Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические эффекты синтетических аналогов меланокортинов: структурно-функциональное исследование

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологические эффекты синтетических аналогов меланокортинов: структурно-функциональное исследование"

На правах рукописи

ЛЕВИЦКАЯ Наталья Григорьевна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СИНТЕТИЧЕСКИХ

АНАЛОГОВ МЕЛАНОКОРТИНОВ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Специальность 03 00 13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ООЗОВ5Б"? 1

МОСКВА-2007

003065571

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова (заведующий кафедрой — профессор А А. Каменский) и в Институте Молекулярной генетики РАН (директор института - профессор С В Костров)

Научные консультанты:

академик РАН, доктор химических наук Н Ф Мясоедов, профессор, доктор биологических наук А А Каменский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Р У. Островская доктор биологических наук С А Титов доктор биологических наук А Н Иноземцев

Ведущая организация- Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится 8 октября 2007 г в 1530 часов на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001 93 Биологического факультета МГУ им М.В Ломоносова (119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан У сентября 2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук

Б А Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной физиологии и фармакологии является разработка и исследование новых нейротропных лекарственных препаратов Создание фармакологических средств, стимулирующих когнитивные функции мозга и способных оказывать нейропротекторное действие в условиях различных патологий центральной нервной системы, особенно важно в настоящее время Это определяется увеличением стрессорной нагрузки и длительным психическим напряжением, сопровождающим многие сферы деятельности человека Все это, наряду со многими другими факторами, приводит к росту различных неврологических заболеваний [Середенин, 2006] При разработке новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов исследователи обращаются к использованию эндогенных регуляторов организма, в первую очередь регуляторным пептидам В настоящее время показано, что вещества пептидной природы являются прямыми или опосредованными регуляторами многих важных физиологических процессов в организме [Ашмарин и др, 2002, 2006] Область биологической активности регуляторных пептидов чрезвычайно широка Вещества этой группы определяют состояние кровеносной, иммунной и других систем Важную роль играют пептиды в регуляции состояния центральной нервной системы Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины (МК) Интерес к данным соединениям вызван тем, что пептиды этого класса обладают широким спектром физиологической активности Многочисленные эксперименты, проводившиеся в последние десятилетия как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что МК, помимо известного гормонального действия, улучшают обучение и внимание, влияют на мотивационные процессы, ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе, оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС, воздействуют на развитие нервной системы, модулируют половое поведение, оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие, взаимодействуют с опиоидной системой, влияют на болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему, вызывают снижение потребления пищи и веса тела, влияют на функционирование экзокринных желез [Starowicz, Przewlocka, 2003, Adán, Gispen, 1997, Catania et al, 2000, Cone, 2005,] Использование коротких фрагментов природных гормонов позволило отделить эндокринные (кортикотропные и меланотропные) свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия

Однако, несмотря на многочисленные исследования нейротропной активности МК и их рецепторов, механизмы, лежащие в основе различных эффектов пептидов этого класса, во многом остаются неясными [Adán, Gispen, 2000, Wikberg, 2000]

Доказательство широкого спектра физиологической активности МК и открытие семейства их рецепторов предоставило новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях [Adán, Gispen, 1997, Catania et al, 2000, Cone, 2005] Препятствием для использования природных МК в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении Для создания лекарственных препаратов на основе АКТГ-подобных пептидов необходимо было разработать их стабилизированные аналоги, лишенные гормональных эффектов [Wikberg, 2000] Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы В ходе этих экспериментов были разработаны аналоги природных МК, лишенные гормональных эффектов, обладающие выраженной биологической активностью и высокой устойчивостью к действию протеаз В результате многолетних исследований был разработан аналог АКТГ4-10 пролонгированного действия - семакс, структура которого включает в себя фрагмент АКТГ4.7 и трипептид Pro-Gly-Pro [Пономарева-Степная и др, 1984] Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическими эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемического инсульта [Ashmarin et al, 1995] Клинические исследования показали его высокую эффективность при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта [Ашмарин и др, 1997] На сегодняшний день этот пептид является единственным широко используемым в клинике лекарственным нейротропным препаратом, разработанным на основе фрагментов АКТГ Несмотря на то, что лекарственные препараты, разработанные на основе семакса, уже более 10 лет используются в клинической практике, исследования физиологических эффектов этого пептида, направленные на выяснение механизмов его действия и на расширение спектра клинического применения препарата, продолжаются

До настоящего времени не определен спектр физиологической активности семакса, не выяснены механизмы, лежащие в основе его пролонгированного

действия, не изучена зависимость структура - активность для отдельных составляющих биологической активности препарата, не выявлено значение отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его нейротропных эффектов Изучение нейропротекторных эффектов семакса на экспериментальных моделях различных патологических состояний позволит расширить возможности клинического применения этого препарата Кроме того, практически все исследования эффектов данного пептида проводили в экспериментах на взрослых животных, поэтому актуальной задачей является оценка вероятных последствий воздействия семакса на развивающийся мозг с целью определения его возможных отставленных эффектов Также важной задачей является оценка ноцицептивных эффектов семакса в норме и на фоне изменения активности различных медиаторных систем Полученные данные могут способствовать выяснению механизмов действия и расширению клинического применения лекарственного препарата семакс

Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось изучение спектра физиологической активности семакса и оценка зависимости эффектов препарата от структуры

Перед нами были поставлены следующие задачи

1 исследование зависимости ноотропных эффектов семакса от времени, дозы, способа введения и вида подкрепляющего раздражителя,

2 изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных,

3 исследование протекторного действия пептида на фоне фармакологически-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга,

4 оценка последствий хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс,

5 изучение влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс,

6 исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных,

7 изучение взаимодействия пептида с опиоидной системой мозга,

8 исследование влияния модификации Ы-концевом области молекулы семакса на сохранение и длительность его ноотропного действия,

9 изучение зависимости анальгетических эффектов ряда синтетических МК от структуры

Научная новизна В представленной работе впервые детально исследованы физиологические эффекты гептапептида семакс в экспериментах на животных Изучено ноотропное действие пептида в различных экспериментальных моделях при внутрибрюшинном и интраназальном способах введения в организм Выявлена анксиолитическая и антидепрессантная активность препарата В работе исследованы эффекты семакса на фоне фармакологически вызванных нарушений дофаминергической системы мозга Показано, что интраназальное введение препарата способствует функциональному восстановлению животных при МФТП-вызванной модели нарушения этой системы Исследованы эффекты семакса в период развития нервной системы животных, полученные результаты свидетельствуют о модулирующем влиянии семакса на развитие нервной системы Впервые проведено исследование влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс Изучено анальгетическое действие гептапептида семакс в экспериментах на животных, проведено сопоставление антиноцицептивного действия препарата в различных экспериментальных моделях При исследовании механизмов влияния семакса на болевую чувствительность животных впервые показана роль серотонинергической и опиоидной систем в реализации анальгетических эффектов семакса Продемонстрированы антиопиоидные свойства семакса, которые были отмечены как на фоне активации эндогенной опиоидной системы, так и при введении экзогенных опиоидов Показано, что семакс более эффективно улучшает обучение животных при интраназальном, чем при внутрибрюшинном введении, что доказывает преимущество интраназального способа введения пептида в организм Впервые изучены физиологические эффекты семакса в дозах, соответствующих рекомендованным для однократного введения дозам препаратов "Семакс 0,1%" и "Семакс 1%" Впервые исследованы ноотропные эффекты продуктов ферментативной деградации семакса, что позволило высказать предположения о механизмах его пролонгированного действия Исследована зависимость ноотропных и анальгетических эффектов ряда синтетических аналогов меланокортинов от структуры Доказана важная роль М-концевого аминокислотного остатка для сохранения нейротропной активности пептида

Основные положения, выносимые на защиту

1 Аналог АКТГ4.ю гептапептид семакс, как и природные меланокортины, обладает широким спектром нейротропной активности Этот препарат оказывает ноотропное, нейропротекторное, анксиолитическое, антидепрессантное, анальгетическое и антиопиоидное действие, влияет на развитие нервной системы В

основе перечисленных эффектов семакса могут лежать различные механизмы, в частности, увеличение экспрессии нейротрофических факторов в мозге и изменение функциональной активности системы биогенных аминов

2 В основе пролонгированного действия семакса лежит выраженная физиологическая активность и высокая протеолитическая устойчивость продуктов его ферментативной деградации Модификация N-концевой области молекулы семакса приводит к изменению как ноотропной, так и анальгетической активности пептида, что может быть связано с изменением скорости и путей протеолитической деградации пептида

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные данные позволяют расширить представления о нейротропных воздействиях синтетических аналогов меланокортинов, способствуют определению спектра биологической активности аналога АКТГ4.10 семакса и выяснению механизмов, лежащих в основе эффектов этого пептида, позволяют сделать предположения о зависимости нейротропных эффектов меланокортинов от структуры Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра применения лекарственных препаратов, разработанных на основе пептида семакс Эти препараты могут быть использованы для лечения патологий у детей в ранний лостнатальный период, в терапии болезни Паркинсона, в качестве анксиолитического и антидепрессантного средства и, возможно, в наркологической практике

Апробация работы Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе 5th Meeting of the European Behavioral Pharmacology Society (UK, 1994), 1-й съезд Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Meeting of European Neuroscience, (Berlin, Germany, 1998), конференция "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, Беларусь, 1999), II и III Российский конгресс по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), XXX Всеросийское совещание по проблемам высшей нервной деятельности (С -Петербург, 2000), XVIII, XIX и XX съездах физиологического общества им И П Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва, 2007), 7-th Regional Meeting of European College of Neuropsychopharmacology (2002), III съезд биохимического общества (С -Петербург, 2002), Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (Москва, 2003, С -Петербург, 2005), 2-й Съезд Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), научная конференция «Нейрохимия

фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), I съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005), 5-th Forum of European Neuroscience (Vienna, Austria, 2006) Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им MB Ломоносова и Отдела химии физиологически активных веществ института молекулярной генетики РАН (май 2007 г)

По теме диссертации опубликовано более 90 печатных работ, в том числе 31 статья в рецензируемых журналах, получено 2 патента на изобретение

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", Программы "Ведущие научные школы РФ", Российского фонда фундаментальных исследований Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 345 страницах, содержит 132 рисунка и 18 таблиц Список литературы включает 478 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на половозрелых самцах белых нелинейных крыс (массой 180-250 г) и мышей (25-30 г) Часть исследования проведена на детенышах белых крыс, выращенных в виварии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище и соблюдением 12-ти часового светового режима дня

В работе были использованы следующие препараты

- семакс - Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (MEHFPGP),

- АКТГ(4-10) - Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (MEHFRWG) (фирма Sigma)

- аналоги семакса

Giu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (EHFPGP), His-Phe-Pro-Gly-Pro (HF PGP), Lys-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (KEHFPGP), Gly-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (GEHFPGP),

rMet-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (rMEHFPGP), где r - остаток глюконовой кислоты,

- аналог АКТГ(5-7) Glu-Arg-Pro (ERP)

Все синтетические меланокортины синтезированы в Секторе регуляторных пептидов Института Молекулярной генетики РАН Пептиды вводили внутрибрюшинно (в/б) или интраназально (и/н) в дозах от 1 5 Мкг/кг до 1 5 мг/кг Дозы препарата 50 и 500 мкг/кг соответствуют рекомендованным для однократного введения дозам препаратов "Семакс-0 1% раствор" и "Семакс-1% раствор"

В целях изменения состояния опиоидной системы мозга использовали морфин и неселективный блокатор опиоидных рецепторов налоксон (фирма Sigma) Для воздействия на дофаминергическую (ДА) систему мозга использовали нейротоксин МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) и блокатор ДА-рецепторов галоперидол (Гедеон Рихтер А О, Венгрия) Для блокады серотониновых рецепторов использовали ципрогептадин (фирма Sigma)

Для решения поставленных задач были использованы следующие методики Методы оценки способности животных к обучению

В качестве модели обучения с положительным подкреплением использовали выработку пищедобывательного рефлекса на место Обучение взрослых крыс проводили в Т-образном лабиринте (размер рукавов - 30x10 см, стартовой камеры 20x10 см) Животное в течение 4-х дней ежедневно помещали в лабиринт по 5 раз подряд, длительность каждой из посадок не превышала 3-х минут В качестве подкрепления использовапись хлебные шарики Регистрировали число выполненных реакций (количество случаев, когда животное находит подкрепление в течение 3-х минут пребывания в лабиринте), латентный период выхода из стартовой камеры, время реакции, число ошибок Обучение детенышей проводили в т н сложном лабиринте - квадратной камере (60x60 см), разделенной пятью перегородками с отверстиями на 6 параллельных отсеков-коридоров Выработку навыка и регистрацию поведенческих параметров осуществляли так же, как и в Т-образном лабиринте

В качестве модели обучения с отрицательным подкреплением использовали тесты выработки условных рефлексов активного и пассивного избегания болевого раздражителя

Выработку условного рефлекса активного (УРАИ) проводили в камере (30x22x35 см) с угловой полкой на высоте 25 см и решетчатым полом, соединенным с электростимулятором Условным сигналом служил звук звонка длительностью 3 сек, безусловным раздражителем - удар током Интервал между условным сигналом и ударом тока составлял 2 сек, условной реакцией являлся прыжок на полку Использовали две схемы опыта в одном случае обучение проводили в течение 4-х

дней, при этом каждое животное получало по 10 предъявлений условного раздражителя ежедневно, в другом - в течение 2-х дней, по 15 предъявлений ежедневно Регистрировали число выполненных реакций (прыжков на полку в ответ на условный сигнал) и число межсигнальных реакций (прыжков на полку в интервале между предъявлениями)

Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) вырабатывали в камере (50x22x35 см), разделенной перегородкой с отверстием на два отсека один ярко освещался, второй был затемнен Камеру устанавливали на решетчатый пол, соединенный с электростимулятором В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек и регистрировали латентный (ЛП) перехода в темноту Затем отверстие закрывали и на пол в течение 3-х сек подавали электрический ток Через 3 дня проверяли воспроизведение навыка, животное вновь помещали в светлую часть камеры и регистрировали латентный период перехода в темный отсек, а также общее время нахождения на свету в течение 3-х минут наблюдений

Методы изучения двигательной и исследовательской активности

Тест "открытое поле" Поле представляет собой круглую арену диаметром 80 см, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга Животное помещали в центр арены и регистрировали латентный период выхода из центра поля, горизонтальную и вертикальную двигательную активность, груминг, число выходов в центр арены Тестирование проводили в течение 2-х мин в тишине при свете красной лампы Тест "норковая камера" Установка представляет собой квадратную арену (40x40x30 см) с 13 круглыми отверстиями в полу, расчерченном на квадраты В ходе опыта животное помещали в угол камеры и в течение 3-х минут визуально регистрировали следующие показатели латентный период выхода из стартового квадрата, пробег (число пересеченных квадратов), норки (число обследованных отверстий), стойки (число подъемов на задние лапы), груминг Опыты проводились в тишине при свете красной лампы

Методы оценки уровня тревожности "Приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ) Длина рукавов лабиринта составляет 35 см, ширина 10 см, высота стенок 20 см Два противоположных рукава затемнены и закрыты с боков и торцов стенками, два других - освещены и открыты Крысу помещали в центр лабиринта, в течение 3-х минут регистрировали латентный период захода в закрытый отсек, общее время нахождения на свету, количество

стоек, груминг, количество свешиваний со светлых рукавов лабиринта, количество выходов на светлые рукава

"Темная - светлая камера" Камера (48x24x40 см) разделена на 2 равных отсека перегородкой с отверстием Один отсек ярко освещен, другой - затемнен Крысу помещали в освещенный отсек и регистрировали латентный период перехода в темный отсек, а также время, проведенное в светлом отсеке за 3 мин тестирования

Оценка депрессивных составляющих поведения-Метод "принудительного плавания" Тестирование проводилось в цилиндрической емкости объемом 25 л на 2/3 заполненной водой (t=27-28°C) Животное помещалось в воду и в течение 10 минут визуально регистрировались следующие параметры

- суммарная длительность активного плавания - крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости,

-суммарная длительность иммобилизации - животное неподвижно или совершает движения, направленные только на поддержание тела на поверхности воды,

- суммарная длительность клайминга - крыса совершает активные движения передними лапами, пытаясь выбраться из воды (карабкается по стенке сосуда),

- латентный период первой иммобилизации

Методы оценки болевой чувствительности Тест "отдергивание хвоста" Болевое раздражение наносили погружением хвоста в воду, нагретую до температуры 56°С Уровень болевой чувствительности определяли по латентному периоду одергивания хвоста Измерения проводили в течение 30 минут до и 120 минут после введения препарата, с интервалом 15 минут Первое измерение приобретенной болевой чувствительности проводили через 15 мин после инъекции

Тест "горячая пластина" (Ugo Basile, Italy) Животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53° С Регистрировали время от момента посадки до первого облизывания задней лапы Латентный период реакции определяли в течение 30 мин до и 120 мин после введения препаратов с интервалом 15 мин Тест "сдавливание задней лапы" Измерение проводилось с помощью анальгезиметра фирмы "Ugo Basile" Задняя лапа крысы помещалась на маленькую подставку Сверху к лапе прикасался пластиковый конус, жестко связанный с направляющим стержнем прибора После включения прибора по направляющему стержню начинает перемещаться груз (скорость 1 деление/сек), давление вершины конуса на поверхность лапы равномерно нарастает В момент возникновения болевых ощущений крыса отдергивает лапу При этом регистрируется расстояние,

пройденное грузом по стержню 1 условная единица длины соответствует увеличению давящей нагрузки на 20 г

При анализе результатов, полученных в тестах "отдергивание хвоста", "сдавливание задней лапы" и "горячая пластина", для вычисления фоновой болевой чувствительности исходные значения усредняли Для каждого животного при каждом измерении вычисляли относительное изменение болевой чувствительности (процент от максимально возможного эффекта - %МВЭ) по формуле (Р,— Po) I (Ртах — Ро) х 100, где Р, - величина болевого порога при измерении, Ро - фоновая болевая чувствительность, Ртах - максимальная длительность болевого раздражения [Akil, 1975] Для тестов "горячая пластина" и "отдергивание хвоста" она составляла - Ртах=30 сек, для теста "сдавливание задней лапы" - Ртах=25 уел ед Модель висцеральных болей - метод "корчей" Исследование болевой чувствительности методом "корчи" проводили на мышах Животным, предварительно получившим инъекцию семакса или растворителя, внутрибрюшинмо вводили 0 6% раствор уксусной кислоты в объеме 0 1 мл/10 г Через 5 минут после введения кислоты подсчитывали количество корчей в течение двух последовательных 10-минутных интервалов

Регистрация электрокардиограммы крыс

Для регистрации ЭКГ животным под кожу вводили два проволочных электрода один - на уровне верхних грудных позвонков ближе к передней левой конечности, другой - на уровне верхних поясничных позвонков ближе к правой нижней конечности На следующий день после операции крысы адаптировались в камере регистрации в течение 30 минут Через двое суток после операции исследовалось влияние препаратов на ЭКГ крыс Регистрация ЭКГ проводилась с помощью программы CONAN, обработка данных осуществлялась с помощью программы для анализа и записей ЭКГ "RR" Электроды через усилитель соединялись с аналого-цифровым преобразователем компьютера Оцифровка аналоговых сигналов проводилась с частотой 300 Гц Фоновая запись повторялась 3 раза с интервалом в 15 минут После третьей записи животным вводили исследуемые препараты Спустя 15, 30, 45 и 60 минут после инъекции вновь регистрировали ЭКГ Длительность каждой записи составляла 150 сек

Статистическая обработка данных

Обработка результатов производилась с помощью пакета статистических программ "Statistrca" Вычислялись средние, дисперсии и стандартные статистические отклонения массивов данных Отличия между группами оценивались

с помощью АЫОУА-методов, точного критерия Фишера м критерия х2 Использовали также параметрический корреляционный анализ Отличие считали достоверным при р<О 05 Данные на графиках представлены в виде среднее + стандартная ошибка среднего

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка спектра физиологической активности семакса Исследование ноотропных эффектов семакса

В первой части нашего исследования проводилось изучение ноотропного действия семакса Ранее было показано, что семакс улучшает обучение животных, при этом длительность его эффектов составляет не менее 20 часов и эффекты сохраняются при интраназальном введении [Пономарева-Степная и др, 1984, АэЬтапп е» а!, 1995] Однако большая часть исследований ноотропных эффектов семакса проводилась с использованием моделей обучения с положительным подкреплением В моделях обучения с отрицательным подкреплением были получены противоречивые данные [Гецова и др, 1988, АзЬтапп е! а!, 1995] Поэтому нами исследовалось влияние пептида на обучение животных в различных экспериментальных моделях, а также изучалась зависимость ноотропных эффектов семакса от дозы, времени и способа введения в организм

Эксперименты показали, что при в/б введении пептида в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до обучения семакс улучшает выработку рефлексов активного и пассивного избегания (рис 1а) В группе животных, получавших семакс, было отмечено достоверное увеличение числа выполненных реакций при обучении в тесте У РАИ, а также значимое увеличение латентного периода захода в темный отсек (ЛП) и общего времени, проведенного в светлом отсеке, при проверке выработки УРПИ Нами также было зарегистрировано положительное влияние семакса на обучение животных в различных моделях при в/б введении пептида за 20 часов до обучения (рис 16) При и/н введении семакса в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до обучения наблюдалось улучшение обучения животных в тестах УРАН и УРПИ (рис 1 в)

Задачей нашего дальнейшего исследования явилось изучение зависимости ноотропного действия пептида от дозы Для этого нами исследовалось влияние семакса при в/б и и/н введении в дозах 15, 15, 50 и 500 мкг/кг на выработку УРПИ Ранее было показано, что при в/б введении семакс улучшает обучение в Т-образном лабиринте в дозах 15-100 мкг/кг, при увеличении дозы до 500 мкг/кг эффект исчезает [Ашмарин и др , 1997] Изучение зависимости доза-эффект для одного из самых

УРАИ

УРПИ

число выполненных реакции

8 -6

4 Н 2

дни обучения

число выполненных реакции

10 -| 8 -6 -4 -2

2 3 дни обучения

■ контроль

- - се макс

число выполненных реакций Ют

*

8 -6 -4 -

2

2 3

дни обучения

сек

150 - *

120 - т т

90 -

60 -

30 -

о- Ц|

ЛП

сек 150 -120 -90 -60 -30 -

о

ЛП

□ контроль

сек 150 -120 -90 -60 ■ 30 -о -

ЛП

II

РщМ

I !Й

время на свету

Жр

И

Ш

время на свету

О семакс

время на свету

В

Рис. 1. Влияние семакеа на обучение животных в тестах выработки условного рефлекса активного и пассивного избегания. Пептид вводили в дозе 50 мкг Iкг в/6 за 15 мин до обучения (А), в/б за 20 час до обучения (Б), и/н зэ 15 мин до обучения (Б). Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0.05) и ** (р-:0.01).

* * I 1

Рис 2 Зависимость ноотропного эффекта семакса от дозы при

200

внутрибрюшинном интраназальном

и

введении

150

препарата По оси абсцисс - доза пептида, по оси ординат

100

50

мкг/кг

латентный период захода в темный отсек в тесте УРПИ в процентах к контролю Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0 05)

0 1,5 15 50 500

исследованных аналогов фрагментов АКТГ ORG 2766 показало, что при увеличении эффективной дозы в 5 раз происходит реверсия поведенческих эффектов -введение этого пептида приводит к нарушению выработки УРПИ [Fekete, De Wied, 1982] Поэтому для оценки зависимости доза - эффект для семакса нами была выбрана эта экспериментальная модель

Проведенные нами исследования показали, что при в/б введении семакс улучшает обучение в дозах 15 и 50 мкг/кг Снижение и увеличение дозы приводит к исчезновению эффекта (рис 2) При и/н введении достоверное улучшение обучение животных было зарегистрировано для доз 1 5,15 и 50 мкг/кг Увеличение дозы, как и в первом случае, приводило к отсутствию эффекта Таким образом, при и/н введении семакс сохранял ноотропную активность в более низких дозах, следовательно эффективность семакса выше при и/н, чем при в/б введении При этом, как видно на графиках, при различных способах введения увеличение эффективной дозы в 10 раз не приводит к реверсии эффекта пептида

На основании полученных данных можно заключить, что положительное ноотропное действие семакса наблюдается в моделях как с положительным, так и с отрицательным подкреплением, длительность ноотропных эффектов пептида в различных экспериментальных моделях составляет не менее 20 часов, сопоставление ноотропных эффектов семакса при различных способах введения свидетельствует о большей эффективности пептида при интраназальном, чем при внутрибрюшинном введении в организм

Изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных

Способность животных к выработке как пищедобывательных, так и оборонительных рефлексов зависит от баланса исследовательской и оборонительной мотиваций. Поэтому при анализе ноотропного действия различных препаратов необходимо учитывать их влияние на исследовательскую активность и уровень тревожности. Согласно данным литературы, природные МК повышают уровень тревожности животных [Adán, et al., 1999; Kask et al., 1998]. Поэтому целью следующего раздела нашей работы было исследование влияния семакса на исследовательское поведение и уровень тревожности крыс. Нами также изучалось влияние пептида на выраженность депрессивных составляющих поведения животных в тесте "принудительное плавание". Эксперименты показали, что однократное введение семакса в дозах от 50 до 600 м к г/кг за 15, 6-0 мин и 24 часа до тестирования не приводит к изменению параметров поведения животных в тестах "открытое поле" и "приподнятый крестообразный лабиринт" Следовательно, пептид не влияет на исследовательскую активность и уровень тревожности животных

сек

4UU -

300 -

200 -

100-

0-

иммобип

150 i 100500--

активное плавание

ЛП иммоб

□ контроль

о семакс

Рис. 3 Влияние семакса на параметры поведения крыс в тесте "принудительное

плавание". Пептид вводили однократно в доге 50 мкг/кг за 24 часа до тестирования. Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0.05).

При изучении влияния семакса на поведение крыс в тесте "принудительное плавание" нами не было зарегистрировано достоверного изменения регистрируемых показателей при введении пептида за 15 мин и 3 часа до плавания. Однако через сутки после введения отмечалось значимое увеличение патентного периода иммобилизации (рис. 3). Следовательно, однократное введение пептида незначительно снижало выраженность депрессивных составляющих поведения крыс в тесте "принудительное плавание". Кроме того, нами была зарегистрирована значимая корреляционная зависимость меизду величиной регистрируемого показателя в контрольной группе животных и выраженностью эффекта семакса {г--0.89; р<0,001) (рис. 4).

Рис. 4 Зависимость эффекта сем экса от вы ражен кости депрессивных составляющих поведения контрольных животных. (По оси X - средняя длительность иммобилизации в контрольных группах крыс; по оси У -изменение длительности иммобилизации в опытных группах относительно контроля по отдельным экспериментам) Каждая точка на графике представляет результаты, полученные в отдельном эксперименте. Прямая соответствует результатам корреляционного анализа

На основании полученных данных можно заключить, что введение семакса в дозе 50 мкг/кг за 24 часа до тестирования оказывает нормализующее воздействие на депрессивные составляющие поведения крыс в тесте "принудительное плавание".

Лекарственный препарат семакс в клинике в большинстве случаев назначают курсом длительность 2-3 недели, т.е. хронически. Поэтому нами исследовалось влияние хронического введения препарата на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных. Пептид вводили и/н в дозе 50 мкг/кг в течение 14 дней Эксперименты показали, что при хроническом введении сом яке не влияет на двигательную активность и исследовательское поведение крыс в тесте ''норковая камера". При оценке уровня тревожности в тесте "темная-светлая камера" в группе крыс, получавших семакс, было зарегистрировано увеличение латентного периода (ЯП) захода в темный отсек камеры и общего времени на свету (рис. 5), что свидетельствует о снижении тревожности животных этой группы. В тесте "принудительное плавание" введение семакса приводило к снижению длительности иммобилизации, увеличению активного плавания и ЛП первой иммобилизации (рис.

50 сек

40 л

30 -

20 ■

10 щ

' "Г ш ■

о -

лп

□ ютнгрси-ь

т

1ШШШ

ШШ6 ■

аремя нэ сеет/

Ш семэкс

Рис. 5 Влияние семакса на параметры поведения крыс в тесте "темная-светлая камера". Пептид вводили и/н в дозе 50 мкг/кг в течение 14 дней. Отличия от контроля отмечены * (р<0 05).

сек 510 ■

490470 -450 ■

430

X

и мм обил

100 -.сек 80 -60 • 40 -20 О

н

кпаймкнг

О контроль

актмвноа плавание □ семакс

ЛП иммобил

Рис. 6 Влияние семакса на параметры поведения крыс в тесте

"принудительное плавание". Пептид

вводили и/н е дозе 50 мкг/кг в течение 14 дней. Отличия от контроля отмечены * (р<0.05).

На основании полученных данных можно заключить, что хроническое введение семакса приводит к снижению тревожности и депрессивное™ и не влияет на исследовательскую активность, экспериментальных животных.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что при однократном введении семакс в широком диапазоне доз не приводит к изменению исследовательской активности и тревожности животных. При изучении влияния пептида на обучение в Т-образном лабиринте и тесте УРАИ улучшение обучения во многих экспериментах было зарегистрировано уже е первый день обучения, т.е. после однократного введения пептида. При обучении в УРПИ пептид вводили перед сеансом обучения, один раз. Отсутствие влияния острого введения семакса на исследовательскую активность и тревожность животных свидетельствует о том, что в основе ноотропного действия препарата лежат более специфические механизмы -воздействие на восприятие стимулов окружающей среды и (или) влияние на консолидацию памятного следа.

Исследование нейропротекторных эффектов семакса на фоне нарушений дофаминергической системы мозга крыс

Задачей следующего раздела нашей работы явилась оценка эффектов семакса на фене нарушения ДА-ергической системы мозга. Для нарушения ДА-системы использовали нейротоксин МФТП, избирательно поражающий ДА-нейроны черной субстанции мозга. Токсин вводили однократно в/б в дозе 25 мг/кг, через 30 мин провода™ первую инъекцию семаксз в дальнейшем семакс вводили ежедневно в течение 4-х дней, и/н в дозах 50 или 200 мкг/кг. Было показано, что ежедневное введение семакса в обеих дозах не приводило к изменению параметров поведения животных в использованных тестах. Введение нейротоксина вызывало и увеличение тревожности животных в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт'. В группе

крыс, получавших МФТП, отмечалось уменьшение времени, проведенного на открытых рукавах лабиринта, числа выходов на открытые рукава и свешиваний (рис. 1), В тесте "норковая камера" быпо зарегистрировано у&егмченяе патентного периода выхода из стартового квадрата, уменьшение пробега и числа стоек по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижение двигательной и исследовательской активности (рис, 8). Введение семакса в дозе 50 мкг/кг животным, получавшим нейротоксин в ряде случаев уменьшало выраженность изменений поведения, вызванных МФТП. Однако эти отличия не были достоверны Введение семакса в большей дозе (200 мкг/кг) в значительной степени нормализовало поведение животных, нарушенное нейротонсином Т.о., ежедневное введение семакса в дозе 200 мкг/кг ускоряло функциональное восстановление животных с повреждениями ДА-системы, вызванными МФТП

сек

50 i 40 -30 -20 J 10 0

время на свет/ чисга выходов на открытые рукава

свеиувании

Рис. 7 Влияние семакса нэ изменения поведения крыс в тесте ПКЛ вызванные введен/ли МФТП. Значимые отличия от контроля отмечены *, от группы с введением МФТП - # (р<0.05).

О контрогь

В МФТП

О МФТЛ+Сем

ЛП

сек ДО -i

30 -20 -100'

I

шт

30 -20 -10 -о -

пробег

стойки

i

I

□ контрогь

ИМФТЛ

И МФТП+Ceivi

Рис. 8 Влияние семакса на изменения поведения крыс в тесте "норковая камера", вызванные

введением МФТП.

Значимые отличия от контроля отмечены *, от группы с введением МФТП - # (р<0.05).

Исследования влияния семакса нз содержание нейротрофических факторов в мозге, проведенные в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток ИМГ РАН, показали, что введение пептида приводит к увеличению содержания

нейротрофинов BDNF и NGF в мозге [Dolotov et ai, 2006] Можно предположить, в случае МФТП-вызванных нарушений эффекты семакса связаны с его нейропротекторной и нейротрофической активностью, обеспечивающей ослабление повреждения и восстановление обратимо поврежденных ДА-нейронов

Исследование отставленных поведенческих эффектов хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс

Из данных литературы известно, что введение МК в пренатальный и ранний постнатальный период оказывает влияние на развивающийся мозг и вызывает отставленные долговременные изменения поведения животных [Strand et al, 1989] Большая часть исследований эффектов семакса проводилась на взрослых животных Задачей нашего дальнейшего исследования было оценка влияния семакса на развивающуюся нервную систему Эксперименты проводились на детенышах белых крыс обоего пола Каждый выводок крысят делили на контрольных и опытных животных Животные опытных групп получали инъекции семакса, контрольных - растворителя При обработке результатов значения параметров поведения для ка>едого выводка нормировали к собственному контролю Нами были исследованы эффекты хронического введения семакса в различные периоды неонатального развития (1, 2, 2-3 недели жизни) как при в/б, так и при и/н способах введения При различных сроках и способах введения были получены близкие результаты На рисунке 9 представлены результаты, полученные при в/б введении пептида в дозе 50 мкг/кг в течение 2-3 недель жизни крыс Было показано, что введение пептида приводит в дальнейшем к увеличению исследовательского поведения в тесте "открытое поле", снижению тревожности в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт", уменьшению депрессивных составляющих поведения в тесте "принудительное плавание" Кроме того, у животных, получавших семакс, отмечено улучшение обучения в тесте УРПИ

Т о, изменения поведения животных, получавших неонатально семакс, можно оценить как положительные Отмеченные изменения наблюдаются, по крайней мере, в течение 2-х месяцев жизни, т е через 2-7 недель после последней инъекции пептида, следовательно носят отставленный долговременный характер

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что в ранний постнатальный период такие воздействия как взятие в руки, отлучение от матери, болевая стимуляция (введение препаратов), являются для животных стрессогенным воздействием и могут вызывать отставленные изменения поведения животных [Huot et al, 2002, Nyakas et al, 1981] Для оценки отставленных эффектов используемых

%

15010050 0

Открытое поле (50 дней)

*

I

е£«1

лп

Пробег Стойки Выходы

* %

т 200-

-ВЦ 150-

100-

88 50-

0 -I

Крестообразный лабиринт (52 дня)

□ контроль

Исемакс

«Принудительное плавание» (50 дней) % *

250

50

*

т гЧ *

Ш I Ьй!

клайминг активное иммобил

□ контроль

В семакс

РЧ I I 1

\ 7. г. 1

1

лп

на свету

%

160 -120 -80 40 0

УРПИ (40 дней) * *

X.

ЛП

время на свету

Рис 9 Отставленные эффекты хронического неонатального введения семакса 1детенышам белых крыс Пептид вводили в/б, ежедневно в течение 2-3 недель постнатального развития Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0 05) В скобках указан возраст животных в момент тестирования

экспериментальных манипуляций нами проводилась отдельная серия опытов - при этом каждый выводок делили на "интактный контроль" (крысы этой группы не извлекались из гнезда до первого тестирования) и "контроль" (животных подвергали тем же воздействиям, что и контрольных крыс в предыдущей серии опытов) Далее животные исследовались по той же схеме Было показано, что "интактный контроль" характеризуется более высокой исследовательской активностью и сниженной тревожностью по сравнению с группой "контроль" Отличий по способности к обучению у животных этих групп зарегистрировано не было Следовательно, используемые нами экспериментальные манипуляции в дальнейшем вызывают снижение исследовательского поведения и увеличение тревожности по сравнению с интактным контролем, но не влияют на обучение Можно предположить, что неонатальное введение пептида приводит к компенсации таких отрицательных последствий неонатального стресса, как снижение исследовательской активности и

увеличение тревожности В основе отставленных влияний семакса на обучение крыс лежат механизмы, не связанные с изменением реакции животных на стрессогенные воздействия

Исследование кардиотропных эффектов семакса

Хорошо известно, что природные МК оказывают влияние на деятельность сердечно-сосудистой системы При этом в зависимости от структуры и способа введения могут наблюдаться различные кардиотропные эффекты {Van Bergen et al, 1995, Gruber, Callahan, 1989] Задачей нашего дальнейшего исследования была оценка влияния семакса на частоту сердечных сокращений (ЧСС) крыс в свободном поведении Эксперименты показали, что введение пептида в дозах 50 и 500 мкг/кг не приводит к изменению ЧСС крыс в течение 1 часа регистрации (рис 10) Следовательно, в исследованных нами дозах пептид не влияет на параметры сердечного ритма крыс

180 т мсек 150120 ■

мин

—I

фон 15 30 45 60

' —♦— контроль - -О- - семакс (50 мкг/кг)1

180-1 150120

мсек

^-—-Й—■■-%---^4

мин

фон 15 30 45 60

I—♦—контроль А - семакс (500 мкг/кг) '

Рис 10 Влияние семакса на частоту сердечных сокращений у крыс По оси абсцисс -время после введения пептида, по оси ординат - длительность кардиоинтервалов

Исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных

Многочисленные данные свидетельствуют об участии природных МК в регуляции болевой чувствительности [Williams et al, 1986, Takeshige et al, 1991, Kshatn, Foster, 1997] Семакс используется в клинике, однако, исследования влияния этого пептида на болевую чувствительность животных не проводилось Поэтому целью следующего раздела наших исследований было изучение влияния этого пептида на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях Было показано, что введение пептида в дозах 50 и 500 мкг/кг не влияет на

15-% 10

5

о , а-т

-5-1 -30 -15 -10

15 Ж Ш 75 ЭД 105 120

- контроль —о— семакс (50 мкг/кг) - -а- - семэкс (500 мкг/кг)

15 10 -5 -О

-5 --10 -

- контроп? —о— семакс (50 мкг/кг) - -а- - семике (500 мкг/кг^ % * * В

- контроль —О — семакс (50 мкг/кг) - - семакс (500 мкг/кг)'

Рис. 11. Влияние семакса на болевую чувствительность животных в тестах "отдергивания хвоста" (А), "горячая пластина" (Б) и "сдавливания задней лапы" (В) По оси абсцисс - время после введения пептида, па оси ординат - аапичима болевого порога а процентах к максимально возможному эффекту Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0.05) и " (р<0.01).

30-5У

40-60

□ контроль п сеглэкс (50 мкг/кг) н семакс (500 мкг/кг)

60 50 -40

3о 20 -10

%

Г= 0,972 рсО,01

Л /

X-

мкг/кг

1,5

15 50

500 1500

Рис. 12 Влияние семакса на болевую чувствительность мышей в тесте корчей, вызванных введением уксусной кислоты. Значимые отличия от контроля отмечены *

Рис. 13 Зависимость анальгетичвского эффекта семакса от дозы. По оси абсцисс - доза пептида, по оси ординат -изменение болевого порога в тесте "сдавливания задней лапы"

величину болевого порога в тесте "отдергивание хвоста" (рис 11а) Однако инъекция семакса в тех же дозах увеличивает болевой порог животных в тесте "горячая пластина" (рис 116) Также возрастание болевого порога было зарегистрировано в тесте "сдавливания задней лапы" (рис 11в) Кроме того, анальгетическое действие семакса было зарегистрировано в модели висцеральной боли - тесте "корчей, вызванных введением уксусной кислоты" (рис 12) Исследование зависимости анальгетической активности семакса от дозы показало, что пептид влияет на болевую чувствительность в дозах от 1,5 мкг/кг до 1,5 мг/кг (рис 13) Зарегистрирована значимая корреляционная зависимость выраженности эффекта от дозы

Для выяснения механизмов анальгетических эффектов семакса нами исследовалось влияние пептида на болевую чувствительность на фоне блокады серотониновых рецепторов ципрогептадином и опиоидных рецепторов налоксоном Блокаторы вводили внутрибрюшинно за 10 мин до инъекции семакса Было показало, что предварительное введение ципрогептадина в дозе 1 мг/кг препятствует развитию анальгетических эффектов семакса (рис 14а) Введение налоксона в дозе 1 мкг/кг не влияет, а в дозе 5 мкг/кг ослабляет влияние пептида на болевую чувствительность животных (рис 146) Известно, что налоксон с большей афинностью связывается с (1-опиоидными рецепторами, а при увеличении дозы он

□ контроль псемакс (500 мкг/кг) п контроль в семакс (500 мкг/кг)

¡Вципрогетздин (1 мг/кг) в ципр/сем в налоксон (5 мг/кг) в нал/сем

Рис 14 Влияние семакса на болевую чувствительность крыс на фоне действия ципрогептадина (А) и налоксона (Б) На гистограммах представлено среднее изменение болевого порога крыс в тесте "сдавливания задней лапы" в течение всего периода регистрации Значимые отличия от контроля отмечены *, от группы с введением семакса - # (р<0 05)

может взаимодействовать и с другими типами опиоидных рецепторов Мы предполагаем, что эффекты семакса не связаны с р-рецепторами, но могут быть опосредованы другими типами опиоидных рецепторов

Сопоставление результатов, полученных в различных экспериментальных моделях, позволяет заключить, что в/б введение семакса приводит к снижению болевой чувствительности животных, эффекты пептида регистрируются в моделях как соматической, так и висцеральной боли, осуществляются при участии супраспинальных механизмов В реализации анальгетических эффектов семакса вовлечены серотонинергическая и опиоидная системы

Исследование взаимодействия семакса с опиоидной системой

Задачей наших дальнейших исследований было изучение взаимодействия семакса с опиоидной системой Показано, что при совместном введении МК и опиоидов наблюдается взаимное подавление эффектов препаратов на болевую чувствительность [Fratta et al, 1981, Contreras, Takemori, 1984] Нами было исследовано влияние семакса на анальгетическое действие агониста опиоидных рецепторов морфина Было показано, что в/б введение морфина приводит к достоверному увеличению болевого порога крыс в тесте "сдавливания задней лапы" в течение всего периода регистрации (рис 15) Введение семакса также вызывало значимое снижение болевой чувствительности Однако при совместном введении

-20 J

—♦— контроль - -а- - семакс (500 мкг/кг)

—морфин (5 мг/кг) —ж - семакс / морфин

Рис 15 Влияние семакса, морфина и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливания задней лапы" По оси абсцисс - время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту Значимые отличия от контроля отмечены *, от группы с введением семакса - # (р<0 05)

препаратов эффекты морфина были менее выражены, достоверные отличия от группы крыс, получавших морфин, наблюдались через 60-75 мин после введения семакса Следовательно, предварительное в/б введение семакса приводит к ослаблению анальгетаческого действия морфина

Нами также проводилось исследование влияния семакса на анальгезию, вызванную стрессом Известно, что стрессогенные воздействия различной природы приводят к активации эндогенной системы подавления болевой чувствительности -развивается стресс-вызванная анальгезия (СБА) [Bergmann, 1987, Богданов и др, 1995] В зависимости от условий может активироваться как опиоидные, так и не опиоидные механизмы - развиваться опиоидная или неопиоидная формы СВА В разных условиях могут наблюдаться как отдельная, так и совместная активация опиоидных и неопиоидных механизмов [Bocheva, Drambazova-Maximova, 2004]

70-, 503010-10-

/Г-

* #

Ч

т

30

45

60

75

ф контроль -О- стресс-контроль

- -Щ ■ стресс-семакс (500 мкг/кг) —ж—стресс-налоксон

Рис 16 Влияние семакса и налоксона на анальгезию, вызванную неизбегаемым плаванием Болевую чувствительность крыс измеряли в тесте "сдавливания задней лапы" По оси абсцисс - время после введения пептида, по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эфсЬекту Значимые отличия от контроля отмечены *, от группы "стресс-контроль" - #

В качестве стрессогенного воздействия в данном эксперименте мы использовали неизбегаемое плавание (длительность 10 мин, Т=27-28° С) Такое воздействие приводило к достоверному увеличению болевого порога в тесте "сдавливания задней лапы" Предварительное введение блокатора опиоидных рецепторов налоксона ослабляло выраженность СВА, но не снимало ее полностью, что свидетельствует о смешанной форме анальгезии, содержащей опиоидный компонент (рис 166) Инъекция семакса в дозе 500 мкг/кг за 15 мин до начала стрессогенного воздействия также вызывала ослабление СВА (рис 16а) Таким образом, введение семакса приводит к ослаблению смешанной формы СВА Так как, нами было показано, что семакс снижает анальгетические эффекты опиоидного агониста морфина, мы предположили, что предварительное введение семакса приводит к уменьшению опиоидной составляющей стресс-вызванной анальгезии На основании проведенного исследования можно заключить, что семакс ослабляет анальгетическое действие как экзогенных, так и эндогенных опиоидов, следовательно, обладает антиопиоидной активностью

Таким образом, проведенные нами исследования спектра физиологической активности семакса показали, что этот пептид обладает ноотропной активностью, оказывает анксиолитическое и антидепрессантное действие, обладает нейротротекторной активностью, влияет на развитие ЦНС, снижает болевую чувствительность, оказывает антиопиоидное действие

Изучение зависимости эффектов синтетических меланокортинов от структуры

Целью второй части наших исследований была оценка зависимости нейротропной активности синтетических МК от структуры Для этого нами изучались эффекты ряда синтетических аналогов Ы-концевых фрагментов АКТГ

Ноотропные эффекты продуктов ферментативной деградации семакса

Нами было проведено сравнительное исследование ноотропной активности семакса и его укороченных с Ы-конца аналогов - гексапептида ЕНРРвР, пентапептида НРРвР и тетрапептида РРвР Эксперименты показали, что введение семакса в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до обучения приводило к улучшению обучения крыс в Т-образном лабиринте В группе крыс, получавших семакс, было зарегистрировано значимое увеличение числа выполненных реакций во 2-ой и 3-ий дни обучения (рис 17) Аналог семакса, лишенный И-концевого метионина, также улучшал обучение животных в этом тесте, при этом его эффекты были более выражены, чем эффекты семакса Аналог, лишенный двух Ы-концевых

аминокислотных остатков, сохранял ноотропное действие, но его эффекты были менее выражены, чем эффекты семакса. Введение пентапептида приводило к достоверному увеличению числа выполненных реакций только 8 3-ий день обучения. Отсутствие 3-х М-концевых аминокислотных остатков в молекуле приводило к потере ноотропной активности. Аналогичные результаты были получены при использовании модели обучения с отрицательным подкреплением - УРАИ (рис. 18). Введение семакса вызывало увеличение числа выполненных реакций во 2-ой и 4-ый дни обучения. В группе животных, получавших инъекции ЕНРРСР, наблюдалось

□ контроль О семакс О ЕНРРСР Р НРРОР В РРЭР

Рис. 17 Влияние семакса и его укороченных аналогов на обучение крыс в Т-образном лабиринте. Пептиды вводили в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения. По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - число выполненных реакций. Достоверные отличия от контроля отмечены *, от группы с введением семакса - # (р<0.05).

12 3 4

□ контроль О семакс Ш1 ЕНРРСР □ НРРОР □ РРйР

Рис. 18. Влияние семакса и его укороченных аналогов на обучение крыс в тесте выработки условного рефлекса активного избегания. Пептиды вводили в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения. По оси абсцисс — дни обучения, по оси ординат — число выполненных реакций. Достоверные отличия от контроля отмечены *. от группы с введением семакса - # (р<0.05).

достоверное увеличение данного показателя со 2-го по 4-ый дни обучения, при этом эффекты гексапептида были достоверно более выражены, чем эффекты семакса. При введении пентапептида достоверное улучшение обучения наблюдалось только а 4-ый день эксперимента. Введение тетрапептада не влияло на выработку рефлекса активного избегания

Мы провели сопоставление активности АКТГ^о и его аналога, лишенного М-концевого метионина фрагмента АКТГ5_ю Было показано, что введение АКТГ4.10 ускоряло обучение крыс в Т-образном лабиринте - наблюдалось увеличение числа выполненных реакций со второго по четвертый дни обучения {рис. 19). В группе крыс, получавших АКТГМ0, значимые отличия от контроля наблюдались только в четвертый день. Следовательно, отсутствие М-кснцевого метионина в молекуле фрагмента АКТГ приводит к резкому падению ноотропной активности

□ конгрогь ШАКТГ(4-10) ВАКТГ(5-10)

Рис. 19. Влияние фрагментов АКТГ+щ и АКТГ5.10 на обучение крыс в Т-образном лабиринте Пептиды вводили в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения. По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - число выполненных реакций. Достоверные отличия от контроля отмечены *, от группы с введением АКТГ.,.,о - # (р<0.05).

В организме пептиды подвергаются протеолитической деградации. Образующиеся при этом фрагменты также могут обладать биологической активностью. На схеме (рис. 20) представлены возможные продукты деградации АКТГ^.ц, и семакса при действии n-концевых и С-концевых протеаз. При С-концееой деградации АКТГМВ и семакса образуются гекса-, лента и тетр а пептиды сохраняющие е своей структуре последовательность АКТГ4.7 - минимальный фрагмент АКТГ, обладающий ноотропной активностью [Gispen, Zwiers, 1985] Т.е. в этом случае, как семакс, так и AKTIV« образуют фрагменты, сохраняющие активность. Далее может образовываться фрагмент АКТГ4.6, не обладающий ноотропной активностью [Fekete, De Wied, 1982]. В случае N-концевой

ЕНР1*\ЛГО

НРР!\А/в РРМв *-

АКТГ(4-10) МЕНРРМКЗ

МЕНРР\Л/ МЕНРЯ -»- МЕНР

МЕН

ЕНРРвР НРРвР

РРвР РвР

Сема кс МЕИЯРСР

МЕНРРв ► МЕНРР МЕНР

МЕН

Рис 20 Продукты ферментативной деградации семакса и АКТГ^ю

деградации АКТГ4ю образуется гексапептид с низкой ноотропной активностью, практически не активный пентапептид и не активные короткие фрагменты В случае семакса - активность сохраняют гекса- и пентапептиды Исследования показали высокую протеолитическую устойчивость этих фрагментов семакса [ТюЫагеу е1 а1, 2006]

На основании полученных нами данных можно заключить, что продукты ферментативной деградации АКТГ410 и семакса обладают собственной нейротропной активностью и являются синергистами АКТГ4-ю в отношении воздействия на процессы обучения Наблюдаемые нами при введении этих пептидов эффекты могут быть результатом действия как исходных веществ, так и продуктов их деградации Значительная физиологическая активность и высокая протеолитическая устойчивость семакса и его фрагментов может лежать в основе пролонгированных эффектов этого пептида

Влияние модификации М-концевой области молекулы на ноотропные эффекты аналогов семакса

Поскольку фрагмент семакса, лишенный Ы-концевого метионина, обладает значительной ноотропной активностью, то возникает вопрос о значении аминокислотного остатка, находящегося в первом положении молекулы, для сохранения активности пептида Для того, чтобы ответить на этот вопрос, в следующем разделе нашей работы изучалась ноотропная активность ряда пептидов — аналогов семакса, в которых М-концевой метионин был модифицирован или заменен на другие остатки Все использованные пептиды вводили в/б в дозе 50 мкг/кг за 15 мин, 1 или 20 часов до сеанса обучения Исследовалось влияние

препаратов на выработку пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте, а также на выработку рефлексов активного и пассивного избегания Во всех сериях экспериментов в качестве препарата сравнения использовали семакс Полученные данные суммированы в таблице 1

Таблица 1 Влияние модификации Ы-концевой области молекулы на ноотропные эффекты аналогов семакса

\время после | ^^цведения 15 мин тгеатвд 1 час 20 часов

Семакс I ..... .1 ' т 1

ЕНРРОР т т | т 0

гМЕДОРОР т 1 т т

КЕШФОР т т I *

БЕОТРОР

\VEHFPGP

СЕНРРОР 1 0

1 ТЕОТРОР • 1 1

| АЕШРОР 0

В таблице отмечено одна стрелка - эффекты сопоставимы с эффектами семакса, две стрелки - эффекты, превышающие эффекты семакса, пунктирная стрелка - эффекты менее выражены, чем эффекты семакса, 0 - отсутствие эффекта

Как видно из таблицы, аналог семакса, лишенный Ы-концевого метионина, при введении за 15 мин до обучения более активен, чем семакс При введении пептидов за час до обучения эффекты препаратов сопоставимы, однако инъекция гексапептида за 20 час неэффективна Следовательно, присутствие Ы-концевого метионина необходимо для сохранения длительного действия семакса В случае

модификации N-концевого метионина присоединением остатка глюконовой кислоты, пептид сохраняет активность - через час после введения его эффекты даже более выражены, чем эффекты семакса Однако через 20 часов после инъекции эффекты пептида меньше, чем эффекты семакса Замена метионина на лизин не влияет на ноотропное действие пептида при введении за 15 мин до обучения, однако через час эффекты этого аналога менее выражены, чем эффекты семакса Следовательно, как модификация метионина, так и замена его на лизин приводят к снижению длительности действия гептапептида - аналога семакса

Замена метионина на серин или триптофан приводит к снижению активности пептида - уже через 15 мин после введения эти пептиды улучшают обучение менее эффективно, чем семакс Замена на аланин, глицин или треонин приводит к потере ноотропной активности пептида

Следовательно, хотя отщепление N-концевого аминокислотного остатка приводит к образованию гексапептида с высокой ноотропной активностью, остаток, находящийся в первом положении гептапептида - аналога семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности его нейротропных эффектов

Фрагменты семакса, образующиеся при его ферментативной деградации, сохраняют значительную нейротропную активность Мы предполагаем, что модификация N-концевой области молекулы семакса может влиять на скорость и пути протеолитической деградации пептида Основными ферментами деградации семакса в сыворотке крови являются аминопептидазы Вклад карбокси- и эндопептидаз не очень высок [Potaman et al, 1991] Однако в случае модифицированных пептидов вклад этих ферментов может изменяться Так, например, можно предположить участие эндопептидаз В таком случае пептиды могут быстро деградировать с образованием малоактивных или неактивных (например, FP6P, GEH или АЕН) фрагментов, что приведет к снижению или полной потере нейротропной активности Изучение путей деградации семакса в присутствии предполагаемых мишеней его действия - первичных культурах клеток нейронов и глии показало, что в этом случае деградация пептида происходит как с N, так и с С-конца с образованием 5-и и 4-х членных фрагментов [Долотов и др , 2004] Если в случае семакса при действии карбоксипептидаз будут образовываться фрагменты, содержащие в своей структуре последовательность АКТГ4-7 и сохраняющие нейротропную активность, то в случае аналогов семакса с модифицированной N-концевой областью аналогичные фрагменты могут быть мало активны или не активны

Изучение нейротропных эффектов структурного аналога АКТГ5.7 -mpunenmuda ERP

Следующий раздел наших исследований связан с изучением нейротропной активности структурного аналога АКТГ5.7 трипептида Glu-Arg-Pro - ERP Последовательность этого пептида была разработана на основании расчетов теоретического конформационного анализа, позволившего предположить, что такая модификация структуры приведет увеличению связывания пептида с гипотетическим рецептором

Эксперименты показали, что, в отличие от природных пептидов, введение ERP ухудшает обучение животных Введение пептида приводило к замедлению обучения животных в Т-образном лабиринте (рис 21)

5 и 4

зн 2 1

12 3 4 [—♦—контроль — - ERP (150 мкг/кг)

Рис 21 Влияние ERP на обучение животных в Т-образном лабиринте Пептид вводили ежедневно, в/б, в дозе 150 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат -число выполненных реакций Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0 05)

Нарушения обучения были зарегистрированы также в моделях с отрицательным подкреплением Введение пептида ERP замедляло выработку условного рефлекса активного избегания (рис 22) и ухудшало воспроизведение рефлекса в тесте УРПИ (рис 23)

Нами изучались также эффекты совместного введения ERP и семакса на обучение животных в Т-образном лабиринте (рис 24) Было показано, что введение семакса улучшает обучение животных, введение ERP тормозит выработку навыка При совместном введении пептидов не было зарегистрировано достоверного изменения параметров обучения относительно контроля - следовательно, инъекция трипептида препятствовала проявлению ноотропного действия семакса Таким образом, введение трипептида ERP приводит к нарушению обучения животных и блокирует ноотропное действие семакса, те ERP проявляет свойства функционального антагониста природных фрагментов АКТГ

8 -I

6 -

4 -

2 -

О -

/У

■ s

сек 160 1

120

80

40 Н

0

2 3 4 ЛП время на свету

контроль —о. - ERP (150 мкг/кг) □ контроль а ERP (150 мкг/кг)

Рис. 22 Влияние ERP на выработку УРАИ. Пептид вводили ежедневно, в/б, в дозе 150 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения. По оси абсцисс -дни обучения, по оси ординат - число выполненных реакций Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0.05).

Рис. 23 Влияние ERP на выработку УРПИ Пептид вводили ежедневно, в/б. в доэй 150 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения. Значимые отличия от контроля отмечены * (р<0.05).

150 -100 -50 -

1 2 О семакс й ERP

з 4

а семакс+E.RP

Рис. 24 Влияние семакса. ERP п их совместного введения на обучение животных з Т-образном лабиринте. Пептиды вводили ежеднев!ю. в/6, в дозе 50 мкг/кг за 15 мин до сеанса обучения По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - число выполненных реакций в процентах к контролю а соответствующий день обучения. Значимые отпичия от контроля отмечены * (р<0.05).

Полученные нами данные свидетельствуют о важности последовательности Glu-His для взаимодействия с рецептором-мишенью Замена остатка гистидина на аргинин, вероятно, увеличивает сродство пептида к рецептору При этом сродство оказывается достаточно высоким, чтобы ERP успешно конкурировал с другими пептидами Пептид ERP связывается с рецептором, однако не способен активировать его, что можно объяснить отсутствием остатка фенилаланина в структуре пептида Это предположение согласуется с известным положением о важности этого остатка в молекуле меланокортинов для проявления ноотропной активности [Bohus, 1979] Исследованный трипептид, по-видимому, способен также блокировать действие эндогенных меланокортинов, выступая в качестве их функционального антагониста и вызывая нарушения обучения животных

Зависимость анальгетической активности синтетических меланокортинов от структуры

Целью наших дальнейших исследований явилась оценка анальгетических эффектов ряда синтетических меланокортинов Нами изучалось влияние на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливания задней лапы" следующих пептидов - rMEHFPGP, KEHFPGP, GEHFPGP, EHFPGP, HFPGP и ERP Все исследуемые препараты вводили в/б в дозах 50 и 500 мкг/кг

Проведенные эксперименты показали, что из семи исследованных аналогов фрагментов АКТГ анальгетической активностью обладают только гептапептиды семакс, rMEHFPGP и KEHFPGP (табл 2) При этом зарегистрированное изменение болевого порога не превышает 10-20 % от максимально возможного эффекта, что свидетельствует о мягком модулирующем действии меланокортинов на болевую чувствительность при внутрибрюшинном введении

Эксперименты показали, в случае модификации метионина в молекуле семакса присоединением остатка глюконовой кислоты или замены его на лизин анальгетическое действие пептида сохраняется Замена метионина на глицин приводит к потере анальгетической активности Т е для гептапептидов в отношении влияния на болевую чувствительность сохраняются те же закономерности, что и в случае ноотропного действия Следовательно, аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептида - аналога семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности как ноотропных, так и анальгетических эффектов

ПЕПТИД Семакс MEHFPGP ОБУЧЕНИЕ Анальгетическая активность

t +

rMEHFPGP t +

KEHFPGP t +

GEHFPGP - -

_EHFPGP t -

__HFPGP t -

ERP l -

Таблица 2 Влияние семакса и его аналогов на обучение и болевую чувствительность животных

Т - улучшение обучения, 4- - ухудшение обучения, + - снижение болевой чувствительности, — отсутствие эффекта

Аналоги семакса, укороченные с N-конца, - EHFPGP и HFPGP, не оказывают влияния на болевую чувствительность животных Введение аналога АКТГ5.7 трипептида ERP также не приводило к изменению болевого порога крыс в использованном тесте Т е, для сохранения анальгетической активности необходимо наличие в структуре пептида - аналога фрагмента АКТГ - N-концевых аминокислотных остатков При этом укороченные с N-конца пептиды влияют на обучение Следовательно, структурно-функциональные зависимости для анальгетической и ноотропной активности меланокортинов носят различный характер Кроме того, нами показано, что зависимости этих эффектов от дозы также различны (рис 3 и 13) Полученные нами различия в зависимости ноотропных и анальгетических эффектов семакса от структуры пептида и дозы позволяют предположить существование различных механизмов, лежащих в основе этих эффектов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, проведенные в течение последних 20 лет, способствовали пониманию роли меланокортиновой системы в регуляции различных функций организма Однако до настоящего времени остается очень много нерешенных вопросов Важным направлением является исследование механизмов, лежащих в основе тех эффектов МК, в реализацию которых не вовлечены известные меланокортиновые рецепторы [Wikberg et al, 2000] Выяснение таких механизмов

необходимо для понимания роли МК системы в регуляции памяти, болевой чувствительности, развитии нервной системы и регенерации

Проведенные нами исследования показали, что семакс, как и природные МК, обладает широким спектром нейротропной активности Пептид обладает ноотропной активностью, оказывает нейропротекторное действие, влияет на развитие нервной системы, оказывает антидепрессантное и анксиолитическое действие, вызывет снижение болевой чувствительности, ослабляет анальгетические эффекты опиоидов Какие же механизмы могут лежать в основе наблюдаемых эффектов?

Изучение влияния семакса на уровень экспрессии нейротрофических факторов показало, что введение семакса крысам приводит к увеличению содержания BDNF в гиппокампе и базальных ядрах переднего мозга крысы [Долотов и др , 2003, Dolotov et 1, 2006] Влияние семакса на содержание нейротрофинов в мозге может лежать в основе нейропротекторных и нейротрофических эффектов этого пептида Способность нейротрофических факторов влиять на рост и дифференцировку нервных клеток, а также стимулировать синтез различных физиологически активных веществ лежит в основе регуляции развивающегося мозга Постулируется адаптивная роль нейротрофинов в формировании пластичности мозга и определении его отношений с окружающей средой [Гомазков, 2006] В частности, показана важная роль нейротрофинов NGF и BDNF в организации нейроэндокринного статуса развивающегося мозга Кроме того, возрастание уровня BDNF в гиппокампе может также служить одним из механизмов ноотропных эффектов семакса В настоящее время показано, что нейротрофические факторы, главным образом BDNF, вовлечены в процессы обучения и формирования памятного следа в мозге млекопитающих Показано, что в процессе обучения происходит увеличение экспрессии BDNF в гиппокампе [Hall, 2000, Miruno et al, 2000], а снижение уровня BDNF в мозге крысы приводит к ухудшению обучения [Alonso et al, 2002, Mu et al, 1999] Однако это не может быть единственным механизмом ноотропного действия пептида, т к во многих экспериментах отмечалось улучшение обучения животных уже в первый день опыта при введении пептида за 15 мин до обучения То есть, эффекты пептида развивались в течение 20-30 мин, а достоверное возрастание уровня BDNF зарегистрировано через 3 часа после инъекции семакса Следовательно, увеличение экспрессии нейротрофических факторов может определять долговременные эффекты семакса на обучение, однако, вероятно, существует и другой механизм реализации ноотропных эффектов пептида

Нейротрофические факторы участвуют в регуляции состояний, связанных со стрессом, тревожностью, страхом, депрессией Поэтому возрастание экспрессии BDNF в гиппокампе может лежать в основе анксиолитического и антидепрессантного действия семакса, тк показана важная роль этого нейротрофина в регуляции уровня тревожности и депрессивности [Dunan et al, 2000]

Изучение влияния семакса на систему биогенных аминов мозга показало, что введение этого пептида приводит к увеличению содержания серотонина и его метаболита в мозге Полученные данные свидетельствуют об ускорении оборота этого медиатора, отражающем увеличение функциональной активности серотонинергической системы мозга [Еремин и др , 2004, Eremin et al, 2005] Кроме того, показано, что семакс вызывает значительное повышение содержания норадреналина в гипоталамусе крыс [Гецова и др, 1988} Анксиолитическое и антидепрессантное действие семакса может быть связано с изменением активности системы биогенных аминов

Известно, что система биогенных аминов мозга играет важную роль в процессах обучения и памяти В частности, показана важная роль этих медиаторных систем на стадии восприятия стимулов окружающей среды Повышение функциональной активности системы биогенных аминов, вызванное введением семакса, может обеспечивать улучшение внимания, выделения значимых стимулов, что в конечном итоге приводит к ускорению обучения

Многочисленные эксперименты свидетельствуют о важной роли меланокортиновой системы в ноцицепции [Walker et al, 1981, Li et al, 1990, Starowicz, Przewlocka, 2003] Проведенные нами эксперименты показали, что семакс при периферическом введении снижает болевую чувствительность животных Исследование механизмов анальгетического действия семакса показало, что эффекты пептида частично ослабляются предварительной блокадой опиоидных рецепторов, а также отсутствуют на фоне блокады серотониновых рецепторов В организме существует нисходящая система контроля болевой чувствительности Медиаторами нисходящих цереброспинальных антиноцицептивных импульсов служат серотонин и норадреналин Активация этих медиаторных систем приводит к снижению болевой чувствительности Эндогенные опиоиды действуют как внутренние спинальные медиаторы, главным образом для нисходящих норадреналинергических путей и, в меньшей степени, серотонинергических терминалей в дорзальных рогах спинного мозга [Liu et al 1999] Семакс, активируя серотонинергическую и норадреналинергическую системы, может усиливать

антиноцицептивную нисходящую систему и, таким образом, оказывать обезболивающее действие Отсутствие анальгетических эффектов семакса на фоне блокады серотониновых рецепторов подтверждает важную роль этой медиаторной системы для реализации анальгетического действия пептида

Увеличение активности опиоидной системы эндогенными (СВА) или экзогенными опиоидами изменяет направленность эффектов семакса Так, семакс ослабляет анальгезию, вызванную морфином, и уменьшает СВА, содержащую опиоидный компонент Таким образом, семакс обладает антиопиоидными свойствами Механизм антиопиоидных эффектов меланокортинов в настоящее время не выяснен По мнению ряда авторов меланокортины действуют на морфиновые рецепторы в спинном мозге как опиоидные антагонисты [Jacquet, 1982], однако согласно другой точке зрения антиопиоидные эффекты меланокортинов не определяются их связыванием с опиоидными рецепторами [Contreras, Takemori, 1984] Ранее было показано, что семакс in vitro не связывается с опиоидными рецепторами [Арефьева, 1992] Следовательно, антиопиоидные эффекты этого пептида не определяются его непосредственным взаимодействием с опиоидными рецепторами Кроме того, ослабление опиоидной анальгезии под действием семакса не связано с влиянием пептида на серотонинергическую систему, т к показано, что серотонин усиливает действие морфина [Eisenach, 1995], а при блокаде синтеза серотонина снижается стресс-вызванная анальгезия [Korzeniewska, Plaznik, 1995] Возможно, антиопиоидное действие семакса осуществляется на внутриклеточном уровне, известно, что опиоиды снижают содержание цАМФ в клетке, а меланокортины - увеличивают [Умрюхин, 2000] Такое влияние семакса может осуществляться как на уровне околоводопроводного серего вещества, так и на уровне задних рогов спинного мозга

Многообразие физиологических функций, в регуляции которых принимает участие МК система, свидетельствует о ее важной роли в организме и возможности использования природных и синтетических МК для коррекции различных патологических состояний Можно с уверенностью утверждать, что в течение ближайшего времени будут разработаны синтетические препараты - агонисты и антагонисты МС рецепторов, которые можно будет использовать в клинике как противовоспалительные и жаропонижающие средства, для лечения ожирения и анорексии, коррекции полового поведения и, возможно, при лечении наркотической зависимости [Adán, Gispen, 1997, Catania et al, 2000, Cone, 2005] В настоящее время семакс является единственным синтетическим МК, разрешенным к

применению в клинической практике Разработанные на основе этого пептида лекарственные препараты используется в качестве ноотропного и нейропротекторного средств Однако, как показывают проведенные исследования, спектр клинического применения этого препарата может быть расширен

Полученные нами результаты свидетельствуют о потенциальной возможности использования препарата семакс для коррекции отрицательных последствий неонатального стресса у детей, в терапии болезни Паркинсона, в качестве анксиолитического и антидепрессантного средства и, возможно, в наркологической практике

ВЫВОДЫ

1 Аналог АКТГ4.10 гептапептид семакс, не обладая гормональной активностью, сохраняет значительную часть спектра нейротропных эффектов природных меланокортинов Этот пептид оказывает ноотропное, нейропротекторное, анксиолитическое, антидепрессантное, анальгетическое и антиопиоидное действие, влияет на развитие центральной нервной системы животных

2 Длительность ноотропного действия семакса в различных экспериментальных моделях составляет не менее 20 часов, эффекты семакса регистрируются в моделях обучения с положительным и отрицательным подкреплением Пептид оказывает ноотропное действие при внутрибрюшинном введении в дозах 15-50 мкг/кг, при интраназальном введении - 1 5-50 мкг/кг, следовательно, семакс эффективнее улучшает обучение при интраназальном, чем при внутрибрюшинном введении в организм

3 При хроническом введении в дозе 50 мкг/кг семакс оказывает анксиолитическое и антидепрессантное действие

4 Хроническое интраназальное введение семакса в дозе 200 мкг/кг ускоряет функциональное восстановление животных с фармакологически вызванными нарушениями ДА-ергической системы мозга Нейропротекторные эффекты пептида связаны с увеличением содержания нейротрофических факторов в мозге

5 Хроническое неонатальное введение семакса в дозе 50 мкг/кг детенышам белых крыс приводит к снижению уровня тревожности и степени депрессивности животных, а также положительно влияет на их способность к обучению Отмеченные изменения поведения носят отставленный долговременный характер Введение семакса приводит к компенсации таких отрицательных последствий неонатального стресса,

как снижение исследовательской активности и увеличение тревожности В основе отставленного воздействия семакса на обучение крыс лежат другие механизмы

6 Периферическое введение пептида в дозах 50 и 500 мкг/кг не вызывает изменения параметров сердечного ритма крыс в покое

7 Внутрибрюшинное введение семакса в дозах 1 5 - 1500 мкг/кг приводит к снижению болевой чувствительности животных В реализацию анальгетических эффектов семакса вовлечены серотонинергическая и опиоидная системы

8 Предварительное введение семакса в дозах 50 и 500 мкг/кг ослабляет анальгетическое действие как экзогенных, так и эндогенных опиоидов, следовательно, пептид обладает антиопиоидной активностью

9 Продукты ферментативной деградации АКТГ4-10 и семакса обладают собственной нейротропной активностью и являются синергистами АКТГ4.10 в отношении воздействия на процессы обучения, следовательно, наблюдаемые при введении этих пептидов ноотропные эффекты могут быть результатом действия как исходных веществ, так и продуктов их деградации Выраженная физиологическая активность и высокая протеолитическая устойчивость семакса и его фрагментов может лежать в основе пролонгированных эффектов этого пептида

10 Аминокислотный остаток, находящийся в первом положении гептапептида -аналога семакса, играет важную роль в сохранении и выраженности как ноотропных, так и анальгетических эффектов пептида, модификация Ы-концевой области молекулы семакса может влиять на скорость и пути протеолитической деградации пептида

11 Зависимости ноотропных и анальгетических эффектов меланокортинов от структуры и дозы препаратов носят различный характер, что позволяет предположить существование разных механизмов, лежащих в основе этих эффектов

12 Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра клинического применения препарата семакс Этот препарат может быть использован для лечения патологий у детей в ранний постнатальный период, в терапии болезни Паркинсона, в качестве анксиолитического и антидепрессантного средства

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Каменский А А, Антонова Л В , Левицкая Н Г Действие разных доз фрагментов АКТГ на организм белых крыс //Физиологический журнал СССР - 1980 - т 66, N10 - с 1549-1553

2 Potaman V N , Alfeeva L Y , Kamensky A A , Levitskava N G , Nezavibatko V N N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog Semax by the rat blood enzymes//Biochem Biophys Res Commun -1991 - v 176-p 741-746

3 Potaman V N , Antonova L V, Dubinin V A , Grivennicov IA , Kamensky A A , Levitskava N G , Myasoedov N F , Nezavibatko V N , Zaitzev D A , Zolotarev Y A Pharmacokinetics of synthetic ACTH(4-10) analog Semax Following intravenous injection //in "Synthesis and applications of Isotopically Labelled Compounds", ed by Buncel E and Kobalko G W -1992 - Elsevier Siense Pub - p 715-718

4 Левицкая H Г , Антонова Л В , Незавибатько В Н , Каменский А А , Дубынин В А , Голубович В П , Пономарева-Степная М А , Ашмарин И П Новый антагонист физиологических эффектов стимулятора обучения АКТГ(4-7) //ДАН СССР - 1993 - т 331 - с 512-514

5 Ashmarin I Р , Levitskava N G , Antonova LV , Nezavibatko V N , Alfeeva L Y , Dubinin V A , Golubovich V P , Ponomareva-Stepnaya M A , Kamensky A A The neurotropic activity of a structural analog of ACTH(5-7) // Regulatory Peptides - 1994 - v 51 - p 49-54

6 Левицкая H Г, Дубынин В A , Воскресенская О Г, Алфеева Л Ю , Голубович В П , Незавибатько В Н , Каменский А А, Ашмарин И П Исследование зависимости структура-активность в ряду синтетических аналогов фрагмента АКТГ(5-7) Н ДАН -1995-т 344, N 3-е 421-424

7 Ashmarin I Р , Nezavibatko V N , Levitskava N G , Koshelev V В , Kamensky A A Design and investigation of an ACTH(4-10) analogue lacking D-amino acids and hidrophobic radicals // Neuroscience Research Commun -1995 - v 16, N 2- p 105-112

8 Левицкая H Г, Уранова M Г , Воскресенская О Г , Придатко Н С , Алфеева Л Ю , Незавибатько В Н, Каменский А А Исследования нейротропной активности структурного аналога АКТГ(5-7) - трипептида ERP // Вестник Московского Университета, сер Биология (16) -1995 - N 1 - с 13-19

9 Ашмарин И П , Левицкая Н Г, Каменский А А, Мясоедов Н Ф Семакс - новое лекарственное средство для коррекции кровообращения мозга, гипоксических состояний и повышения трудоспособности // Фарматека - 1997 - т 4 - с 32-33

10 Глазова НЮ, Левицкая Н Г, Андреева Л А, Каменский АА, Мясоедов НФ Ноотропные эффекты нового аналога фрагмента АКТГ(5-10) - гексапептида АКТГ(5-7)-PGP//ДАН-1999-т 367-с 137-140

11 Левицкая Н Г, Себенцова Е А, Глазова Н Ю , Воскресенская О Г, Андреева Л А, Алфеева Л Ю, Каменский А А, Мясоедов Н Ф Исследование нейротропной активности продуктов ферментативной деградации семакса //ДАН - 2000 - т 372 (2) -с 268-271

12 Левицкая Н Г, Латышева НВ, Андреева Л А, Каменский А А Поведенческие эффекты трипептида Pro-Gly-Pro // Вестник МГУ, сер Биология - 2000 (2) - с 17-22

13 Левицкая Н Г, Глазова НЮ, Горенкова НА, Сарычева НЮ, Андреева Л А, Апфеева Л Ю , Каменский А А Влияние аналогов фрагментов АКТГ на параметры сердечного ритма крыс в различных экспериментальных условиях // Вестник МГУ, сер Биология - 2001 (1)-с 49-52

14 Каменский АА, Воскресенская О Г, Дубынин В А, Левицкая Н Г Зависимость физиологических эффектов ряда нейропептидов от пути введения // Физиологический журнал им И М Сеченова - 2001 - т 87 - №11 - с 1493-1501

15 Левицкая Н Г, Себенцова ЕА, Андреева ЛА, Апфеева ЛЮ, Каменский АА, Мясоедов Н Ф Нейропротекторные эффекты семакса на фоне МФТП-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга II Физиологический журнал им И М Сеченова - 2002 - т 88 - № 11 - с 1369-1377

16 Иванова ДМ, Левицкая Н Г, Андреева Л А, Алфеева ЛЮ, Каменский АА, Мясоедов Н Ф Влияние семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях II ДАН- 2003 -т 388-№ 3-е 416-419

17 Долотов О В, Середенина ТС, Левицкая Н Г, Каменский АА, Андрева ЛА, Алфеева Л Ю , Нагаев И Ю , Золотарев Ю А , Гривенников И А , Энгеле Ю , Мясоедов Н Ф Гептапептид семакс стимулирует экспрессию BDNF в различных отделах мозга крыс in vivo НИ ДАН - 2003 -т 391 (1) - с 131-134

18 Шеремет НЛ, Полунин ГС, Овчинников АН, Каменский АА, Левицкая Н Г. Андреева Л А, Алфеева Л Ю , Нагаев И Ю Экспериментальное обоснование использования нейропротектора семакса в лечении заболевания зрительного нерва // Вестник офтальмологии - 2004 - т 120 - № 6 - с 25-27

19 Levitskava N G . Sebentsova ЕА, Andreeva LA, Alfeeva LYu, Kamensky AA, Myasoedov N F The neuroprotective effects of semax in conditions of MPTP-induced lesions of the brain dopaminergic system II Neuroscience and Behavioral Physiology -2004-v 34 - № 4 - p 399-405

20 Ashmarin I P , Samonina G E , Lyapina L A , Kamenskii A A , Levitskava N G , Grivennikov I A , Dolotov О V , Andreeva L A, Myasoedov N F Natural and hybrid ("chimeric") stable regulatory glyproline peptides //Pathophysiology - 2005 - v 11, p 179185

21 Себенцова E A , Глазова H Ю , Левицкая H Г , Андреева Л A , Алфеева Л Ю , Каменский А А , Мясоедов Н Ф Зависимость отставленных эффектов аналога АКТГ(4-10) семакса от сроков его неонатального введения // Рос физиол журн им ИМ Сеченова 2005-т 91-№2-с 122-131

22 Себенцова Е А, Денисенко А В , Левицкая Н Г , Андреева Л А , Алфеева Л Ю , Каменский А А , Мясоедов Н Ф Отставленные поведенческие эффекты хронического неонатального введения аналога АКТГ(4-10) семакса детенышам белых крыс II Журнал ВНД им ИП Павлова 2005 -т 55-№2-с 213-220

23 Глазова Н Ю , Себенцова Е А , Левицкая Н Г , Андреева Л А , Алфеева Л Ю , Каменский А А, Мясоедов Н Ф Влияние модификации N-концевой области молекулы на выраженность ноотропного действия аналогов семакса // Известия Академии Наук, серия Биологическая - 2005 - № 4, с 460-466

24 Иванова Д М , Виленский Д А , Левицкая Н Г , Андреева Л А , Алфеева Л Ю , Каменский А А, Мясоедов Н Ф Исследование зависимости анальгетической активности аналогов меланокортинов от структуры Н Известия Академии Наук, серия Биологическая - 2006 - т 2 - стр 162-167

25 Иванова Д М , Виленский Д А , Левицкая Н Г, Андреева Л А , Алфеева Л Ю , Каменский А А, Мясоедов Н Ф Влияние семакса на изменения болевой чувствительности и поведения животных, вызванные принудительным плаванием II ДАН - 2006 - т 407 - № 2 - с 275-279

26 Себенцова Е А , Левицкая Н Г , Андреева Л А , Алфеева Л Ю , Каменский А А , Мясоедов Н Ф Эффекты семакса на фоне блокады дофаминергических рецепторов галоперидолом //БЭБиМ-2006-т 141-№2-с 128-132

27 Dolotov OV, Karpenko ЕА, Seredenina TS, Inozemtseva LS, Levitskava N G. Zolotarev Yu A, Kamensky A A , Grivennikov IA, Engele J , Myasoedov N F Semax, an analogue of adrenocorticotrpin (4-10), binds specifically and increases levels of brain-derived neurotrophic factor protein in rat basal forebrain // J of Neurochemistry - 2006 - v 97 (suppl 1), p 82-86

28 Шевченко KB,, Нагаев И Ю, Алфеева ЛЮ, Андреева Л А, Каменский А А, Левицкая Н Г, Шевченко В П , Гривенников И А, Мясоедов Н Ф Изучение кинетики

проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении // Биоорганическая химия - 2006 - т 32 (1) - с 64-70

29 Dolotov О V, Karpenko Е A, Inozemtseva L S , Seredenina Т S , Levitskava N G , Rozyczka J , Dubynina E V, Novosadova E V , Andreeva L A , Alfeeva L Yu „ Kamensky A A, Grivennikov IA , Myasoedov N F , Engele J Semax, an analog of ACTH(4-10) with cognitive effects, regulates BDNF and trkB expression in the rat hippocampus // Brain Res-2006-v 1117 (1)-p 54-60

30 Иванова Д M , Левицкая H Г, Андреева Л A , Каменский A A , Мясоедов H Ф Сравнительное исследование анальгетической активности фрагмента АКТГ(4-10) и его аналога семакса // БЭБиМ - 2007 - т 143 (1) - с 8-12

31 Виленский ДА, Левицкая Н Г. Андреева ЛА, Алфеева ЛЮ, Каменский АА, Мясоедов Н Ф Влияние хронического введения семакса на исследовательскую активность и эиоциональное состояние белых крыс И Рос физиол журн им И М Сеченова - 2007 - т 93 (6) - с 661-669

Мясоедов Н Ф , Левицкая Н Г , Андреева Л А , Глазова Н Ю , Безменова С , Каменский А А Гексапептид, обладающий активностью стимулятора памяти (патент на изобретение) -1999 - №2131743

Ашмарин И П , Алфеева Л Ю , Андреева Л А , Гривенников И А , Дубынин В А , Каменский А А , Козловская М М , Левицкая Н Г , Мясоедов Н Ф , Незавибатько В Н , Середенин С Б Семейство пептидов, обладающих нейротропными свойствами // (патент на изобретение) - 2003 - № 2206573

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@.stprmt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 03 09 2007 г

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Левицкая, Наталья Григорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мел анокортиновая система

Природные меланокортины

Рецепторы меланокортинов

Эндогенные антагонисты МС рецепторов

Физиологические эффекты меланокортинов

Стероидогенная активность

Меланокортины и пигментация

Ноотропные эффекты меланокортинов 32 Влияние меланокортинов на двигательную активность и эмоциональное состояние животных 38 Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов:

- регенерация нервов и протекторное влияние меланокортинов

- влияние меланокортинов на развивающуюся нервную систему 45 Действие меланокортинов на сердечно-сосудистую систему 50 Влияние меланокортинов на болевую чувствительность 52 Взаимодействие меланокортинов с опиоидной системой 55 Влияние меланокортинов на иммунную систему 58 Влияние меланокортинов на пищевое поведение и вес тела 65 Влияние меланокортинов на половое поведение 71 Регуляция функции экзокринных желез

Влияние меланокортинов на медиаторные системы мозга

Синтетические аналоги меланокортинов

Семакс - аналог АКТГ4-10 пролонгированного действия

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы оценки двигательной активности, исследовательского поведения, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения животных

Методы оценки способности животных к обучению

Методы оценки уровня физической выносливости

Методы оценки болевой чувствительности животных

Исследование изменений поведения и болевой чувствительности животных, вызванных стрессогенным воздействием

Регистрация электрокардиограммы крыс

Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Оценка спектра физиологической активности семакса

Глава 1 Исследование ноотропных эффектов семакса в различных экспериментальных условиях

Глава 2 Изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных

Глава 3 Исследование нейропротекторных эффектов семакса на фоне нарушений дофаминергической системы мозга крыс

Глава 4 Исследование отставленных поведенческих эффектов хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс

4.1. Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение первой недели постнатального развития крыс

4.2 Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй недели постнатального развития крыс

4.3 Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс

4.4 Отставленные эффекты хронического интраназального введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс

4.5 Исследование влияния однократного введения семакса на поведение и способность к обучению детенышей белых крыс

4.6 Исследование отставленного воздействия используемых экспериментальных манипуляций в неонатальный период развития детенышей белых крыс

Глава 5 Исследование кардиотропных эффектов семакса

Глава 6 Исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных

6.1 Изучение анальгетических эффектов семакса в различных 196 экспериментальных моделях

6.2 Исследование влияния АКТГ4.10 на болевую чувствительность 204 животных

6.3 Исследование анальгетических эффектов семакса на фоне фармакологически вызванных изменений серотонинергической и 207 опиоидной систем

Глава 7 Исследование взаимодействия семакса с опиоидной системой

7.1 Влияние семакса на анальгезию, вызванную введением морфина

7.2 Влияние семакса на стресс-вызванную анальгезию

II Изучение зависимости эффектов синтетических меланокортинов от структуры

Глава 8 Исследование ноотропных эффектов фрагмента семакса гексапептида EHFPGP

Глава 9 Изучение ноотропных эффектов продуктов ферментативной деградации семакса

Глава 10 Влияние модификации N-концевой области молекулы на ноотропные эффекты аналогов семакса

10.1 Зависимость выраженности ноотропного действия аналогов 246 семакса от N-концевого аминокислотного остатка

10.2 Влияние модификации N-концевой области молекулы на 260 длительность ноотропного действия аналогов семакса

Глава 11 Изучение нейротропных эффектов структурного аналога

АКТГ5.7 - трипептида ERP

Глава 12 Зависимость анальгетической активности синтетических меланокортинов от структуры

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиологические эффекты синтетических аналогов меланокортинов: структурно-функциональное исследование"

Разработка и исследование новых нейротропных лекарственных препаратов является одной из актуальных проблем современной физиологии и фармакологии. Создание фармакологических средств, стимулирующих когнитивные функции мозга и способных оказывать нейропротекторное действие в условиях различных патологий центральной нервной системы, особенно важно в настоящее время. Это определяется увеличением стрессорной нагрузки и длительным психическим напряжением, сопровождающим многие сферы деятельности человека. Все это, наряду со многими другими факторами, приводит к росту различных неврологических заболеваний. При разработке новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов исследователи обращаются к использованию эндогенных регуляторов организма, в первую очередь регуляторным пептидам. В настоящее время показано, что вещества пептидной природы являются прямыми или опосредованными регуляторами многих важных физиологических процессов в организме. Область биологической активности регуляторных пептидов чрезвычайно широка. Вещества этой группы определяют состояние кровеносной, иммунной и других систем. Важную роль играют пептиды в регуляции состояния центральной нервной системы. Механизм действия большинства известных нейропептидов очень сложен и недостаточно изучен.

Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Многочисленные эксперименты, проводившиеся в последние десятилетия как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что меланокортины, помимо известного гормонального действия, обладают широким спектром экстрагормональной активности. Соединения этого класса улучшают обучение и внимание; влияют на мотивационные процессы; ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе; оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС; воздействуют на развитие нервной системы; модулируют половое поведение; оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; взаимодействуют с опиоидной системой; влияют на болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему; вызывают снижение потребления пищи и веса тела; влияют на функционирование экзокринных желез. Использование коротких фрагментов природных гормонов позволяет отделить гормональные (кортикотропные и меланотропные) свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия.

Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизмы, лежащие в основе различных эффектов меланокортинов, во многом остаются неясными.

Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов, открытие семейства их рецепторов и разработка синтетических агонистов и антагонистов этих рецепторов предоставили новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях. Препятствием для использования природных меланокортинов в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении. Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы. В ходе таких экспериментов были получены аналоги природных пептидов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной биологической активностью. В результате многолетних исследований был разработан аналог фрагмента АКТГ4.10 пролонгированного действия - семакс. Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическим эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемического инсульта. Клинические исследования продемонстрировали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений. Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта. На сегодняшний день этот пептид является единственным широко используемым в клинике лекарственным нейротропным препаратом, разработанным на основе фрагментов АКТГ.

Однако, несмотря на то, что семакс уже более 10 лет используется в клинической практике, исследования эффектов этого пептида, направленные на определение спектра физиологической активности препарата и на выяснение механизмов его нейротропного действия, продолжаются. Изучение нейропротекторных эффектов семакса на экспериментальных моделях различных патологических состояний позволит расширить возможности клинического применения этого препарата. Кроме того, актуальной задачей является выявление всех вероятных последствий воздействия семакса на развивающийся мозг с целью выяснения его возможных отставленных эффектов. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что меланокортины участвуют в регуляции болевой чувствительности, однако механизмы ноцицептивного действия этих пептидов до настоящего времени не выяснены. В ходе клинических исследований семакса было отмечено аналитическое действие этого препарата при ряде болевых синдромов. Однако изучения влияния семакса на болевую чувствительность в экспериментах на животных не проводилось.

До настоящего времени не выяснены механизмы, лежащие в основе пролонгированного действия семакса, не изучена зависимость структура - активность для отдельных составляющих биологической активности препарата, не выявлено значение отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его нейротропных эффектов.

Представленная работа посвящена определению спектра физиологической активности семакса и оценке зависимости эффектов препарата от структуры. В работе впервые детально исследованы физиологические эффекты гептапептида семакс в экспериментах на животных. Проведенные исследования показали, что аналог АКТГ4.10 гептапептид семакс, как и природные меланокортины, обладает широким спектром нейротропной активности. Этот препарат оказывает ноотропное, нейропротекторное, анксиолитическое, антидепрессантное, анальгетическое и антиопиоидное действие, влияет на развитие нервной системы. В основе указанных эффектов семакса могут лежать различные механизмы, в частности, увеличение экспрессии нейротрофических факторов в мозге и изменение функциональной активности системы биогенных аминов. Пролонгированное действие семакса определяется выраженной физиологической активностью и высокой протеолитической устойчивостью продуктов его ферментативной деградации. Модификация N-концевой области молекулы семакса приводит к изменению как ноотропной, так и анальгетической активности пептида, что может быть связано с изменением скорости и путей протеолитической деградации пептида.

Полученные данные позволяют расширить представления о нейротропных воздействиях синтетических аналогов меланокортинов, способствуют определению спектра биологической активности аналога АКТГ4-10 семакса и выяснению механизмов, лежащих в основе эффектов этого пептида, позволяют сделать предположения о зависимости нейротропных эффектов меланокортинов от структуры. Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра клинического применения лекарственных препаратов, разработанных на основе пептида семакс.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Меланокортиновая система

Меланокортиновая система организма включает в себя природные меланокортины - адренокортикотропный гормон (АКТГ) и меланоцитстимулирующие гормоны (а-, Р" и у-МСГ), пять рецепторов меланокортинов (MC1R - MC5R) и эндогенные антагонисты меланокортиновых рецепторов - агути-протеин и AGRP (agouti-related protein, белок, родственный агути) [Gantz, Fong, 2003]. Меланокортиновые рецепторы и их эндогенные агонисты и антагонисты образуют периферическую и центральную сигнальную систему, которая контролирует целый ряд важнейших физиологических процессов в организме. Интерес к меланокортиновой системе обусловлен тем, что она вовлечена в регуляцию необычайно широкого круга физиологических функций, таких как память и внимание, поддержание энергетического гомеостаза, пигментация, стероидогенез, половое и пищевое поведение, экзокринная секреция, болевая чувствительность, воспаление и иммунная реакция, терморегуляция, деятельность сердечно-сосудистой системы, регенерация в нервно-мышечной системе [Starowicz, Przewlocka, 2003; Wikberg, 2001]. Такой широкий спектр физиологических эффектов делает меланокортины перспективными с точки зрения их клинического применения. Лекарственные препараты, разработанные на основе природных меланокортинов, могут быть использованы при различных патологиях, таких как нарушения когнитивных функций, ожирение, анорексия и кахексия, половые дисфункции, различные кожные заболевания, включая рак кожи, воспалительные процессы, повреждения нервной системы и ряд других патологических состояний.

Природные меланокортины

К семейству природных меланокортинов (МК) относятся АКТГ, а-, 0-, у-МСГ и фрагменты этих гормонов. Все природные МК образуются из 31-36-кДа белка-предшественника - проопиомеланокортина (ПОМК) [Eipper et al., 1980; Розен, 1994]. а-МСГ был впервые выделен из гипофизарного экстракта в 1955 году, как один из первых пептидных гормонов. Далее была описана аминокислотная (а.к.) последовательность АКТГ и Р-МСГ. Анализ а.к. последовательности выделенных пептидов показал, что а-МСГ является фрагментом молекуля АКТГ, а Р-МСГ - частью последовательности p-липотропина. В конце семидесятых годов была определена структура предшественника этих пептидов - прогормона ПОМК [Nakanishi et al., 1979], а позже было обнаружено, что мРНК этого белка экспрессируется не только в гипофизе, но и в других регионах мозга и в периферических тканях [Wikberg, 1999; Gantz, Fong, 2003].

ПОМК состоит из 264-267 аминокислотных остатков и содержит в себе последовательности не только АКТГ и всех трех видов МСГ, но также липотропина, а-, Р- и у-эндорфинов и Met-энкефалина [Nakanishi et al., 1979; Мертвецов, 1999]. Основным регионом, в котором экспрессируется этот белок, являются передняя и промежуточная доли гипофиза. Концентрация ПОМК мРНК в гипофизе на один-два порядка превышает ее концентрацию в других регионах мозга [Slominski et al., 2000]. В гипофизе человека в норме ПОМК синтезируется только кортикотрофами передней доли, так как промежуточная доля у взрослого человека отсутствует. В передней доле гипофиза человека синтезируется ПОМК мРНК, которая транслируется в молекулу ПОМК, состоящую из 267 а.к. Эта молекула начинается с 26-а.к. сигнального пептида, необходимого для переноса белка через мембрану эндоплазматического ретикулюма, после чего пептид отщепляется [Raffm-Sanson et al., 2003].

Иммунохимические исследования показали широкое распространение меланокортинов в различных структурах ЦНС [Gantz, Fong, 2003; Slominsky et al., 2000]. MK могут попадать в мозг благодаря ретроградному кровотоку от гипофиза. Однако гипофиз не является единственным источником МК - синтез этих пептидов происходит также непосредственно в тканях мозга, где обнаружены ПОМК-содержащие нейроны [Tonnaer et al., 1982]. Клеточные тела данных нейронов локализованны главным образом в вентромедиалыюй части гипоталамуса, в частности, на уровне аркуатного ядра и, в меньшей степени, в дорсальном гипоталамусе и амигдале, а также в ядре солитарного тракта в стволе мозга [Gantz, Fong, 2003]. В этих нейронах экспрессируется ПОМК мРНК идентичная гипофизарной и синтезируется ПОМК, который служит предшественником мозговых p-эндорфина, а-МСГ и других пептидов [Gee et al., 1983; Raffin-Sanson et al., 2003]. Гипоталамические нейроны образуют сеть разветвленных волокон, проникающих в различные структуры головного мозга. Самая высокая концентрация ПОМК обнаружена в медиальной субстанции: области, локализованной в переднем перивентрикулярном гипоталамусе, откуда исходит гипофизарный портальный тракт, подходящий к передней доле гипофиза. Другие нервные волокна идут в амигдалу и лимбическую систему к околоводопроводному серому веществу, тегментуму, голубому пятну, гиппокампу и неокортексу. В мозге крыс высокие концентрации МК обнаружены в нижних ядрах ствола мозга, в околоводопроводном сером веществе, дорсальном ядре шва; средние - в голубом пятне, парабранхиальных ядрах, большом ядре шва и ядре солитарного тракта.

Предполагается, что МК в ядре солитарного тракта имеет местное происхождение, а ретикулярная формация продолговатого мозга может получать МК-содержащую иннервацию от соответствующих нейронов гипоталамуса и продолговатого мозга [Глебов, Горячева, 1990; Starowicz, Przewlocka, 2003]. Меланокортины были обнаружены также во многих периферических тканях, таких как органы кровообращения, почки, желудочно-кишечный тракт, поджелудочная железа, надпочечники, легкие, селезенка, семенники, яичники, плацента и кератиноциты и меланоциты кожи [Eberle, 1988; Wikberg, 1999]. Многими исследователями показано существование ПОМК мРНК в различных типах тканей помимо перечисленных выше, однако в большинстве случаев экспрессия белка качественно и количественно отличается от той, что наблюдается в гипофизе - образуется в низких концентрациях укороченная нефункциональная мРНК, которая в ПОМК не транслируется [Raffin-Sanson et al., 2003].

У большинства млекопитающих идентифицирован единственный ген ПОМК. В геноме человека этот ген локализован в коротком плече хромосомы 2 [Owerbach et al., 1981]. Исключение составляет геном мыши, который содержит два неаллельных гена, кодирующих мРНК ПОМК - а- и р-гены. Однако только один из них (а-ген) оказался функционально активным, а другой - псевдогеном [Slominski et al., 2000; Мертвецов, 1999]. Показано, что мутации, нарушающие трансляцию гена ПОМК у человека, приводят к тяжелой глюкокортикоидной недостаточности, а также, гипоглекемии, ожирению, которое развивается с первых лет жизни, красно-оранжевой окраске волос и светлой коже [Krude, Gruters, 2000].

В процессе аксонального транспорта ПОМК подвергается серии протеолитических расщеплений и химических трансформаций, которые приводят к образованию различных биологически активных пептидов. Расщепление ПОМК происходит по парам основных а.к. остатков (Arg-Lys, Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg); в последовательности белка присутствует 8 пар и 1 квадриплет таких остатков [Raffin-Sanson et al., 2003]. В зависимости от типа тканей и региона мозга происходит разрыв различных сайтов протеолитического расщепления и, следовательно, образование различных пептидных продуктов [Eipper, Mains, 1981].

Посттрансляционный процессинг ПОМК осуществляется специфическими ферментами - прогормонконвертазами РС1 и РС2, которые относятся к семейству сериновых протеаз. Ферменты РС1 и РС2 узнают пары основных аминокислот и разрывают связи между ними. Затем карбоксипептидаза Е отщепляет С-концевые основные а.к. остатки [Zhou, Mains, 1994]. Альтернативность процессинга ПОМК показана для передней и промежуточной долей гипофиза. Хотя структура ПОМК одинакова в обеих долях гипофиза, протеолитический процессинг приводит к образованию различных пептидных продуктов [Eipper, Mains, 1980]. В передней дозе гипофиза присутствует только РС1, под действием этого фермента расщепляется 4 сайта. В результате в передней доле образуется 6 пептидов - N-терминальный пептид (NT), соединительный пептид (СП), АКТГ, Р-липотропин и небольшие количества у-липотропина и p-эндорфина, т.к. последний сайт расщепления подвергается незначительному воздействию. В других регионах (промежуточной доле гипофиза, гипоталамусе, коже) присутствуют оба фермента, и их совместное действие приводит к расщеплению связей между всеми парами основных а.к. остатков и образованию более коротких пептидов. Из NT образуется у-МСГ, из АКТГ - а-МСГ и CLIP (corticotrophin-like intermediate lobe peptide, кортикотропиноподобный пептид промежуточной доли), из Р-липотропина - Р-МСГ, Р-эндорфиньз) и р-эндорфин1.27 (рис. 1) [Zhou et al., 1993]. В зависимости от сайта расщепления N-концевого пептида образуется один из видов у-МСГ (yi-, у2- или уз-МСГ), которые отличаются друг от друга длиной аминокислотной последовательности. yi-МСГ и уг-МСГ представляют собой 11- и 12- а.к. пептиды, соответственно, в уз-МСГ пролонгирована С-концевая область. In vivo амидирование С-концевого остатка глицина в У2-МСГ приводит к образованию yi-МСГ [Oosterom et al., 1999].

Молекулы меланокортинов филогенетически очень древние и характеризуются высокой степенью консервативности, они незначительно изменились за последние несколько сотен миллионов лет. Кроме того, отмечено большое межвидовое сходство в структуре этих пептидов [Catania, Lipton, 1993]. Сопоставление а.к. последовательности ПОМК животных различных видов показал, что у всех млекопитающих биологически активные домены в белке-предшественнике расположены сходным образом и ограничены с обеих сторон парами положительно заряженных аминокислот. Исключение составляют ПОМК мыши и крысы, в которых одна пара а.к. остатков Arg-Arg заменена на Arg-Pro, в результате чего У12-МСГ не могут образоваться в ходе процессинга ПОМК [Smith, Funger, 1988]. Сравнительный анализ также показал, что степень консервативности а.к. последовательности ПОМК неравномерна по всей длине белка-предшественника, причем границы консервативных и вариабельных участков четко совпадают с границами биологически активных доменов белка [Мертвецов, 1999].

Сигнальный пептид N-терминальный пептид СП АКТГ Р-липотропин

ПОМК у-МСГ а-МСГ CLIP Р-эндорфин Сигнальный пептид

N- терминальный пептид СП АКТГ р-липотропин

N- терминальный пептид СП

АКТГ

Передняя доля гипофиза

-Л /\ у-МСГ СП а-МСГ CLIP у-липотропин Р-эндорфин

I-1 □ 1=1 I I I 1=1 Промежуточная

Рис. 1. Процессинг ПОМК в передней и промежуточной долях гипофиза и центральной нервной системе [Slominski et al., 2000].

Биологическая активность АКТГ, МСГ и других пептидов проявляется только после выщепления их из последовательности ПОМК в результате тканеспецифического посттрансляционного процессинга и последующих модификаций, таких как гликозилирование, амидирование или ацетилирование [Smith, Funder, 1988]. В промежуточной доле гипофиза Р-эндорфин и а-МСГ находятся преимущественно в ацетилированном состоянии, что приводит к изменению их биологической активности [Dores et al., 1993]. a-N-ацетилирование Р-эндорфина приводит к тому, что пептид не взаимодействует с опиоидными рецепторами и не способен вызывать анальгезию, ацетилирование a-МСГ вызывает усиление его активности [Smith, Funder, 1988]. доля гипофиза, ЦНС р-МСГ

Пептидные гормоны - производные ПОМК - представляют собой секреторные пептиды. Они упакованы в гранулы и освобождаются в кровь под действием стимулов окружающей среды. ПОМК переносится от мРНК, локализованной в мембраносвязанных полирибосомах, в эндоплазматический ретикулум. Далее образующиеся в ходе процессинга пептиды поступают в мембранные органеллы, где упаковываются в секреторные гранулы [Мертвецов, 1999]. Так как пептиды, продуцируемые в гипофизе или в гипоталамусе, образуются из одной молекулы-предшественника, то они секретируются в эквимолярных количествах в ходе экзоцитоза. Однако уровень циркулирующих в крови меланокортинов не одинаков, что связано с их различной протеолитической устойчивостью [Raffin-Sanson, et al., 2003].

Показано, что секреция пептидов - производных ПОМК - по-разному регулируется в разных долях гипофиза крысы. В передней доле АКТГ освобождается в ответ на действие кортикотропин-релизинг фактора (КРФ) гипоталамуса. Этот пептид, состоящий из 41 а.к. остатка, способен вызывать секрецию АКТГ и P-эндорфина в культуре клеток переднего гипофиза крыс. В настоящее время известно, что КРФ имеет два вида рецепторов - КРФ-Р] и КРФ-Рг. Рецепторы первого типа расположены преимущественно в переднем и среднем гипофизе, а рецепторы второго типа - в неокортексе, мозжечке, вентромедиальном гипоталамусе и в очень небольшом количестве в переднем гипофизе [Engler et al., 1999]. КРФ, поступая в переднюю долю гипофиза, взаимодействует с КРФ-Р 1, который стимулирует продукцию цАМФ, что приводит к увеличению протеолиза ПОМК и выбросу АКТГ. КРФ является главным фактором, вызывающим выброс АКТГ, но синтез этого гормона может также повышаться в ответ на действие вазопрессина, окситоцина, норадреналина, хотя и в меньшей степени [Owens, Nemeroff, 1991]. АКТГ стимулирует синтез и секрецию глюкокортикоидов надпочечниками. Глюкокортикоиды по принципу обратной связи тормозят синтез КРФ, ПОМК и АКТГ, и выделение этих гормонов возвращается к своему базовому уровню [Shipston, 1995]. В промежуточной доле гипофиза секрецию а-МСГ стимулируют p-адренергические агописты, в то время как дофамин (ДА) ингибирует выброс ПОМК-пептидов [Vermes et al., 1980]. Введение антагониста ДА -галоперидола вызывает увеличение содержания ПОМК-пептидов в промежуточной доле гипофиза и стимулирует их освобождение [Hollt et al., 1982]. При этом ДА и галоперидол не влияют на секрецию МК кортикотрофами передней доли гипофиза. Введение морфина стимулирует синтез ПОМК мРНК в передней доле и понижает его в промежуточной доле гипофиза [Hollt et al., 1982]. Таким образом, реакция передней и промежуточной долей гипофиза на одни и те же воздействия в отношении регуляции содержания и секреции МК различны.

По некоторым данным при введении и, по-видимому, при эндогенном выбросе кортикотропин циркулирует в крови 3-5 минут, быстро захватывается тканями и разрушается [Sydnor, Sayers, 1953]. Деградация молекулы АКТГ начинается с N-конца, причем уже через 1 минуту после внутривенного введения гормона 50% метки определяется в коже и мышцах, меньшее количество - в плазме, почках, кишечнике и печени. В коже и мышцах уже в этот период содержатся, главным образом, метаболиты АКТГ, а через 5 минут - во всех тканях обнаруживаются только фрагменты этого гормона [Ambler et al., 1982]. Однако по данным других авторов повышенное содержание АКТГ в плазме крови сохраняется в течение нескольких часов после введения экзогенного гормона [Allen et al., 1974; Nicholson et al., 1978]. При этом меченый АКТГ регистрируется в спинномозговой жидкости, однако его концентрация там в 100 раз ниже, чем в плазме. Эти данные свидетельствуют о том, что АКТГ очень плохо проникает через гематоэнцефалический барьер. При системном введении только 1-2% гормона проникает в мозг [Mezey, 1978; Nicholson et al., 1978].

Анализ а.к. последовательности МК показал что АКТГ, а- и Р-МСГ содержат в своей структуре общую последовательность - Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly, которая очень важна для реализации их эффектов [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Эта последовательность может быть расположена в различных участках пептидной молекулы гормонов. В молекулах а-МСГ и АКТГ гептапептид локализован в 4-10-м положениях цепи, в Р-МСГ - в 7-13-м. В у-МСГ аналогичный фрагмент присутствует, но в пятом положении вместо остатка Glu - Gly, а в 10-ом - вместо Gly - Asp (рис. 2). Общей последовательностью для всех МК является АКТГб-9 - Phe-Arg-Trp-Gly, которая необходима для связывания со всеми известными типами МС рецепторов. Общими чертами для всех МК являются также Туг во втором положении и Met в четвертом (положение остатков указано для АКТГ/а-МСГ) [Oosterom et al., 1999]. Наличие аналогичного фрагмента у всех представителей МК определяет общность их функциональных свойств, таких как влияние на пигментацию (меланоцитстимулирующая активность) и жировой обмен в липоцитах (липотропная активность), стимуляция синтеза кортикостероидов в коре надпочечников (кортикотропная активность). Сохраняя различные виды биологической активности, каждый гормон способен наиболее выражено выполнять одну из них. Так, кортикотропная активность АКТГ примерно на порядок выше, чем у МСГ. И наоборот, меланоцитстимулирующее действие МСГ выше, чем АКТГ [Розен, 1994].

АКТГ

Ser-Tyr-Ser-; Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-jLys-Pro-Val- + 26 а.к. а-МСГ

Ac-Ser-Tyr-Ser-;Met-GIu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-iLys-Pro-Val-NH2 р-МСГ Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Arg-jMet-GIu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-}Ser-Pro-Pro-Lys-Asp-OH yi-MC У2-МС

Уз-МС

Lys-Tyr-Val-iMet-C^-His-Phe-Arg-Trp-zlsp-^rg-Phe-NHi I

Lys-Tyr-Val-| Met-C/^-His-Phe-Arg-Trp-/ls/>-|Arg-Phe-Gly i i i Lys-Tyr-Val-jMet-C/>»-His-Phe-Arg-Trp-/lsp-lArg-Phe-Gly-Arg- + 13 а.к.

Рис. 2. Аминокислотная последовательность меланокортинов человека.

Молекула АКТГ состоит из 39 аминокислотных остатков. Участок молекулы с 4 по 10 аминокислоту, АКТГ4.10, является актоном гормона. Участок АКТГ15.21, особенно тетрапептид АКТГ15.18, обуславливает специфическое связывание молекулы гормона с рецептором, то есть является гаптоном. Роль усилителей меланоцитстимулирующей активности молекулы, по-видимому, выполняют трипептиды АКТГ1.3 и АКТГц.13. С-концевой фрагмент АКТГ25-33 наиболее вариабелен, он обуславливает иммуногенные свойства гормона, характерные для каждого вида животных. Функционально активные участки молекулы защищены от действия экзопептидаз фрагментом АКТГ20-24, который играет роль стабилизатора [Розен, 1994].

Фрагменты АКТГ обладают различной стероидогенной активностью. АКТГ1.24, лишенный только иммуногена, сохраняет специфическую кортикотропную активность целого гормона. Его эффекты полностью идентичны эффектам АКТГ, как по биологической активности, так и по продолжительности его действия в организме [Розен, 1994]. Фрагменты АКТГ^п и АКТГ4.Ю обладают значительно более низкой гормональной активностью [Schwyzer et al., 1980]. Стероидогенный эффект АКТГ5.24 в 100 раз ниже, чем у АКТГ4.23, что говорит о необходимости присутствия последовательности аминокислот с 4 по 10 для сохранения полной стероидогенной активности [Schwyzer et al., 1971]. В молекуле АКТГ можно выделить фрагменты с агонистическими и антагонистическими свойствами по отношению к целому гормону. Фрагмент АКТГ может быть полным агонистом (АКТГ1.24, АКТГ4-24), частичным агонистом (АКТГ5-24), антагонистом (АКТГ7.24) или не иметь гормональной активности [Lin et al., 1991]. Таким образом, различные участки молекулы АКТГ обусловливают отдельные составляющие биологического ответа гормона. Множественность участков АКТГ, обеспечивающих биологическую активность, определяет возможность его связывания с разными рецепторами и наличие различных биологических эффектов АКТГ.

Рецепторы меланокортинов

Меланокортиновые рецепторы были выделены и клонированы в 1992-1994 годах. Они принадлежат к семейству рецепторов, сопряженных с G-белками, представляют собой семидоменные трансмембранные белки. По сравнению с другими рецепторами, сопряженными с G-белками, МС рецепторы имеют в своей структуре короткую вторую экстрацеллюлярную петлю, интрацеллюлярный С-концевой домен и короткий экстрацеллюлярный N-концевой домен [Starowicz, Przewlocka, 2003] (рис. 3). Выделено 5 типов МС рецепторов: MC1R - MC5R. Все 5 типов MCR схожи по строению: на N-конце рецепторов расположен участок, способный к N-гликозилированию, а также цистеиновый остаток на С-конце, который является потенциальным сайтом для ацетилирования жирных кислот. Все 5 форм MCR функционально связываются с аденилатциклазой и активируют цАМФ-зависимый сигнальный путь. Однако, также существуют данные об активации для MC3R фосфоинозитольного пути [Konda et al., 1994] и Jak/STAT пути для MC5R [Buggy et al., 1998]. Меланокортиновые рецепторы содержат в своей структуре участки, узнаваемые протеинкиназой С и протеинкиназой A [Mountjoy et al., 1992], что указывает на возможность фосфорилирования. Подтипы рецепторов различаются по аминокислотному составу. Наиболее схожи МС4 и МС5 рецепторы - их структуры одинаковы на 60%. Аминокислотный состав MC1R и MC3R совпадает на 45%, а состав MC2R и MC4R - лишь на 38% [Schioth et al., 1998]. У всех подтипов рецепторов наиболее схожи сегменты ТМ1, ТМЗ и ТМ7, а самая низкая гомология наблюдается у сегментов ТМ4 и ТМ5, а также в области внеклеточных петель. Это определяется тем, что ТМ4 и ТМ5 не участвуют в связывании с лигандом. Считается, что связующий центр рецептора состоит из двух, расположенных рядом, доменов. Один домен - это сегменты ТМ1, ТМ2 и ТМЗ, а другой домен - это ТМ7 и, возможно, ТМ6 [Schioth et al., 1998].

По крайней мере, рецепторы четырех типов - MCI, МСЗ, МС4 и МС5 рецепторы - характеризуются высоким уровнем собственной, лиганд-независимой активности, т.е. стимулируют продукцию цАМФ в отсутствие агониста. Уникальность МС рецепторов среди других семидоменных трансмембранных белков состоит в том, что только у этих рецепторов уровень собственной активности регулируется не только эндогенными йшшвша

Рис. 3. Модель МС4 рецептора. На рисунке отмечены остатки, идентичные во всех типах рецепторов (белое на черном) или консервативные остатки, встречающиеся в трех и более типах МС рецепторов (белое на сером). Можно отметить, что консервативные остатки локализованы главным образом внутри трансмембранных сегментов и во внутриклеточных петлях. Внеклеточные домены слабо консервативны, за исключением внеклеточной петли 3. Последовательность внеклеточной петли 2 не консервативна, но во всех МС рецепторах эта петля очень короткая [Hoist, Schwartz, 2003]. агонистами, но и эндогенными инверсными агонистами [Nijenhuis et al., 2001; Hoist, Schwartz, 2003].

АКТГ, а-, Р-МСГ обладают высокой аффинностью ко всем видам MCR, за исключением рецепторов 2 типа. MC2R высоко селективны к АКТГ [Schioth et al., 1996]. Селективность, функции и области экспрессии MCR представленны в таблице 1 [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Самый короткий природный пептид, обладающий сродством к МК рецепторам, - АКТГ4.10. Три N-концевых и три С-концевых а.к. остатка увеличивают аффинность МК пептида [Wikberg et al., 2000]. Ни один из известных МС рецепторов не активируется и не связывается с ORG 2766, аналогом АКТГ4-9, который был использован в большинстве исследований нейротропных эффектов меланокортинов. Только у-МСГ в наномолярных концентрациях активирует MC3R, следовательно является селективным эндогенным агонистом этого рецептора. Р-МСГ обладает несколько меньшим сродством к MC5R, чем а-МСГ. а- и р-МСГ примерно одинаково активируют MC3R и MC4R [Adan, Gispen, 1997]. Для большинства МС рецепторов показано, что связывание с лигандом приводит к следующим событиям - увеличение продукции цАМФ, возрастание Са++ мобилизации и интернализация рецептора [Wong, Minchin, 1996; Clark et al., 2002; Nickolls et al., 2005]. Как и многие другие рецепторы, сопряженные с G-белками, МС рецепторы подвергаются агонист-зависимому эндоцитозу, комплекс агонист-рецептор перемещается от поверхности клетки в область аппарата Гольджи. Кроме того, показана спонтанная интернализация МС рецепторов с поверхности - клетки даже в отсутствие агонистов [Shinyama et al., 2003]. Исследования показали существование внутриклеточных мест связывания для МК [Slominski et al., 2000]. Интернализованные комплексы MK-MCR в дальнейшем аккумулируются в лизосомах, вероятно, для последующей деградации. В отличие от многих других рецепторов, сопряженных с G-белками, для МС рецепторов не показана возможность рециклинга рецептора или лиганда [Gao et al., 2003]. При длительном воздействии агониста интернализация рецепторов приводит к снижению их активности - десенситизации рецепторов [Wong, Minchin, 1996; Baig et al., 2002]. При связывании с антагонистом не происходит интернализация рецептора, комплекс лиганд-рецептор остается на мембране клетки [Gao et al., 2003]. Помимо того, что присутствие антагониста подавляет интернализацию комплекса агонист-рецептор, воздействие антагонистов (например, AGRP) ингибирует также спонтанную интернализацию, что обеспечивает его действие как инверсного агониста, т.е. снижение активности рецептора в отсутствие агониста [Shinyama et al., 2003]. Таким образом, с одной стороны, интернализация рецептора меланокортинов при длительном воздействии агониста вызывает десенситизацию рецепторной клетки, регулируя таким путем активность рецептора и рецепторной передачи. С другой стороны, медленная диссоциация комплекса рецептор-агонист, характерная для рецепторов этого типа, может играть важную роль в передаче сигнала, опосредуемого МС рецептором. После интернализации такой комплекс в течение продолжительного времени может быть вовлечен в передачу сигнала [Gao et al., 2003].

Большинство регионов, в которых экспрессируются дофаминовые (ДА) рецепторы, также содержат MC4R. Более того, MC3R и MC4R синтезируются в области вентральной покрышки, a MC4R - в черной субстанции. Следовательно, МК рецепторы экспрессируются в ДА-ергических ядрах и в основных областях ДА проекций, что указывает на тесные связи ДА и МК систем. Также показано, что серотонинергические и адренергические нейроны экспрессируют MC4R, что свидетельствует о возможности МК модулировать эти системы. MC4R и MC3R представлены в области околоводопроводного серого вещества, что может служить анатомическим доказательством связей МК и опиоидиой систем мозга [Adan, Gispen, 1997].

Меланокортиновые рецепторы 1 типа

Впервые МС1 рецепторы были обнаружены в клетках меланомы [Chhajlani, Wikberg, 1992], но позже было доказано, что они присутствуют и в мембранах нормальных меланоцитов млекопитающих [Loir et al., 1999]. Позже MC1R были найдены во многих периферических тканях, а также в ЦНС [Wikberg, 1999; Hartmeyer et al., 1997] (табл. 1). MC1R локализованы в ограниченном числе нейронов околоводопроводного серого вещества (ОСВ) у человека и крысы. Из всех клонированных МС рецепторв MC1R обладали наиболее высокой аффинностью к а-МСГ [Mountjoy, 1994], который является физиологическим регулятором быстрого изменения цвета у низших позвоночных, включая рыб, амфибий и рептилий; а также стимулирует меланогенез в меланоцитах млекопитающих [Sawyer, 1980].

Показано, что уровень экспрессии МС1 рецепторов в меланоцитах в 10-20 раз ниже, чем в злокачественных клетках [Loir et al., 1999]. Так как в ходе трансформации меланоцитов в клетки меланомы происходит резкое возрастание уровня MC1R, то этот рецептор может быть использован в качестве маркера при ранней диагностике рака кожи и при его лечении [Wikberg et al., 2000].

MCI рецепторы контролируют образование пигмента меланина в меланоцитах. Активация этих рецепторов приводит к увеличению количества черно-коричневого пигмента - эумеланина, а уменьшение рецепторной активности - к усилению синтеза

Таблица 1. Меланокортиновые рецепторы рецептор агонисты и степень их аффинности экспрессия мРНК

МС1 а-МСГ=АКТГ> р-МСГ>у-МСГ Меланоциты, к-ки Лейдинга, семенники, желтое тело яичника, плацента, макрофаги, моноциты, нейтрофилы, эндотелиальные к-ки, фибробласты, к-ки глиомы, астроциты, околоводопроводное серое вещество, гипофиз.

МС2 АКТГ Кора надпочечников.

МСЗ у-МСГ>а-МСГ= р-МСГ=АКТГ Головной мозг (Г.м.): гипоталамус, ядро уздечки, латеральное септальное ядро перегородки, вентральная покрышка. Периферические ткани (П.т.): плацента, двенадцатиперстная кишка, поджелудочная железа, желудок.

МС4 а-МСГ=АКТГ> Г. м.: гипоталамус, зрительная кора, область р-МСГ»у-МСГ септума, гиппокамп, передние бугры четверохолмия, ядро оптического тракта, ствол мозга и спинной мозг. В течение онтогенеза: г. м., спинной мозг, вегетативная нервная система и мозговое вещество надпочечников.

МС5 а-МСГ>АКТГ= р-МСГ»у-МСГ П.т.: кожа, надпочечники, скелетная мускулатура, костный мозг, селезенка, тимус, семенники и яичники, матка, легкие, печень, щитовидная железа, желудок, почки, экзокринные железы. Г.м.: кора, мозжечок.

Starowicz, Przewlocka, 2003]. красно-желтого пигмента - феомеланина [Wikberg et al., 2000]. У человека активация MC1R приводит к появлению загара. Мутации MC1R могут приводить к нарушению их функций и фенотипически у человека проявляются в рыжей или светлой окраске волос, светлой коже и ослабленной способности к загару [Healy et al., 2000]. В человеческом эпидермисе были обнаружены различные меланокортины, взаимодействующие с МС1 рецепторами: АКТГмо, АКТГ].17, АКТГ1.39, а-МСГ. Их способность связываться с данным подтипом рецепторов не одинакова и выражается следующим образом: АКТГ]. 17>а-МСГ>АКТГ 1,39>АКТГ 1ю [Wakamatsu et al., 1997].

MC1R обнаружен также во многих клетках иммунной системы, включая макрофаги, моноциты, нейтрофилы, фибробласты, кератиноциты и др. [Catania et al., 1996; Wikberg et al., 2000]. Недавно было показано, что моноциты из 5 типов МС рецепторов экспрессируют только MC1R. Митогены, эндотоксины и провоспалительные цитокины повышают уровень экспрессии MC1R в моноцитах. [Luger et al., 1998]. Эти данные свидетельствуют об участии MC1R в реализации иммуномодулирующих эффектов меланокортинов.

Меланокортиповые рецепторы 2 типа

Вскоре после открытия MC1R были клонированы мелапокортиновые рецепторы в коре надпочечников - MC2R. В отличие от других подтипов МС рецепторов, которые способны связываться с различными меланокортинами, МС2 рецепторы высокоселективны и взаимодействуют исключительно с АКТГ или его фрагментами не короче, чем АКТГ1.24 [Schioth et al., 1996; Wikberg, 2001]. MC2R опосредуют стероидогенные эффекты этого гормона. Большое количество этих рецепторов было найдено в коре надпочечников, причем именно в тех зонах, где осуществлялась продукция глюкокортикоидов [Xia, Wikberg, 1996]. Кроме того, мРНК МС2 рецепторов была обнаружена в коже человека [Slominski et al., 1996] и в адипоцитах мышей [Boston, Cone, 1996]. А поскольку адипоциты грызунов содержат МС2 рецепторы, то существует предположение, что липолиз, вызванный стрессом, регулируется именно через этот подтип меланокортиновых рецепторов [Boston, 1998]. У людей же стресс-вызванный липолиз опосредуется через другие механизмы, поскольку адипоциты человека не содержат МС2 рецепторы, и АКТГ не стимулирует липолиз в этих клетках [Bousquet-Melou et al., 1995]. У цыплят МС2 рецепторы были обнаружены в селезенке и надпочечниках [Takeuchi et al., 1998], что говорит об увеличении функций этих рецепторов у птиц по сравнению с млекопитающими и о том, что один и тот же подтип рецептора может проявлять различные свойства у отдаленных видов.

Мутации гена, кодирующего МС2 рецепторы, часто вызывают ослабление рецепторных функций, что приводит к наследственной глюкокортикоидной недостаточности [Elias et al., 1999]. Однако иногда этот синдром проявляется у людей с нормальным МС2-геном, что говорит о существовании других нарушений, приводящих к этому заболеванию [Huebner et al., 1999].

Меланокортиновые рецепторы 3 типа

МСЗ рецепторы обладают афинностью к а-, Р-, у-МСГ и АКТГ, но наибольшее сродство они проявляют к yi-МСГ и уг-МСГ. Высокая селективность рецептора к у-МСГ может свидетельствовать о том, что этот пептид является основным эндогенным агонистом МСЗ рецептора [Roselli-Rehfuss et al., 1993; Wikberg et al., 2000]. Ha периферии экспрессия MC3R показана во многих органах и тканях (табл. 1) [Gantz et al., 1993а; Chhajlani, 1996]. Экспрессия MC3R также широко представлена в ЦНС: в гипоталамусе, таламусе, гиппокампе, передней миндалине и коре [Low et al., 1994]. Высокая плотность MC3R также показана в вентромедиальных ядрах гипоталамуса, включая аркуатное ядро, и в заднем гипоталамусе. Изучение связывания 125I-NDP-MSH показало высокую плотность MC3R в прилежащем ядре, а также в медиальной преоптической зоне и центральном сером веществе. Высокий уровень MC3R представлен в прозрачной перегородке и обонятельном бугорке. Существует предположение, что большое распространение рецепторов в ЦНС говорит об их пресинаптическом расположении [Wikberg et al., 2000]. Кроме того, показано, что большое количество этих рецепторов находится в клетках аркуатного ядра, которое известно, как место продукции ПОМК [Roselli-Rehfuss et al., 1993]. На основании этого было высказано предположение о том, что MC3R функционируют как ауторецепторы и контролируют выброс меланокортинов из ПОМК-содержащих нейронов [Wikberg et al., 2000]. Установлено, что в течение онтогенеза крыс экспрессия МСЗ рецепторов в ЦНС подвергается изменениям: при рождении экспрессия довольно низкая, затем она возрастает в течение 21 дня и далее остается неизменной [Xia, Wikberg, 1997]. У птиц эти рецепторы не встречаются в мозге, зато они обнаружены в надпочечниках [Takeuchi, Takahashi, 1999].

Функции МСЗ рецепторов пока недостаточно изучены, однако распределение этого рецептора в ЦНС свидетельствует о его возможной роли в регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы, контроле полового поведения, терморегуляции и энергетического обмена [Low et al., 1994; Wikberg et al., 2000]. Экспрессия этого рецептора в сердце и высокая аффинность к нему у-МСГ также указывает на участие МСЗ рецептора в эффектах у-МСГ на сердечный ритм и кровяное давление [Schioth et al., 1998]. Показано, что мыши, нокаутные по гену MC3R, характеризуются нарушением обмена веществ, увеличением массы жировых запасов и снижением мышечной массы, при этом общая масса тела практически не изменяется. Кроме того, у этих животных отмечалась гипофагия и снижение локомоторной активности. Эти данные свидетельствуют о важной роли МСЗ рецепторов в регуляции энергетического гомеостаза [Butler et al., 2000].

Меланокортиновые рецепторы 4 типа

Вторым типом нейрональных меланокортиновых рецепторов, которые были клонированы, являются MC4R [Gantz et al., 19936]. Распределение МС4 рецепторов в мозге даже более разнообразно, чем MC3R. Экспрессия этого рецептора показана в таламусе, гипоталамусе, стволе мозга и коре. Распространение MC4R в этих регионах мозга свидетельствует об их возможном участии в регуляции вегетативных и нейроэндокринных функций. Наличие MC4R в прилежащем ядре представляет большой интерес для выяснение роли меланокортиновой системы в развитии наркотической зависимости [Starowicz, Przewlocka, 2003]. MC4R экспрессируются также в спинном мозге [Mountjoy et al., 1997]. Детальное изучение органов человека продемонстрировало низкий уровень MC4R на периферии. Кроме мозга, было исследовано еще 20 различных органов человека и показано, что в периферических органах МС4 рецепторы отсутствуют [Chhajlani, 1996]. Однако позже другие ученые установили, что МС4 рецепторы могут присутствовать в жировой ткани, что говорит об их возможной роли в регуляции веса [Chagnon et al., 1997]. В отличие от млекопитающих, у птиц МС4 рецепторы встречаются во многих периферических органах [Takeuchi, Takahashi, 1998].

МС4 рецепторы появляются в эмбриональном мозге задолго до МСЗ рецепторов. Они были обнаружены в эмбрионах крыс на 18 день, в то время как МСЗ рецепторы еще отсутствовали [Kistler-Heer et al., 1998]. Во время развития эмбриона эти рецепторы активно экспрессируются в нервной системе, что говорит об их участии в ее развитии [Wikberg et al., 2000].

Основной функцией МС4 рецепторов является контроль веса тела и регуляция пищевого поведения [Wikberg, 1999]. Инактивация гена МС4 рецепторов у мышей приводит к выраженному увеличению потребления пищи и, как следствие, к увеличению веса тела [Huszar et al., 1997]. Были изучены некоторые мутации гена человека, кодирующего последовательность МС4 рецептора, и показано, что нарушение активности рецептора приводит к развитию тяжелых наследственных форм ожирения [Hinney et al., 1999].

Однако центральные МС4 рецепторы могут быть также вовлечены в регуляцию других эффектов МСГ-пептидов. В частности, получены данные, свидетельствующие об участии рецепторов этого типа в регуляции интенсивного груминга и некоторых других видов стереотипического поведения (синдром потягивания-зевания), вызванных центральным введением АКТГ и а-МСГ [Adan, Gispen, 1997; Wikberg et al., 2000]. Показано участие MC4 рецепторов в регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы [Wikberg et al., 2000].

Показано, что хроническое введение морфина приводит к снижению экспрессии MC4R в регионах мозга, вовлеченных в развитие наркотической зависимости, что свидетельствует о взаимодействии МК и опиоидной систем мозга и указывает на возможную роль меланокортиновой системы в развитии наркотической, в частности опиоидной, зависимости [Alvaro et al., 1996].

Мелапокортиновые рецепторы 5 типа

Последними из меланокортиновых рецепторов были клонированы гены MC5R. Данный тип рецепторв наиболее гомологичен MC4R и наименее схож с MC2R. Из всех меланокортинов МС5 рецепторы предпочтительнее связываются с а-МСГ, a наименьшее сродство они проявляют к у-МСГ [Wikberg et al., 2000]. MC5R мРНК экспрессируется в большом количестве в экзокриппых железах, таких как слезные, семенные, препуциальные, сальные железы и простата [van der Kraan et al., 1998]. MC5R также экспрессируются во многих других периферических тканях (табл. 1). Кроме того, эти рецепторы представлены в некоторых областя мозга, включая гипофиз, обонятельную луковицу, черную субстанцию и стриатум [Griffon et al., 1994]. Экспрессия MC5R мРНК обнаружена у мышей в адипоцитах, но в более низком уровне, чем мРНК меланокортиновых рецепторов 2 типа. Функции MC5R до сих пор не до конца изучены, известно что их активация опосредует слабую липолитическую активность а-МСГ в адипоцитах некоторых видов грызунов [Boston et al., 1996]. У животных с дисфункцией MC5R была понижена продукция секрета сальных желез, что приводило к затруднению отталкивания воды мехом и нарушению терморегуляции [Chen et al., 1997]. Показано, что MC5R расположены па ацинарных клетках секреторного эпителия слезных желез. Активация МС5 рецепторов в этих клетках стимулирует секрецию белков и пероксидазы. В сальных и препуциальпых железах MC5R стимулируют выделение секрета, липогенез и биосинтез порфиринов. Экспрессия МС5 рецепторов в секреторном эпителии многих экзокринных желез подтверждает возможность МК напрямую регулировать их работу [van der Kraan et al., 1998]. Существует предположение, что MC5R опосредует регуляцию секреции стресс-вызванных "ферамонов тревоги" [Chen, 2000]. Кроме того, присутствие MC5R на мембранах В- и Т-лимфоцитов свидетельствует о роли этих рецепторов в иммунной регуляции. Недавно было показано, что а-МСГ участвует в регуляции активности В-лимфоцитов, специфически связываясь с MC5R [Catania et al., 2004].

Эндогенные антагопнсты МС рецепторов

В организме существуют два эндогенных антагониста МС рецепторов - агути-протеин и AGRP (agouti related protein). Эти белки уникальны, так как кроме них до настоящего времени не выявлено других эндогенных антагонистов семидоменных трансмембранных рецепторов. Агути-протеии и AGRP обладают различной селективностью к разным МС рецепторам [Gantz, Fong, 2003].

Агути-протеин является паракринным сигнальным фактором, который секретируется папиллярными клетками кожи, окружающими мелапоциты [Dinulescu, Cone, 2000]. В норме у животных этот белок синтезируется только в коже в области волосяных фолликул [Miller et al., 1993; Wikberg, 2001]. Молекула агути-протеина грызунов состоит из 131 а.к. остатка и имеет гидрофобную сигнальную последовательность. Для этого белка также характерно наличие большого числа основных остатков на N-конце молекулы, обогащенный пролином центральный регион и С-концевая область, обогащенная остатками цистеина [Dinulescu, Cone, 2000]. Роль этого белка у грызунов состоит в регуляции окраски волосяного покрова совместно с а-МСГ и МС1 рецептором. Агути-протеин является конкурентным высокоаффинным антагонистом рецепторов меланокортинов. У него высокое сродство к МС1 и МС4 рецепторам. Он также связывается с МСЗ, но с более низкой аффинностью, и с МС5 с еще более низким сродством [Dinulescu, Cone, 2000]. Агути-протеин воздействует на меланоциты, блокируя эффекты МК на MC1R. У животных секреция агути-протеина в коже приводит к преобладанию желто-красной окраски меха, что связано с увеличением синтеза феомеланина из-за блокады МС1 рецептора. Кроме того, агути способен снижать продукцию эумеланина в культуре клеток в отсутствие а-МСГ. Этот эффект связан с MC1R, так как в клетках, лишенных этого рецептора, агути не влиял на синтез пигмента. Следовательно, агути-протеин способен снижать активность рецептора, действуя как инверсный агонист. Такой механизм создает эффективную систему контроля образования пигмента [Wikberg et al., 2000]. Показано, что повышенная экспрессия агути-протеина в коже мышей приводит к желтой окраске меха, а увеличение его синтеза в других регионах вызывает ожирение, диабет и возрастание риска образования опухолей [Wikberg, 1999]. У человека выделен белок, гомологичный агути грызунов, названный ASIP (agouti signaling protein). Этот белок близок по строению к агути-протеину грызунов, но более широко распространен. Он синтезируется в жировой ткани, семенниках, яичниках, сердце, нижних слоях кожи, почках и печени [Wilson et al., 1995]. У человека роль ASIP в регуляции пигментации кожи и волос сомнительна, физиологическое значение этого белка до настоящего времени не ясно [Gantz, Fong, 2003].

Позже был выделен белок, близкий по строению агути-протеину, получивший название AGRP (agouti related protein). Этот белок на 25 % гомологичен агути, у человека состоит из 132 а.к., у мыши - из 131 а.к. [Shutter et al., 1997]. В отличие от агути, этот белок не имеет большого числа основных остатков на N-конце молекулы и богатого пролином центрального домена, но также обладает обогащенной цистеином С-концевой областью [Dinulescu, Cone, 2000]. AGRP является конкурентным антагонистом МСЗ и МС4 рецепторов, обладает примерно одинаковым сродством к этим рецепторам, практически не связывается с МС5 рецептором [Fong et al., 1997]. Этот белок экспрессируется главным образом в аркуатном ядре гипоталамуса, в субталамической области и коре надпочечников. AGRP распространен в ЦНС в регионах, в которых расположены ПОМК-экспрессирующие нейроны [Wikberg et al., 2000]. Основную роль этот белок играет в гипоталамусе, где является мощным ориксигенным фактором из-за способности блокировать эффекты МК на МСЗ и МС4 рецепторы. Во многих клетках AGRP экспрессируется одновременно с нейропептидом Y, который также является регулятором потребления пищи [Wikberg, 2001].

Таким образом, в настоящее время показано, что агути-протеин и его гомологи являются частью общей сигнальной системы, которая распространяется значительно дальше регуляции синтеза меланина. Существующие данные указывают на функциональное сходство этих белков. Агути-протеин и AGRP служат регуляторами активности МК системы в коже и мозгу, соответственно [Dinulescu, Cone, 2000].

Первые сведения о непосредственном, не связанном с надпочечниками, влиянии меланокортинов на ЦНС были получены еще в 50-ых годах прошлого столетия [De Wied, 1964, 1966]. Однако в течение длительного времени оставалось непонятным, каким образом МК могут оказывать влияние на мозг. Доказательство присутствия пептидов этого семейства в ЦНС в конце 70-ых годов послужило первым свидетельством существования меланокортиновой системы мозга [Jacobowitz et al., 1978]. В начале 80-ых годов была изучена структура ПОМК и показана его экспрессии в мозге, что явилось еще одним подтверждением [Gee et al., 1983]. Однако только через 10 лет было выявлены места связывания МК в ЦНС и периферических тканях, было открыто семейство меланокортиновых рецепторов [Tatro, 1990]. Таким образом, исследования последних десятилетий предоставили убедительные доказательства у-МСГ а-, р-МСГ

АКТГ

ПОМК

Рецепторы

Эндогенные антагонисты

Функции

MC1R

Агути-протеин пигментация иммуно-модуляция

MC3R

AGRP энергетический гомеостаз, сердечнососудистая система

MC4R

AGRP потребление пищи, груминг, стресс, боль, сердечно-сосудистая система

MC5R регуляция экзокринны*; желез

MC2R стрероидо-генез память, обучение

Рис. 4. Меланокортиновая система [Adan, Gispen, 2000]. существования меланокортиновой системы организма. Именно такая система, которая включает в себя эндогенные агонисты - меланокортины, меланокортиновые рецепторы, различающиеся по локализации и аффинности к разным лигандам, а также эндогенные антагонисты этих рецепторов, обеспечивает реализацию широкого спектра физиологических эффектов меланокортинов (рис. 4). Существование разных лигандов, обладающих разнонаправленной активностью по отношению к одним рецепторам, обеспечивает механизм интеграции различных сигналов на рецепторном уровне и возможность тонкой регуляции активности МК системы [Nijenhuis et al., 2001].

Физиологические эффекты меланокортинов

Меланокортины были открыты и первоначально известны как регуляторы пигментации и продукции стероидных гормонов корой надпочечников. Однако дальнейшие исследования показали, что, помимо гормональных эффектов, МК играют важную роль в процессах обучения и памяти, регенерации, иммуномодуляции, деятельности сердечно-сосудистой системы и других. Было показано, что многие из этих эффектов являются результатом прямого действия этих пептидов на ЦНС.

Стеропдогеннан активность

Стресс это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих в организме под влиянием любого воздействия и включающих комплекс неспецифических защитно-приспособительных реакций. Одним из важнейших организаторов реализации этого комплекса реакций в организме позвоночных является гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система (ГГАС). При воздействии на организм происходит выброс КРФ гипоталамусом, вызывающий секрецию АКТГ из гипофиза, которая приводит к быстрому увеличению продукции глюкокортикоидов [Розен, 1994]. АКТГ1.39 является единственным пептидом, обладающим выраженной кортикотропной активностью [Raffin-Sanson et al., 2003]. Влияние АКТГ на продукцию и выброс стероидов корой надпочечников, их циркадная вариабельность и стресс-вызванные изменения опосредуются МС2 рецепторами. Молекула АКТГ - единственный известный эндогенный лиганд этих рецепторов, локализованных на мембранах клеток коры надпочечников. Связывание АКТГ с МС2 рецептором стимулирует аденилатциклазу, которая вызывает увеличение продукции цАМФ в клетке, что приводит к активации протеинкиназы А, которая индуцирует экспрессию ферментов, участвующих в биосинтезе стероидов [Catania et al., 2004]. В конечном итоге происходит секреция глюкокортикоидов, андрогенных стероидов и, в меньшей степени, минералокортикоидов. Острый эффект АКТГ заключается в стимуляции перехода холестерина в Д5-прегпеналон, что является исходным шагом в биосинтезе кортизола. Хронический эффект АКТГ включает в себя активацию синтеза большинства ферментов, участвующих в биосинтезе стероидов [Raffin-Sanson et al., 2003]. Показано, что снижение уровня АКТГ в крови приводит к снижению массы и размера надпочечников, а хронический стресс (долговременное воздействие АКТГ), напротив, вызывает увеличение массы надпочечников. Следовательно, АКТГ стимулирует пролиферацию клеток коры надпочечников. Однако не только АКТГ, но и другие производные ПОМК участвуют в регуляции пролиферации клеток коры надпочечников. Показан митогенный эффект N-концевой последовательности молекулы ПОМК - N-терминального пептида. Инфузия N-терминального фрагмента ПОМК(1-28) частично предотвращала атрофию надпочечников у гипофизэктомированных животных [Raffin-Sanson et al., 2003].

Важность АКТГ для нормального функционирования надпочечников была продемонстрирована в ряде патологических ситуаций. У человека описано несколько мутаций, приводящих к нарушению синтеза АКТГ или его рецепции корой надпочечников (врожденное отсутствие передней доли гипофиза, врожденная АКТГ недостаточность, нечувствительность к АКТГ, связанная с мутацией в гене, кодирующем МС2 рецептор). Независимо от вида мутаций, дефицит АКТГ вызывал тяжелую глюкокортикоидную недостаточность, которая приводила к гипогликемии и холестазу в неонатальный период, а также к осложненному протеканию инфекционных заболеваний во взрослом состоянии [Krude, Gruters, 2000].

Меланокортины ii пигментация

У млекопитающих цвет кожи и меха определяется соотношением пигментов эумеланина и феомеланина, синтезируемых в меланоцитах. Это соотношение регулируется МК системой - меланокортиновыми пептидами, МС1 рецептором и агути-протеином. Активация меланокортинами МС1 рецепторов приводит к увеличению продукции черно-коричневого пигмента эумеланина, а ингибирование этого рецептора агути-протеином - к усилению синтеза желто-красного пигмента феомеланина [Wikberg, 2001]. Активация МС1 рецептора приводит к увеличению содержания внутриклеточного цАМФ, что стимулирует продукцию микрофтальмического транскрипционного фактора (microphtalmia transcription factor, MITF) в меланоцитах. MITF активирует гены ферментов, вовлеченных в синтез меланина - тирозиназы и белков, связанных с тирозиназой (tyrosinase-related proteins, TRP) - TRP1 и TRP2. Эти ферменты локализованы в меланосомах. Тирозиназа является лимитирующим ферментом синтеза меланина, катализирующим первую реакцию этого процесса. TRP1 и TRP2 необходимы на следующих этапах синтеза эумеланина. Феомеланин синтезируется в отсутствие TRP1 и TRP2 и при низком уровне тирозиназы [Wikberg et al., 2000]. Вариации цвета кожи у людей определяются различным количеством, типом и соотношением различных типов продуцируемого меланина [Rees, 2004].

У человека и других млекопитающих показано присутствие в коже ПОМК и ферментов РС1 и РС2. В кератиноцитах и меланоцитах происходит транскрипция и трансляция гена ПОМК, образовавшийся белок подвергается посттрансляционному процессингу [Wakamatsu et al., 1997; Slominski et al., 2000]. АКТГ и МСГ образуются в кератиноцитах и меланоцитах, где действуют как пара/аутокринные факторы, контролирующие образование пигмента. В настоящее время накоплено множество доказательств того, что различные цвета кожи и волос определяются различным уровнем активации МК системы [Gantz, Fong, 2003].

Важным фактором, регулирующим активность МК системы кожи, является ультрафиолетовое излучение (УФ). Воздействие высоких доз УФ может быть повреждающим фактором для организма, и активация МК системы в ответ на такое воздействие является защитной реакцией. При действии УФ происходит активация всех компонентов МК системы - возрастание продукции КРФ в меланоцитах, стимуляция экспрессии ПОМК и РС1 и РС2, образование АКТГ и МСГ, увеличение экспрессии МС1 рецептора, пролиферация мелапоцитов [Slominski et al., 2000]. Повышение активности МК системы приводит к увеличению продукции эумеланина и, как следствие, усиливается пигментация кожи, что защищает кожу от воздействия высоких доз УФ [Wakamatsu et al., 1997].

В норме регуляция пигментации осуществляется МК, которые образуются в коже. Однако у человека при ряде патологических ситуаций наблюдается сверхпродукция АКТГ гипофизом (например, при опухолях гипофиза или в случае мутации МС2 рецептора, приводящей к потере функции). В таких случаях повышенный уровень АКТГ вызывает гиперпигментацию [Krude, Gruters, 2000].

Таким образом, помимо эндокринных эффектов меланокортинов гипофиза, пептиды этого класса в коже выполняют пара/аутокриппую функцию, регулируя ее пигментацию.

Первым из негормональных эффектов меланокортинов было открыто воздействие пептидов этого класса на обучение и память. В середине 60-ых годов XX века, когда не были открыты места связывания МК в мозге и не было доказательств присутствия этих пептидов в ЦНС, David De Wied предложил свою концепцию пейропептидов (1969 г.). Эта концепция основывалась на факте, что фрагменты гипофизарных гормонов воздействуют на поведение животных через экстраэпдокринные механизмы, что подразумевало прямое воздействие пептидов на ЦНС [Adan, Gispen, 2000].

Ноотропные эффекты меланокортинов

Обучение и память необходимы для человека и животных. Эти функции способствуют адаптации организма к изменениям окружающей среды, что является необходимым условием выживания живого организма. В литературе встречаются многочисленные данные о влиянии меланокортинов на процесс обучения. Большинство пептидов этого класса способно оказывать ноотропное действие - ускорять обучение, улучшать внимание и память.

Первые данные по влиянию АКТГ на поведение животных были получены в середине 50-х годов [Mirsky et al. 1953; Murphy, Miller, 1955]. В дальнейшем De Wied и его сотрудники исследовали влияние АКТГ и его фрагментов на обучение животных. Было показано, что удаление передней доли гипофиза приводит к нарушению выработки рефлекса активного избегания [De Wied, 1964]. Введение АКТГ нормализовало обучение животных. Затем было показано, что АКТГ улучшает обучение и у интактных животных [Bohus, Endroczi, 1965]. Было высказано предположение о том, что этот эффект опосредован через кору надпочечников и является составной частью гормонального действия АКТГ. Но вскоре выяснилось, что удаление надпочечников не приводит к исчезновению влияния АКТГ на поведение [Bohus et al., 1968; Miller, Ogawa, 1962]. Было также показано, что аналогичным действием на обучение обладают а- и Р-МСГ, хотя они содержат лишь часть аминокислотной последовательности АКТГ и проявляют низкую кортикотропную активность [Bohus, De Wied, 1966; De Wied, 1966; De Wied, 1969]. При этом глюкокортикоиды обладают собственным воздействием на процессы обучения. Показано, что введение гормонов коры надпочечников гипофизэктомированным крысам улучшает их способность к выработке навыка [De Wied, 1964]. Однако АКТГ и глюкокортикоиды разными путями влияют на формирование навыка. При этом АКТГ стимулирует обучение более специфическим путем, чем гормоны коры надпочечников, которые, по-видимому, вызывают общее повышение уровня активности [Miller, Ogawa, 1962; Weiss et al., 1970; Bohus, 1974]. В пользу этого свидетельствует тот факт, что введение глюкокортикоидов вызывает ускорение угашения ранее выработанного навыка [Bohus, Lissak, 1968]. Удаление коры надпочечников приводит к замедлению угасание рефлекса активного избегания, что связано с высоким уровнем эндогенного АКТГ [Bohus et al., 1968].

В настоящее время в литературе представлено большое количество данных по влиянию АКТГ и МСГ на выработку условных рефлексов. При этом в случае использования моделей с отрицательным (болевым) подкреплением результаты не однозначны. В одних работах показано, что у интактных животных эти гормоны улучшают выработку рефлексов с болевым подкреплением [Beaty et al., 1970; Bohus et al., 1968; Van Wimersma Greidanus, 1980], в других - не обнаружено влияние АКТГ на способность животных избегать болевой раздражитель [Murphy, Miller, 1955; Kelsey, 1975], в-третьих - показано негативное действие фрагментов АКТГ на обучение животных с отрицательным подкреплением [Izquierdo, Dias, 1983]. По-видимому, неоднозначность эффектов АКТГ при обучении животных в тестах с отрицательным подкреплением может быть связана с различным уровнем эндогенного АКТГ, в значительной степени зависящего от условий эксперимента. Исследования влияние АКТГ и МСГ на выработку рефлексов с положительным подкреплением демонстрируют улучшающий эффект [Sandman et al., 1969; Guth et al., 1971; Stratton,

Kastin, 1975; Garrud et al., 1974a; Kastin et al., 1975]. В литературе также встречается множество данных о положительном действии АКТГ на сохранение и угашение предварительно выработанных рефлексов. Торможение угашения под действием этих гормонов наблюдалось в самых различных модификациях опытов: в тестах активного [De Wied, 1966; Nyakas, Endroczi, 1980] и пассивного избегания удара током [Dempsey et al., 1975; Levine, Jones, 1965; Mc Gaught et al., 1975; Wiegant, Gispen, 1977], с пищевым подкреплением [Gray, 1977], в тестах, основанных на вкусовом отвращении [Levine et al., 1977; Smotherman, Levine, 1978]. Более выраженное действие АКТГ на сохранение навыка по сравнению с его действием на выработку рефлексов, по-видимому, связано с тем, что во время обучения возникает стрессорная реакция и наблюдается выброс эндогенного АКТГ, что не дает возможность проявиться эффектам экзогенного гормона.

Исследование зависимости эффектов АКТГ от дозы показало, что малые дозы гормона улучшают, а высокие - ухудшают сохранение и воспроизведение предварительно выработанного навыка [Sands, Wright, 1979; Gold, Van Buskirk, 1976]. В работах нашей лаборатории было показано, что внутрибрюшинное введение крысам 150 мкг/кг гормона за 5 минут или сразу после сеанса обучения в Т-образном лабиринте приводило к ускорению выработки навыка. При увеличении дозы до 500 мкг/кг эффекты пептида изменялась: при введении за 5 минут наблюдалось торможение выработки, а при введении непосредственно после эксперимента влияния на обучение не наблюдалось [Антонова и др., 1988]. Введение оптимально действующих доз через 2 часа после обучения также пе оказывало влияния на сохранение навыка [Gold, Van Buskirk, 1976]. Таким образом, эффекты АКТГ на обучение зависят от дозы и времени введения гормона.

Показано, что введение антител к АКТГ приводит к ускорению угашения ранее выработанного рефлекса активного избегания и нарушает воспроизведение рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя. Эти результаты свидетельствуют о физиологической роли эндогенных МК в процессах обучения [De Wied, Jolles, 1982].

Дальнейшие исследования показали, что способностью улучшать обучение животных обладают также и фрагменты АКТГ и МСГ, заведомо лишенные гормональной активности. Изучение поведенческой активности фрагментов АКТГ позволили выявить зависимость эффектов пептидов от их структуры. Было показано, что минимальным фрагментом, сохраняющим поведенческие эффекты целой молекулы АКТГ при полной потере гормональных свойств, является пептид АКТГмо. Несколько меньшей активностью обладает тетрапептид АКТГ4.7 (Met-Glu-His-Phe) [De Wied et al.,

1975]. По данным некоторых авторов более короткий фрагмент гормона (Glu-His-Phe) также оказывает действие на поведение животных, но его эффекты слабо выражены [De Wied et al., 1975; Greven, De Wied, 1973]. Остаток Phe в позиции 7 играет ключевую роль в проявлении поведенческих эффектов фрагментов АКТГ. Замена этой аминокислоты на D-энантиомер в АКТГыо, АКТГ4.10 или АКТГ4-7 приводила к появлению противоположного эффекта - замедлению выработки условной реакции избегания [Ашмарин и др., 1980; Garrud et al., 19746; Flood et al., 1976]. Аналоги (D-РЬе7)-АКТГ также способствовали угашению ранее выработанных реакций [Garrud et al., 19746; De Wied, 1993]. Замена других аминокислотных остатков на D-изомеры не приводит к реверсии поведенческих эффектов МК и, в ряде случаев, даже увеличивает ноотропное действие пептидов. Интересно, что у-МСГ, который отличается от других МК по структуре и практически не обладает меланоцитстимулирующей активностью, так же, как и DPhe-содержащие аналоги, замедляет выработку и ускоряет угашение условных рефлексов [De Wied, 1993].

Исследовались ноотроппые эффекты различных фрагментов АКТГ. Было показано, что АКТГыо и АКТГ4.10 влияют па обучение гипофизэктомированных животных также хорошо, как и АКТГ].24 [De Wied, 1969]. Позже было показано положительное влияние АКТГ4.10 па выработку условных рефлексов у интактных животных [Greven, De Wied, 1973; Flood et al., 1976; Bohus, De Wied, 1981]. Фрагменты АКТГ4-7 и АКПУю также ускоряют выработку условных рефлексов [Виноградов, Медведев и др., 1980]. Причем более активным из исследованных пептидов является АКТГ4.7. Фрагменты АКТГ также положительно влияют на выработку навыков, основанных на положительном подкреплении [Kastin et al., 1975; Вознесенская, Полетаева, 1984]. В работах нашей лаборатории было показано, что введение фрагмента АКТГ4.10 сразу после сеансов обучения в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением приводит к ускорению обучения в тесте [Ашмарин и др., 1978].

Эксперименты, проведенные на добровольцах, показали, что АКТГ и МСГ положительно влияют на когнитивные способности человека. Было показано, что введение меланокортинов улучшает внимание и способность к выполнению длительных однообразных заданий. Введение АКТГ и МСГ приводило к улучшению воспроизведения навыка у людей с различными нарушениями памяти, но не влияло на пожилых людей [Zager, Black, 1985]. Изучение влияния фрагментов АКТГ в опытах, проводимых на людях, также показало положительное действие пептидов на память человека. Введение фрагмента АКТГ].17 приводило к улучшению краткосрочной памяти. Одновременно с этим у испытуемых было зарегистрировано повышение уровня кортизола в плазме крови, увеличение давления, а несколько позже (через 20 и 40 мин после инъекции) уменьшение уровня тревожности. На основании этих данных авторы делают вывод, что влияние АКТП-п на краткосрочную память связано с центральным действием пептида [Pancheri et al., 1984]. Исследования на добровольцах показали, что введение АКТГ4.10 приводит к повышению селективного внимания [Miller et al., 1974]. Эффект развивался через 30 мин и длился в течение 1 часа [Born ег al., 1990]. Положительный эффект пептидов был более выражен в том случае, когда в опытах участвовали люди с исходно плохой памятью или пожилые люди с ослабленными познавательными способностями [Sandman et al., 1975; Dornbush, Volavska, 1976]. У здоровых людей введение АКТГ4.10 вызывало снижение порога восприятия при выделении простых стимулов, облегчало восприятие сложной информации, увеличивало способность распознавать значимые и незначимые стимулы. На основании полученных данных было сделано заключении о влиянии этого пептида на внимание и восприятие [Sandman et al., 1977]. В других исследованиях было показано, что введение АКТГ4.ю приводит к улучшению внимания и визуальной, но не вербальной памяти [Miller et al., 1976].

Не существует единого мнения по поводу механизмов ноотропных эффектов МК. Ряд авторов предполагает, что эти пептиды усиливают мотивациопную направленность специфических поведенческих ответов па внешние воздействия. Такое усиление может быть вызвано возрастанием уровня arousal в структурах лимбической системы среднего мозга. Это приводит к увеличению избирательности внимания, то есть происходит усиление мотивационной значимости условных стимулов, имеющих непосредственное отношение к экспериментальной ситуации, и ослабление внимания к посторонним стимулам, что, в конечном счете, приводит к возможности появления стимулспецифических ответов [De Wied, 1993; Zager, Black, 1985]. Эта гипотеза хорошо объясняет влияние МК на обучение с отрицательным подкреплением. АКТГ/МСГ-подобные пептиды также увеличивают селективное внимания и концентрацию. Этот факт может объяснить влияние этих пептидов на обучение с неаверсивным подкреплением. Электрофизиологические данные о том, что МК увеличивают чувствительность гиппокампа крыс при стимуляции ретикулярной формации подтверждают влияние этих пептидов на уровень arousal в лимбической системе [Kovacs, De Wied, 1994]. Однако, по мнению других исследователей МК воздействуют на обучение более специфично, чем влияние на мотивационный уровень. Другим механизмом может быть улучшение кратковременной памяти [Bohus et al., 1968; Pancheri et al., 1984]. Имеются данные о том, что фрагменты АКТГ влияют на специфические механизмы памяти — процессы формирования, хранения и воспроизведения памятного следа. Это подтверждается опытами с введением пептидов после сеансов обучения [Flood et al., 1976].

Для выяснения механизма действия МК проводили исследования эффектов пептидов при повреждениях различных областей мозга. Так, перерезка в районе заднего таламуса полностью снимала положительное влияние АКТГ4.10 на сохранение приобретенного навыка. Эксперименты с аппликацией АКТГ4.10 в различных регионах мозга также показали важность заднего таламуса для реализации ноотропного действия МК [Kovacs, De Wied, 1994]. Перерезка в области лимбических структур и инъекции пептидов в эти районы мозга показали, что такие образования как перегородка, гиппокамп, миндалина тоже вовлечены в проявление поведенческих эффектов МК. Основываясь на этих данных, можно предположить, что для реализации своих эффектов МК используют не на одну конкретную область мозга, а нуждаются в целой, анатомически не поврежденной лимбической системе [Van Wimersma Greidanus ct al., 1983].

Механизмы ноотропных эффектов МК не выяснены. Предполагается, что влияние этих пептидов на обучение осуществляется за счет увеличения оборота моноамииов в мозге. Действительно, многими исследователями показано возрастание оборота и содержания катехоламинов и серотонина в различных регионах мозга после введения МК. Возможно также, что ноотропное влияние реализуется за счет увеличения обмена ацетилхолина в гиппокампе и коре головного мозга. Также показано, что поведенчески активные фрагменты МК снижают связывание глютамата. Известно, что МК влияют на гидролиз полифосфоинозитолов, вызванный активацией рецепторов. При помощи такого механизма МК могут влиять на процесс фосфорилирования белков мозга [Kovacs, De Wied, 1994].

До настоящего времени неясно, какой из рецепторов принимает участие в ноотропном, нейротрофическом и нейропротекторном действии меланокортинов. Наиболее вероятными кандидатами являются МСЗ и МС4 рецепторы, поскольку они экспрессируются в мозге [Hoi et al., 1995]. Однако в литературе встречаются данные, противоречащие этому предположению. Эксперименты показали, что интраназальное введение людям АКТГ4.10 (фрагмента, обладающего низким сродством к известным МС рецепторам) улучшало кратковременную память. Кроме этого пептида, ученые использовали дезацетил-а-МСГ, пептид, способный с высокой степенью аффинности связываться со всеми типами МС рецепторов, находящихся в мозге. Оказалось, что дезацетил-а-МСГ менее эффективно улучшал показатели памяти. Это говорит о том, что механизм ноотропных эффектов МК не связан с МС рецепторами [Smolnik et al., 2000]. АКТГ4.10 и аналог АКТГ4.9 ORG 2766 обладают выраженной ноотропной и нейротрофической активностью. Слабая аффинность АКТГ4.10 к известным МС рецепторам и неспособность ORG 2766 активировать эти рецепторы свидетельствует о том, что известные МС рецепторы не опосредуют поведенческие и нейротрофические эффекты МК. Вероятно, существует другие центральные МК рецепторы, обеспечивающие реализацию широкого спектра физиологической активности МК [Roselli-Renfuss et al., 1993; Adan, Gispen, 1997].

Влияние меланокортинов на двигательную активность и эмоциональное состояние животных

При изучении поведенческих эффектов АКТГ было показано, что этот гормон оказывает влияние на двигательную активность и исследовательское поведение животных [Amir et al., 1980]. Внутрижелудочковая инъекция АКТГ приводит к резкому снижению двигательной активности, количества стоек и обследованных отверстий в тесте "норковая камера" через 15 минут после введения [Issacson, Green, 1978]. При периферическом введении АКТГ также наблюдаются изменения двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных. В данном случае влияние гормона определяется условиями, в которых находится животное во время эксперимента. Инъекция АКТГ перед помещением животного в новые условия приводит к усилению двигательной активности в том случае, когда крысу тестируют в отсутствие сильных внешних раздражителей. В таких условиях поведение в большей степени определяется исследовательской мотивацией. Увеличение двигательной активности свидетельствует, по-видимому, об усилении ориентировочно-исследовательской реакции под действием АКТГ [Антонова и др., 1980]. В случае, когда животное помещается в стрессогенные условия (яркий свет, шум), введение гормона приводит к уменьшению двигательной активности. В этих условиях поведение крыс определяется в основном оборонительной мотивацией, проявлением которой является реакция затаивания [Denenberg et al., 1975]. Следовательно, введение АКТГ приводит к усилению оборонительной реакции. Таким образом, кортикотропин способен усиливать поведенческие реакции, характерные для той ситуации, в которой находится животное, что согласуется с его ролью адаптивного гормона.

Показано, что МСГ и АКТГ при центральном введении способны вызывать у крыс интенсивный груминг. Груминг - это активное поведение животных, направленное на поверхность тела, т.е. умывание, лизание, чистка гениталий, почесывание. В норме такое поведение наблюдается у грызунов неожиданной или конфликтной ситуации - при помещении в новую или стрессогенную обстановку, при социальных контактах, исследовательском поведении. Общим для этих ситуаций является наличие потенциально опасных или новых стимулов, а также стимулов, несущих противоречивую информацию [De Wied, 1993]. В этом случае интенсивный груминг является примером так называемой "смещенной активности", которая возникает у животных при высокой эмоциональной напряженности [Spruijt, Gispen, 1983]. Интенсивный груминг связан в первую очередь с уровнем arousal - уровнем активации животного, он является вторичным ответом, отражающим увеличение уровня arousal в организме. Меланокортины активируют лимбические структуры среднего мозга, что способствует улучшению оценки мотивационной значимости стимулов окружающей среды. Такой механизм может лежать в основе как влияния МК на интенсивный груминг, так и на процессы обучения [Jolles et al., 1979]. Зависимость влияния МК на развитие интенсивного груминга от структуры хорошо изучена. Груминг животных вызывается внутрижелудочковым введением АКТГ, а-МСГ и синтетических агонистов МС рецепторов — NDP-MSH и меланотана-П. Интересно, что yl-МСГ при введении в область вентральной покрышки вызывает увеличение груминга, а у2-МСГ (который отличается только одним С-концевым аминокислотным остатком, рис. 2) не оказывает такого влияния [Wikberg et al., 2000]. Фрагмент АКТГно не вызывает интенсивного груминга, а его аналог с заменой L-Phe в седьмом положении на D-Phe, стимулирует интенсивный груминг, по он менее активен, чем а-МСГ [Isaacson, Thomas, 1986; Adan, Gispen, 2000]. Показано, что способность аналогов вызывать интенсивный груминг коррелирует с их способностью активировать МС4 рецептор. При этом селективный агонист МСЗ рецепторов Nle-y-МСГ не оказывает влияния на груминг при этом введении [Adan et al., 1999]. Груминг крыс, вызванный внутрижелудочковым введением а-МСГ и АКТГ, блокируется антагонистом МС рецепторов HS014 [Klusa et al., 1998; Strand 1999]. АКТГ/МСГ-подобные пептиды способны оказывать влияние на груминг животных и при введении в другие области мозга, например, в паравентрикулярные и дорзометральные ядра гипоталамуса и передний гипоталамус. Антагонист МС рецепторов HS014, введенный в те же области, дозозависимо ингибирует этот эффект [Wikberg et al., 2000]. Все эти данные указывают на то, что влияние МК на груминг опосредуется МС4 рецепторами. Этот рецептор экспрессируется в регионах мозга, вовлеченных в регуляцию такого поведения - ОСВ, черная субстанция, паравентрикулярные ядра [Strand, 1999].

Области мозга, в которых экзогенные меланокортины вызывают груминг животных, являются областями, иннервирующимися ПОМК-нейронами, что говорит о роли эндогенных меланокортинов в груминге животных. Это подтверждается также и тем, что внутрижелудочковое введение блокатора МС рецепторов SHU9119 или антител к АКТГ подавляет груминг у крыс [Wikberg et al., 2000]. Вероятно, а-МСГ является эндогенным лигандом, который опосредует поведение груминга у грызунов в ответ на новые условия. Доказательством этого предположения является сходство между грумингом, вызванным новыми условиями, и грумингом, которым наблюдается после в/м введения этого пептида. Кроме того, показано, что введение антител к а-МСГ или снижение экспрессии ПОМК в гипоталамусе ингибирует интенсивный груминг у грызунов [Adan, Gispen, 1997].

В/ж введение АКТГ/МСГ-подобных пептидов способно вызывать у млекопитающих другой вид поведения, характеризующий эмоциональную напряженность, - это синдром стереотипического поведения, состоящего из чередования потягивания и зевания. Синдром потягивания и зевания, вызванный а-МСГ, снимается предварительным введением антагониста МС рецепторов HS014, что говорит об участии МС рецепторов (преимущественно МС4) в формировании этот процесса [Vergoni et al., 1998]. Этот синдром также возникает при введении АКТГ1.24 и а-МСГ в паравентрикулярные ядра гипоталамуса (PVH) [Argiolas et al., 2000]. Изучение эффектов в/ж введения АКТГ1.24 6-, 9-, и 15-недельным крысам показало, что вызванный синдром потягивания и зевания более выражен у молодых крыс, в то время как интенсивность груминга не зависит от возраста животных [De Wied, 1993].

Таким образом, эндогенная МК система опосредует интенсивный груминг, вызванные новыми условиями, и синдром потягивания - зевания, характеризующий эмоциональную напряженность, то есть при участии этой системы реализуется один из ответов организма на эмоциональный стресс [Adan, et al., 1999; Adan, Gispen, 2000].

Исследование влияния природных МК на социальное поведение животных показало, что периферическое и центральное введение АКТГ1.24 и АКТГио снижают длительность активных социальных контактов у крыс. Влияния на двигательную активность в этих экспериментах пептиды не оказывали. Авторы предполагают, что наблюдаемые эффекты связаны с повышением тревожности под действием пептидов [File, 1979; File, Clarke, 1979]. Интересно, что инъекция аналога АКТГ(4-9) ORG 2766 приводила к увеличению длительности социальных контактов [Clarke, File, 1983]. Анксиогенное действие АКТГ было также показано в других экспериментальных моделях на животных. В этих экспериментах периферическое введение АКТГ в дозах

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ тьтштГ 41

50-75 мкг/кг вызывало повышение тревожности. Авторы предполагают, что наблюдаемые эффекты связаны с увеличением обмена серотонина в среднем мозге и гипоталамусе [File, Vellucci, 1978]. Возрастание уровня тревожности и агрессивного поведения было также зарегистрировано при внутримозговом введении а-МСГ [Gonzales et al., 1986; Kask et al., 1998a]. В настоящее время показано, что важную роль в регуляции стрессорного ответа и эмоционального поведения играет MC4R. Активация этого рецептора вызывает интенсивный груминг и приводит к активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) [Von Frijtag et al., 1998]. Показано, что антагонисты MC4R ослабляют стресс-вызванные анорексию и тревожность у грызунов, а агонисты оказывают анксиогенное действие [Chaki et al., 2003а]. Стрессогенное воздействие приводит к повышению экспрессии ПОМК и MC4R мРНК в амигдале и гипоталамусе, что указывает на роль МК системы в регуляции тревожности и стресс-вызванного поведения. В/ж введение а-МСГ или МТ II (агонистов МС рецепторов) приводит к увеличению экспрессии КРФ в гипоталамусе и возрастанию уровня кортикостерона в плазме крови. На основании этих данных было высказано предположение о том, что активация МС4 рецептора при стрессе приводит к стимуляции ГГАС путем усиления экспрессии КРФ [Yamano et al., 2004].

Таким образом, в настоящее время можно считать доказанным, что МК система вовлечена в регуляцию стресс-вызванного поведения. Препараты, воздействующие на эту систему, могут быть использованы при лечении таких связанных со стрессом заболеваний, как депрессия и тревожность [Chaki et al., 20036]. Исследования на людях показали, что хроническое введение АКТГ4.10 пациентам пожилого возраста в депрессивном состоянии приводит к снижению уровня тревожности и депрессивности [Frederiksen et al., 1985].

Непропротекторпые п нейротрофнческне эффекты меланокортинов

Регенерация нервов и протекторное влияние меланокортинов

Нейротрофические эффекты меланокортинов были продемонстрированы во многих экспериментах in vitro и in vivo. Исследования in vitro показали, что МК влияют на нервные клетки в культуре - эффекты этих пептидов включают в себя повышение выживаемости нейронов, увеличение прорастания отростков, усиление синтеза белка и др. [Strand et al., 1993а]. Эксперименты показали, что а-МСГ стимулирует прорастание отростков в клетках нейробластомы линии Neuro2A, которые экспрессируют МС4 о рецепторы. При этом введение антагониста MC4R (D-Apr -АКТГ4.10) ингибирует стимулирующее действие пептида [Adan et al., 1996]. Также показано, что а-МСГ и

АКТГ4-10 увеличивают аксональный рост в культурах нейронов спинного мозга [Van der Neut et al., 1988]. Синтетические аналоги меланокортинов ORG 2766 и BIM 22015 также ускоряют прорастание отростков в культуре клеток спинного мозга в отсутствие фактора роста нервов (NGF), при этом эффекты пептидов были соспоставимы с эффектами самого NGF [Strand et al., 1993 а]. Литературные данные также указывают на то, что МК оказывают влияние на рост и дифференциацию центральных нейронов в культуре клеток. Присутствие фрагментов АКТГ в культуре серотонинэргических нейронов стимулировало созревание этих клеток и приводило к увеличению числа нервных отростков [Azmitia, De Kloet, 1987]. Обработка культуры церебральных нейронов цыпленка АКТГ1.24 приводит к увеличению клеточного метаболизма и стимулирует прорастание отростков [Daval, 1983]. Введение АКТГио и АКТГ1.24 в культуру клеток мозга, полученных из эмбрионов крысы, приводит к увеличению плотности нейрональных сетей и нейронных связей [Richter-Landsberg, 1986].

Многочисленные эксперименты показали трофическое действие МК при повреждениях и перерезках периферических нервов. Нейротрофическое влияние на поврежденные нервы оказывают а-МСГ и его короткие фрагменты, такие как АКТГио, их синтетические аналоги - ORG 2766 и BIM 22015 [Catania et al., 2004]. Также показано, что агонист МК рецепторов меланотан II обладает мощным нейротрофическим действием [Тег Laak et al., 2003]. Гистологические и функциональные исследования показали, что МК не увеличивают скорость роста поврежденных нервов, а приводят к возрастанию числа вновь сформированных отростков в месте перерезки [Bar et al., 1993]. В случае повреждение периферических нервов и при ряде патологий МК являются эффективными ростовыми факторами, ускоряющими и улучшающими регенерацию нервов и мышечную реиннервацию [Strand et al., 1993а]. Морфологические исследования показали, что введение МК приводит к возрастанию числа регенирирующих отростков, улучшает образование концевых пластинок и увеличивает количество реиннервированных моторных единиц, то есть МК воздействуют на весь комплекс реиннервации мышечных волокон регенерирующим нервом [Strand et al., 19936]. МК облегчают восстановление как сенсорных, так и моторных функций после повреждения или перерезки периферических нервов у крыс [Edwards et al., 1984]. Интратекальное введение а-МСГ оказывает стимулирующее влияние на прорастание отростков нейронов спинного мозга после травмы. У животных, получавших а-МСГ, ускорялось также функциональное восстановление [Lankhorst et al., 1999]. В экспериментальной модели травмы спинного мозга у взрослых крыс присутствие а-МСГ в коллагеновом матриксе, заполняющем место повреждения, вызывало прорастание внутрь него регенерирующих волокон [Joosten et al., 1999].

Меланокортины оказывают протекторное действие в случае токсического повреждения нервной системы. Показано положительное влияние МК в моделях цисплатин- и токсол-вызванных невропатий. Цисплатин и токсол являются противораковыми препаратами, побочным эффектом которых является снижение скорости проведения нервного импульса. Одновременное введение этих препаратов и а-МСГ или аналога ORG 2766 в значительной степени предотвращало развитие невропатии [Gispen et al., 1992; Hamers et al., 1993; Catania et al., 2004].

Способность экзогенных МК стимулировать восстановление периферических нервов свидетельствует о возможном участии аналогичных эндогенных пептидов в регенерации нервов. Хотя МК синтезируются главным образом в гипофизе, предполагается, что такие пептиды могут образовываться в травмированном нерве. Биологически активные МК пептиды были определены в экстрактах регенерирующих нервов, но отсутствовали в интактном контроле [Plantinga et al., 1995]. О роли эндогенных МК в процессах регенерации свидетельствует также увеличение содержания АКТГ4.10 в мотонейронах вентральных рогов спинного мозга после перерезки периферического нерва [Lee et al., 1994]. Введение синтетического антагониста а-МСГ, [D-Trp7,Ala8,D-Phe,0]a-MCr6.n, в течение первых 10 дней после повреждения седалищного нерва крысы приводило к значительному замедлению восстановления функции организма. Это также свидетельствует о том, что эндогенные меланокортины участвуют в регенерации нервной ткани и стимулируют рост периферических нервных волокон [Plantinga et al., 1995].

АКТГ/МСГ-подобные пептиды также способны оказывать положительное действие на восстановление функций организма при повреждениях центральной нервной системы, вызванными как перерезками в различных регионах мозга, так и введением нейротоксинов. Было показано, что АКТГ способен ускорять восстановление поврежденного гиппокампа и нормализовать поведение животных после повреждения или перерезки свода. Периферическое введение аналога АКТГ4.10 BIM 22015 способствовало востановлению когнитивных функций у животных с повреждением фронтальной коры [Antonawich et al., 1994]. Нейропротекторное действие меланокортинов было показано на животных с нарушением дофаминергической (ДА) системы. После повреждения черной субстанции мозга инъекцией 6-гидроксидофамина (6-OHDA) у крыс наблюдались признаки, характерные для болезни Паркинсона (нарушения поведения и расстройства моторных функций).

Восстановление этих функций значительно ускорялось при введении аналога АКТГ4-9 -ORG 2766. У животных, получавших пептид, отмечено ускорение восстановления поведенческих, морфологических и биохимических показателей по сравнению с контрольной группой [Strand et al., 19936]. Кроме того, исследования показали, что у крыс, которым вводили ORG 2766, наблюдается увеличение содержания ДА по сравнению с контролем [Antonawich et al., 1993а].

Меланокортины оказывают протекторное действие в случае ишемических повреждений центральной нервной системы. В экспериментальных моделях инсульта введение а-МСГ ослабляло нарушения, вызванные ишемией ствола головного мозга. Системное введение этого пептида также оказывало нейропротекторное действие на модели глобальной церебральной ишемии. Исследование показало, что введение а-МСГ снижает продукцию провоспалительных цитокинов в мозге [Catania et al., 2004].

В основе функционального восстановления после повреждения структур ЦНС могут лежать различные механизмы. С одной стороны, эти механизмы могут включать в себя защиту нейронов от дальнейшего разрушения, инициацию синаптогенеза или пролиферации новых нейронов. С другой стороны, функциональное восстановление может происходить за счет компенсаторных процессов, таких как изменение плотности рецепторов, коллатеральный спрутинг, изменение скорости обмена медиаторов или их высвобождения неповрежденными нейронами [Antonawich et al., 1994]. Процессы регенерации в ЦНС маловероятны, но МК могут осуществлять защиту нейронов, увеличивать деиннервационную чувствительность или облегчать компенсаторные процессы, которые ускоряют функциональное восстановление [Strand et al., 19936].

Изучение зависимости "структура - активность" показало, что нейротрофические эффекты меланокортинов, также как их ноотропное действие, обусловлены общей последовательностью АКТГ и МСГ - фрагментом АКТГмо- Положительные эффекты МК на повреждение нервного волокна имеют дозозависимый характер и более выражены при введении в короткий период после повреждения [Edwards et al., 1984]. Наиболее действенными пептидами являются а-МСГ и аналог АКТГ4.9 ORG 2766 [De Wied et al., 1990].

Таким образом, МК оказывают нейротрофическое влияние при повреждениях периферической нервной системы, следовательно, пептиды этого класа можно рассматривать как ростовые факторы [De Wied et al., 1990]. Способность экзогенных меланокортинов стимулировать восстановление нервной системы может отражать участие эндогенных пептидов этого класса в физиологическом ответе организма на повреждение. Восстановление центральных нейронов при действии МК, вероятно, осуществляет за счет нейропротекторного действия пептидов, так как МК наиболее эффективны при введении сразу после повреждения нервной системы [Attella et al., 1992; Wolterink et al., 1990]. Исследования показали, что увеличение продукции цАМФ в нейрональных культурах стимулирует рост нейритов, в экспериментах in vivo также было показано, что увеличение продукции цАМФ ускоряет функциональное восстановление после повреждения периферических нервов. Все это свидетельствует о важной роли этого вторичного посредника в нейротрофических процессах. Известно, что рецепторы МК сопряжены с аденилатциклазой и эти пептиды вызывают увеличение продукции цАМФ в клетке. Вероятно, нейротрофическое действие меланокортинов осуществляется при участии аденилатцеклазы и опосредуется МСЗ, МС4 и МС5 рецепторами, которые экспрессируются в нервной ткани [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Более того, короткий пептидный фрагмент АКТГ4.10, который узнается данными типами рецепторов, вызывает регенерацию нервных отростков in vivo [Bijlsma et al., 1983] и in vitro [Van der Neut et al., 1988]. О роли MC4R в нейротрофическом влиянии МК свидетельствует тот факт, что блокада этого рецептора препятствует трофическим эффектам а-МСГ. Экспрессия MC4R в спинном мозге и MC5R в скелетной мускулатуре мыши также указывает на то, что данные типы рецепторов могут играть роль в нейротрофических эффектах а-МСГ [Starowicz, Przewlocka, 2003]. MC4R присутствует в поясничном отделе спинного мозга и локализован, главным образом, в желатинозной субстанции и области, окружающей центральный канал. Кроме того, показана экспрессия ПОМК в спинном мозге и ганглиях дорзальных корешков. Такая локализация ПОМК и MC4R в регионах, которые в основном ассоциируются с ноцицепцией, предполагает вовлечение МК системы в спинальный путь, опосредующий ответ на периферическое повреждение, помимо прямого воздействия МК на рост нейритов и спрутинг [van der Kraan et al., 1999]. Однако, как уже указывалось выше, слабая аффинность АКТГд.ю к известным МС рецепторам и неспособность ORG 2766 активировать эти рецепторы свидетельствует о том, что не только известные МС рецепторы опосредуют нейротрофические эффекты МК. Вероятно, в реализацию нейротрофических эффектов меланокортинов вовлечены другие, в настоящее время неизвестные МК рецепторы [Roselli-Renfuss et al., 1993; Adan, Gispen, 1997].

Влияние меланокортинов на развивающуюся нервную систему.

В исследованиях in vitro было показано, что меланотрофы средней доли гипофиза влияют на дифференцировку гипоталамических дофаминергических нейронов. В присутствие меланотрофов в культуре эмбриональных гипоталамических нейронов увеличивается доля дофаминергических нейронов, ускоряется рост их нервных волокон. Оказалось, что фактором, обеспечивающим нейротрофический эффект на дофаминергические нейроны, является а-МСГ, в то время как увеличение их числа зависит от присутствия других факторов. Схожий результат наблюдался в культуре гипоталамических нейронов, выделенных из мозга новорожденных крыс, однако, в этом случае а-МСГ был ответственен за оба эффекта [Egles et al., 1998].

С различным ответом клеток на действие а-МСГ в разные периоды развития хорошо сочетаются данные об изменении рецепции клеток во время онтогенеза. Было выявлено, что в течение всего эмбрионального периода доминирующим рецептором является МС4. Он обнаруживается во всех эмбриональных областях, связывающих а-МСГ, включая симпатические ганглии, сенсорные и моторные ядра продолговатого мозга, мозжечок. Наблюдаются быстрые всплески в экспрессии, часто совпадающие по времени с формированием нейронной сети, что дает основания предполагать важную роль МС4 рецепторов в раннем онтогенезе. Позже эти функции принимает, вероятно, другой рецептор - МСЗ, который удается обнаружить только в постнатальный период, при этом наблюдается быстрая его экспрессия в вентромедиальном и аркуатном ядрах [Kistler-Heer et al., 1998].

Введение АКТГ/МСГ-подобных пептидов животным в раннем онтогенезе, когда структуры мозга и нейрональные проекции еще развиваются, приводит к ускорению созревания нервно-мышечной системы и влияет на развитие центральной нервной системы [Strand et al., 1989]. Развитие нервно-мышечной системы - сложный процесс, который начинается на ранних этапах внутриутробного развития и продолжается в течение первых недель жизни. В течение этого периода мышцы и нервы чувствительны к влиянию различных ростовых и трофических факторов, которые способствуют нормальному созреванию нервно-мышечной системы [Strand et al., 19936]. Изучение действия МК на развитие нервно-мышечной системы показало, что АКТГцо и а-МСГ положительно влияют на рост и созревание мышечных и нервных волокон, как в эмбриональный, так и в постнатальный период. АКТГ-подобные пептиды влияют на скорость развития и морфологию нервно-мышечного контакта. Данные электронной микроскопии свидетельствуют об ускорении формирования концевой пластинки под влиянием АКТГ [Strand et al., 1989]. Следует отметить, что данные пептиды способны непосредственно влиять на рост и развитие мышечной ткани только в ранний эмбриональный период. Введение пептидов на более поздних сроках беременности влияло только на рост и созревание нервных волокон, а ускорение развития мышечной системы происходило за счет увеличения иннервации мышц. В течение первых двух недель жизни крыс введение фрагментов АКТГ или а-МСГ ускоряло дальнейшие созревание нервно-мышечной системы. Восприимчивость нервно-мышечной системы к АКТГ/МСГ-пептидам исчезало, когда ее развитие завершалось [Strand et al., 19936].

Неонатальное введение АКТГ, его фрагментов и аналогов влияет также на состояние различных рецепторных систем. Были показаны изменения связывающих характеристик рецепторов кортикостероидов в гиппокампе у крыс [Nyakas et al., 1997]. Выявлено действие на рецепторы серотонина [Pransatelli, 1989]. Перинатальное воздействие, приводящее к повышению уровня АКТГ и кортикостероидов, обеспечивает значительные долговременные изменения функций центральных моноаминергических систем. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что неонатальное введение меланокортинов оказывает влияние на созревание системы биогенных аминов мозга, что приводит к изменению содержания и скорости обмена этих нейромедиаторов у взрослых животных [Alves et al., 1997; Nyakas et al., 1981; Strand et al., 1989]. Показано, что перинатальное воздействие стрессогенных факторов или агентов, вызывающих увеличение выброса АКТГ или кортикостероидов, могут вызывать значительные быстрые и долговременные изменения в центральной моноаминергической системе, что в дальнейшем может привести к нарушениям полового поведения у взрослых животных [Alves et al., 1997]. Результатом неонатальных инъекций АКТГ4.10 является повышение синтеза катехоламинов в большинстве групп катехоламинергических нейронов. Происходит повышение уровней дофамина, норадреналина и их метаболитов в гиппокампе и стволе мозга [Шилова и др., 1996]. Наблюдается также повышенная концентрация моноаминов в переднем мозге, что свидетельствует об ускоренном развитии этих структур у животных, подвергавшихся в неонатальном возрасте введению АКТГ. Наблюдаемые нейрохимические изменения моноаминергических систем в ранний постнатальный период приводит в дальнейшем к изменению функций гипоталамо-гипофизарной системы [Alves et al., 1997]. Обнаружено, что реакция катехоламинергических нейронов на неонатальное введение АКТГ является зависимой от генотипа. При сравнении эффектов введения пептида на разных линиях мышей, были выявлены различия как в количественном их выражении, так и в пространственном распределении в структурах мозга. Также существовали зависимые от генотипа различия в поведении [Шилова и др., 1998].

Показано долговременное нейропротекторное воздействие неонатального введения меланокортинов. Так, введение аналога АКТГ4.9 ORG 2766 в ранний постнатальный период оказывало благоприятное воздействие на выживаемость холинергических нейронов при цитотоксическом инсульте увзрослых животных [Horvath et al., 2000].

Исследования показали, что хроническое введение меланокортинов в течение первых 3 недель жизни крыс приводит к долговременным, отставленным изменениям поведения животных [Acker et al., 1985]. Так, у взрослых животных, получавших ежедневно инъекцию фрагмента АКТГ4.10 в раннем неонатальном периоде, отмечено улучшение выработки рефлекса пассивного избегания [Nyakas et al., 1981], показано также ускорение обучения в Т-образном лабиринте [Acker et al., 1985]. Что касается реакции активного избегания, влияния неонатального воздействия АКТГ и АКТГ4-10 на выработку рефлекса не обнаружено, однако, существует значимая разница во времени угасания навыков: у животных, получавших пептиды, навык сохраняется в течение более длительного времени [Nyakas et al., 1981].Отставленные изменения исследовательского поведения взрослых животных зависят от сроков неонатального введения меланокортинов - инъекции АКТГио в дозе 10 мкг/кг в течение 1-й недели жизни крысят не влияют, а в течение 2-й недели вызывают увеличение исследовательской активности крыс [Rose et al., 1998, Strand et al., 1989]. Однако, имеющиеся в литературе данные о влиянии неонатального введения АКТГ и АКТГ4.10 на ориентировочно-исследовательскую активность противоречивы. Некоторые исследователи не выявили значимого влияния на интенсивность исследовательской реакции [Nyakas et al., 1997]. Воздействие на развитие нервной системы оказывает также синтетический аналог АКТГ4.9 - ORG 2766. Введение этого пептида в 1-й, 3-й и 5-й дни постнатального развития приводило в дальнейшем к улучшению обучения крыс в возрасте 3 мес в водном лабиринте Мориса, а также к снижению длительности иммобилизации в тесте принудительного плавания [Felszeghy et al., 1993; Horvath et al., 1999].

Известно, что неонатальные стрессогенные воздействия вызывают долговременные отставленные изменения адаптивного поведения животных, такие как снижение исследовательской активности, увеличение уровня тревожности и ухудшение обучения [Huot et al., 2002; Nyakas et al., 1981; Penke et al., 2001]. Введение МК в ранний неонатальный период вызывает противоположные изменения. Было высказано предположение о том, что неонатальное введение меланокортинов компенсирует влияние на поведение неонатального стресса, вызванного экспериментальными процедурами. Вероятно, пептиды этого класса в ранний постнатальный период воздействуют на развитие и организацию мозговых структур и функциональных связей, вовлеченных в регуляцию адаптивного поведения [Nyakas et al., 1981].

Показано изменение сексуального поведения крыс, как самцов, так и самок в результате перинатального введения АКТГ [Alves et al., 1997]. Эти изменения коррелируют с изменениями в росте и метаболизме развивающихся серотонинергических и дофаминергических систем в гипоталамических ядрах, связанных с половым поведением. Показано, что самцы крыс, которые пренатально подвергались воздействия АКТГ1.24 (500 мкг/кг веса тела самки, 2 раза в день, в течение 3-ей недели пренатального развития), демонстрируют снижение полового поведения, что сопровождается у них повышенным содержанием серотонина в медиальной преоптической области [Strand et al., 1989]. Однако постнатальное введение этого пептида (с 1 по 14 день постнатального развития, 500 мкг/кг ежедневно), напротив, приводит к усилению полового поведения взрослых животных [Strand et al., 19936]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ответ развивающейся нервной системы на воздействие меланокортинов зависит от сроков введения этих пептидов.

Таким образом, в настоящее время накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о нейротрофическом влиянии меланокортинов на развивающуюся и регенерирующую нервно-мышечную систему. Использование коротких фрагментов АКТГ и их аналогов, лишенных гормональной активности, позволяет отделить эндокринные свойства гормонов от их нейротрофических эффектов. Структурно-функциональные исследования показали, что, как и в случае поведенческих эффектов, ответственной за нейротрофическую активность является N-концевая область молекулы АКТГ - фрагмент АКТГ4.10. Иммупохимические исследования показали наличие эндогенного фрагмента АКТГ4-10 в мозге взрослых животных только в волокнах аркуатного ядра и средней септалыюй области. В случае исследования мозга животных в ранний неонатальный период показано присутствие эндогенного АКТГ4.10 как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. У взрослых животных иммунореактивность к АКТГ4.10 отмечена после повреждения нервной системы -например, при повреждении черной субстанции этот пептид обнаружен в стриатуме и других регионах мозга. Основываясь на иммунохимической локализации фрагмента АКТГ4.10 можно предположить, что роль этого пептида в функционировании взрослого организма в норме незначительна, однако в период развития нервной системы и во время регенерации нервной ткани эндогенный фрагмент АКТГ4.10 образуется в мозге и является нейропротекторным и нейротрофическим фактором [Antonawich et al., 19936; 1994]. Дальнейшее исследование нейротропных и нейропротекторных эффектов меланокортинов имеют большое значение как для понимания регуляции процессов развития и регенерации нервной ткани, так и для создания лекарственных препаратов на основе регуляторных пептидов.

Действие меланокортинов на сердечно-сосудистую систему

Меланокортины способны регулировать деятельность сердечно-сосудистой системы. При этом направленность эффектов МК зависит от структуры и способа введения пептида. Внутривенное (в/в) введение у-МСГ вызывает прессорные эффекты, повышает церебральный кровоток и частоту сердечных сокращений (ЧСС) [Gruber, Callahan, 1989]. Внутрижелудочковое (в/ж) введение у-МСГ также вызывало длительное повышение артериального давления [Sun et al., 1992]. Показано, что кардиотропные эффекты у-МСГ не снимались введением блокатора МСЗ и МС4 рецепторов SHU9119 и, следовательно, не были связаны с рецепторами этого типа. Вероятно, действие у-МСГ на кардиоваскулярную систему опосредуется через центральный механизм, не связанный с известными видами МС рецепторов [Li et al., 1996]. Возможно, структуры, ответственные за кардиоэффекты у-МСГ, находятся в областях близких к третьему желудочку, поскольку повреждение этих областей приводит к снижению прессорных эффектов у-МСГ [Wikberg, 2000]. Существуют данные, свидетельствующие о связи кардиотропных эффектов у-МСГ с активацией симпатической системы в сосудах и сердце [Versteeg et al., 1998]. В пользу этой точки зрения говорят исследования влияния блокаторов адренорецепторов на кардиоваскулярные эффекты этого пептида. Показано, что предварительное введение антагониста pi-адренорецепторов, метопролола, уменьшает влияние у-МСГ на сердечный ритм, но не влияет на артериальное давление. Предварительное введение антагониста а 1-адренорецепторов, празоцина, напротив, снимало влияние у-МСГ на артериальное давление, но не на частоту сердечных сокращений. Таким образом, эффекты у-МСГ связаны с повышением симпатической активности, что в свою очередь приводит к увеличению активности а 1-адренорецепторов в сосудах и pi-адренорецепторов в сердце. Авторы также полагают, что действие у-МСГ может осуществляться и через центральную систему вазопрессина, поскольку внутрижелудочковое введение антагониста VIA рецепторов приводит к уменьшению эффектов у-МСГ на сердечно-сосудистую систему [Van Bergen et al., 1997]. АКЩ.ю при периферическом введении также оказывает прессорное действие, но его эффекты в 5-10 раз слабее, чем эффекты у-МСГ [Van Bergen et al., 1996]. Авторы полагают, что для вазопрессорного и тахикардического действия необходима последовательность His

Phe-Arg-Trp, расположенная близко к С-концевой области молекулы пептида [Van Bergen et al., 1995].

В отличие от у-МСГ, внутривенное введение АКТГ 1.24 вызывает понижение артериального давления, что сопровождается рефлекторной тахикардией [Van Bergen et al., 1998; Versteeg et al., 1998]. Показано, что этот эффект не связан с надпочечниками. Авторы предполагают, что депрессорный эффект АКТГ может быть связан с активацией МС2 рецепторов в периферических сосудах [Versteeg et al., 1998]. а-МСГ и АКТГi-i7 при периферическом введении не оказывают влияния на сердечно-сосудистую систему. Однако центральное введение а-МСГ и АКТГ вызывало выраженный гемодинамический эффект. В/ж введение этих пептидов приводило к увеличению артериального давления, которое сопровождалось возрастанием активности симпатической нервной системы. Этот эффект блокировался внутрижелудочковым введением агути-протеина, антагониста МС рецепторов [Dunbar, Lu, 2000]. Введение а-МСГ в область дорзовагального комплекса, который включает в себя ядра солитарного тракта и дорзальное двигательное ядро блуждающего нерва, вызывало брадикардию и снижение давления. В дорзовагальном комплексе находятся первые синапсы барорецепторного рефлекса и там же заканчиваются отростки ПОМК-содержащих нейронов, локализованных в аркуатном ядре [Strand, 1999]. В этом регионе отмечена высокое содержание МС4 рецепторов. Брадикардический эффект а-МСГ снимался блокатором этих рецепторов. Также показано, что стимуляция ПОМК нейронов аркуатного ядра вызывает депрессорный эффект. Перечисленные данные свидетельствуют об участии эндогенной МК системы в регуляции сердечно-сосудистой системы и, возможно, в контроле барорецепторного рефлекса [Adan, Gispen, 1997]. При этом эффекты а-МСГ и АКТГ на кардиоваскулярную систему, в отличие от у-МСГ, опосредуются МС рецепторами (возможно MC4R) [Wikberg et al., 2000]. Таким образом, показано существование, по меньшей мере, двух центральных механизмов кардиоваскулярных эффектов МК. Первый включает в себя МС4 рецепторы в дорзовагальном комплексе, второй - не идентифицированные рецепторы МК, которые преимущественно связываются с у-МСГ [Li et al., 1996].

Многочисленные исследования показали положительное влияние а-МСГ и некоторых фрагментов АКТГ (АКТГ1-24, АКТГы6 и АКТГ4.10) при экспериментальном геморрагическом шоке. Введение этих пептидов нормализует сердечный выброс и другие параметры сердечно-сосудистой системы, что приводит к увеличению времени жизни животного после острой кровопотери [Wikberg, 2001]. Восстановление гемодинамических параметров после в/в введения а-МСГ и АКТГ также наблюдалось при длительной экспериментальной остановке дыхания, что приводило к увеличению выживаемости животных [Guarini et al., 1997]. Изучение механизмов, лежащих в основе противошоковых эффектов МК, позволило заключить, что в условиях нарушения циркуляторного гомеостаза эти пептиды ингибируют сверхпродукцию фактора некроза опухоли-а (TNF-а) и оксида азота. Было показано, что при кровопотере у крыс сильно повышается уровень TNF-a в крови (в норме TNF-a в крови отсутствует). Кроме того, введение АКТГ и a-МСГ активирует или восстанавливает сложный вазомоторный рефлекс, который приводит к мобилизации крови из периферических депо. Этот рефлекс, вероятно, подавляется массированным выбросом эндогенных опиоидов, который наблюдается в условиях такой патологии. Опиоиды ингибируют освобождение норадреналина из симпатических терминалей, в то время как МК оказывают противоположное действие [Guarini et al., 1999]. Введение блокатора МС4 рецепторов полностью ингибировало противошоковые эффекты АКТГ1.24 в модели геморрагического шока. Этот эффект наблюдался как при в/в, так и при в/ж введении блокатора. у-МСГ, который характеризуется низкой аффинностью к MC4R, не эффективен при геморрагическом шоке. Следовательно, в реализации противошоковых эффектов МК вовлечены центральные МС4 рецепторы [Wikberg et al., 2000].

Показано, что МК оказывают протекторное действие на модели ишемии сердца. АКТГ и а-МСГ уменьшают последствия кратковременной коронарной ишемии и постоянной коронарной акклюзии. В/в введение АКТГ1.24 уменьшало выраженность аритмии и фибрилляции желудочков, снижало летальность. При в/ж введении пептид был также эффективен, что указывает на центральные механизмы протекторных эффектов МК при ишемии сердца [Catania et al., 2004].

Влияние меланокортинов на болевую чувствительность

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что меланокортины играют важную роль в процессах восприятия боли. Однако сведения о влиянии АКТГ и МСГ на болевую чувствительность достаточно противоречивы. Исследование действия этих гормонов на болевую чувствительность животных показали, что эффекты пептидов этого класса зависят от структуры, способа введения и дозы пептида. В ряде исследований было показано повышение болевого порога при системном введении АКТГ человеку [Kshatri, Foster, 1997] и животным [Li et al., 1990]. Исследование влияния внутрибрюшинного введения АКТГ на болевую чувствительность крыс в тесте "отдергивания хвоста" показало, что инъекция пептида в дозе 250 мкг/кг приводит к понижению болевой чувствительности, однако введение низких доз АКТГ (30-60 мкг/кг) вызывало гиперальгезию [Takeshige et al., 1991]. В других работах не было выявлено влияния АКТГ на болевую чувствительность при системном введении [Gispen et al., 1976]. При внутримозговом введении направленность воздействия меланокортинов на болевую чувствительность зависит от места введения пептида. Показано, что введение АКТГ в область околоводопроводного серого вещества (ОВС) вызывает повышение болевого порога [Li et al., 1990]. Предварительное введение блокатора опиоидных рецепторов - налоксона не предотвращает снижения болевой чувствительности, вызванного введением АКТГ в ОСВ. Анальгетические эффекты также наблюдаются после введения в эту область а-МСГ [Walker et al., 1980]. Микроинъекции АКТГ в дозах 0.2-1 мкг/кг в заднее аркуатное ядро гипоталамуса также вызывает анальгезию [Takeshige et al., 1991]. Однако в некоторых работах не показано изменение болевой чувствительности после введения АКТГ в ОСВ [Jacquet, Wolf, 1981]. Противоречия между результатами различных исследований можно, отчасти, объяснить различиями в дозе введенного АКТГ. Это предположение находит свое подтверждение в работе, выполненной на мышах [Amir, 1981], в которой показано, что при введении различных доз АКТГ могут наблюдаться различные типы болевой реакции (гипо- и гиперальгезия).

Введение АКТГ1.24 в дозе 5-10 мкг в боковые желудочки мозга вызывает гиперальгезию у крыс в тестах "отдергивания хвоста" и "горячая пластина". Предварительное введение морфина снижает, а налоксона потенциирует этот эффект [Bertolini et al., 1979; Fratta, et al., 1981]. При в/ж инъекции АКТГ в дозе 1 мкг изменения болевого порога в тесте "отдергивания хвоста" зарегистрировано не было [Smock, Field, 1981]. Гиперальгетический эффект наблюдался в случае в/ж введения АКТГ кроликам в дозах 0.5 и 1 мкг [Williams et al., 1986]. Гиперальгетические эффекты также наблюдались при в/ж введении а-МСГ в дозах от 0.1 до 10 мкг в тесте "отдергивания хвоста". Снижение болевого порога наблюдалось через 20 мин после введения препарата и продолжалось в течение часа [Sandman, Kastin, 1981]. Однако при исследовании влияния в/ж инъекции а-МСГ на болевую чувствительность животных в тесте "горячая пластина" было показано, что введение пептида в дозах 0.1, 1 и 10 мкг оказывает анальгетическое действие [Ohkubo et al., 1985]. Снижение болевой чувствительности в тесте "горячая пластина" зарегистрировано также при в/ж введении фрагментов АКТГ1.9, АКТГ5.9 и АКТГ7-9 в дозах 100-150 мкг [Genedani et al., 1978].

Изучение влияния интрацистернального введения а- и у-МСГ на болевую чувствительность мышей в тесте "отдергивания хвоста" показало, что инъекция у2

МСГ вызывает выраженную анальгезию, yl-МСГ оказывает незначительный анальгетический эффект, в то время как введение а-МСГ вызывает гиперальгезию. Предварительное введение налоксона или блокатора МСЗ/МС4 рецепторов не влияло на анальгетические эффекты у2-МСГ, однако эти эффекты блокировались предварительным введением антагониста ГАМК-ергических рецепторов бикукулина [Klusaet al., 2001].

Изучение механизмов анальгетических эффектов МК показало, что повышение болевого порога, вызванное в/б введением АКТГ, сопровождается увеличением содержания серотонина в гиппокампе и гипоталамусе, а также возрастанием уровня норадреналина в гиппокампе. Разрушение ОСВ предотвращало анальгетическое действие АКТГ и снимало его влияние на содержание серотонина, но не норадреналина. При непосредственном введении в ОСВ АКТГ вызывал снижение болевой чувствительности и увеличение содержания серотонина, но не влиял на норадреналин. Анальгетические эффекты АКТГ не снимались налоксоном. На основании полученных результатов авторами сделано заключении об участии серотонинергической системы мозга в реализации анальгетических эффектов МК [Li et al., 1990].

Проводилось исследование анальгетической активности аналога АКТГ4.9 - ORG 2766. Было показано, что введение этого пептида в ОСВ вызывает дозозависимые анальгетические эффекты в тесте "отдергивания хвоста". При этом эффективные дозы (3-30 мкг) ORG 2766 были сопоставимы с дозами морфина при внутрижелудочковом введении. Предварительное введение налоксона не препятствовало анальгетическим эффектам ORG 2766. Внутрижелудочковое введение пептида не оказывало влияния на болевую чувствительность животных. В экспериментах in vitro ORG 2766 в больших концентрациях не влиял на взаимодействие налоксона с опиоидными рецепторами мозга [Walker et al., 1981]. Авторы работы делают выводы о неопиоидной природе анальгетических эффектов ORG 2766.

Таким образом, в зависимости от способа введения, дозы и структуры меланокортинов может наблюдаться как снижение, так и повышение болевой чувствительности. На уровне ОСВ меланокортины и опиоиды однонаправлено влияют на болевую чувствительность, при этом их эффекты опосредуются различными рецепторными механизмами [Walker et al., 1981]. Проведенные исследования позволили сделать заключение о неопиоидной природе анальгетических эффектов меланокортинов, вероятно, эти эффекты опосредуются серотонинергической системой мозга [Walker et al., 1981: Li et al., 1990]. Гиперальгетическое действие этих пептидов, вероятно, опосредуется опиоидной системой организма [Fratta, et al., 1981; Starowicz, Przewlocka, 2003].

Взаимодействие меланокортинов с опиоидной системой.

Большой интерес исследователей вызывает вопрос о возможном взаимодействии меланокортинов с опиоидной системой мозга. В пользу такого взаимодействия может свидетельствовать то, что а-МСГ и p-эндорфин образуются из одного предшественника (ПОМК), хранятся в одних и тех же синаптических визикулах, одновременно выделяются в ответ на стрессорное воздействие [Adan, Gispen, 2000]. Эти пептиды также взаимодействуют на рецепторном уровне. Показано, что АКТГ и его N-концевые фрагменты обладают сродством к опиоидным рецепторам in vitro [Gispen et al., 1976]. В гомогенате мозга АКТГ вытесняет 3Н-дигидроморфин и налоксон из участков связывания [Terenius et al., 1975]. АКТГ1.24 является конкурентным ингибитором опиоидных рецепторов и дозозависимо вытесняет из рецепторов Р-эндорфин [Hendrie, 1988].

Исследование взаимодействия меланокортинов и опиоидов in vivo позволили высказать предположение о том, что эти пептиды являются антагонистами в ЦНС. Известно, что p-эндорфин вызывает выраженную анальгезию, каталепсию и ингибирует половое поведение животных. Все эти эффекты блокируются налоксоном. АКТГ во многих тестах оказывает действие, противоположное p-эндорфину, -вызывает гиперальгезию при центральном введении, стимулирует половое поведение, ингибирует стериотипическое поведение мышей, вызванное введением морфина. При этом налоксон ингибирует интенсивный груминг, вызванный введением МК [Fratta et al., 1981; Adan, Gispen, 1997]. Кроме того, было показано, что при одновременном внутрижелудочковом (в/ж) введении АКТГ1-24 и P-эндорфина в дозах 10 мкг наблюдается взаимное подавление эффектов пептидов на болевую чувствительность [Fratta et al., 1981]. При совместном в/ж введении АКТГ1.24 (1мкг) и морфина (15мкг) анальгетические эффекты морфина также блокируются [Smock, Fields, 1981]. В/ж введение а-МСГ за 15 мин до инъекции морфина ослабляло анальгезию, вызванную морфином, при этом эффективные концентрации а-МСГ были ниже, чем необходимые для развития гиперальгезии [Contreras, Takemori, 1984]. Исследование зависимости структура-активность в ряду фрагментов АКТГ показали, что фрагменты гормона, обладающие сродством к опиоидным рецепторам, ингибируют анальгезию, вызванную морфином [Gispen et al., 1976]. Изучение антагонизма между морфином и различными фрагментами АКТГ показало, что АКТГ1-9 полностью устраняет анальгезию, вызванную морфином, АКТГ5.9 - частично, а АКТГ7.9 практически не действует [Genedani et al., 1978]. Изучение механизмов антиопиоидных эффектов АКТГ-подобных пептидов показало, что меланокортины блокируют спинальную анальгезию, вызванную активацией мю и дельта, но не каппа-опиоидных рецепторов [Fang, 1995]. Рядом авторов было высказано предположение о том, что АКТГ1.24 или его фрагменты действуют на морфиновые рецепторы в спинном мозге как опиоидные антагонисты [Jacquet, 1982]. Однако, по мнению других исследователей, антиопиоидные эффекты меланокортинов опосредуются не через опиоидные рецепторы [Contreras, Takemori, 1984]. Предполагают, что механизм антиопиоидных эффектов АКТГ связан со способностью пептида модулировать вызванное опиоидами снижение внутриклеточного содержания цАМФ и подавление кальциевого входа [Fang, 1995].

Повреждения или дисфункция нервной системы приводят к развитию невропатической боли. Это может быть результатом повреждения периферических нервов, ганглиев дорзальных рогов или спинного мозга. В случае невропатической боли наблюдается повышение реакции на болевые стимулы низкой интенсивности и болевая реакция на неноцицептивные раздражители (аллодиния). При невропатической боли применение опиоидных анальгетиков недостаточно эффективно [Starowicz, Przewlocka, 2003].

В настоящее время показана экспрессия меланокортиновых рецепторов, а именно MC4R, в спинном мозге. Большинство этих рецепторов локализовано в задних рогах спинного мозга и сером веществе, окружающем центральный канал, т. е. отделах, вовлеченных в передачу болевого сигнала [Adan, Gispen, 2000]. Сведения об экспрессии ПОМК мРНК в спинном мозге противоречивы. По некоторым данным, иммунореактивность к ПОМК мРНК отмечена в этой области [Adan, Gispen, 1997]. Но более вероятным его источником являются нисходящие пути из ядер солитарного тракта. Показано присутствие ПОМК-производных пептидов (АКТГ, а-МСГ и [3-эндорфина) в дорзальных рогах спинного мозга. Все эти данные свидетельствуют о наличие функциональной МК системы в спинном мозге [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Экспрессия МК и опиоидных пептидов, а также их рецепторов в дорзальных рогах спинного мозга и в сером веществе, окружающем центральный канал, предполагает взаимодействие этих систем и роль МК в процессах ноцицепции. В настоящее время накоплено много экспериментальных данных, подтверждающих это предположение. Так показано, что содержание MC4R в спинном мозге увеличивается у животных в моделях невропатической боли. Введение антагониста MC4R SHU9119 снижало аллодинию, связанную с невропатической болью, что свидетельствует о тоническом влиянии МК системы на передачу болевой информации в случае невропатической боли. При этом в норме антагонисты MC4R не влияют на болевую чувствительность [Vrinten et al., 2000]. Вероятно, ослабление аллодинии под действием антагониста MC4R происходит за счет блокады тонического влияния эндогенной МК системы на поток ноцицептивной информации [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Известно, что а-МСГ и p-эндорфин хранятся в одних визикулах и выброс а-МСГ сопровождается выбросом P-эндорфина в одних и тех же участках. При взаимодействии с рецепторами опиоиды тормозят действие аденилатциклазы (АЦ), а меланокортины, наоборот, стимулируют ее работу. Локализованные на одних клетках рецепторы могут влиять на АЦ разнонаправлено. Активность МК и опиоидной систем интегрируется на уровне одной клетки за счет ко-экспрессии опиоидных и МС рецепторов на ее поверхности [Adan, Gispen, 1997]. В нейронах, получающих информацию через опиоидные и МС рецепторы, АЦ может воспринимать сигналы от двух систем, которые конкурируют друг с другом. При этом в случае невропатической боли блокада МС рецепторов может ослаблять тоническое влияние эндогенных МК на ноцицепцию, позволяя развиваться анальгетическому действию P-эндорфина, что способствует снижению аллодинии [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Таким образом, МК и опиоидная системы, взаимодействуя на уровне спинного мозга, способны модулировать восприятие боли (рис. 5). Представленные данные также свидетельствуют о возможности применения антагонистов MC4R в терапии невропатической боли.

Рис. 5. Регуляция болевой чувствительности в спинном мозге меланокортиновой и опиоидной системами [Adan, Gispen, 2000].

Другим примером взаимодействия меланокортиновой и опиоидной систем является влияние МК на развитие толерантности к опиоидам и опиоидной зависимости. Показано, что введение а-МСГ ингибирует развитие толерантности к морфину и морфиновой зависимости [Starowicz, Przewlocka, 2003]. МК снижают потребление героина в опытах с самовведением на крысах. Такой эффект оказывают у2-МСГ, DPhe7-АКТГ4.10 и большие дозы аналога ORG 2766, в то время как АКТГ1.24 и АКТГ4.10 были не эффективны [Van Ree, 1983]. Введение МК вызывало симптомы, сходные с синдромом отмены, у морфин-зависимых животных [Bertolini et al., 1981]. Хроническое ведение морфина приводило к снижению уровня MC4R в стриатуме и ОСВ, регионах, вовлеченных в развитие опиоидной зависимости и синдрома отмены, что служит доказательством участия этого рецептора в долговременных эффектах опиоидных пептидов [Alvaro et al., 1996; 2003]. Анатомические связи между МК и опиоидной системами в ОСВ могут быть основой для влияния а-МСГ на развитие опиоидной зависимости [Adan, Gispen, 2000].

Существует гипотеза о том, что меланокортиновая и опиоидная системы вместе составляют сложную сбалансированную конструкцию. На основании этой гипотезы предложены механизмы развития толерантности и влияния МК на этот процесс. Эндогенные МК и опиоиды выбрасываются ПОМК-экспрессирующими нейронами и постсинаптическая мишень взаимодействует с этими пептидами одновременно. В случае длительного воздействия экзогенных опиоидов баланс нарушается. На клетку действуют высокие нефизиологические концентрации опиоидов. Это может вызывать компенсаторный сдвиг процессинга ПОМК в сторону увеличения продукции МК или активацию процесса ацетилирования, т. к. показано, что N-ацетилирование увеличивает меланотропную и поведенческую активность а-МСГ и снижает опиоидную активность Р-эндорфина [Smith, Funder, 1988]. На таком фоне для достижения анальгетического эффекта необходимы большие дозы опиоидов. В пользу предложенной гипотезы свидетельствует то, что у морфин-зависимых животных повышена иммунореактивность к АКТГ и а-МСГ в гипоталамусе [Vergoni et al., 1989].

Необходимы дальнейшие исследования взаимодействия меланокортиновой и опиоидной систем с целью выяснения механизмов развития наркотической зависимости и возможной разработки методов ее лечения.

Влияние меланокортинов на иммунную систему

Воспаление является необходимой для выживания организма защитной реакцией на внешнее повреждающее воздействие. Но если воспалительный процесс слишком длительный и интенсивный, то он может приводить к тяжелым нарушениям функционирования организма. Поэтому изучение механизмов воспаления и разработка методов модуляции этого процесса являются важной задачей современной биологии и медицины. Многочисленные данные свидетельствуют о важной роли меланокортинов в регуляции процесса воспаления. Введение МК, в частности а-МСГ и АКТГ].24, подавляет воспаление, снижает жар, ослабляет развитие кожной гиперчувствительности, вызванные введением провоспалительных агентов [Glyn, Lipton, 1981; Daynes et al., 1987; Rheins et al., 1989]. Показано, что а-МСГ ослабляет воспалительные процессы при болезнях кишечника, артритах, воспалениях мозга, ишемии мозга и дерматитах [Rajora et al., 1997а, б; Ceriani et al., 1994; Chiao et al., 1996; 1997]. МК показали свою эффективность в различных моделях как острого, так и хронического воспаления [Luger et al., 1998].

Наблюдающийся при воспалении подъем температуры является результатом сдвига баланса между пирогенными и криогенными цитокинами и гормонами. Хотя подъем температуры это часть защитной реакции организма, необходимо, чтобы уровень температуры был не слишком высоким. Эндогенные соединения, вызывающие повышение температуры (пирогены), включают в себя интерлейкины IL-1, IL-2 и IL-6. Существуют различные эндогенные антипиретики, ограничивающие подъем температуры. К ним относятся IL-10, аргининвазопрессин, а-МСГ и глюкокортикоиды. Самым мощным эндогенным антипиретиком является а-МСГ [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Этот гормон ингибирует жар, вызванный эндотоксином и цитокинами. При системном введении а-МСГ в 20000 раз более эффективно снижает температуру (в молярном отношении), чем ацетаминофен. Жаропонижающее действие а-МСГ наблюдается как при центральном, таки при периферическом введении, при этом внутримозговое введение в 100 раз эффективнее, что свидетельствует о центральных механизмах этого эффекта [Catania, Lipton, 1998]. Антиперитическое действие сохраняет С-концевой фрагмент а-МСГ - трипептид Lys-Pro-Val. Этот пептид менее эффективен, чем целый гормон, но также снижает температуру при центральном и периферическом введении. N-концевые и центральные фрагменты гормона не оказывают жаропонижающего действия [Catania, Lipton, 1993]. При возрастании температуры, вызванном воспалением, наблюдается 2-3-кратное увеличение содержания а-МСГ в области перегородки мозга, в других регионах мозга содержание а-МСГ не изменялось. Не отмечалось также увеличения уровня а-МСГ в мозге животных, подвергнутых воздействию высокой температуры окружающей среды. Это свидетельствует о специфичности увеличения содержания а-МСГ в области перегородки при воспалительной реакции [Catania, Lipton, 1993]. Внутрижелудочковое введение блокатора МСЗ/4 рецепторов SHU9119 приводит к увеличению жара, вызванного инъекцией эндотоксина или бактериального липополисахарида (ЛПС), в то время как периферическое введение этого блокатора не эффективно [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Предварительное в/ж введение SHU9119 блокирует антиперитические эффекты как центрального, так и периферического введения а-МСГ. В/ж введение антител к а-МСГ приводит к усилению и пролонгированию гипертермии, вызванной воспалением. Все эти данные свидетельствуют о важной роли центральной эндогенной МК системы в регуляции температуры тела [Tatro, Sinha, 2003]. При этом следует подчеркнуть, что а-МСГ оказывает антипиретическое, а не креогенное действие, т.к. не влияет на температуру тела в норме. Эндогенные центральные МК оказывают жаропонижающее действие, активируя MCR, локализованные в мозге, при этом антипиретический эффект МК не контролируется надпочечниками, т.к. после адреналэктомиии жаропонижающее действие а-МСГ сохраняется [Catania, Lipton, 1993; Huang et al., 1997]. Ингибирование жаропонижающего действия а-МСГ предварительным введением SHU9119, а также локализация MC3R и MC4R в регионах мозга, связанных с терморегуляцией, указывают на возможную роль этих рецепторов в реализации гипотермических эффектов гормона. Однако показано, что у мышей, нокаутных по генам MC3R или MC4R, не изменяется гипертермическая реакция на введение ЛПС. Кроме того, С-концевой фрагмент а-МСГ, обладающий жаропонижающим действием, не связывается с этими рецепторами. Таким образом, существующие в настоящее время данные не позволяют сделать окончательного заключения о механизмах антипиретических эффектов МК [Starowicz, Przewlocka, 2003; Tatro, Sinha, 2003].

Меланокортины обладают выраженным противовоспалительным действием. Показано, что а-МСГ ингибирует воспалительный ответ, вызванный введением бактериальных липополисахаридов, интерферона, IL-1 [Wikberg, 1999]. Противовоспалительное действие МК осуществляется за счет ингибирования продукции медиаторов воспаления, стимуляции выброса эндогенных противовоспалительных агентов и снижением миграции иммунных клеток к очагу воспаления [Lipton et al., 2000]. Под действием МК снижается продукция провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-2, IL-6, а также фактора некроза опухоли TNFa и у-интерферона (y-IFN). Кроме того, a-МСГ подавляет продукцию оксида азота (NO), вызванную воспалением, ингибируя экспрессию индуцибельной NO-синтазы [Luger et al., 1997; Lipton et al., 1998; Starowicz, Przewlocka, 2003]. MK стимулируют синтез противовоспалительных цитокинов - IL-8 и IL-10 [Lunder et al., 1997]. Показано, что а-МСГ подавляет хемотаксис нейтрофилов. Снижение миграции нейтрофилов приводит к ослаблению воспалительной реакции [Starowicz, Przewlocka,

2003].

Как указывалось выше, меланокортины снижают продукцию целого ряда провоспалительных агентов (II-1, IL-6, TNFa, NO и др.). Влияние МК на различные провоспалительные факторы связано с его ингибирующим действием на фактор NF-kB (nuclear factor kB). NF-kB является транскрипционным фактором, который участвует в активации иммунной системы [Manna, Aggarwal, 1998; Gantz, Fong, 2003]. NF-kB индуцирует транскрипцию многих соединений, участвующих в воспалительном процессе - цитокинов, хемокинов, индуцируемой NO-синтазы и др. [Catania et al.,

2004]. Активацию NF-kB вызывают многие воздействия, такие как бактериальные и вирусные инфекции, оксидантный стресс, ЛПС и др. а-МСГ действует как общий ингибитор NF-kB активации и таким образом оказывает противовоспалительное действие [Starowicz, Przewlocka, 2003].

Меланокортины оказывают противовоспалительное действие как при периферическом, так и при центральном введении. При этом МК, введенные в мозг, способны ингибировать периферическое воспаление. Так показано, что а-МСГ и его С-концевой фрагмент а-МСГц.п при в/ж введении подавляют кожное воспаление [Starowicz, Przewlocka, 2003]. а-МСГ при в/ж введении также способен модулировать возрастание уровня TNFa и NO в легких и печени, вызванное введением ЛПС. Центральное введение антител к a-МСГ приводит к увеличению содержания этих маркеров воспаления [Lipton et al., 2000]. Эти данные свидетельствуют об участии а-МСГ мозга в контроле системного воспаления.

В ЦНС меланокортины ингибируют выброс провоспалительных агентов. Например, показано, что в/м введение а-МСГ подавляет возрастание уровня TNFa в мозге, вызванное воспалением. Быстрое развитие эффектов свидетельствует о влиянии пептида на клетки мозга (астроциты, нейроглию) [Wong et al., 1997]. Способность а-МСГ подавлять продукцию TNFa клетками мозга вызывает большой интерес исследователей, т.к. многие заболевания ЦНС сопровождаются увеличением содержания этого фактора (множественный склероз, болезнь Альцгеймера, менингит, а также острые заболевания, связанные с ишемией мозга и травмой) [Rajora et al., 1997а].

На периферии МК воздействуют на иммунные клетки, клетки крови, а также другие типы клеток - эндотелиальные и эпителиальные. Пептиды этого класса секретируются клетками, участвующими в иммунном ответе, и действуют как паракринные и эндокринные факторы [Gantz, Fong, 2003]. Макрофаги и моноциты обладают аутокринным механизмом для модуляции выброса TNFa. Этот механизм включает в себя a-МСГ (а, возможно, и другие МК) и меланокортиновые рецепторы. Макрофаги человека экспрессируют MC1R, MC3R и MC5R. Вероятно, что один или более из этих рецепторов участвует в регуляции продукции TNFa. Показано также, что макрофаги синтезируют a-МСГ в норме, и продукция этого пептида резко возрастает при воспалении [Taherzaden et al., 1999]. В моноцитах и макрофагах а-МСГ ингибирует продукцию и снижает активность иммунорегуляторных и провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины IL-1 и IL-2, и у-интерферон, при этом усиливает продукцию факторов, подавляющих воспаление, таких как IL-10. В макрофагах, кроме того, а-МСГ подавляет продукцию N0, связанную с воспалением, ингибируя экспрессию индуцибельной NO-синтазы [Star et al., 1995]. Важным периферическим источником, а также органом-мишенью МК является кожа. ПОМК-пептиды экспрессируются во многих клетках кожи - меланоцитах, кератиноцитах, фибробластах, кожных моноцитах, макрофагах и нейтрофилах. Показано, что образование МК в коже увеличивается при травме, инфекциях и воздействии УФ. Все это указывает на необходимость периферической МК системы для модуляции иммунного ответа [Starowicz, Przewlocka, 2003; Catania et al., 2004].

Таким образом, противовоспалительные эффекты МК могут быть разделены на три категории: 1) прямое действие на периферические клетки (моноциты, макрофаги и др.); 2) действие на глиальные клетки; 3) нисходящее противовоспалительное влияние центральных МК (рис. 6). Действие МК на циркулирующие и тканевые иммунные клетки прямо модулирует продукцию медиаторов воспаления, возможно, на уровне транскрипции. На иммунные клетки ЦНС меланокортины, вероятно, оказывают аналогичное действие. Нисходящий нейрогенный противовоспалительный ответ на центральные МК более сложен и недостаточно изучен [Lipton et al.,. 2000]. Существует предположение, что такое влияние осуществляется по пути, аналогичному механизму нисходящего антиноцицептивного контроля. Согласно этому предположению, МК активируют нисходящий путь, включающий в себя спинной мозг, ганглии дорзальных корешков и симпатическую нервную систему. Включение такого механизма приводит к уменьшению нейрогенного аспекта воспаления, возможно, за счет подавления выброса гистамина и субстанции Р [Catania et al., 2004]. В пользу данной модели

Меланокортины ингибируют воспаление в периферических органах и ЦНС головной мозг снижение продукции провоспалительных цитокинов и N0 (глиальные клетки) периферические клетки моноциты, нейтрофилы) i

Рис. 6. Противовоспалительные эффекты меланокортинов [Lipton et al., 2000]. свидетельствует то, что перерезка спинного мозга блокирует периферические противовоспалительные эффекты центрального а-МСГ. Кроме того, периферическое (но не центральное) введение Рг-адреноблокаторов также препятствует противовоспалительному действию центральных МК [Ichiyama et al., 1999а, б]. Блокада холинергических, а-адренергических и Pi-адренергических путей не влияла на противовоспалительные эффекты центрального а-МСГ [Lipton et al.,. 2000; Catania et al., 2004].

Воспалительная реакция, жар, анорексия и снижение физической активности -классические черты общего ответа организма при бактериальных и вирусных инфекциях и хронических воспалительных заболеваниях. Все эти симптомы опосредуются провоспалительными цитокинами. Как уже указывалось выше, МК подавляют воспалительную реакцию и снижают жар. Однако исследование их влияния на другие аспекты воспалительного ответа организма показало, что введение МК усиливает уменьшение потребления пищи и снижение физической активности, вызванные воспалением. Таким образом, эндогенные и экзогенные МК, действуя через центральные механизмы, разнонаправлено влияют на различные аспекты острой фазы воспалительного ответа. Пептиды этого класса подавляют воспалительную реакцию и жар, но усиливают анорексию и гиподинамию [Huang et al., 1999].

До настоящего времени не выяснен вопрос о том, какими рецепторами опосредуются противовоспалительные эффекты МК. Показано, что MC1R экспрессируется в различных типах клеток, вовлеченных в иммунный ответ, таких как макрофаги, моноциты, нейтрофилы, астроциты и др. Более того, экспрессия этого рецептора резко возрастает в процессе воспаления [Bhardwaj et al, 1997]. Для изучения механизмов действия меланокортинов на иммунную систему были исследованы эффекты селективных агонистов МС1 рецепторов: MS05 и MS09. Оба этих вещества понижали сосудистую и клеточную адгезию и ингибировали nuclear factor-kB (NF-kB) эндотелиальных клеток точно так же, как и а-МСГ [Brzoka et al., 1999]. Ha основании этого можно сделать вывод, что именно МС1 рецепторы опосредуют эффекты меланокортинов на клетки иммунной системы [Lipton et al., 1998]. Однако это утверждение нельзя считать полностью верным. Опыты, проведенные на мышах с генетически дефективными МС1 рецепторами, показали, что введение а-МСГ так же, как и МСГц-13, способно предупреждать активацию NF-kB при воспалительном процессе [Ichiyama et al., 1999а]. Следовательно, помимо MC1R, другие рецепторы вовлечены в реализацию противовоспалительных эффектов МК. Показана экспрессия MC3R в перитонеальных макрофагах. Введение эндогенного лиганда этого рецептора у-МСГ оказывало положительное влияния на модели перитонита. Инъекция блокатора MC3/4R препятствовало противовоспалительным эффектам у-МСГ, при этом селективный антагонист MC4R был не эффективен [Starowicz, Przewlocka, 2003]. Кроме того, системное введение АКТГ4.10, а также а- и Р-МСГ, подавляло аккумуляцию макрофагов при остром воспалении и ингибировало их фагоцитарную активность. Введение антагониста MC3/4R препятствовало этим эффектам [Getting et al., 1999]. Перечисленные данные свидетельствуют об участии MC3R, локализованного на макрофагах, в противовоспалительном действии МК. Показана экспрессия MC5R в моноцитах человека, лимфоцитах и моноцитах крысы и мыши [Buggy et al., 1998; Starowicz, Przewlocka, 2003]. Экспрессия MC1R и MC5R продемонстрирована в тучных клетках человека [Artuc et al., 1999]. На основании сказанного можно заключить, что разные типы МС рецепторов необходимы для реализации противовоспалительных эффектов МК в разных тканях в разных физиологических и патологических условиях. Не ясным остается вопрос о механизмах противовоспалительных эффектов С-концевого фрагмента а-МСГ. Показано, что этот трипептид сохраняет эффекты целой молекулы, хотя его активность менее выражена. Однако этот пептид не связывается ни с одним из известных MCR. Следовательно, действие МСГ-пептидов на иммунную систему может осуществляться как через классические МС рецепторы, так и минуя их [Starowicz, Przewlocka, 2003; Catania et al., 2004].

Выраженное противовоспалительное действие МК, в частности а-МСГ, в сумме с их низкой токсичностью открывают возможности для использования пептидов этого класса при лечении воспалительных и нейродегенеративных заболеваний. Многие заболевания ЦНС связаны с увеличением продукции провоспалительных цитокинов клетками мозга (множественный склероз, болезнь Альцгеймера и др. патологии). МК, способные проникать в мозг и снижать продукцию медиаторов воспаления, могут быть использованы при лечении таких заболеваний. Исследование противовоспалительной и терморегуляторной роли МК системы может привести к развитию новой фармакологической стратегии, основанной на селективных агонистах MCR, для лечения различных заболеваний, включающих воспалительный компонент [Tatro, Sinha, 2003; Starowicz, Przewlocka, 2003; Catania et al., 2004].

Влияние меланокортинов на пищевое поведение и вес тела

У млекопитающих в норме запасы энергии сохраняются практически на одном уровне, несмотря на большие колебания в доступности пищи и физической активности [Raffin-Sanson, 2003]. Потребление пищи и уровень метаболизма модулируются сложной сетью физиологических регуляторных путей, которые включают в себя как центральный, так и периферический уровни. В ЦНС в регуляцию пищевого поведения вовлечены такие факторы как нейропептид Y (NPY), орексигены, КРФ, и др. Образующиеся в периферических тканях лептин и инсулин также являются важными медиаторами, влияющими на потребление пищи. Все эти системы контролируют количество потребляемой пищи и уровень метаболизма и, таким образом, влияют на вес тела, жировую массу и скорость роста [Wikberg, 1999]. Одна из цепей этой тонкой регуляторной сети начинается лептином. Показано, что увеличение содержания лептина в физиологических границах вызывает анорексию и снижение веса тела [Marks, Cone, 2001]. Периферический гормон лептин, секретируемый адипоцитами, сигнализирует об увеличении массы жировой ткани, взаимодействуя с рецепторами в гипоталамусе [Krude, Gruters, 2000]. Активация рецепторов лептина включает нейроэндокринный ответ, в котором участвуют нейропептиды, модулирующие аппетит и накопление энергии. Среди них центральные меланокортины являются важнейшими медиаторами лептинового контроля энергетического гомеостаза [Raffin-Sanson, 2003]. Показано, что 40% ПОМК-содержащих нейронов аркуатного ядра гипоталамуса экспрессируют мРНК рецептора лептина [Yeo et al., 2000]. Лептин воздействует на ПОМК-содержащие нейроны в аркуатном ядре, что приводит к увеличению экспрессии этого белка и образованию его фрагментов, в частности а-МСГ [Schwarts et al., 1997]. Активация гипоталамических и корковых MCR под действием образовавшихся пептидов приводит к сохранению энергетического гомеостаза, так как снижает потребление пищи и увеличивает скорость метаболизма [Krude, Gruters, 2000].

Первые доказательства участия МК системы в регуляции пищевого поведения были получены 20 лет назад. Было показано, что введение а-МСГ и АКТГ1.24 как в желудочки мозга, так и в вентромедиальную часть гипоталамуса подавляет потребление пищи у животных разных видов (крыс, мышей, кроликов) [Vergoni et al., 1986; 1990]. Кроме того, было показано, что принудительное переедание сопровождается резким возрастанием уровня ПОМК мРНК в аркуатном ядре. После прекращения переедания у животных отмечается гипофагия и потеря избыточного веса. Блокада центральных MCR приводит к нарушению реакции гипофагии после переедания [Hagan et al., 1999]. В дальнейшем результаты, полученные при исследовании человека и животных с генетическими нарушениями синтеза и процессинга ПОМК, а также нарушениями экспрессии MCR, ясно показали важную роль гипоталамической МК системы в контроле пищевого поведения и энергетического гомеостаза [Yeo et al., 2000].

Одной из мутаций, приводящих к ожирению у мышей, является "lethal yellow" (Ау/-). Фенотипически мыши, носители этой мутации, характеризуются ожирением, гиперфагией, снижением уровня метаболизма, развивающейся с возрастом инсулиновой нечувствительностью, а также желтой окраской меха. Исследования показали, что эти нарушения связаны с постоянной и повышенной экспрессией агути-протеина, паракринного фактора, в норме участвующего в регуляции пигментации. Этот белок является антагонистом MC1R на пигментных клетках. Его функция заключается в снижении синтеза эумеланина, вызванного а-МСГ [Marks, Cone, 2001]. Однако в 1994 году Lu с соавторами показали, что агути-протеин является антагонистом не только МС1, но и МС4 рецептора. Это открытие объяснило тот факт, что мыши линии Ау/- не только характеризуются желтой окраской меха (из-за блокады MC1R в коже), но и страдают ожирением (из-за блокады MC4R в мозге) [Lu et al., 1994]. Исследования с использованием агонистов и антагонистов MCR также показали важную роль МК системы в контроле пищевого поведения. Неспецифический агонист МС рецепторов меланотан II снижал потребление пищи, причем этот эффект блокировался введением неселективного антагониста MC3/4R SHU9119 [Gantz, Fong, 2003]. Этот антагонист не только предотвращал анорексическое действие агонистов МС рецепторов, но и сам стимулировал потребление пищи, что свидетельствует о тоническом ингибирующем влиянии МК системы на пищевое поведение [Marks, Cone, 2001]. Дальнейшие доказательства были получены при исследовании мышей, нокаутных по гену MC4R. Было показано, что такие мыши отличались тяжелым ожирением и гиперфагией, причем у гомозиготных особей нарушения были более выражены, чем у гетерозиготных [Adan, Gispen, 2000; Raffm-Sanson, 2003]. Позже было показано, что MC3R также вовлечен в регуляцию энергетического гомеостаза. Гомозиготные мыши, нокаутные по гену MC3R, не отличались значительным увеличением массы тела, но их жировые запасы были почти в 2 раза больше, чем у контрольных и гетерозиготных мышей, в то время как мышечная масса была снижена. Эти животные не отличались повышенным потреблением пищи [Raffm-Sanson, 2003].

Эксперименты показали, что блокада центральных МСЗ и МС4 рецепторов хроническим введением SHU9119 приводит к значительному увеличению массы тела и возрастанию содержания лептина в крови у крыс со свободным доступом к пище. Увеличение массы тела было в значительной степени связано с возрастанием жировых запасов. При этом у крыс в 2 раза увеличивалось потребление пищи по сравнению с контролем. В случае если на фоне блокады MC3/4R животных ограничивали в пище на уровне контроля, то увеличения массы тела практически не наблюдалось, однако отмечалось возрастание жировых запасов. Также отмечалось повышение содержания лептина. Эти данные свидетельствуют о том, что центральная МК система контролирует энергетические запасы организма через зависящий и независящий от потребления пищи пути [Adage et al., 2001]. Одним из механизмов независящего от потребления пищи контроля может быть стимуляция термогенеза. Показано, что активация гипоталамических MCR вызывает увеличение симпатического влияния на бурую жировую ткань и скелетные мышцы, что приводит к усилению термогенеза. Это воздействие может вызывать снижение веса помимо подавления аппетита под действием МК [Haynes et al., 1999]. Таким образом, в настоящее время показано, центральные МС рецепторы - MC3R и MC4R - играют важную роль в контроле массы тела. В то время как MC4R главным образом влияет на потребление пищи, MC3R может регулировать жировые запасы метаболическим путем [Raffin-Sanson, 2003].

Исследования синдрома ожирения, связанного с повышенной экспрессией агути-протеина, привели к открытию и клонированию белка AGRP (agouti-related protein), эндогенного гипоталамического антагониста МС рецепторов. Функция этого белка была доказана на модели с трансгенными мышами. Увеличение экспрессии AGRP приводила к ожирению, аналогично тому, что наблюдалось у мышей, нокаутных по гену MC4R. Паттерн экспрессии AGRP также свидетельствовал о его роли MCR антагониста. Высокий уровень этого белка наблюдался в нейронах аркуатного ядра, направляющих свои проекции к MCR экспрессирующим нейронам [Marks, Cone, 2001]. Поскольку МС4 рецептор обладает собственной фоновой активностью, можно предположить, что МК система оказывает тоническое ингибирующее влияние на пищевое поведение. При этом AGRP может снижать активность МК системы не зависимо от содержания а-МСГ в мозге [Nijenhuis et al., 2001]. Показано, что экспрессия AGRP ингибируется лептином. Большинство AGRP-содержащих нейронов экспрессирует также NPY, пептид который участвует в поддержании энергетического гомеостаза. Он продуцируется в гипоталамических ядрах, контролирующих аппетит и уровень метаболизма, и при центральном введении оказывает орексигенное действие [Marks, Cone, 2001]. Однако, хотя многие экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли AGRP в регуляции энергетического гомеостаза, недавно было показано, что мыши, нокаутные по гену этого белка, не отличаются по фенотипу и пищевому поведению от контрольных. Исследователи считают, что это связано с существованием компенсаторных механизмов [Gantz, Fong, 2003].

Таким образом, накопленные к настоящему времени физиологические, нейроанатомические и электрофизиологические данные доказывают важную роль МК системы в регуляции пищевого поведения и уровня метаболизма. На основании этих данных был предложен регуляторный каскад [Krude, Gruters, 2000] (рис. 7).

Рис. 7. Роль МК системы в контроле энергетического гомеостаза.

Лептин синтезируется адипоцитами и его концентрация положительно коррелирует с возрастанием массы жировых запасов. Лептин воздействует на рецепторы в гипоталамусе, активирует экспрессию ПОМК в аркуатном ядре и подавляет выброс антагониста МС рецепторов AGRP. Проекции ПОМК- и AGRP-содержащих нейронов достигают гипоталамических и высших центров, регулирующих питание и метаболизм. При действии лептина увеличивается содержание а-МСГ, активируются MCR, что приводит к снижению аппетита и усилению метаболизма. Эти механизмы контролируются антагонистом МС рецепторов AGRP, блокирующем действие а-МСГ на рецепторы [Krude, Gruters, 2000].

Генетические нарушения, вызывающие снижение активности МК системы, приводят к ожирению у человека. Мутация MC4R была обнаружена у 5% детей, страдающих ожирением. Носители этой мутации характеризовались увеличением жировой и мышечной массы, большим ростом, гиперфагией и тяжелой гиперинсулинемией [Raffm-Sanson, 2003]. Мутации MC3R были обнаружены у женщин, страдающих ожирением [Li et al, 2000]. страдающих Также были описаны 2 мутации гена ПОМК человека, приводящие к дефициту АКТГ и МСГ. У носителей этих мутаций отмечалось тяжелое раноразвивающееся ожирение, гиперфагия и адреналовая недостаточность. Все эти данные свидетельствуют о важной роли МК системы в регуляции массы тела [Wikberg, 1999].

Многие острые и хронические заболевания сопровождаются нарушением энергетического баланса. Кахексия является сочетанием драматического снижения аппетита и увеличением скорости метаболизма жировой и мышечной массы тела. Такое сочетание отмечено при многих заболеваниях, включая СПИД, онкологические заболевания, ревматоидный артрит, почечную недостаточность и др. При этом в ряде случаев кахексия является определяющим фактором, влияющим на качество жизни и смертность. Изучение причины кахексии позволило предположить, что цитокины, которые высвобождаются при воспалении, могут влиять на ЦНС и изменять метаболизм медиаторов, вовлеченных в регуляцию энергетического гомеостаза. Многочисленные экспериментальные данные подтвердили эту гипотезу. Так было показано, что введение цитокинов, таких как IL-1 р, IL-6 и TNF-a вызывают кахексию. Данные о выраженном противовоспалительном действии МК, а также возрастание содержания этих пептидов в мозге при воспалительных заболеваниях привели к предположению о возможной роли этой системы в развитии анорексии и кахексии, связанных с воспалением. Было показано, что центральное введение a-МСГ приводит к усилению анорексии, вызванной введением ЛПС [Huang et al., 1999]. По аналогии с ролью МК системы в развитии ожирения, рядом авторов было высказано предположение о том, что причиной кахексии является повышенная активность меланокортиновой системы мозга. Однако необходимы дальнейшие исследования связи МК с анорексией и кахексией [Marks, Cone, 2001]. Участие МК системы в контроле пищевой мотивации и уровня метаболизма позволяет рассматривать эту систему как мишень для потенциальных лекарственных препаратов при лечении ожирения и анорексии [Wikberg, 1999].

Влияние меланокортинов на половое поведение

Первые сведения о влиянии МК на половое поведение были получены в конце 1960-ых годов. Было показано, что в/ж введение АКТГ1.24 и а-МСГ самцам крыс, котов и кроликов стимулирует половое поведение даже в отсутствии самки [Bertolini et al., 1968; 1969]. Так, в/ж введение а-МСГ самцам крыс в 10 раз увеличивало частоту эрекций в течение 1 часа после введения. Также было показано, что инъекция а-МСГ в вентромедиальные ядра гипоталамуса и медиальную преоптическую область усиливает половое поведение [Gonzales et al., 1996]. Изучение влияния МК на самок крыс показало, что эти пептиды могут как стимулировать, так и ингибировать половое поведение в зависимости от гормонального статуса животного [Gantz, Fong, 2003; Pfaus et al., 2004]. В случае рецептивных самок введение а- и у-МСГ в вентромедиальные ядра гипоталамуса приводило к стимуляции лордозов [Cragnolini et al., 2000].

Механизмы, лежащие в основе влияния МК на половое поведение, до настоящего времени не выяснены, не определены рецепторы, опосредующие эти эффекты. Доказано, что МК регулируют половую функцию как на центральном, так и на периферическом уровне. Предполагается, что модуляция эректильной функции опосредуется центральными и периферическими MC4R, а регуляция лордозов у самок - MC3R [Cone, 2005]. Однако показано, что в/ж инъекция антагониста MC3/4R HS014 только частично блокирует влияние а-МСГ на частоту эрекций у крыс, хотя в таких же дозах полностью предотвращает интенсивный груминг, вызванный введением а-МСГ [Vergoni et al., 1998]. HS014 также не влиял на стимуляцию полового поведения самцов и самок, вызванную введением МК в вентромедиальные ядра гипоталамуса [Cragnolini et al., 2000; Wikberg et al., 2000]. Хроническое в/ж введение антагониста MC3/4R в течение 12 дней не вызывало изменения параметров полового поведения крыс, однако при этом приводило к значительному увеличению потребления пищи и веса тела [Vergoni et al., 2000]. Было высказано предположение о том, что MC4R не является основным рецептором, опосредующим влияние МК на половое поведение. Вероятно, в основе этих эффектов лежат другие механизмы, не связанные с известными MCR [Wikberg et al., 2000; Vergoni et al., 2000]. Однако недавно было проведено исследование роли MC4R в регуляции эрекции и копулятивного поведения с использованием высокоселективного агониста этого рецептора THIQ, а также мышей, нокаутных по гену MC4R (MC4R-null). Было показано, что в/в инъекция THIQ приводит к повышению внутрикавернозного давления, вызванного электростимуляцией, у мышей. Этот эффект отсутствовал у мышей MC4R-null, при этом у этих мышей было нарушено половое поведение, хотя способность к размножению сохранялась [Van der Ploeg et al., 2002]. Кроме того, в работе была показана экспрессия MC4R мРНК в тканях, связанных с регуляцией эрекции (спинной мозг крыс, пенис крыс и человека), что предоставляет нейроанатомическую основу влияния МК на половое поведение. Полученные данные свидетельствуют о важной роли MC4R в регуляции эректильной функции на периферическом уровне [Van der Ploeg et al., 2002]. Однако следует отметить, что у мужчин с дефицитом MC4R снижения эректильной функции не наблюдалось [Raffm-Sanson, 2003].

В последние годы проводятся исследования влияния МК на половое поведение человека. Было показано, что в/в введение неселективного агониста МС рецепторов MT-II вызывает спонтанную эрекцию у мужчин с психогенными или органическими нарушениями половой функции [Wessells et al., 1998]. Изучалось также влияние на половое поведение аналога меланокортинов циклического пептида РТ-141, способного связываться с МС1, МСЗ и МС4 рецепторами. Было показано, что подкожное введение этого пептида в дозах от 1 до 6 мг стимулировало эрекцию как у здоровых мужчин, так и у пациентов с нарушениями эрекции [Rosen et al., 2004]. При интраназальном введении этого пептида в дозах от 7 мг эффекты сохранялись [Diamond et al., 2004]. Проводилось также исследование влияния РТ-141 на самок крыс. Было показано, что при п/к введении этот препарат, не влияя на число лордозов, усиливает такие компоненты полового поведения, как стремление к контакту с партнером, сексуальные игры и др. Полученные данные свидетельствуют об усилении сексуального влечения у самок крыс под действием РТ-141. Авторы исследования считают, что, если допустить аналогию в регуляции полового поведения самок крыс и женщин, то препарат РТ-141 можно рассматривать как возможный фармакологический агент для лечения нарушения сексуального влечения у женщин [Pfaus et al., 2004].

В настоящее время не вызывает сомнений важная роль МК системы в регуляции полового поведения человека и животных [Wessells et al., 2005]. Однако механизмы этих эффектов недостаточно изучены. Показано, что влияние МК на половое поведение осуществляется при участии NO, так как в/ж введение блокатора NO-синтазы NAME понижает вызванную АКТГ эрекцию [Poggioli et al., 1995]. Кроме того, влияние МК на половое поведение меняется при действии блокаторов мускариновых рецепторов и блокаторов кальциевых каналов, что говорит о вовлечении в этот процесс большого количества различных нейро-медиаторных систем [Argiolas et al., 2000].

Регуляция функции экзокринных желез

Меланокортины способны регулировать функции различных периферических органов, включая экзокринные железы, такие как сальные, препуциальные, слезные, гардеровы и другие. В слезных железах МК стимулируют секрецию белков и пероксидазы ацинарными клетками, что свидетельствует о роли этих пептидов в регуляции продукции слез. МК также регулируют работу гардеровых желез, стимулируя в них синтез порфиринов. Таким образом, пептиды этого класса играют важную роль в обеспечении защиты глаза от внешних воздействий [Slominski et al., 2000].

Показано, что МК влияют на работу сальных желез - у крыс АКТГ и МСГ стимулируют выделение сального секрета, который предохраняет мех от намокания [van der Kraan et al., 1998]. У человека, вероятно, МК также влияют на сальные железы, т.к снижение функции гипофиза сопровождается нарушением продукции этих желез [Slominski et al., 2000]. МК синергично с тестостероном оказывают трофическое действие на препуциальные железы и простату. Показано, что активность специализированных ферамон-продуцирующих препуциальных желез зависит от уровня а-МСГ в крови. Хроническое введение МК стимулировало препуциальный липогенез, вызывало гипертрофию и гиперплазию, увеличивало секрецию ферамонов препуциальной железой у грызунов [Morgan et al., 2004]. У самок грызунов воздействие МК на препуциальные железы приводит к стимуляции продукции и выброса половых аттрактантов, у самцов - ферамонов, повышающих агрессивность [Slominski et al., 2000]. У мышей, лишенных МС5 рецептора, отмечалось снижение содержания половых ферамонов в препуциальной железе и моче. Эти животные также характеризовались сниженной агрессивностью [Chen et al., 1997; Morgan et al., 2004].

В секреторном эпителии различных экзокринных желез показан высокий уровень экспрессии MC5R. Следовательно, МК могут прямо воздействовать на железы, регулируя их функцию [van der Kraan et al., 1998]. Показано, что нокаут гена MC5R приводит к множественным экзокринным нарушениям, что свидетельствует о необходимости эндогенных МК для нормального функционирования экзокринных желез [Chen et al., 1997]. Возможность МК непосредственно регулировать работу экзокринных желез и наличие в них MCR подразумевает существование источника эндогенных агонистов. а-МСГ и АКТГ гипофиза могут оказывать влияние на периферические органы. Однако также не исключено аутокринное и паракринное действие синтезируемых на периферии пептидов [van der Kraan et al., 1998]. Хотя гипофиз является основным источником МК, ряд данных свидетельствует о том, что роль альтернативного источника циркулирующих пептидов может играть кожа [Slominski et al., 2000].

Способность МК модулировать работу экзокринных желез может представлять периферический компонент, который связан с центральными функциями МК системы. У мышей нокаут по гену MC5R приводит к нарушению терморегуляции, что связано со снижением продукции кожных сальных желез и намоканием меха. Однако известно, что МК через центральные рецепторы модулируют терморегуляцию [Catania, Lipton, 1998]. Следовательно, МК могут действовать как на периферическом, так и на центральном уровне одновременно, способствуя поддержанию постоянной температуры тела. Аналогично, через центральные механизмы МК регулируют половое поведение [Cone, 2005] и при этом а-МСГ действует на периферии, регулируя секрецию половых ферамонов. То есть, МК модулируют половое поведение на различных уровнях. Все эти данные свидетельствуют о функциональной взаимосвязи между центральными и периферическими эффектами МК в регуляции таких важнейших физиологических функций, как половое поведение и терморегуляция [van der Kraan et al., 1998].

Таким образом, в настоящее время показано, что меланокортины улучшают обучение и внимание, влияют на мотивационные процессы; ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе; оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС; влияют на развитие нервной системы; модулируют половое поведение; оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие; взаимодействуют с опиоидной системой; влияют па болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему; вызывают снижение потребления пищи и веса тела; влияют на функционирование экзокринных желез. Доказательство широкого спектра физиологической активности меланокортинов и открытие семейства их рецепторов предоставило новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях.

Влияние меланокортинов на меднаторпые системы мозга

В настоящее время собраны обширные сведения о влиянии МК на различные нейромедиаторные системы. Проведены исследования способности пептидов этого класса связываться с различными рецепторами. Было показано, что АКТГ1.39 в микромолярных концентрациях взаимодействует in vitro с дофаминовыми [Florijn et al., 1991], опиатными [Snell, Snell, 1982], холиновыми Mi [Florijn et al., 1991], серотониновыми 5-HT1A и 5-HT1B [Florijn et al., 1991, Pranzatelli, 1988] и глютаматными [Trifiletti, Pranzatelli, 1992] рецепторами. АКТГ не связывается с бензодиазепиновыми, ГАМКд, гистаминовыми Hi [Florijn et al., 1991], p-адренергическими [Duman et al., 1984] и мускариновыми M2 [Wiemer et al., 1988] рецепторами. АКТГ1.24 также способен вытеснять лиганды из комплекса с другими рецепторами, такими, как Д1 рецепторы, 5-НТ1А и 5-НТ1В, мускариновые Ml и гистаминовые HI рецепторы, однако, для этого необходимы гораздо более высокие концентрации АКТГ1-24 [Florijn et al., 1991]. Обычно большей активностью обладают АКТГ1.39 и фрагменты большей длины, а короткие фрагменты менее активны [Snell, Snell, 1982]. Однако это верно не во всех случаях - АКТГ7.16 активнее, чем АКТГ].24 взаимодействует с дофаминовыми D2 рецепторами [Florijn et al., 1991] и опиатными рецепторами [Terenius, 1975]. Таким образом, не существует прямой зависимости между длиной аминокислотной цепи и способностью связываться с рецепторами.

МК воздействуют на метаболизм многих пейромедиаторов. Показано влияние этих пептидов на синтез, освобождение, обратный захват и обмен таких медиаторов, как дофамин, норадреналин, ацетилхолин, серотонин и ГАМК. Однако механизм влияния МК на метаболизм медиаторов в большинстве случаев не выяснен. Так же, как в отношении связывания с различными рецепторами, эффекты МК не являются специфичными для одной медиаторной системы [Pranzatelli, 1994].

Ацетилхолипергическая система

Холинергическая система играет большую роль в процессах памяти. На модели амнезии, вызванной введением блокатора м-холинорецепторов скополамина, было показано положительное влияние аналога АКТГ4.9 НОЕ 427 [Hock et al., 1988]. Меланокортины способны изменять активность ферментов, участвующих в биосинтезе различных медиаторов. Так, было показано, что НОЕ 427 через 30 мин после введения вызывает снижение уровня ацетилхолина и повышение уровня ацетилхолинтрансферазы и цГМФ в мозге [Wiemer et al., 1988]. Однократное введение АКТГ4.7 также увеличивает активность ацетилхолинэстеразы головного мозга крыс [Алексидзе и др., 1983]. Вероятно, МК активируют метаболизм ацетилхолина.

Адренергическая система

Важную роль в формировании пямятного следа играет система биогенных аминов мозга, поэтому было исследовано влияние МК на эту медиаторную систему. В настоящее время можно считать доказанным, что периферическое введение АКТГ может изменять активность катехоламинергической системы мозга [Dunn, Gispen, 1977]. Инъекции фрагментов АКТГ приводят к увеличению скорости обмена норадреналина, при этом изменяется его содержание - в вентромедиальных ядрах гипоталамуса и аркуатном ядре снижается, а в голубом пятне - увеличивается [Fekete et al., 1978]. Кроме того, было показано, что введение АКТГ после обучения животных в тесте выработки условного рефлекса избегания тока слабой интенсивности приводила к снижению содержания норадреналина в мозге на 20-40 % [Gold, McGaugh, 1978]. На основании этих данных было высказано предположение о том, что одним из действий АКТГ-подобных пептидов на ЦНС может быть увеличение освобождения норадреналина в ответ на внешние воздействия [Gold, Delanoy, 1981]. Известно, что при действии раздражающих факторов снижается содержание норадреналина в мозге, что объясняется высвобождением моноамина. Предполагается, что фрагменты АКТГ ускоряют освобождение норадреналина из депо или оказывают влияние на его метаболизм в мозге.

Взаимодействие с дофаминергической системой.

Существует много данных о воздействии фрагментов АКТГ и их аналогов на дофаминергическую систему. Так, например, при в/ж введении АКТГ1.24 в течение часа наблюдается повышение концентрации дофамина (ДА) в области хвостатого ядра, что сопровождается интенсивным грумингом [Florijn et al., 1993]. Введение АКТГ4.10 увеличивает флуоресценцию дофамина в переднем мозге [Lichtensteiger et al., 1977]. Известно также, что АКТГ1-24 и АКТГмо оказывают модулирующее действие на ДА рецепторы полосатого тела, при этом пептиды на 50% увеличивают захват [3Н]-ДА в синаптосомах [Громов, 1992]. Проводился ряд работ по исследованию влияния МК на связывание дофаминергических лигандов с Д2 рецепторами in vitro. Выяснилось, что АКТГ,.24 и АКТГ4.10 уменьшают связывание агониста Д2 рецепторов [ H]N-пропилнорапоморфина ([ H]NPA) с мембраной стриатума. Анализ показал, что между АКТГ1.24 и [ H]NPA имеет место конкурентная борьба за связывание с Д2 рецептором. Также было продемонстрировано, что АКТГ 1.24 препятствует связыванию антагониста Д2 рецепторов [3Н]-спиперона с мембраной стриатума, гипофиза, перегородки и черной субстанции [Florijn et al., 1991]. Было показано, что внутрижелудочковое введение в течение 2-х недель агониста МС рецепторов меланотана II приводит к изменению связываемости Д1 и Д2 рецепторов. Связываемость Д1 рецепторов увеличивалась в прилежащем ядре, бледном шаре, но снижалась в ретикулярной части черной субстанции. Связываемость Д2 рецепторов снижалась в бледном шаре и увеличивалась в ОСВ, компактной части черной субстанции и в области вентральной покрышки [Lindblom et al., 2002].

Введение МК внутрижелудочково или в область вентральной покрышки стимулирует выброс дофамина в стриатуме и прилежащем ядре. Этот эффект может быть связан с МС4 рецепторами [Lindblom et al., 2001]. Предполагается, что такие эффекты меланокортинов, как влияние на пищевое поведение, синдром потягивания-зевания и груминг связаны с дофаминовой системой [Ferrari et al., 1997]. Так, показано, что введение блокатора ДА рецепторов галоперидола ослабляет интенсивный груминг, вызванный МК. Кроме того, инъекции агонистов MCR в прилежащее ядро приводит к увеличению стереотипного поведения, что сопровождается активацией дофаминергической системы [Spruijt, 1992; Florijn et al., 1993]. В экспериментах in vitro а-МСГ увеличивал продукцию цАМФ путем взаимодействия с D1 рецепторами [Cremeretal., 2000].

В последнее время активно исследуется вопрос привыкания к наркотическим средствам. Прилежащее ядро - участок мозга, участвующий в положительном подкреплении при действии кокаина и других наркотических препаратов. Это ядро богато MC4R. Активация дофаминергической системы введением каких-либо агонистов, в том числе и кокаина, приводит к повышению экспрессии ПОМК в прилежащем ядре. А введение агонистов МС рецепторов в боковые желудочки усиливает действие амфетамина на самостимуляцию [Cabeza de Vaca et al., 2002]. Таким образом, можно заключить, что МК увеличивают дофаминергическую передачу, а дофамин и психостиуляторы, в свою очередь, усиливают действие МК системы. Так, микроинъекция антагониста МС рецепторов HSU9119 в область прилежащего ядра приводила к снижению привыкания к кокаину. Кроме того, показано увеличение экспрессии МС4 рецепторов в этом ядре после употребления животными кокаина [Hsu et al., 2005].

Взаимодействие с серотонинергической системой

Данных о влиянии меланокортинов на серотонинергическую систему не очень много. Известно, что введение аналогов АКТГ вызывает усиление метаболизма серотонина в среднем мозге и медулле [Гецова и др., 1988]. Было показано, что в стволе мозга АКТГ-содержащие волокна локализованы в ядрах шва, которые содержат серотонин [Romagnano, Joseph, 1983]. Ствол вовлечен в передачу болевой чувствительности и предполагают, что рецепторы серотонина могут опосредовать анальгезию, вызванную АКТГ [Wu et al., 1999]. При обучении животных в тесте пассивного избегания было показано, что электро-болевое раздражение увеличивает содержание серотонина в гиппокампе через 24 ч. Воздействие СОг сразу после удара током приводило к нарушению запоминания, в этом случае уровень серотонина в гиппокампе не увеличивался. Инъекция АКТГ4.10 и (Б-РЬе)АКТГ4.ю за 1 ч до повторного тестирования через сутки уменьшало амнезию, вызванную СОг. Антиамнестический эффект коррелировал с увеличением содержания серотонина в гиппокампе. Введение АКТГ4.ю до первого предъявления тока или АКТГ] 1.24 до или после тока не приводило к увеличению содержания серотонина в гиппокампе и не влияло на амнезию [Ramaekers et al., 1978]. Можно заключить, что антиамнестический эффект АКТГ связан с серотонинергической системой гиппокампа и для реализации этого эффекта необходима последовательность АКТГ4.10. Показано, что MC4R опосредует влияние МК на серотонин- и норадренергические системы, с чем может быть связана роль этого рецептора в регуляции стрессорного ответа [Kawashima et al., 2003].

Взаимодействие с ГАМК-ергической системой

Уровень циркулирующего в крови АКТГ влияет па связываемость ГАМК рецепторов. Так, системное введение АКТГ1.39 и АКТГ4-10 приводило к увеличению связываемости ГАМК рецепторов в среднем мозге и стриатуме [Kendall et al., 1982]. В исследованиях in vitro показано, что АКТГ4ю и АКТГ 1-24 дозозависимо предотвращают связывание глютамата и мусцимола с ГАМК-А рецепторами. Авторы предполагают, что АКТГ и его фрагменты могут работать как аптикопвульсанты [Ito et al., 1988].

Множественность эффектов МК может свидетельствовать о модулирующем влиянии пептидов этого класса на нейротрансмиссию. Анатомические связи ПОМК-содержащих нейронов с различными участками мозга, связанными с разными нейромедиаторами, обеспечивает возможность МК функционировать в качестве нейромодуляторов [Pranzatelli, 1994].

Синтетические аналоги меланокортинов

Широкий спектр физиологической активности меланокортинов открывает возможности для использования препаратов этого класса в клинической практике при различных патологических состояниях. Однако препятствием для применения этих соединений в клинике является их низкая биодоступность и недостаточная продолжительность действия. Длительность нейротропных эффектов природного фрагмента АКТГ4—ю при системном введении составляет 30—60 мин [Ашмарин и др., 1997]. Многими исследователями предпринимались попытки повышения эффективности МК путем модификации структуры молекулы природных пептидов. В результате этих экспериментов были получены аналоги природных пептидов, лишенные гормональных эффектов и обладающие выраженной активностью.

Одним из возможных путей увеличения эффективности регуляторных пептидов является введение в их структуру D-аминокислот, что приводит к повышению устойчивости пептида к действию протеаз. Так, замена Met4 на сульфоксид метионина, g q

Arg на D-Lys, а Тгр на Phe привела к появлению нового пептида ORG 2766 (рис. 8), который значительно более активен, чем АКТГ4.9 [Greven, De Wied, 1977]. Препарат ORG 2766 сохраняет поведенческую активность при пероральном введении. При этом он не проявляет меланоцитстимулирующей и стероидогенной активности, не приводит к мобилизации липидов из жирового депо. Однако в дальнейшем было показано, что направленность действия этого пептида на сохранение навыка зависит от дозы -введение малых доз (0.5-1.0 нг/кг) улучшает, а больших доз (от 5.0 нг/кг) ухудшает сохранение [Fekete, De Wied, 1982]. Исследования показали нейротрофическое влияние ORG 2766 после токсического воздействия 6-OHDA на нигростриатум. Этот пептид также оказывает положительный эффект на регенерацию периферических нервных волокон у крыс [De Koning, Gispen, 1987; Bravenboer et al, 1993]. Действие Org 2766 также исследовалось на моделях аутоиммунных заболеваний, при которых наблюдается деградация миелиновых оболочек и ослабление нейронных функций. Было показано, что аналог восстанавливает координацию движений животных и препятствует демиелинизации аксонов [Duckers et al., 1993].

АКТГ(4-10) Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly

ORG 2766 Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0H

ORG 31433 Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0-(CH2)9-CH3

HOE 427 Met (02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-NH-(CH2)8-NH2

BIM 22015 D-Ala-Gln-Tyr-Phe-Arg-Trp-Gly

Семакс Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro

Рис. 8. Аминокислотные последовательности АКТГ4.ю и синтетических меланокортинов.

Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой СООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ - НОЕ 427 и ORG 31433 (рис. 8), которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. Однако, так же как и ORG

2766, в малых дозах эти пептиды облегчают выработку условных рефлексов, а в больших - нарушают процесс сохранения навыка. ORG 31433 существенно ускоряет функциональное восстановление после повреждения прилежащего ядра 6-OHDA [Wolterink et al., 1991]. НОЕ 427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании памяти и способности к обучению. Этот пептид при подкожном введении ликвидирует у крыс амнезию, вызванную электрошоком, улучшает обучение и память в различных тестах [Hock et al., 1988]. Показано, что даже единичное введение НОЕ 427 людям пожилого возраста с нарушением когнитивных функций, а также пациентам с болезнью Альцгеймера оказывало небольшое, по достоверное положительное влияние на внимание и настроение больных [Sieqfried, 1991].

Был синтезирован и исследован еще один аналог AKTTYio - BIM-22015 (рис. 8). Изучение эффектов этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложиооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. И в этом случае BIM оказывал нормализующее действие на оперированных животных [Attella et al., 1992].

Все перечисленные выше аналоги фрагментов АКТГ содержат D-аминокислоты. Однако введение в состав молекулы пеприродных аминокислот ведет к появлению у пептида новых биологических свойств, которые в ряде случаев, нельзя считать полезными. В частности, накопление в стареющем организме неприродных D-аминокислот может, по мнению ряда авторов, быть причиной возникновения злокачественных новообразований. Кроме того, как уже указывалось, терапевтический диапазон аналогов АКТГ, содержащих D-аминокислоты, очень узок - введение доз 0.51.0 нг/кг ускоряет обучение, тогда как увеличение дозы всего до 5.0 нг/кг приводит к ухудшению сохранения навыка. Возможно именно по этой причине эти аналоги в настоящее время используются только в клинических экспериментах и лекарственные препараты на их основе не разработаны [Ашмарин и др., 1997]. Таким образом, включение энантиомеров природных аминокислот хоть и усиливает действие пептидов, но одновременно приводит к целому ряду неблагоприятных побочных последствий. Следовательно, необходимо было разработать принципиально иной способ продления "жизни" фрагментов АКТГ в организме.

Открытие и клонирование МС рецепторов открыло пути идентификации их природных агонистов и антагонистов, а также синтетических соединений, проявляющих аффинность к МС рецепторам. Наибольшее внимание было уделено разработке синтетических аналогов а-МСГ. Одним из широко используемых синтетических пептидов является меланотан-1 - (Nle4, D-Phe7)a-MSH или NDP-MSH (структура аналогов представлена в табл. 2), который является наиболее мощным из линейных аналогов меланокортинов [Sawyer et al., 1980]. NDP-MSH проявляет свойства агониста MCR и обладает высокой аффинностью ко всем типам МС рецепторов, кроме MC2R. Степень его аффинности к MCR можно представить следующей последовательностью: MC1R > MC3R > MC4R > MC5R.

Таблица 2. Структура а-МСГ и синтетических лигандов мслаиокортнновых рецепторов

Пептид Структура а-МСГ Ас-8ег1-Туг2-8ег3-Ме14-О1и5-Н15б-РЬе7^8-Тф9-О1у,0-Ьу811-Рго12-Уа113^Н2

NDP-MSH Ас-8ег1-Туг2-8ег3^1е4-О1и5-Н186-О-РЬе7^8-Тф9-О1у10-Ьу811-Рго12-Уа113^Н2

МТII Ac-Nle4-c(Asp5-His6-D-Phe7-Arg8^9-Lys10)-NH2

SHU9119 Ac-Nle4-c(Asp5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Lys10)-NH2

HS964 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cysu)-NH2

HS963 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cys")-NH2

HS005 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cys")-NH2

HS006 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cysn)-NH2

HS007 Ac-c(Cys4-Arg5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cys")-NH2

HS009 Ac-c(Cys4-Glu5-Ala6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cys")-NH2

HS011 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Asp10-Cysn)-NH2

HS014 Ac-c(Cys4-Glu5-His6-D-Nal7-Arg8-Trp9-Gly10-Cysll)-Prol2-Prol3-Lys14-Asp15-NH2

HS024 Ас-с(Суз3^1е4-Агё5-Ш56-О^а17-Агё8-Тф9-О1у10-Су$")-Ш2

MS05 Ac-Ser1 -Ser2-Ile 3-Ile4-Ser5-His6-Phe7-Arg8^rp9-Gly1 °-Lys'1 -Pro 12-Val13-NH2

MS09 Ac-Ser1-Ser2-Ile3-Ile4-Ser5-His6-D-Phe7-Arg8-Trp9-Gly10-Lys"-Pro12-Val13-NH2

НР-228 Ac-Nle4-Gln5-His6-D-Phe7-Arg8-D^9-Gly10-NH2

Nle - норлейцин; D-Nal - 0-2'-нафтилаланин)

Исследование структуры а-МСГ привели к разработке циклического пептида -меланотана-П (MT-II). MT-II активирует МС рецепторы, он является сильным, но не селективным агонистом рецепторов 3, 4 и 5 типа [Al-Obeidi et al., 1989]. Показано, что фрагмент а-МСГ с 6 по 9 а.к. - His6-Phe7-Arg8-Trp9, заключенный в лактамовое кольцо меланотана-П, является активным центром при взаимодействии с меланокортиновыми рецепторами. N-концевая область MT-II - Ac-Nle4, не включенная в лактамовое кольцо, является структурной особенностью определяющей селективность MT-II к MC3R-MC5R человека. Данная последовательность не оказывает влияния на связывание, аффинность и активацию MC4R, по, вероятно, она необходима для полной aKTHBauHHMC5R [Bednarek et al., 1999]. Показано, что MT-II при периферическом введении стимулирует меланогенез, а при центральном введении ингибирует потребление пищи [Wikberg et al., 2000]. Клинические исследования показали положительное действие MT-II при лечении нарушения половой функции у мужчин [Wessells et al., 1998].

Модификация молекулы MT-II привела к разработке SHU9119, который является селективным антагонистом MC3R и MC4R [Hurby et al., 1995]. SHU9119 представляет собой циклический лактамовый пептид. Позже был синтезирован еще один синтетический антагонист MCR-HS014, селективный антагонист MC4R [Wikberg, 1999]. Степень селективности данного лиганда к рецепторам 4 типа в 20, 30 и 200 раз выше, чем к МСЗ, МС1 и МС5 рецепторам, соответственно. Однако оба аналога, являясь антагонистами MC3/4R, проявляют агопистические свойства по отношению к МС рецепторам 1 и 5 типов. SHU9119 и HS014 широко используются в исследованиях механизмов, лежащих в основе различных эффектов МК пептидов и их рецепторов. Оба соединения при центральном введении увеличивают потребление пищи и вес тела [Wikberg et al., 2000].

В 1998 году был синтезирован и исследован селективный антагонист MC4R -HS024. Этот аналог связывался с MC4R с субнаномолярных концентрациях. HS024, также как SHU9119 и HS014, является антагонистом МСЗ и МС4 рецепторов, однако, в отличие от этих пептидов, по отношению к MC1R и MC5R, он также является антагонистом [Kask et al., 19986]. Внутримозговое введение HS024 также приводило к увеличению потребления пищи [Wikberg, 2001].

Дальнейшие исследования привели к разработке новых циклических МК аналогов: HS963, HS964, HS005 и HS006, которые можно описать общей формулой [Cys4-X7-Cys11]a-MSH4n, отличающейся только в 7 позиции [Schioth et al., 19986, Kask et al., 1998а]. В дальнейшем на основе HS964 были разработаны аналоги HS007, HS009 и HS011, в которых были сделаны замены в 5, 6 и 10 положениях. Исследование аффинности этих аналогов к MCR позволило авторам сделать заключение о важной

7 R О роли последовательности АКТГб.9 (His -Phe -Arg -Тгр ) для связывания с рецепторами [Starowicz, Przewlocka, 2003].

Позднее были разработаны высоко селективные агонисты MC1R - MS05 и MS09. Оба пептида являются полными агонистами MC1R. MS09 более активен, однако его селективность по отношению к MC1R меньше, чем у MS05. MS05 привлекает внимание исследователей как возможное противовоспалительное средство [Brzoka et al., 1999].

Другим селективным агонистом MC1R является линейный аналог АКТГЛХ-МСГ4. ю - НР-228. Этот аналог связывается с теми же рецепторами, что и а-МСГ (т.е MC1R и MC3-5R), однако наибольшая активность была показана в отношении MC1R. Исследования показали, что НР-228 способен снижать уровень TNF-a и IL-6 в крови мышей, которым вводили бактериальный ЛПС. Кроме того, введение этого пептида снижало отек конечности, вызванный введением каррагинана. НР-228 также снижал гиперальгезию и жар, вызванные введением IL-бр или ЛПС. В настоящее время проводятся клинические исследования аналога НР-228 [Wikberg, 2001].

Таким образом, за последние десятилетия разработано, синтезировано и исследовано большое количество синтетических агонистов и антагонистов меланокортиновых рецепторов. Применения этих соединений в экспериментах способствовало выяснению функций МС рецепторов различных типов. Однако большинство из этих соединений не может быть использовано в клинической практике, что связано с их низкой биодоступностью при периферическом введении. Хотя небольшие пептиды, такие как MT-II, способны, вероятно, проникать через ГЭБ, парентеральный способ введения этого препарата делает маловероятным его клиническое применение. Таким образом, необходима разработка синтетических аналогов МК, высокоэффективных при неинвазивных способах введения в организм [Wikberg, 2001].

Семакс - аналог АКТГ4.ю пролонгированного действия

Как уже отмечалось ранее, недостатком природных фрагментов АКТГ является кратковременность их эффектов. Длительность действия наиболее эффективного природного фрагмента - АКТГио составляет 30-60 мин [Ashmarin et al., 1995; Ашмарин и др., 1997]. Для пролонгирования эффектов фрагментов АКТГ бессмысленно увеличивать дозу вводимого препарата, т.к. это приводит к исчезновению эффекта [Ашмарин и др., 1997]. Исследования, проведенные в Институте молекулярной генетики РАН и на Биологическом факультете МГУ, показали, что пролонгировать эффекты пептида и увеличить его устойчивость к действию пептидаз можно путем включения в структуру молекулы участков, обогащенных пролиновыми остатками. Известно, что в органах и тканях большинства теплокровных животных широко представлены экзо- и эндопептидазы с низкой специфичностью. Они не расщепляют связи -АА-Pro-, где АА — любая аминокислота, а также другие последовательности, обогащенные пролиновыми остатками. Специфические пролингидроксилазы сосредоточены главным образом в отдельных органах и тканях в небольшом количестве. На основании этого было высказано предположение, что присоединение к С-концу фрагмента АКТГ4.7 обогащенной пролином цепочки приведет как к усилению эффекта пептида, так и к его пролонгированию [Ашмарин и др., 1997]. Изучение нейротропной активности ряда аналогов АКТГ4.10 с различными модификациями С-концевой области показало, что наибольшей активностью обладает аналог, в котором три С-концевые аминокислоты заменены на последовательность Pro-Gly-Pro [Пономарева-Степная М.А. и др., 1984]. Этот пептид (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) сохраняет ноотропное действие природного прототипа, при этом длительность его действия составляет порядка 20-24 часов [Ашмарин и др., 1997].

Изучение влияния семакса на обучение животных показало, что внутрибрюшинное введение этого пептида в дозах 15-150 мкг/кг ускоряет выработку пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали положительное действие этого препарата на обучение животных с отрицательным болевым подкреплением - выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Ashmarin et al., 1995]. Однако в других работах не было обнаружено влияния семакса на обучение крыс с отрицательным подкреплением [Гецова и др., 1988]. Было показано, что семакс стимулирует мнестические процессы не только у интактных животных, но и в условиях патологии: введение пептида значительно ослабляло амнезию, вызванную электрическим шоком [Ашмарин и др., 1997]. Кроме того, инъекция пептида предотвращала амнезию, вызванную введением 5-окситриптофана или дисульфирама [Гецова и др., 1988]. Изучение гормональных эффектов пептида показали, что семакс не обладает кортикотропной и меланоцитстимулирующей активностью [Пономарева-Степная и др., 1985].

Исследования антигипоксического действия семакса, проведенные на крысах, показали, что этот пептид в 2.5 раза увеличивает время жизни животных на экстремальной «высоте» (12000 м), а также положительно влияет на адаптацию организма к гипоксии. В исследованиях на людях-добровольцах обнаружена способность препарата купировать постгипервентиляционные ЭЭГ-эффекты, вызванные компенсаторным уменьшением мозгового кровотока [Каплан и др., 1992].

Проводилось исследование влияния семакса на последствия острой гипобарической гипоксии у крысят различного возраста. Было показано, что предварительное однократное введение семакса в дозе 50 мкг/кг приводит к повышению индивидуальной устойчивости животных к гипоксии, положительно влияет на параметры сердечной деятельности во время гипоксии и ослабляет отставленные изменения поведения животных, вызванные кислородной недостаточностью [Балан и др., 1999; Маслова и др., 1999].

Семакс способен оказывать нейропротекторное действие. Большие дозы семакса (150-300 мкг/кг) увеличивают выживаемость животных и уменьшают выраженность неврологического дефекта при экспериментальном ишемическом инсульте [Ашмарин и др., 1997]. Кроме того, опыты, проведенные на эмбриональных культурах клеток мозга крыс, показали, что семакс в дозе 0.1-10 мкМ увеличивает количество выживших нейронов в 1.5-3 раза по сравнению с контролем и при этом не влияет на пролиферацию глиальных клеток [Гривенников и др., 1999]. Дальнейшие исследования показали, что семакс осуществляет свое нейротрофическое действие через регуляцию уровня экспрессии нейротрофических факторов [Долотов и др., 2003].

Введение семакса увеличивало скорость регенерации сенсорных волокон периферического нерва мыши после его пережатия. Пептид стимулировал восстановление преимущественно крупных миелинизированных аксонов из группы афферентов в составе регенерирующего смешанного нерва [Балезина и др., 2002].

Для определения возможности использования семакса в коррекции постреанимационных неврологических нарушений были проведены исследования действия препарата на модели клинической смерти. Остановка общего кровообращения осуществлялась пережатием сосудистого пучка сердца крыс. Спустя 10 минут животных оживляли с помощью закрытого массажа сердца и искусственной вентиляции легких. Далее у крыс оценивали степень запоминания экспериментальной обстановки при повторном тестировании в "открытом поле". Ежедневное интраназальное введение семакса в дозе 50 мкг/кг в течение двух недель нормализовало параметры ориентировочно-исследовательской реакции крыс, приближая их значения к интактному контролю [Волков и др., 1992; Геренко и др., 1991].

Получены данные, позволяющие предположить антистрессорное действие семакса. Известно, что при эмоциональном стрессе наблюдается усиление экспрессии гена c-Fos в разных структурах мозга. Наиболее выраженная экспрессия этого гена выявлена в мозге предрасположенных к эмоциональному стрессу животных. Предварительное внутрибрюшинное введение семакса вызывает снижение индуцированной стрессом экспрессии гена c-Fos в паравентрикулярном гипоталамусе и медиальных отделах перегородки у предрасположенных к эмоциональному стрессу крыс [Умрюхин и др., 2001].

Исследование ноотропных эффектов семакса было проведено и на людях-добровольцах. Опыты показали, что интраназальное введение пептида в дозе 16 мкг/кг достоверно повышало внимание и краткосрочную память испытуемых при тестировании как в начале, так и в конце рабочего дня. Данные ЭЭГ показали, что интраназальное введение пептида в количестве 0.25-1.0 мг вызывает изменение энцефалографических параметров аналогичное изменениям, возникающим при введении типичных ноотропных препаратов [Kaplan et al., 1996].

Клинические исследования показали положительное действие семакса в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Семакс вводился интраназально в суточной дозе 12, 18 и 24 мг в течение 5 дней. Первое введение осуществлялось через 3-4 часа после поступления больного в клинику, т.е. в первые часы заболевания. Одновременно с введением семакса все больные подвергались комплексной базисной терапии. Интраназальное введение семакса совместно с интенсивной терапией острого полушарного ишемического инсульта оказывало благоприятное действие на выраженность и темпы восстановительных процессов, способствуя ускорению регресса общемозговых и очаговых нарушений [Гусев и др., 1997].

Нейротрофические свойства семакса подтвердились во время исследования действия препарата при заболеваниях зрительного нерва различной этиологии. Введение семакса интраназально или в виде эндоназального электрофореза, особенно в острой стадии заболевания, эффективно защищало нервную ткань от последствий повреждений. При этом достоверно увеличивался прирост остроты зрения, расширялось суммарное поле зрения, повышалась электрическая чувствительности и проводимость зрительного нерва, улучшалось цветовое зрение [Полунин и др., 2000].

Оценка эффективности семакса при лечении больных с различными цереброваскулярными заболеваниями показала, что после курса лечения у большинства больных отмечается значительное улучшение общего самочувствия - уменьшаются головные боли, нормализуется сон, увеличивается работоспособность, возрастает объем запоминания и концентрация внимания, снижается тревожность [Шмырев и др., 1998].

В ходе клинических испытаний было отмечено анальгетическое действие семакса при ряде болевых синдромов. Было показано, что через 30 мин препарат достоверно уменьшает интенсивность и субъективное восприятие боли в случае мигренозной боли и дентальной плексалгии [Королева и др., 1996].

Данные о положительном действии семакса на восстановление мнестических функций мозга в постреанимационный период были получены при клинических исследованиях. Изучалось влияние препарата на восстановление функций ЦНС у больных с тяжелыми формами постреанимационной патологии (интеллектуальными и мнестическими расстройствами). У 89% больных, получавших семакс, отмечалось значительное улучшение состояния. Нейропсихологическое исследование выявило улучшение внимания, запоминания, познавательных способностей, подвижности мышц, слухоречевой памяти. Данные энцефалографического обследования также подтвердили эффективность препарата - отмечалось улучшение показателей функционального состояния мозга [Алексеева и др., 1999].

На основании клинических исследований Фармакологический комитет МЗ РФ рекомендовал разрешить медицинское применение семакса. Спектр лечебного и профилактического действия семакса оказался достаточно широким. В него входят выраженные терапевтические эффекты при таких тяжелых заболеваниях как инсульт и атрофия зрительного нерва, а также ряд хронических патологий, связанных с нарушением мозгового кровообращения. Кроме того, показана высокая эффективность семакса в качестве профилактического средства для повышения умственной работоспособности здоровых людей в экстремальных условиях.

Однако, несмотря на то, что семакса более 10-и лет применяется в клинической практике, механизм его действия до настоящего времени окончательно не выяснен. Важнейшим аспектом для понимания центральных эффектов пептида является оценка его способности проникать через ГЭБ. Была проведена серия экспериментов с использованием меченного тритием семакса. Исследования показали, что после внутривенного введения в головной мозг экспериментальных животных проникает 0.01% введенного пептида [Potaman et al., 19916]. Эти данные сравнимы с величинами, описанными для другого аналога АКТГ4.ю- Org 2766 (0.004%) [Ашмарин и др., 1997].

Исследование устойчивости семакса к действию протеаз сыворотки крови показало, что первым шагом деградации молекулы является отщепление N-концевого метионина. При этом образуется достаточно стабильный интермедиат Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro [Potaman et al., 1991a, Potaman et al., 1993]. Изучение деградации пептида в присутствии плазматических мембран нервных клеток, а также в культуре глиальных и нервных клеток, полученных из переднего мозга крысы, показало, что во всех случаях деградация семакса происходит как с N-, так и с С-конца. Однако расщепление пептида с N-конца пептидной цепи идет более интенсивно. В присутствии всех трех объектов основным путем деградации является отщепление С- и N-концевых дипептидов и образование пентапептидов HFPGP и MEHFP [Zolotarev et al., 2006].

Далее были предприняты попытки выявить рецепторное связывание семакса с препаратами плазматических мембран нейронов и глиальных клеток мозга крыс и целыми нейронами. Было показано, что семакс способен связываться с мембранами нервных клеток базальных ядер переднего мозга крыс, причем это связывание специфично и обратимо. Вопрос о принадлежности данных центров связывания к семейству известных МС рецепторов требует дальнейшего исследования [Dolotov et al., 2006а, б].

Существует предположение, что эффекты семакса связаны с изменением активности ацетилхолинергической системы. Введение пептида в дозе 150 мкг/кг вызывает увеличение активности ацетилхолинэстеразы в гиппокампе и белом веществе головного мозга более чем в 2 раза. Действие препарата наблюдается в течение 2-3 часов после инъекции. В других отделах мозга активация не наблюдалась [Алексидзе и др., 1983].

Показано также влияние семакса на обмен моноаминов в мозге. При однократном внутрибрюшинном введении в дозах 150 и 600 мкг/кг семакс увеличивает содержание дофамина, серотонина и его метаболита 5-оксииндолуксусной кислоты. Эффект наблюдался в течение 24 часов после введения пептида. При хроническом ежедневном введении семакса в дозе 600 мкг/кг (1 раз в сутки) в течение 7 дней наблюдалась тенденция к снижению уровня дофамина и достоверное уменьшение содержания серотонина в гипоталамусе. Полученные данные свидетельствуют об ускорении оборота серотонина, отражающем увеличение функциональной активности этой медиаторной системы [Еремин и др., 2002; 2004а]. Показано также, что предварительное введение семакса потенцирует эффекты D-амфетамина на ДА систему стриатума и локомоторную активность крыс. Авторы предполагают, что семакс повышает ДА передачу в стриатуме [Еремин и др., 20046].

Показано также, что введение семакса полностью предотвращало увеличение содержания N0 в модели глобальной ишемии у крыс и уменьшало неврологический дефицит, вызванный инсультом [Bashkatova et al., 2001].

Изучение влияния семакса на уровень экспрессии нейротрофических факторов показало, что пептид повышает экспрессию нейротрофинов NGF и BDNF в культуре глиальных клеток [Shadrina et al., 2001]. Дальнейшие исследования показали, что интраназальное введение семакса крысам приводит к увеличению содержания BDNF в гиппокампе и базальных ядрах переднего мозга крысы [Долотов и др., 2003; Dolotov et al., 2006а, б].

Исследование механизмов нейропротекторного действия семакса в остром периоде ишемического инсульта подтвердили целесообразность включения пептида в комплекс интенсивной терапии инсульта и позволили выявить механизмы действия препарата. Была установлена иммуномодуляторная и нейротрофическая активность семакса, сдвигающая баланс пептидергической системы мозга в сторону преобладания противовоспалительных и трофических факторов (IL-10) над факторами, поддерживающими воспалительную реакцию (IL-8, С-реактивный белок) [Мясоедов и др., 1999]

В настоящее время препарат семакс широко используется в клинике для лечения различных заболеваний ЦНС. Однако, вероятно, лечебный потенциал семакса не исчерпан, и в будущем могут быть выявлены новые показания к его применению [Ашмарин и др., 1997]. Так, анализ результатов, полученных в экспериментах на животных, позволяет предположить возможное положительное действие семакса при терапии таких заболеваний как нарушение внимания, сопровождающееся гипорактивностью, и синдрома Ретта [Tsai, 2007]. В последние годы проводятся исследования влияния семакса на патологические состояния, не связанные с повреждением нервной системы. Например, опыты, проведенные на лабораторных животных, показали, что семакс положительно влияет на течение острого панкреатита у крыс. Однократное в/б введение препарата в дозе 100 мкг/кг уменьшало летальность животных, снижало гиперферментацию, активацию перекисного окисления липидов, сосудистую проницаемость, улучшало микроциркуляцию и ускоряло заживление зон деструкции в поджелудочной железе [Иванов, Яснецов, 2000]. Изучение эффектов семакса на различных моделях язвообразования показало выраженное противоязвенное действие препарата [Иваников и др., 2002; Жуйкова и др., 2002]. Исследование влияния семакса на систему гемостаза показало, что пептид способен взаимодействовать с высокомолекулярным гепарином с образованием комплексного соединения, обладающего антикоагулянтными и фибринолитическими свойствами как в условиях in vitro, так и in vivo при внутривенном введении. Авторы предполагают, что семакс, особенно в комплексе с гепарином, может быть перспективным антитромботическим средством [Ляпина и др., 2000]. Получены данные о возможном противовоспалительном действии семакса. Было показано, что семакс способен изменять активность нейтрофилов человека, влияя на обмен ионов кальция [Асташкин и др., 2000].

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что семакс обладает целым комплексом положительных эффектов на ЦНС. Препарат стимулирует функции переднего мозга: усиливает избирательное внимание в момент восприятия информации, улучшает консолидацию памяти, повышает способность к обучению. При этом, в отличие от большинства ноотропных препаратов непептидной природы, этот препарат не вызывает истощения соответствующих функций. Семакс увеличивает адаптационные возможности мозга, повышая его устойчивость к стрессорным повреждениям, гипобарической и сосудистой гипоксии, способствует уменьшению тяжести последствий экспериментального ишемического инсульта у животных. Клинические испытания показали высокую эффективность семакса при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза [Ашмарин и др., 1997; Ashmarin et al., 1995].

Несмотря на то, что семакс уже более десяти лет используется в клинической практике, до настоящего времени не определен спектр физиологической активности препарата, не исследованы механизмы, лежащие в основе его пролонгированного действия, не выявлено значения отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его нейротропных эффектов.

Целью представленной работы являлось изучение спектра физиологической активности семакса и оценка зависимости эффектов препарата от структуры.

Перед нами были поставлены следующие задачи:

1. исследование зависимости ноотропных эффектов семакса от времени, дозы, способа введения и вида подкрепляющего раздражителя;

2. изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных;

3. исследование протекторного действия пептида на фоне фармакологически-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга;

4. оценка последствий хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс;

5. изучение влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс в покое и при действии сенсорных раздражителей;

6. исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях;

7. изучение взаимодействия пептида с опиоидной системой мозга;

8. исследование влияния модификации N-концевой области молекулы семакса на сохранение и длительность его ноотропного действия;

9. изучение зависимости анальгетических эффектов ряда синтетических МК от структуры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на самцах нелинейных белых крыс (массой 180-250 г) и мышей (массой 25-30 г). Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде и соблюдением 12-ти часового светового режима дня (искусственное освещение с 9 до 21 часа). Эксперименты, представленные в главе 4, проводились на детенышах белых крыс обоего пола. Крысята каждого выводка содержались в отдельной клетке вместе с матерью до достижения ими месячного возраста, после чего крысят делили на самцов и самок и отсаживали от матери. Каждый выводок делили на опытных и контрольных крыс. В опытах использовали следующие препараты:

- гептапептид Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), синтезированный в Секторе регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН;

- синтетические аналоги N-концевых фрагментов АКТГ:

Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (EHFPGP), His-Phe-Pro-Gly-Pro (HFPGP), Phe-Pro-Gly-Pro (FPGP), Lys-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (KEHFPGP), Trp-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (WEHFPGP), Ser-Glu-His-Phe-Pro-GIy-Pro (SEHFPGP), Ala-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (AEHFPGP), Thr-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (TEHFPGP), Gly-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (GEHFPGP), rMet-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (rMEHFPGP), где r - остаток глюконовой кислоты, Glu-Arg-Pro (ERP).

Все использованные синтетические аналоги меланокортинов синтезированы в секторе регуляторных пептидов ИМГ РАН;

- N-концевые фрагменты АКТГ:

АКТПмо Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (MEHFRWG) (фирма Sigma), АКТГ5.10 Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (EHFRWG) (фирма Sigma);

- налоксон (naloxone, фирма Sigma) - блокатор опиоидных рецепторов;

- морфин - агонист опиоидных рецепторов;

- ципрогептадин (cyproheptadin, фирма Sigma) - неселективный блокатор серотониновых рецепторов;

- галоперидол (Гедеон Рихтер А.О., Венгрия)- неселективный блокатор рецепторов дофамина (Д1 и Д2);

- МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина гидрохлорид, C12H15N-HCI), нейротоксин, избирательно поражающий ДА-нейроны черной субстанции мозга, синтезирован в Институте Фармакологии РАМН.

Исследуемые препараты вводили в водном растворе внутрибрюшинно (в объеме 1 мл/кг) или интраназально (в объеме 0.1 мл/кг). Контрольные животные получали инъекцию растворителя в эквивалентном объеме в соответствующие сроки.

Оценку поведения и болевой чувствительности животных проводили с использование стандартных методов исследования (см., Буреш и др., 1991; Behavioural Neuroscience, a Practical Approach, 1993).

Методы оценки двигательной активности, исследовательского поведения, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения животных

Тест "Открытое поле"

Открытое поле" представляет собой арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга. Арена окружена стенкой высотой 40 см. Над ареной на высоте 80 см помещена красная лампа мощностью 15 Вт, яркая лампа мощностью 200 Вт и электрический звонок. Опыты проводились в трех различающихся по уровню сенсорной нагрузки модификациях - "бесстрессорной" (в тишине, при свете красной лампы, в течение 2-х мин), "стрессогенной" (при ярком свете и звуке электрического звонка, в течение 2-х мин) и со сменой освещенности. В последнем случае за основу был взят метод, предложенный Родиной с соавторами [Родина и др., 1993] и предполагающий оценку поведения в течение 5 мин. При этом первые 3 мин был включен яркий свет; затем вместо яркой лампы на 1 мин с включали красную, после чего восстанавливали исходный уровень освещенности.

При тестировании животное помещали в центр арены и визуально оценивали следующие показатели:

- латентный период выхода из центра поля;

- горизонтальную двигательную активность (пробег) - число пройденных секторов;

- вертикальную двигательную активность (стойки) - число подъемов на задние лапы;

- количество выходов в центр поля - число пересечений внутренней концентрической окружности;

- число умываний (груминг) - число касаний морды передними лапами.

Тест "норковая камера".

Экспериментальная установка представляет собой квадратную арену с круглыми отверстиями в полу, расчерченном на квадраты. В ходе экспериментов были использованы 2 различные экспериментальные камеры - НК1 и НК2. НК1 - деревянная камера размером 40x40x30 см с 13 отверстиями в полу, который расчерчен на 9 квадратов. НК2 - металлическая камера размером 47x47x27 см с 16 отверстиями, пол расчерчен на 16 квадратов. Использование двух различных установок позволяло при повторном тестировании изучать реакцию животного на новые экспериментальные условия. В ходе опыта животное помещали в угол камеры и в течение 3-х минут визуально регистрировали следующие показатели:

- латентный период выхода из стартового квадрата;

- горизонтальная двигательная активность (пробег) число пересеченных квадратов;

- число обследованных отверстий (норки);

- вертикальная двигательная активность (стойки) число подъемов на задние лапы;

- количество умываний (груминг)- число касаний морды передними лапами.

Опыты проводились в тишине при свете красной лампы.

Тест "Приподнятый крестообразный лабиринт"

Экспериментальная камера состоит из четырех расходящихся из центра рукавов (длина 35 см, высота стенок 20 см). Два противоположных рукава затемнены и закрыты с торцов стенками; два других - освещены и открыты. Лабиринт устанавливали на высоте 50 сантиметров от пола. Крысу помещали в центр лабиринта и в течение 3 минут регистрировали следующие показатели:

- латентный период захода в закрытый рукав;

- общее время нахождения на свету;

- количество выходов на открытые рукава;

- количество свешиваний с открытых рукавов лабиринта;

- вертикальная двигательная активность (стойки)- число подъемов на задние лапы;

- количество умываний (груминг) - число касаний морды передними лапами.

Темная - светлая камера".

Экспериментальная камера (48x24x40 см) разделена на 2 равных отсека перегородкой с отверстием. Один отсек ярко освещен, другой - затемнен. Крысу помещали в освещенный отсек и регистрировали латентный период перехода в темный отсек камеры, а также суммарное время, проведенное в светлом отсеке за 3 мин тестирования.

Метод "принудительного плавания"

Метод "принудительного плавания" применяется для выявления антидепрессантных свойств фармакологических препаратов. Тестирование проводилось в цилиндрической емкости объемом 25 л на 2/3 заполненной водой (t=27-28°С). Животное помещалось в воду и в течение 10 минут визуально регистрировались следующие параметры:

- суммарная длительность активного плавания - крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости;

-суммарная длительность иммобилизации - животное неподвижно или совершает движения, направленные только на поддержание тела на поверхности воды;

- суммарная длительность клайминга - крыса совершает активные движения передними лапами, пытаясь выбраться из воды (карабкается по стенке сосуда);

- длительность первого периода активного плавания;

- латентный период первой иммобилизации;

- число периодов активного плавания;

- число периодов иммобилизации, -число периодов клайминга.

Методы оценки способности животных к обучению.

Выработка условного рефлекса пассивного избегания болевого раздражителя (УРПИ)

Обучение проводилось в экспериментальной камере (размерЗ0x22x3 5 см), разделенной перегородкой с отверстием на два отсека: один - ярко освещенный, другой

- затемненный. Камера устанавливалась на решетчатый металлический пол, подсоединенный к источнику тока. В первый день эксперимента животное помещали в освещенный отсек камеры и регистрировали латентный период перехода в темный отсек, в котором крысу подвергали неизбегаемому удару электрическим током длительностью 3 сек. Напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного по вокализации (в диапазоне 60-90 В), частота составляла 50 Гц, длительность - 10 мсек. После отключения тока крысу оставляли в затемненном отсеке на 20 секунд. Через 72 часа проводили проверку выработки навыка пассивного избегания болевого раздражителя. Животное на 3 минуты помещали в светлый отсек камеры и регистрировали латентный период перехода в темный отсек (ЛП), суммарное время, проведенное в светлом отсеке. Препараты вводили в первый день до сеанса обучения.

Выработка условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя ГУ РАИ).

Обучение проводили в экспериментальной камере (размер 30x22x35 см) с решетчатым полом, в углу которой на высоте 25 см находилась полка. На пол камеры подавали электрический ток со стимулятора ЭСЛ-2. Условным раздражителем служил звук звонка; безусловным - удар тока (напряжение подбиралось индивидуально для каждого животного в диапазоне 70-100 В, частота составляла 200 Гц, длительность - 1 мсек). Продолжительность звучания звонка составляла 3 сек. Через 2 сек после его выключения подавался безусловный раздражитель. Условной реакцией являлся прыжок на полку. Если избавление не наступало в течение 30 сек, то напряжение отключали. Длина временных интервалов между сочетаниями колебалась случайным образом в пределах 7-30 секунд. В работе использовали четырехдневную и двухдневную схемы выработки У РАИ. В первом случае каждое животное в течение 4-х дней получало по 10 предъявлений условного раздражителя. Препараты вводили ежедневно перед сеансом обучения. В случае двухдневной схемы каждое животное ежедневно получало по 15 предъявлений условного раздражителя. Препараты вводили только перед первым сеансом обучения.

В качестве показателей выработки УРАИ использовали:

- количество выполненных реакций (КВР) - число избеганий болевого раздражителя, т.е. число прыжков на полку до включения тока, в ответ на условный сигнал;

- число межсигнальных реакций (МСР) - число прыжков на полку до включения условного раздражителя;

- количество невыполненных реакций (КНР) - число случаев, когда животное не запрыгивало на полку в течение 20 секунд действия болевого раздражителя.

Выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте.

Выработку условной реакции с пищевым подкреплением проводили в Т-образном лабиринте (размер рукавов лабиринта - 30x10 см; размер стартовой камеры - 20x10 см). В первый день эксперимента крыс помещали в лабиринт на 20 минут для угашения ориентировочно-исследовательской реакции. Затем крыс не кормили в течение суток. В последующие 4 дня проводилось обучение: каждое животное помещали в стартовую камеру лабиринта 5 раз подряд каждый день. В качестве пищевого подкрепления использовали хлеб, который помещали в один из отсеков лабиринта. После взятия подкрепления или спустя 3 минуты животное извлекалось из лабиринта. Ежедневно регистрировали:

1) латентный период (среднее время выхода из стартовой камеры из 5 посадок животного в лабиринт);

2) время реакции (среднее из 5 посадок время от момента посадки в лабиринт до момента взятия подкрепления);

3) число ошибок (число заходов в неподкрепляемый отсек);

4) количество выполненных реакций (число заходов в подкрепляемый отсек и съедания подкрепления).

Кроме того, подсчитывали средний ЛП и среднее BP за весь период обучения, а также суммарное КВР и суммарное число ошибок за все дни эксперимента. В дни опыта животных кормили один раз в сутки, через час после обучения. Вещества вводили ежедневно перед сеансом обучения.

Выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в сложном лабиринте.

Сложный лабиринт представляет собой квадратную камеру, разделенную пятью прозрачными перегородками на 6 коридоров. В каждой перегородке имелось прямоугольное отверстие. Перед экспериментом животных подвергали 24-часовой пищевой депривации. За сутки до обучения крыс помещали в лабиринт на 30 мин с целью адаптации и угашения ориентировочно-исследовательской реакции. В последующие 4 дня животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х минут. В ходе обучения визуально регистрировали следующие показатели:

- количество выполненных реакций - число случаев, когда животное находит подкрепление в течение 3-х минут пребывания в лабиринте;

- количество ошибок - число любых отклонений от правильной траектории движения;

- время выполнения реакции.

В дни опыта животных кормили один раз в сутки через час после эксперимента. Методы оценки уровня физической выносливости.

Уровень физической выносливости крысят в возрасте 18-20 дней оценивалась по следующим показателям:.

- время удержания на вертикальном стержне (стержень диаметром 9 мм, жестко закрепленный на высоте 28 см от поверхности стола);

- время удержания на неподвижном горизонтальном стержне (стержень диаметром 5 мм, жестко закрепленный на высоте 19 см от поверхности стола);

- время удержания на подвижном горизонтальном стержне (деревянный стержень диаметром 7 мм, расположенный горизонтально на высоте 22 см и имеющий возможность свободно качаться в нескольких направлениях - "качели").

В тестах животное помещали на деревянный стержень с шероховатой поверхностью таким образом, чтобы оно было лишено иной опоры, и регистрировали время от момента посадки до падения.

Тест "вертикальная сетка"

Статическую физическую выносливость животных в возрасте двух месяцев оценивали в тесте "вертикальная сетка". Экспериментальная установка представляет собой проволочную сетку с ячейками 1.5x1.5 мм, площадью 30x60 см. Сверху и с боков сетка ограничена деревянными стенками. Установку располагали на краю стола. При тестировании животное помещают на сетку и регистрируют время, прошедшее с момента посадки на сетку до момента падения. Каждую крысу тестировали три раза, при обработке данных полученные результаты усредняли.

Методы оценки болевой чувствительности животных

Для оценки болевой чувствительности животных использовали следующие тесты - тест "отдергивание хвоста", тест "сдавливание задней лапы", тест "горячая пластина" и модель висцеральных болей - метод "корчи".

Тест "отдергивание хвоста"

Болевое раздражение крысе наносили путем погружения хвоста на 4 см в горячую воду с температурой 56° С. Уровень болевой чувствительности определяли по латентному периоду одергивания хвоста. Измерения проводили в течение 30 минут до и 120 минут после введения препарата, с интервалом 15 минут (3 измерения исходной и 8 измерений приобретенной болевой чувствительности). Первое измерение приобретенной болевой чувствительности проводили через 15 мин после инъекции.

Тест "сдавливание задней лапы"

Уровень болевой чувствительности в данном тесте определяли по величине критического давления на заднюю лапу крысы (ВКД). Измерение проводилось с помощью анальгезиметра фирмы "Ugo Basile". Задняя лапа крысы помещалась на маленькую подставку-диск. Сверху к лапе (в центре стопы) прикасался пластиковый конус, жестко связанный с направляющим стержнем прибора. На стержень нанесены деления, служащие для измерения ВКД. После включения прибора по направляющему стержню начинает перемещаться грузик (скорость 1 деление/сек); давление вершины конуса на поверхность лапы равномерно нарастает. В момент возникновения болевых ощущений крыса отдергивает лапу. При этом регистрируется расстояние, пройденное грузиком по стержню. 1 условная единица длины соответствует увеличению давящей нагрузки на 20 г.

Измерения ВКД проводили в течение 30 минут до и 2-х часов после введения препарата с интервалом 15 минут (3 измерения исходной и 8 измерений приобретенной болевой чувствительности). Первое измерение приобретенной болевой чувствительности проводили через 15 мин после инъекции. Тест "горячая пластина"

В тесте "горячая пластина" (Ugo Basile, Italy) животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53° С. Регистрировали латентный период поведенческой реакции на болевой раздражитель - время от момента посадки до первого облизывания задней лапы. В опытах на крысах латентный период реакции определяли в течение 30 мин до введения препаратов с интервалом 15 мин (3 измерения исходной болевой чувствительности). В опытах на мышах исходную болевую чувствительность регистрировали 2 раза с интервалом 15 мин.

После введения препарата определение болевой чувствительности проводили через 15, 30 и 45 мин (1-ая серия опытов), через 30, 45 и 60 мин (2-ая серия) и через 75, 90 и 105 мин (3-я серия). Такое проведение экспериментов связано с тем, что животное нежелательно многократно помещать на "горячую пластину". При повторных измерениях у крысы нарушается адекватная поведенческая реакция на болевой раздражитель.

При анализе результатов, полученных в тестах "отдергивание хвоста", "сдавливание задней лапы" и "горячая пластина", для вычисления фоновой болевой чувствительности исходные значения усредняли. При статистической обработке данных для каждого животного при каждом измерении вычисляли относительное изменение болевой чувствительности по формуле:

Р~ Ро)/(Ртах — Ро)х100, где Pi - величина болевого порога при измерении, Ро - фоновая болевая чувствительность, Ртах - максимальная длительность болевого раздражения [Akil, 1975]. Для тестов "горячая пластина" и "отдергивание хвоста" она составляла - Ртах=30 сек, для теста "сдавливание задней лапы" - Ртах=25 усл. ед. Модель висцеральных болей - метод "корчи"

Исследование болевой чувствительности методом "корчи" проводили на мышах. Животным, предварительно получившим инъекцию семакса или растворителя, внутрибрюшинно вводили 0.6% раствор уксусной кислоты в объеме 0.1 мл/10 г. Затем мышей помещали в индивидуальные прозрачные пластиковые камеры и через 5 минут после введения кислоты подсчитывали количество корчей в течение двух последовательных 10-минутных интервалов. При статистической обработке сравнивали среднее числа корчей за каждые 10 мин и суммарное количество корчей. Проводили две серии экспериментов: в первой серии исследуемые препараты вводили за 25 мин, во второй - за 35 мин до введения уксусной кислоты.

Исследование изменений поведения и болевой чувствительности животных, вызванных стрессогенньш воздействием.

При изучении стресс-вызванных изменений поведения и болевой чувствительности животных в качестве стрессогенного воздействия использовали метод "принудительного плавания". Эксперименты проводили на крысах и мышах.

В случае исследования последствий стрессогенного воздействия у крыс для оценки болевой чувствительности использовали тест "сдавливание задней лапы", для оценки уровня тревожности и исследовательской активности - тест "норковая камера". Предварительно у животных измеряли исходную болевую чувствительность (3 измерения с интервалом 15 мин). За 15 мин до начала стрессогенного воздействия крысам вводили исследуемые препараты. Затем крыс подвергали "принудительному плаванию" при температуре 28-30°С длительностью 5 или 10 мин. Регистрацию болевой чувствительности начинали через 5 мин после окончания плавания и проводили каждые 15 мин в течение часа. Измерение параметров поведения проводили через 20 мин после окончания стрессогенного воздействия.

При исследовании стресс-вызванной анальгезии у мышей для оценки болевой чувствительности использовали тест "горячая пластина". Предварительно у животных измеряли исходную болевую чувствительность (2 измерения с интервалом 15 мин). За 15 мин до начала стрессогенного воздействия мышам вводили исследуемые препараты. Затем животных подвергали "принудительному плаванию" (t=28-30°C) длительностью 10 мин, 3 мин или 45 сек. Приобретенную болевую чувствительность регистрировали через 5 и 20 мин после плавания.

Регистрация электрокардиограммы крыс

Для регистрации ЭКГ животным под кожу вводили два проволочных электрода. Операция проводилась под легким эфирным наркозом за трое суток до основного эксперимента. Электроды изготавливались из мягкой стальной проволоки диаметром 1 мм. Электроды размещались на уровне верхних грудных позвонков ближе к передней левой конечности и на уровне верхних поясничных позвонков ближе к правой нижней конечности. Электроды пропускались под кожей животного на участке около 5 мм, их концы загибались на наружной поверхности кожи. Подкожное введение отрезков проволоки не вызывало воспалительных явлений, и после окончания серии измерений электроды легко удалялись.

На следующий день после операции крысы адаптировались в камере регистрации в течение 30 минут при свете красной лампы в тишине. Животное помещалось в экранированную камеру размером 15x25x30 см, на дно которой были насыпаны опилки из клетки, где оно содержалось. Над камерой размещались красная лампа мощностью 15 Вт и яркая лампа мощностью 200 Вт.

Через двое суток после операции исследовалось влияние препаратов на ЭКГ крыс в покое. Регистрация ЭКГ проводилась с помощью программы CONAN на ЭВМ IBM РС/АТ-386, обработка данных осуществлялась с помощью программы для анализа и записей ЭКГ "RR". Крыса помещалась в экранированную камеру. Электроды через усилитель соединялись с аналого-цифровым преобразователем компьютера. Оцифровка аналоговых сигналов проводилась с частотой 300 Гц.

Регистрация ЭКГ начиналась через 5 минут после помещения крысы в экранированную камеру, условия регистрации были аналогичны условиям адаптации. Фоновая запись повторялась 3 раза с интервалом в 15 минут, при этом животное каждый раз извлекалось из камеры. После третьей записи животным вводили исследуемые препараты. Спустя 15, 30, 45 и 60 минут после инъекции вновь регистрировали ЭКГ. Длительность каждой записи составляла 150 сек.

На следующие сутки после записи ЭКГ в покое проводили исследование изменения ЭКГ в ответ на стрессирующее воздействие низкой интенсивности на фоне действия пептидов. В качестве стрессирующего воздействия использовали включение яркой лампы на 6 сек. До введения веществ трижды регистрировали фоновые значения ЭКГ. После третьей регистрации крысам вводили исследуемые препараты и регистрировали ЭКГ еще 4 раза с интервалом в 15 мин. В ходе каждой регистрации запись ЭКГ проводилась в течение 150 сек, при этом первые 6 сек запись проводилась в тишине и при свете красной лампы, затем на 6 сек включали яркий свет, после выключения которого регистрация продолжалась в бесстрессорных условиях. При обработке данных анализировались интервалы записи длительностью 3 сек.

Статистическая обработка данных

При обработке результатов использовались стандартные методы статистического анализа. Вычислялись средние, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего массивов данных. При сравнении характеристик массивов применяли как параметрические (ANOVA), так и непараметрические (Фишера, % ) критерии. Кроме того, использовали метод корреляционного анализа. Названные операции и оценка форм распределений массивов осуществлялись с помощью пакета статистических программ STATISTIKA.

При обработке результатов, полученных на детенышах крыс, значения параметров поведения для каждого выводка нормировали к собственному контролю, что было связано с вариабельностью показателей поведения крыс различных выводков. Отличия между контролями разных выводков не достигали уровня значимости, однако приводили к увеличению дисперсии показателей.

На рисунках представлены данные в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Различия между группами считали достоверными при вероятности ошибки р< 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Оценка спектра физиологической активности семакса

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Левицкая, Наталья Григорьевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лекарственные препараты, разработанные на основе пептида семакс, - "Семакс-0.1% раствор" и "Семакс-1% раствор" - широко применяется в клинической практике. Однако, несмотря на это, до настоящего времени не был определен полный спектр физиологической активности пептида, не исследованы механизмы, лежащие в основе его пролонгированного действия, не выявлено значения отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его нейротропных эффектов. Целью представленной работы являлось изучение спектра физиологической активности семакса, как основа для расширения показаний к клиническому применению лекарственных препаратов, сопоставление эффектов пептида с эффектами природных меланокортинов и оценка зависимости эффектов препарата от структуры, что необходимо для направленного конструирования новых пептидов с заданным спектром физиологической активности.

Исследования ноотропного действия семакса, проведенные ранее в нашей лаборатории, показали, что этот пептид улучшает обучение животных. При этом длительность его действия составляет не менее 20 часов, что значительно превышает длительность ноотропных эффектов его природного прототипа АКТГ4.10 [Пономарева-Степная и др., 1984]. Семакс улучшает обучение животных как при внутрибрюшинном, так и при интраназальном введении в организм [Ashmarin et al., 1995]. В представленной работе нами был проведен более детальный анализ ноотропных эффектов семакса. Проведенные эксперименты позволили заключить, что влияние пептида на процессы обучения и длительность его ноотропного действия не зависят от знака подкрепляющего раздражителя. Эффективность ноотропного действия семакса выше при интраназальном, чем при внутрибрюшинном введении в организм. Вероятно, это связано с тем, что при и/н введении пептид быстрее достигает ЦНС и меньше подвергается ферментативной деградации в кровеносном русле. Таким образом при и/н введении семакса в более низких дозах, чем при в/б, достигается необходимая для проявления нейротропного действия концентрация пептида в мозге. Проведенные нами исследования подтвердили преимущества интраназального введения семакса, как наиболее эффективного и неинвазивного пути введения пептида в организм.

Оценка влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных показала, что при однократном введении семакс не влияет на исследовательское поведение и уровень тревожности животных. При хроническом введении пептид оказывает анксиолитическое и антидепрессантное действие.

Поскольку улучшение обучения животных было зарегистрировано во многих экспериментах после однократного введения семакса, можно заключить, что влияние пептида на обучение не связано с его анксиолитическим действием. Вероятно, как и в случае природных МК, в основе ноотропного действия пептида лежит его влияние на внимание, восприятие экспериментальной обстановки, мотивации и (или) консолидацию памятного следа [De Wied, 1993; Kovacs, De Wied, 1994; Flood et al., 1976].

Изучение эффектов семакса на фоне нарушений ДА-ергической системы мозга, вызванных введением нейротоксина МФТП, позволило продемонстрировать нейропротекторное действие пептида. Повреждения ДА-системы мозга животных, вызванные МФТП, являются экспериментальной моделью болезни Паркинсона. Зарегистрированные нами в этих экспериментах положительные эффекты семакса свидетельствуют о возможности использования лекарственных препаратов, разработанных на основе этого пептида, при лечении паркинсонизма. При этом необходимо использовать более высокие дозы препарата, чем для достижения ноотропных эффектов ("Семакс-1% раствор").

Исследование отставленных эффектов хронического введения семакса детенышам белых крыс показало, что животные, получавшие пептид в первые три недели жизни, характеризуются сниженной тревожностью и высокой способностью к обучению. Снижение тревожности животных, получавших семакс, являются результатом компенсации отрицательных последствий неонатального стресса, а в основе отставленных воздействий пептида на обучение животных лежат другие механизмы, не связанные с изменением реакции животных на стрессогенные воздействия. Таким образом, как в случае неонатального введения семакса, так и при введении пептида взрослым животным, влияние семакса на обучение и его воздействие на уровень тревожности экспериментальных животных определяются различными механизмами. Проведенные нами исследования отставленных эффектов неонатального введения семакса детенышам белых крыс показали положительное влияние пептида на способность к обучению и уровень тревожности взрослых животных. При этом не было отмечено влияния пептида на показатели физического развития крыс. Важность полученных нами результатов определяется тем, что в настоящее время разработан и внедрен в клиническую практику новый препарат на основе пептида семакс -"Минисем". Этот препарат предназначен для лечения неврологических заболеваний у новорожденных детей.

Проведенные нами эксперименты показали, что семакс обладает анальгетической активностью, причем пептид снижает болевую чувствительность животных эффективнее, чем АКТГ4.10. Изменения порога болевой чувствительности, вызванные введением семакса, не превышают 15-20% от максимально возможного эффекта, что не позволяет рассматривать этот препарат в качестве обезболивающего средства. Однако, если заболевания, при котором применяют семакс, сопровождаются болевым синдромом, анальгетическое влияние пептида может оказывать дополнительное позитивное воздействие.

В различных исследованиях семакс использовался нами в широком диапазоне доз -от 1.5 мкг/кг до 1.5 мг/кг веса тела. Проведенные эксперименты позволили определить зависимость ноотропных и анальгетических эффектов семакса от дозы препарата. Однако в большей части опытов пептид вводили в дозах 50 или 500 мкг/кг. При изучении влияния семакса на обучение животных было показано, что препарат оказывает ноотропное действие в дозах 15-100 мкг/кг [Ашмарин и др., 1997]. Эти данные и последующие клинические испытания позволили рекомендовать в качестве ноотропного препарата "Семакс-0.1% раствор". В дальнейшем эксперименты на животных и клинические исследования показали, что для проявления нейропротекторной активности (например, в случае ишемического инсульта) необходима большая доза семакса. На основании этих исследований был разработан и внедрен в клиническую практику нейропротекторный препарат "Семакс-1% раствор". Однако, до настоящего времени не проводилось детального изучения эффектов больших доз препарата в экспериментах на животных. Проведенные нами эксперименты позволяют охарактеризовать спектр эффектов семакса в дозах, соответствующих рекомендованным для однократного введения дозам лекарственных препаратов "Семакс-0.1% раствор" и "Семакс-1% раствор".

Как уже указывалось в обзоре литературы, МК обладают широким спектром экстрагормональных эффектов. Пептиды этого класса улучшают обучение и память, влияют на уровень тревожности и болевую чувствительность, оказывают нейротротекторное и нейротрофическое действие, обладают антиопиоидной и кордиотропной активностью, воздействуют на половое и пищевое поведение, оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие [Starowicz, Przewlocka, 2003; Adan, Gispen, 2000; Wikberg, 2000]. Как показали проведенные нами исследования, семакс, как и другие представители семейства меланокортинов, оказывает влияние на широкий круг физиологических функций организма. Этот пептид обладает ноотропной и анальгетической активностью, оказывает анксиолитическое, антидепрессантное и антиопиоидное действие, обладает нейропротекторной активностью и влияет на развитие ЦНС. В таблице 17 представлен спектр физиологической активности семакса в сравнении с другими природными и синтетическими МК. Как видно из таблицы, семакс сохраняет значительную часть спектра экстрагормональной активности природных МК. При этом пептид не обладает ни стероидогенной, ни меланоцитстимулирующей активностью [Пономарева-Степная и др., 1985]. Однако не наблюдается полного совпадения эффектов семакса ни с одним из представленных в таблице МК. Так, сравнение негормональных эффектов АКТГ, а-МСГ и семакса показывает, что эти пептиды характеризуются однонаправленным ноотропным, нейропротектороным, анальгетическим и антиопиоидным действием, но оказывают противоположное влияние на уровень тревожности и интенсивный груминг. Семакс и у-МСГ разнонаправлено влияют на обучение, кроме того, у-МСГ оказывает влияние на сердечно-сосудистую систему, а семакс не обладает кардиотропной активностью. В большинстве случаев эффекты семакса совпадают с эффектами его природного прототипа АКТГ4.10. Оба эти пептида улучшают обучение, обладают нейропротекторной и анальгетической активностью при периферическом введении, влияют на развитие нервной системы, не обладают кардиотропным действием. Однако на уровень тревожности эти пептиды влияют разнонаправлено. Наибольшее сходство можно отметить при сопоставлении эффектов семакса и аналога АКТГ4.9 ORG 2766. Но в доступной нам литературе мы пе обнаружили данных по взаимодействию этого аналога с опиоидной системой и его влиянию на болевую чувствительность при периферическом введении.

Открытие семейства МК рецепторов, разработка и исследование синтетических агонистов и антагонистов этих рецепторов способствовали выяснению механизмов, лежащих в основе физиологических эффектов пептидов этого класса. Однако до настоящего времени не выяснены механизмы ноотропных, нейропротекторных и нейротрофических эффектов МК, не определены рецепторы, опосредующие эти эффекты. Присутствие МСЗ и МС4 рецепторов в ЦНС позволило предположить их участие в реализации нейротропных эффектов МК [Hoi et al., 1995]. Был получен ряд данных, свидетельствующих в пользу такого предположения. Так, показано, что блокада MC4R препятствует проявлению нейротрофического эффекта а-МСГ [Adan et al., 1996]. Исследования взаимодействия семакса с МС рецепторами показало, что при внутримозговом введении этот пептид проявляет свойства антагониста MC4R [Adan et al., 1994]. Основываясь на этих данных, можно предположить либо отрицательное действие пептида при повреждении нервной системы, либо отсутствие

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Левицкая, Наталья Григорьевна, Москва

1. Алексеева Г.В., Боттаев Н.А., Горошкова В.В. Применение семакса в отдаленном периоде у больных с посттипоксической патологией мозга // Анестезиология и реаниматология.- 1999 (1).- с. 40-43.

2. Антонова и др., Пономарева-Степная М.А., Титов С.А., Каменский А.А. Влияние двух аналогов АКТГ на обучение и ориентировочное поведение белых крыс // Теоретические основы патологических состояний.-1980,- Л., «Наука».- с. 173-175.

3. Антонова Л.В., Каменский А.А., Незавибатько В.Н. Сравнение поведенческих эффектов кортикотропина и его фрагментов, лишенных гормональной активности // тезисы докладов симпозиума "Физиология пептидов".- 1988.- Ленинград.- с. 7-8.

4. Арефьева И.А. Изучение действия аналога АКТГ и тафтсина на клетки нервной системы млекопитающих // автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.- 1992.- М.- с. 1-25.

5. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г.,л i

6. Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са -ответы нейтрофилов человека // ДАН.- 2000.- т. 374 (3).- с. 401-403.

7. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Шелехов С.Л. Действие фрагмента адренокортикотропного гормона АКТГ(4-10) на обучение белых крыс при положительном подкреплении // ДАН СССР.- 1978.- т. 240 (5).- с. 1245-1247.

8. Ашмарин И.П., Антонова Л.В., Титов С.А., Максимова Л.А., Каменский А.А. Возможные механизмы разнонаправленного действия АКТГ4-10 и его аналога, содержащего D-изомер фенилаланина, на поведение // Журнал ВНД.- 1980.- т. 30 (6).- с. 1196-1202.

9. Балан П.В., Маклакова А.С., Крушинская Я.В., Соколова Н.А., Кудашов Н.И. Отставленные эффекты острой гипобарической гипоксии в эксперименте: влияниегептапептида семакс (AKTT4.7-PGP) // Акушерство и генекология.- 1999.- № 1.- с. 46-49.

10. Балезина О.П., Вардья И.В., Гуляев Д.В. Нейротрофическое действие пептидов а-МСГ и аналога АКТГ4.7 (семакса) на регенерацию аксонов периферического нерва // Нейрохимия.- 2002.- т. 19 (1).- с. 46-51.

11. Биохимия мозга. Под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В., Ещенко Н.Д. // С-Пб.-Изд-во С.-Петербургского университета.- 1999.- с. 328.

12. Богданов А.И., Багаева Т.Р., Фефелова Н.Н., Филаретов А.А. Стресс-вызванная анальгезия. Роль кортикостероидов. // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1995. -81 (3).-с. 61-67.

13. Виноградов В.М., Медведев В.И., Гречко А.Т., Бахарев В.Д., Пономарева-Степная М.А. Влияние на поведенческую активность крыс нейропептидов -фрагментов АКТГ и вазопрессина // Физиол. Журн. СССР.- 1980.- т. 66.- с. 419-415.

14. Вознесенская В.В., Полетаева И.И. Влияние АКТГ(4-10) на поведение мышей // Журн. ВИД.- 1984,- т. 34.- с. 32-37.

15. Геренко А.Н., Незавибатько В.Н., Волков А.В., Каменский А.А. Двигательная активность крыс в посреанимационном периоде // Вестн. МГУ, сер. 16, Биология.-1991 (3).- с. 24-30.

16. Гецова В.М., Орлова Н.В., Фоломкина А.А., Незавибатько В.Н. Влияние аналога АКТГ на процессы обучения и памяти у крыс // Ж. ВНД.- 1988.- т. 38 (6).- с 10411047.

17. Глебов Р.Н., Горячева Т.В. АКТГ как нейропептид. Функциональная роль в мозге. // Патол. физиология и эксп. тер.- 1990.- № 4,- с. 54-57.

18. Гомазков О.А. Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозга // 2006,-М., Изд-во «Икар».- 330 с.

19. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих // Молекулярная биология.- 1999.- т. 33 (1).- с. 120-126.

20. Гривенников И.А. Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний // автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.- 2006.- М.- с. 1-42.

21. Громов JT.A. Нейропептиды // 1992.- Киев: "Здоровье".- 248 с.

22. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL // Нейрохимия.- 2002.- т. 19 (3).- с. 202-205.

23. Еремин К.О., Кудрин B.C., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на дофамин- и серотонинергические системы мозга // ДАН.-2004а.- т. 394(1).-с. 1-3.

24. Жуйкова С.Е., Сергеев В.И., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. Влияние семакса на индометациновое язвообразование у крыс и один из возможных механизмов его действия // БЭБиМ.- 2002.- т. 133 (6).- 665-667.

25. Замятнин А.А. Специализированный банк данных EROP-Moscow о регуляторных олигопептидах с Internet-доступом // Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов.- М., 2003.

26. Иваников И.О., Брехова М.Е., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф., Ашмарин И.П. Опыт применения пептида семакс при лечении язвы желудка // БЭБиМ.- 2002.- т. 134 (7).-с. 83-84.

27. Иванов Ю.В., Яснецов В.В. Влияние семакса и мексидола на течение острого панкреатита у крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология,- 2000.- т. 63 (1).- с. 41-44.

28. Ивашкин Т.В., Шульпекова Ю.О. Нервные механизмы болевой чувствительности. // Рос. Журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.- 2002.- т. 12 (4).-с. 16-20.

29. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека.- 1992.- т. 18 (5).- с. 104-107.

30. Королева М.В., Мейзеров Е.Е., Незавибатько В.Н., Каменский А.А., Дубынин В.А., Яковлев Ю.Б. Изученеие анальгетического действия препарата семакс. // Фармакология и токсикология. -1996. с. 527-529.

31. Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В., Карабань Н.В. Компенсаторные и восстановительные процессы при паркинсонизме // 1995.- Киев.-изд-во "Книга".

32. Машковский М. Д. Лекарственные средства. 1997.- Харьков.- "Торсинг".

33. Мертвецов Н.П. Исследование белково-пептидных гормонов методами генной инженерии // Новосибирск : изд-во "Наука", 1999

34. Полунин Г.С., Нуриева С.М., Баяндин Д.Л., Шеремет Н.Л., Андреева Л.А. Определение терапевтической эффективности нового отечественного препарата «Семакс» при заболеваниях зрительного нерва // Вестник офтальмологии.- 2000.- т. 116(1).- с. 15-18.

35. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Аналог АКТГ4.10 -стимулятор обучения пролонгированного действия // Хим.-фарм. Ж.- 1984 (7).- с. 790-795.

36. Пономарева-Степная М.А., Порункевич Е.А., Скуиныш А.А., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Гормональная активность аналога АКТГ4.10 стимулятора обучения пролонгированного действия // БЭБиМ.- 1985.- № 3.- с. 267-268.

37. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.В., Андреева Л.А., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Декапептид седативного действия // Хим.-фарм. Ж.- 1986.- № 10.- с. 1195-1199.

38. Розен В.Б. Основы эндокринологии // М.: Изд-во МГУ, 1994.

39. Рыжавский Б.Я. Развитие головного мозга в ранние периоды онтогенеза: последствия некоторых воздействий // Соросовский образовательный журнал.-2000,-т. 6(1).-с. 37-43.

40. Угрюмов М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции // М.- «Наука». 1999.

41. Шилова О.Б., Полетаева И.И., Веретенников Н.А., Корочкин Л.И Влияние неонатального введения АКТГ4.10 на поведение и катехоламинэргическую систему мозга взрослых мышей различных линий // ДАН.- 1996.- т. 348 (5).- с. 715-718.

42. Acker G.R., Berran J., Strand F.L. ACTH neuromodulation of the developing motor system and neonatal learning in the rat // Peptides.- 1985.- v. 6 (2).- p. 41-49.

43. Adan R.A.H., Gispen W.H. Brain melanocortin receptors: from cloning to function // Peptides.- 1997.- v. 18.- p. 1279-1287.

44. Adan R.A.H., Gispen W.H. Melanocortins and the brain: from effects via receptors to drug targets // Eur. J. of Pharmacol.- 2000.- v. 405.- p. 13-24.

45. Adan A.H., Oosterom J., Ludvigsdottir G., Brakkee J.H., Burbach J.P.H., Gispen W.H. Identification of antagonists for melanocortin МСЗ, MC4 and MC5 receptors // Eur. J. Pharmacol.- 1994.- v. 269.- p. 331—337.

46. Allen J.P., Kendall J.W., McGilvra R., Vancura C. Immunoreactive ACTH in cerebrospinal fluid // J. Clin. Endocrinol.- 1974.- v. 38.- p. 486-493.

47. Al-Obeidi F., Castrucci A.M., Hadley M.E., Hruby V.J. Potent and prolonged acting cyclic lactam analogues of alphamelanotropin: design based on molecular dynamics. // J. Med. Chem.- 1989,- v. 32 (12).- p.2555-2561.

48. Alvaro J.D., Tatro J.B., Quillan J.M., Fogliano M., Eisenhard M., Lemer M.R., Nestler E.J., Duman R.S. Morphine down-regulates melanocortin-4 receptor expression in brain regions that mediate opiate addiction // Mol. Pharm.- 1996.- v. 50.- p. 583-591.

49. Alvaro J.D., Taylor J.R., Duman R.S. Molecular and behavioral interaction between central melanocortins and cocaine // J. Pharmacol. Exper. Ther.- 2003.- v. 304 (1).- p. 391-399.

50. Ambler.L., Bennet H.P., Hudson A.M, McMartin C. Fate of human corticotropin immediately after intravenous administration to the rat // J. Endocrinol.- 1982.- v. 93 (2).-p. 287-292.

51. Amir S. Effects of ACTH on pain responsiveness in mice: interaction with morphine // Neuropharmacology.-1981.- v. 20 (10).- p. 959-962.

52. Amir S., Galina Z.H., Blaiz R., Brown Z.W., Amit Z. Opiate receptors may mediate the suppressive but not the excitatory action of ACTH on motor activity in rats // Eur. J. Pharmacol.- 1980.- v. 66.- p. 307-313.

53. Anand K.J., Coskun V., Thrivikraman K.V., Nemeroff C.B., Plotsky P.M. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rats pups //Physiol. Behav.- 1999.- v. 66 (4).- p. 627-637.

54. Anand K.J. Effects of perinatal pain and stress // Prog. Brain Res.- 2000.- v. 122.- p. 117-129.

55. Anand K.J., Scalzo F.M. Can adverse neonatal experiences alter brain development and subsequent behavior? // Biol. Neonate.- 2000.- 77 (2).- p. 69-82.

56. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Kramer H.K., Strand F.L. Specificity versus redundancy of melanocortins in nerve regeneration // Ann. NY Acad. Sci.- 1994.- v. 739.- p. 60-73.

57. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Strand F.L. Rapid neurotrophic actions of an ACH/MSH(4-9) analogue after nigrostriatal 6-OHDA lesioning // Peptides.- 1993a.- v. 14 (6).-p. 1317-1324.

58. Antonawich F.J., Lee S.J., Strand F.L. Immunocytochemical localization of ACTH4-10 in the adult rat brain after 6-OHDA lesioning of the substantia nigra // Soc. Neurocsi. Abstr.- 19936,-v. 19.-N709.8.

59. Argiolas A., Melis M.R., Murgia S., Schioth H.B. ACTH- and cc-MSH-induced grooming, stretching, yawning and penile erection in male rats: site of action in the brain and role of melanocortin receptors // Brain Res. Bull.- 2000,- v. 51.- p. 425-431.

60. Artuc M., Grutzkau A., Luger Т., Henz B.M. Expression of MCI- and MC5-receptors on the human mast cell line HMC-1. // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1999.- v. 885.- p. 364-367.

61. Ashmarin I.P., Nezavibatko V.N., Levitskaya N.G., Koshelev V.B., Kamensky A.A. Design and investigation of an ACTH(4-10) analogue lacking D-amino acids and hydrophobic radicals //Neurosci. Res. Commun.- 1995.- v. 16.- p. 105-112.

62. Attella M.J., Hoffman S.W., Pilotte M.P., Stein D.G. Effects of BIM-22015, an analog ACTH(4-10), on functional recovery after frontal cortex injury // Behav. Neural. Biol.-1992.- v. 57 (2).- p. 157-166.

63. Azmitia E.C., De Kloet E.R. ACTH neuropeptide stimulation of serotonergic neural maturation in tissue culture: modulation by hippocampal cell // Prog. Brain Res.- 1987.-v. 50.- p. 689-697.

64. Baig A.H., Swords F.M., Szaszak M., King P.J., Hunyady L., Clark A.J. Agonist activated adrenocorticotropin receptor internalizes via a clathrin-mediated G protein receptor kinase dependent mechanism // Endocr. Res.- 2002.- v. 28 (4).- p. 281-289.

65. Bar P.R., Hoi E.M., Gispen W.H. Trophic effects of melanocortins on neuronal cells in culture // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1993.- v. 692.- p. 284-286.

66. Bars D., Gozariu M., Cadden S.W. Animal Models of Nociception. // Pharmacol. Rev.-2001.- v. 53.-p. 597-619.

67. Beaty P.A., Beatty W.W., Bowman R.E., Gilchrist J.C. The effects of ACTH, adrenalectomy and dexametasone on the acquisition of an avoidance response in rats // Physiol. Behav.- 1970.- v. 5.- p. 939-944.

68. Bernheimer H., Birkmayer W., Hornykiewicz 0. Et al. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson's and Huntington's diseases: clinical and neurochemical correlation // J. Neurol. Sci.- 1973.- v. 20.- p. 415-455.

69. Bertolini A., Gessa G.L., Vergoni W., Ferrari W. Induction of sexual excitement with intraventricular ACTH; permissive role of testosterone in the male rabbit // Life Science.-1968.- v. 7.-p. 1203-1206.

70. Bertolini A., Vergoni W., Gessa G.L., Ferrari W. Induction of sexual excitement by the action of adrenocorticotropic hormone in brain // Nature.- 1969.- v. 221.- p. 667-669.

71. Bertolini A., Poggioli R., Ferrari W. ACTH-induced analgesia in rats // Experientia.-1979.- v. 35 (9).- p. 1216-1217.

72. Bertolini A., Poggioli R., Fratta W. Withdrawal symptoms in morphine-dependent rats intracerebroventricularly injected with ACTH1-24 and with beta-MSH // Life Sci.-1981.-v. 29 (3).- p. 249-252.

73. Bhardwaj R, Becher E, Mahnke K, Hartmeyer M, Schwarz T, Scholzen T, Luger ТА. Evidence for the differential expression of the functional a-melanocyte-stimulating hormon receptor MC-1 on human monocytes // J Immunol, 1997, v.158, p. 3378-84.

74. Bijlsma W.A., Schotman P., Jennekens F.G., Gispen W.H., De Wied D. The enhanced recovery of sensorimotor function in rats is related to the melanotropic moiety of ACTH/MSH neuropeptides. // Eur. J. Pharmacol.- 1983.- v. 92 (3^).- p. 231-236.

75. Bocheva A., Dzambazova-Maxsimova E. Antiopioid properties of peptides of theTyr-MIF-1 family. // Methods Fund. Exp. Ckin. Pharmacol.- 2004a.- v. 26 (9).- p. 673-677.

76. Bocheva A.I., Dzambazova-Maxsimova E.B. Effects of Tyr-MIF's family of peptides on immobilization stress-induced antinociception. // Folia Med (Plovdiv).- 20046.- v. 46 (2).- p. 42-46.

77. Bohn L.M., Xu.F., Gainetdinov R.R., Caron M.G. Potentiated opioid analgesia in norepinefrine transporter knock-out mice. // J. Neurosci. -2000. -v. 20 (24). p. 90409045.

78. Bohus B. Pituitary-adrenal hormones and forced extinction of a passive avoidance response in the rat // Brain Res.- 1974.- v. 66.- p. 366-367.

79. Bohus B. Effects of ACTH-like neuropeptides on animal behavior and man // Current Rev. Pharmacol.- 1979.- v. 18.- p. 113-122.

80. Bohus В., De Wied D. Inhibitory and facilitatory effect of two related peptides on extinction of avoidance behaviour // Science.- 1966.- v. 153.- p. 318-320.

81. Bohus В., De Wied D. Actions of ACTH- and MSH-like peptides on learning, performance, and retention // In: Endogenous peptides and learning and memory processes, Academic press.- N. Y., London.-1981.- p. 60-74.

82. Bohus В., Endroczi E. The influence of pitutary-adrenocortical function on the avoiding conditioned reflex activity in rats // Acta Physiol. Acad. Scientiarum Hungaricae.- 1965.-v. 26.-p. 183-189.

83. Bohus В., Lissak K. Adrenocortical hormones and avoidance behaviour of rars // Int. J. Neuropharmacol.- 1968.- v. 7,- p. 301-306.

84. Bohus В., Nyakas C.S., Endroczi E. Effects of adrenocorticotropic hormone on avoidance behaviour of intact and adrenalectomized rats // Int. J. Neuropharmacol.-1968.- v.7.- p.307-314.

85. Born J., Unseld U., Pietrowsky R., Bickel U,. Voigt K., Fehm H.L. Time course of ACTH 4-10 effects on human attention // Neuroendocrinology.- 1990.- v. 52 (2).- p. 169174.

86. Boston B.A. The role of melanocortins in adipocyte function. // An. N.Y. Acad. Sci.-1998.- v. 885.- p. 75-84.

87. Boston B.A., Cone R.D. Characterization of melanocortin receptor subtype expression in murine adipose tissues and in the 3T3-L1 cell line. // Endocrinology.- 1996,- v. 137 (5).-p. 2043-2050.

88. Bousquet-Melou A,Galitzky J, Lafontan M, Berlan M. Control of lipolysis in intraabdominal fat cells of nonhuman primates: comparison with humans // J. Lipid Res.-1995.- v. 36.- p. 451-461.

89. Bravenboer B, Kappelle AC, van Buren T, Erkelens DW, Gispen WH. ACTH4-9 analogue ORG 2766 can improve existing neuropathy in streptozocin-induced diabetic rats. // Acta Diabetol.- 1993.- v. 30 (1).- p. 21-24.

90. Buggy J.J. Binding of alpha-melanocyte-stimulating hormone to its G-protein-coupled receptor on B-lymphocytes activates the Jak/STAT pathway. // Biochem. J.- 1998.- v. 331 (1).-p. 211-216.

91. Butler A.A., Kesterson RA., Khong K. et al., A unique metabolic syndrome causes obesity in the melanocortin-3 receptor-deficient mouse // Endocrinology.- 2000.- v. 141.-p. 3518-3521.

92. Cabeza de Vaca S., Kim G.Y., Carr K.D. The melanocortin receptor agonist MTII augments the rewarding effect of amphetamine in ad-libitum-fed and food-restricted rats // Psychopharmacology (Berl).- 2002.- v. 161 (1).- p. 77-85.

93. Catania A., Gatti S., Colombo G., Lipton J.M. Targeting melanocortin receptors as a novel strategy to control inflammation // Pharmacol. Rev.- 2004.- v. 56 (1).- p. 1-29.

94. Catania A., Lipton J.M. a-Melanocyte stimulating hormone in the modulation of host reactions. // Endocrine Reviews.- 1993.- v. 14 (5).- p. 564-576.

95. Catania A., Lipton J.M. Peptide modulation of fever and inflammation within the brain // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1998.- v. 856,- p. 62-68.

96. Catania A., Rajora N., Capsoni F., Minonzio F., Star R.A, Lipton J.M. The neuropeptide alpha-MSH has specific receptors on neutrophils and reduces chemotaxis in vitro. // Peptides.- 1996,- v. 17 (4).- p. 675-679.

97. Ceriani G., Diaz J., Murphree S., Catania A., Lipton J.M. The neuropeptide alpha-melanocyte-stimulating hormone inhibits experimental arthritis in rats. // Neuroimmunomodulation.- 1994.- v. 1 (1).- p. 28-32.

98. Chaki S., Ogawa S., Toda Y., Funakoshi Т., Okuyama S. Involvement of the melanocortin MC4 receptor in stress-related behavior in rodents // Eur. J. Pharmacol.-2003a.- v. 474(1).-p. 95-101.

99. Chalmers D.V., Levine S. The development of heart rate responses to weak and strong shock in the preweaning rat. // Dev. Psychobiol.- 1974.- v. 7 (6).- p. 519-527.

100. Chen W. The melanocortin-5 receptor // In Cone R.D., ed. The Melanocortin receptors.-Totowa, N.Y.,: Humana.- 2000.- p. 449-472.

101. Chen W., Kelly M.A., Opitz-Araya X., Thomas R.E., Low M.J., Cone R.D. Exocrine gland dysfunction in MC5-R-deficient mice: evidence for coordinated regulation of exocrine gland function by melanocortin peptides // Cell.- 1997.- v. 91.- p. 789-798.

102. Chhajlani V., Wikberg J.E.C. Molecular cloning and expression of the human melanocyte stimulating hormone receptor cDNA. // FEBS Letters.- 1992.- v. 309 (3).- p. 417-420.

103. Chhajlani V. Distribution of cDNA for melanocortin receptor subtypes in human tissues. // Biochem. and Mol. Biol. Int.- 1996.- v. 38 (1).- p. 73-80.

104. Chiao H, Foster S, Thomas R, Lipton J, Star RA. Alfa-melanocyte-stimulating hormone reduces endotoxin-induced liver inflammation // J Clin Invest.- 1996.- v.97.- p. 20382044.

105. Chiao H., Kohda Y., McLeroy P., Craig L., Housini I., Star R.A. Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against renal injury after ischemia in mice and rats. // J. Clin. Investigation.- 1997.- v. 99 (6).- p. 1165-1172.

106. Clark A.J., Baig A.H., Noon L., Swords F.M., Hunyady L., King P.J. Expression, desensitization and internalization of the ACTH receptor (MC2R) // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 2003.- 994.- p. 111-117.

107. Clarke A., File S.E. Social and exploratory behavior in the tar after septal administration of ORG 2766 and ACTH(4-10) // Psychoneuroendocrinology.- 1983.- v. 8 (3).- p. 343350.

108. Cone R.D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system // Nature Neuroscience.- 2005.- v. 8,- p. 571-578.

109. Contreras P.C., Takemori A.E. Antagonism of morphine-induced analgesia, tolerance and dependence by alpha-melanocite-stimulating hormone // J. Pharmacol. Exper. Ther.-1984.- 229(1).-p. 21-26.

110. Conzales M.I., Vaziri S., Wilson C.A. Behavioral effects of a-MSH and MCH after central administration in the female rat // Peptides.- 1996.- v. 17 (1).- p. 171-177.

111. Cragnolini A., Scimonelli Т., Celis M.E., Schioth H.B. The role of melanocortin receptors in sexual behavior in female rats // Neuropeptides.- 2000.- v. 34 (3-4).- p. 211215.

112. Cragnolini A.B., Schioth H.B., Scimonelli T.N. Anxiety-like behavior induced by IL-lbeta is modulated by alpha-MSH through central melanocortin-4 receptors // Peptides.-2006.-v. 27 (6).-p. 1451-1456.

113. Cremer M.C., de Barioglio S.R., Celis M.E. Interaction between alpha-MSH and acetylcholinergic system upon striatal cAMP and IP(3) levels // Peptides.- 2000.- v. 21 (5).-p. 699-704.

114. Daval J.L., Louis J.C., Gerard M.J., Vincendon G. Influence of adrenocorticotropic hormone on the growth of isolated neurons in culture. // Neuroscience Letters.- 1983.- v. 36 (3).-p. 299-304.

115. De Koning P., Gispen W.H. Org 2766 improves functional and electrophysiologic aspects of regenerating sciatic nerve in the rat // Peptides.- 1987.- v. 8.- p. 415-418.

116. De Wied D. Influence of anterior pitutary on avoidance learning and escape behavior // Am. J. Physiol.- 1964.- v. 7.- p. 307-314.

117. De Wied D. Inhibitory effect of ACTH and related peptides on extinction of conditioned avoidance brhaviour in rats // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1966.- v.122.-p.28-32.

118. De Wied D. Effects of peptide hormones on behaviour // Frontiers in Neuroendocrinology.- 1969.- p. 97-140.

119. De Wied D. Pituitary-adrenal system hormones and behaviour // The Neurosciences, Third Study Program, Press. Cambridge.- 1974.- p. 653-666.

120. De Wied D. Neurotrophic effects of ACTH/MSH neuropeptides. // Acta Neurobiologiae Experimentalis. (Warsz).- 1990.- v. 50 (4-5).- p. 353-366.

121. De Wied D. Melanotropins as neuropeptides // An. N.Y. Acad. Sci.- 1993 v. 680.- p. 20-28.

122. De Wied D. Neuropeptides in learning and memory processes // Behav. Brain Res.-1997.- v. 83.-p. 83-90.

123. De Wied D, Jolles J. Neuropeptides derived from proopiocortin: Behavioural, physiological, and neurochemical effects // Physiol. Rev.- 1982.- v. 62.- p. 976-1059.

124. De Wied D, Witter A, Greven HM. Commentary: behaviourally active ACTH analogues // Biochem. Pharmacol.- 1975.- v. 24.- p. 1463-1468.

125. Dempsey G.L., Kastin A.I., Schally A.V. The effects of MSH on restructed passive avoidance response // Horm. Behav.- 1975.- v. 3.- p. 333-337.

126. Denenberg V.H., Cartner I., Myers M. Absolute measurement of open-field activity in mice // Physiol, and Behav.- 1975.- v. 15.- p. 505-509.

127. Dinulescu D.M., Cone R.D. Agouti and agouti-related protein: analogies and contrasts // J. Biol. Chem.- 2000.- v. 275 (10).- p. 6695-6698.

128. Dores R.M., Steveson T.C., Price M.L. A view of the N-acetylation of a-MSH and p-endorphin from a phylogenic perspective // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1993.- v. 680.- p. 161174.

129. Dornbush R.L., Volavka J. ACTH 4-10 : a study of toxicological and behavioral effects in an aging sample // Neuropsychobiology.- 1976.- v. 2 (5-6).- p. 350-360.

130. Dravid A., Jaton A.L., Enz A., Frei P. Spontaneous recovery from motor asymmetry in adult rats with 6-hydroxydopamine-induced partial lesions of the substantia nigra // Brain Res.- 1984.- v. 311 (2).-p. 361-365

131. Duckers H.J., Verhaagen J., Gispen W.H. The neurotropic analogue of АСТЩ4-9), ORG 2766, protects against experimental allergic neurits // Brain.- 1993.- v. 116.- p. 1059-1075.

132. Duman R.S., Strada S.J., Enna S.J. Effect of immipramine and adrenocorticotropic administration on adrenergic receptor adaptations in rat brain cerebral cortex // J.Neurochem.- 1984.- v. 42.- p. 33-37.

133. Duman R., Malberg J., Nakagawa S., DiSa C. Neuronal plasticity and survival in mood disorders // Biol. Psychiatry.- 2000.- v. 48.- p. 732-739.

134. Dunbar J.C., Lu H. Proopiomelanocortin (POMK) products in the central regulation of sympathetic and cardiovascular dynamics: studies on melanocortin and opioid interaction // Peptides.- 2000.- v. 21.- p. 211-217.

135. Dunn A.J., Gispen W.H. How ACTH acts on the brain // Biobehavi. Rev.- 1977.- v. 1.-p. 15-23.

136. Eberle A.N. The melanotropins. // Basel, Karger.- 1988.

137. Egles C., Rene F., Varon S., Lois J.C., Felix J.M., Schimchowitsch S. Differentiation of rat hypothalamic dopaminergic neurons is stimulated in vitro by target cells: the melanotrophs // Eur. J. Neurosci.- 1998.- v. 10 (4).- p. 1270-1281.

138. Eipper B. A., Mains R. E. Structure and biosynthesis of pro-opiomelanocortin/endorpin and related peptides. // Endocrine Reviews.- 1980.- v. 1 (1).- p. 1-27.

139. Eipper B. A., Mains R. E. Futher analysis of post-translational processing of endorphin in rat intermediate pituitary // J. Biol. Chem.- 1981.- v. 256 (11).- p. 56895695.

140. Eisenach J.C., Gebhart G.F. Intrathecal amitriptyline. Antinociceptive interactions with intravenous morphine and intrathecal clonidine, neostigmine, and carbamylcholine in rats. // Anesthesiology.- 1995.- v. 83 (5).- p. 1036-1045.

141. Ercil N.E., Galici R., Kesterson R.A. HS014, a selective melanocortin-4 (MC4) receptor antagonist, modulates the behavioral effects of morphine in mice // Psychopharmacology (Berl).- 2005.- v/180 (2).- p. 279-285.

142. Fang Y. Adrenocorticotropic hormone (ACTH): antagonistic effect on opioid analgesia in central nervous system of the rat and its possible mechanisms of action // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan.- 1995.- v. 26 (2).- p. 137-140.

143. Fawcett J., Busch K.A., Jacobs D., Kravitz H.M., Fogg L. Suicide: a four-pathway clinical-biochemical model // Arm. N Y Acad. Sci.- 1997.- v. 836.- p. 288-301.

144. Fekete M.I., Stark E., Herman J.P. Catecholamine concentration of various brain nuclei of the rat as affected by ACTH and corticosterone // Pharmacol. Biochem. and Behavior. -1978.- v. 8.-p. 81-87.

145. Fekete M.I., De Wied D. Doserelates facilitation and inhibition of passive avoidance behaviour by the ACTH(4-9) analog ORG 2766 // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1882.- v. 17,-p. 177-182.

146. Felszeghy K., Sasvari M., Nyakas C. Behavioral depression: opposite effects of neonatal dexamethasone and ACTH-(4-9) analogue (ORG 2766) treatments in the rat // Horm. Behavioral.- 1993.- v. 27 (3).- p. 380-396.

147. Ferrari F, Giuliani D Involvement of dopamine D2 receptors in the effect of cocaine on sexual behaviour and stretching-yawning of male rats // Neuropharmacology.- 1997.- v. 36 (6).-p. 769-777.

148. Ferrer I., Serrano Т., Soriano E. Naturally occurring cell death in the subicular complex and hippocampus in the rat during development. // Neurosci. Res.- 1990.- v. 8 (1).- p. 6066.

149. File S.E. Effects of ACTH4.10 in the social interaction test of anxiety // Brain Res.-1979.- v. 171.-p. 157-160.

150. File S.E., Clarke A. Intraventricular ACTH reduces social interaction in male rats // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1979.- v. 12,- p. 711-715.

151. File S.E., Vellucci .V. Studies on the role of ACTH and of 5-HT in anxiety using an animal model // J. Pharm. Pharmacol.- 1978.- v. 30 (2).- p. 105-110.

152. Flood Y.M., Yarvik M.E., Bennet E.L. Effects of ACTH peptide fragments on memory formation//Pharmacol. Biochem. Behav.- 1976.- v.5.- p. 41-51.

153. Florijn W.J., De Boer Т., Tonnaer J.A.D. M., Van Nispen J.W., Versteeg D.H.G. ACTH/MSH-like peptides inhibit the binding of dopaminergic ligands to the dopamine D2 receptor in vitro // Eur. J. Pharmacol.-1991.- v. 207.- p. 43-50.

154. Florijn W.J., Hens J.J., De Graan P.N.E., Versteeg D.H.G., Gispen W.H. Effects of ACTH(l-24) on dopamine and noradrenaline release, B-50 phosphorilation and calmodulin binding to B-50 in vitro // Life Sci.- 1993.- v. 52.- p. 1013-1022.

155. Florijn W.J., Tarazi F.I., Creese I. Dopamine receptor subtypes: differential regulation after 8 months treatment with antipsychotic drugs // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1997.- v. 280 (2).- p. 561-569.

156. Fong T.M., Mao C., MacNeil Т., Kalyani R., Smith Т., Weinberg D., Tota M.R., Van der Ploeg L.H. AGR protein product of agouti-related transcript as an antagonist of MC3 and MC4 receptors // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.- v. 237.- p. 629-631.

157. Fratta W., Rossetti Z.L., Poggioli R., Gessa G.L. Reciprocal antagonism between ACTH 1-24 and beta-endorphin in rats // Neurosci. Lett.-1981.- v. 24.- p. 71-74.

158. Frederiksen S.O., d'Elia G., Bengtsson B.O. ACTH 4-10 analogue (ORG 2766) in depressed erderly patients. Effects on depressed mood // Acta Psychiatr. Scand.- 1985.- v. 72 (4).- p. 341-348.

159. Friedman H.J., Jen M.F., Chang J.K., Lee N.M., Loh H.H. Dynorphin: a possible modulatory peptide on morphine or beta-endorphin analgesia in mouse // Eur J Pharmacol.-1981.- v. 69 (3).- p. 357-360.

160. Gantz I., Konda Y., Tashiro Т., Shimoto Y., Miwa H., Munzert G., Watson S.J., DelValle J., Yamada T. Molecular cloning of a novel melanocortin receptor. // J. Biol. Chem.- 1993a.- v. 268 (11).- p. 8246-8250.

161. Gantz I., Miwa H., Konda Y., Shimoto Y., Tashiro Т., Watson S.J., DelValle J., Yamada T. Molecular cloning, expression, and gene localization of a fourth melanocortin receptor. // J. Biol. Chem.- 19936.- v. 268 (20).- p. 15174-15179.

162. Gantz I., Fong T.M. The melanocortin system // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.-2003.- v. 284.- p. E468-E474.

163. Gao Z., Lei D., Welch J., Le K., Lin J., Leng S., Duhl D. Agonist-dependent internalization of the human melanocortin-4 receptor in human embryonic kidney 293 cells // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 2003.- v. 307 (3).- p. 870-877.

164. Garrud P., Gray J.A., De Wied D. Pituitary-adrenal hormones and effects of partial reinforcement of appetitive behavior in rats // Physiol. Behav.- 1974a.- v. 18.- p. 813-818.

165. Garrud P., Gray I.A., De Wied D. Pituitary-adrenal hormones and extinction of rewarded behaviour in the rat / / Physiol. Behav.- 19746.- v. 5.- p. 109-119.

166. Gee C.E., Chen C.L., Roberts J.L., Thompson R., Watson S.J. Identification of proopiomelanocortin neurones in rat hypothalamus by in situ cDNA hybridization // Nature.- 1983,-v. 306.- p. 374-376.

167. Genedani S., Castelli M., Viappiani A., Bertolini A. Influence, in rats, of intraventricularly injected ACTH-fragments on the pain threshold and on morphine analgesia // Rivista di Farmacologia e Terapia.- 1978,- v. 9.- p. 51-54.

168. Gispen W.H., Buitelaar J., Wiegant V.M., Terenius L., De Wied D. Interaction between ACTH fragments, brain opiate receptors and morphine-induced analgesia // Eur. J. Pharmacol.- 1976.- v. 39.- p. 393-397.

169. Gispen W.H., Hamers F.P., Vecht C.J., Jennekens F.G., Neyt J.P. ACTH/MSH like peptides in the treatment of cisplatin neuropathy // J. Steroid Biochem. Mol. Biol.- 1992.-v. 43(1-3).- p.179-183.

170. Gispen W.H., Isaacson R.L. Excessive grooming in response to ACTH // In: De Wied D., Gispen W.H., Van Wimersma Greidanus T.B., eds. Neuropeptides and Behavior (Oxford, Pergamon Press).- 1986,- v. 1,- p. 273-312.

171. Gispen W.H., Zwiers H. Behavioral and neurochemical effects of ACTH // Handbook ofNeurochemistry.- 1985.- v. 8.- p. 375-412.

172. Glyn JR, Lipton JM. Hypotermic and antipyretic effects of centrally administered ACTH (1-24) and alfa-melanotropin//Peptides.-1981.-v. 2.-p. 177-187.

173. Gold P.E., van Buskirk R. Effects of posttrial injections on memory processes // Hormones and behavior.- 1976.- v. 7.- p. 509-517.

174. Gold P.E., McGaugh J.L. Endogenous modulators of memory storage processes // In Clinical Psychoneuroendocrinology in Reproduction ed. by L.Carenza, P. Pancheri. London, Academic Press.- 1978.- p. 25-46.

175. Gold P.E., Delanoy R.L. ACTH modulation of memory storage processing. // In Endogenous Peptides and learning and memory process. Academ. Press.-1981,- p. 79-97.

176. Gonzales M.I., Vaziri S., Wilson C.A. Behavioral effects of a-MSH and MCH after central administration in the female rats // Peptides.- 1986.- v. 17.- p. 171-177.

177. Gonzales M.I., Vaziri S., Wilson C.A. Behavioral effects of alpha-MSH and MCH after central administration in the female rat // Peptides.- 1996.- v. 17 (1).- p. 171-177.

178. Gray J. A. Effects of ACTH on extinction of rewarded behaviour is blocked by previous administration of ACTH //Nature.- 1977.- v. 229,- p. 52-54.

179. Greven H.M., De Wied D. The active sequence in the ACTH molecule responsible for inhibition og the ixtinction of conditioned avoidance behavior in rats // Eur. J. Pharmacology.- 1967.- v. 2.-p. 14-6.

180. Greven H.M., De Wied D. The influence of peptides derived from corticotrophin (ACTH) on performance. Structure activity studies // Progress in Brain Res.- 1973.- v. 39,-p. 429-442.

181. Greven H.M., De Wied D. Influence of peptides structurally related to ACTH and MSH on active avoidance in rats // Frontiers of Hormone research.- 1977.- v.4.- p. 140-152.

182. Griffon N., Mignon V., Facchinetti P., Diaz J., Schwartz J.C., Sokoloff P. Molecular cloning and characterization of the rat fifth melanocortin receptor. // Bioch. Biophys. Res. Comm.- 1994.- v. 200 (2).- p. 1007-1014.

183. Grino M., Young W.S., Burgunder J.M. Ontogeny of expression of the corticotrophin-releasing factor gene in the hypothalamic paraventricular nucleus and of the proopiomelanocortin gene in rat pituitary // Endocrinology.- 1989.- v. 124 (1).- p. 60-68.

184. Gruber K.A., Callahan M.F. ACTH(4-10) through y-MSH: evidence for a new class of central autonomic nervous system-regulating peptides // Am. J. Physiol.- 1989.- v. 257.-p.R681-694.

185. Guarini S., Bazzani C., Bertolini A. Resuscitating effect of melanocortin peptides after prolonged respiratory arrest // Br. J. Pharmacol.- 1997.- v. 121.- p. 454-460.

186. Gutierrez A.C., Keller E.A. Analgesic response to stress is reduced in perinatally undernourished rats. // J. Nutr. -1997. -v. 127. -p. 765-769.

187. Guth S., Levine S., Seward J.P. Appetitive acquisition and extinction effects with exogenous ACTH // Physiol. Behav.-1971.- v.7.- p. 195-200.

188. Hagan M.M., Rushing P.A., Schwartz M.W., Yagaloff K.A., Burn P., Woods S.C., Seeley R.J. Role of the CNS melanocortin system in the response to overfeeding // J. Neurosci.- 1999.- v. 19 (6).- p. 2362-2367.

189. Hall J., Thomas K.L., Everitt B.J. Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning // Nat Neurosci.- 2000.- v. 3 (6).- p. 533535.

190. Hamers F.P., Pette C., Bravenboer B.,Vecht C.J., Neijt J.P., Gispen W.H. Cisplatin-induced neuropathy in mature rats: effects of the melanocortin-derived peptide ORG2766 // Cancer Chemother. Pharmacol.- 1993.- v. 32 (2).- p. 162-166.

191. Hartfield A.W., Moore N.A., Clifton P.G. Serotonergic and histaminergic mechanisms involved in intralipid drinking. // Pharmacol. Biochem. Behav.- 2003.- v. 76 (2).- p. 251258.

192. Haynes W.G., Morgan D.A., Djalali A., Sivitz W.I., Mark A.L. Interactions between the melanocortin system and leptin in control of sympathetic nerve traffic // Hypertension.-1999.- v. 33 (part II).- p. 542-547.

193. Healy E., Flannagan N., Ray A., Todd C., Jackson I.J., Matthew J.N., Birch-Machin M.A., Rees J.L. Melanocortin-1-receptor gene and sun sensitivity in individuals without red hair // Lancet.- 2000.- v. 355.- p. 1072-1073.

194. Henderson G., McKnight A.T. The orphan opioid receptor and its endogenous ligand-nociceptin/orphanin FQ // Trends Pharmacol. Sci.- 1997.- v. 18 (8).- p. 293-300.

195. Hendrie C.A. ACTH: a single pretreatment enhances the analgesic efficacy of and prevents the development of tolerance to morphine // Physiol. Behav.- 1988.- v. 42.- p. 41-45.

196. Hock F.J., Gerhards H.J., Wiemer G., Usinger P., Geiger R. Learning and memory process of an ACTH(4-9) analog (ebiratide; HOE 427) in mice and rats //Peptides.- 1988.-v.9.- p. 575-581.

197. Hofer M.A., Masmela J.R., Brunelli S.A., Shair H.N. The ontogeny of maternal potentiation of the infant rats' isolation call // Dev Psychobiol.- 1998.- v. 33 (3).- p. 189201.

198. Hoi E.M., Gispen W.H., Bar P.R. ACTH-related peptides: receptors and signal transduction systems involved in their neurotrophic and neuroprotective actions // Peptides,- 1995,- v. 16,- p. 979-993.

199. Hoist В., Schwartz T.W. Molecular mechanism of agonism and inverse agonism in the melanocortin receptors. ZN2+ as a structural and functional probe // Ann. N.Y. Acad. Sci.-2003.-v. 994.-p. 1-11.

200. Horvath K.M., Meerlo P., Felszeghy K. et al Early postnatal treatment with ACTH4-9 analog ORG 2766 improves adult spatial learning but does not affect behavioural stress reactivity // Behavioral. Brain Res.- 1999,- v. 106 (1-2).- p. 181-188.

201. Hsu R., Taylor J.R., Newton S.S., Alvaro J.D., Haile C., Han G., Hruby V.J., Nestler E.J., Duman R.S. Blockade of melanocortin transmission inhibits cocaine reward // Eur. J. Neurosci.- 2005.- v. 21 (8).- p. 2233-2242.

202. Huang Q.H., Entwistle M.L., Alvaro J.D., Duman R.S., Hruby V.J., Tatro J.B. Antipyretic role of endogenous melanocortins mediated by central melanocortin receptors during endotoxin-induced fever. // J. Neurosci.- 1997.- v. 17 (9).- p. 3343-3351.

203. Huang Q.H., Hruby V.J., Tatro J.B. Role of central melanocortins in endotoxin-induced anarexia // Am. J. Physiol.- 1999.- v. 276.- p. R864-R871.

204. Huebner A., Elias L.L.K., Clark A.J.L. ACHT resistance syndromes // J. Pediatr. Endocrinol. Metab.- 1999.- v. 12 (Suppl. 1).- p. 277-293.

205. Huot R.L., Plotsky P.M., Lenox R.H., Mc Namara R.K. Neonatal maternal separation reduces hippocampal mossy fiber density in adult Long Evans rats // Brain Res.- 2002.- v. 950(1-2).- p. 52-63.

206. Ichiyama Т., Sakai Т., Catania A., Barsh G.S., Furukawa S., Lipton J.M. Systemically administered alfa-melanocyte stimulating peptides inhibit NF-kB activation in experimental brain inflammation // Brain Res.- 1999a.- v. 836,- p. 31-37.

207. Ichiyama Т., Sakai Т., Catania A., Barsh G.S., Furukawa S., Lipton J.M. Inhibition of peripheral NF-kB activation by central action of alfa-melanocyte stimulating hormone // J. Neuroimmunol.- 19996.- v. 99.- p. 211-217.

208. Igaraski M., Ishikawa K., Ishii M., Schmidt K. Effect of ACTH(4-10) on equilibrium compensation after unilateral labyrinthectomy in the squirrel monkey // Eur. J. Pharmacol.- 1985.- v. 119.- p. 239-242.

209. Isaacson L., Green E.J. The effect of ACTH(l-24) on locomotion, exploration, rearing and grooming // Behavioral Biol.- 1978.- v. 24.- p. 118-122.

210. Isaacson R.L., Thomas J. Character of (D-Phe-7) ACTH4-10-induced excessive grooming // Exp. Neurol.- 1986.- v. 93 (3).- p. 657-661.

211. I to M., Yu 0., Chiu Т.Н. Interactions of ACTH4-10 and ACTHi.24 with L-3H.glutamate binding sites and GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in vitro // Brain Dev.- 1988.-v. 10 (2).-p. 106-109.

212. Itoh S., Katsuura G., Maeda Y. Caerulein and cholecystokinin suppress beta-endorphin-induced analgesia in the rat // Eur. J. Pharmacol.- 1982.- v. 80 (4).- p. 421-425.

213. Izquierdo I, Dias RD. Effect of ACTH, epinephrine, beta-endorphin, naloxone and of the combination of naloxone or beta-endorphin with ACTH or epinephrine on memory consolidation//Psychoneuroendocrinology.- 1983.- v. 8 (1).-p. 81-87.

214. Jacquet Y.F. Dual action of morphine on the central nervous system: parallel action of beta- endorphin and ACTH // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982. - v. 398. -p. 272-290.

215. Jacquet Y.F., Wolf G. Morphine and ACTH1-24: correlative behavioral excitations following micro-injections in rat periaqueductal gray // Brain Res.-1981.- v. 219,- p. 214218.

216. Jacobowitz D.M., O'Donohue T.L., a-melanocyte-stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of the rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- v. 75.- p. 6300-6304.

217. Jolles J., Rompa-Barendrest J., Gispen W.H. ACTH-induced excessive grooming in the rat: the influence of environmental and motivational factors // Hormones and Behavior.-1979.-v. 12.-p. 60-72.

218. Kaplan A.Ya., Kochetova A.G., Nezavibatko V.N., Rjasina T.V., Ashmarin I.P. Synthetic ACTH analogue semax displays nootropic-like activity in human // Neuroscience res. Comm.- 1996,- v. 19 (2).- p. 115-123.

219. Kask A., Rago L., Mutulis F., Pahkla R., Wikberg J.E.S., Schioth H.B. Selective antagonist for the melanocortin 4 receptor (HS014) increases food intake in free-feeding rats // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 19986.- v. 245.- p. 90-93.

220. Kastin A.I., Plotnikoff N.P., Sandman C.A. et al. The effects of MSH and MIF on the brain // In: Anatomical Neuroendocrinology, Basel.- 1975.- p. 290-297.

221. Kawashima N., Chaki S., Okuyama S. Electrophysiological effects of melanocortin receptor ligands on neuronal activities of monoaminergic neurons in rars // Neurosci. Lett.- 2003.- v. 353 (2).- p. 119-122.

222. Kelsey J.E. Role of pituitary-adrenocortical system in mediating avoidance behavior of rats with septal lessions // J. Сотр. Psichol.- 1975.- v. 88.- p. 271-280.

223. Kendall D.A., McEwen B.S., Enna S.J. The influence of ACTH and corticosterone on 3H.GABA receptor binding in rat brain // Brain Res.- 1982.- v. 236 (2).- p. 365-374.

224. Kent J.M., Coplan J.D., Gorman J.M. Clinical utility of the selective serotonin reuptake inhibitors in the spectrum of anxiety // Biol. Psychiatry.- 1998.- v. 44 (9).- p. 812-824.

225. King M.A., Bradshaw S., Chang A.H., Pintar J.E., Pasternak G.W. Potentiation of opioid analgesia in dopamine2 receptor knockout mice: evidence for a tonically active anti-opioid system. // J. of Neurosci.- 2001.- v. 21 (19).- p. 7788-7792.

226. Kistler-Heer V., Lauber M.E., Lichtensteiger W. Different developmental patterns of melanocortin MC3 and MC4 receptor mRNA: predominance of MC4 in fetal rat nervous system//J Neuroendocrinol.- 1998.-v. 10 (2).-p. 133-146.

227. Klusa V., Germane S., Svirskis S., Wikberg J.E. The gamma(2)-MSH peptide mediates a central analgesic effect via a GABA-ergic mechanism that is independent from activation of melanocortin receptors // Neuropeptides.- 2001.- v. 35 (1).- p. 50-57.

228. Konda Y., Gantz I., DelValle J., Shimoto Y., Miwa H., Yamada T. Interaction of dual intracellular signaling pathways activated by the melanocortin-3 receptor. // J. Biol. Chem.-1994.- v. 269 (18).-p. 13162-13166.

229. Korzeniewska I.,Plaznik A. Influence of serotonergic drugs on restraint stress induced analgesia. // Pol. J. Pharmacol.- 1995.- v. 47 (5).- p. 381-385.

230. Kotlinska J., Rafalski P. Nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ)~the opioid, antiopioid or neuromodulator? // Postepy Hig. Med. Dosw.- 2004.- v. 1558,- p. 209-215.

231. Kovacs G.L., De Wied D. Peptidergic modulation of learning and memory processes // Pharmacol. Rev.- 1994.- v. 4 (3).- p. 269-290.

232. Krude H., Gruters A. Implications of proopiomelanocortin (POMC) mutations in human: the POMC deficiency syndrome // ТЕМ,- 2000.- v. 11 (1).- p. 15-22.

233. Kshatri A.M., Foster P.A. Adrenocorticotropic hormone infusion as a novel treatment for postdural puncture headache. // Reg. Anesth.- 1997.- v. 22.- p. 432-434.

234. Lee S.J., Aoki C.J., Strand F.L. Immunocytochemical localization of ACTH4-10 in the rat brain // Soc. Neurocsi. Abstr.- 1992.- v. 18.- N 121.2.

235. Lee S.J., Lee T.S., Alves S.E., Strand F.L. Immunocytochemical localization of ACTH(4-10) in the rat spinal cord following peripheral nerve trauma // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1994.- v. 739.- p. 320-323.

236. Levine S., Mullins R. Neonatal androgen or estrogen treatment and the adrenal cortica response to stress in adult rats // Endocrinology.- 1967.- v. 80 (6).- p. 1177-1179.

237. Levine S., Jones L.E. Adrenocorticotropic hormone (ACTH) and passive avoidance learning // J. Сотр. Physiol. Psichol.- 1965.- v.59.- p. 357-360.

238. Levine S., Smotherman W.P., Hennessy J.W. Pituitary-adrenal hormones and learned taste aversion // In: Neuropeptide influences on the brain and behavior.- N.Y., Paven. Press.- 1977.-p. 163-179.

239. Li Y., Han J.S. Cholecystokinin-octapeptide antagonizes morphine analgesia in periaqueductal gray of the rat // Brain Res.- 1989.- v. 480 (1-2).- p. 105-110.

240. Li X.C., Li H.D., Zhao B.Y. Serotonin of hippocampus and hipotalamus taking part in the analgesic effect of adrenocorticotropic hormone in rats // Zhongguo Yao Li Xue Bao.-1990.-v. 11 (l).-p. 89-92.

241. Li S-J., Varga K., Arvher P., Hruby V.J., Sharma S.D., Kesterson R.A. Melanocortin antagonists define two distinct pathways of cardiovascular control by a- and y-MSHs // J. Neurosci.- 1996.- v. 16 (16).- p. 5182-5188.

242. Li W.D., Joo E.J., Furlong E.B., Golvin M., Abel K„ Bell C.J., Price R.A. Melanocortin 3 receptor (MC3R) gene variants in extremely obese women // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disort.- 2000.- v. 24.- p. 206-210.

243. Lichtensteiger W., Lienhart R., Kopp H.G. Peptide hormones and central dopamine neuron systems // Psychoneuroendocrinology.- 1977.- v. 2.- p. 237-248.

244. Lin C., Sarath G., Frank J.A., Krueger R.J. Bivalent ACTH antagonists: Influence of peptide and spacer components on potency enhancement // Biochem. Pharmacol.-1991.-V.41.- p. 789-795.

245. Lindblom J., Opmane В., Mutulis F., Mutule I., Petrovska R., Klusa V., Bergstrom L., Wikberg J.E. The MC4 receptor mediates alpha-MSH induced release of nucleus accumbens dopamine //Neuroreport.- 2001.- v. 12 (10).- p. 2155-2158.

246. Lindblom J., Kask A., Hagg E., Harmark L., Bergstrom L., Wikberg J.E. Chronic infusion of a melanocortin receptor agonist modulates dopamine receptor binding in the rat brain // Pharmacol Res.- 2002.- v. 45 (2).- p. 119-124

247. Lipton J.M., Catania A., Delgado R. Peptide modulation of inflammatory processes within the brain // Neuroimmunomodulation.- 1998.- v. 5.- p. 178-183.

248. Lipton J.M., Catania A., Ichiyama T. Marshaling the anti-inflammatory influence of the neuroimmunomodulator alfa-MSH//News Physiol. Sci.- 2000.- v. 15.- p. 192-195.

249. Liu R.J., Zhang R.X., Qiao J.T., Dafny N. Interrelations of opioids with monoamines in descending inhibition of nociceptive transmission at the spinal level: an immunocytochemical study. //BrainRes.- 1999.- v. 830 (1).-p. 183-190.

250. Low M.J., Simerly R., Cone R.D. Receptors for the melanocortin peptides in the central nervous system. // Current Opinion in Endocrinol. Diab.- 1994.- v. 1.- p. 79-88.

251. Lu D., Willard D., Patel I.R., Kadwell S., Overton L., Kost Т., Luther M., Chen W., Woychik R.P., Wikinson W.O., Cone R.D. Agouti-protein is an antagonist of the melanocyte-stimulating hormone receptors // Nature.- 1994.- v. 371.- p. 799-802.

252. Luger T.A, Scholzen Т., Brzoska Т., Becher E., Slominski A., Paus R. Cutaneous immunomodulation and coordination of skin stress responses by alpha-melanocyte-stimulating hormone. // An. N.Y. Acad. Sci.- 1998.- v. 840.- p. 381-394.

253. Luger T.A., Kalden D., Scholzen Т.Е., Brzoska T. Alpha-melanocyte-stimulating hormone as a mediator of tolerance induction. // Pathobiology.- 1999.- v. 67 (5-6).- p. 318-321.

254. Lutfy K., Maidment N.T. Blockade of mu-opioid receptors reveals the hyperalgesic effect of orphanin FQ/nociceptin in the rat hot plate test // Br. J. Pharmacol.- 2000,- v. 131 (8).-p. 1684-1688.

255. Lynch D.K., Snyder S.H. Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways, and receptors // Ann. Rev. Biochem.- 1986.- v. 55.- p. 773-799.

256. Manna S.K., Aggarwal B.B. Alpha-melanocyte-stimulating hormone inhibits the nuclear transcription factor NF-kB activation induced by various inflammatory agents // J. Immunol.- 1998.- v. 161.-p 2873-2880.

257. Marks D.L., Cone R.D. Central melanocortins and regulation of weight during acute and chronic disease // Recent Prog. Horm. Res.- 2001.- v. 56.- p. 359-375.

258. Mc Gaught J.L., Gold P.E., Van Buskirk R., Haycock J. Modulating influences of hormones and catecholamines on memory storage processen // Prog. Brain Res.- 1975.-v.42.-p. 151-162.

259. Melzack R., Wall P.D. Pain mechanisms: a new theory. // Science.- 1965,- v. 150 (699).- p. 971-979.

260. Meunier J.C. Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor // Eur. J. Pharmacol.- 1997.- v. 340 (l).-p. 1-15.

261. Mezey E., Palcovitz M., De Kloet E.R., Velhoef J., De Wied D. Evidince for pituitary-brain transport of a behaviorally potent ACTH analog // Life Sci.- 1978.- v. 22,- p. 831838.

262. Miller L.H., Harris L.C., Van Riezen H., Kastin A.J. Neuroheptapeptide influence on attention and memory in man // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1976.- v. 5 (1).- p. 17-21.

263. Miller L.H., Kastin A.J. Sandman C.A., Fink M., Van Veen W.J. Polypeptide influence on attention, memory and anxiety in man // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1974.- v. 2.- p. 663-668.

264. Miller R.E., Ogawa N. The effect of adrenocorticotropic hormone (ACTH) on avoidance conditioning in the adrenalectomized rat // J. Сотр. Physiol. Psichol.- 1962.-v. 55.- p. 211-213.

265. Mirsky J.A., Miller R., Stein M. Relation of adrenocortical activity and adaptive behaviour// Psychosomatic Medicine.- 1953.- v. 15.- p. 574-584.

266. Mizuno M., Yamada K., Olariu A., Nawa H., Nabeshima T. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats // J. Neurosci.- 2000,- v. 20 (18).- p. 7116-7121.

267. Mogil J.S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. // Colloquium Paper. -1999.- v. 96.- p. 7744-7751.

268. Morgan C., Thomas R.E., Ma W., Novotny M.V., Cone R.D. Melanocortin-5 receptor deficiency reduces a pheromonal signal for aggression in male mice // Chem. Senses.-2004.-v. 29.-p. 111-115.

269. Mountjoy K.G., Robins L.S., Mortrud M.T, Cone R.D. The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors. // Science.- 1992.- v. 257.- p. 1248-1251.

270. Mountjoy K.G. The human melanocyte stimulating hormone receptor has evolved to become "super-sensitive" to melanocortin peptides. // Molecular Endocrinology.- 1994.-v. 102 (1-2).-p. 7-11.

271. Mountjoy K.G., Wong J. Obesity, diabetes and functions for proopiomelanocortin-derived peptides. // Mol. Endocrinol., Mol. and Cellular Endocrinol.- 1997.- v. 128 (1-2).-p. 171-177.

272. Mu J.S., Li W.P., Yao Z.B., Zhou X.F. Deprivation of endogenous brain-derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats // Brain Res.- 1999.- v. 835 (2).- p. 259-265.

273. Murphy J.V., Miller R.E. The effect of ACTH on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol.- 1955.- v.48.- p.47-49.

274. Nakanishi S., Inoue A., Kita Т., Nakamura M., Chang A., Cohen S.N., Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor // Nature.- 1979.- v. 278.- p. 423-427.

275. Nicholson W.E., Liddle R.A., Puett D., Liddle G.W. Adrenocorticotropic hormone biotransformation, clearance, and catabolism // Endocrinology.- 1978.- v. 103,- p. 13441351.

276. Nickolls S.A., Fleck В., Hoare S.R., Maki R.A. Functional selectivity of melanocortin-4 receptor peptide and nonpeptide agonists: evidence for ligand-specific conformational states // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005.- v. 313 (3).- p. 1281-1288.

277. Nijenhuis W.A.J., Oosterom J., Adan R.A.H. AGRP(83-132) acts as an inverse agonist on the human melanocortin-4 receptor // Mol. Endocrinol.- 2001,- v. 15 (1).- p. 164-171.

278. Nyakas C., Endroczi E. Effect of ACTH-peptides given at an early postnatal age an adult adaptive behavior of rats // Acta Med. Acad. Sci. Hung.- 1980.- v.36.- p. 321-323.

279. Nyakas C., Levay G., Viltsek J. Effects of neonatal ACTH4.10 administration on adult adaptive behavior and brain tyrosine hydroxylase activity. // Development Neurosci.-1981,-v 4(3).- p. 225-232.

280. Nyakas C. Age-related alterations in cardiac response to emotional stress. Relations to behavioural reactivity in the rat // Physiol. Behav.- 1990.- v. 47.- p. 273-280.

281. Nyakas C., Felszeghy K., Bohus В., Luiten P.G. Permanent upregulation of hyppocampal mineralcorticoid receptors after neonatal administration of ACTH (4-9) analog ORG 2766 in rats // Brain Res. Dev. Brain. Res.- 1997.- v. 99 92).- p. 142-147.

282. Ohkubo Т., Shibata M., Takahashi H., Naruse S. Naloxone prevents the analgesic action ofalpha-MSH in mice// Experientia.- 1985.- v. 41 (5).- p. 627-628.

283. Owens MJ, Nemeroff CB. Physiology and pharmacology of corticotropin-releasing foctor // Pharmacol Rev.-1991.- v. 43.- p. 425-473.

284. Owerbach D., Rutter W.J., Roberts J.L. The proopiocortin (adrenocorticotropin/p-lipotropin) gene is located on chromosome 2 in humans // Somatic Cell Genet.-1981.- v. 7.-p. 359-367.

285. Pancheri P, Biondi M, Chiaie RD, Marchini AM, Fierro A, Giovannini C. ACTH 1-17 and short-term memory, anxiety, heart rate, blood pressure // Ric. Clin. Lab.- 1984.- v. 14 (2),- p. 221-229.

286. Penke Z., Felszeghy K., Fernette B. Postnatal maternal deprivation produces long-lasting modifications of the stress response, feeding and stress-related behaviour in the rat // Eur. J. Neurosci.- 2001,- v. 14 (4).- p. 747-755.

287. Pfaus J.G., Shadiack A., Van Soest T,. Tse M., Molinoff P. Selective facilitation of sexual solicitation in the female rat by a melanocortin receptor agonist // PNAS.- 2004.-v. 101 (27).-p. 10201-10204.

288. Plantinga L.C., Verhaagen J., Edwards P.M., Hali M., Brakkee J.H., Gispen W.H. Pharmacological evidence for the involvement of endogenous a-MSH-like peptides in peripheral nerve regeneration // Peptides.- 1995.- v. 16 (2).- p. 319-324.

289. Poggioli R., Benelli A., Arletti R., Cavazzuti E., Bertolini A. Nitric oxide is involved in the ACTH-induced behavioral syndrome // Peptides.- 1995,- v. 16.- p. 1263-1268.

290. Poisnel G., Quentin Т., BarreL., Debruyne D. Competitive displacement binding assay on rat brain sections and using a beta-imager: Application to mu-opioid ligands. // J. Neurosci. Methods.- 2006.- v. 16.- p. 1-12.

291. Porter F.L., Grunau R.E., Anand K.J. Long-term effects of pain in infants // J. Dev. Behav. Pediatr.- 1999.- v. 20 (4).- p. 253-261.

292. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitzkaya N.G., Nezavibatko V.N. N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // BBRC.- 1991a.- v. 176 (2).- p. 741-746.

293. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. Entry of the synthetic ACTH(4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection // Neurosci. Lett.-19916.- v. 127 (1).- p. 133.

294. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog Semax by rat serum enzymes: an inhibitor study//Peptides.- 1993.- v. 14 (3).- p. 491-495.

295. Pranzatelli M.R. Effect of antiepileptic and antimyoclonic drugs on serotonin receptors in vitro // Epilepsia, 1988, v. 29, p. 412-419.

296. Pransatelli M.R. In vivo and in vitro effects of adrenocorticotrophic hormone on serotonin receptors in neonatal rat brain // Dev. Pharmacol. Ther.- 1989.- v.12 (1).- p. 4956.

297. Pranzatelli M.R. On the Molecular mechanism of adrenocorticotrophic hormone in the CNS: Neurotransmitters and Receptors // Exper. Neurology.- 1994.- v. 125,- p. 142-161.

298. Raffin-Sanson M.L., d Eipper B. A., Mains R. E. e Keyzer Y., Bertagna X. Proopiomelanocortin, a polypeptide precursor with multiple functions: from physiology to pathological conditiones // Eur. J. Endocrinology.- 2003.- v. 149.- p. 79-90.

299. Ramaekers F., Rigter H., Leonard B.E. Parallel changes in behaviour and hippocampal monoamine metabolism in rats after administration of ACTH-analogues.// Pharmacol. Biochem. Behav.- 1978.- v. 8 (5).- p. 547-551.

300. Rajora N., Boccoli G., Burns D., Sharma S., Catania A.P., Lipton J.M. Alpha-MSH modulates local and circulating tumor necrosis factor-alpha in experimental brain inflammation. // Journal of Neuroscience.- 1997a.- v. 17 (6).- p. 2181-2186.

301. Rajora N., Boccoli G., Catania A., Lipton J.M. Alpha-MSH modulates experimental inflammatory bowel disease. // Peptides.- 19976.- v. 18 (3).- p. 381-385.

302. Rees J.L. The genetics of sun sensitivity in humans // Am. J. Genet.- 2004.- v. 75.- p. 739-751.

303. Rheins L.A., Cotleur A.L., Kleier R.S., Hoppenjans W.B., Saunder D.N., Nordlund J.J. Alfa-melanocyte-stimulating hormone modulates contact hypersensitivity responsiveness in C57/BL6 mice // J. Invest. Dermatol.- 1989,- v. 93.- p. 511-517.

304. Richter-Landsberg C., Jastorff B. The role of cAMP in nerve growth factor-promoted neurite outgrowth in PC12 cells. // J. Cell Biol.- 1986.- v. 102 (3).- p. 821-829.

305. Rigter H. Peptide hormones and extinction of conditioned taste aversion // Brit. J. Pharmacol.- 1975.- v. 55.- p. 270-276.

306. Romagnano M.A., Joseph S.A., Immunocytochemical localization of ACTH1-39 in the brainstem of the rat // Brain Res.- 1983.- v. 276 (1).- p. 1-16.

307. Rose K.J., Frischer R.E., King J.A., Strand F.L Neonatal neuromuscular parameters vary in suspectibility to postnatal ACTH/MSH 4-10 administration // Peptides.- 1998.- v. 9(1).-p. 151-156.

308. Rothman R.B. A review of the role of anti-opioid peptides in morphine tolerance and dependence // Synapse.- 1992.- v. 12 (2).- p. 129-138.

309. Rubinstein M., Mogil J.S., Japon M., Chan E.C., Allen R.G., Low M.J. Absence of opioid stress-induced analgesia in mice laking □-endorphin by site-directed mutagenesis //Neurobiology. -1996. -v. 93. -p. 3995-4000.

310. Sakata M., Prasad C. Transient decrease in rat striatal D2 dopamine receptor mRNA level after acute haloperidol treatment // Brain Res. Mol. Brain Res.- 1992.- v. 14 (3).- p. 282-284.

311. Sandman C.A., George J.M., McCanne T.R., Nolan J.D., Kaswan J., Kastin A.J. MSH/ACTH 4-10 influences behavioral and physiological measures of attention // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1977.- v. 44 (5).- p. 884-891.

312. Sandman C.A., George J.M., Nolan J.D., Van Riezen H., Kastin A.J. Enchancement of attention in man with ACTH/MSH(4-10) // Physiol. Behav.- 1975.- v. 15.- p. 427-431.

313. Sandman C.A., Kastin A.J., Schally A.V. Melanocite-stimulating hormone and learned appetitive behavior//Experimentia.- 1969.- v.25.-p. 1001-1002.

314. Sandman C.A., Kastin A.G. Intraventricular administration of MSH induces hiperalgesia in rats//Peptides.-1981.- v. 2.- p. 231-233.

315. Sands S.F., Wright A.A. Enhancement and disruption of retention performance by ACTH in a chois task // Behav. Neurol. Biol.- 1979,- v. 27.- p. 413-422.

316. Sapolsky R.M., Meaney M.J. Maturation of the adrenocortical stress response: neuroendocrine control mechanisms and the stress hyporesponsive period // Brain Res.-1986.- v. 396(1).- p. 64-76.

317. Schioth H.B., Chhajlani V., Muceniece R., Klusa V., Wikberg J.E.S. Major pharmacological distinction of the ACTH receptor from other melanocortin receptors // Life Sci.- 1996.- v. 59.-p. 797-801.

318. Schioth H.B., Mutulis F., Mucience R., Prusis P., Wikberg J.E. Discovery of novel melanocortin4 receptor selective MSH analogues. // Brit. J. Pharmacol.- 1998a.- v. 124 (l).-p. 75-82.

319. Schwartz M.W., Seeley R.J., Woods S.C., Weigle D.S., Campfield L.A., Born P., Baskin D.G. Leptin increases hypothalamic pro-opiomelanocortin mRNA expresion in the rostral arcuate nucleus // Diabetes.- 1997.- v. 46.- p. 2119-2123.

320. Schwyzer R. Structure and function in neuropeptides // Proc. R. Soc. Lond. Biol. Sci.-1980.- v. 210 (1178).- p. 5-20

321. Schwyzer R., Schiller P., Seelig S., Sayers G. Isolated adrenal cells: Log dose response curves for steroidogenesis induced by АСЩ1-24), ACTH(l-lO), ACTH(4-10) and ACTH(5-10) // FEBS Lett.-1971.- v. 19 (3).- p. 229-231.

322. Sgoifo A., Stilli D., Amini В., Parmigiani S., Manghi M., Musso E. Behavioral and electrocardiographic responses to social stress in male rats // Physiol. Behav.- 1994.- v. 55.- p. 209-216.

323. Sibley D.R., Monsma F.J., Yong Shen. Moleculare neurobiology of dopaminergic receptor// Intern. Rev. of Neurobiology.- 1993.- v. 35.- p. 391-415.

324. Sieqfried K.R. First clinical impressions with a ACTH analog (HOE 427) in the treatment of Alzheimer's disease // Ann. N.Y. Acad. Sci.-1991.- v. 640.- p. 280-283.

325. Shimazaki Т., Chaki S. Anxiolytic-like effects of a selective and nonpeptidergic melanocortin-4 receptor antagonist, MCL0129, in a social interaction test // Pharmacol. Biochem. Behav.- 2005.- v. 80 (3).- p. 195-400.

326. Shinyama H., Masuzaki H., Fang H., Flier J.S. Regulation of melanocortin-4 receptor signaling: agonist-mediated desensitization and internalization // Endocrinology.- 2003.-v. 144 (4).-p. 1301-1314.

327. Shipston MJ. Mechanism(s) of early glucocorticoid inhibition of ACTH secretion from anterior pituitary corticotropes // Trends Endocrinol Metab.- 1995.- v. 6.- p. 261-266.

328. Shirayama Y., Chen A.C.H., Nakaga wa S., Russell D.S., Duman R.S. Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioural models of depression // J. Neurosci.- 2002.- v. 22 (8).- p. 3251-3261.

329. Shutter J.R., Graham M., Kinsey A.C., Scully S.,. Luthy R,. Stark K.L. Hypothalamic expression of ART, a novel gene related to agouti, is up-regulated in obese and diabetic mutant mice // Genes Dev.- 1997.- v. 11.- p. 593-602.

330. Slominski A., Ermak G., Mihm M. ACTH receptor, CYP11A1, CYP17 and CYP21A2 genes are expressed in skin. // J. Clin. Endocrinol. And Metabolism.- 1996.- v. 81 (7).- p. 2746-2749.

331. Slominski A., Wortsman J., Luger Т., Paus R., Solomon S. Corticotropin Relising Hormon and Proopiomelanocortin Involvement in the Cutaneous Response to Stress // Physiol. Ev.- 2000.- v. 80.- p. 979-1020.

332. Smith A.I., Funder J.W. Proopiomelanocortin processing in the pituitary, central nervous system, and peripheral tisuis // Endocrinol. Rev.- 1988.- v. 9 (1).- p. 159-179.

333. Smock Т., Fields H.L. ACTH1-24 blocks opiate induced analgesia in the rat // Brain Res.-1981.- v. 212.- p. 202-206.

334. Smotherman W.P., Levine S. ACTH and ACTH(4-10) modification of neophobia and taste aversion responses in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol.- 1978.- v. 92.- p. 22-23.

335. Snell C.R., Snell P.H. A molecular basis for the interaction of corticotrophin with opiate receptors // FEBS Lett.- 1982,- v. 137.- p. 209-212.

336. Spruijt В., Gispen W.H. Hormones and behaviour in higher vertibrates // Springer-Veriag.- 1983.-Berlin.-p. 118-136.

337. Spruijt BM. Effects of the ACTH4.9 analog Org2766 on brain plasticity: modulation of excitatory neurotransmission? // Psychoneuroendocrinology.- 1992.- v. 17(4).- p. 315325.

338. Star R.A., Rajora N., Huang J., Stock R.C., Catania A., Lipton J.M. Evidence of autocrine modulation of macrophage nitric oxide synthase by alpha-melanocyte-stimulating hormone. II Proc. Nat.l Acad. Sci. USA.- 1995.- v. 92 (17).- p. 8016-8020.

339. Starowicz K., Przewlocka B. The role of melanocortins and their receptors in inflammatory processes, nerve regeneration and nociception // Life Sci.- 2003.- v. 73 (7).-p. 823-847.

340. Strand F.L. New vistas for melanocortins. Finally, an explanation for their pleiotropic functions //Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1999.- v. 897.- p. 1-16.

341. Strand F.L., Rose K.J., King J.A. ACTH modulation of nerve development and regeneration // Prog. Neurobiol.- 1989.- v. 33 (1).- p. 45-85.

342. Strand F.L., Zuccarelli L.A., Williams K.A., Lee S.J., Lee T.S., Antonawich F.J., Alves S.E. Melanotropins as growth factors // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1993a.- v. 680.- p. 29-50.

343. Strand F.L., Lee S.J., Lee T.S., Zuccarelli L.A., Kume J., Williams K.A. Non-corticotrophic ACTH peptides modulate nerve development and regeneration // Rev. Neurosci.- 19936,- v. 4 (4).- p. 391-363.

344. Stratton O.L., Kastin A.J. Increased acquisition of a complex appetitive task after MSH and MIF // Pharmacology.- 1975.- v.3.- p. 901-904.

345. Sun X.Y., Feng Q.P., Gong Q.L., Edvinsson L., Hedner T. Cardiovascular and renal effects of gamma-MSH in spontaneously hypertensive and normotensive Wistar Kyoto rats // Am. J. Physiol.- 1992,- v. 262.- p. 77-84.

346. Sydnor K.L., Sayers G. Biological half-life of endogenous ACTH // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1953.- v. 83.- p. 729-733.

347. Takeshige C., Tsuchiya M., Zhao W., Guo S. Analgesia produced by pituitary ACTH and dopaminergic transmission in the arcuate // Brain Res. Bull.- 1991.- v. 26.- p. 779788.

348. Takeuchi S, Kudo T, Takahashi S. Molecular cloning of the chicken melanocortin 2 (ACTH)-receptor gene // Biochim Biophys Acta.- 1998.- v. 1403.- p. 102-108.

349. Takeuchi S, Takahashi S. Melanocortin receptor genes in the chicken-tissue distributions // Gen Comp Endocrinol.- 1998.- v. 112,- p. 220-231.

350. Takeuchi S, Takahashi S. A possible involvement of melanocortin 3 receptor in the regulation of adrenal gland function in the chicken // Biochim Biophys Acta.- 1999.- v. 1448.- p. 512-518.

351. Tatro J.B., Melanotropin receptors in the brain are differentially distributed and recognize both corticotropin and a-melanocyte-stimulating hormone // Brain Res.- 1990.-v.- 536.-p. 124-132.

352. Tatro J.B., Sinha P.S. The central melanocortin system and fever // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 2003.- v. 994.- p. 246-257.

353. Terenius L. Effect of peptides and amino acids on dihydromorphin binding to the opiate receptors // J. Pharm. Pharmacol.- 1975.- v. 27.- p. 450-451.

354. Tonnaer J.A.D.M., Weigant V.M., De Jong W., De Wied D. Centraleffects of angiotensins on drinking and blood pressure: structure-activity relationships // Brain Res.-1982.- v. 236(2).- p. 417-428.

355. Trifiletti R.R., Pranzatelli M.R. ACTH binds to 3H.MK-801-labelled rat hippocampal NMDA receptors // Eur. J. Pharmacol.- 1992.- v. 226.- p. 377-379.

356. Tsai S.-J. Semax, an analogue of adrenocorticotropin(4-10), is a potential agent for the treatment of attention-deficit hyperactivity disorder and Rett syndrome // Med. Hypotheses.- 2007.- v.68.- p. 1144-1146.

357. Van Bergen P., Janssen P.M., Hoogerhout P., De Wildt D.J., Versteeg D.H. Cardiovascular effects of gamma-MSH/ACTH-like peptides: structure-activity relationship // Eur. J. Pharmacol.- 1995.- v. 294 (2-3).- p. 795-803.

358. Van Bergen P., Van der Vaart J.G., Kasbergen C.M., Versteeg D.H., e Wildt D.J. Structure-activity analysis for the effects of gamma-MSH/ACTH-like peptides on cerebral hemodynamics in rats // Eur. J. Pharmacol.- 1996.- v. 318.- p. 357-368.

359. Van Buren Т., Kasbergen C.M., Gispen W.H., De Wildt D.J. In vivo cardiovascular reactivity and baroreflex activity in diabetic rats // Cardiovasc. Res.- 1998.- v. 38 (3).- p. 763-771.

360. Van der Neut R., Bar P.R., Sodaar P., Gispen W.H. Trophic influences of alpha-MSH and ACTH4-10 on neuronal outgrowth in vitro. // Peptides.- 1988.- v. 9 (5).- p. 10151020.

361. Van Ree J.M. The influence of neurppeptides related to proopiomelanocortin on acquisition of heroin self-administration of rats // Life Sci.- 1983.- v. 33.- p. 2283-2289.

362. Van Wimersma Greidanus Tj.B. Effects of MSH and related peptides on avoidance behavior in rats // In Tj.B. Van Wimersma Greidanus (ed) Frontiers in Hormone Research.- 1980,- Basel, Karger.- v. 4,- p. 129-139.

363. Van Wimersma Greidanus Tj.B., et al., Sites of bahavioural and neurochemical action of ACTH-like peptides and neurohypophyseal hormones // Neurosci. And Behav. Rev.-1983.- v. 7.- p. 453-463.

364. Vaswani K.K., Richard 3rd C.W., Tejwani G.A. Cold swim stress-induced changes in the levels of opioid peptides in the rat CNS and peripheral tissues. // Pharmacol. Biochem. Behav. -1988. -v. 29 (1). -p. 163-168.

365. Vergoni A.V., Poggioli R., Bertolini A. Corticotropin inhibits food intake in rats // Neurosci.- 1986.- v. 7.-p. 153-158.

366. Vergoni A.V., Poggioli R., Marrama D., Bertolini A Inhibition of feeding by ACTH(1-24): behavioral and pharmacological aspects // Eur. J. Pharmacol.- 1990.- v. 179.- p. 347355.

367. Vergoni A.V., Bertolini A., Wikberg J.E., Schioth H.B. Selective melanocortin MC4 receptor blockage reduces immobilization stress-induced anorexia in rats // Eur. J. Pharmacol.- 1999,- v. 369(1).-p. 11-15.

368. Vergoni A.V., Bertolini A., Guidetti G., Karefilakis V., Filaferro M., Wikberg J.E.S., Schioth H.B. Chronic melanocortin 4 receptor blockage causes obesity without influencing sexual behavior in male rats // J. Endocrinol.- 2000.- v. 166.- p. 419-426.

369. Verhoef J., Witter A. // Pharmacol. Biochem. Behav.- 1976.- v. 4.- p. 583-590.

370. Vermes I., Milder G.H., Smelik P.G., Tilders F.G.H. Differential control of p-endorphin/p-lipotropin secretion from anterior and intermediate lobes of the rat pituitary gland in vitro // Life Sci.- 1980.- v. 27.- p. 1761-1768.

371. Versteeg D.H., Van Bergen P., Adan R.A., De Wildt D.J. Melanocortins and cardiovascular regulation // Eur. J. Pharmacol.- 1998.- v. 360 (1).- p. 1-14.

372. Vonvoigtlander P.F., Lewis R.A., Neff G.L. Kappa opioid analgesia is dependent on serotonergic mechanisms. // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1984,- v. 231 (2).- p. 270-274.

373. Vrinten D.H., Gispen W.H., Groen G.J., Adan R.A.H. Antagonism of the melanocortin system reduces cold and mechanical allodynia in mononeuropathic rats // J. Neurosci.-2000.- v. 20 (21).- p. 8131-8137.

374. Wakamatsu K., Graham A., Cook D., Thody A.J. Characterisation of ACTH peptides in human skin and their activation of the melanocortin-1 receptor // Pigment Cell Res.-1997.- v. 10.- p. 288-297.

375. Walker J.M., Akil H., Watson S.J. Evidence for homologous actions of proopiomelanocortin products // Science.- 1980.- v. 210.- p. 1247-1249.

376. Walker J.M., Berntson G.G., Sandman C.A., Kastin A.G., Akil H. Induction of analgesia by central administration of ORG 2766, an analog of ACTH 4-9 // Eur. J. Pharmacol.-1981,- v. 69.- p. 71-79.

377. Weiss J.M., Mc Even B.S., Silva M., Kalkut M. Pituitary-adrenal alteration and fear responding // Amer. J. Physiol.- 1970.- v. 218.- p. 864-868.

378. Wessells H., Blevins J.E., Vanderah T.W. Melanocortinergic control of penile erection // Peptides.- 2005.- v. 26 (10).- p. 1972-1977.

379. Wiegant V.M., Gispen W.H. ACTH-induced excessive grooming in the rat: latent activity of АСТЩ4-10) // Behav. Biol.- 1977.- v.19.- p. 554-558.

380. Wiemer G, Gerharhs HJ, Hock FJ, Using P, Van Rechenberg W, Geiger R. Neurochemical effects of the synthetic ACTH4.9 analog Hoe 427 (Ebiratide) in rat brain //Peptides.- 1988.- v.9 (5).- p. 1081-1087.

381. Wikberg J.E.C. Melanocortin receptors: perspectives for novel drugs. // Eur. J. Pharmacol.- 1999,- v. 375 (1-3).- p. 295-310.

382. Wikberg J.E.S. Melanocortin receptors: new opportunities in drug discovery // Exp. Opin. Ther. Patents.- 2001.- v. 11 (1).- p. 1-16.

383. Wikberg J. E. C., Muceniece R., Mandrika I., Prusis P., Lindblom J., Post C., Skottner A. New aspects on the melanocortins and their receptors // Pharmacol. Res.- 2000.- v. 42 (5).-p. 393-420.

384. Williams D.W.J., Lipton J.M., Giesecke A.H.Jr. Influence of centrally administered peptides on ear withdrawal from heat in the rabbit // Peptides.- 1986.- v. 7 (6).- p. 10951100.

385. Wilson B.D., Oilman M.M., Kang L., Stoffel M,. Bell G.I., Barsh G.S. Structure and function of ASP, the human homolog of the mouse agouti gene // Hum. Mol. Genet.-1995.- v.5.-p. 223-230.

386. Wolterink G., Van Ree J.M., van Nispen J.W. Structural modification of the ACTH(4-9) analog ORG 2766 yields peptides with high biological activity // Life Sci.- 1991.- v. 48.-p. 155-161.

387. Wong W., Minchin R.F. Binding and internalization of the MSH receptor ligand Nle4, D-Phe7. alfa MSH in B16 melanoma cells // Int. J. Biochem. Cell Biol.- 1996.- v. 28 (11).- p. 1223-1232.

388. Wu Q., Li X.C., Ruan H.z., Li H.D. Effect of ACTH on the expression of somatostatin and c-fos in the spinal cord and formalin evoked pain response // Sheng Li Xue Bao. -1999. -v. 51 (1). -p. 60-64.

389. Xia Y., Wikberg J.E.C. Localization of ACTH receptor mRNA by in situ hybridization in mouse adrenal gland. // Cell and Tissue Research.- 1996.- v. 286 (1).- p. 63-68.

390. Xia Y., Wikberg J.E.C. Postnatal expression of melanocortin-3 receptor in rat diencephalon and mesencephalon // Neuropharmacol.- 1997.- v. 36.- p. 217-224.

391. Yamada K., Nabeshima T. Stress-induced behavioral responses and multiple opioid sistems in the brain. // Behav. Brain Res. -1995. -v. 67 (2). -p. 133-145.

392. Yehuda S. Effects of alpha-MSH, TRH and AVP on learning and memory, pain threshold, and motor activity: preliminary results. // Int. J. Neurosci.- 1987,- v. 32.(3-4).-p. 703-709.

393. Yeo G.S.H., Farooqi I.S., Challis B.G., Jackson R.S., O'Rahilly S. The role of melanocortin signalling in the control of body weight: evidence from human and murine genetic models // Q. J. Med.- 2000.- v. 93.- p. 7-14.

394. Zager E.L., Black P.M. Neuropeptides in human memory and learning processes // Neurosurgery.- 1985.-v. 17 (2).-p. 355-369.

395. Zimmer A., Zimmer A.M., Baffi J, Usdin Т., Reynolds K., Konig M., Palkovits M., Mezey E. Hypoalgesia in mice with a targeted deletion of the tachykinin 1 gene. // Neurobiology. -1998. -v. 95. -p. 2630-2635.

396. Zirnheld P.J., Carroll C.A., Kieffaber P.D., O'Donnell B.F., Shekhar A., Hetrick W.P. Haloperidol impairs learning and error-related negativity in humans // J. Cogn. Neurosci.-2004.-v. 16 (6).-p. 1098-1112.

397. Zhou A., Bloomquist B.T., Mains R.E. The prohormone convertases PCI and PC2 mediate distinct endoproteolytic cleavages in a strict temporal order during proopiomelanocortin biosynthetic processing // J. Biol. Chem.- 1993.- v. 268.- p. 17631769.

398. Zhou A., Mains R.E. Endoproteolytic processing of POMC and prohormone convertases 1 and 2 in neuroendocrine cells overexpressing prohormoneconvertases 1 or 2 // J. Biol. Chem.- 1994,- v. 269 (26).- p. 17440-17447.