Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение резистентности к геморрагии и гипобарической гипоксии комплексом регуляторных пептидов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Повышение резистентности к геморрагии и гипобарической гипоксии комплексом регуляторных пептидов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

ПОВЫШЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ГЕМОРРАГИИ И ГИШБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ КОМПЛЕКСОМ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ.

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа рыполнека на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой - академик РАМ11 И.П. Ашмарин).

Научный руководитель:

доктор биологических наук H.A.Соколова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.А.Титов доктор медицинских наук, профессор А.Г.Камкин

Ведущее учреждение - НИИ Общей Реаниматологии РАМН

Защита диссертации состоится "J3." С' £/-t&A X в

/¿-го и U

__часов на заседании Специализированного Ученого Совета

Д.053.05.ЯЬ. Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова по адресу:

119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "

г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Проблема геморрагии и гипобарической гипоксии как экстремальных состояний организма привлекает пристальное внимание исследователей, что обусловлено ее большой значимостью для практического здравоохранения.

В патогенезе геморрагии и гипоксии нарушения кровообращения играют главную роль. Одним из важнейших проявлений нарушения системной гемодинамики является централизация кровообращения, которая обусловлена повышением активности симпатоадреналовой системы. На ранней стадии симпатоадреналовая реакция организма обеспечивает на достаточно хорошем уровне кровоток в коронарных сосудах и сосудах головного мозга. Если же она затягивается, то в общей картине состояния организма все больше проявляются отрицательные стороны вазоконстрикции - уменьшение перфузии и гипоксия периферических тканей, за счет которых достигается централизация кро-вобращения. В свете вышеизложенного вполне логичным выглядит мнение о необходимости коррекции в таких условиях гиперактивности симпатоадреналовой системы.

Регуляторные пептиды - класс физиологически активных веществ протеиновой природы, играющих ключевую роль в регуляции и реализации разнообразных функций организма не только в норме, но и при экстремальных состояниях. Многие из них участвуют в поддержании артериального давления на оптимальном уровне, что представляет собой ключевую задачу организма при экстремальных воздействиях. Важной особенностью эффектов регуляторных пептидов является каскадный характер действия, приводящий к пролонгированным влияниям пептидов.

Важную, но неоднозначную роль при развитии геморрагии и гипоксии играет эндогенная опиоидная система. Если рассматривать роль опиоидной системы как возможного антагониста симпато-адрена-ловой системы, то на ранней стадии экстремального воздействия на организм она может быть отрицательной, а на поздней - положительной.

В этой связи в исследовании был проведен анализ действия при геморрагии и гипобарической гипоксии трех представителей пептидного континуума: В1!?Ра, Т1?Н и аналога фрагмента АКТГ 4-10 пептида Бетах. Такой выбор объясняется тем, что все эти пептиды обладают способностью изменять активность опиоидной системы. Тиролиберин,

FMRFa и фрагменты АКТГ, как правило, относят к группе физиологических антагонистов опиоидов, хотя в отношении TRH и FMRFa имеются данные об их способности проявлять опиоидподобное действие. Кроме того, известно, что эти пептиды обладают прямыми эффектами, не опосредуемыми через активность опиоидной системы. Так, FMRFa способен оказывать активирующее влияние на деятельность сердечно-сосудистой системы (Raffa, 1988). TRH среди пептидов выделяется сочетанием антигипоксических свойств со специфическим активирующим влиянием на дыхательную регуляцию и кислородный гомеостаз (Власова и др., 1994). Для пептида Semax также было показано защитное действие при гипоксических состояниях (Ashmarin et al., 1995). Как TRH, так и Semax, активируют процессы обучения и консолидации долговременной памяти.

Таким образом данные пептиды обладают способностью воздействовать на разные стороны развития процессов геморрагии и гипоксии, что делает логичным их сочетанное использование, т.е. использование комплексов пептидов. Это создает условия, приближенные к событиям, происходящим в организме in vivo, т.к. любая реакция организма обеспечивается одновременным действием множества эндогенных соединений пептидной природы. Кроме того, при применении пептидных комплексов появляется возможность снижения доз ре-гуляторных пептидов, входящих в их состав, что также способствует приближению экспериментальных условий к физиологическим, имеющимся в организме in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование действия пептидного комплекса на течение процессов геморрагии и гипобарической гипоксии и на поведение животных в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах. В соответствии с целью в работе были поставлены следующие основные задачи:

- исследовать влияние пептидов FMRFa, TRH и Semax на изменение среднего АД и ЧСС после геморрагии; определить действующие и подпороговые дозы пептидов при их раздельном введении;

- исследовать действие комплекса пептидов FMRFa, TRH и Semax в подпороговых дозах на показатели АД и ЧСС после геморрагии;

- определить характер влияния предварительной инфузии комплекса пептидов на выживаемость крыс после острой геморрагии;

- исследовать влияние комплекса регуляторных пептидов на устойчивость крыс к экстремальной гипобарической гипоксии;

- оценить влияние пептидного комплекса на изменение уровня биогенных аминов в тканях крыс и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови после гипобарической гипоксии;

- изучить характер влияния геморрагии и гипобарической гипоксии на поведение экспериментальных животных;

- оценить влияние комплекса пептидов на поведение животных в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах.

- провести сравнение эффектов комплекса пептидов и антагониста опиоидных рецепторов налоксона.

Научная новизна: впервые в работе показана возможность повышения резистентности организма к таким экстремальным состояниям, как геморрагия и острая гипобарическая гипоксия комплексом подпо-роговых доз регуляторных пептидов РМНРа, 7№! и Бетах.

При исследовании периодов последействия показано отставленное во времени влияние экстремальных воздействий на поведение животных; использование комплекса пептидов практически устраняло влияния геморрагии и гипоксии на поведение животных в постгемор-рагичсском и постгипоксическом периодах.

Теоретическая и практическая значимость. Диссертационная работа является одной из первых работ, посвященных исследованию возможности комплексного использования регуляторных пептидов при экстремальных состояниях. Впервые показано длительное защитное влияние комплекса пептидов ПЖРа, Т№ и Бетах в подпороговых дозах на течение геморрагии и гипобарической гипоксии и на поведение в последействии. Полученные в работе результаты открывают возможность дальнейшей разработки комплексов пептидов с целью использования их для повышения резистентности организма к экстремальным воздействиям различной этиологии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы апробированы на 1-ом съезде физиологов России, Пушино, 1993; на Международном симпозиуме "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга", Санкт-Петербург, 1994; на Международной студенческой конференции по фундаментальным наукам "Воробьевы горы-94"; на конференции молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995; на П-ом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1995; на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов~96", Москва, 1996; на Всероссийской конференции "Физиологические механизмы

развития экстремальных состояний", Санкт-Петербург, 1995; на 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием, Москва, 1996; на Научной конференции по функциональной нейрохи-мии, Пущино, 1996; и на заседании кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ, 1996.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, 4 работы находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения и выводов и списка литературы. Работа изложена на Ш'2, страницах, содержит/¿"рисунка и /^таблиц. Список литературы включает 1 Восточников.

Автор глубоко признателен сотрудникам кафедры физиологии человека и животных и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ, чья неоценимая помощь позволила состояться этой работе

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы самки и самцы беспородных белых крыс весом 220-320 г, всего в работе использовано 595 животных.

В экспериментах применяли следующие препараты:

- тетрапептид Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (FMRFa), синтезированный в КНД РАМН;

- трипептид тиролиберин pGlu-His-Pro-NH2 (TRH), "Sigma";

- гептапептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (Semax, аналог фрагмента АКТГ 4-10), синтезированный в Институте Молекулярной генетики РАН;

- налоксон, "Du Pont".

Исследование гемодинамики после кровопотери у бодрствующих крыс. Геморрагию вызывали в хроническом эксперименте у бодрствующих крыс (169 самок массой 210-280г), которым за сутки под нембу-таловым наркозом вживляли полиэтиленовый катетер в общую сонную артерию. Регистрацию среднего артериального давления (АД) осуществляли прямым способом через катетер. Для регистрации использовали датчик давления "STATHAM" (США), с которого сигнал поступал на усилитель, а затем на самописец. Частоту сердечных сокращений (ЧСС) определяли по пульсовым колебаниям давления. Регистрацию АД и ЧСС проводили в течение 20 мин до начала забора крови

(исходный уровень) и в течение 1 часа после окончания забора крови. Кровь забирали шприцем через катетер со скоростью 4 мл/мин в количестве 86 мл/кг, объем кровопотери соответствовал 35% теоретически рассчитанного общего количества крови.

Введение веществ проводили сразу после забора крови путем внутриартериальной инфузии через катетер со скоростью 1.2 мл/ч в течение 40 мин. Использовали инфузор Веда-2. Исследуемые вещества растворяли в физиологическом растворе, в контроле вводили соответствующие объемы физ.раствора (0.8 мл).

Исследование выживания после острой геморрагии. Эксперименты проводили на 38 самцах нелинейных белых крыс массой 250-350 г. В отличие от предыдущих опытов в данной серии животным вживляли два катетера: в общую сонную и бедренную артерии. Забор крови проводили из сонной артерии в количестве 28 мл/кг с низкой скоростью (1 мл/мин). Регистрацию АД и ЧСС проводили через катетер в бедренной артерии, начиная за 20 мин до инфузии, в течение 2-х часов. Физиологический раствор в контроле и исследуемые вещества в опыте вводили в/а через катетер в сонной артерии в течение 40 мин до начала забора крови. Если животное не погибало в течение суток, его считали выжившим.

Исследование резистентности животных к действию экстремальной гипобарической гипоксии. Моделирование гипобарической гипоксии осуществляли в барокамере. Опыты были проведены на 151 самце белых нелинейных крыс массой 210-280 г. Эксперименты выполняли при минимальном разрежении атмосферы, при котором гибнет 100% животных; для крыс этот показатель составляет 145 мм рт.ст., что соответствует высоте 11000-11500 м над уровнем моря. "Подъем на высоту" проводили за 1 мин. За 15 мин до начала подъема в/б вводились исследуемые вещества или соответствующие объемы физиологического раствора (1 мл/кг).

Регистрировали следующие параметры:

- время потери позы (ВПП, сек);

- время жизни на "высоте", которое отсчитывали от момента окончания подъема до остановки дыхания либо появления второго атонального вдоха (ВЖ, сек);

- время реституции - время от прекращения гипоксии до момента восстановления активной позы (ВР, сек).

Кроме этих основных показателей для оценки антигипоксическо-

го эффекта рассчитывали коэффициент BI/BP; увеличение значений данного соотношения говорит о возрастании устойчивости организма к действию экстремальной гипобарической гипоксии.

Определение уровня биогенных аминов в тканях крыс и продуктов перекисного окисления липидов (ПОД) в сыворотке крови после гипобарической гипоксии. Опыты были проведены на 89 самцах нелинейных белых крыс массой 210-300 г. Крысы находились в условиях гипоксии, соответствующих высоте 11000 м, в течение 5 мин. Измеряли уровень биогенных аминов через 1 мин и через 20 мин после прекращения гипоксического воздействия с использованием стандартных биохимических методик. Животных забивали путем декапитации, ткани помещали в жидкий азот. Определяли уровень биогенных аминов флуориметрическим методом на спектрофлуориметре Hitachi 850: се-ротонина в селезенке (Miller, Maikel. //Life Sei.1970.V.9. Parti. N13.P.747-752.), адреналина и норадреналина в надпочечниках (Met-colf //Anal.Biochem. 1974. V.57.N1.P.316-320). Флуоресценцию измеряли для адреналина при Х=500 и возбуждающем свете с Х=410 нм, для норадреналина при \=485 и А=385 нм, для серотонина при А=470 и А=360 нм соответственно.

Продукты ПОЛ определяли в сыворотке крови через 20 мин после прекращения гипоксического воздействия. Кровь собирали из нижней полой вены печени и термостатировали при 37°С в течение 1 часа; центрифугировали в течение 10 минут при 1000g, отбирали сыворотку и определяли количество ТБК-активных продуктов на спектрофотометре Specord М-40 при А=532 нм, используя для расчетов s=1.56-105M"1cm~1 (Asakava, Matususita. //Lipids.1980. V.15. N1. P.137-140).

В контроле вводили физиологический раствор (1 мл/кг,в/б) за 15 мин до начала гипоксии, в опыте - комплекс пептидов в подпоро-говых дозах. Определяли также уровни биогенных аминов у животных в отсутствие гипоксии при введении пептидного комплекса или физиологического раствора.

Эксперименты данной серии были проведены на базе кафедры биофизики биологического факультета МГУ под руководством дбн Е.Н.Гончаренко.

Исследование поведения крыс в тесте "открытое поле" в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах. Поведение животных регистрировали на 2-ой, 4-ый и 6-ой дни после соответствующего

- ? -

воздействия. Всего в данной части работы было исследовано поведение 201 крысы.

Животное помещали в центр арены поля и в течение 2-х минут визуально регистрировали следующие показатели:

- горизонтальную двигательную активность по числу пройденных сегментов арены (1 сектор 10x10см);

- вертикальную двигательную активность по числу стоек;

- количество выходов в центр поля;

- интенсивность груминга по числу "умываний".

При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа. Использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, а также критерий t (Стьюдента) и ТМФ (точный метод Фишера). Обработку данных осуществляли на IBM PC/AT-286 с помощью пакета статистических программ STATGRAF, а также с помощью статистических таблиц (Гублер, Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Влияние пептидов FMRFa, TRH и Semax на изменение среднего АД и ЧСС после геморрагии при раздельном введении. Значения АД и ЧСС до геморрагии (исходный уровень) в опытных и контрольных группах достоверно не различались и составили в среднем 112 мм рт.ст. и 356 уд/мин соответственно. После кровопотери наблюдалось падение среднего АД до 25-30% от исходного уровня и ЧСС до 270 уд/мин, которое сменялось постепенным восстановлением.

Введение FMRFa со скоростью 0.1 мг/кг/мин (45 мин, общая доза 4.5 мг/кг) приводило к значительному подъему АД и ЧСС по сравнению с уровнем контроля (рис.1, а). Однако после прекращения ин-фузии наблюдалось резкое снижение АД ниже уровня контроля. Несмотря на более высокие значения гемодинамических показателей на фоне инфузии FMRFa по сравнению с контролем, животные в опытной группе чувствовали себя хуже, и время жизни после прекращения инфузии пептида не превышало 3-х часов в 80% случаев, тогда как в контроле смертность не превышала 14%.

При введении TRH со скоростью 0.1 мг/кг/мин в течение 40 мин на фоне инфузии также наблюдали достоверное увеличение среднего АД, но влияния на АД и особенно на ЧСС были менее выраженными (рис.1,6). Сходные результаты были получены при введении пептида

а) РМЯРа

** >»1» ** ** ** ** ** о—®--Ч

г>

600

ЧСС уд/мин

фиа.раствор 0.1 иг/кг/мин

фиа.раствор 0.1 мг/кг/мин

0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60

мин , ыин

б) ТПН

АЛ*

40 20 0

ЧСС уд/ыин

0 10 20 30 40 50 во 0 10 20 30 40 50 60

пин мии

в) ЭЕМАХ

100

** ** *

I

фиа.раствор 3.0 мкг/кг/мик

500

ЧСС уд/мин

0 10 20 30 40 50 ыин

60

10 20 30 40 50 60 иин

Рис.1. Влияние пептидов П^а, ТВД и Бетах на изменение среднего АД и ЧСС после геморрагии при раздельном введении. По оси абсцисс - время (в мин) от момента окончания забора крови и начала инфузии; | - момент окончания инфузии. По оси ординат -среднее артериальное давление в %% и частота сердечных сокращений уд/мин. За 100% приняты исходные (до забора крови) значения АД. * - р<0.05; ** - р<0.01 (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

Бетах со скоростью 3 мкг/кг/мин, однако влияния на ЧСС выявлено не было (рис.1,в). Случаев гибели животных при введении Т1?Н и 5е-тах не наблюдалось.

При снижении дозы ЛЖРа (0.01 мг/кг/мин и 0.005 мг/кг/мин) не было зарегистрировано достоверных отличий значений АД и ЧСС от контроля, случаев гибели животных также не было отмечено. Таким образом снижение дозы пептида устраняло отрицательное влияние на выживаемость животных, но также устранялось влияние на уровень АД и ЧСС. Аналогичные результаты были получены при снижении дозы ТКН (0.01 мг/кг/мин и 0.005 мг/кг/мин, 40 мин) и Бетах (2 мкг/кг/мин). Т.к. эти дозы пептидов не оказывали выраженного влияния на изменение среднего АД и ЧСС после геморрагии, то в отношении действия на эти показатели указанные дозы являются подпороговыми.

2. Исследование влияния комплексного введения пептидов на показатели АД и ЧСС после геморрагии. Исходя из педставления о комплексном действии регуляторных пептидов в организме мы предположили, что введение смеси исследованных нами пептидов, но в под-пороговых дозах по отношению к их собственным эффектам, сможет оказать положительное влияние на течение геморрагии. Применение подпороговых доз в таком комплексе позволило бы устранить отрицательные эффекты пептидов.

При сочетанном введении пептидов РМКРа и ТРИ в подпороговых дозах (РМЕ^а 0.01 мг/кг/мин + Т??Н 0.01 мг/кг/мин, 40 мин) на фоне инфузии регистрировали достоверное увеличение уровня АД и ЧСС при геморрагии по сравнению с результатами, полученными в контроле (рис.2,а). Кроме того, введение такой смеси устраняло отрицательный эффект, наблюдавшийся при действии РШРа в эффективной дозе: падения АД ниже уровня контроля после прекращения инфузии не возникало.

Введение в смесь третьего компонента - пептида Бетах в под-пороговой дозе (2 мкг/кг/мин, 40 мин) - привело к тому, что значимое превышение АД при введении смеси пептидов относительно уровня АД в контроле наблюдали не только на фоне введения смеси, но и в течение 20 мин после прекращения инфузии (рис.2,б); т.е. в этом случае было достигнуто длительное поддержание АД, что не наблюдалось при независимом действии в сверхпороговых дозах ни одного из регуляторных пептидов. Таким образом в отношении влияния на уровень среднего АД после кровопотери трехкомпонентная

10080 ** ** Г ** ** ** *# ** -------+

00 -1 i

40 фкэ.раствор

20 '"•** пептиды

0- t

a) FMRFa+TRH

50Qqcc УД/»"»

40Q

300

200

10 20

30 40 SO мин

60

у Ио.раствор пептиды

100-BOSO-

ад-го-0-

* f

******* * * * * * *

б) FMRFa+TRH+SEMAX

„„„ ЧСС уд/иин 600 -^^-

£00

20 30 40 50 60 мин

фиэ.раствор пептиды

физ.раствор

ПСПТИДЫ

0 10 20 30 40 мин

50 80 О 10

в) НАЛОКСОН

ЧСС уд/мяв

20 30 40 50 60 мин

500

400

300

200

ф из.раствор нолоксон

10 20 30 40 50 60

МИН

Рис.2. Влияние комплексного введения пептидов и налоксона на показатели АД и ЧСС после геморрагии.

По оси абсцисс - время (в мин) от момента окончания забора крови и начала инфузии; J - момент окончания инфузии. По оси ординат -среднее артериальное давление в U и частота сердечных сокращений уд/мин. За 100% приняты исходные (до забора крови) значения АД. Дозы веществ: FMRFa 0.01 мг/кг/мин; TRH 0.01 мг/кг/мин; Semax 0.002 мг/кг/мин; налоксон - 0.1 мг/кг/мин (40 мин, в/а). Контроль - физ.раствор 1.2 мл/ч, 40 мин, в/а.

* - р<0.05; ** - р<0.01 (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

смесь пептидов (Ш1?Ра+Т1?Н+Зепш) оказывала более выраженное действие, чем двухкомпонентная смесь (П/КРа + Т1?Н) и чем независимое введение каждого из регуляторных пептидов в эффективных дозах.

3. Исследование влияния налоксона на показатели АД и ЧСС после геморрагии. Поскольку мы предполагали, что наблюдаемое нами влияние пептидной смеси при геморрагии могло быть отчасти обусловлено ее антиопиоидной активностью, то с целью выяснения этого предположения были предприняты эксперименты по анализу действия на те же показатели неселективного антагониста опиоидных рецепторов налоксона. Введение налоксона (0.1 мг/кг/мин, 40 мин) на фоне инфузии не оказывало выраженного влияния на АД и ЧСС, а в последействии даже отмечалось достоверное снижение ЧСС ниже уровня контроля (рис.2,в). Необходимо отметить, что из 12 крыс, получавших налоксон, 4 погило в течение суток после кровопотери, что составило 33% (в контроле - 14%).

4. Исследование влияния предварительной инфузии комплекса пептидов (РМУа, ТИН, Зетах) и налоксона на выживаемость крыс после острой геморрагии. Предварительное введение комплекса регуляторных пептидов в подпороговых дозах (П№а 0.01 мг/кг/мин + Т1?Н 0.01 мг/кг/мин + Зетах 0.002 мг/кг/мин, 40 мин) приводило к достоверному (р<0.025 по ТШ?) повышению выживаемости крыс при острой геморрагии: в контрольной группе наблюдалось 79% летальных исходов, в опыте - 23%. Также была проведена серия экспериментов по изучению влияния на выживаемость предварительного введения налоксона (0.1 мг/кг/мин, 40 мин). Данная выборка недостаточно репрезентативна (N=6), тем не менее можно сделать вывод, что введение налоксона не увеличивало выживаемости животных в исследуемой модели геморрагического шока: уровень смертности составил 83%.

Таким образом защитный эффект введения комплекса пептидов при кровопотере проявлялся не только в увеличении среднего АД при введении пептидов после забора крови, но и в увеличении выживаемости животных при острой летальной геморрагии в случае предварительного введения пептидов.

5. Исследование влияния регуляторных пептидов на устойчивость крыс к экстремальной гипобарической гипоксии. В связи с тем, что процесс геморрагии приводит, в конечном счете, к развитию гипоксии в тканях, была проведена серия экспериментов, в которой анализировали действие того же комплекса пептидов

(РМ1?Ра+ТРН+2етах) на развитие гипоксии.

Сначала провели оценку действия сверхпороговых концентраций пептидов при их раздельном введении. Эта оценка частично проводилась по литературным данным, частично в нашем исследовании. Было показано, что ПЖРа в дозе 1 мг/кг увеличивал ВПП и ВЖ, но не влиял на ВР и ВЖ/ВР. Зетах в дозе 100 мкг/кг достоверно увеличивал ВЖ крыс. Введение ТЕ?Н в дозе 1 мг/кг приводило к увеличению ВПП и ВЖ/ВР, но не оказывало значимого влияния на показатели ВЖ и ВР. Таким образом все исследуемые пептиды обладали способностью увеличивать резистентность крыс к условиям экстремальной гипоба-рической гипоксии, но в некоторых случаях эффект был ограничен влиянием на отдельные показатели.

После определения подпороговых доз пептидов, не оказывавших достоверных влияний на регистрируемые параметры, мы исследовали влияние комплекса пептидов в подпороговых дозах.

%

150 125 100 75 50 25 О

**

ВР

ВПП ВЖ

I физ. раствор |

Г~~1 нал оке он 1 мг/кг

2 1.5 1

0.5 О

0.8 0.6 0.4 0.2 - О

ВЖ/ВР - ВЖ/ВР

РМР!Ра 0.6 мг/кг ТРН 0.6 мг/кг ЭЕМАХ 0.05 мг/кг

Рис.3. Влияние комплекса пептидов и налоксона на устойчивость крыс к экстремальной гипобарической гипоксии.

По оси ординат - средние значения ВПП, ВЖ и ВР в %% (за 100X приняты соответствующие значения в контрольной группе) и отношение ВЖ/ВР.

Достоверные отличия от контроля (физ.раствор 1 мл/кг, в/б): *-р<0.05; **-р<0.01 (по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

Введение комплекса пептидов (РКета 0.5 мг/кг + ТИН 0.5 мг/кг Ь'етах 0.05 мг/кг, в/б) приводило к достоверному увеличению ВЦП, ВЖ и отношения ВЖ/ВР, а также к снижению ВР, т.е. пептидный комплекс оказывал положительное влияние на все показатели (рис.3).

Сопоставление действия комплекса пептидов и налоксона при гипобарической гипоксии с целью проверки возможного антиопиоидно-го компонента смеси показало, что налоксон, как и пептидный комплекс, достоверно увеличивал ВПП и ВЖ, но не оказывал влияния на ВР и ВЖ/ВР.

Таким образом сочетанное воздействие пептидов приводило к повышению переносимости животными состояния экстремальной гипобарической гипоксии, т.е. оказывало, как и в случае кровопотери, выраженное положительное влияние на развитие экстремального состояния. Наблюдалось частичное совпадение эффектов налоксона и пептидного комплекса.

6. Анализ изменений уровня биогенных аминов в тканях крыс и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови после гипобарической гипоксии. Развитие экстремальных состояний вызывает значительные сдвиги ряда биохимических показателей, прежде всего характеризующих активность симпаго-адреиаловой системы, которая играет ключевую роль в стрессорных реакциях организма. Эта роль может быть как положительной, так и отрицательной, поскольку такая активация может приводить к потенциации процессов перекисного окисления липидов.

Основные результаты, полученные в этой серии , сводятся к следующему: сразу после гипоксии (1 мин) отмечалось достоверное (р(1:)<0.05) снижение содержания серотонина в селезенке на 33%, адреналина и норадреналина в надпочечниках на 29% и 20% соответственно. Введение комплекса подпороговых доз регуляторных пептидов (РМ!ЗРа, ТК!Н, Зетах) в отсутствие гипоксии не оказывало значимого влияния на содержание биогенных аминов по сравнению с контролем, тогда как предварительное введение такого комплекса за 15 мин до гипоксии практически устраняло эффекты гипоксии на этот показатель: содержание серотонина и адреналина возвращалось к контрольному уровню.

Анализ процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) показал, что к тому моменту, когда в периферических тканях исчезают изменения со стороны биогенных аминов (20 мин после окончания ги-

поксического воздействия), отмечается достоверное увеличение содержания продуктов ПОЛ (МДА) в сыворотке крови на 192% (р<0.01) относительно контроля. Предварительное введение смеси пептидов снижало этот эффект до 66£ (р<0.05). При этом сама смесь не оказывала достоверного влияния на содержание МДА.

Таким образом проведенный нами биохимический анализ позволил заключить, что использованный комплекс пептидов способен препятствовать развитию изменений в уровне биогенных аминов, сопровождающих стрессорную реакцию в условиях острой гипоксии, и частично устраняет эффект гипоксического воздействия на процессы ПОЛ. Эти эффекты в совокупности с полученными данными о способности пептидного комплекса оказывать влияние на физиологические показатели устойчивости крыс к действию гипобарической гипоксии дают основание говорить об определенном ангигипоксическом действии исследуемого комплекса регуляторных пептидов.

В целом выявленное положительное влияние комплекса пептидов ГШ^а, Т{?Н и Бетах на величину АД и ЧСС после кровопотери, на выживаемость животных после острой летальной геморрагии, а также на увеличение устойчивости крыс к условиям экстремальной гипобарической гипоксии говорит о том, что такой комплекс может обеспечивать повышение резистентности организма к экстремальным факторам воздействия.

Анализ возможного участия в этом эффекте опиоидподобного компонента показал, что в случае геморрагии действие пептидного комплекса не опосредовано через эндогенную опиоидную систему, тогда как при гипоксии явно присутствует антиопиоидный компонент действия. Кроме того, при гипоксии защитный эффект пептидного комплекса проявлялся во влияниях на уровень биогенных аминов и на процессы перекисного окисления липидов. Возможно, что кроме этого присутствовали и собственные эффекты пептидов, входящих в комплекс. Таким образом, наблюдаемое нами повышение резистентности к гипобарической гипоксии может быть обусловлено действием комплекса пептидов на все эти процессы.

7. Исследование поведения крыс в тесте "открытое поле" в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах. Известно, что как кровопогеря, так и гипоксия вызывают значительные изменения в состоянии животных, выражающееся не только в сиюминутных, но и в отставленных во Бремени сдвигах физиологических и биохимических

показателей. Изменения такого рода могут сказываться и на поведенческих реакциях животных. Для исследования этого предположения был проведен анализ поведения животных в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах, результаты представлены в табл.1 и табл.2 соответственно.

Таблица 1. Влияние комплексов пептидов и налоксона на поведение животных в постгеморрагическом периоде.

группы животных п ГДА, условн.ед. |ВА,число стоек число"выходов"

дни после геморрагии

2 4 6 2 4 6 2 4 6

операция (контроль) 28 41.7 26.1 25.9 »# 7.4 4.0 3.7 1.3 0.7 0.7 #

гeмoppaгия^ физ.раствор 34 26.0 -к* 26.4 27.9 5.1 * 4.5 5.8 * 1.4 1.0 1.1

геморрагия* FMRFa+TRH 9 40.2 @ 31.4 33.3 6.4 5.9 6.0 0.9 1.7 1.3

гемор.+TRH+ FMRFa+Semax 11 42.7 @@ 30.0 25.6 # 6.1 4.5 2.8 # 2.6 @ * 1.1 0.8 #

геморрагия* налоксон 8 52.5 @@ 34.5 28.8 и 7.0 4.5 3.3 # 2.3 1.7 * 0.7 К

Дозы веществ : FMRFa 0.01 мг/кг/мин; TRH 0.01 мг/кг/мин; Semax 0.002 мг/кг/мин; наюксон 0.1 мг/кг/мин (в/а инфузия, 40 мин). Достоверные отличия между группами : от контроля (оперированные крысы) *-р<0.05; **-р<0.01; от геморрагии (геморрагия + в/а инфузия физиологического раствора) @-р<0.05; @@-р<0.01; внутри групп: от значения соответствующего показателя на 2-ой день 8-р<0.05; ##-р<0.01 (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

В качестве контроля при геморрагии была использована группа оперированных животных. Операция приводила к снижению величины двигательной активности по сравнению с интактными животными, но не влияла на динамику показателей: как и в группе интактных животных, у оперированных крыс наблюдается достоверное снижение ГДА, ВА и количества "выходов в центр" к 3-й посадке в арену "открытого поля" (6-й день) (табл.1). Наблюдаемое угасание ориентировочно-исследовательской реакции, очевидно, связано с запоминанием животными экспериментальной обстановки. Аналогичные результаты были получены в группе контрольных животных при исследовании влияния гипоксии на поведение (табл.2; рис.4,а).

%

100 75 50

100 75 60 25 0

ГДА

2-й

4-й

6-й

1 в

%

1 г ВА

1 г

4-й

6-й

12 12 1 г выходы в центр

100 75 50 25 О

2-Й

4-й

6-й

3 4 3 4 3 4

выходы в центр

Рис.4. Сравнение влияний геморрагии и гипоксии на поведение крыс в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах.

а) 1. операция без последующей геморрагии 2. физ.раствор без последующей гипоксии

б) 3. геморрагия + физ.раствор 4. гипоксия + физ.раствор

ГДА - горизонтальная двигательная активность, ВА - вертикальная двигательная активность. По верхней оси абсцисс - дни после воздействия; по оси ординат - значения показателей в Во всех случаях за 100 % приняты значения характеристик в соответствующем контроле на 2-ой день после воздействия.

Достоверные отличия между группами: * - р<0.05; внутри групп от значения соответствующего показателя на 2-ой день: #-р<0.05; ##-р<0.01; ###-р<0.001 (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

- г/ -

В то же время сопоставление значений показателей поведения у геморрагичеких животных (геморрагда+физ.раствор) и у гипоксичес-ких животных (гипоксия+физ.раствор) показало, что и кровопотеря, и гипоксия приводят к снижению ГДА и ВА крыс на 2-ой день после воздействия а также нарушают способность к запоминанию экспериментальной обстановки (отсутствует достоверное снижение значений показателей к 6-ому дню). В случае гипоксии значения ГДА на 4-ый и 6-ой дни были ниже соответствующих значений в группе геморрагических животных (рис.4,б), что, однако, не влияло на общую направленность изменений показателей.

Таблица 2. Влияние комплекса пептидов и налоксона на поведение животных в постгипоксическом периоде.

группы животных п ГДА, условн.ед. ВА,число стоек число"выходов"

дни после гипоксии

2 4 6 2 4 6 2 4 б

физ.раствор (контроль) 23 56.4 32.8 21.6 ### 12.6 5.3 3.6 ### 3.3 1.8 А 1.7 1.3 1.5 и

ГИП0КСИЯ+ физ.раствор 22 30.3 *** 22.5 27.9 7.4 ** 5.6 6.4 * 1.9

гипокс. +Т1?Н ВКРа+Бетах 16 48.6 @@(Э 38.4 @@@ 24.3 ### 11.0 @ 8.9 @ * 6.2 # 3.2 @ 2.7 1.1 ##

ГИП0КСИЯ+ налоксон 8 48.6 @@ 41.6 21.3 9.3 6.3 3.7 # 4.3 @ 3.6 @ * 1.8 #

Дозы веществ : РШРа 0.5 мг/кг; ТШ 0.5 мг/кг; Зешах 0.05 мг/кг; налоксон 1 мг/кг (в/б).

Достоверные отличия между группами : от контроля *-р<0.05; **-р<0.01; ***-р<0.001; от гипоксии (гипоксия + физ.раствор) @-р<0.05; @@-р<0.01; @@@-р<0.001; внутри групп: от значения соответствующего показателя на 2-ой день #-р<0.05; ##-р<0.01; «й«-р<0.001 (по критерию Вилклксона-Манна-Уитни).

Таким образом, на основании анализа поведенческих характеристик мы показали, что относительно кратковременное острое изменение физиологического состояния организма влечет за собой длительное последействие, вероятно, связанное с нарушением центральных механизмов, обеспечивающих процессы запоминания. Однонаправленность изменений поведенческих параметров в случае геморраги-

ческих и гипоксических воздействий, возможно, объясняется тем, что оба эти процесса сопровождаются развитием гипоксии и сходными сдвигами биохимических показателей.

8. Влияние комплекса пептидов на поведение крыс в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах. На основании полученных нами данных мы предположили, что повышение резистентности организма к геморрагии и гипоксии, обусловленное комплексом пептидов, может оказать положительное влияние и в период последействия. Эксперименты показали, что как в посгеморрагическом, так и в постгипоксическом периодах введение пептидного комплекса (РМ1?Ра+Т1?Н+5етах) приводило к достоверному увеличению ГДА и количества "выходов в центр" на 2-ой день после воздействия по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор (табл.1; табл.2). Кроме того, в постгипоксическом периоде отмечалось достоверное увеличение также и ВА крыс на 2-ой и 4-ый дни.

Введение комплекса пептидов приводило к восстановлению способности к запоминанию экспериментальной обстановки: на 6-ой день показано достоверное снижение ГДА, ВА и количества "выходов в центр" как при гипоксическом, так и при геморрагическом воздействии. Возможно, на восстановление способности к запоминанию обстановки непосредственное влияние оказывает введение в смесь пептида Бетах, так как при исследовании влияния двухкомпонентного комплекса (РШРа+ТШ) отмечалось увеличение двигательной активности в постгеморрагическом периоде на 2-ой день после кровопоте-ри, но достоверного снижения показателей к 6-ому дню выявлено не было (табл.1).

Сравнение данных показало, что влияние трехкомпонентного комплекса пептидов на поведение животных в постгипоксическом и постгеморрагическом периодах сопоставимо (рис.5, а).

Таким образом, одноразовое введение комплекса пептидов непосредственно перед экстремальным воздействием (при гипоксии) или инфузия сразу после такого воздействия (при геморрагии) вызывает длительный следовой эффект, выражающийся в значительном изменении поведения животных.

Наблюдаемое нами влияние на поведенческие реакции животных могло быть связано с антиопиоидным компонентом комплекса пептидов. Анализ поведенческих характеристик животных, которым вводили налоксон, показал, что как в постгипоксическом,так и в постгемор-

-

выходы в центр & выходы и центр

а) б)

Рис.5. Сравнение влияний введения комплекса пептидов (а) и налок-сона (б) на поведение крыс в постгеморрагическом и постгипокси-ческом периодах.

а) 1. геморрагия + комплекс пептидов (РШРа+ТШ+Бетах 0.01+0.01+

0.002 мг/кг/мин, 40 мин, в/а) 2. гипоксия + комплекс пептидов (РМР?Ра+Г1?Н+Бетах 0.5+0.5+0.05 мг/кг, в/б)

б) 3. геморрагия + налоксон (0.1 мг/кг/мин, 40 мин, в/а) 4. гипоксия + налоксон (1 мг/кг, в/б)

Условные обозначения см. рис.4.

Достоверные отличия мегкду группами отсутствуют; внутри групп от значения соответствующего показателя на 2-ой день: #-р<0.05; ##-р<0.01; ###-р<0.001 (по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

рагическом периодах налоксон оказывал существенные однонаправленные влияния на поведение животных: наблюдалось увеличение ГДА на 2-ой день после воздействия, а также восстанавливалась способность к запоминанию животными экспериментальной обстановки (табл.1; табл.2; рис.5,б).

Влияние налоксона на поведение животных было сопоставимо с влиянием комплекса пептидов, что может свидетельствовать об участии эндогенной опиоидной системы в постгипоксическом и постгеморрагическом периодах. Однако восстановление способности к запоминанию экспериментальной обстановки при введении пептидного комплекса могло быть обусловлено и другими причинами, в частности, его антигипоксическим действием, показанным в предшествующих экспериментах, и прямыми эффектами ТВД и Бетах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общий анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод о способности комплекса подпороговых доз исследованных регулятор-ных пептидов оказывать защитное влияние при таких тяжелых экстремальных состояниях, как острая геморрагия и гипобарическая гипоксия. Это влияние выражается в повышении резистентности организма и сохраняется в период последействия.

Сравнение эффектов пептидного комплекса с эффектами опиоид-ного антагониста налоксона показывает, что при гипоксии и в постгипоксическом и постгеморрагическом периодах имеется антиопиоид-ный компонент действия, что, возможно, обусловлено антиопиоидной активностью РМ!?Га, ТИН и Бетах. С этой активностью может быть связано и выявленное нами влияние комплекса пептидов на уровень биогенных аминов и продуктов ПОЛ, однако эти эффекты могут быть следствием и прямого действия на эти процессы пептидов, входящих в состав комплекса. Наряду с этим надо учитывать и возможность прямых эффектов этих пептидов на сердечно-сосудистую, дыхательную систему и процессы обучения и консолидации памяти.

Таким образом в основе обусловленного пептидным комплексом повышения резистентности организма к геморрагии и гипобарической гипоксии, скорее всего, лежит не один, а несколько механизмов, взаимосвязанных и дополняющих друг друга.

Физиологическое значение этого факта прямо связано с концепцией плейотропности пептидного континуума, согласно которой в ре-

гуляции экстремальных состояний участвует большое число взаимосвязанных регуляторных пептидов, каждый из которых полифункционален.

ВЫВОДЫ.

1. Пептиды ВЖРа, ТИН и Бетах при независимом действии в сверхпороговых дозах достоверно увеличивали АД и ЧСС при геморрагии и повышали устойчивость крыс к гипобарической гипоксии. Однако при этом наблюдались как отрицательные эффекты, так и ограниченное влияние на изменение показателей при обоих видах экстремальных воздействий.

2. Сочетанное введение комплекса пептидов РМРГа, ТРН и Бетах в подпороговых дозах при геморрагии достоверно увеличивало АД и ЧСС по сравнению с контролем и устраняло отрицательный эффект КМ!?Ра в сверхпороговой дозе, а также приводило к значительному увеличению длительности защитного эффекта.

3. Защитный эффект пептидного комплекса при геморрагии проявлялся также в достоверном увеличении выживаемости крыс при остром геморрагическом шоке, приводящем к летальному исходу.

4. Комплекс подпороговых доз пептидов достоверно повышал резистентность крыс к острой гипобарической гипоксии, что выражалось в достоверном увеличении времени потери позы и времени жизни, уменьшении времени реституции и увеличении отношения времени жизни к времени реституции.

5. Гипоксия приводила к достоверному снижению содержания се-ротонина в селезенке и адреналина в надпочечниках через 1 минуту после прекращения гипоксии-, введение пептидного комплекса устраняло эти эффекты. Через 20 мин после гипоксии отмечалось достоверное уменьшение содержания норадреналина в стволе мозга, пептидная смесь также устраняла этот эффект.

6. Сопоставление действия комплекса регуляторных пептидов с действием неселективного антагониста опиоидных рецепторов налок-сона показало, что в случае геморрагии эффект пептидного комплек-

са отличался от действия налоксона, тогда как при гипоксии эти эффекты были сопоставимы.

7. Исследование поведения крыс в постгеморрагическом и пост-гипоксическом периодах показало достоверное изменение ряда поведенческих характеристик: снижение ГДА и ВА на 2-ой день и подавление способности к запоминанию экспериментальной обстановки к 6-ому дню после экстремального воздействия.

8. Введение пептидного комплекса практически устраняло влияния геморрагии и гипоксии на поведение животных в постгеморрагическом и постгипоксическом периодах. Влияние налоксона на поведение в целом было сопоставимо с действием пептидного комплекса.

9. В целом полученные нами данные позволяют сделать общий вывод о повышении резистентности организма к действию экстремальных факторов (геморрагии и гипобарической гипоксии) под влиянием комплекса подпороговых доз пептидов FMRFa, TRH и Semax.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Крушинская Я.В., Мамаева Т.В., Соколова H.A. Защитное действие FMRFa при остром геморрагическом шоке у бодрствующих крыс.// Вестник МГУ, 1996, сер.16 биология, N1, с.19-22.

2. Крушинская Я.В., Бастрикова Н.А., Соколова H.A. Пептидер-гическая коррекция кардио- и гемодикамических показателей при остром геморрагическом шоке у бодрствующих крыс. // Вестник МГУ, 1996, сер.16 биология, N4, с.21-24.

3. Бастрикова H.A., Крушинская Я.В., Дубинин В.А., Каменский A.A., Соколова H.A. Влияние пептидергической коррекции геморрагического шока на поведение крыс в постгеморрагическом периоде.// Бюл.эксп.биол. и медицины, 1995, N12, с.623-625.

4. Бастрикова H.A., Крушинская Я.В., Каменский A.A., Соколова H.A., Ашмарин И.П. Пептидергическая коррекция геморрагического шока.// Успехи физиологических наук, 1996, Т.27, N1. с.32-46.

5. Крушинская Я.В. Влияние FMRFa и TRH на течение острого геморрагического шока у бодрствующих крыс.//Тез.докл.конф. молодых физиологов и биохимиков России, Санкт-Петербург, 1995, с.105.

6. Крушинская Я.В., Бастрикова H.A., Белов И.Ю., Кошелев

В.Б., Соколова H.A. Защитное влияние эндогенного антагониста опи-оидных рецепторов FMRFa при гипоксическом шоке у крыс.// Тез. докл. II Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 1995, с.222.

7. Крушинская Я.В., Орлов A.B., Соколова H.A. Влияние смеси регуляторных пептидов на устойчивость крыс к экстремальной гипобарической гипоксии. // Тез.докл. I Российского конгресса по патофизиологии с международным участием, 1996, с.300.

8. Крушинская Я.В., Соколова H.A., Кошелев В.Б. Влияние под-пороговых доз эндогенных регуляторных пептидов на кардио- и гемодинамику при развитии острого геморрагического шока у бодрствующих крыс. // В сб.: Физиология регуляторных пептидов, Кемерово, 1993, с.37.

9. Соколова H.A., Крушинская Я.В., Кошелев В.Б., Крылов В.Н., Ларин С.Б. Роль эндогенной антиопиоидной системы при геморрагическом шоке.// Успехи физиологических наук, 1994, Т.25, N 4, с.65. Тезисы съезда физиологов.

10. Соколова H.A., Крушинская Я.В., Бастрикова H.A., Кошелев

B.Б., Беспалова Ж.Д. Защитное влияние эндогенного пептидного опи-оидного антагониста FMRFa при остром гипоксическом и геморрагическом шоках у крыс.// Тез. докл. Международного симпозиума "Фи-зиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга", Санкт-Петербург, 1994, с.34.

11. Антонова C.B., АхалаяМ.Я., Байжуманов А. А., Шестакова

C.B., Гончаренко E.H., Крушинская Я.В., Орлов A.B., Соколова H.A., Каменский A.A., Парин С.Б., Ашмарин И.П. Функциональные и биохимические корреляты гипоксического шока: кооперативное влияние регуляторных пептидов.// Бюл.зксп.биол. и медицины, в печати.

12. Гончаренко E.H., Платонов А.Г., Крушинская Я.В., Балан П.В., Кудряшова H.Е., Соколова H.A. Повышение резистентности к гипобарической гипоксии пептидным комплексом: физиологические и биохимические данные. //Вестник МГУ, 1996, в печати.

13. Байжуманов A.A., Крушинская Я.В. Гипоксический шок и ре-гуляторные пептиды: влияния на интенсификацию перекисного окисления липидов. //Тез.докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96", 1996, в печати.

14. Крушинская Я.В., Орлов A.B. Влияние регуляторных пепти-