Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение действия аналога АКТГ и тафтсина на клетки нервной системы млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение действия аналога АКТГ и тафтсина на клетки нервной системы млекопитающих"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

АРЕФЬЕВА Ирина Алексеевна

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ АНАЛОГА АКТГ И ТАФТСИНА НА КЛЕТКИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики Российской Академии Наук.

Научный руководитель кандидат биологических наук Гривенников И. Д.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ярыгнн К.Н. доктор биологических, наук Глебов Р.Н.

Ведущая организация - Институт мозга РАМН Защита состоится 1992

и

года

в " "" часов на заседании специализированного ученого совета К 001.22.02 в Кардиологическом научном центре РАЫН по адресу: 151552, Москва, 3-я Черепковская ул., д.15а. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кардиологического научного центра РАИН.

Автореферат разослан "

&Г* 19Э2 г-

Ученый секретарь. специализированного совета кандидат биологических наук

"Венгерова Т.И.

с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность.

, Нейропептовн (Ш1) представляют собой короткие эндогенные белковые фрагменты, игращиа чрезвычайно вазгиу» роль в центральной Нервной системе (ЦНС). выполняя функции НеЙромедиаТоров, нейрогор-монов и нейромодуляторов. Нак правило. НИ образуются из крупных предшественников путем ограниченного гротеолиза, причем в составе одного предшественника может синтезироваться целый набор пептидов, обладахщих. различными свойствами.

¡Широкий спектр биологически! эффектов, проявляемых сравнительно небольшой группой НП, позволяет предположить, что врожденные и приобретенные нарушения в поптидэргической системе могут служить причиной ряда психиатрическг.х и неврологических заболеваний. Подобные нарушения могут включать в себя изменения в структуре и экспрессии генов НП, в процессинге молекул-предшественников или их метаболизме и приводить таким образом к модуляции количества регуляторных пептидов или ш биологической активности, причем' даже незначительные аномалии могут вызывать серьезные нарупекия гомеостаткческого контроля е ЦНС. В связи с втим особую важность приобретают исследования, направленные на использование природных НП и их аналогов для коррекции подобных нарушений, а также для осуществления тонкой регуляции функций ЦНС. Примерами такого рода пептидов могут слукить синтезированный в Лаборатории регуляторных пэптидов Института молекулярной генетики РАН аналог фрагмента (4-10) адргя^кортикотропноге гормона семакс (Ме1;-С1и-Н1э-Р11е-РгоЧ^у-г1\> ■ и эндогенный иммуномодулятор тафгсин (ТЬг-Ьуз~Рго-/.Г5). Выявленные в физиологических экспериментах эффекта, оказываемые этики пептидами на ЦНС, а также возможность их интраназального введения пгзцоляют

создать на их основе лекарственные препараты. Поэтому чрезвычайно важным п актуальным представляется изучение Око-химических механизмов действия семакса и тафтсина на нервную ткань.

Цель и задачи работ.

Целью данной работа было изучение взаимодействия тафтсина и семакса с клетками ЦНС млекопитающих.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Изучение взаимодействия семакса и тафтсина с плазматическими мембранами мозга крысы.

2. Изучение взаимодействия семакса и тафтсина с культивируемыми клетками нейроналышх и глиальных линий.

Научная новизна работ.

На плазматических мембранах мозга крысы обнаружены и

охарактеризованы две популяции центров связывания тафтсина. Показано, что выявленные центры по своим фармакологическим свойствам неидентичнн описанным в литературе тафтсиновым рецепторам, расположенным на макрофагах мыши [Со1с1тал и. ег а!.. 1983]. Отмечено существование специфического связывания тафтсина с трансформированными клетками некоторых нейрональных и глиальных линий.

Выяснено, что использование высокомеченных тритием коротких И-концевых фрагментов АКТГ для изучения взаимодействия этих пептидов с клеточными мембранами радиорецепторным методом неэффективно из-за недостаточной удельной радиоактивности получаемых препаратов.

Практическая ценность работы.

Разработаны условия радиорецепторного метода для изучения взаимодействия тафтсина и его аналогов со специфическими центрами, расположенными на плазматических мембранах мозга красы а трансформированных клетках нейрояальшго и глиального происхождения. Учп-

тывая перспективу создания на Сазе тзфтсина лекарственного препарата. Метод может быть использован для тестирования аналогов

этого. пептида, синтезируемых для придания ему свойств,

необходимых для использования в практической медицине

(устойчивость в организме, растворимость, стабильность при

хранении и т.д.), а такие для повышения биологической активности.

Апрбсщия результатов и публикации.

Результаты настоящей работы доложены и обсузЭДёйы на советско-американском симпозиуме по молекулярной нейробиологии (Киев, 1991) и Международном симпозиуме "Структура и функция полипептидов" (Москва, 1992), а также на межлзбораторном семинаре №Г РАН и меалаборагорном семинаре ШТОЗК КНЦ РАМН.

Основные материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Х.Езучепие взаимодействия 13Н]тафтсннэ с мембранами нервных

клеток

1.1. оптимизация условий эксперимента Проведению экспериментов - по радиорвцепторному связывании ["^Штефтсинз с мембранами нервных клеток предшествовало определение устойчивости меченого пептида в присутствии плазматических мембран мозга крысы н в суспензии клеток нейробластсмы мшгя линии НВ-41АЗ методом ВЭЕХ (ркз.1 А и Е). Как видно из рисунков, [^НЗтафтста обладает достаточно высокой устойчивость!) к действию протеаз мембран мозга: степень его деградации за 60 минут не превышает 40% (А!. Б сус:.?нгда кроток время полужизни пептида составляет "ко.и ¡^ мшу? (Б). Пятикратное различие в скорости деградации тм^тс^пэ мембранами мозга и кивыми клетками можно объяснил. отсутствие« акции

ВРЕМЯ (МИН.) ВРЕМЯ (ИИН.)

Рис.1.Деградация [3Н]тзфтсина мембранами мозга при 35°С(А) и клетками нейробластомн мыши линии NB-41A3 при 37°С (Б). Инкубационная смесь содержала 4 мкКи/мл (0,2 мкМ) меченого пептида, 0,5 мг/мл мембранного Cernía и 2 мМ CsClj в 50 мЫ Грис-НС1 рН 7,4 (А) или 5 мкКи/мл меченого пептида и 1 млн./мл клеток в растворе Хенкса (Б). Нативнооть пептида определяли ВЭНХ.

растворимых протеаз в препарате мембран.

Проблема неспецифической адсорбции С^Зтафгсина на «фильтрах СР/В, с помощью которых проводилось отделение комплекса пептида с белком от несвязавшейся метки, была решена обработкой последних 0,31-ным раствором полиэтиленимина, в результате чего связывание метки с фильтрами снизилось более чем в 140 раз и не превышало 0,1* от количества фильтруемой метки. Использование для забивки несдацифических центров связывания на фильтрах других высокомолекулярных соединений, таких как Твин-20, поливинилпирролидон и БСА в концентрации 0,1*, оказалось менее эффективным.

В процессе оптимизации условий для ■ проведения радиорецепторного анализа, было выяснено, что добавление в инкубационную среду различных ингибиторов протеаз, таких как апротинин <0,01%), бацитрацин (0.015), бензамитин (0,0IÍ6), пуромицан (0,01*) и фенилатлсульфони-тфторид (0,1 мЫ), а такте

ЭДТА (I мЫ) не оказывают существенного влияния на связывание [3Н]тафтсша с мембранами ыозга. В.то же время оказалось, что зтот процесс в значительной степени зависит от наличия ионов двухвалентных металлов. Как видно из рисунка 2, кальциевая зависимость носит колоколообразный характер с максимумом, соответствупцим почти двухкратной стимуляции связывания 2 мМ СаС12. Ионы магния практически не оказывают влияния на связывание тафтсина. Небольшой (около 30%) ингибирующий эффект наблюдается лишь при высоких (6-10 мМ) концентрациях ионов Ионы Со2+,

Мп2+ и 2пг+ (I Ш) полностью ингибирувт связывание.

специфическое связывание

2003: 150Х 100Х

50S 0»

o.oot 0.01 0.1 1 10

!g [металл^ФЮ

Рис.2. Зависимость специфического связывания тафтеика с мембранам:' мозга крысы от концентрации ионов калщия (1) и магния (2). 1 мл реакционной смеси содержал 1 мкКи (IV пмоль; 1°Н!?гфтскнэ, 0,5 мг белка и хлориды кальция или магния в £0 м.4 Тркс-Hül рН 7,4. Инкубации итоБрд1и.и яри 30°С в течение I часп. специфическое связывание определяли в присутствии ICO кк\( немеченого тпфт'мна. Данные представляют средний результат двух эксиериментси.

специфическое связывание

время (пин)

Рнс.З. Связывание тафтсина с мембранами мозга (1), печени (2), сердца (3) и почек (4) крысы при 3D°C. Данные представляют средний результат двух измерензШ.

Специфическое связывание t^J тафтсина с мембранами мозга' зависит такзе и от природы буфера. В качестве инкубационной среды нами применялись: Трис, TES, HEPES. KOPS, Tri ein и фосфат калия (все буферы 50 мМ, pH 7,4), а также раствор Хенкса. Наилучшие 4 результаты были получены в Трис буфере и растворе Хенкса, поэтому все дальнейте эксперименты проводились в этих средах.

1.2. Локализация центров связывания тафтсина.'

Для определения специфичности взаимодействия тафтсина с яерйными клетками, было проведено сравнительное изучение связывания меченого пептида с плазматическими мембранами мозга, сердца, печени а почек крысы. Методика Еыделения мембран и условия прОйедешш экспериментов во всех случаях были идентичны. Временная зависимость связывания С тафтсина с мембранами всех четырех типов, приведенная на рис.3, демонстрирует

преимущественное взаимодействие' пептида с мембранами нервных клеток. Специфическое связывание с препаратам сердца, печени и почек составляет • соответственно 14%, 16$ и 5% по отношению к связыванию с мембранами мозга.

ДЛя более детальной локализации обнаруженных центров, мембраны мозге были подвергнуты центрифугированию в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы (0,32 Ы; 0,8 М; 1,2 М). При этом были получены три фракции, обогащенные миелином, синаптосомальными мембранами и митохондриями. Специфическое связывание Г^Штафгсина с этими фракциям! показано на рисунке 4. Очевидна преимущественная локализация изучаемых центров на синаптосомадьных мембранах и практически полное их отсутствие на митохондриях. Весьма значительное связывание пептида с фракцией, обогащенной миелином, объясняется, на наш взгляд, возможным присутствием в ней мелких фрагментов синаптосомалъннх мембран. -

60 40

30 20 10 О

ШЗ Мисум г I Синоптосоы. «еыбромм . ПЭ Миюх^дрми

Рис.4. Специфическое связывание [ЧМтафтс-.шз с пропарстами мембран мозга. обогащенными миелином. синаптосомзл!-нымк мечоранами и митохондриями. Инкубацию проводили в течение I часа при 30 С. Данные представляет средний результат тр°:-. измерений.

Э

Специфическое связывание тыс. имп./мин.

100%

40% "г' " '• • -

■9 5%

1.3. Характеристика центров связывания тафтсина.

Основными критериями рецепторного характера связывания изучаемого соединения с клеточной мембраной являются зависимость этого процесса от времени, насыщаемость и обратимость. Исследования обратимости связывания тафтсина с плазматическими мембранами мозга крысы проводились в экспериментах дв}х типов. Один из них включал Еытеснэние связавшейся метки 1000-кратным избытком немеченого пептида, а другой - 50-кратное разведение инкубационной смеси. Обе манипуляции проводились через 60 минут после начала инкубации, когда кривая временной зависимости связывания тафтсина вшила на плато. Полученные данные представлены на рисунке 5 (А и Б). В обоих случаях наблюдалась быстрая (1-2 мин.) диссоциация половины связавшегося пептида с последующим более медленным снижением до базового уровня (60 мин.).

Известно, что большинство мембранных рецепторов содержит, белковый компонент, поэтому нашим следующим шагом было выяснение термической и протеолитичвской устойчивости изучаемых центров. Результаты, представленные в таблице I, показывают, что 15-мшутная инкубации мембран при 100°С приводит к полной потере способности связывать тафтсин, а после 30-минутной обработки мембран трипсином (рис. 6). их связывающая способность падает на 80%. Приведенные данные могут рассматриваться как указания на белковую природу изучаемых центров.

На рис. 7(А) приведена изотерма связывания 13НЗтафтсина с мембранами мозга крысы. Как видно из рисунка, специфическое связывание насыщаемо. Обращает на себя внимание высокий процент кесп>}цифй4еского связывания (около 50%) 1 На наш взгляд, это может сыть следствием полозкительной ззряженности молекул тафтсина при физиологических значениях рН. Компьютерная обработка полученных

общее связывание (имп./мин х 10 )

время (мин) общее связывание (иып/мич х 10*^)

время (кил)

Рис.5. Диссоциация 13Н]тафтсина с мембран мозга при 50-крзтном разведении (А) и под действием 1СОО-краткого избытка немеченого пептида (Б) при 30°С Начало диссоциации указано стрелками. Низкие кривые - контроль (связывание в 50-кратном объеме бь'^зрз или в присутствии избытка немеченого пептида соответственно). Данные Пр5£С?ЭВ.1?ЛГ Ср?ЛНЙ*. р^"у.ТЬТ5Т дву! экспериментов.

Таблица 1. Херцоинактивадая мембран мозга крысы

Связывание Контроль 1Ь мин при Ю0°С

(имп./мин) (имп./мин)

Обдее 7360 + 200 2400 + 300

Не спецнфкче ское 2800 + 250 2260 + 150

специф. связывание (%) 120)---:---

100 - 'лл; . , ■ 80 -

60 - -:-

чо - Л -—-г-,

го- '•,;■:

01_ь—,—_1-!. ^ —, , I.. -г.';,..".-«',.4' ;1

контроль 0 10 30

еремя (мин.)

Рис.6. Инактивация специфических центров связывания тафтсина на мембранах мозга под действием трипсина. Массовое соотношение трипсин : белок =1:10.

результатов в координатах Скэтчарда (рис.7(Б)), выполненная с помощью программ 1пР1о1 и SígmaPlot, позволила выявить существование двух типов специфических центров связывания тафтсина, характеризующихся следующими параметрами:

КЙ1 = 0.23 + 0,16 мкМ Вшах1 = 0,78 + 0,55 пмоль/мг белка

К^ = 26,2 + 9.50мкМ Втят? = 170 + 63 пмоль/мг белка

В (нЫ)

о

Рис.7. Изотерма связывания { Н1тафтсина с мембранами мозгз (общее (а ) и специфическое (а) связывание) (А) и обработка результатов в координатах ■ Скэтчарда (Б). Т - обцее количество пептида, В -количество связанного пептида, F - количество несвязанного пептида. Данные представляют результат двух экспериментов.

Возможно, реализация ряда физиологических и поведенческих свойств тафтсина, таких как влияние на исследовательскую и двигательную-активность, агрессивность, температуру тела и других [Вальдаан и др.. 1982, 1983], включает взаимодействие тафтсина с обнаруженными нами высокоаффннными центрами. В то время как низковффинныэ центры могут участвовать в опосредовании обезболиваицего и ряда поведенческих эфГектов, наблюдаемых при интрацеребровентрикулярном введении крысам тафтсина в количестве 200 мкг на животное [Herman & Stachura, 19803.

Для дальнейшей характеристики обнаручкных центров, нами была проведена серия экспериментов по конкурент! [°н:тафтсина и ряда его аналогов, а также некоторых НП и классических нейротрансмиттерсв за центры связывания на мембранах мозгз крысы.

Суруктурно-функциональные исследования показали, что удаление Н-концевой аминокислоты или замена Ъ~кг& в 4-ом положении на Б-Аге в равной степени ухудшают связывание получаемых аналогов с изучаемыми центрами, в то время как удлиннение полипептидной цепи путем присоединения к С-крнцу фрагмента Рго-С1у-Рго, существенно не влияет на параметры связывания (табл.2).

Найдено также, что классические нейротрансмиттеры, такие как

дофамин, серотонип, норэдреналин и гистамин, а также универсальный

опиатный антагонист налоксон в концентрациях до 50 мкМ не оказывают

з

влияния на специфическое связывание I Штафтсина.

В тзолице 3 представлены результаты экспериментов по конкуренции тафтсина с различными НП. На основании полученных данных исследованные поптиды можно расположить в порядке убывания их ингибирущей способности следующим образом: субстанция Р > нейротензин >, тафтсин = тафтсин-Рго-С1у-Рго > а-МОГ = Аге-вазопрессин > Б-АГ8-тафтсин = йеа-ТЬг-тафтсин > субстанция Р(1-4) » кентоин.

Таблица 2. Вытеснение тафтсина с иеибран мозга различными

аналогами

Наименование Структура Ингибирование IC50

связывания (%)* (мкМ)

тафтсин ТЬг-Ьуз-Рго-А^ too 5

D-Arg-тафтсин Thr-Lya-Pro-D-Arg 75 30

ües-Thr-

тафтсин Lys-Pro-Arg 65 50

тафтсин- Thr-Lya-Pro-Arg-

Pro-Gly-Pro Pro-Gly-Pro 90 10

* - Ингибирование связывания С тафтсина (50 нМ) определялось в присутствии 100 мкМ тестируемого пептвда

з

Таблица 3. Вытеснение I Штзтфтсина с мембран мозга псйрспентид.ши

Наименование Ингнбироваше JC50

связывания •.»)* '¡.исМ)

тафгсип 100 5

субстанция Р 100 1.5

нейротензин 100 4

а-МСГ 80 40

Arg-вазопрессин 80 40

субстанция Р(1-4) 45 > 100

кентсйн 30 >100

*- Ингибированиэ, связывания [3Н)тафтсина (50 нМ) определялось в присутствии 100 мкМ тестируемого пептида

Следует отметить, что по кинетическим параметрам обнаруженные нами центры высокого сродства сходны со специфическими тафтсиновыми рецепторами, присутствующими на некоторых клетках периферической " крови и перитонеальных макрофагах млекогштащих. В работах Голдман и Бар-Шавита [Goldman & Bar-ShayJt, 1983] тафтсиновые рецептор;; на макрофагах мыши охарактеризованы по способности различных пептидов шгибировать связывание [°НЗтафтсина. Авторами биле показано снижение ингибирувдей способности пептида при замене С-концевого Ь-Arg на D-энантиомер, а также весьма эффективное вытеснение тафтсин? субстанцией Р и нейротензином. что хорошо согласуется с результатами, полученными нами на мембранах мозга. Однако, в отличие от представленного выше профиля активности, в котором фрагмент субстанции Р(1-4) и кентсин затгкмают последние места (1С50 > 100 ггкГЛ), в профиле, характеризующем периферические рецепторы, ин:"1::груицая способность вещества Р и ее N-концевого фрагмента (1-4) идентичны, а кентсин в концентрации 5 мкМ

рттиоирует связывание та'фтсина.так ке, как нейротензин (на 91 Ж), - , наш взгляд, свидетельствует об отличии центров связывания тафт": а в мозге и на периферии.

1.4. Связывание Лзтафтсина с трансформированными нервными клетками Наш было показано, что [^Штафтсин специфически связывается с прикрепленными и неприкрепленными трансформированными клет- . :'эми неЯроналыгого и глиального происхождения. Процент специфического связывания, определенного в присутствии 1000-кратного избытка немеченого пептида, от общего изменяется для различных прикрепленных клеток от 30% (Q-6) до 10% (Neuro-2A), а для неприкрепленных клеток - от 53£ (С-б) до 78% (Neuro-2A) (рис.8). В качестве контроля специфичности связывания тафтсина мы использовали прикрепленные трансформированные клетки почечного эпителия зеленой мартышки (линия Vero). Специфическое связывание меченого пептиде, с этими клетками- отсутствовало.

Из рисунка 9 (на примере лиши NB-41A3) видно, что -связывание С^НЗтафтскна с клетками зависит от времени и обращается при добавлении избытка (50 .мкМ) немеченого пептида'. Кроме того, обнарукенные центры связывания оказались чувствительными . к действию протеолитичоских ферментов. . ' Использование для снятия клеток с подложки раствора трипсина (0,05% в 0.02S ЭДТА) (инкубация 10 мин. -при 37°С) приводило к исчезновению специфического связывания, восстанавливавшегося только через сутки после удаления трипсина.

Параметры связывания таф^сина оценены в эксперименте по вытеснению меченого пептида немеченым с поверхности прикрепленных клеток линии (Neuro-2A) (рис.10). Из представленной кривой вытеснения было найдено, что 1С50 для немеченого тафтеша составляет около 2 мкМ.

специф. связывание от общего)

100

с-6

НГУК-1 Neurü*2A

Рис.8. Специфическое

связывание С^Зтафтсана с прикрепленными (сз ) и не-щул'решюнными ( ® ) клетками линий С-6 , МСЦК-1 и Иеиго-2А. Смесь, содержащую 0,3 мкКи (5 шоль) (3Н1тафтсина я 100 тыс. клеток в 100 мкл раствора Хенкса инкубировали 30 мин. при 37°С. Специфическое связывание определяла в присутствии 100 мкМ немеченого пептида. Данные представляют средний результат четырех измерений.

ю

общее связывание (имп./мин х 10 )

' / i

/ • . • / Jr • » - ■ ф

** /» У /

50 100 150 200

время (мин)

250

Рас.9.Обратимость специфического связывания С^Штафтсина с прикрепленными клетками нейроблэстсаш мыли НВ-41АЗ. Условия инкубации принед-зш. в подписи к рис.8. £ точке, стмеч^ннсй стрелкой, к .тонной смеси прибавляли нгмеченный пепт-д до конечной концентрации ЮС ккМ. Лзшше представляют средний

FonvTrvfon« TjQTtTT^oT ГТт: WJTrrr\ _ trarrrafrrrr*-,T*tjii,-»tiY>Q ,-<T:c:T<]T "ЛГ' о

слишф. связываний (кмп./мкн х 10"®)

Рис.10. Ингибирование связывания [3Штаф1-сина с неприкрепленными клетками нейро-йдастоны кыш линии Неиго-2А немеченым пептидом. Условия инкубации приведены в подписи х рис.6. ' Данные представляют средний результат четырех измерений.

0.001

0.01

too

0.1 X 10

Ыгафтсина] Ш) Полученные данные, на ваш.взгляд, свидетельствуют о широкой распространенности центров связывания тафтсина на клетках ШС. Врц этом возникает вопрос являются ли обнаруженные нами центры, специфическими тафтсиновыми рецепторами. Следует отметить, что связывание С3Н)твфгсина с плазматическими, мембранами мозга крысн соответствует большинству критериев' рецепторного' связывания [Burt, 19781. Оно зависит от времени, насыпаемо, обратимо, тканеспецифично . и стереоспецифично. Кроме того, _ оно стимулируется ионами кальция, чувствительно- к нагревания и действию протеолитических ферментов. Показано . также преимущественное связывание тафтсана с фракцией синаптосомальных мембран клеток мозга по сравнению с митохондриями и миелином. Особенно важным представляется соответствие двух типов центров связывания уафтсинэ даум группам физиологических и поведенческих

эффектов,' наблюдаемых при введении различных количеств пептида. Все' это свидетельствует о том, что .обнаруженные нами центры действительно являются тафтсиновнми р. :;'торами. Вместе с тем, следует отметить низкую афЗданность второго типа центров (Кй=26,2 мкМ). Такая концентрация пептида не является физиологической и достижима лишь при центральном введении больших (несколько мг/кг) количеств пептида. Кроме того, способность ряда яейропептидов вытеснять меченный тритием тафтсин (табл.3) также может служить указанием на связывание тафтсина с рецептореми других регуляторных- пептидов. Эффективное ингибирование связывания [3Н1тафтсина субстанцией Р и нейротензшюм, наблюдаемое при

л

сравнительно низких концентрациях этих пептидов (1С50 1,5 мкМ и 4 мкЫ . соответственно), позволяет предположить, что центры связывания тафтсина высокого сродства на самом деле являются рецепторами субстанции Р или нейротензина. Однако, это предположение можно опровергнуть, принимая во внимание слэдугацие факты: во-первых, спектры физиологической активности тафтсина, субстанции Р и нейротензина различны й практически не пересекаются ШетегоГГ, 1987; Ьеетап, 1987) во-вторых, известно, что связывание субстанции Р с мембранами мозга увеличивается в 2-4 раза в присутствии ионов марганца, кальция и магния Шагиуатз, 1986), в то время • как связывание тафтсина стимулируется только ионами кальция, не чувствительно к ионам магния и ингабируется ионами марганца. Окончательное решение этого вопроса может быть получено в результате сравнительного изучения характера распределения участков связывания тафтсина, субстанции Р и нейротензина в мозге, н также в результате очистки и характеристики тафтсиновых рец8]г; :ров нервных клеток.

/ II. Изучение взаимодействия 13Шсемакса с

мембранами нервных клетсж Л.1. Определение устойчивости ["^НЗсемакса в условиях эксперимента

На первом этапе работы Сала проведена оценка устойчивости семакса в присутствии мембран мозга. Кок видно из рисунка 11. демонстрирующего уменьшение относительного содержания метки в пике натшвого пептида, самакс обладает достаточно высокой устойчивостью к действию протеаз мозга: степень его деградации за 60 минут инкубации не превышает 502.

II .2. Определение 'неспецифической адсорбции семакса на различных поверхностях.

Во избежание искажений результатов экспериментов из-за нэ~ специфической адсорбции семаксз на фильтрах СУ/В, с псмоаью которых проводилось отделение комплекса пептида с мембранами от ке-связавшегося лигакдэ, вами была использована предварительная двухчасовая обработка фильтров 0,1*-яыми растворами бычьего сывороточного альбумина, шлизгшюнгликоля-4000, поливиншпшрролидона или Твин-20. При этом наблюдалось более чем 2-кратное уменьшение сорбции. Наилучшие результаты (400 имп./мян при 200 ООО имп./мин в пробе) были получены при использовании поливиналшрролидона, что и было учтено в наших дальнейших экспериментах.

НЕГИБКОСТЬ __

Рис.11. Деградация

(^Зсемакса мембранами мозга крысы при 35°С. Инкубационная смесь содержала 70 нМ меченого пептида и 0,7 мг/мл белка в 50 мМ Тряс-KCl pH 7,4. HaTItBHOCTi: пептида определял! ВЭНХ.

15 30

виемя (млн)

11.3. Эксперименты по связыванию.

' Изучение взаимодействия Лпсемакса с мембранами целого мозга крысы не выявило достоверного специфического связывания пептида. Учитывая возможность узкой локализации искомых центров, мы получили препараты мембран ствола мозга, коры и подкорковых структур, однако и в этих случаях достоверного специфического связывания семакса обнаружено не было (таблица 4). Для увеличения плотности гипотетических центров нами было предпринято центрифугирование исходного препарата мембран подкорковых структур в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы (0,32; 0,8 и 1,2 М) с целью получения фракций, обогащенных миелином, синаптосомальными мембранами и митохондриями.

ч

Результаты экспериментов, проведенных на этих фракциях представлены в тёблице 5. Отсутствие достоверного специфического связывания пептида и в этих случаях вполне очевидно.

Попытки оптимизации условий эксперимента, путем добавления в среду инкубации ионов металлов, ингибиторов прэтеаз, а также в применении различных буферов, отражены в таблице 6. Ни в одном из этих случаев достоверного специфического связывания обнаружено не было.

Таблица 4. Связывание 13Н1сеыакса с мембранами мозга крысы

Общее связывание Неспецифическое

(имп./мин) связывание (имп./мин)

целый мозг 990 + 30 910 + 30

кора 800 + 20 820 20

ствол 820 + 20 820 20

подкорковые 900

структуры + 30 710 + 30

концентрация бел:з - 0,8 мг/мл, [3Шсемакса - 0,8 мкКи/мл (67 нМ)

- лица 5.

Связывание ["НЗсеыакса с фракциям:: ыеыбран подкорковых структур

Общее связывание Неспецифическое

(расп./мия) связывание (расп./мин)

исходные мембраны 2900 + 100

фракции миелина 2900 + 100

фракция синапгосомальных

. -эмбран фракция митохондрий

2900 + 100 2600 + 100

2800 + 100 2400 + ТОО

2800 +100 2200 + 100

концентрация белка - 0,8 мг/ыл, t3!?] семакса - 0,8 мкКи/мл (67 нМ)

Таблица С. Влияние буферов и различных добавок на связывание 13Н)семакса с мембранами целого мезга

Общее связывание Неспецифическое

(имп./мин) связывание (ими./мин)

50 ыМ Трис-НС1 р!' 7,4 (стандартный) 990 + 70 1070 + 70

50 мМ фосфат калия рН 7-, 4 86Ó + 80 880 + 60

фосфатш-солввой буфзо рН 7,4 860 + 60 . 860 ■+ 60

раствор Хенкса •1900 4- 140 1500 150

феншиетилсульфонил-фторад (0,1 мгл) 1100 + 100 1000 + 100

бацитрацнн (0,01®) 1250 + 100 1300 + 100

апротишш (0,01%) • 1300 + 100 1300 100

ЭДТА (I мМ) 1000 4- 50 1000 ± 50

йдС12 (5 мМ) 1250 + 70 IIC50 ± 60

Са012 (2 мЧ) 1030 + 70 903 + 70

Дктиотрейтол (ОД мМ) нею + 60 1000 + 60

концентрация белка - 0,6 кг'мл, ¡"НЗссмпкса - 0,8 мсКя/мл (Б7 нМ)

Эксперименты на неприкрепленных. клетках ¡шн ilei.'ro-2A ыемОронзх клеток С--6, NE-41A3 и 11ГУК-1 так же ну увончз.члсь успехом. Так, на клетках линии Кеиго-2А общее связызаиие составило 600 + 100 расп./мин, а не специфическое - 400 + 100 расп./мин. Нз мембранах клеток линий С-6, NB-41A3 и НГУК-1 общее и неспецифическое связывание было на уровне 300 расп./мин.

Следует отметить, что неудачные попытки обнаружить связывание коротких N-концевнх фрагментов . АКТГ с нервными клетками предпринимались разными группами исследователей. Основной причиной этих неудач считалась низкая - удельная радиоактивность меченных тритием пептидов (10-20 Ки/ммоль) (Witter, 19303. В своей работе :,ы использовали С^НЗсемакс с удельной активностью 80 Ки/ммоль. синтезированный' р Лаборатории изотопного обмена Ш* РАН. На основании полученных наш результатов можно высказать предположение либо об отсутствии специфических центров связывания Се-макса на нервных клетках и существовании норецепторных путей воздействия' этого пептида на ЩС, либо о наличии очень узко локализованной популяции високоаффшшых центров, обнаружение которых радиорецепторннм методом с использованием моченных тритием пептидов представляется невозможным.

вывода

ч

1. Обнаружено специфическое связывание L Штафтсана с плазматическими мембранами мозга крысы и трансформированными клетками неЗ-;.анального' и глиального происхождения.

2. Связывание зависит от времени, насыщаемо, обратимо, стимулируется ионами кальция (2 мМ).

3. Обнаруженные центры локализованы преиг-.^стеешо нп синаптосомаль-ных мембранах г.зга. Специфическое связывание тафтсина • мембранами сердца, почек и печена не превышает от специфического связывания с мембранами мозга.

23

На плазматических «ембранах мозга крысы обнаружено два типа центров свпгчвазт, характеризующиеся следующими параметрами: К41 = 0,23 ЫКш, Ваах1 » 0,8 пмоль/мг белка, К^ = 26,2 мкН, В^^ * 170 пмодь/ыг белка.

5. Изучена способность различных нейропетздов вытеснять [3Штафтсин с мембран мозга. На основании сравнительного анализа полученных результатов и имеющихся в литературе данных, высказано предположение о нввдентичности центральных и периферических центров связывания тефтсина.

6. Радаорецелторшг методом с использованием семакса, меченного тритием с удельной активностью 60 Ки/даоль, специфических центров связывания для физиологически активного аналога АКТГ(4-10) на мембранах мозга крысы и клетках нейронального и глиального происхождения обнаружено не было.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) й. А.Макарова (Арефьевв). Л.Ю.Алфеева, Г.С.Ильина, И.А.Гривенштков. Связывание. тафтсинв с плазматическими мембранами мозга крысы и клетками нэйробластомы. Материалы Всесоюзной конференции "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990).

2) К.А.Арефьева, Л.С.Длфеева, Й.А.Гривенников. Связывание тафгеина с плазматическими мембранами мозга крысы, клетками глиомы крысы и нейробластокы мыши. , Нейрохимия, 1991, т.10, Но 1-2, стр.28-37.

3) И. А .Арефьева, Л.Ю.Алфеева, Л.А.Андреева, И.А.Гривенников, Д.А.Зайцев, Г.С.Илыша, В.Н.Потаман, В.Н.Незавибатько. Изучение связывания аналога АКТГ(4-7) и тафгеина с плазматическими мембранами мозга красы и с клетками глиомы и нейробластомн. Биологические мембраны, 1991, т.8, Но 11, стр.1167-1163.

4) И.А.Арефьева, Д.А.Зайцев, Л.А.Андреевэ, И.А.Гривенников, В.Я. Назавибатько. Поиск рецепторов для Н-концевого фрагмента АКТГ на плазматических мембранах мозга крысы с использованием высоко" меченого аналога. Материалы 3 Всесоюзного совещания "Физиологи-• чески активные соединения, меченныэ радиоактивными и стабильными изотопами" (Звенигород, 1991), стр.22. ;

б) I.А.Grlvennikov, I.A.Arefyeva, L.Yu.Alfeeva, V.JT.Nezavlbatko. Tuftsin binding on plasna membranes of rat brain. Proceedings oi Sympoalum on Molecular . Neurobiology, Kiev, 1991, p.35-35.

6) I.A.Grlvennikov, I.A.Arefyeva, D.A.Zaltzev, V.N.Nezavlbatko. Application oi tritium labelled tuftsin aa the tracer In the binding experimentз on manmalian central nervous system In- vitro. Proceedings of 17 International Symposium on the Synthesis and Application of Isotopes and Isotopically Labelled Compounds. Toronto, Canada, 1991.

7) I.A.Araf у eva, D.A.Zaltzev, I.A.Criyennitov, L.A.Andreeva, 7.H.Potaman, V.N.Nezavlbatko, N.F.HyasoedDY. .Application of high radioactive trltlua labelled behaviorally active ACTH(4-10) analog for investigation of lt3 binding to rat brain. Neuroscl. Hes. Comm., 1992, v.11, p.37-44.

8) I.A.Arefyeva, L.A.Andreeva, I;A.Grlvennlkov, V.N.Nezavlbatko. Investigation of tuftsin binding sites In rat brain. Abstracts of the International Symposium "Structure & Function of Regulatory Polypeptides" Moscow, 1992. p.5.

9) I.A.Grlvennikov, I.A.Arefyeva, V.N.Nezavlbatko, N.F.Myasoedov. Interaction of lmmmomodulatlng peptide tuftsin Tilth nervous cells. Там же, стр.25.

10)V.N.Potaman, I.A.Grlvennikov, I.A.Arefyeva, L.Yu.Alfeeva, D.A.Zaltzev. A.A.Kamensky, V.N.Nezavlbatko, N.F.Myaso^iov. Synthetic АСТЩ4-10) analog semax that affects central nervous system functions. Там ке, стр.65.