Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства и механизм действия АКТГ-подобных пептидов иммунокортина и лейкокортикотропина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и механизм действия АКТГ-подобных пептидов иммунокортина и лейкокортикотропина"

На правах рукописи

ВАНИНА ВЕРА ИВАНОВНА

СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АКТГ - ПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИММУНОКОРТИНА И ЛЕЙКОКОРТИКОТРОПИНА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пушино - 2006

Работа выполнена в лаборатории пептидных биорегуляторов Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Е.В. Наволоцкая

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Е.И. Маевский

кандидат химических наук, И.П.Удовиченко

Ведущая организация: Институт иммунологии ФМБА РФ

Защита состоится « 30 » ноября 2006 г. в 14 ч.ОО мин.

на заседании Диссертационного совета Д.002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Стресс — это одна из общих неспецифических нейро-гуморальных реакций организма на действие "чрезвычайных" раздражителей (стрессоров), которая в основном определяется деятельностью гипоталамуса, гипофиза и коры надпочечников. Стресс имеет защитное значение и направлен на восстановление нарушенного гомео стаза. Патогенное действие любого агента включает в себя специфическое действие на ткань, неспецифическое местное действие и неспецифическое влияние, опосредованное через гормоны гипофиз-адреналовой системы. Усиление психоэмоциональной нагрузки, ухудшение экологической обстановки - все это приводит к возрастанию стрессорных воздействий и снижению адаптационных возможностей организма современного человека. Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессу - это важная и актуальная задача.

В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, в частности, АКТГ- подобных конструкций, рассматриваются как потенциальные лекарственные средства нового класса. Несомненными достоинствами пептидов являются быстрая реакция организма на их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты. К сожалению, полифункциональность пептидных гормонов является лимитирующим фактором их применения в качестве лекарственных препаратов. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидных гормонов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеплению. Показано, что основным регулятором гормонального ответа организма на стресс является адренокортикотропный гормон (АКТГ)' В этой связи детальная характеристика свойств и механизма действия неизвестных ранее АКТГ- подобных пептидов иммунокортина (УККРОЗЗУКУ) и лейкокортикотропина (ОКУЬКККЯ) важна и актуальна.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия АКТГ-подобных пептидов иммунокортина (ИМК) и лейкокортикотропина (ЛКТ).

Основные задачи исследования: 1. Получение [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и 1251-меченого АКТГ(11 -24) и исследование связывания с мембранными фракциями коры надпочечников крысы.

2. Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на уровень П-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс в покое, при холодовом и тепловом шоке in vivo.

3. Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на систему гистамин - диаминоксидаза миокарда крыс при различных термических воздействиях in vivo.

4. Изучение влияния ИМК и ЛКТ на пролиферацию Т и В лимфоцитов селезёнки крысы in vitro.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что АКТГ - подобные пептиды: ИМК, соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжелой цепи иммуноглобулина G1 (Н-пепи IgGl) человека, и ЛКТ, соответствующий фрагменту 81-88 предшественника интерлейкина-la (pIL-la) человека, быка, кролика и мыши, обладают стресс-протекторной активностью. Установлено, что ИМК, ЛКТ, фрагмент АКТГ(15-18) и его модифицированные аналоги снижают уровень КС при термических воздействиях, а также приводят к равновесию систему гистамин -диаминоксидаза (ДАО), как при холодовом, так и при тепловом шоке.

Также обнаружено, что ИМК, в отличие от АКТГ и глнжокортикоидов, увеличивает пролиферацию митоген-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Показано, что это действие ИМК опосредовано через рецептор АКТГ.

Приоритетными являются результаты исследования с помощью [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и 1251-меченого АКТГ(11-24) G-белок-связанного рецептора АКТГ (меланокортин-2 рецептор, MC2R) на мембранах коры надпочечников крысы.

Практическая ценность результатов работы. В настоящее время решением одной из важнейших задач современных биологии и медицины является создание новых эффективных и безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу. Поэтому такое свойство ИМК и ЛКТ, как способность усиливать адаптационные возможности организма при действии различных экстремальных факторов, может привлечь внимание фармакологов и клиницистов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международном конгрессе "Цитокины и интерфероны" ("Joint Meeting of the International Society for Interferon and Cytokine Research", Турин, Италия, 2002); на

Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); на V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); на XV зимней Международной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); на Пущи неких конференциях молодых ученых (Пущино, 2003, 2004, 2005); на II Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития1* (Москва, 2003); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); на Международной конференции "Наука а бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина" (Пущино, 2004); на Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005); на I Международном междисциплинарном конгрессе "Достижения нейронауки для современной медицины и психологии" (Крым, Украина, 2005); на Международной конференции по изучению аминокислот и белков ("The Forum for Amino Acid and Protein Research", Вена, Австрия, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 12 таблиц. Библиографический указатель содержит 174 источника литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связывание [^Щиммунокортина, [3Н]лейкокортикотропина и •меченого АКТГ(11-24) с мембранами коры надпочечников крысы

Нами был синтезирован АКТГ-подобный декапептид ИМК, который соответствовал аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжёлой цепи человека и имел 50% гомологию с фрагментом АКТГ(13-22) (Рис.1).

1 13 22 39

АКТГ ЗУЗМЕНГКТСКРУСКККНРУКУУРОСЕАЕОЗАЕАГРЬЕГ

Иммунокортим УККРСБЗУКУ

Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей АКТГ и ИМК.

Мы получили [3Н]ИМК и изучили его связывание с мембранами, выделенными из коры надпочечников крыс.

На Рис.2а. показана зависимость величины общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3Н]ИМК с мембранами коры надпочечников. Видно, что динамическое равновесие в системе меченый пептид-рецептор установилось примерно через 1ч. Дальнейшая инкубация не увеличивала специфическое связывание [3Н]ИМК (кривая 2). Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (АГа) реакцию связывания [3Н]ИМК с мембранами проводили в течение часа. Неспецифическое связывание [3Н]ИМК в этих условиях составляло 14,6% от величины его общего связывания.

График Скетчерда (Рис.2б) показывает, что

[3Н]ИМК с высоким сродством взаимодействует с одним типом участков связывания (рецепторов) на мембранах коры надпочечников (Кл комплекса [3Н]ИМК - рецептор составила 2.1 нМ).

Для характеристики специфичности связывания

[3Н]ИМК в качестве потенциальных конкурентов были протестированы немеченые АКТГ (4-10), АКТГ (1-24), соматостатин, р-эндорфин и [Ме1!]энкефалин. Результаты, представленные в табл.1., показывают, что только АКТГ (1-24) мог ингибировать специфическое связывание ИМК с мембранами коры надпочечников крыс: К\ 1.3. Ингибиторная активность других пептидов была очень низкой.

Таким образом, ИМК связывается с высоким сродством и специфичностью с рецептором АКТГ на мембранах коры надпочечников крыс, и воздействие ИМК на секрецию кортикостероидов может быть опосредовано через этот рецептор.

0,25-, 0,200,150,100,050,00-0,0

Рис. 2. (А) Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3Н]ИМК с мембранами коры надпочечников крысы от времени инкубации. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием. (Б) Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3Н]ИМК с мембранами коры надпочечников крысы (В и Г - молярные концентрации связанного и свободного меченых пептидов соответственно).

б

—,-• | • |->-I-■-I

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

В,нМ

Таблица 1. Ингибирование специфического связывания [3Н]ИМК с мембранами коры надпочечников крысы немечеными пептидами

Пептид 1и К,

нМ ± стандартное отклонение

АКТГ(1-24) 43 ± 0.1 13 ± 0.1

АКТГ(4-10) >10000 >10000

Соматостатин >10000 >10000

р-Эндорфив >10000 >10000

(МеГ^энкефялнн >10000 >10000

Также нами был синтезирован октапептид ЛКТ, который соответствовал АКТГ -подобной последовательности 81-88 р1Ь- 1а и имел 80% гомологии с фрагментом АКТГ 10-18 (Рис.3).

1 10 1В 39

АКТГ ЗУЗМЕНГКТСКРТСКККНРУКУУРОСЕАЕОЗАЕАГРЪЕЕ*

Ллйкокортикотропмн вКУБИОЖ

Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей АКТГ и ЛКТ.

Мы получили [3Н]ЛКТ и изучили его связывание с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы.

Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях [3Н]ЛКТ специфически связывается с мембранами коры надпочечников крысы. На рис. 4а показана зависимость величины общего (кривая 1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [ЭН]ЛКТ с мембранами при 4°С от времени инкубации. Видно, что динамическое равновесие в системе меченый пептид - рецептор устанавливалось примерно через 1 ч и сохранялось не менее 2 ч. Поэтому для определения величины равновесной константы диссоциации (К<д реакцию связывания [3Н]ЛКТ с мембранами проводили в течение 1 ч. Неспецифическое связывание [3Н]ЛКТ в этих условиях составляло 8,4 ± 1,6 % от величины его общего связывания.

Анализ специфического связывания [3Н]ЛКТ с мембранами коры надпочечников крысы в координатах Скэтчарда (рис. 46, график 1) показывает, что на мембранах коры имеется один тип участков связывания (рецепторов) этого пептида - график представляет

собой прямую линию. Величина Кй, равная 2,2 ± 0,1 нМ, свидетельствует о высоком сродстве ЛКТ к рецептору. Максимальная связывающая способность мембран - Втах -составила 1,064 ± 0,128 пмоль/мг белка.

Для характеристики специфичности выявленных рецепторов в качестве потенциальных конкурентов [3Н]ЛКТ были протестированы немеченые АКТГ (1-24), АКТГ (11-24), АКТГ (4-10), соматостатин, р-эндорфин, [Ме^]энкефалин.

Результаты экспериментов приведены в табл. 2. Видно, что только АКТГ (1-24), АКТГ (И-24) ингибировали специфическое связывание [3Н]ЛКТ, соответствующие значения К\ - 1,7 ± 0,1 и 1,9 ± 0,2 нМ. Таким образом, выявленные рецепторы являются общими для АКТГ и ЛКТ.

Таблица 2. Ингибирование специфического связывания [3Н]ЛКТ с мембранами коры надпочечников крысы немечеными пептидами

Пептид 150 К,

нМ ± стандартное отклонение

АКТГ(1-24) 5.6 ± 0.2 1.7 ±0.1

АКТГ(11-24) 6.2 ± 0.3 1.9 ±0.2

АКТГ(4-10) >10000 >10000

Соматостатин >10000 >10000

р-Эидорфип >10000 >10000

[Ме^]энкефалин >10000 >10000

300001

100 120 Время, мин.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,$

В, нМ

Рис. 4. (А) Зависимость общего (I), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3Н]ЛКТ с мембранами коры надпочечников крысы от времени инкубации. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием. (Б) Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3Н]ЛКТ (I) и 1И1-меченого АКТГ (11-24) (2) с мембранами коры надпочечников крысы (Вир- молярные концентрации связанного и свободного меченых пептидов соответственно).

Анализ специфического связывания ш1-меченого АКТГ (11-24) с мембранами коры надпочечников в координатах Скэтчарда (рис. 46, график 2) показал, что меченый пептид взаимодействует с одним типом рецепторов: К^ - 1,8 ± 0,1 нМ. В^ - 1,056 ±0,116 пмоль/мг белка. Результаты инигибирования специфического связывания П51-меченого АКТГ (11-24) немечеными ЛКТ, АКТГ (1-24), АКТГ (4-10), соматостатином, р-эндорфином и [МеГ1 ]энкефалином, приведенные в табл. 3, показывают, что только ЛКТ и АКТГ (1-24) обладали хорошо выраженной ингибирующей активностью: соответствующие значения К) - 2,0 ± 0,1 и 1,9 ± 0,1 нМ. Остальные пептиды были неактивны, К(> 10 мкМ. Полученные результаты свидетельствуют о способности ЛКТ и АКТГ(11-24) с высоким сродством связываться с рецептором АКТГ на мембранах коры надпочечников крысы.

Таблица 3. Ингибирование специфического связывания ,г51-меченого АКТГ(11-24) с мембранами коры надпочечников крысы немечеными пептидами

Пептид 150 К.

нМ ± стандартное отклонение

ЛКТ 7.6 ±0,2 2.0 ±0.1

АКТГ(1-24) 7.2 ±0.2 1.9 ± 0.1

АКТГ(4-Ю) >10000 >10000

Соматостатнн >10000 >10000

0-Эндорфнн >10000 >10000

|Ме^]энкефалин >10000 >10000

2. Влияние иммунокортина, лейкокоргикотропнна и АКТГ (11-24) на аденилатциклазиую активность мембран коры надпочечников крысы

Результаты, приведенные в табл.4., показывают, что ИМК и тестированный параллельно АКТГ (1-24) к концентрации 1-1000 нМ увеличивают аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крыс. Наиболее эффективной оказалась доза ИМК и АКТГ (1-24), равная 100 нМ, приводившая к 55% и 66% росту активности, соответственно. Увеличение концентраций обоих пептидов (1000 нМ) не влечет за собой рост активности аденилатциклазы.

Таблица 4. Влияние ИМК на аденилатдиклазную активность мембран коры надпочечников крысы

Концентрация пептцда нМ Аденилатциклазная активность, нмоль цАМФ на 1 мг белка за 10 мин ± стандартное отклонение

ИМК

0 1.43 ±0.12

0,1 1.46 ± 0.13

1 1.69 ± 0.15

10 2.13 ±0.18

100 2.22 ± 0.16

1000 2.19 ±0.18

Результаты, представленные в табл. 5, показывают, что при концентрациях 1 -1000 нМ ЛКТ и АКТГ (11-24) не влияли на аденилатциклазяую активность мембран коры надпочечников крысы.

Следовательно, как ЛКТ, так и АКТГ (11-24) являются антагонистоми рецептора АКТГ.

Таблица 5. Влияние ЛКТ, АКТГ(1-24) и АКТГ(11-24) на аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы

Концентрация пептида нМ Аденилатциклазная активность, нмоль цАМФ на 1 мг белка за 10 мин ± стандартное отклонение

ЛКТ АКТГ(1-24) АКТГ(11-24)

0 1.43 ± 0.12 1.43 ± 0.12 1.43 ±0.12

0.1 1.46 ± 0.13 1.44 ± 0.15 1.48 ±0.12

1 1.46 ± 0.15 1.82 ± 0.17 1.54 ±0.18

10 1.43 ±0.18 2.23 ±0.19 1.50 ±0.14

100 1.52 ± 0.16 2.38 ±0.21 1.43 ± 0.12

1000 1.41 ± 0Л8 236 ±0.17 1.49 ± 0.12

3. Влияние АКТГ- подобных пептидов на уровень

И-окснкортикостероидов (КС) в надпочечниках крысы in vivo.

■ i..

До недавнего времени действие ИМК исследовалось в основном в экспериментах in vitro, и практически не изучено их влияние на важные биохимические системы на уровне целого организма, т.е. в экспериментах in vivo.

Было изучено влияние этого пептида' на уровень КС в коре надпочечников лабораторных животных при разных термических воздействиях in vivo.

Согласно данным, приведенным на рис. 5, содержание КС в надпочечниках крыс в отсутствие термического воздействия составляло в среднем 115 мкг/г ткани. У крыс, подвергнутых холодовому шоку, этот показатель возрастал в 2,4 раза (Рис. 5а), а тепловому - в 3 раза (рис.5б).

ИМК при троекратном интраназальном введении в дозе 20 мкг/животное практически не влиял на уровень КС в надпочечниках крыс в покое (Рис.5). В то же время, в условиях как холодового, так и теплового шока ИМК отменял резкое возрастание содержания КС в надпочечниках (Рис.5).

Поскольку известно, что ИМК с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором АКТГ на мембранах коры надпочечников крыс (Рис. 2) и увеличивает аденилатциклазную активность этих клеток (Табл. 4), можно предположить, что воздействие ИМК на секрецию кортикостероидов при термических воздействиях опосредовано через рецептор АКТГ.

250

200

150

а

100

Ч.

Контроль ИМК Контроль ИМК

J V.

Покой

Холодовой шок

Контроль ИМК Контроль ИМК

-уПокой

У Ч.

-У-

Тепловой шок

Рие. 5. Влияние ИМК на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс линии ЭЭ в отсутствие термического воздействия, при холодовом (А) и при тепловом шоке (Б). Пептид вводили интраназально в дозе 20 мкг/животное троекратно за 3, 2 и 1 сутки до шока.

AK IT

S YSMEH FRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAED E SAEAFPLEF

«i

too

HproIL-la(81-109) -GK-VLKKRRLSLSQSITDDDLEAIANDSEA-

100

MproIL-la(81-109) -GK-1LKKRRLS FS ET FT E DDLQSITH DLEA-

40

100

BproIL-la(81-109) -GK-ILKKRRLSLNQPITDVDLETNVSDPEL-

i

ЛКТ

GK-VLKKRR

Рис, 6. Сравнение аминокислотных последовательностей АКТГ человека, фрагментов предшественников интерлейкина-lcc человека, мыши, крысы и ЛКТ. Совпадающие аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

Сравнение аминокислотных последовательностей показывает, что наибольшую степень подобия с АКТГ (фрагментом 10-18) имеет фрагмент 81-88 pIL-la человека (последовательность ЛКТ).

Было изучено влияние ЛКТ на уровень КС в коре надпочечников крыс при разных термических воздействиях in vivo. Действие ЛКТ было сходным с действием ИМК (рис.5). ЛКТ при троекратном интраназальном введении в дозах 10-20 мкг/животное практически не влиял на уровень КС в надпочечниках крыс в покое (данные не приведены). В то же время, в условиях как холодового, так и теплового шока ЛКТ отменял (доза 20 мкг/животное троекратно) или значительно снижал (доза 10 мкг/животное троекратно) резкое возрастание содержания КС в надпочечниках, вызванное термическим воздействием (данные не приведены).Результаты исследования влияния ЛКТ на уровень КС в надпочечниках крыс in vivo свидетельствуют в пользу того, что при процессинге pILla наряду с активатором оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники IL-1 образуется АКТГ-подобной пептид - антагонист рецептора АКТГ, способный ингибировать ось.

Для связывания и активации рецептора АКТГ имеет большую важность его фрагмент 15-18 (KKRR). Поэтому для наших экспериментов мы использовали фрагмент АКТГ(15-18) - KKRR и его модифицированные аналоги - KKRRLLLL, LLKKRRLLLL и ac-KKRR-NH2. Действие этих пептидов в покое и при холодовом воздействии в дозах 10 и 20 мкг/животное было сходным с действием ИМК и ЛКТ. Но было замечено, что ac-KKRR-NH2 в дозе 10 мкг/животное не только значительно снижал резкое возрастание содержания КС в надпочечниках, вызванное термическим воздействием, а полностью его отменял (Рис. 7а).

280240-

200<

400

Контроль Пмтгмды Контроль ККИЯ КККНШХ иККР(Р!1-Ш_ «.ККР№1-МН2

Покой

Холодовой шок

2701 240210* 1804 ф

I £ 1воЧ I ^

5. а 120 %

3 90 60

30

о

Контроль

Холод, шок

Холод, шок + ас-ИКРИ-ИНг

Рис. 7. Влияние ККЛК, КЮШХ1Х, ШНСНЫНХ и ас-ККЯЯ^Н2 на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс линии в отсутствие термического воздействия и при холодовом шоке. Пептид вводили интраназально в дозе 10 мкг/животное (А) троекратно за 3, 2 и 1 сутки и 2 мкг/животное (Б) однократно за 1 сутки до шока.

Основываясь на этих данных, мы протестировали ac-K.KRR.-NH2 на модели холодового шока в более низких дозах. Доза 2 мкг/животное была признана наиболее оптимальной. Полученные результаты показывают (Рис. 76), что пептид в этой дозе при однократном введении за сутки до холодового воздействия полностью отменял возрастание уровня КС , вызванное стрессом.

4. Влияние АКТГ- подобных пептидов на систему гистамин - диамнноксцдаза миокарда крыс при различных стрессовых факторах /и ^¡'уо.

Особое значение для адаптации организма к функциональным перегрузкам придается состоянию сердечно-сосудистой системы, для нормального функционирования которой необходима устойчивость системы гнетами н-диамнно ксидаза. В связи с этим исследовалась способность наших пептидов поддерживать на стационарном уровне систему гнетам и н-диам иноксидаза в миокарде крыс, подвергнутых воздействию различных экстремальных факторов.

В табл. 6 представлены результаты воздействия холодового шока на активность диаминоксидазы и уровень гистамина (контрольные значения взяты за 100%).

Таблица 6. Влияние имунокортина в дозе 20 мкг/животное на изменение содержания гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде крыс а покое н при холодовом шоке, % от нормы.

Воздействия Уровень гистамина Активность ДАО Коэффициент соотношения гнетами н/ДАО

Контроль (покой) 100 100 1,00

Опыт (покой) 103 96 1,07

Контроль (холодовое воздействие) 110 37 2,97

Опыт (холодовое воздействие) 91 99 0,92

Содержание гистамина у контрольных животных в покое составляло 3,5 мкг/г ткани, а активность фермента ДАО - 37,2 ± SEM мкг/ч/г.

Так, основная роль в реакции этой системы при холодовом воздействии принадлежит ферментному компоненту; активность фермента понижалась и составляла лишь около 1/3 от нормы, тогда как в отношении содержания свободного гистамина наблюдали лишь тенденцию к увеличению. В результате этого значение коэффициента,

характеризующего отношение между содержанием свободного гнстамина н активностью ДАО, в сердечной мышце у опытных животных было значительно выше, чем значение этого коэффициента у животных контрольной группы. Профилактическое введение животным ИМК предотвращало столь резкое падение активности фермента и понижало уровень свободного гнстамина, в связи с чем исследуемые показатели системы гистамин-ДАО были такими же, как у контрольных животных.

Стрессовый фактор, противоположный холодовому воздействию, - тепловое воздействие - затрагивал как уровень гнстамина, так и активность фермента, И в этом случае ИМК приводил оба этих значения к норме (Табл.7).

Таблица 7. Влияние иммунокортина в дозе 20 мкг/животаое на изменение содержания гнстамина и активности диаминоксидазы в миокарде крыс в покое и при тепловом шоке, % от нормы.

Воздействия Уровень гнстамина Активность ДАО Коэффициент соотношения гистамин/ДАО

Контроль (покой) 100 100 1,00

Опыт (покой) 101 98 1,03

Контроль (тепловое воздействие) 120 160 0,75

Опыт (тепловое воздействие) 101 110 0,92

Содержание гнстамина у контрольных животных в покое составляло 3,5 мкг/r ткани, а активность фермента ДАО - 37,2 ± SEM мкг/ч/г.

Обращаясь к табл. 7., мы видим увеличение как уровня гнстамина, так и активности фермента, но в случае ферментной компоненты это увеличение больше, что следует рассматривать как защитную реакцию организма на действие высокой температуры. Предварительное введение ИМК и в этом случае воздействовало на систему гнетам и н-ДАО, нормализуя уровень гнстамина и снижая активность ДАО.

Действие JIKT в покое, при холодовом и тепловом воздействиях в дозе 10 н 20 мкг/животное (данные не приведены) было сходным с действием ИМК (Табл. 7). ЛКТ предотвращал столь резкое падение ДАО при холодовом токе и снижал при тепловом, а также нормализовал уровень амина в сердечной мышце при разных термических воздействиях.

Изучив влияние фрагмента АКТГ(15-18) - КККК и его модифицированных аналогов - ККЮШХЦ ЬЬККЯтХЬ и ас-ККЛЯ-КИг в дозе 10 и 20 мкг/животное, мы увидели, что все пептиды в большей дозе увеличивали активность фермента, приводя её показатель в норму и в разных дозах нормализовали уровень амина (данные не приведены). В дозе 10 мкг/животное пептиды повышали активность фермента при холодовом воздействии, но показатель был ниже контрольного значения. И только ac-K.KRR.-NH2 как в большей, так и в меньшей дозе предотвращал снижение активности ДАО, и её значение не отличалось от контрольного (данные не приведены).

Основываясь на этих данных, мы протестировали ас-ККЛК-ЫШ на модели холодового шока в более низких дозах. Доза 2 мкг/животное была признана наиболее оптимальной. Полученные результаты показывают (Табл.8), что пептид в этой дозе при однократном введении за сутки до холодового воздействия предотвращал резкое падение активности фермента и понижал уровень свободного гистамина, в связи с чем исследуемые показатели системы гистамин-ДАО были такими же, как у контрольных животных.

Таблица 8. Влияние ас-ККИЯ-ЫШ в дозе 2 мкг/животное при однократном введении на изменение содержания гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде крыс, при холодовом шоке, % от нормы.

Воздействия Уровень гистамина Активность ДАО Коэффициент соотношения гистамин/ДАО

Контроль (покой) 100 100 1,00

Контроль (холодовое воздействие) 108 36 3,00

Опыт (холодовое воздействие) 96 96 1,00

Содержание гистамина у контрольных животных в покое составляло 3,5 мкг/г ткани, а активность фермента ДАО - 38,3 ± SEM мкг/ч/г.

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что исследуемые пептиды способны нормализовать биохимические показатели функционального состояния миокарда крыс, подвергнутых стрессорному воздействию.

5. Влияние иммунокортнна, лейкокортикотропина н АКТГ(11-24) на бласт-трансформацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro Было изучено влияние ИМК на пролиферацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Для митогенной стимуляции Т-клеточноЙ популяции селезёнки использовали лектин Конканавалин А (Кон А) (5мкг/мл), В-клетки активировали бактериальным липополисахаридом (ЛПС) (20 мкг/мл). Контролем служили пробы без митогена и пептида, а также с митогеном, но без пептида. Результаты показали, что ИМК в диапазоне концентраций 10'7-I0'J М увеличивает пролиферативный ответ Т -лимфоцитов к Кон А. Максимальный эффект наблюдался в дозе I0'5 М и был в 2 раза выше, по сравнению с контролем (Рис. 8).

лГ S 2,0-

3 i 1,8-

® о

£ 1

£1 i.e.

¡5 1.4-

и

1 1.2-

1,0-

10

10

10* 10"* [Иммунокортин], М

Рис. 8. Влияние иммунокортина на пролиферацию Конканавалин А стимулированных лимфоцитов селезенки крысы. Приведены средние значения ± SEM трех независимых экспериментов.

Кроме того, мы изучили влияние ИМК на ЛПС - индуцированную пролиферацию В-лимфоцитов селезёнки. Было показано, что как и в случае с Кон А - индуцируемой пролиферацией лимфоцитов, этот пептид вызывает увеличение пролиферативного ответа В-лимфоцитов в диапазоне концентраций 10"8-! О"6 М (Рис. 9).

i;

и

2 °

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

—г ""I-I-l l-I-I 11-I i

10"* 10- 10"* 10"? 10*

[Иммунокортмн], M

Рис. 9, Влияние иммунокортина на пролиферацию лимфоцитов селезенки крысы, стимулированных ЛПС Salmonella typhi. Приведены средние значения ± SEM трех независимых экспериментов.

Максимальный эффект наблюдался в дозе 10"6 М и был в 2 раза больше по сравнению с контрольным значением. Кроме того, при концентрациях ИМК 5x10"® и 10'5М наблюдалось снижение уровня пролиферации В-клеток. Более высокие концентрации пептида не изучали, поскольку они не являются физиологическими.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что ИМК активировал как Т-лимфоциты, так и В-клетки селезенки крысы.

Также мы изучили влияние ЛКТ и АКТГ(11-24) на стимулирующее действие ИМК. Проведённые эксперименты показали, что ИМК в диапазоне концентраций Ю'МО"6 М увеличивает пролиферацию Кон А-стимулированных лимфоцитов селезёнки крысы. ЛКТ и АКТГ(11-24) в диапазоне физиологических концентраций не влияли на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов к митогену (данные не приведены). Поскольку известно, что ЛКТ и АКТГ(И-24) конкурируют с АКТГ за связывание с рецептором на перитонеальных макрофагах мыши было изучено влияние этих пептидов в концентрации Ю-4 М на стимулирующее действие ИМК (Ю'МО"6 М).

Было показано, что предынкубация в течение 1 ч с обоими пептидами приводила к ингибированию стимулирующего действия ИМК (Рис. 10). Таким образом, ЛКТ и АКТГ(11-24) проявляли свойства антагонистов.

25000-.

20000-

5 15000-

£1 S S

s s

ЭС <D T

2 §

Ш

10000-

5000-

Комтроль Контроль jyj IQ^M Кон A „

Иммунокортин Иммунокортин Иммунокортин

10"7M 10* M 10ТМ 10"* M

AKTF(11-24)

—v—

ЛКТ

Plie. 10, Влияние ЛКТ и АКТГ(11-24) в концентрации 10"4М на способность иммунокортина стимулировать пролиферацию Кон А стимулированных лимфоцитов селезенки крысы. Приведены данные одного из двух независимых экспериментов.

Результаты, приведенные на рисунке, свидетельствуют о том, что хотя, ЛКТ и АКТГ(11-24) не оказывают никакого стимулирующего действия на спленоциты, но выступая в качестве конкурирующих пептидов, блокируют активирующий эффект ИМК. Кроме того, т.к. известно, что фрагмент АКТГ(11-24) является "адресным", т.е. необходим для связывания с рецептором, можно полагать, что действие ИМК опосредовано через рецептор АКТГ.

Выводы

1. Обнаружено, что иммунокортин с высоким сродством и специфичностью связывается

с рецептором АКТГ на мембранах коры надпочечников крыс и увеличивает аденилатциклазную активность этих клеток,

2. Воздействие иммунокортина, АКТГ (15-18) и его модифицированных аналогов на секрецию кортикостероидов ш vivo при термических воздействиях опосредовано через рецептор АКТГ.

3. Воздействие лейкокортикотропина на секрецию кортикостероидов in vivo при термических воздействиях связано с тем, что при процессинге pIL-lct наряду с активатором оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники IL-1 образуется АКТГ-подобной пептид - антагонист рецептора АКТГ, способный ингибировать ось.

4. Установлено, что исследуемые пептиды способны нормализовать биохимические показатели функционального состояния миокарда крыс, подвергнутых стрессорному воздействию.

5. Показано, что АКТГ- подобный пептид иммунокортин стимулирует пролиферацию Т и В лимфоцитов селезёнки in vitro, и этот эффект опосредован через рецептор АКТГ,

Слисок научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Е.В. Наволоцкая, В.И. Ванина, Т.А. Заргарова, E.H. Гончаренко.Н.Ю. Кудряшова, М.Я. Ахалая, В.Б. Садовников, С.Г, Семущина, A.A. Колобов, ЕЛ. Кампе-Немм, В.В. Юровский, В.М. Липкин. Влияние АКТГ - подобного пептида иммунокортина на активность клеток коры надпочечников крысы. Биоорганическая химия, 2004, т.ЗО, № 4, с. 350-355

2. Е. V. Navolotskaya, V. I. Vanina, Yu, A. Zolotarev, N. Yu. Kudryashova,

E. N. Goncharenko, A. A. Kolobov, E. A. Kampe-Nemm, V. V. Yurovsky, V. M. Lipkin Synthetic Peptide Immunocortin Stimulates the Production of Il-Oxycorticosteroides by Rat Adrenal Cortex through ACTH Receptors, Regulatory Peptides 119 (2004) 99-104

3. В.И. Ванина, Ю.А. Ковалицкая, A.A. Колобов, E.A. Кампе-Немм, Ю.А. Золотарев, В.В. Юровский, В.М. Липкин, Е.В. Наволоцкая. Исследование стресс - протекторной активности синтетического АКТГ-подобного пептида лейкокортикотропина. Биоорганическая химия, 2006, т.32, № 5, с. 1 -8

4. В.И. Ванина, С.Г, Семушина, Е.В. Наволоцкая, В.М. Липкин. Иммуномодулирующая активность пептидов с кортикотро пин подобной структурой. Материалы V Съезда иммунологов и аллергологов СНГ (8-11 июля 2003 г., г. Санкт-Петербург, Россия). Аллергология н иммунология, 2003, Т. 4(2), С. 76.

5. В.И. Ванина, Е.В Навололоцкая. Стресс - протекторная активность кортикотропинподобного пептида лейкокортикотропина. Всероссийская конференция молодых исследователей "Физиология и медицина", Санкт-Петербург, 14-16 апреля 2005 г., с.19

6. В.И. Ванина, В.Б, Садовников, A.A. Колобов, Е.А. Кампе-Немм, Е.В Навололоцкая. Исследование стресс-протекторной АКТГ (11-24) и АКТГ - подобных пептидов иммунокортина и лейкокортикотропина. Первый Международный Междисциплинарный Конгресс "Достижения нейронауки доя современной медицины и психологии". Судак, Крым, Украина, 10-21 июня, 2005 г., с. 53

Принято к исполпеиию 26/10/2006 Исполнено 27/10/2006

Заказ № 814 Тираж: 70 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ванина, Вера Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Влияние интерлейкина-1 на ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники.

1. Концепция двунаправленного взаимодействия между иммунной и эндокринной системами.

2. Ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники.

2.1. Организация оси ГГН.

2.2 Экспериментальная оценка секреторной активности оси ГГН.

3. Цитокины.

3.1. Цитокины и семейство цитокиновых рецепторов.

3.2. IL-1, IL-6 и TNF-a.

4. Влияние цитокинов на секреторную активность ГГН оси ш vivo.

4.1. Исследования на животных.

4.2. Исследования на человеке.

5. Механизмы активации оси ГГН интерлейкином-1.

5.1. Непосредственные воздействия на гипофиз и надпочечники.

5.2. Проникновение цитокинов в мозг.

5.2.1. Цитокины и целостность гематоэнцефалического барьера.

5.2.2 Опосредованный переносчиками перенос цитокинов через гематоэнцефалический барьер.

6. Синтез цитокинов в мозге.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и механизм действия АКТГ-подобных пептидов иммунокортина и лейкокортикотропина"

Актуальность проблемы. Стресс - это одна из общих неспецифических нейрогуморальных реакций организма на действие "чрезвычайных" раздражителей (стрессоров), которая в основном определяется деятельностью гипоталамуса, гипофиза и коры надпочечников (8е1уе, 1950, 1956). Стресс имеет защитное значение и направлен на восстановление нарушенного гомеостаза. Патогенное действие любого агента включает в себя специфическое действие на ткань, неспецифическое местное действие и неспецифическое влияние, опосредованное через гипофиз-адреналовую систему. Усиление психоэмоциональной нагрузки, ухудшение экологической обстановки - все это приводит к возрастанию стрессорных воздействий и снижению адаптационных возможностей организма современного человека. Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессу - это важная и актуальная задача.

В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, рассматриваются как потенциальные лекарственные средства нового класса. Несомненными достоинствами пептидов являются быстрая реакция организма на их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты. К сожалению, полифункциональность пептидных гормонов является лимитирующим фактором их применения в качестве лекарственных препаратов. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидных гормонов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеплению. Основным регулятором ответа организма на стресс является адренокортикотропный гормон (АКТГ). В этой связи детальная характеристика свойств и механизма действия неизвестных ранее

АКТГ-подобных пептидов иммунокортина (VKKPGSSVKV) и лейкокортикотропина (GKVLKKRR) важна и актуальна. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение свойств и механизма действия активности АКТГ-подобных пептидов иммунокортина (ИМК) и лейкокортикотропина (ЛКТ).

Основные задачи исследования:

1. Изучение влияния ИМК и JIKT на пролиферацию Т и В лимфоцитов селезёнки крысы in vitro.

2. Получение [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и ,251-меченого АКТГ(11-24) и исследование связывания с мембранными фракциями коры надпочечников крысы.

3. Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТГ(15-18) и его модифицированных аналогов на уровень 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках крыс в покое, при холодовом и тепловом шоке in vivo.

4. Изучение влияния ИМК, ЛКТ, фрагмента АКТЦ15-18) и его модифицированных аналогов на систему гистамин - диаминоксидаза миокарда крыс при различных термических воздействиях in vivo.

Работа выполнена в лаборатории "Пептидных биорегуляторов" Филиала Инстиута биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в соответствии с планом научно - исследовательских работ.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что кортикотропинподобные пептиды: ИМК, соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжелой цепи иммуноглобулина G (Н-цепи IgGl) человека, и ЖТ, соответствующий фрагменту 81-88 предшественника интерлейкина-1а (pIL-la) человека, быка, кролика и мыши, - обладают стресс-протекторной активностью.

Установлено, что ИМК, JIKT, фрагмент АКТЦ15-18) и его модифицированные аналоги снижают уровень КС при термических воздействиях, а также коррегируют систему гистамин - диаминоксидаза (ДАО) как при холодовом, так и при тепловом шоке.

Также обнаружено, что ИМК увеличивает пролиферацию митоген-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Показано, что это действие иммунокортина опосредовано через рецептор АКТГ.

Приоритетными являются результаты исследования с помощью [3Н]ИМК, [3Н]ЛКТ и 1251-меченого АКТГ(11-24) G-белок-связанного рецептора АКТГ (меланокортин-2 рецептор, MC2R) на мембранах коры надпочечников крысы.

Практическая ценность результатов работы. В настоящее время решением одной из важнейших задач современных биологии и медицины является создание новых эффективных и безопасных средств, повышающих устойчивость организма к стрессу. Поэтому такое свойство ИМК и JIKT, как способность усиливать адаптационные возможности организма при действии различных экстремальных факторов, может привлечь внимание фармакологов и клиницистов.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. АКТГ- подобный пептид ИМК увеличивает пролиферацию митоген-стимулированных Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы in vitro. Показано, что ЛКТ и АКТГ( 11-24), не оказывая никакого стимулирующего действия на спленоциты, блокируют активирующий эффект ИМК, выступая в качестве конкурирующих пептидов.

•5 о

2. Меченые [ТЦИМК и [/Н]ЛКТ с высоким сродством и специфичностью связываются с G-белок-связанными рецепторами АКТГ на мембранах коры надпочечников крысы.

ИМК, ЛКТ, фрагмент АКТГ(15-18) и его модифицированные аналоги снижают уровень КС при термических воздействиях, а также коррегируют систему гистамин - ДАО как при холодовом, так и при тепловом шоке.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ванина, Вера Ивановна

выводы

Показано, что АКТГ- подобный пептид иммунокортин стимулирует пролиферацию Т и В лимфоцитов селезёнки in vitro, и этот эффект опосредован через рецептор АКТГ.

Обнаружено, что иммунокортин с высоким сродством и специфичностью связывается с рецептором АКТГ на мембранах коры надпочечников крыс и увеличивает аденилатциклазную активность этих клеток. Воздействие иммунокортина, АКТГ (15-18) и его модифицированных аналогов на секрецию кортикостероидов in vivo при термических воздействиях опосредовано через рецептор АКТГ.

Воздействие лейкокортикотропина на секрецию кортикостероидов in vivo при термических воздействиях связано с тем, что при процессинге pIL-la наряду с активатором оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники IL-1 образуется АКТГ-подобной пептид - антагонист рецептора АКТГ, способный ингибировать ось.

Установлено, что исследуемые пептиды способны нормализовать биохимические показатели функционального состояния миокарда крыс, подвергнутых стрессорному воздействию.

Заключение

Основополагающие открытия Беседовского и Блалока продемонстрировали, что IL-1 является важным эндогенным регулятором оси ГГН. В настоящее время известно, что множество цитокинов способно оказывать аналогичное влияние.

Цитокиновые рецепторы были обнаружены во многих нейроэндокринных тканях.

Общепризнанным является тот факт, что влияние на ось ГГН происходит не только извне - цитокины не только попадают в ЦНС с кровью, но и синтезируются в мозге и надпочечниках. Афферентные нейроны, наподобие представленных в блуждающем нерве, также могут быть целью цитокинов - они передают информацию о воспалении в мозг.

Наконец, в последнее время выдвигают предположение, что цитокиновая регуляции оси ГГН может происходить не только во время инфекционного заболевания, воспаления или в результате травмы, но также под действием физических и психологических стрессов независимо от наличия вышеперечисленных общепризнанных факторов.

Очевидно, что гипофиз и надпочечники представляют собой потенциальные мишени для цитокинов (когда данные органы подвержены продолжительному влиянию их повышенной концентрации), однако большинство данных показывает, что и прямая, и косвенная стимуляция секреции КРГ в гипоталамусе является основным средством, с помощью которого цитокины (как минимум 1Ь-1,1Ь-6 и Т№-а) активируют ось ГГН.

Существует множество различных механизмов воздействия ГЬ-1 на ось ГГН. В случае, когда уровень 1Ь-1 повышается эндогенно (в отличие от экзогенного введения), механизмы активации сильно зависят от анатомического положения тканей и жидкостей, в которых наблюдается значительное повышение концентрации 1Ь-1 (кровь, периферийная ткань, мозг), однако в реальных условиях трудно выделить одного конкретного виновника. Например, при локальном воспалении, когда уровень 1Ь-1 повышается только в поврежденных тканях, механизм воздействия с помощью афферентных нейронов кажется наиболее подходящим кандидатом на роль активатора оси ГГН. Однако, 1Ь-1 активизирует секрецию ГГ-6, который получает доступ к кровотоку, таким образом, хотя бы частично оказывая влияние на ось ГГН. Ситуация еще больше усложняется, так как ни один из предлагаемых механизмов активации не принимает во внимание тот факт, что выделение лишь одного цитокина в ответ на угрозу гомеостазису является очень маловероятным, а систематических исследований, посвященных одновременному влиянию множества цитокинов на ось ГГН (например, 1Ь-1 и 1Ь-б), не проводилось.

Вероятно, наиболее важным результатом огромного количества исследований, посвященных механизму активации 1Ь-1 оси ГГН, является установление существования большого разнообразия способов иммунонейроэндокринного взаимодействия. Это разнообразие дает уверенность, что факт возникновения угрозы клетке, ткани или всему живому организму будет тем или иным способом доведен до оси ГГН.

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 1. Материалы и методы 1. Реактивы

В работе использовали АКТГ(4-10), АКТГ(1-24), соматостатин, ß-эндорфин и [МеР]энкефалин («Sigma», США), кортикостерон (ICN, США), гидрокортизон ((«Sigma», Германия), гистамин (ICN, США), Конканавалин А (Кон A) (ICN, США), липополисахарид Salmonella typhi (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАН), L-глутамин, Hepes, гентамицин, среду для культивирования клеток RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), 1,3,4,6-тетрахлор-3а,6а-дифенилгликоурил (иодоген), сахарозу, БСА, ЭДТА, ЭГТА, Tris, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), азид натрия (NaN3) («Serva», Германия), N-метилпирролидон, диизопропилкарбодиимид, 1-гидроксибензотриазол, тиоанизол («Merck», Германия), сцинтиллятор Unisolv 100 («Amersham», Англия). Остальные реактивы имели квалификацию ос.ч. Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы Mono-Q (Millipore, США). i

Меченые соединения: [метил -TT] ти ми дин (удельная активность 76 Ки/ммоль), Na123I (удельная активность 2х106 Ки/моль) (Санкт-Петербургское отделение Российского объединения "Изотоп").

2. Экспериментальные животные

В работе использовали половозрелых крыс - самцов весом 180-210 г, полученных из питомника ФИБХ РАН (Табл.). Таблица 1. Линии подопытных крыс

Линия крыс

SD 1. Получение органов (надпочечники, сердце) для исследования стресс -протекторной активности пептидов. 2. Получение мембранных фракций из органов для рецепторных исследований, изучение функциональной активности коры надпочечников крысы.

3. Синтетические пептиды

Все пептиды были получены в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Пептиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе Vega Coupler, модель С250 (США), очищены до гомогенного состояния препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф Gilson, Франция, колонка Waters SymmetryPrep CI8, 19x300 мм, 7 мкм, скорость потока 10 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 10-40% за 30 мин). Синтезированные соединения охарактеризованы данными аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (хроматограф Gilson, Франция, колонка XTerra RP18, 125А0, 3,9x150мм, 5мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 1040%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Finnigan, США).

4. Методы выделения и оценки влияния пептидов на бласт-трансформацию Т- и В- лимфоцитов селезёнки крысы

4.1. Клеточные культуры

Спленоциты крысы выделяли по следующей схеме: животных подвергали декапитации, затем в стерильных условиях извлекали селезёнку и гомогенезировали в бессывороточной среде RPMI - 1640. Суспензию клеток центрифугировали в градиенте плотности среды для выделения лимфоцитов при 1000 об/мин в течение 30 мин для отделения эритроцитов, макрофагов и клеток жировой ткани. Затем отбирали клеточную суспензию, содержащую лимфоциты, отмывали однократно бессывороточной средой RPMI-1640 и помещали в среду для культивирования.

4.2. Оценка влияния пептидов на бласт-трансформацию Т- и В-лнмфоцитов по включению [метил-3Н]тимидина в клетки

Для определения влияния иммунокортина на бласт-трансформацию клеток селезёнки крысы in vitro в лунки планшета для культивирования клеток вносили по 1 мл суспензии клеток (2,5 х 106 клеток). Тестируемые клетки икубировали с пептидом в течение 1 ч, затем добавляли Кон А (5 мкг/мл) для стимуляции Т клеточной популяции. B-клетки активировали ЛПС (20 мкг/мл). Контролем служили пробы без митогена и пептида, а также с митогеном, но без пептида. Спленоциты культивировали в течение 72 ч при 37°С в атмосфере 5% С02. За 12 ч до окончания инкубации в каждую лунку о добавляли [метил- Н]тимидин (1 мкКи в каждую лунку). По окончании инкубации, содержимое каждой лунки переносили на стекловолокнистый фильтр GF/C (Whatman, Англия) и промывали 15-кратным объёмом охлаждённого физиологического раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика о

Beckman, США). Включение [метил- Н]тимидина рассчитывали по формуле:

Доля включения [метил-3Н]тимидина = (имп/мин в опыте)/(имп/мин в контроле).

Данные аминокислотного анализа (гидролиз 6 N HCl, 24 ч, 110°; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция): иммунокортин-Pro-0.94(l), Gly-0.97(1), Val-3.40(3), Lys-3.01(3), Arg~2.10(2), Ser-2.02(2); лейкокортикотропин - Gly 1.22, Val 1.00, Lys 2.92, Arg 2.10; АКТГ(11-24)- Pro 3.40, Gly 1.00, Туг 1.00, Val 2.78, Lys 4.62, Arg 1.40.

5. Методы изучения стресс - протекторного действия пептидов

Для эксперимента животных разделяли на группы - две контрольных и две опытных, по 10 животных в каждой. Контрольным группам вводили интраназально воду (20 мкл), а опытным пептид в разных дозах за 3, 2 и 1 сут. до термического воздействия. Сразу после термического воздействия животных подвергали декапитации.

Для создания модели холодового шока крыс выдерживали в течение 3 мин. в состоянии свободного плавания в кювете с водой при температуре 4°С. Для создания модели теплового шока крыс помещали в вентилируемую термокамеру при температуре 40°С на 1 ч.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ванина, Вера Ивановна, Пущино

1. Ахалая М.Я., Гончаренко Е.Н., Кудряшова Н.Ю. Влияние природного радиопротектора карнозина на систему гистамин-диаминоксидаза миокарда крыс после действия различных экстремальных факторов. // М. .-радиационная биология.Радиоэкология, 2001

2. Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии. // М.: Наука, 1981.277 с.

3. Лакин Г.Ф. Биометрия. // М.: Высш. шк. 1990. - 352 с.

4. Мещерякова С.А., Герасимова У.И. Флюориметрический метод определения содержания гистамина в крови и тканях. // Лабораторное дело, 1971, т.2, с. 103

5. Сиворакша Г.А., Сидельников Ю.Н. // Лаб. дело. 1991. № 2 С. 51-54

6. Юденфренд С.Ю. Флуориментрический анализ в биологии и медицине // М.: Мир, 1965. 580 с.

7. Albinus M., Sewing K.: Cardiovascular Effect Of Burimamide And Metiamide // Agent And Actions, 1974, Vol 4, 222

8. Alvarez-Mon M., Kehrl J.H., Fauci A.S. Potential Role For Adrenocorticotropin In Regulating Human В Lymphocyte Functions. // J. Immunol. 1985, 135, 3823-3826.

9. Argento-Ceru M., Sartori C., Autuori F. Diamine Oxidase In Rabbit Liver.// Europ. J. Biochem., 1973, Vol. 34, 2, 375

10. Arrang J-M. Pharmacological Properties Of Histamine Receptor Subtypes. //Cell Mol Biol 1994; 40: 273-279.

11. Atkins, E. Pathogenesis Of Fever. // Physiol. Rev. 40: 580-646, 1960

12. Banks, W. A., A. J. Kastin, And D. A. Durham. Bidirectional Transport Of Interleukin-1 Alpha Across The Blood-Brain-Barrier. // Brain Res. Bull. 23: 433-437, 1989.

13. Banks, W. A., A. J. Kastin, And E. G. Gutierrez. Penetration Of Interleukin-6 Across The Murine Blood-Brain-Bamer. // Neurosci. Lett. 179: 5356, 1994.

14. Banks, W. A., A. J. Kastin, And R. D. Broadwell. Passage Of Cytokines Across The Blood-Brain Barrier. //Neuroimmunomodulation 2: 241-248, 1995.

15. Banks, W. A., And A. J. Kastin. The Interleukin-1 , -1 , And -2 Do Not Acutely Disrupt The Murine Blood-Brain Barrier. Int. J. Immunopharmacol. 14: 629-636, 1992.

16. Banks, W. A., L. Ortiz, S. R. Plotkin, And A. J. Kastin. Human Interleukin (II) 1 , Murine II-1 And Murine II-1 Are Transported From Blood To Brain In The Mouse By A Shared Saturable Transport Mechanism. // J. Pharmacol. Exp.Ther. 259:988-996, 1991.

17. Bazzoni, F., And B. Beutler. The Tumor Necrosis Factor Ligand And Receptor Families. //N. Engl. J. Med. 334: 1717-1725, 1996.

18. Beall G, Histamine The View Today. // Calif. Med., 1967, Vol. 294, 1,30

19. Berkenbosch, F., J. Van Oers, A. Del Rey, F. Tilders, And H. Besedovsky. Corticotropin-Releasing Factor-Producing Neurons In The Rat Activated By Interleukin-1. // Science 238: 524-526, 1987.

20. Bernton, E. W., J. E. Beach, J. W. Holaday, R. C. Smallridge, And H. G. Fein. Release Of Multiple Hormones By A Direct Action Of Interleukin-1 On Pituitary Cells. // Science 238: 519-521, 1987.

21. Besedovsky H.O., Del-Rey A. // Endocrinol. Rev. 1996. V. 17. P. 64102.

22. Besedovsky, H. 0., A. Del Rey, I. Klusman, H. Furukawa, G. M. Arditi, And A. Kabiersch. Cytokines As Modulators Of The Hypothalamus-Pituitary-Adrenal Axis. //J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 40: 613-618, 1991.

23. Besedovsky, H., A. Del Rey, E. Sorkin, And C. A. Dinarello. Immunoregulatory Feedback Between Interleukin-1 And Glucocorticoid Hormones. 11 Science 233: 652-654, 1986.

24. Beuschlein F., Fassnacht M., Klink A., Allolio B., Reincke M. // Eur. J. Endocrinol. 2001. V. 144. P. 199-206.

25. Blalock, J. E., And J. D. Stanton. Common Pathways Of Interferon And Hormonal Action. // Nature 283: 406-408, 1980.

26. Blalock, J. E. Proopiomelanocortin-Derived Peptides In The Immune System. // Clin. Endocrinol. 22: 823-827, 1985.

27. Blalock, J. E. The Syntax Of Immune-Neuroendocrine Communication. //Immunol. Today 15: 504-511, 1994.

28. Breder C., Dinarello C., Saper C. // Science. 1988. V. 240. P. 321-324.

29. Brooks K.H. Adrenocorticotropin (Acth) Functions As A Late-Acting B Cell Growth Factor And Synergizes With Interleukin 5. // J. Mol. Cell. Immunol. 1990, 4,327-337.

30. Chang K-J., Jacobs S., Cuatrecasas P. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 406. P. 294-303.

31. Cheifetz, S., N. Ling, R. Guilleman, And J. Massague. A Surface Component On Gh3 Pituitary Cells That Recognizes Transforming Growth Factor-Activin And Inhibin. // J. Biol. Chem. 263: 17225-17228, 1988.

32. Cheng Y.C., Prusoff W. // Biochem. Pharmacol. 1973. V. 22. P. 30993108.

33. Clarke B.L., Bost K.L. Differential Expression Of Functional Adrenocorticotropic Hormone Receptors By Subpopulations Of Lymphocytes. // J. Immunol. 1989, 143, 464-9.

34. Cohen, M. C., And S. Cohen. Cytokine Function. A Study In Biological Diversity. //Am. J. Clin. Pathol. 105: 589-598, 1996.

35. Costa Jl, Bui S, Reed P, Dores Rm, Brennan Mb, Hochgeschwender U. // Gen Comp Endocrinol. 2004 Mar;136(l):12-6

36. Cote M, Paye M.D., Rousseau E., Guillon G, Gallo-Payet N. // Endocrinol. 1999. V. 140. P. 3594-3601.

37. Dallman M.F., Akana S.F., Jacobson L., Levin N., Cascio C.S., Shinsako J. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1987. V. 512. P. 402-414.

38. Darnay, B. G., And B. B. Aggarwal. Early Events In Tnf Signaling: A Story Of Associations And Dissociations. // J. Leukoc. Biol. 61: 559-566, 1997.

39. De Carli D., Castro-Vasquez A. Effect Of Histamine On Uterine Uptake Of Oestradiaol. //J. Endocrinol, 1971, Vol. 50, 3, 541

40. Dinarello, C. A, And R. C. Thompson. Blocking II-1: Interleukin-1 Receptor Antagonist In Vivo And In Vitro. // Immunol. Today 12: 404-410, 1991.

41. Dinarello, C. A. Interleukin-1 And Interleukin-1 Antagonism. // Blood 77: 1627-1652, 1991.

42. Eisenberg, S. P, R. J. Evans, W. P. Arend, E. Verderber, M. T. Brewer, C. H. Hannum, And R. C. Thompson. Primary Structure And Functional Expression From Complimentary Dna Of A Known Interleukin-1 Receptor Antagonist. //Nature 343: 341-346, 1990.

43. El-Aclcad T, Brody M. Evidence Of Non-Mast Cell Histamine In The Vascular Wall.//Blood Vessels, 1975, Vol 12, 3, 181

44. El-Ackad T., Meyer M., Sturkie P. Inotropic And Chronotropic Actions Of Histamine On The Avian Heart.// Fed. Proc., 1974, Vol 33, 3, 585

45. El-Ackad T., Sturkie P. Histamine In Blood And Tissue Of Aves.// Proc. Soc. Exp. Biol. And Med., 1972, Vol 141, 2, 448

46. Ericsson, A., M. Ek, And N. Lindefors. Distribution Of Prostaglandin E2 Receptor (Ep3 Subtype) Mrna Containing Cells In The Rat Central Nervous System. // Soc. Neurosci. Abstr. 21: 45.9, 1995.

47. Farrar W„ Kilian P, Ruff M, Hill J, Pert C. // J. Immunol. 1987. V. 139. P. 459-463.

48. Giotti A., Guidotti A. The Influences Of Adrenotropic Drugs And Noradrenaline On The Histamine Release In Cardiac Anaphylaxis In Vitro // J. Physiol, 1966, Vol. 184, 924

49. Gonsalkorale W.M, Dascombe M.J, Hutchinson I.V. Adrenocorticotropic Hormone As A Potential Enhancer Of T-Lymphocyte Function In The Rat Mixed Lymphocyte Reaction. // Int. J. Immunopharmac. 1995, 17, 197-206.

50. Goshen I, Yirmiya R, Iverfeldt K, Weidenfeld J. // Endocrinol. 2003. V. 144. P. 4453-4458.

51. Goverde FIj, Pesman Gj, Smals Ag. Major Contribution Of The Basic Amino Acid Lysine At Position 11 To The Bioactivity Of ACTFI In Purified Isolated Rat Adrenocortical Cells.//Biochem Biophys Res Commun. 1993 Feb 15;190(3): 1060-5.

52. Grahame-Smith D.G, Butcher R.W, Ney R.L, Sutherland E.W. // J. Biol. Chem. 1967. V. 242. P. 5535-5541.

53. Gutierrez, E. G, W. A. Banks, And A. J. Kastin. Blood-Borne Interleukin-1 Receptor Antagonist Crosses The Blood-Brain Barrier. // J. Neuroimmunol. 55: 153-160, 1994.

54. Gutierrez, E. G., W. A. Banks, And A. J. Kastin. Murine Tumor Necrosis Factor Alpha Is Transported From Blood To Brain In The Mouse. // J. Neuroimmunol. 47: 169-176, 1993.

55. Hansson R., Thysell H., The Effect Of Heparine And Some Related Agents On Diamine Oxidase In Rabbit Blood Plasma. // Acta Phyxsiol. Scand., 1970, Vol 78, 4, 539

56. Haynes R.C.Jr, Koritz S.B, Peron F.G. // J. Biol. Chem. 1959. V. 234. P.1421-1423.

57. Howlland R., Spector S. Disposition Of Histamine In Mammalian Blood Vessels. // J. Pharmacol. And Exp. Ther, 1972, Vol 182, 239

58. Ilyin, S. E., And C. R. Plata-Salaman. Hiv-1 Envelope Glycoprotein Gpl20 Regulates Brain II-1 Beta System And Tnf-Alpha Mrnas In Vivo. // Brain Res. Bull. 44: 67-73, 1997.

59. Itoi K., Jiang Y.Q., Iwasaki Y., Watson S.J. // Neuroendocrinol. 2004. V. 16. P. 348-355.

60. Jochem J. Involvement Of Proopiomenalocortin-Derived Peptides In Endogenous Central Histamine-Induced Reversal Of Critical Haemorrhagic Hypotension In Rats// Journal Of Physiology And Pharmacology 2004, 55, 1, 57.71

61. Johnson E.W., Blalock J.E., Smith E.M. ACTH Receptor-Mediated Induction Of Leukocyte Cyclic Amp. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 157, 1205-11.

62. Johnson E.W., Hughes T.K.Jr., Smith E.M. ACTH Receptor Distribution And Modulation Among Murine Mononuclear Leukocyte Populations. // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2001, 15, 156-62.

63. Johnson H.M., Downs M.O., Pontzer C.H. Neuroendocrine Peptide Hormone Regulation Of Immunity. // Chem. Immunol. Basel, Karger. 1992, 52, 49-83.

64. Johnson, H. M, B. A. Torres, E. M. Smith, L. D. Dion, And J. E. Blalock. Regulation Of Lymphokine (Gamma-Interferon) Production By Corticotropin. // J. Immunol. 132: 246-250, 1984.

65. Johnston B., Owen D., Histamine, Histamine Antagonists And Regional Blood Flow In Cats. // J Physiol., 1977, Vol 266, 1, 49

66. Julliard J.H., Shibasaki T., Ling N., Giullemin R. High-Molecular-Weight Immunoreactive ?-Endorphin In Extract Of Human Placenta Is A Fragment Of Immunoglobulin G. // Science. 1980, 208, 183-85.

67. Kapas S., Cammas F.M., Hinson J.P., Clark A.J. // Endocrinology. 1996. V. 137. P. 3291-3294.

68. Katahira M., Iwasaki Y., Aoki,Y., Oiso Y., Saito H. // Endocrinol. 1989. V. 139. P. 2414-2422.

69. Keane, K. M, D. A. Giegel, W. J. Lipinski, M. J. Callahan, And B. D. Shivers. Cloning, Tissue Expression And Regulation Of Rat Interleukin 1 Converting Enzyme. // Cytokine 7: 105-110, 1995.

70. Keller-Wood, M. E., And M. F. Dallman. Corticosteroid Inhibition Of ACTH Secretion. //Endocr. Rev. 5: 1-24, 1984.

71. Kishimoto, T., S. Alcira, M. Narazaki, And T. Taga. Interleukin-6 Family Of Cytokines And Gpl30. // Blood 86: 1243-1254, 1995.

72. Klir, J. J., J. L. Mcclellan, And M. J. Kluger. Interleukin-1 Causes The Increase In Anterior Hypothalamic Interleukin-6 During Lps-Induced Fever In Rats. // Am. J. Physiol. 266(Regulatory Integrative Comp. Physiol. 35): R1845-R1848, 1994.

73. Kluger, M. J. Fever: Role Of Pyrogens And Cryogens. // Physiol. Rev. 71:93-127, 1991.

74. Kobayashi Y. Histamine Binding By Heparine. // Arch. Biochem. And Biophys., 1962, Vol 96, 1,20

75. Kravchenco I.V., Furalev V.A. Secretion Of Immunoreactive Corticotropin Releasing Factor And Adrenocorticotropic Hormone By T- And B-Lymphocytes In Response To Cellular Stress Factors. // Biochem. Biophys. Research Communication. 1994, 204, 828-834.

76. Leurs R, Smit Mj, Timmerman H. Molecular Pharmacological Aspects Of Histamine Receptors. //Pharmac Ther 1995; 66: 413-463.

77. Levine, S., F. Berkenbosch, D. Suchecki, And F. J. H. Tilders. Pituitary-Adrenal And Interleukin-6 Responses To Recombinant Interleukin-1 In Neonatal Rats.//Psychoneuroendocrinology 19: 143-153, 1994.

78. Lindner E., Sholkens B.: ACTH And Alpha-Msh Cardiovascular And Antiarrythmic Properties. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 208, 19, 1974

79. Liu, C., D. Chalmers, R. Maki, And E. B. De Souza. Rat Homolog Of Mouse Interleukin-1 Receptor Accessory Protein: Cloning, Localization And Modulation Studies. // J. Neuroimmunol. 66: 41-48, 1996.

80. Loddick S.A., Liu C., Takao T., Hashimoto K., De Souza E.B. // Brain Res. Brain Res. Rev. 1998. V. 26. P. 306-319.

81. Lonovies J., Geese A., Karady S. New Aspects Of Histaminopexy // Arch. Intern. Physiol Et Biochim, 1974, Vol 82, 1, 41

82. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr O.L., Randall R.J. Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. — P. 265-73.

83. Lustig, S., H. D. Danenberg, Y. Kafri, D. Kobiler, And D. Ben-Nathan. Viral Neuroinvasion And Encephalitis Induced By Lipopolysaccharide And Its Mediators. //J. Exp. Med. 176: 707-712,1992.

84. Mackiewicz, A., M. Wiznerowicz, E. Roeb, A. Karczewska, J. Nowak, P. C. Heinrich, And S. Rose-John. Soluble Interleukin-6 Receptor Is Biologically Active In Vivo. // Cytokine 7: 142-149, 1995.

85. Mannaioni P. Physiology And Pharmacology Of Cardiac Histamine. // Arch. Intern. Pharmacodyn. Et Ther., 1972, Vol 196, 64

86. Marshall P. The Influence Of Adrenal Cortical Deficiency Of The Histamine Content Of Rat Tissues. // J. Physiol., 1943

87. Mastorakos, G., G. P. Chrousos, And J. S. Weber. Recombinant Interleukin-6 Activates The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis In Humans. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 77: 1690-1694, 1993.

88. Minami, M., Y. Kuraishi, T. Yamaguchi, S. Nakai, Y. Hirai, And M. Satoh. Immobilization Stress Induces Interleukin-1 Mrna In The Rat Hypothalamus. //Neurosci. Lett. 123: 254-256, 1991.

89. Mitin Y.V., Navolotskaya E.V., Vasilenko R.N., Abramov V.M., Zav'yalov V.P. Synthesis And Properties Of The Peptide Corresponding To The ACTH-Like Sequence Of Human Immunoglobulin Gl. // Int. J. Pept. Protein Res. 1993,41,517-21.

90. Naito, Y., J. Fukata, S. Nakaishi, Y. Nakai, Y. Hirai, S. Tamai, K. Mori, And H. Imura. Chronic Effects Of Interleukin-1 On Hypothalamus, Pituitary And Adrenal Glands In Rat. //Neuroendocrinology 51: 637-641, 1990.

91. Naito, Y., J. Fukata, T. Tominaga, Y. Masui, Y. Hirai, N. Murakami, S. Tamai, And H. Imura. Adrenocorticotropic Hormone Releasing Activities Of1.terleukins In A Homologous In Vivo System. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1262-1267, 1989.

92. Nakumura M. Et AI.: Depressor Effect Of Synthetic Peptides Related To ACTH On Blood Pressure In Rats. Experimentia 32, 368, 1976

93. Navolotskaya E. V., T. A. Zargarova, T. N. Lepikhova, V. I. Turobov, R. I. Nurieva, N. V. Malkova, V. M. Lipkin, V. P. Zav'yalov: Biochemistry (Moscow), 64 (7), 758, (1999).

94. Nolten, W. E., D. Goldstein, M. Lindstrom, M. V. Mckenna, I. H. Carlson, D. L. Trump, J. Schiller, E. C. Borden, And E. N. Ehrlich. Effects Of Cytokines On The Pituitary-Adrenal Axis In Cancer Patients. // J. Interferon Res. 13:349-357, 1993.

95. Novelli G., Piscitelli P., Baccani A. Effetti Microcircolatori Delia Deplezione Istaminica Nel Ratto. // Acta Anaesthesiol. Ital., 1974, Vol 25, 3, 241

96. O'grady, M. P., N. R. S. Hall, And R. A. Menzies. Interleukin-1 Stimulates Adrenocorticotropin And Corticosterone Release In lO-Day-Old Rat Pups. //Psychoneuroendocrinology 18: 241-247, 1993.

97. Ottaviani, E., And C. Francheschi. The Invertebrate Phagocytic Immunocyte: Clues To A Common Evolution Of Immune And Neuroendocrine Systems. //Immunol. Today 18: 169-174, 1997.

98. Ottaviani, E., And C. Francheschi. The Neuroimmunology Of Stress From Invertebrates To Man. // Prog. Neurobiol. 48: 421-440, 1996.

99. Parrot I., Flavian N., Provost M. Binding C-14 Labeled Histamine By Normal Human Serum. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1962, Vol 109, 459

100. Parrot J., Mordelet-Dambrine M. Influence De Differents Corticoides Sur L'histaminopexie Serique Du Rat Surrenalectomise Et Castre. // J.Physiol, 1963,55,313

101. Paul, W. E. Pleiotropy And Redundancy: T-Cell Derived Lymphokines In The Immune Response. // Cell 57: 521-524, 1989.

102. Peter E., Mangensteen G., Production Of Gastric Secretory By Diamine Oxidase. // Surg. Forum, 1963, Vol 14, 336

103. Plotkin, S. R., W. A. Banks, And A. J. Kastin. Comparison Of Saturable Transport And Extracellular Pathways In The Passage Of Interleukin-1 Across The Blood-Brain Barrier. // J. Neuroimmunol. 67: 41-47, 1996.

104. Plotsky, P. M. Pathways To The Secretion Of Adrenocorticotropin: A View From The Portal. // J. Neuroendocrinol. 3: 1-9, 1991.

105. Reyes, T. M., And C. L. Coe. Interleukin-1 Differentially Affects Interleukin-6 And Soluble Interleukin-6 Receptor In The Blood And Central Nervous System Of The Monkey. // J. Neuroimmunol. 66: 135-141, 1996.

106. Riad M., Mogos M., Thangathurai D., Lumb P.D. // Curr. Opin. Crit. Care. 2002. V. 8. P. 281-284.

107. Rivest, S. Molecular Mechanism And Neural Pathways Mediating The Influence Of Interleukin-1 On The Activity Of Neuroendocrine Crf Motoneurons In The Rat. // Int. J. Dev. Neurosci. 13: 135-146, 1995.

108. Rivier, C., And P. M. Plotsky. Mediation By Corticotropin-Releasing Factor (Crf) Of Adenohypophysial Hormone Secretion. // Annu. Rev. Physiol. 48: 475-494, 1986.

109. Rivier, C., And W. Vale. Interaction Of Corticotropin-Releasing Factor (Crf) And Arginine Vasopressin (Avp) On ACTH Secretion In Vivo. // Endocrinology 113: 939-942, 1983.

110. Rothwell, N. J., G. Luheshi, And S. Toulmond. Cytokines And Their Receptors In The Central Nervous System: Physiology, Pharmacology, And Pathology. //Pharmacol. Ther. 69: 85-95, 1996.

111. Saija, A., P. Princi, M. Lanza, M. Scalesse, E. Aramnejad, And A. De Sarro. Systemic Administration Can Affect Blood-Brain Barrier Permeability. // Life Sci. 56: 775-784, 1995.

112. Salacinski P. R. P., C. Mclean, J. E. C. Sykens, V. V. Clement-Jones, P. J. Lowry: Anal. Biochem., 117, 136, (1981).

113. Saltarelli D., S. Fischer, G. Gacon. Biochem. Biophys. Res. Commun., 127,318 (1985).

114. Sapolslcy, R., C. Rivier, G. Yamamoto, P. Plotsky, And W. Vale. Interleulcin-1 Stimulates The Secretion Of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Factor. // Science 238: 522-524, 1987.

115. Sawchenko, P. E, E. R. Brown, R. K. W. Chan, A. Ericsson, H.-Y. Li, B. L. Roland, And K. J. Kovacs. The Paraventricular Nucleus Of The Hypothalamus And Functional Neuroanatomy Of Visceromotor Responses To Stress. //Prog. Brain Res. 107: 201-222, 1996.

116. Sawchenko, P. E., L. W. Swanson, And W. W. Vale. Co-Expression Of Crf- And Vasopressin-Immunoreactivity In Parvocellular Neurosecretory Neurons In The Adrenalectomized Rat. // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 81: 1883-1887, 1984.

117. Sawyer C. Rhinenecephalic Involvement In Pituitary Activation By Intraventricular Histamine In The Rabbit Under Nembutal Anestesia. // Amer. J. Physiol, 1955, Vol 180,37

118. Selye H. The Physiology And Pathology Of Exposure To Stress. // Montreal, 1950

119. Selye H. The Stress Of Life. //N. Y., 1956

120. Sharief, M. K., M. Ciardi, And E. J. Thompson. Blood-Brain Barrier Damage In Patients With Bacterial Meningitis: Association With Tumor Necrosis Factor- But Not Interleukin-1. //J. Infect. Dis. 166: 350-358, 1992.

121. Sharp, B. M., S. G. Matta, P. K. Peterson, R. Newton, C. Chao, And K. Mcallen. Tumor Necrosis Factor- Is A Potent ACTH Secretagogue: Comparison With Interleukin-1 . //Endocrinology 124: 3131-3133, 1989.

122. Sheppard Ke. Corticosteroid Receptors, 11 Beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase, And The Heart.// Vitam Horm. 2003;66:77-112

123. Shintani, F., T. Nakai, S. Kanba, R. Kato, And M. Asai. Role Of Interleukin-1 In Stress Responses. A Putative Neurotransmitter. // Mol. Neurobiol. 10:47-71, 1995.

124. Shohami, E., R. Bass, D. Wallach, A. Yamin, And R. Gallily. Inhibition Of Tumor Necrosis Factor Alpha (Tnf) Activity In Rat Brain Is Associated With Cerebroprotection After Closed Head Injury. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 16: 378-384, 1996.

125. Shore P., Cohn V. A Method For The Fluorometric Assay Of Histamine In Tissues. // J.Pharmacol. And Exp. Ther., 1959, Vol 127, 182

126. Shulkez A.A. Et Al.: Concerning The Independence Of The Basis Of Hypertension Due To ACTH Or Renovascular Constriction. Cardiovasc Res. 10, 593, 1976

127. Sims, J. E., And S. K. Dower. Interleukin-1 Receptors. // Eur. Cytokine Netw. 5: 539-546, 1994.

128. Smith, E. M., M. Phan, T. E. Kruger, D. H. Coppenhaver, And J. E. Blalock. Human Lymphocyte Production Of Immunoreactive Thyrotropin. // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 80: 6010-6013, 1983.

129. Spenser P. A New Method For The Estimation Of Histaminase Activity. // J.Pharm And Pharmacol., 1963, Vol. 15, 225

130. Spiess J., Rivier J., Rivier C., Vale W. // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 1981. V. 78. P. 6517-6321.

131. Suda T., Tozawa F., Ushiyama T., Sumitomo T., Yamada M., Demura H. //Endocrinol. 1990. V. 126. P. 1223-1228.

132. Suda T., Tozawa F., Ushiyama T., Tomori N., Sumitomo T., Nakagami Y., Yamada M., Demura H., Shizume K. // Endocrinol. 1989. V. 124. P. 14441449.

133. Szikra J., Benyhe S., Orosz G., Darula Z., Piot J.M., Fruitier I., Monory K., Hanoune J., Borsodi A. Radioligand Binding Properties Of Vv-Hemorphin 7, An Atypical Opioid Peptide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 281. -P. 670-7.

134. Tilders, F. J. H., E. D. Schmidt, And D. C. E. De Goeij. Phenotypic Plasticity Of Crf Neurons During Stress. // Ann. Ny Acad. Sci. 697: 39-52, 1993.

135. Tsien, J. Z., D. F. Chen, D. Gerber, C. Tom, E. H. Mercer, D. J. Anderson, M. Mayford, E. R. Kandel, And S. Tonegawa. Subregion- And Cell Type-Restricted Gene Knockout In Mouse Brain. // Cell 87: 1317-1326, 1996.

136. Turnbull A.V., Rivier C.L. // Physiol. Rev. 1999. V. 79. P. 1-71.

137. Udenfriend S. Fluorescence Assay In Biology And Medicine. // New York, London: Acad. Press, 1962

138. Urban I, Stazka W, Tychowska I, Dyba S. Participation Of Histamine In The Cardiovascular Reactions In Response To ACTH.// Ann Univ Mariae Curie Sklodowska, 1987;42:77-82.

139. Vale, W., J. Speiss, C. Rivier, And J. Rivier. Characterization Of A 41-Amino Acid Residue Ovine Hypothalamic Peptide That Stimulates The Secretion Of Corticotropin And -Endorphin.//Science 213: 1394-1397, 1981.

140. Van Bergen, P., Kleijne, J.A., De Wildt, D.J., Versteeg, D.H.G. Different Cardiovascular Profiles Of Three Melanocortins In Conscious Rats; Evidence For Antagonism Between G2-Msh And ACTH-(1 24).// Br. J. Pharmacol. 120, 1561- 1567, 1997.

141. Van Dam, A.-M., H. E. De Vries, J. Kuiper, F. J. Zijlstra, E. G. De Boer, F. J. Tilders, And F. Berkenbosch. Interleukin-1 Receptors On Rat Brain Endothelial Cells: A Role In Neuroimmune Interaction. // Faseb J. 10: 351-356, 1996.

142. Van Dam, A.-M., J. Bauer, F. J. H. Tilders, And F. Berkenbosch. Endotoxin-Induced Appearance Of Immunoreactive Interleukin-1 In Ramified Microglia In Rat Brain: A Light And Electron Microscopic Study. // Neuroscience 65: 815-826, 1995.

143. Van Der Goot H, Timmerman H. Selective Ligands As Tools To Study Histamine Receptors. //Eur Jmed Chem 2000; 35: 5-20.

144. Vitkovic L., Bockaert J., Jacque C. // J. Neurochem. 2000. V. 74. P. 457-471.

145. Waguespack, P. J., W. A. Banks, And A. J. Kastin. Interleukin-2 Does Not Cross The Blood-Brain Barrier By A Saturable Transport System. // Brain Res. Bull. 34: 103-109, 1994.

146. Watkins, L. R., L. E. Goehler, J. Relton, M. T. Brewer, And S. F. Maier. Mechanisms Of Tumor Necrosis Factor- (Tnf-) Hyperalgesia. // Brain Res. 692: 244-250, 1995.

147. Weigent, D. A., And J. E. Blalock. Production Of Peptide Hormones And Neurotransmitters By The Immune System. // Chem. Immunol. 69: 1-30, 1997.

148. Weigent, D. A., J. B. Baxter, W. E. Wear, L. R. Smith, K. L. Bost, And J. E. Blalock. Production Of Immunoreactive Growth Hormone By Mononuclear Leukocytes. H Faseb J. 2: 2812-2818, 1988.

149. Wermelskirchen A.S., Latocha D.H., Clarke B.L. Adrenocorticotropic Hormone Controles Concanavalin A Activation Of Rat Lymphocytes By Modulating 11-2 Production. // Life Sei. 2000, 67, 2177-2187

150. Wick, G. W., Y. Hu, S. Schwarz, And G. Kroemer. Immunoendocrine Communication Via The Hypothalamo-Pituitary-Adrenal Axis In Autoimmune Diseases. //Endocr. Rev. 14: 539-563, 1993.

151. Young, W. S., Iii, E. Mezey, And R. E. Siegel. Quantitative In Situ Hybridization Histochemistry Reveals Increased Levels Of Corticotropin

152. Releasing Factor Mrna After Adrenalectomy In Rats. I I Neurosci. Lett. 70: 198203, 1986.

153. Zav'yalov V.P., Maiorov V.A., Safonova N.G., Navolotskaya E.V., Volodina E.Yu., Abramov V.M. Receptor-Binding Properties Of The Peptides Corresponding To The ACTH-Like Sequence Of Human Pro-Interleukin-1 Alpha. //Immunol. Lett. 1995, 46, 125-8.

154. Zeller E. Identity Of Histamine And Diamine Oxidase. // Fed. Proc., 1965, Vol 24, 766

155. Zenker N„ Berbstein D.E. //J Biol. Chem. 1958. V. 231. P. 695-701.

156. Zhou, D., N. Shanks, S. E. Riechman, R. Liang, A. W. Kusnecov, And B. S. Rabin. Interleukin-6 Modulates Interleukin-1- And Stress-Induced Activation Of The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis In Male Rats. // Neuroendocrinology 63:227-236, 1996.

157. Zolotarev Y. A., A. IC. Dadayan, E. V. Bocharov, Y. A. Borisov, B. V. Vaskovsky, E. M. Dorokhova, N. F. Myasoedov. Amino Acids, 24, 325 (2003).

158. Zolotarev Y. A., E. M. Dorokhova, V. N. Nezavibatko, Y. A. Borisov, S. G. Rosenberg, G. A. Velikodvorskaya, L. V. Neunivakin, V. V. Zverlov, N. F. Myasoedov. Amino Acids, 8, 353 (1995).