113. H202-induced block of glycolysis as an active ADP-ribosylation reaction protecting cells from apoptosis / C. Colussi et al. // FASEB J. -2000. V.14. -P.2266-2276.

114. Hanan S. 6-PGDG from Lactococcus Lactis: A role for arginine residues in binding substrate and coenzyme / S. Hanan, M.G. Adams // Boichem. J. 1999. - V.338, No.l. -P.55-60.

115. Hanan S. NADPH activates a decarboxylation reaction catalysed by lamb liver 6-PGDG / S.Hanan, M.Rippa // Biochem. Biophys. Acta. Prot. Struct. Mol. Enzymol. 1992. -V.l 122, No.3. -P.273-277.

116. Hepatotoxicity of hydrazine in isolated rat hepatocytes / T. Sendo et al. // Chem. Pharm. Bull. 1984. - Y.32, No.2. - P.795-806.

117. Hino Y. Glucose-6-phosphate oxidation pathway in rat-liver microsomal vesicles. Stimulation under oxidative stress / Y. Hino, S. Ishio, Minakami // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 165. - P. 195-199.

118. Hussain S.M. Involvement of apoptosis in hydrazine induced toxicity in rat primary hepatocytes / S.M. Hussain, J.M. Frazier // Toxicol. Vitro. -2003. V.l7, No.3. - P.343-355.

119. Hussain S.M. Toxicity of hydrazine in primary rat hepatocytes / S.M. Hussain, J.M. Frazier // Toxicol. Sci. 2002. - V.69. - P.424-432.

120. Hydrazine radical formation catalyzed by rat microsomal NADPH-cytochrome P-450 reductase / A. Noda et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - V.153,No.l. -P.256-260.

121. Implication of lysine residues in the loss of enzymatic activity in rat liver 6-phosphogluconate dehydrogenase found in aging / E. Gordillo et al. //J. Biol. Chem. 1989 -V. 264, No.29. - P. 17024-17028.

122. In situ detection of oxidative stress in rat hepatocytes / S. Mochida et al. //J. Pathol. 1992. - V.l 67, No.l. -P.83-89.

123. Inactivation of key metabolic enzymes by mixed-function oxidation reactions: possible implication in protein turnover and ageing / Fucci L. et al. // Biochem. 1983. - V.80. - P. 1521 -1525.

124. Increase of lipid hydroperoxides in liver mitochondria and inhibition of cytochrome oxidase by carbon tetrachloride intoxication in rats / Ikeda K. et al. // Free. Radic. Res. 1998. - V.28, No.4. - P.403-410.

125. Integrated metabonomic analysis of the multiorgan effects of hydrazine toxicity in the rat / S. Garrod, M.E. et al. // Chem. Res. Toxicol. 2005. - V. 18, N0.2. - P. 115-122.

126. Janero D.R. Hydroperoxide-induced oxidative stress impairs heart muscle cell carbohydrate metabolism / D.R. Janero, D. Hreniuk, H.M. Sharif//AJP, Cell Physiol. 1994,-V.266, issue 1.-P. 179-188.

127. Jenner A.M. In vitro microsomal metabolism of hydrazine / A.M. Jenner, J.A. Timbrell // Xenobiotica. 1995. - V.25, No.6. - P.599-609.

128. Johnston D.E. Mechanism of early carbon tetrachloride toxicity in cultured rat hepatocytes / D.E. Johnston, C. Kroening // Pharmacol. Toxicol. 1998. - V.83, No.6. - P.231-239.

129. Karsten W.E. Glutamate 190 is a general acid catalyst in the 6-phosphogluconate dehydrogenase-catalyzed reaction / W.E. Karsten, L. Chooback, P.F. Cook//Biochem. -V.37. -P.15691-15697.

130. Katz J. The pentose cycle, triose phosphate isomerization, and lipogenesis in rat adipose tissue / J. Katz, B.R. Landau, G.E. Bartsch // J. Biol Chem. 1966. - V.241. - P.727-740.

131. Kinetic studie of Haemophilis influenzae 6-PGDG / У. Heejeong et al. //Biochem. Biophys. Acta. 1989. - V.l. -P.75-80.

132. Kliman S.J. Association of gluceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with human red cell membrane. A kinetic analysis / S.J. Kliman, T.L. Steck J. //Biol. Chem. 1980. -V.255. -P.6314-6321.

133. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. -1970. V.227. - P.680-685.

134. Lee W.M. Drug-induced hepatotoxicity / W.M. Lee // N. Eng. J. Med.- 1995. V.333, No.17.-P.ll 18-1127.

135. Li L. Importance in catalysis of the 6-phosphate-binding site of 6-phosphogluconate in sheep liver 6-phosphogluconate dehydrogenase / L. Li, F.S.N. Dworkowski, P.F. Cook // J. Biol. Chem. 2006. - V.281, issue 35. -P.25568-25576.

136. Lipid peroxidation activation and cytochrome P-450 decrease in rat liver endoplasmic reticulum under oxidative stress / E.A. Serbinova et al. // Toxicol. Lett. 1989. - V.47, No.2. -P.ll 9-223.

137. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr // J. Biol. Chem. 1951. -V. 194, No. 1. - P.265-271.

138. Luzzata L. G-6-PDG: genetic and haemotological aspects / L. Luzzata// Cell Biochem. Funct. 1987. - V.5, No.2. -P.101-107.

139. Mack D.O. Regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in the meal-fed rat / D.O. Mack, J.J. Watson, B.C. Johnson // J. Nutr. 1975. - V.105, No.6. - P.714-720.

140. Margaret A.J. Structure of 6-PGDG from sheep liver at 6A resolution / A.J. Margaret, J.R.Helliwell, B.E.Charles I I J. Mol. Biol. -1977.-V.112, No.2. -P.183-197.

141. Markers of protein oxidation by hydroxyl radical and reactive nitrogen species in tissues of aging rats / Leeuwenburgh C. et al. // Am. J. Physiol. 1998. - V.274. - P.R453-R461.

142. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide / A. Shevchenko et al. // Anal. Chem. 1996. - V.68. -P.850-858.

143. Mechanisms of hydrazine toxicity in rat liver investigated by proteomics and multivariate data analysis / T.G. Kleno et al. // Proteomics. 2004. - V.4, No.3. - P.868-880.

144. Medd S.M. Sheep 6-PGDG: Revised protein sequence based upon the sequences of cDNA clones obtained ninth the poly chain reaction /M.S. Medd, Y.Walker // Biochem. J. 1992. - V.288, No.3. - P.1061-1067.

145. Metabolism and cytotoxicity of hydrazine in isolated rat hepatocytes / Noda A. et al. // Chem. Pharm. Bull. 1987. - V.35, No.6. -P.2538-2544.

146. Metabolism of isoniazid and free hydrazine formation in isolated rat hepatocytes / Hirata M. et al. // J. Pharmacobiol. 1981. - V.4, No.2. -P.145-147.

147. Metabonomic investigations into hydrazine toxicity in the rat / Nicholls A.W. et al. // Chem. Res. Toxicol. 2001. - V.14, No.8. -P.975-987.

148. Moloney S.J. The interactions of hydrazine derivatives with rat-hepatic cytochrome P-450 / S.J. Moloney, B.J. Snider, R.A. Prough // Xenobiotica. 1984. - V.14, No. 10. -P.803-814.

149. Morgan P.E. Inhibition of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase by peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen attack / P.E. Morgan, T.D. Roger, M.J. Davies // Eur. J. Biochem. -2002. -V.269. -P.1916-1925.

150. Oxidized amino acids in the urine of aging rats: potential markers for assessing oxidative stress in vivo / Leeuwenburgh C. et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 1999. - V.276. - P. 128135.

151. Pascual С. Coordinate regulation of the pentose phosphate pathway and of the activity 6-PGDG (decarboxylatins) / C.Pascual, S.Herreral // Folia microbiol. 1982. - V.27, No.6. - P.305-349.

152. Peleato Sanchez M.L. Effects of GS-SG on the inhibition of G-6-PDG and 6-PGDG by NADPH in Aspergillys oryzae / M.L. Peleato Sanchez, J.A. Perez // Biochem. Soc. Trans. 1981. - V.9, No.2. - P.326-330.

153. Preece N.E. Investigation of lipid peroxidation induced by hydrazine compounds in vivo in the rat / N.E. Preece, J.A. Timbrell // Pharmacol. Toxicol. 1989. - V.64, No.3. - P.282-285.

154. Price N.E. Kinetic and chemical mechanisms of the sheep liver 6-PHDG / N.E. Price, P.F. Cook // Arch. Biochem. Biophys. 1996. -V.336, No.2.-P.215-223.

155. Procsal D. Dietary regulation of 6-phosphogluconate dehydrogenase synthesis / D. Procsal, L. Winberry, D. J. Holten // Biol. Chem. 1976 - V.251, No. 12. - P.3539-3544.

156. Protection of rat liver microsomes against carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation by red ginseng saponin through cytochrome P~ 450 inhibition / Kim H.J. et al. I I Planta Med. 1997. - V.63, No .5. -P.415-418.

157. Purification and properties of 6-PGDG from Mytilus galloprovincinalis digestive gland / Garcia Martin L.O. et al. // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. - V. 79, No.4. - P.599-606.

158. Purucker E. Glutathione in plasma, liver, and kidney in the development of CCl4-induced cirrhosis of the rat / E. Purucker, W. Wernze, G. Krandik // Res. Exp. Med. 1995. - V.195, No.4. - P.193-199.

159. Ray P.D. Inhibition by hydrazine of gluconeogenesis in the rat / P.D. Ray, R.L. Hanson, H.A. Lardy // J. Biol. Chem. 1970. - V.245. -P.690-696.

160. Refsgaard H.H.F. Modifications of proteins by polyunsaturated fatty acid peroxidation products / H.H.F. Refsgaard, L. Tsai, E.R. Stadtman // PNAS 2000. - V.2, No.2. - P.611-616.

161. Regulation of Hsp27 oligomerization, chaperone function, and protective activity against oxidative stress/tumor necrosis factor a by phosphorylation / Rogalla T. et al. // J. Biol. Chem. V.274, No.27, issue 2. -P.18947-18956.

162. Reznick A.Z. Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric method for carbonyl assay / A.Z. Reznick, L. Packer // Meth. Enzimol. -1994.-Vol. 233.-P. 357-363.

163. Risk assessment of high-energy chemicals by in vitro toxicity screening and quantitative structure-activity relationships / Trohalaki S. et al. // Toxicol. Sci. 2002. - V.68. - P.498-507.

164. Rodriguez M. 6-Phosphogluconate dehydrogenase from Zymomonas mobilis / M. Rodriguez, A.G. Wedd Antony, R.K. Scopes // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. - V.38, No.4. - P.783-789.

165. Rumyantseva G.V. Transition metal-catalyzed reactions in the microsomal metabolism of alkyl hydrazines to carbon-centered free radicals / G.V. Rumyantseva, C.H. Kennedy, R.P. Mason // J. Biol. Chem.- 1991. -V.266, No.32. P.21422-21427.

166. Salaris S.C. Traumatic versus postischemic induction of oxidative stress in rat liver / S.C. Salaris, C.F. Babbs, J. Pham // J. Trauma.- 1993. V.34, No.2. - P. 199-204.

167. Seya K. Changes in the ability of ATP synthesis in the mitochondrial membrane in the rat liver injured by carbon tetrachloride / K.

168. Seya, N. Ohkohchi, S. Mori // Tohoku J. Exp. Med. 1996. - V.178, No.4. -P.425-430.

169. Short-term CR decreases cardiac mitochondrial oxidant production but increase carbonyl content / Judge S. et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 2004. - V.286. - P.254-259.

170. Stadtman E.R. Ascorbic acid and oxidative inactivation of proteins / E.R. Stadtman // Am. J. Clin. Nutr. 1991. - V.54. - P.1125S-1128S.

171. Stadtman E.R. Fenton chemistry. Amino acid oxidation / E.R. Stadtman, B.S. Berlett // J. Biol. Chem. 1991. - V.266, No.26. -P.17201-17211.

172. Stadtman E.R. Metal-catalyzed oxidation of proteins / E.R. Stadtman, C.N. Oliver // J. Biol. Chem. 1991. - V.266, No.4. - P.2005-2008.

173. Stadtman E.R. Protein oxidation / E.R. Stadtman, R.L. Levine // An. N.Y. Acad. Scien. 2000. - V.899. - P. 191-208.

174. Stadtman E.R. Protein oxidation in aging and age-related diseases / E.R. Stadtman // An. N.Y. Acad. Scien. 2001. - V.928. - P.22-38.

175. Starke P.E. Modification of hepatic proteins in rats exposed to high oxygen concentration / P.E. Starke, C.N. Oliver, E.R. Stadtman // FASEB J. 1987. - V.l. - P.36-39.

176. Stimulation of the pentose phosphate pathway and glutathion levels by dehydroascorbate, the oxidized form of vitamin С / F. Puskas, et al. // FASEB J. 2000. - V.14. - P.1352-1361.

177. Sundari P.N. Does oxidative protein damage play a role in the pathogenesis of carbon tetrachloride-induced liver injury in the rat? / P.N. Sundari, G. Wilfred, B. Ramakrishna // Biochim. Biophys. Acta. 1997. -V.1362, No.2-3. -P.169-176.

178. Teulsch H.F. Chemomorphology of liver parenchyma. Owalilative histochemical distribute on 6-PGDG and mails enzyme activity and glycogen content / H.F.Teulsh // Prog. Histochem. 1981. - V.14, No.3.-P.92.

179. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver / Cogger V.C. et al. // Pharmacol. Toxicol. 2001. -V.89, No.6.-P.306-311.

180. The effect of fructose-2,6-bisphosphate on 6-PGDG from cultured cells of Cantharanthus roscus / Y.Yamoshita et al. // J. Plant Physiol. 1998. - V.133, No.5. - P.605-607.

181. The increase in H202-induced apoptosis by ADP-ribosylation inhibitors is related to cell blebbing / L. Ghibelli et al. // Exp. Cell. Res.1995. V.221.-P.462-469.

182. Tissue-specific activity of pentose cycle oxidative enzymes during feeder lamb development / Belk K.E. et al. // J. Anim. Sci. 1993. -V.71. -P.1796-1804.

183. Toews M.L. 6-phosphogluconate dehydrogenase. Purification and kinetics / M.L. Toews, M.I. Kanji, W.R. Carper // J. Biol. Chem. -1976. V.251, No.22. - P.7127-7131.

184. Topham C.M. Kinetic studies of 6-phosphogluconate dehydrogenase from sheep liver / C.M. Topham, B. Matthews, K. Dalziel // Eur. J. Biochem. 1986 - V. 156. -P.555-567.

185. Uptake, distribution, and elimination of carbon tetrachloride in rat tissues following inhalation and ingestion exposures / Dallas C.E. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997. - V. 143, No.l. - P. 120-129.

186. Vertessy B.G. Specific characteristics of phosphofructokinase-microtubule interaction / B.G. Vertessy, J. Kovacs, J. Ovadi // FEBS Lett.1996. V.379. - P.191-195.

187. Yan L.-J. Oxidative damage during aging targets mitochondrial aconitase / L.-J. Yan, R.L. Levine, R.S. Sohal // Biochem. 1997. - V.94. -P.11168-11172.

188. Yokota A. Regulation of the activity 6-PGDG / A.Yokota, A.Wadano //Eur. J. Biochem. 1992. - V.208, No.3. -P.721-727.

189. Zaidi S.M. Effects of antioxidant vitamins on glutathione depletion and lipid peroxidation induced by restraint stress in the rat liver / S.M. Zaidi, T.M. Al-Qirim, N. Banu // Drugs. R. D. 2005. - V.6, No.3. -P.157-165.

190. Zhang, L. Lysine 183 is the general base in the 6-phosphogluconate dehydrogenase-catalyzed reaction I L. Zhang, L. Chooback, P. F. Cook//Bioch. 1999. -V.38. -P.l 1231-11238.

Информация о работе

Свиридов, Максим Михайлович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы