Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства 4/1-подобных белков растений - возможных факторов внутри- и межклеточного транспорта

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства 4/1-подобных белков растений - возможных факторов внутри- и межклеточного транспорта"

РОССИЙСКАЯ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

МИНИНА Елена Андреевна

СВОЙСТВА 4/1-ПОДОБНЫХ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ -ВОЗМОЖНЫХ ФАКТОРОВ ВНУТРИ- И МЕЖКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА

03.00.03-МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003068585

Работа выполнена в группе молекулярной диагностики Института Биоорганической Химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Кандидат химических наук

Ерохина Татьяна Николаевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

кандидат биологических наук

Васецкий Никита Сергеевич

доктор биологических наук, профессор

Добров Евгений Николаевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защита состоится 25 апреля 2007 года на заседании Диссертационного совета Д 002.019.01 при Институте Биоорганической Химии им. М.М.Шемякина и ЮЛ.Овчинникова. РАН, по адресу: Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биоорганической Химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.

РАН

Автореферат разослан «23» марта 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

ВА.Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аннотация.

В диссертационной работе поставлена актуальная научная задача, состоящая в идентификации и изучении свойств белков, участвующих в межклеточном и внутриклеточном транспорте в растениях. Ранее было показано, что белок 4/1 Arabidopsis thaliana способен взаимодействовать с транспортным белком вируса бронзовости томата. В ходе выполнения данной работы был обнаружен ряд гомологов белка 4/1 А. thaliana, которые были объединены в новый класс белков растений, предположительно вовлеченных в процесс внутриклеточного и межклеточного транспорта макромолекул. Целью данной работы было изучение свойств белков нового класса на примере белков 4/1 А. thaliana, Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana.

Актуальность проблемы

Изучение молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта в растениях является одним из основных направлений молекулярной биологии растений.

Функционирование любого многоклеточного организма предполагает наличие тесного контакта между отдельными клетками. В растениях клетки соединены между собой специализированными межклеточными контактами - плазмодесмами (ПД), которые представляют собой поры, пронизывающие клеточные стенки соседних клеток и объединяющие соседние клетки в единый синцитий. Считается, что на ранних стадиях развития растение представляет собой симпласт клеток, соединенных плазмодесмами; в дальнейшем часть плазмодесм отмирает или модифицируется, и симпласт разделяется на "домены" (Esau and Thorsch,1985). Было показано, что внутри каждого такого симпластного домена метаболизм и функционирование клеток синхронизировано (Goodwin, 1983). Межклеточный транспорт является одним из основных процессов, регулирующих рост и развитие растений. Чд>ез плазмодесмы осуществляется транспорт питательных веществ, гормонов, а также макромолекул; при участии этих межклеточных контактов происходит распространение сигналов дифференцировки, посттранскрипционного умолкания генов, апоптоза {Lucas et al.,1993). Известно также, что через плазмодесмы происходит распространение вирусной инфекции из первично зараженной клетки (Atabekov and Dorokhov, 1984). Было показано, что транспорт небольших молекул, размер которых не превышает диаметр плазмодесм, является пассивным процессом и происходит за счет диффузии. Транспорт более крупных молекул является

активным процессом, требующим затрат энергии и сопровождающимся изменениями структуры как самой плазмодесмы, так и транспортируемой частицы (Ding et al., 1992).

Необходимой стадией, предваряющей межклеточный транспорт, является доставка транспортируемых частиц на периферию клеток к плазмодесмам. (Ding et al, 198; Lazarowitz and Beachy, 1999).

Удобной моделью для исследования молекулярных механизмов межклеточного и внутриклеточного транспорта в растениях являются транспортные белки вирусов растений (ТБ). Транспортные белки обеспечивают перемещение генома вируса внутри клетки, перенос его в соседние клетки и распространение вирусной инфекции по всему организму растения (Atabekov and Dorokhov, 1984). Известно, что ТБ вирусов растений используют систему транспорта клеток хозяина (Lucas et al ,1995; Carrington et al.,1996; Ghoshroy et al.,1997). Большое разнообразие транспортных белков делает их удобными моделями для изучения молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта растений (Mushegian et al, 1993; Lazarowitz and Beachy, 1999).

Белок 4/1 A. thaliana был обнаружен как фактор, способный взаимодействовать с транспортным белком вируса бронзовости томата. Изучение свойств белка 4/1, предположительно вовлеченного в процесс транспорта вирусов в растениях, является существенным вкладом в исследование молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта и представляет собой актуальную задачу.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение свойств белка 4/1 A. thaliana и его гомологов, предположительно участвующих в процессе межклеточного транспорта вирусов в растениях. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Выявление гомологов белка 4/1 в геномах других растений;

2. Определение структуры гена бежа 4/1;

3. Изучение внутриклеточной локализации белка 4/1 и мутационное картирование районов белка 4/1, ответственных за его внутриклеточную локализацию;

4. Выявление потенциальных белков-партнеров белка 4/1.

Научная новизна исследования и практическая ценность работы

В ходе выполнения данной работы был открыт новый класс белков, предположительно участвующих в межклеточном транспорте вирусов в растениях. Были изучены особенности внутриклеточной локализации этих белков, показана их ассоциация с актиновым цитоскелетом клеток и

эндоплазматическим ретикулумом. Получены данные о том, какие белки растений способны взаимодействовать с белками 4/1. В частности было показано взаимодействие белков 4/1 с ферментами биогенеза клеточной стенки и некоторыми транскрипционными факторами растений.

Работа имеет значение для дальнейших исследований молекулярных механизмов транспорта в растениях. Полученные данные могут использоваться для создания новых подходов к созданию трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на российских и международных конференциях:

XIII International Conference and Scientific Discussion Club "New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology", Гурзуф, Украина, 2005; The 6th International Symposium in the Series "Recent advances in plant biotechnology", Чески Будиевицы, Чехия, 2005; 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века», Пущино, 2006; на конференции «VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова», Москва, 2006, а также на совместном семинаре группы молекулярной диагностики и лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литература», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы»,

«Список литературы». Работы изложена на_страницах, содержит_

иллюстраций. Список литературы включает_публикаций.

Содержание работы.

В данной работе мы изучали свойства белка 4/1 A. thaliana, предположительно вовлеченного в процесс межклеточного транспорта в растениях.

Белок 4/1 был выявлен при скрининге кДНК библиотеки A. thaliana как потенциальный партнер Nsm - транспортного белка вируса бронзовости томата (ВБТ) (von Bargen et al,2001). Белок 4/1 является небольшим гидрофильным полипептидом длиной 247 аминокислотных остатков с предсказанной молекулярной массой 29,1 кДа.

При анализе аминокислотной последовательности бежа 4/1 A. thaliana не удалось выявить наличие у него каких-либо известных функциональных доменов. Однако было показано сходство его аминокислотной последовательности с последовательностями миозина (von Bargen et al.,2001).

Взаимодействие белка 4/1 с транспортным белком ВБТ в условиях дрожжевой двугибридной системы, позволило сделать предположение о вероятном участии этого белка в процессе транспорта в растениях.

Поиск гомологов белка 4/1 Arabidopsis thaliana in silico.

Анализ электронных баз данных NCBI позволил выявить наличие гомологов белка 4/1 А. thaliana в геномах других однодольных и двудольных растений. Сходство между последовательностями этих белков у двудольных растений составляет примерно 52-60%, а между последовательностями одно- и двудольных - около 40-43% (рис.1). Дальнейший анализ электронных баз данных показал, что наличие 4/1-подобных белков характерно только для представителей царства растений; значительного сходства 4/1-подобных белков с другими белками одно- и двудольных растений найдено не было. В связи с этим, белок 4/1 и его гомологи были объединены в новый класс белков растений.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей обнаруженных гомологов белка 4/1 позволил выявить несколько консервативных областей, характерных для этих белков. В частности, было установлено, что наиболее консервативной является С-концевая область белков, кодируемая последним экзоном гена (рис.1).Было показано, что наиболее консервативный участок белков 4/1 имеет сходство с консервативным мотивом MADS-box, характерным для транскрипционных факторов растений. Известно, что MADS-box-содержащие белки способны к автономному транспорту через плазмодесмы (Hake and Char, 1997).

Также было обнаружено, что последовательности рассмотренных нами 4/1-подобных белков на большей части их длины формируют coiled-coil структуры и содержат так называемые мотивы «лейциновая молния», представляющие собой 3 или более остатков лейцина, расположенных на расстоянии шести аминокислотных остатков друг от друга. Известно, что данный мотив может играть роль в олигомеризации белков (Porte et al., 1997)

На основании

полученных данных нами была выдвинута гипотеза, что 4/1-нодобные белки возникли в ходе эволюции зеленых растений. Высокая степень гомологии 4/1-подобных белков позволяет

предположить, что они связаны с базовыми биологическими процессами, вероятно, появившимися впервые в

таксономической груттае зеленых

растений.

Ни один из обнаруженных нами 4/1-подобных белков не был ранее охарактеризован. Кроме того, не для всех обнаруженных гомологов белка 4/1, имеющихся в базах данных NCBÎ, была показана экспрессия in vivo. Поэтому, для подтверждения результатов, полученных ¡и silico, была проведена иммунодегекция белка 4/1 и его гомологов из других растений.

Иммунодегекция белка 4/1 Arabidopsis thaliana и его гомологов.

Для иммунодетекции белка 4/1 A. thaliana и его гомологов из других растений был получен и протестирован ряд моноклональных антител (MA).

Получение моноклональных антител проводилось с использованием стандартной методики, изложенной в разделе "Methods for the production of mouse monocional antibodies" книги "Molecular methods in plant pathology" (Mernaugh R. and Memaugh G„ 1995). Мыши линии BALB/c иммунизировались счищенным на Ni-NTA агарозс белком 4/\ A. thaliana, содержащим на N-конце дополнительные 6 гистидиновых аминокислотных остатка.

ÎLYSÈdtïJïïipgç^H^- ______

KÉrtis

».¿■iJ-SifBlTUYKJ^Siafrjîtcn—* .- VI :: : L i- и 1. ? ^ - ГС :H F i .

tOYtjH

liÎK^BabÎÏ^L^wrwJ "''''""ÎjÉ'^fiOÇBMSpÇj

■НЩт^кнвгш

рбШчкяйР1*!!

h.ttuXUnh

M. tri(OC*t. U.bentli«.

S.elttcift, г.тлу

V^jÔçl^Are1Л D sifj, VÊQBïtKK

îamw d wsBkîî^çv^ t fак

-■■lyebÔQD со

¡¡ЕхЦмх?«

Ряс. Jr СрлйНстк îmmiiomic.KH Иш iieewiOïflеяыюгаЦ J./l-lhvrainuï fiMWûfr, Цифрами

от I до 8 «гн^чени юС-КЛОаятымюсги, соот&г тпнукмик нпиш юопон.

Картирование эпигонов МА проводилось при помощи методов иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга (таб. 1), Для этого были получены делеционные мутанты белка 4/1 А. ЛаНапа (рис,2)

»1 ДОш

Э1РК Я-Жэг

Ш - —■■ аоКаН*1чо

Рис.2. Схема делеционные мутантов белка 4/1 АгаЫ(1орз11 ¡ИаИат.Темным цветом выделены районы аминокислотной последовательности, предположительно участвующие и формировании со1Ы-соИ структуры.

Р1-С, ДСрк1 и АЬ'хИо. Мутанта ый белок Д1чх1ю содержал наиболее консервативный С-концевой район белка, белок ДСрз! содержал нею последовательность белка, кроме консервативного С-концйного участка, а Р1-С - последовательности всех пяти консервативных районов белка, участвующих в образовании соЙей-соП структуры.

М о нок локальные антитела, наиболее сильно вза им о-действующие с белком 4/1 А. (кЫШпа, использовались для детекции его гомологов в других растениях. Наиболее зффек-тиииая реакция наблюдалась при использовании антител 11.32, взаимодействующих с коксерва-тивным С-концевым участком белков 4/1.

Методом 13естерн б л от было подтверждено, что белок 4/1 экспрессируется в растениях А. (НаНапа. Также с помощью этого метода была проведена детекция гомологов белка 4/1 А. ГкаПапа в других растениях.

Результаты иммуно-детекции гомологов белка 4/1 А. !НаПапа при помощи м о но кл опальных антител позволили выявить наличие белков 4/1 в растениях, последовательности геномов которых не доступны пока в электронных базах данных, а также показали, что в ходе эволюции сохранялись консервативные эпитопы. Таким образом, результаты опытов по

ТаВлшы 1. Эпкгопное картою вине беПВЙАЙоЙога

МА к Методы тес тира вант МА

ббОД ИФА Иммунтлоттннг

4П 4П п-с ¿ср»( 4/1 15С(Ж

102 + * + + + • +

41)4 + + + + т + + -

4В6 + + + + + + • +

2В1 ... + + - + + + -

2А! + + + + + +

1СЗ + + + 1 + +

• . гешпкеттаодая реакция; отрицательная реакция.

иммунодетекции подтвердили и дополняли результаты, по;[ученные при помощи компьютерного анализа.

г

э

4

—

— 83-л. —>45>л.

S

7

Рис. Ъ А. Детекция белков 4/1 в экстрактах растений методом Вестерн блот. 1-

рекомбинантиый белок 4/ix6His; 2-Nicoliuna clevelandii;

3- Nicotiana tabacum; 4- Nicotiana benthamiana; 5-маркер молекулярных масс; 6-Solanum tuberosum, 7- Gingko biloba; 8- Manihot eiculenia; 9-Aruhidopsis ihaliana; 10- Poa pratensis.

Клонирование кДНК гомологов белка 4/1 ю растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum

В опытах по им му и о детекции гомологов белка 4/1 А. thalicina было показано, что таковые имеются у растений N. benthamiana и N. tabacum Поскольку N. benthamiana и N. tabacum являются более удобной моделью для проведения запланированных нами экс пери ментол по временной экспрессии белка 4/1 в клетках растений и флуоресцентной микроскопии, нами были клонированы полные копии кДНК гомологов белка 4/1 из этих растений. Для этого использовались методы 5' и 3' RACB-PCR.

В результате было установлено, что сходство последовательностей кДНК 4/1-подобных белков N. benthamiana и N. tabacum составляет 98%, такой же уровень сходства был показан при выравнивании продуктов трансляции этих последовательностей. Сходство последовательностей кДНК 4/1-подобиых белков из растений Табаков и кДНК белка 4/1 А. thaliana составляет около 60% (рис.1).

При клонировании к ДНК 4/1-подобных белков из растений Табаков было обнаружено, что в клетках растений N. tabacum помимо обычной мРНК 4/1 присутствует также ее укороченная форма. На основе результатом сравнительного анализа последовательностей гена белка 4/1 А. thaliana, и обеих кДНК 4/1-подобного бежа N. tabacum, было выдвинуто предположение, что укороченная форма не содержит IV-й экзон и является продуктом альтернативного сплайсинга мРНК этого белка.

Для того чтобы определить, действительно ли район, отсутствующий у укороченной формы мРНК, является IV-м экзон ом, нами была предпринята попытка установления структуры гена белка 4/1 N. tabacum.

Клонирование полных копий генов гомологов белка 4/1 из растений Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum

На основе результатов анализа последовательностей, доступных в электронных базах данных NCBI, было выдвинуто предположение о возможной структуре генов белков 4/1 A. thaliana и О. sativa. Размеры этих генов составляют 2 и 2,5 кб, соответственно, и оба имеют сходную структуру: содержат 7 кодирующих экзонов размером от 50 до 100 нуклеотидов и 8 интронов со средней длиной около 150 нуклеотидов.

Исходя из того, что A. thaliana и О. sativa - представители классов однодольных и двудольных - имеют похожую структуру генов белков 4/1, мы предположили, что такая структура генов характерна для всех белков 4/1. В пользу этого предположения свидетельствовали результаты анализа других имеющихся в электронных базах данных полных и частичных последовательностей генов 4/1. Чтобы подтвердить это предположение, была изучена структура генов белков 4/1 из растений N. benthamiana и N. tabacum.

Полные копии генов 4/1 были амплифицированы на матрице тотальной ДНК растений N. benthamiana и N. tabacum и клонированы в вектор GEM-Т (Promega).

Мы предположили, что длина генов 4/1 белков N. benthamiana и N. tabacum также составляет приблизительно 2 кб. Однако длина полученных продуктов ПЦР почти вдвое превосходила ожидаемый размер. Более того, на тотальной ДНК N. tabacum амплифицировалось два продукта, отличающихся по массе на 600 нуклеотидов.

Секвенирование клонированных последовательностей генов показало, что, несмотря на столь значительное различие в длине, гены белков 4/1 N. benthamiana и N. tabacum имеют структуру, сходную с генами 4/1 А. thaliana и О. sativa, т.е. так же содержат 7 кодирующих экзонов и 8 интронов. Однако размеры интронов 4/1 генов N. benthamiana и N. tabacum сильно отличаются от таковых у A. thaliana и О. sativa.

Сравнительный анализ последовательностей кДНК и генов белка 4/1 N. tabacum, а также сравнение с последовательностями генов и кДНК других белков 4/1, позволил установить, что участок последовательности, отсутствующий у обнаруженной нами при помощи RACE-PCR укороченной формы мРНК 4/1 N. tabacum, точно соответствует IV-му экзону, что является подтверждением гипотезы о возможном альтернативном сплайсинге мРНК белка 4/1.

Анализ последовательностей интронов генов 4/1 N. benthamiana и N. tabacum выявил наличие в них характерных для паслёновых SINE-элементов семейства TS. TS-элементы - короткие ретропозоны растений, являются часто встречающимися повторами; один геном может содержать

до 104 копий различных TS-элементов. Эти элементы могут играть роль в регуляции экспрессии генов, встраиваясь в кодирующую область гена. Кроме того, ретропозон может нарушить транскрипцию кодирующего участка гена или изменить рамку считывания.

Известно, что последовательности TS-элементов часто бывают обогащены CpG повторами, являющимися мишенью для метилирования ДНК. CpG-обогащенные элементы способны влиять на экспрессию гена, встраиваясь даже в некодирующую область. Такие элементы вызывают метилирование участков ДНК, что в свою очередь приводит к более плотной упаковке соответствующих участков ДНК и затрудняет взаимодействие промоторных областей с факторами транскрипции (Yoshyoka et al, 1993; Kramerov and Vassetzky, 2005).

Однако наличие коротких ретропозонов не объясняет полностью увеличение длины генов 4/1 N. benthamiana и N. tabacum почти вдвое по сравнению с их гомологами из растений A. thaliana и О. sativa. Вероятно, некодирующие области генов 4/1 N. benthamiana и N. tabacum содержат дополнительные геномные повторы, претерпевшие многочисленные изменения в ходе эволюции. В пользу этой гипотезы свидетельствует наличие в гене 4/1 N. benthamiana более коротких, чем TS-элементы, последовательностей, имеющих высокую степень сродства к последовательностям некодирующих областей генов других белков N. benthamiana.

На рисунке 4 схематически изображено расположение геномных повторов в интронах генов 4/1 N. tabacum и N. benthamiana. II -й и IV-й интроны Т-гена белка 4/1 N. tabacum и IV-й интрон гена белка 4/1 N. benthamiana содержат последовательности, являющиеся ретропозонами семейства TS-элементов. IV-й интрон S-гена белка 4/1 N. tabacum и IV-й интрон гена белка 4/1 N. benthamiana содержат последовательности, обнаруженные в некодирующих областях генов других белков растений семейства пасленовых.

Рис. 4 Схема структуры генов 4/1 (А) - ген 4/Ш Ъеыкатшпа; (Б) в-ген N. шЬасит; (В) Т-ген N ¡аЬасит. Черным цветом обозначены кодирующие области генов, белым цветом - интроны, серым цветом обозначены районы, содержащие ретропозоны.

Количество элементов и ИХ позиция варьирует у генов 4/1 белков, из чего можно сделать вывод, что либо встраивание элементов произошло на некой стадии эволюции уже после разделения N. benthcimiana и N. tabacum, или же имела место дальнейшая ми фация элементов по некодирующим областям гена. Сравнительный анализ положения этих элементов в интронах генов 4/1 показал, что встраивание элементов происходило в случайные области генов, но в то же время, не затрагивая кодирующие районы. Наличие сразу нескольких элементов в каждом из генов свидетельствует о том, что их встраивание - активный процесс. Отсутствие ретропозонов в кодирующих областях или на границах экзонов и интронов, где последовательность TS-элемента могла бы нарушить сплайсинг мРНК или ее трансляцию, позволяет предположить, что эволюционный отбор шел по пути сохранения последовательностей белков 4/1, что, в свою очередь, свидетельствует о важности этих белков для жизнедеятельности растений.

Наличие двух ПЦР продуктов при амплификации гена растения N. tabacum объясняется тем, что геном N. tabacum является ам фи диплоидным гибридом геномов Nicotiana sylvestris и Nicotiana tomentosiformis, полученным в результате скрещивания в природных условиях {Yukawa et al, 2006). Соответствующие составляющие генома N. tabacum принято называть S- и Т-геномзми, по первым буквам видового название предшественников N. tabacum (Fulnecek. et al., 2002). В результате амплификации генов 4/1-подо6ных белков на матрице тотальной ДНК из растений N. sylvestris к N. tomentosiformis, было показано, что более тяжелая форма гена 4/1 N. tabacum соответствует по массе гену 4/1 N. tomentosiformis, а более легкая - гену 4/1 N. sylvestris (рис 5.). Соответсвенно более тяжелая форма гена 4/1 N. tabacum была названа Т-геном 4/1, а более легкая - S- геном 4/1,

Рис. 5. Продукты амплификации полных копий генов 4/1 на матрице тотальной ДНК (2) М.хуЬехМз, (3) М шЬасит, (4) N. ¡отемои^/огтп . ([) контрольный ПЦР, как матрица использовался йтсн 4/1, клонированный в плазмиду йЕМ-Т, (2) контрольный ПЦР, как матрица использовался Т-гсн 4/1, клонированный в плазмиду ОЕМ-Т

Нами был проведен анализ не полностью сплайсированных мРНК белка 4/1 N. tabacum. Для этого была составлена пара праймеров, комплементарных последовательностям II-го интрона генов 4/1 N. tabacum. Причем расстояние между местами отжига

праймфов составляла около 500 нуклсотидов для Т гена 4/1 и 300 нуклеотидов - для S гена 4/1. При помощи метода RT-PCR с использованием этих праймеров было показано, что в клетках N. tabacum обе м РНК (рис.6). Следовательно, оба гена 4/1 N. tabacum экс премируются.

Интересно, что в клетках N. tabacum, геном которой является амфидиплоидным гибридом геномов N sylvestris и N. tomentosiformis, не происходит встраивания ТS-элементеб в кодирующие области какого-либо из двух имеющихся генов 4/1. Это указывает на то, что, вероятно, оба гена, и Т- и S, находятся под давлением положительного i 2 3

отбора.

Вт»

Vin. 6. ДрИжЦИЯ прс-мРНК Т- я S-генеж белка 4/1 N. 1 »

tabacum.(l) - продукты амплификации участка 11-го ингрона s —► И

Т- и S-и рем РНК на матрице тотальной РНК N. tabacum при

помощи метода RT-PCR. (2) - контрольная ПЦР на матрице

тотальной РНК N, tabacum без проведения реакции обратной

тран скрипи и. (3) - маркер масс.

Таким образом, было установлено, что гены 4/1 имеют сходную структуру. Все они содержат 7 кодирующих экзонов и 8 интронов. Более того, длина экзонов в ходе эволюции сохраняется практически без изменений, однако длина интронов генов 4/1 сильно варьирует у разных организмов. Было подтверждено, что укороченная форма мРНК белка 4/1 ¡V, tabacшп не содержит IV-й экзон. Также было показано, что амфидиплоидйый геном N. tabacum содержит 2 копии гена 4/1 белка, и обе копии экспрессируются.

Внутриклеточная локализация белка 4/1, слитого с GFP.

Дальнейшее изучение свойств белка 4/1 предполагало установление его внутриклеточной локализации и возможной ассоциации этого белка с каким-либо из компартментов клеток растений при помощи методов флуоресцентной микроскопии.

Временная экспрессия в клетках эпидермиса листьев N. benthamiana инициировалась в результате обстрела листьев растения микрочастицами вольфрама, содержащими адсорбированную плазм ид ну ю ДИК. Использованная в этом опыте плазмида pGYl -At-4/1 -GFP кодирует слитый с GFP белок 4/1 A. thaliana, ген находится под контролем 35S промотора вируса, мозаики цветной капусты, который обеспечивает экспрессию в клетках растений. Аналогичные конструкции были получены для экспрессии белков 4/1 N. benthamiana и N. tabacum.

Флуоресцентная микроскопия клеток, экспрессирующих слитый с ОРР белок 4/1 А. ¡Шита, показала, что белок 4/1 локализуется в небольших структурах везикулярного типа, часть из которых расположена на периферии клеток вблизи ПД (рис7 А). Также было показано, что белок 4/1 может располагаться в виде двойных точек по обе стороны клеточной стенки, что указывает на способность этого белка транспортироваться через ПД из клетки, в которой происходит его экспрессия, в соседние клетки, (рис. 7 Б).

' "1 гМ I '' .

•Ч-

I.

* 1

**

* » *

* 4 яки

Рнс.7. Флуоресцентная микроскопия клеток эпителия листьев N. Ьеткат'юпа, экспрессирующих слитый с СИР белок 4/1 Л. !ИаИапа (А) локализация 4/1-содержащих структур везикулярного типа на периферии клеток; (Б) локализация слитого с ОРР белка 4/1 в виде двойных точек. (В)

полярная локаик'Аацик 4/1 -содержащих структур в клетке, для визуализации границ клетки проводилась экспрессии белка ЕЯ-УРР.

Интересным фактом является неравномерность распределения 4/1-содержащих везикул по периферии клеток. В большинстве случаев наблюдалась полярность, когда большая часть везикул локализовалась у одного полюса клетки, и лишь небольшое их количество присутствовало в других частях клетки (рис. 7 В).

Для подтверждения достоверности полученных данных опыт был повторен с использованием аналогичных конструкций, кодирующих слитые с ОБР гомологи белка 4/1 из растений N. (аЬасит и N. Ьепйттгапа. Было показано, что эти белки также локализуются в структурах везикулярного типа, однако диаметр этих структур был несколько больше, чем в случае белка 4/1 А. ¡ИаПапа. Помимо этого, везикулы, несущие белок 4/1 N. ГаЬасит или N. ЪеыНатшпа, отличались большей подвижностью, чем структуры, содержащие белок 4/1 А. ¡каНапа. Лишь небольшое количество N. (аЬасит или N. ЬепИгапйапа 4/1-содержащих везикул располагались вблизи ПД на периферии клетки, тогда как большая их часть активно передвигалась по клетке.

При длительной экспрессии наблюдалось уменьшение количества небольших структур везикулярного типа, несущих белок 4/1 N. (аЬасит или N. Ьеткапиапа, при этом диаметр этих структур возраста.'! (данные не

приведены). Вероятно, гиперэкспрессия белка приводит к слиянию небольших 4/1-содержатцих везикул в более крупные.

Сравнительный анализ локализации белков 4/1, кодируемых полной копией мРНК 4/1 N. ¡аЬасит и ее укороченной формой, не несущей ГУ-го экзона, показал, что существенной разницы в локализации этих белков нет. Однако белок, кодируемой укороченной формой мРНК, накапливается с большей скоростью и быстрее вызывает слияние структур везикулярного типа.

В результате данных экспериментов было показано, что белки 4/1 локализуются в структурах везикулярного типа, частично расположенных на периферии клетки. Для выяснения природы этих везикулярных структур были поставлены опыты по ко-экспрессии белка 4/1 с флуоресцентными белками-маркерами клеточных мембранных структур.

Ко-локализация белка 4/1 с маркером ЭПР.

Образование структур, фенотипически похожих на 4/1-содержащие везикулы, ранее наблюдалось при экспрессии в клетках растений транспортного белка ТБГЗ полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ) (Solovyev е/ а/. 2000; ХатуаМп et а1. 2002). Белок ТБГЗ является одним из трёх транспортных белков, кодируемых тройным блоком генов (ТБГ) ПЛВМ. Все три белка ТБГ необходимы для распространения вирусной инфекции из первично зараженной клетки. Известно, что ТБГЗ играет роль в локализации комплекса вирусной РНК и двух других транспортных белков на периферии клетки возле плазмодесм. В опытах по иммунофлуоресцентной микроскопии клеток трансгенных растений N. ЬеШкатгапа, экспрессирующих слитый с вБР белок ТБГЗ, было показано, этот белок локализуется возле плазмодесм в виде двойных точек по обе стороны клеточной стенки (ОогяИкоуа е1 а!., 2003).

Сходство в поведении белков 4/1 и ТБГЗ позволило предположить, что, вероятно, структуры, в которых эти белки локализуются, имеют общую природу. Для проверки этого предположения была проведена ко-экспрессия в клетках N. ЬеШИатгапа слитого с вБР белка 4/1 А. гкаНапа и слитого с "УТР белка ТБГЗ ПЛВМ. Было показано, что оба белка локализуются в одних и тех же структурах (рис. 8). На основе этих результатов было выдвинуто предположение, что белок 4/1 локализуется в структурах везикулярного типа, в составе которых происходит его доставка на периферию клетки, где белок каким-то образом оказывается связан с плазмодесмами и далее транспортируется через них в соседние клетки.

Рис. 8. Ко-экспрессия в клетка* У. ЬегиИат^апа белков ДЛ-ОТР (А) и УРР-ТБГЗ (Е). (В) - совмещение сигналов в канала* детекции ОРР и УРР (изображений А и Б)

Ранее было показано, что при транспорте внутри клетки белок ТЕГЗ, вероятно, ассоциирован с мембранами ЭПР (^о!оууе\' еХ а!., 2000). Чтобы проверить, являются ли 4/1-содержащие структуры производными эн доп л азмати ческо го ретикулума, был поставлен опыт по колокализации белка 4/1 и маркера ЭПР.

Рис. 9. Ко-покштвзацш) белка 4/1-ОРР и белка-маркера ЕКЛТР в клетках эпителия Ы.Ьеткатшпа. Б -увеличенное изображение, снятое в канале детекции УТР. В - совмещение изображений, снятых в каналах детекции \ТР и ОРР

В качестве маркера эндоплазматического ретикулума использовался белок \TP-ER ('ХстуаШп е( а!., 2004), который представляет собой модифицированный белок УБУ, несущий ^-концевой отщепляемый сигнальный пептид хитин азы А. (ЬаТшпа и С-кои ценой теграпептид 1ЮЕЬ, являющийся сигналом локализации в ЭПР (Воехчпк е! а!., ¡998, 1999).

При ко-экспрессии слитого с ОРР белка 4/1 и белка УЬ'Р-ЕК наблюдалось наличие маркера ЭПР в 4/1 -содержащих везикулах (рис.9).

Результаты опытов по локализации белка 4/1 А. fНаНапа полностью подтвердились результатами аналогичных опытов с использованием слитых с ОБР белков 4Л К. Ьеп1каппапа и № юЬасит.

Таким образом, было установлено, что 4/1-содержащие структуры везикулярного типа, имеют общую природу с мембранами ЭПР, часть таких структур расположена возле ПД.

Ко-лакализация белка 4/1 с акти новыми филаменгами.

Важной задачей являлось определение того, каким образом происходит доставка ьезикул, содержащих бедок 4/1 «а периферию клетки. В ране« проведенных экспериментах по флуоресцентной микроскопии нами наблюдалось активное движение 4/1-содержащих везикул по клетке, в

которой происходит экспрессия белка. Подобное быстрое передвижение везикул обычно происходит при участии элементов цитоскелета клетки. Чтобы проверить эту гипотезу, нами были проведены опыты по ко-экспрессии слитого с GFP белков 4/1 A. thaliana, N. benthamiana, N. tabacum и белка YFP-tai, Флуоресцирующий белок-маркер YFP-tal, в котором в состав слитого с YFP белка входит актин-связывающий домен талина мьши (Kost et al1998), использовался в данных экспериментах для визуализации актиновых филаментов.

Флуоресцентная микроскопия экспрессирующих клеток показала, что 4/1-содержащие везикулы связаны с актиновым цитоскелетом клеток растений (рис, 10). Разницу в подвижности 4/1-содержащих везикул в случае белков A. thaliana, N. benthamiana и N. tabacum, вероятно, можно объяснить степенью сродства белка 4/1 к актину клеток N. benthamiana. При экспрессии в клетках эпидермиса N. benthamiana белка 4/1 близкородственного растения N. tabacum наблюдалось активное движение везикул по актиновым филаментам, тогда как при экспрессии в той же системе белка 4/1 A. thaliana, относящегося к другому семейству, подвижность 4/1-е о держащих везикул была заметно ниже. Однако общие черты локализации белков сохранялись в обоих случаях. При обработке клеток цитохалазином В, движение 4/1-со держащих везикул останавливалось (данные не приведены).

Рис.Ю, Ко-жспрессия в клетках N. benthamiana белков YFP-tal (обозначен красным цветом) и слитого с GFP белка 4/1 A. thaliana (А) н слитого с GFP белка 4/1 N. tabacum

За счет взаимодействия белка 4/1 с актиновым цитоскелетом, вероятно, происходит внутри-

клеточный транспорт 4/1 к периферии клеток. Не исключено так же, что это взаимодействие играет роль и в межклеточном транспорте белка 4/1, т.к. в составе ПД был обнаружен актин-подобный белок (Radford et al., 1998).

На данный момент пока остается неясным, взаимодействуют ли белки 4/1 с актином напрямую или посредством неких белков-адапторов. В пользу первой гипотезы свидетельствуют результаты дальнейших опытов с дрожжевой двугибридной системой. Косвенным доказательством возможности подобного взаимодействия является миозин-подобная

структура белков 4/1, сохранение которой, как было показано в экспериментах с делеционными мутантами, необходимо для'.нормальной локализации белка 4/1,

Таким образом, было показано, что 4/1-содержащие структуры везикулярного типа, являющиеся производными ЭПР, взам о действу гот с актиновым цитоскелетом. Этот результат согласуется с полученными ранее данными: как было показано Воеутк и коллегами в статье Воеутк е( а!,, 1998, актиновые филаменты в клетках растений расположены параллельно тяжам полигональной кортикальной сети ЭГТР и участвуют в движении мембран ЭПР Щигйопз et а!., 2005)..

Ко-локализация белка 4/1 с маркером аппарата Гольджи.

Фенотипически быстрое движение 4/1-содержащих везикул напоминает описанный ранее транспорт везикул аппарата Гольджи (АГ), который происходит в клетках растений при участии актинового цитоскелета (Воеутк е? а!., 1998). Несмотря на ранее полученные результаты по колокализации белков 4/1 и маркера ЭПР, нельзя было исключить участие и АГ в образовании 4/1-содержащие структур. Чтобы проверить, участвуют пи мембраны АГ в образовании везикулярных структур, содержащих белок 4/1, были проведены эксперименты по ко-экспреесии слитого с ОРР белка4/1 А. tha.lia.na и белка- маркера аппарата Гольджи.

Флуоресцентный белок-маркер А Г 8Т-УРР содержит желтый флуоресцирующий белок УБР, слитый с М-концсвой последовательностью фермента еиалилтрансферазы крысы (8Т), которая обеспечивает локализацию белка в АГ (Воеутк е( а!., 1998. ВгапШги е! а!.. 2002). При введении вектора экспрессии рКТ-5Т-УРР в клетки листа N. ЬешЬат^апа маркерный белок локализовался в структурах АГ (рис. 11 А) (Воеутк ег а1. 1998; Вгапе1Ш <й а1, 2002).

Рнс.П, Ко-экспрессия в клетках N. ЬшНапнапа белка-маркера аппарата Гольджи ЙТ-У1-Ри слитого СРР белка 4/1 А ¡каЦапа (А), Структура аппарата Гольджи нарушена за счет экспрессии мутантного белка малой ГТФазы АгП (В)

ГТФаза АгП регулирует транспорт СОР1 -везику л между цистернами АГ. из АГ в ЭПР, а так же транспорт секреторных везикул из АГ к

внутриклеточным компартментам клеток растений (Nebenfuhr et al., 2002; Barlowe et al, 2003; Метоп et al., 2004). Точечная аминокислотная замена треонина на аспарагин в каталитическом ГТФазном центре белка Arfl А. thaliana приводит к стабилизации ГДФ-связанной неактивной формы ГТФазы (Lin et al., 2002).

Ко-экспрессия такого доминантно-негативного мутанта Arfl[T31N], маркера AT ST-YFP и 4/1-GFP приводила к перераспределению сигнала YFP в полигональную сеть кортикального ЭПР, тогда как зеленая флуоресценция 4/1-GFP детектировалась в классических везикулярных структурах (рис. 11 Б).

Аналогичные результаты были получены в параллельных экспериментах с использованием белков 4/1 N. tabacum и N. benthamiana.

Результаты проведенных опытов показали, что несмотря на сходство в характере внутриклеточного транспорта, везикулярные структуры, содержащие белок 4/1 не являются элементами аппарата Гольджи.

Мутационное картирование участков белка 4/1, ответственных за его внутриклеточную локализацию.

Белок 4/1 A. thaliana и его гомологи содержат консервативные мотивы типа «лейциновая молния», способные участвовать в образовании олигомеров белка. При помощи программы, основанной на алгоритме, изложенном в статье (Lupas et al., 1991), было показано, что в последовательности белков 4/1 имеется 5 участков, потенциально способных участвовать в образовании структуры coiled-coil. Подобные мотивы содержат миозин и миозин - подобные белки, для которых характерно, в частности, взаимодействие с элементами актинового цитоскелета. Т.к. ранее было показано, что везикулы, содержащие белок 4/1, связаны с актиновыми филаментами, мы предположили, что coiled-coil структуры могут играть роль во внутриклеточном транспорте белков 4/1.

Для проверки этой гипотезы был получен ряд слитых с GFP делеционных мутантов белка 4/1 N. tabacum под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Мутантный белок BgNA соответствовал продукту трансляции укороченной формы мРНК 4/1, присутствующей в клетках N. tabacum. Из всех полученных мутантных белков, только белки BgNA и PIN содержали все пять консервативных мотивов, вовлеченных в образование coiled-coil структуры (рис.12). Как было подтверждено результатами компьютерного анализа, из набора полученных делеционных мутантов только эти белки сохранили способность формировать структуру coiled-coil, характерную для бежа дикого типа.

7i¡

!í¡№ t']N

P1M2 P5M F2Mt pjm;

a,mi H¡M

Рнс,12. Схема генов делеционных мутантов белка 4/1 N.tabacum. Последовательность BgK соответствует последовательное™ полной мРНК белка дикого типа (бельем цветом отмечены районы, предположительно ответственные за формирование coiled-coíl структуры), BgNA - соответствует последовательности обнаруженной нами укороченной формы мРНК белка 4/1 (пунктирной линией обозначен отсутствующий район).

Далее полученные конструкции использовались для бомбардировки листьев N. benthamiana. Флуоресцентная микроскопия экспреесирующих клеток показала, что способность локализоваться в характерных структурах везикулярного типа сохраняют мутантные белки BgNA и PIN, т. е белки предположительно имеющие интактный coiied-coil. В то время как все прочие мутантные белки локализовались днффузко, как GFP.

На рисунке 13 приведены результаты опытов по ко-экспрессии белка YFP-tal и слитых с GFP мутантных белков 4/1 N. tabacum.

РисЛЗ. Ко-экспрессия в клетках N. ЬепГИапиапи белка-маркера

актииового цитоскелета УРРЧа! н слитого ОРР белка 4/1 Л' ¡аЬасит (А); слитого ОРР делеционного мутанта белка 4/1 ЫлаЬасит РЖ (Б) ; слитого вРР делеционного мутанта белка 4/1 N. тЬасит Р1М1 (В)

Таким образом, можно предположить, что для нормштьиой локализации белков 4/) в составе характерных, связанных с актиновыми филаментами, везикул, необходима интактная структура соШьй-соИ.

т Ч J-*. V ■ ч ., 1 • Я. Г . а -

Поиск белков-партнеров белка 4/1 с помощью дрожжевой двугибридной системы

Как показали результаты опытов по внутриклеточной локализации, белки 4/1 способны взаимодействовать с актиновым цитоскелетом клеток растений, а также «заякориваться» у плазмодесм на периферии клеток, транспортироваться через ПД и локализоваться по обе стороны канала ПД. Вероятнее всего, все эти процессы происходят при участии неких белков-партнеров 4/1.

Поиск потенциальных белков-партнеров проводился с использованием дрожжевой двугибридной системы Gal4 Matchmaker System3 (Clontech). Для этого белок 4/1 A. thaliana был клонирован в бейт-вектор и использовался для скринирования библиотеки кДНК A. thaliana.

В результате данного опыта из приблизительно 30 ООО полученных клонов был отобран ряд клонов, экспрессирующих белки, способные взаимодействовать с белком 4/1. Среди выявленных потенциальных белков-партнеров 4/1 были обнаружены ферменты биогенеза клеточной стенки, факторы транскрипции и элемент цитоскелета - актин 7.

CADH2_ARATH (циннамил-алкогольдегидрогеназа 5)

[UniProtAc:.049482] Белок CADH2_ARATH A. thaliana является одним из представителей мультигенного семейства циннамил-алкогольдегидрогеназ растений. Эти ферменты участвуют в синтезе лигнинов в клетках растений и играют важную роль в формировании вторичной клеточной стенки (Raes et al., 2003; Kim et al„ 2004; Youn et al., 2006). Известно, что мутации в гене фермента CADH2_ARATH нарушают нормальное формирование проводящей системы (Sibout et al, 2005) В экспериментах по измерению ферментативной активности всех восьми циннамил-алкогольдегидрогеназ A. thaliana было установлено, что наиболее активным ферментом является именно белок CADH2_ARATH (Kim et al., 2004). Как показало изучение промоторной активности гена CADH2_ARATH, наиболее интенсивная экспрессия этого гена наблюдается в клетках проводящей системы (Sibout etal, 2003; Kim etal., 2004)

XYL1_ARATH (P-D-ксилозидаза 1) [UniProt Ac:Q9S7Y7], XYL1_ARATH A. thaliana - это белок массой 64 кДа, обладающий бифункциональной ферментативной активностью: a-L-арабинофуранозидазной и p-D-ксилозидазной. Результаты опытов по измерению активности этого фермента в различных тканях растения А. thaliana показали, что белок XYL1_ARATH наиболее активен в клетках молодых тканей. Предполагается, что это связано с его участием в формировании и модификации клеточной стенки во время роста и деления клеток (Minic et al., 2004). Учитывая наличие a-L-арабинофуранозидазной

и p-D-ксилозидазной ферментативных активностей, можно предположить, что белок XYL1_ARATH задействован в деградации ксилановых и арабиноксилановых полимеров за счет отщепления боковых a-L-арабинофуранозидных групп. В пользу этой гипотезы свидетельствуют результаты, полученные in vivo, согласно которым белок XYL1ARATH участвует в гидролизном расщеплении полисахарида первичной клеточной стенки RG-I (Ridley etal., 2001; Willats et al.,2001; Glushkaetal., 2003).

GUN6_ARATH (Эндо-1,4-р-Б-глюконаза) [UniProt Ac:Q42059], Эндо-1,4-Р-О-глюконазы (EGases) про - и эукариот объединяют в обширное семейство гидролитических ферментов. Субстратом эндо-M-P-D-глюконаз растений являются ксилоглюканы и целлюлоза клеточной стенки (Henrissat et al.,1989; Brummell et al., 1994). Изучение профиля экспрессии генов зндо-1,4-р-Б-глюконаз в ходе развития растения показало возможное участие этих ферментов в процессах роста клеток, созревания плодов и т.д. Предполагается, что эти ферменты играют роль в формировании сети целлюлозы-гемицеллюлозы в составе клеточной стенки при росте клеток (Nicol et al, 1998).

Известно, что процесс активного транспорта через ПД требует увеличения пропускной способности этих межклеточных контактов. ПД представляет собой канал, пронизывающий клеточную стенку. Не исключено, что для увеличения пропускной способности плазмодесмы происходит локальная разборка примыкающей к ней клеточной стенки (Ding et al.,1992; Wolf et al., 1991). Этот процесс требует участия таких ферментов, как глюконазы, ксилозидазы и пр. Взаимодействие белков 4/1 с CADH2 ARATH, XYL1ARATH и эндо-1,4-р-О-глюконазой можно объяснить участием 4/1 в привлечении данных ферментов для разборки клеточной стенки при транспорте через ПД. Возможно также, что взаимодействие данных ферментов с белком 4/1 играет роль в их привлечении к местам формирования вторичных плазмодесм. При этом также происходит частичная разборка клеточной стенки и впячивание в полость образовавшегося канала тяжа ЭПР (Ding et al.,1992). Механизм этого процесса пока еще не изучен; вероятно, что в образовании новой десмотубулы принимает участие актин (Baluska etal., 2004).

Не исключено, однако, что взаимодействия белка 4/1 с ферментами клеточной стенки играют роль и в его доставке на периферию клеток. Поскольку последовательность белка 4/1 не содержит сигналов локализации в плазмолемме или каких-либо других известных сигналов транспорта в клеточные структуры, можно предположить, что направление белка 4/1 к периферии клеток, а затем заякоривание около плазмодесм,

происходит за счет взаимодействия с белками, несущими соответствующие сигналы, например ферментами клеточной стенки.

Q9SJ56_ARATH (ДНК-связывающий белок) [UniProt Ac:Q9SJ56], Белок Q9SJ56_ARATH A. thaliana относится к мультигенному семейству AP2/EREBP транскрипционных факторов растений (APETALA2/ ethylene-responsive element binding proteins). Характерной особенностью этих белков является наличие ДНК-связывающего домена (АР2) (Okamuro et al., 1997). Было показано участие транскрипционных факторов AP2/EREBP во множестве различных процессов в растениях: формировании цветков, дифференцировке эпидермальных клеток листьев, регуляции развития ответа на различные биотические и абиотические стрессовые условия (Cheong et al, 2002; Chen et al., 2003; Nakano et al, 2006). Исследования профиля экспрессии генов в различных тканях растений позволило предположить, что транскрипционные факторы AP2/EREBP также могут играть роль в формировании проводящей системы растений (Raemdonck et al., 2005).

Q9SJ56_ARATH (гомеодоменный белок BLH1) [UniProt Ac:Q9SJ56], BELl-подобные гены кодируют транскрипционные факторы растений, участвующие в процессе регуляции развития растений и активации транскрипции при стрессовых условиях (Guan et al., 2004).

Q058I4_ARATH (транскрипционный фактор WRKY36) [UniProt Ac:Q058I4] К семейству транскрипционных факторов WRKY относятся белки, содержащие консенсусную последовательность аминокислот WRKY. Некоторые представители этого семейства задействованы в процессе включения генов PR в условиях стресса (Rushton et al. 1995; Rushton et al 1996; Wang et al. 1998; Eulgem et al. 1999; Yang et al. 1999; YamasaM et ail, 2005)

Все обнаруженные транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с белком 4/1, участвуют в ответе на условия биотического или абиотического стресса. Этот факт указывает на возможное участие белка 4/1 в развитии ответной реакции на стрессовые условия. Известно, что в стрессовых условиях, например при вирусной инфекции, происходит модификация плазмодесм, приводящая к затруднению межклеточного транспорта и тем самым блокирующая распространение инфекции дальше (Roberts and Oparka, 2003; Fridborg et al, 2003). В этом процессе также требуется участие ферментов клеточной стенки, получающих соответствующий сигнал от защитной системы клетки.

Возможно также, что взаимодействие белка 4/1 с транскрипционными факторами, играющими роль в росте и дифференцировке клеток, а также с ферментами биогенеза клеточной стенки определяет морфологию клетки.

ACT7_ARATH (актин 7) [UniProt Ас:Р53492]. Act7, актин A. thaliana, является представителем мультигенного семейства актинов растения А, thaliana. Изучение экспрессии этого белка показало его присутствие во всех тканях A. thaliana, однако наиболее активно его экспрессия имеет место в клетках молодых тканей растения. Интересной особенностью белка Act7 является то, что в отличие от других актинов, экспрессия этого гена находится под сильным валянием стрессовых условий, а также регулируется гормонами растений. Анализ промоторной области гена Act7 показал наличие последовательностей, гомологичных известным на данный момент консенсусам, ответственным за регуляцию транскрипции фитогормонами (phytohormone responsive elements) (McDowell et al.,1996; Gillilandetal., 2003)

Взаимодействие этих белков с белками 4/1 было подтверждено результатами аналогичных опытов с использованием белка 4/1 N. tabacum в качестве затравки.

С помощью дрожжевой двугибридной системы было также доказано, что белки 4/1 A. thaliana и N. tabacum способны образовывать гомодимеры. Как показали результаты опытов мутационного анализа, 4-х из 5 консервативных мотивов, участвующих в образовании coiled-coil структуры и кодируемого последним экзоном гена 4/1, достаточно для димеризации белка 4/1.

Выводы

1. Анализ баз данных нуклеотидных последовательностей позволил обнаружить ряд гомологов ранее открытого белка 4/1 A. thaliana Определены общие черты в структуре генов белков 4/1, найдены консервативные районы последовательностей белков 4/1.

2. Получены поликлональные и моноклональные антитела к белку 4/1. Показано наличие экспрессии белка 4/1 и его гомологов in vivo.

3. Впервые клонированы кДНК и гены белка 4/1 N. tabacum и N. benthamiana.

4. Показана внутриклеточная локализация белка 4/1, слитого с флуоресцирующими белками-маркерами, в составе структур везикулярного типа, образованных мембранами ЭПР и расположенных вблизи плазмодесм.

5. Доказана способность белка транспортироваться через плазмодесмы.

6. Выявлена полярная локализация белка 4/1 в разных типах клеток растения и способность его транспортироваться по клетке с использованием актинового цитоскелета.

7. С помощью дрожжевой двугибридной системы были выявлены потенциальные белки-партнеры, взаимодействующие с белком 4/1 А. thaliana и его гомологами из растений Табаков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рааре М, Solovyev AG, Erokhina TN, Minina EA, Schepetilnikov MV, Lesemann DE, Schiemann J, Morozov SY, Kellmann JW. (2006) At-4/1, an interactor of the Tomato spotted wilt virus movement protein, belongs to a new family of plant proteins capable of directed intra- and intercellular trafficking. MPMI. V 19, № 8. 874-883.

2. EA. Минина, Т.Н. Ерохина, H.B. Сошникова, А.Г. Соловьев, С.Ю. Морозов (2006). Иммунологическая детекция белка растений At-4/l, способного взаимодействовать с вирусными белками межклеточного транспорта. Доклады Академии Наук, 2006, том 411, № 5, стр 689-693.

3. Т. Erokhina, Е. Minina, М. Schepetilnikov, A. Solovyev, S. Morozov. Investigation of role of a new class plant proteins in intercellular trafficking of macromolecules through plasmodesmata. Materials of the XIII International Conference and Scientific Discussion Club "New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology". May 31-June 9,2005. Ukraine. Yalta-Gursuf. p. 270-271

4. T. Erokhina, E. Minina, M. Schepetilnikov, J. Kellmann, A. Solovyev, S. Morozov. Studies on plant cell protein At-4/1 capable of interacting with viral movement proteins. 6th International Symposium in the Series "Recent advances in plant biotechnology". September 12-16,2005, Ceske Budejovice, Czech Republic. Book of Abstracts, p. 78.

5. Е.А.Минина, Н.В.Сошникова, Т.Н. Ерохина, А.Г.Соловьев, С.Ю.Морозов. «Идентификация белков растений, вовлеченных в процесс межклеточного транспорта макромолекул через плазмодесмы». Сборник тезисов 10-й школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА" 17-21 апреля 2006 г., Пущино, стр 30-31.

6. Е.А. Минина, Т.Н. Ерохина, Н.В. Сошникова, А.Г. Соловьев, С.Ю. Морозов. Изучение растительных белков семейства 4/1, вовлеченных в процесс межклеточного транспорта макромолекул через плазмодесмы. Тезисы VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, 25-27 октября 2006 г., Москва, стр. 22.

Принято к исполнению 22/03/2007 Исполнено 23/03/2007

Заказ №215 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минина, Елена Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Внутриклеточный транспорт

1.1 Экзоцитоз

1.2 Эндоциоз

1.3 Регуляция внутриклеточного транспорта

1.4 Внутриклеточный транспорт к плазмодесмам.

2. Межклеточный транспорт

2.1 Типы плазмодесм

2.2 Структура плазмодесм

2.3 Транспорт через плазмодесмы

2.3.1 Заякоривание около ПД

2.3.2 Транслокация через плазмодесмы

2.3.3 Высвобождение из плазмодесмы в соседней клетке

2.4 Регуляция межклеточного транспорта.

2.4.1. Предельная пропускная способность плазмодесм.

2.4.2 Роль цитоскелета в регуляции межклеточного 45 транспорта

2.4.3 Роль посттранскрипционных модификаций в регуляции 46 транспорта белков

2.5 Специфичность транспорта макромолекул в растениях и 48 его регуляция

3. Белок 4/1 АгаЫйорьк /АаИапа. 50 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51 РЕЗУЛЬТАТЫ

1 Поиск гомологов белка 4/1 АгаЫс1ор$1$ 1каИапа т $Шсо

2 Иммунодетекция белка 4/1 АгаЫс1ор$1$ 1каИапа и его 74 гомологов.

3 Клонирование кДНК гомологов белка 4/1 из растений 76 ШсоИапа ЬепШат1апа и ШсоНапа шЬасит методом

ЛАСЕ-РСЯ

4 Клонирование полных копий генов гомологов белка 4/1 78 из растений ШсоНапа ЬеШкат1апа и ШсоИапа /аЬасит

5 Изучение внутриклеточной локализации белка 4/1 82 5.1 Внутриклеточная локализация белка 4/1, слитого с вРР.

5.2. Ко-локализация белка 4/1 с маркером ЭПР.

5.3. Ко-локалзация белка 4/1 с актиновыми филаментами.

5.4. Ко-локализация белка 4/1 с маркером аппарата Гольджи.

5.5. Мутационное картирование участков белка 4/1, ответственных за его внутриклеточную локализацию.

6. Поиск белков-партнеров белка 4/1 с помощью дрожжевой двугибридной системы

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства 4/1-подобных белков растений - возможных факторов внутри- и межклеточного транспорта"

Изучение молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта в растениях является одним из наиболее актуальных направлений молекулярной биологии растений.

Функционирование любого многоклеточного организма предполагает наличие тесного контакта между отдельными клетками. В растениях клетки соединены между собой специализированными межклеточными контактами -плазмодесмами (ПД), которые представляют собой поры, пронизывающие клеточные стенки соседних клеток. Через плазмодесмы осуществляется транспорт питательных веществ, гормонов, при участии этих межклеточных контактов происходит распространение сигналов дифференцировки, посттранскрипционпого умолкания генов, апоптоза (Lucas et al.,1993). Известно также, что через плазмодесмы происходит распространение вирусной инфекции из первично зараженной клетки (Atabekov and Dorokhov, 1984).

Необходимой стадией, предваряющей межклеточный транспорт, является доставка транспортируемых частиц на периферию клеток к плазмодесмам. (Ding et äl., 1998; Lazarowitz and Beachy, 1999). Несмотря на общие черты в организации транспортных систем, механизм внутриклеточного транспорта растительных и животных клеток имеет ряд существенных отличий. На данный момент, выявлены некоторые пути регуляции внутриклеточного транспорта растений, показана роль в этом процессе цитоскелета и эндомембранных структур, но для полного понимания функционирования системы требуются дальнейшие исследования.

Удобной моделью для изучения молекулярных механизмов межклеточного и внутриклеточного транспорта в растениях являются транспортные белки вирусов растений (ТБ). Транспортные белки обеспечивают перемещение генома вируса внутри клетки, перенос его в соседние клетки и распространение вирусной инфекции по всему организму растения (Atabekov and Dorokhov, 1984). Известно, что ТБ вирусов растений используют систему транспорта клеток хозяина (Lucas et al, 1995; Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997). Большое разнообразие транспортных белков делает их удобными моделями для изучения молекулярных механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта растений (Mushegian et al.,1993; Lazarowitz and Beachy, 1999).

Белок 4/1 A. thaliana был обнаружен как фактор, способный взаимодействовать с транспортным белком вируса бронзовости томата, что позволило предположить его участие в процессе внутри- и межклеточного транспорта в растениях. Данная работа посвящена изучению свойств белка 4/1 и его гомологов из других растений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В 1879 году Eduard Tangle впервые показал, что стенки соседних клеток в растениях пронизаны тонкими тяжами цитоплазмы, объединяющими клетки в более сложную структуру, симпласт. В дальнейшем, эти контакты были названы плазмодесмами (ПД), было показано, что они являются специфичным для растений видом межклеточных контактов (Сагг, 1976).

Простая плазмодесма представляет собой заполненный цитоплазмой канал, пронизывающий стенки соседних клеток. Изнутри канал выстлан плазмалеммой, в его центре располагается десмотрубочка, образованная спрессованной мембраной эндоплазматического ретикулума двух соседних клеток (Robarás et al, 1990). Десмотрубочка соединена с плазмалеммой канала белковыми "мостиками", разделяющими полость плазмодесмы на 10-20 микроканальцев диаметром 1,5-3,0 нм (Ding et al., 1992). Предполагается, что транспорт идет по микроканальцам (Radford et al, 1998) и внутри десмотрубочки (Grabski et al, 1993; Gamalei et al, 1994).

Долгое время считалось, что плазмодесмы служат для транспортировки питательных веществ и гормонов. Затем результаты опытов по изучению механизмов распространения вирусной инфекции по растению показали, что с участием плазмодесм происходит также и транспорт макромолекул: белков и нуклеиновых кислот. Дальнейшее изучение межклеточного транспорта в растениях позволило выявить ряд белков растений, способных самостоятельно перемещаться из клетки в клетку, и также транспортировать собственную мРНК.

На данный момент установлено, что плазмодесмы играют важную роль в росте и развитии растений (Lucas et al, 1993). В ходе деления и дифференцировки клеток меристемы происходит формирование плазмодесм в результате неполного цитокинеза, тем самым обеспечивается непрерывность цитоплазмы и эндомембранных структур между дочерними клетками во всей новообразующейся ткани растения (Mezitt and Lucas, 1996). Таким образом, на ранних стадиях развития растение представляет собой симпласт клеток, соединенных плазмодесмами; в процессе развития, часть плазмодесм отмирает или модифицируется и симпласт разделяется на "домены" (Esau and Thorsch, 1985). Считается, что внутри каждого такого симпластного домена метаболизм и функционирование клеток синхронизировано (Goodwin, 1983).

Различают два основных типа транспорта у растений: локальный (транспорт между соседними клетками) и системный (транспорт по проводящей системе). И в том и в другом процессе задействованы специализированные контакты - плазмодесмы. основное отличие механизмов локального транспорта от системного заключается в том, что перемещение из клетки в клетку при локальном транспорте представляет собой активный процесс, требующий участия ассоциированных с плазмодесмами белков и затраты энергии (Wolf et al, 1989; Maule, 199l;Deom et al., 1990), тогда как циркуляцию по проводящей системе принято считать пассивным процессом (Leisner et al, 199За,b).

Локальный транспорт можно в свою очередь подразделить на два основных этапа: внутриклеточный транспорт на периферию клетки и собственно межклеточный транспорт.

Удобной моделью для изучения механизмов доставки макромолекул на периферию клеток и их перемещения через плазмодесмы являются вирусы растений. Вирусы растений попадают в клетки хозяина через механические повреждения клеточной стенки. Из первично инфицированной клетки происходит распространение вирусной инфекции в близлежащие клетки, пока вирус не достигнет элементов проводящей системы, по которой происходит распространение вируса по всему организму растения. Перемещение вируса из клетки в клетку и его системный транспорт происходит в виде транспортной частицы. На данный момент считается, что геном вируса транспортируется в составе рибонуклеопротеинового комплекса (РНП). В ходе эволюции фитовирусы выработали пути активного использования системы внутри- и межклеточного транспорта растений. Геном вирусов растений кодирует специфические транспортные белки (ТБ), необходимые для распространение вирусной инфекции из первично зараженной клетки.

Относительная примитивность геномов вирусов растений облегчает задачу идентификации их ТБ и последующего изучения свойств этих белков.

Разнообразие транспортных белков вирусов растений очень велико. Известны однокомпонентные и многокомпонентные транспортные системы вирусов, когда при транспорте необходим только один ТБ или несколько, соответственно. К первым относится транспортная система вируса табачной мозаики (ВТМ), перемещение которого происходит при участии белка ЗОК (Deom et al., 1987), а также системы других вирусов, кодирующих ЗОК-подобные белки, например, представителей родов Bromovirus, Cucumovirus, Tombusvirus, Tobamovirus, Tobravirus, Umbravirus, Begomovirus, Comovirus, Nepovirus, Tospovirus и др. (Koonin et al., 1991; Melcher, 1990, 1993; Mushegian and Koonin, 1993; Mushegian, 1994).

К многокомпонентным транспортным системам, относятся системы вирусов, представителей родов Potexvirus, Carlavirus, Allexivirus, Foveavirus, Hordeivirus, Benyvirus, Pomovirus, Pecluvirus, геном которых содержит тройной блок генов (ТБГ). ТБГ содержит гены с перекрывающимися рамками считывания, кодирующими 3 белка, необходимыми для транспорта соответствующего вируса (Morozov et al., 1989, Solovyev et al., 1996).

Транспорт вирусного генома в составе РНП может сопровождаться разрушением структуры ПД, такой вид транспорта характерен вирусов, принадлежащих к группам Comovirus, Nepovirus, Caulimovirus, Tospovirus, Alfamovirus, Bromovirus ( van Lent ei. al., 1990; Wieczoreck and Sanfacon, 1993; Storms et. al., 1995; Kasteel et. al., 1997; Zheng et. al., 1997); или же обратимыми изменениями структуры ПД, этот способ используют вирусы групп Tobamovirus, Tobravirus, Diantovirus, Hordeivirus и др. (Dawson et. al., 1988; Saito et. al., 1990; Xiong et. al., 1993; Hamilton and Baulcombe, 1989; Petty and Jackson, 1989). Большое разнообразие ТБ позволяет использовать их для многостороннего исследования механизмов транспорта в растениях.

Общим свойством всех транспортных белков вирусов растений является то, что они способны рекруитизировать транспортную систему клеток растений. Так например, предполагается, что ТБ взаимодействуют с рецепторами плазмодесм, используя таким образом систему межклеточного транспорта растений для переноса своего генетического материала (Lucas et al.,1995). Взаимодействие вирусного белка с хозяйскими факторами предполагает наличие между ними некого сродства, уровень этого сродства может варьировать для различных комбинаций вируса и хозяина; тем самым определяется специфичность вируса по отношению к растению и чувствительность растения к данной вирусной инфекции (Morozov et al.,1997).

Ранее считалось, что только вирусы растений имеют белки, способные взаимодействовать с плазмодесмами и обеспечивать транспорт других белков и нуклеиновых кислот между клетками. Именно поэтому, рекомбинантные транспортные белки вирусов в основном использовались для изучения межклеточного транспорта в растениях (Ding et. al., 1992). Позднее было установлено, что транспорт в растении может идти и в отсутствии вирусной инфекции, и вирусы используют универсальный механизм. Основываясь на этих данных, была выдвинута гипотеза о том, что вирусные ТБ изначально имеют растительное происхождение и были "захвачены" вирусным геномом для обеспечения транспортных функций (Mezitt and Lucas, J996).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Минина, Елена Андреевна

выводы.

1. Анализ доступных баз нуклеотидных последовательностей позволил обнаружить ряд гомологов ранее открытого белка 4/1 АгаЫс1ор$1$ ЛаНапа. Определены общие черты в структуре генов белков 4/1, найдены консервативные районы последовательностей белков 4/1.

2. Получены поликлональные и моноклоналные антитела к 4/1 белку и обнаружены его экспрессия и накопление в мембрано-ассоциированных фракциях клеток у растений семейства пасленовых, включая табак и картофель.

3. Впервые клонированы кДНК и хромосомные гены 4/1 белка табака.

4. Была показана внутриклеточная локализация белка 4/1, сшитого с флуоресцирующими белками-маркерами, в составе структур везикулярного типа, образованных мембранами ЭПР и ассоциированных с плазмодесмами.

5. Выявлена полярная локализация белка 4/1 в разных типах клеток растения и способность его транспортироваться по клетке с использованием актинового цитоскелета.

6. Доказана способность белка транспортироваться через плазмодесмы.

7. С помощью дрожжевой двугибридной системы были выявлены потенциальные белки-партнеры, взаимодействующие с белком 4/1 АгаЫс1орз15 МаИапа и его гомологами из табака.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минина, Елена Андреевна, Москва

1. Allan, B. B„ Moyer, B. D. and Balch, W. E. (2000). Rabl recruitment of pi 15 into a cis-SNARE complex: programming budding COPII vesicles for fusion. Science 289,444-8.

2. Alvarez, C., Garcia-Mata, R., Hauri, H. P. and Sztul, E. (2001). The pll5-interactive proteins GM130 and giantin participate in endoplasmic reticulum-Golgi traffic. J Biol Chem 276,2693-700.

3. Andreeva, A. V., Kutuzov, M. A., Evans, D. E. and Hawes, C. R. (1998). Proteins involved in membrane transport between the ER and the Golgi apparatus: 21 putative plant homologues revealed by dbEST searching. Cell Biol Int 22,145-60.

4. Andreeva, A. V., Zheng, H., Saint-Jore, C. M., Kutuzov, M. A., Evans, D. E. and Hawes, C. R. (2000). Organization of transport from endoplasmic reticulum to Golgi in higher plants. Biochem Soc Trans 28,505-12.

5. Aniento, F. and Robinson, D. G. (2005). Testing for endocytosis in plants. Protoplasma 226,3-11

6. Antonny, B., Gounon, P., Schekman, R. and Orci, L. (2003). Self-assembly of minimal COPII cages. EMBO Rep 4, 419-24.

7. Atabekov, J. G. and Dorokhov Yu, L. (1984). Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Adv Virus Res 29,313-64.

8. Balachandran S., Xiang Y., Shobert C., Thompson G.A., Lucas W.J. (1997) Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14150-14155

9. Baluska F, Samaj J, Napier R,VolkmannD (1999)Maize calreticulin localizes preferentially to plasmodesmata in root apex. Plant J 19: 48M88

10. Baluska, F., Cvrckova, F., Kendrick-Jones, J. and Volkmann, D. (2001). Sink plasmodesmata as gateways for phloem unloading. Myosin VIII and calreticulin as molecular determinants of sink strength? Plant Physiol 126,39-46.

11. Baluska, F., Samaj, J., Hlavacka, A., Kendrick-Jones, J. and Volkmann, D. (2004). Actin-dependent fluid-phase endocytosis in inner cortex cells of maize root apices. J Exp Bot 55,463-73.

12. Barlowe, C. (2003). Molecular recognition of cargo by the COPII complex: a most accommodating coat. Cell 114,395-7.

13. Bednarek, S. Y. and Falbel, T. G. (2002). Membrane trafficking during plant cytokinesis. Traffic 3,621-9.

14. Ben-Tekaya, H., Miura, K., Pepperkok, R. and Hauri, H. P. (2005). Live imaging of bidirectional traffic from the ERGIC. J Cell Sci 118, 357-67.

15. Bi, X., Corpina, R. A. and Goldberg, J. (2002). Structure of the Sec23/24-Sarl pre-budding complex of the COPII vesicle coat. Nature 419, 2717.

16. Bielli, P., Casavola, E. C., Biroccio, A., Urbani, A. and Ragnini

17. Wilson, A. (2006). GTP drives myosin light chain 1 interaction with the class V107myosin Myo2 IQ motifs via a Sec2 RabGEF-mediated pathway. Mol Microbiol 59,1576-90.

18. Blackman L.M., Harper J.D.I, and Overall R.L. (1999) Localization of a. centrin-like protein to higher plant plasmodesmata. Eur J Cell. Biol 78:297-304

19. Blackman L.M. and Overall R.L. (2001) Structure and function of plasmodesmata. Aust. J. Plant Physiol. 28:709-727.

20. Boehm, M., Aguilar, R. C. and Bonifacino, J. S. (2001). Functional and physical interactions of the adaptor protein complex AP-4 with ADP-ribosylation factors (ARFs). Embo J 20, 6265-76.

21. Boevink P. and Oparka K.J.(2005) Virus-Host Interactions during Movement Processes. Plant Physiol, 138:1815-1821.

22. Boevink, P., Oparka, K., Santa-Cruz, S., Martin, B., Betteridge, A., Hawes, C. (1998). Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network. Plant J, 15,441-447.

23. Boevink, P., Martin, B., Oparka, K., Santa-Cruz, S., Hawes, C. (1999). Transport of virally expressed green fuorescent protein through the secretory pathway in tobacco leaves is inhibited by cold shock and brefeldin A. Planta, 208,392-400.

24. Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D. and Satiat-Jeunemaitre, B. (2004). FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc 214,159-73.

25. Bonifacino JS, Lippincott-Schwartz J (2003) Coat proteins: shaping membranetransport. Nat Rev Genet 4:409-414

26. Brandizzi, F., Frangne, N., Marc-Martin, S., Hawes, C., Neuhaus, J. M. and Paris, N. (2002a). The destination for single-pass membrane proteins is influenced markedly by the length of the hydrophobic domain. Plant Cell 14, 1077-92.

27. Brandizzi, F., Irons, S. L., Johansen, J., Kotzer, A. and Neumann, U. (2004). GFP is the way to glow: bioimaging of the plant endomembrane system. J Microsc 214,138-58.

28. Brummell,D.A., Lashbrook,C.C. and Bennett,A.B. (1994) Plant endo-l,4-b-D-glucanases. Structure, properties and physiological function.In Himmel,M.E., Baker,J.O. and Overend,R.P. (eds), EnzymaticConversion of Biomass for Fuels Production.: 100-129.

29. Cantrill L.C., Overall R.L., Goodwin P.B.(1999) Cell-to-cell communication via plant endomembranes. Cell Biol Int 23:653-661.

30. Carr, D.J. (1976) Historical perspectives on plasmodesmata. In Intercellular Communication in Plants: Studies on Plasmodesmata (Gunning, B.E.S. and Robards, A.W. eds), pp. 291-295, Springer-Verlag

31. Carrington J.C, Kasschau K.D., Mahajan S.K., and Schaad M.C. (1996) Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants. Plant Cell 8: 1669-1681.

32. Caumont, A. S., Galas, M. C., Vitale, N., Aunis, D. and Bader, M. F. (1998). Regulated exocytosis in chromaffin cells. Translocation of ARF6stimulates a plasma membrane-associated phospholipase D. J Biol Chem 273, 1373-9.

33. Chen, Y. A. and Scheller, R. H. (2001). SNARE-mediated membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol 2,98-106.

34. Chen, X., Goodwin, S.M., Boroff, V.L., Liu, X. and Jenks, M.A. (2003) Cloning and characterization of the WAX2 gene of Arabidopsis involved in cuticle membrane and wax production. Plant Cell, 15:1170-1185.

35. Chen MH, Tian GW, Gafni Y, Citovsky V (2005) Effects of calreticulin on viral cell-to-cell movement. Plant Physiol doi/10.1104/pp.l05.064386

36. Cheong, Y.H., Chang, H.S., Gupta, R., Wang, X., Zhu, T. and Luan, S. (2002) Transcriptional Profiling Reveals Novel Interactions between Wounding, Pathogen, Abiotic Stress, and Hormonal Responses in Arabidopsis. Plant Physiol., 129:661-677.

37. Cilia, M.L., Jackson, D., 2004. Plasmodesmata form and function. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 500-506.

38. Citovsky V, Mclean BG, Zupan JR, Zambryski P (1993) Phosphoiylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase. Genes Dev 7:904-910

39. Cleland, R.E., Fujiwara, T., Lucas, W.J., 1994. Plasmodesmal-mediated cell-tocell transport in wheat roots is modulated by anaerobic stress. Protoplasma 178, 81-85.

40. Clary, D. O. and Rothman, J. E. (1990). Purification of three related peripheral membrane proteins needed for vesicular transport. J Biol Chem 265,10109-17.

41. Cook, M.E., Graham, L.E., Botha, C.E.J., Lavin, C.A. (1997). Comparativeultrastructure of plasmodesmata of Chara and selectedbryophytes: toward an elucidation of the evolutionary origin ofplant plasmodesmata. American Journal of Botany. 84: 1169-1178.

42. Coppolino MG, Woodside MJ, Demaurex N, Grinstein S, StArnaud R, Dedhar S (1997) Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion. Nature 386: 843-847

43. Dawson W.O., Bubrick P., and Grantham G.L. (1988) Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication movement and symptomatology. Phytopathology 78: 783-789.

44. Denecke, J., Botterman, J. and Deblaere, R. (1990). Protein secretion in plant cells can occur via a default pathway. Plant Cell 2,51-9.

45. Denecke J, Carlsson LE, Vidal S, Hoglund AS, Ek B, van Zeijl MJ, Sinjorgo KMC, Palva ET (1995) The tobacco homolog of mammalian calreticulin is present in protein complexes in vivo. Plant Cell 7: 391-406

46. Deom, C.M., Oliver, M.J., Beachy, R.N., 1987. The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement. Science 237, 389-394.

47. Deom C.M., Schubert K.R.,Wolf S., Holt C.A., Lucas W.J., and Beachy R.N.(1990) Molecular characterization and biological function of the movement protein of tobacco mosaic virus in transgenic plants. Proc.Natl.Acad.Sci.USA87: 3284-3288.

48. Derrick PM, Barker H, Oparka KJ (1992) Increase in plasmodesmatal permeability during cell-to-cell spread of tobacco rattle virus from individually inoculated cells. Plant Cell 4:1405-1412

49. Ding B. (1998) Intercellular protein trafficking through plasmodesmata. Plant Molecular Biology 38:79-310.

50. Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M.V. (1991). Routine cryofixation of plant tissue by propane jet freezing for freeze substitution. J Electron Microsc Tech, 19,107-17.

51. Ding B, Haudenshield JS, Hull RJ, Wolf S, Beachy RN, Lucas WJ (1992) Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.Plant Cell 4: 915-928

52. Ping B., Kwon M.O., and Warnberg L. (1996) Evidence that actin filaments are involved in controlling the permeability of plasmodesmata in tobacco mesophyll. Plant J.10: 157-164 .

53. Ding, X.S., Carter, S.A., Deom, C.M., Nelson, R.S. (1998). Tobamovirus and potyvirus accumulation in minor veins of inoculated leaves from representatives of the Solanaceae and Fabaceae. Plant Physiol, 116, 125136.

54. Edeling, M. A., Smith, C. and Owen, D. (2006). Life of a clathrin coat: insights from clathrin and AP structures. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 32-44.

55. Ehlers, K., and Kollmann, R. (2001). Primary and secondary plasmodesmata: Structure, origin, and functioning. Protoplasma 216:1-30.

56. Ehlers K, Schultz M, Kollmann R (1996) Subcellular localization of ubiquitin in plant protoplasts and the function of ubiquitin in selective degradation of outer-wall plasmodesmata in regenerating protoplasts. Planta 199: 139-151.

57. Esau K.,Thorsch J. (1985) Sieve plate pores and plasmodesmata , the communication channels of the symplast: ultrastructural aspects and developmental relations. Am J.Bot. 72:1641-1653 .

58. Eulgem, T., Rushton, P.J., Schmelzer, E., Hahlbrock, K., and Somssich, I.E. (1999). Early nuclear events in plant defence signaling:Rapid gene activation by WRKY transcription factors. EMBO J. 18:4689-4699.

59. Fridborg, I., Grainger, J., Page, A., Coleman, M., Findlay, K., Angelí, S. (2003). TIP, a novel host factor linking callóse degradation with the cell-to-cell movement of Potato virus X. Mol Plant Microbe Interact, 16, 132140.

60. Fulnecek J. K. Y. Lim A. R. Leitch A. Kovarik R. Matyasek (2002) Evolution and structure of 5S rDNA loci in allotetraploid Nicotiana tabacum and its putative parental species. Heredity 88: 19-25

61. Gamalei, Y.V. (1989). Structure and function of leaf minor veins intrees and herbs. Trees, 3: 96-110.

62. Gamalei Y.V., Van Bel A.,J.,E., Pakhomova M.V., and Sjutkina A. (1994) Effects of temperature on the conformation of the endoplasmatic reticulum and on starch accumulation in leaves with the symplastic minor-vein configuration. Planta 194:443-453

63. Ghoshroy S., Lartley R., Sheng J.,Citovsky V. (1997) Transport of proteins and nucleic acids through plasmodesmata. Annu.Rev.Plant. Physiol. Plant.Mol.Biol. 48:27-50

64. Gilliland, L.U., Pawloski, L.C., Kandasamy, M.K. and Meagher, R.B. 2003. Arabidopsis actin gene ACT7 plays an essential role in germination and root growth. The Plant Journal 33 (2), 319-328.

65. Gillingham, A. K. and Munro, S. (2003). Long coiled-coil proteins and membrane traffic. Biochim Biophys Acta 1641, 71-85.

66. Gillingham, A. K., Tong, A. H., Boone, C. and Munro, S. (2004). The GTPase Arflp and the ER to Golgi cargo receptor Ervl4p cooperate to recruit the golgin Rud3p to the cis-Golgi. J Cell Biol 167,281-92.

67. Glushka JN, Terrell M, York WS, O'Neill MA, Gucwa A, Darvill AG, Albersheim P, Prestegard JH (2003) Primary structure of the 2-O-methyl-alpha-L-fucose-containing side chain of the pectic polysaccharide, rhamnogalacturonan II. Carbohydr Res 338:341-352

68. Goodwin P.B. (1983) Molecular size limit for movement in the symplast of the Elodea leaf. Planta 157:124-130.

69. Gorbalenya, A. E., Koonin, E.V. (1993). Helicases. Amino acid sequence comparisons and beyond. Curr. Opin. Struct. Biol., 3,419-429.

70. Goodwin P.B. (1983) Molecular size limit for movement in the symplast of the Elodea leaf. Planta 157:124-130.

71. Grabski, S., de Feijter, A.W., Schindler, M. (1993). Endoplasmic reticulum forms a dynamic continuum for lipid diffusion between contiguous soybean root cells. Plant Cell, 5,25-38.

72. Guan Y. and Nothnagel E.A.(2004) Binding of Arabinogalactan Proteins by Yariv Phenylglycoside Triggers Wound-Like Responses in Arabidopsis Cell Cultures. Plant Physiol. 135:1346-1366,

73. Gunning, B. E. S. and Overall R. L., 1983: Plasmodesmata and cell-, to-cell transport in plants. Bioscience 33,260—265

74. Hake, S. and Char, B.R. (1997) Cell-Cell Interactions during Plant. Development, Genes Devel.,vol. 11,1087-1097.

75. Hadlington, J. L. and Denecke, J. (2000). Sorting of soluble proteins in the secretory pathway of plants. Curr Opin Plant Biol 3,461-8.

76. Hamilton, W.D.O., and Baulcombe, D.C. (1989). Infectious RNA produced by in vitro transcription of a full-length tobacco rattle virus RNA-1 cDNA. Gen. Virol. 70,963-968.

77. Hanton, S. L., Bortolotti, L. E., Renna, L., Stefano, G. and Brandizzi, F. (2005). Crossing the divide-transport between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus in plants. Traffic 6, 267-77.

78. Haupt S., Cowan G.H., Ziegler A., Roberts A.G., Oparka K.J., Torrance L (2005) Two plant-viral movement proteins traffic in the endocytic recycling pathway. Plant Cell 17:164-181

79. Hawes, C. and Satiat-Jeunemaitre, B. (2005). The plant Golgi apparatus—going with the flow. Biochim Biophys Acta 1744, 93-107.

80. Hawes, C. (2005). Cell biology of the plant Golgi apparatus. New Phytologist 165,29-44.

81. Haywood, V., Kragler, F., Lucas, W.J., 2002. Plasmodesmata: pathways for protein and ribonucleoprotein signaling. Plant Cell 14, S303-S325.

82. Heinlein, M., Epel, B.L., Padgett, H.S., Beachy, R.N., 1995. Interaction oftobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science 270,1983-1985

83. Helariutta, Y., Fukaki, H., Wysocka-Diller, J., Nakajima, K., Jung, J., Sena, G., Hauser, M.T., and Benfey, P.N. (2000). The SHORT-ROOT gene controls radial patterning of the Arabidopsis root through radial signaling. Cell 101,555-567.

84. Henrissat,B., Claeyssens,M., Tomme,P., Lemesle,L. and Mornon,J.-P.(1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis.Gene, 81: 83-95.

85. Hirst, J., Miller, S. E., Taylor, M. J., von Mollard, G. F. and Robinson, M. S. (2004). EpsinR is an adaptor for the SNARE protein Vtilb. Mol Biol Cell 15,5593-602.

86. Hohl, I., Robinson, D. G., Chrispeels, M. J. and Hinz, G. (1996). Transport of storage proteins to the vacuole is mediated by vesicles without a clathrin coat. J Cell Sci 109 ( Pt 10), 2539-50.

87. Hong, W. (2005). SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta 1744,120-44.

88. Huang Z, Andrianov VM, Han Y, Howell SH (2001) Identification of Arabidopsis proteins that interact with the cauliflower mosaic virus (CaMV) movement protein. Plant Mol Biol 47: 663-675

89. Itaya A., Hickman H., Bao Y., Nelson R.,and Ding B. (1997)Cell-to-cell trafficking of cucumber mosaic virus movement protein: GFP fusion produced by biolistic gene bombardment in tobacco. Plant J. 12: 1223-1230

90. Itaya A., Woo Y.M., Masuta C., Bao Y., NelsonR.S., and Ding B.(1998) Developmental Regulation of Intercellular Protein Trafficking through Plasmodesmata in Tobacco Leaf Epidermis Plant Physiol. 118: 373-385.

91. Jackson, D., 2002. Double labeling of KNOTTED 1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot apex. Plant Physiol. 129,1423- 1429.

92. Jackson, D., Hake, S., 1997. Morphogenesis on the move: cell-to-cell trafficking of plant regulatory proteins. Curr. Opin. Genet. Dev. 7,495-500.

93. Jauh, G. Y., Phillips, T. E. and Rogers, J. C. (1999). Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions. Plant Cell 11, 186782.

94. Jahn, R., Lang, T. and Sudhof, T. C. (2003). Membrane fusion. Cell 112,519-33.

95. Jia, J.H., Tong, C., Wang, B., Luo, L.P., Jiang, J., 2004. Hedgehog signalling activity of Smoothened requires phosphorylation by protein kinase A and casein kinase I. Nature 432,1045- 1050.

96. Jiang, R., Gao, B., Prasad, K., Greene, L. E. and Eisenberg, E. (2000). Hsc70 chaperones clathrin and primes it to interact with vesicle membranes. J Biol Chem 275, 8439-47.

97. Jones, M.G.K. (1976). The origin and development of plasmodesmata. In Intercellular Communication in Plants: Studies on Plasmodesmatapp. Springer-Verlag, Berlin, Germany, 81-105.

98. Kalinina, N.A., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, T., Morozov, S.Yu., Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analysis of recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Lett, 397,75-78.

99. Karasev A.V, Kashinab A.S, Gelfandb V.I. and DoljaV.V.(1992) HSP70-related 65 kDa protein of beet yellows closterovirus is a microtubule-binding protein. FEBS 304: 12-14.

100. Karpova, O.V., Ivanov, K.I., Rodionova, N.P., Dorokhov, Y.L., Atabekov, J.G., 1997. Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology 230,11-21.

101. Karpova, O.V., Rodionova, N.P., Ivanov, K.I., Kozlovsky, S.V., Dorokhov, Y.L., Atabekov, J.G., 1999. Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology 261, 2024.

102. Kasteel J. W., Goldbach R. W. and van Lent J. W. M.(1997) Isolation and characterization of tubular structures of cowpea mosaic virus. J. of Gen.Vir. (1997), 78,3167-3170

103. Kim JY, Rim Y, Wang L, Jackson D (2005) A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev 19: 788— 793

104. Kim, J.Y., Yuan, Z., Jackson, D., 2003. Developmental regulation and significance of KNOX protein trafficking in Arabidopsis. Development 130, 4351-4362.

105. Kim JY, Yuan ZA, Cilia M, Khalfan-Jagani Z, Jackson D (2002) Intercellular trafficking of a KNOTTED 1 green fluorescent protein fusion in the leaf and shoot meristem of Arabidopsis. Proc Natl Acad Sei USA 99: 4103^108

106. Kim, S-J., Kim, M-R, Bedgar, D.L., Moinuddin, S.G.A., Cardenas, C.L., Davin, L.B., Kang,C. and Lewis, N.G. (2003b) Functional reclassification of the putative cinnamyl. alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis. PNAS. 101 (6): 1455-1460

107. Kirchhausen, T. (2002). Clathrin adaptors really adapt. Cell 109,413.6.

108. Kollmann, R., and Glockmann, C. (1985). Studies on graft unions.I. Plasmodesmata between cells of plants belonging to different unrelated taxa. Protoplasma 124,224-235.

109. Kollmann, R., and Glockmann, C. (1991). Studies on graft unions.III. On the mechanism of secondary formation of plasmodesmata at the graft interface. Protoplasma 165, 71-85,

110. Koonin, E. V. and Dolja, V. V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit Rev Biochem Mol Biol 28,375-430.

111. Kost B, Spielhofer P, Chua N-H (1998) A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes. Plant J. 1998 Nov;16(3):393-401.

112. Kotlizky G., Shurtz S., Yahalom A., Malik Z., Traub O., and Epel B.L.(1992)An improved procedure for the isolation of plasmodesmata embedded in clean maize cell walls. Plant J. 2:623-630.

113. Kragler F, Curin M, Trutnyeva K, Gansch A, Waigmann E (2003) MPB2C, a microtubule-associated plant protein binds to and interferes with cellto-cell transport of tobacco mosaic virus movement protein. PlantPhysiol 132:1870-1883

114. Kragler, F., Monzer, J., Shash, K., Xoconostle-Ca'zares, B., Lucas, W.J., (1998). Cell-to-cell transport of proteins: requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J. 15, 367-381.

115. Kragler, F., Monzer, J., Xoconostle-Ca'zares, B., Lucas, W.J., 2000. Peptide antagonists of the plasmodesmal macromolecular trafficking pathway. EMBO J. 19,2856- 2868.

116. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227,680-5.

117. Lazarowitz S.G., Beachy R.N. (1999) Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants. Plant Cell 11: 535548

118. Lederkremer, G. Z., Cheng, Y., Petre, B. M., Vogan, E., Springer, S., Schekman, R., Walz, T. and Kirchhausen, T. (2001). Structure of the Sec23p/24p and Secl3p/31p complexes of COPII. Proc Natl Acad Sei U S A 98, 10704-9.

119. Lee, J.Y., Yoo, B.C., Rojas, M.R., Gomez-Ospina, N., Staehelin, L.A., Lucas, W.J., 2003. Selective trafficking of non-cell-autonomous proteins mediated by NtNCAPPl. Science 299,392-396.

120. Lee, J.Y. and Lucas, W.J.(2001). Phosphorylation of viral movement proteins— Regulation of cell-to-cell trafficking. Trends Microbiol. 9, 5-8.

121. Lee, Y. R. and Liu, B. (2004). Cytoskeletal motors in Arabidopsis. Sixty-one kinesins and seventeen myosins. Plant Physiol 136,387783.

122. Leisner, S.M., Howell, S.H. (1993 a). Long distance movement of viruses in plants. Trends Microbiol., 1:314-317.

123. Leisner, S.M., Turgeon, R., Howell, S.H. (1993 b). Effects of host plant development on the long-distance movement of cauliflower mosaic virus in Arabidopsis. Plant Cell, 5: 191-202.

124. Li, B. and Fields, S. (1993) Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 T antigen by using the yeast two-hybrid system. FASEB J. 7:957-963.

125. Loh, E. and Hong, W. (2004). The binary interacting network of the conserved oligomeric Golgi tethering complex. J Biol Chem 279,24640-8.

126. Lucas, W.J. and Lee, J.-Y. (2004) Cell-to-cell communication in plants: plasmodesmata as a supracellular control network. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:712-726.

127. Lucas WJ, Bouchepillon S, Jackson DP, Nguyen L, Baker L, Ding B, Hake S (1995) Selective trafficking of KNOTTED 1 homeodomain protein and its messenger-RNA through pl^sfjjodesmata. Science 270:1980-1983

128. Lucas, W.J., Ding, B., van Der SchoQt, Q„ JP93. PJasmqcje^^ and the supracellular nature of plants. New Phytol. 125,435-476.

129. Lucas, W. J. 1993 Process of virus systemic infection studied using microinjection procedures. In: Genetic Engineering, Molecular Biology and Tissue

130. Lupas, A. (1997). Predicting coiled-coil regions in proteins. Curr Opin Struct Biol 7,388-93.

131. Lupas, A., Van Dyke, M., and Stock, J. (1991) Predicting Coled Coils from Protein Sequences, Science 252:1162-1164.

132. Macia, E., Luton, F., Partisani, M., Cherfils, J., Chardin, P. and Franco, M. (2004). The GDP-bound form of Arf6 is located at the plasma membrane. J Cell Sci 117,2389-98.

133. Matsushita, Y., Hanazawa, K., Yoshioka, K., Oguchi, T., Kawakami, S., Watanabe, Y., Nishiguchi, M., Nyunoya, H.( 2000). In vitro phosphorylation of the movement protein of tomato mosaic tobamovirus by a cellular kinase. J. Gen. Virol. 81,2095-2102.

134. Matsushita, Y., Ohshima, M., Yoshioka, K., Nishiguchi, M., Nyunoya, H. (2003). The catalytic subunit of protein kinase CK2 phosphorylates in vitro the movement protein of Tomato mosaic virus. J. Gen. Virol. 84, 497505.

135. Maule, A.J. (1991). Virus movement in infected plants. Cri. Rev. Plant Sci., 9:457-473.

136. McDowell, J. M., An, Y.-Q., McKinney, E. C., Huang, S., and Meagher, R. B. (1996). T The arabidopsis ACT7 actin gene is expressed in rapidly developing tissues and responds to several external stimuli. Plant physiol. 111(3): 699-712.

137. Mclean BG, Zupan J, Zambryski PC (1995) Tobacco mosaic virus movement protein

138. McMahon HT, Mills IG. COP and clathrin-coated vesicle budding: different pathways, common approaches. Current Opinion in Cell Biology 2004; 16(4): 379-391.

139. Meckel, T., Hurst, A. C., Thiel, G. and Homann, U. (2004). Endocytosis against high turgor: intact guard cells of Vicia faba constitutively endocytose fluorescently labelled plasma membrane and GFP-tagged K-channel KAT1. Plant J 39, 182-93.

140. Melcher, U. (1990). Similarities between putative transport proteins of plant viruses. J. of Gen. Virology 71,1009-1018.

141. Melcher, U. (1993). HIV-1 proteinase as structural model of intercellular transport proteins of plant viruses. J. of Theoretical Biology 162, 6174.

142. Memon, A. R. (2004). The role of ADP-ribosylation factor and SARI in vesicular trafficking in plants. Biochim Biophys Acta 1664, 9-30.

143. Mernaugh R. and Mernaugh G., (1995) Methods for the production of mouse monoclonal antibodies. In "Molecular methods in plant pathology", ed by Rudra P.Singh and UmaN. Singh,"LEWIS Publisher", 343-358.

144. Mezitt, L.A., Lucas, W.J. (1996). Plasmodesmal cell-to-cell transport of proteins and nucleic acids. Plant Mol Biol, 32,251-273.

145. Minic Z, Rihouey C, Do CT, Lerouge P, Jouanin L (2004) Purification and characterization of enzymes exhibiting beta-D-xylosidase activities in stem tissues of Arabidopsis. Plant Physiol,2004,135(2):78-867.

146. Morozov, S., Dolja, V. V. and Atabekov, J. G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J Mol Evol 29, 52-62.

147. Movafeghi, A., Happel, N., Pimpl, P., Tai, G. H. and Robinson, D. G. (1999). Arabidopsis Sec21p and Sec23p homologs. Probable coat proteins of plant COP-coated vesicles. Plant Physiol 119,1437-46.

148. Mushegian, A. R. (1994). The putative movement domain encoded by nepovirus RNA-2 is conserved in all sequenced nepoviruses. Archives of Virology 135,437-441.

149. Mushegian, A. R. and Koonin, E. V. (1993). Cell-to-cell movement of plant viruses. Insights from amino acid sequence comparisons of movement proteins and from analogies with cellular transport systems. Archives of Virology 133,239-257.

150. Nakajima, K., Sena, G., Nawy, T., and Benfey, P.N. (2001). Intercellular movement of the putative transcription factor SHR in root patterning. Nature 413,307-311.

151. Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H: Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant Physiol. 140(2):411-432.

152. Nebenfuhr, A. (2002). Vesicle traffic in the endomembrane system: a tale of COPs, Rabs and SNAREs. Cuit Opin Plant Biol 5, 507-12.

153. Nebenfuhr, A., Gallagher, L. A., Dunahay, T. G., Frohlick, J. A., Mazurkiewicz, A. M., Meehl, J. B. and Staehelin, L. A. (1999). Stop-and-go movements of plant Golgi stacks are mediated by the acto-myosin system. Plant Physiol 121,1127-42.

154. Nebenfiihr, A. and Staehelin, L. A. (2001). Mobile factories: Golgi dynamics in plant cells. Trends Plant Sci 6, 160-7.

155. Neumann, U., Brandizzi, F. and Hawes, C. (2003). Protein transport in plant cells: in and out of the Golgi. Ann Bot (Lond) 92,167-80.

156. Nickel, W., Brugger, B. and Wieland, F. T. (2002). Vesicular transport: the core machinery of COPI recruitment and budding. J Cell Sci 115, 3235-40.

157. Nicol, F., His, I., Jauneau, A., Vernhettes, S., Canut, H., Hofte, H. (1998) A plasma membrane-bound putative endo-l,4-b-Dglucanase is required for normal wall assembly and cell elongation in Arabidopsis. EMBO 17 (19):5563—5576.

158. Nufer, O., Guldbrandsen, S., Degen, M., Kappeler, F., Paccaud, J. P., Tani, K. and Hauri, H. P. (2002). Role of cytoplasmic C-terminal amino acids of membrane proteins in ER export. J Cell Sci 115, 619-28.

159. Okamuro J.K., Caster B., Villarroel R., van Montagu M., Jofuku K.D. (1997). The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:70767081.

160. Oparka KJ (2004) Getting the message across: How do plant cells exchange macromolecular complexes? Trends Plant Sci 9:33^11

161. Overall R.L. and Blackman L.M.( 1998) Immunolocalization ofthe cytoskeleton to plasmodesmata of Chara corallina. Plant J. 14:733-741.127

162. Overall R.L. and Blackman L.M. (1996) A model of the macromolecular structure of plasmodesmata. Trends Plant Sei 1: 307-311

163. Paleotti, O., Macia, E., Luton, F., Klein, S., Partisani, M., Chardin, P., Kirchhausen, T. and Franco, M. (2005). The small G-protein Arf6GTP recruits the AP-2 adaptor complex to membranes. J Biol Chem 280, 21661-6.

164. Paris, N. and Neuhaus, J. M. (2002). BP-80 as a vacuolar sorting receptor. Plant Mol Biol 50,903-14.

165. Paris, N., Stanley, C. M., Jones, R. L. and Rogers, J. C. (1996). Plant cells contain two functionally distinct vacuolar compartments. Cell 85, 563-72.

166. Peremyslov VV, Hagiwara Y, Dolja VV (1999) HSP70 homolog functions in cell-to-cell movement of a plant virus. Proc Natl Acad Sei USA 96:14771-14776

167. Petty, I.T.D., Jackson, A.O. (1990). Mutational analysis of barleystripe mosaic virus RNAß. Virology, 179: 712-71

168. Pilon M, Schekman R (1999) Protein translocation: how Hsp70 pulls it off.Cell 97: 679-682

169. Pimpl, P., Movafeghi, A., Coughlan, S., Denecke, J., Hillmer, S. and Robinson, D. G. (2000). In situ localization and in vitro induction of plant COPI-coated vesicles. Plant Cell 12,2219-36.

170. Porte B., Oertel-Buchheit P., Granger-Schnarr M., Schnarr M. (1997). Fos Leucine Zipper Variants with Increased Association Capacity. Nucleic Acids Res. 25(15): 3026-3033.

171. Pratelli, R., Sutter, J. U. and Blatt, M. R. (2004). A new catch in the SNARE. Trends Plant Sei 9,187-95.

172. Pruyne DW, Schott DH, Bretscher A (1998) Tropomyosin-containing actin cables direct the Myo2p-dependent polarized delivery of secretory vesicles in budding yeast. J Cell Biol 143: 1931-1945

173. Qi, Y., Pelissier, T., Itaya, A., Hunt, E., Wassenegger, M. and Ding, B. (2004). Direct role of a viroid RNA motif in mediating directional RNA trafficking across a specific cellular boundary. Plant Cell.16(7): 1741 1752

174. Radford J.,E., and White R.,G. (1998) Localization of myosin -like protein to plasmodesmata. Plant J. 14(6): 743-50

175. Raemdonck, D. van, Pesquet E., Cloquet S., Beeckman H., Boeijan W., Goffner D., El Jaziri M., and Baucher M.(2005). Molecular changes associated with the setting up of secondary growth in aspen. J. of Experimental Botany. 56(418): 2211-2227.

176. Raes, J., Rohde, A., Holst-Christensen, J., Van de Peer, Y. and Boeijan, W. (2003) Genome-wide characterization of the lignification toolbox in Arabidopsis. Plant Physiol. 133:1051-1071

177. Reichel C, Mas P, Beachy RN (1999) The role of the ER and cytoskeleton in plant viral trafficking. Trends Plant Sei 4:458^62

178. Rein, U., Andag, U., Duden, R., Schmitt, H. D. and Spang, A. (2002). ARF-GAP-mediated interaction between the ER-Golgi v-SNAREs and the COPI coat. J Cell Biol 157,395-404.

179. Ridley BL, O'Neill MA, Mohnen D (2001) Pectins: structure, biosynthesis, and oligogalacturonide related signaling. Phytochemistry 57: 929967

180. Rinne, P.L.H., Kaikuranta, P.M., van der Schoot, C. (2001). Theshoot apical meristem restores its symplastic organisation duringchilling-induced release from dormancy. Plant J., 26,249-264.

181. Robards M.R., Lucas W.J. (1990) Plasmodesmata. Annu Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol 41: 368-419.

182. Roberts, A.G., and K.J. Oparka. 2003. Plasmodesmata and the control of symplastic transport.Plant Cell Environ. 26:103-124.

183. Roberts K. (2001) How the Cell Wall Acquired a Cellular Context. Plant Physiology, January 2001, Vol. 125, pp. 127-130.

184. Roberts A. G. and Oparka K. J. (2003) Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell and Environment 26:103-124.

185. Roberts, A.G., Santa-Cruz, S., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Turgeon,.R., Oparka, K.J. (1997). Phloemunloading in sink leaves ofNicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute withafluorescent virus. Plant Cell, 9:1381-1396.

186. Robinson, D. G., Hinz, G. and Holstein, S. E. (1998). The molecular characterization of transport vesicles. Plant Mol Biol 38,49-76.

187. Roth, M. G. (1999). Inheriting the Golgi. Cell 99, 559-62.

188. Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Càzares, B., and Lucas, W.J. (1999). Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: Implications for supracellular regulation in plants. Development 126,4405-4419.

189. Runions J, Brach T, Ku"hner S, Hawes C (2005) Photoactivation of GFP for quantification of protein dynamics within the endoplasmic reticulum membrane. J Exp Bot 57:43-50

190. Rushton, P.J., Macdonald, H., Huttly, A.K., Lazarus, C.M., and Hooley, R. (1995). Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of a-Amy2 genes. Plant Mol. Biol. 29, 691-70

191. Rushton, P.J., Torres, J.T., Parniske, M., Wernert, P., Hahlbrock, K., and Somssich, I.E. (1996). Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteinswith elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes. EMBOJ. 15, 5690-5700.

192. Russinova, E., Borst, J. W., Kwaaitaal, M., Cano-Delgado, A., Yin, Y., Chory, J. and de Vries, S. C. (2004). Heterodimerization and endocytosis of Arabidopsis brassinosteroid receptors BRI1 and AtSERK3 (BAK1). Plant Cell 16, 3216-29.

193. Sacher, M., Barrowman, J., Wang, W., Horecka, J., Zhang, Y., Pypaert, M. and Ferro-Novick, S. (2001). TRAPP I implicated in the specificity of tethering in ER-to-Golgi transport. Mol Cell 7,433-42.

194. Saito, T., Yamana, K., Okada, Y. (1990). Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology. 176: 329-336.

195. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.

196. Sanderfoot, A. A., Assaad, F. F. and Raikhel, N. V. (2000). The Arabidopsis genome. An abundance of soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptors. Plant Physiol 124,1558-69.

197. Sanderfoot, A. A., Kovaleva, V., Bassham, D. C. and Raikhel, N. V. (2001). Interactions between syntaxins identify at least five SNARE complexes within the Golgi/prevacuolar system of the Arabidopsis cell. Mol Biol Cell 12, 3733-43.

198. Sapperstein, S. K., Walter, D. M., Grosvenor, A. R., Heuser, J. E. and Waters, M. G. (1995). pi 15 is a general vesicular transport factor related to the yeast endoplasmic reticulum to Golgi transport factor Usolp. Proc Natl Acad Sci U S A 92,522-6.

199. Schott D, Ho J, Pruyne D, Bretscher A (1999) The COOH-terminal domain of Myo2p, a yeast myosin V, has a direct role in secretory vesicle targeting. J Cell Biol 147: 791-808

200. Serafini, T., Orci, L., Amherdt, M., Brunner, M., Kahn, R. A. and Rothman, J. E. (1991a). ADP-ribosylation factor is a subunit of the coat of Golgi-derived COP-coated vesicles: a novel role for a GTP-binding protein. Cell 67,239-53.

201. Shorter, J. and Warren, G. (2002). Golgi architecture and inheritance. Annu Rev Cell Dev Biol 18, 379-420.

202. Sibout R, Eudes A, Mouille G, Pollet B, Lapierre C, Jouanin L and Seguin A (2005): CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant Cell. 17:2059-2076.

203. Sollner, T., Whiteheart, S. W., Brunner, M., Erdjument-Bromage, H., Geromanos, S., Tempst, P. and Rothman, J. E. (1993). SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature 362,318-24.

204. Solovyev, A. G., Stroganova, T. A., Zamyatnin, A. A., Jr., Fedorkin, O. N., Schiemann, J. and Morozov, S. Y. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins: TGBp3-assisted targeting ofTGBp2. Virology 269,113-27.

205. Storms, M.M., Kormelink, R., Peters, D., van Lent, J.W., Goldbach, R.W. (1995). The nonstructural NSm protein of tomato spotted wilt virus induces tubular structures in plant and insect cells. Virology, 214: 485-493.

206. Sudhof, T. C. (2004). The synaptic vesicle cycle. Annu Rev Neurosci 27, 509-47.

207. Surpin, M. and Raikhel, N. (2004). Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 5,100-9.

208. Suvorova, E. S., Duden, R. and Lupashin, V. V. (2002). The Sec34/Sec35p complex, a Yptlp effector required for retrograde intra-Golgi trafficking, interacts with Golgi SNAREs and COPI vesicle coat proteins. J Cell Biol 157, 631-43.

209. Sztul, E. and Lupashin, V. (2006). Role of tethering factors in secretory membrane traffic. Am J Physiol Cell Physiol 290, CI 1-26.

210. Terry B.R and Robards A.B.(1987) Hydrodynamic radius alone governs the mobility of molecules trough plasmodesmata. Planta 172: 145-157 .

211. Tilney, L.G., Cooke, T.J., Connelly, P.S., Tilney, M.S. (1991). The structure of plasmodesmata as revealed by plasmolysis, detergent extraction, and protease digestion. J Cell Biol, 112, 739-747.

212. Trutnyeva K, Bachmaier R, Waigmann E (2005) Mimicking carboxyterminal phosphorylation differentially effects subcellular distribution and cell-to-cell movement of tobacco mosaic virus movement protein. Virology 332: 563-577

213. Tucker E.B. (1982)TransIocation in the staminal hairs of Setcreasea purpurea. I. Study of ultrastructure and cell-to-cell passage of molecular probes. Protoplasma 113:193-201.

214. Ueda, T. and Nakano, A. (2002). Vesicular traffic: an integral part of plant life. Curr Opin Plant Biol 5, 513-7.

215. Ueda, T., Ueraura, T., Sato, M. H. and Nakano, A. (2004). Functional differentiation of endosoraes in Arabidopsis cells. Plant J 40,783-9.

216. Uemura, T., Ueda, T., Ohniwa, R. L., Nakano, A., Takeyasu, K. and Sato, M. H. (2004). Systematic analysis of SNARE molecules in Arabidopsis: dissection of the post-Golgi network in plant cells. Cell Struct Funct 29,49-65.

217. Ungermann, C. and Langosch, D. (2005). Functions of SNAREs in intracellular membrane fusion and lipid bilayer mixing. J Cell Sci 118, 381928.

218. Van Lent J., Wellink J., and Goldbach R. (1990) Evidence for the involvement of the 58K and 48K proteins in the intercellular movement of cowpea mosaic virus. J.Gen. Virol. 71:219-223.

219. Wada T, Tachibana T, Shimura Y and Okada K (1997) Epidermal cell differentiation in Arabidopsis determined by a myb homolog, CPC. Science, 277,1113-1116.

220. Waigmann E, Chen MH, Bachmaier R, Ghoshroy S, Citovsky V (2000) Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO J 19:4875-4884

221. Waigmann, E., Turner, A., Peart, J., Roberts, K., Zambryski, P. (1997). Ultrastructural analysis of leaf trichome plasmodesmata reveals major differences from mesophyll plasmodesmata. Planta. 203: 75-84.

222. Waigmann, E., Zambryski, P., 1995. Tobacco mosaic virus movement protein-mediated protein transport between trichrome cells. Plant Celli, im-im.

223. Wang, Z., Yang, P., Fan, B., and Chen, Z. 1998. An oligo selection procedure for identification of sequence-specific DNA-binding activities associated with plant defense. Plant J. 16:515-522.

224. Ward T.H., Polishchuk R.S., Caplan S., Hirschberg K. and Lippincottschwartz J. (2001) Maintenance of Golgi structure and function depends on the integrity of ER export. J. Cell Biol., 155:, 557-570.

225. Waters, M. G., Clary, D. O. and Rothman, J. E. (1992). A novel 115-kD peripheral membrane protein is required for intercisternal transport in the Golgi stack. J Cell Biol 118,1015-26.

226. Wieczorek A and Sanfacon H. (1993) Characterization and subcellular location of Tomato Ringspot nepovirus putative movement protein . Virology, ,194:734-742.

227. Wickner, W. and Haas, A. (2000). Yeast homotypic vacuole fusion: a window on organelle trafficking mechanisms. Annu Rev Biochem 69, 247-75.

228. Willats WG, McCartney L, Mackie W, Knox JP (2001) Pectin: cell biology and prospects for functional analysis. Plant Mol Biol 47: 9-27

229. White, R.G., Badelt, K., Overall, R.L., Vesk, M. (1994). Actin associated with plasmodesmata. Protoplasma, 180, 169-184.

230. Wolf, S., Deom, C.M., Beachy, R.N., Lucas, W.J. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, 426:377-379.

231. Wolf S, Deom CM, Beachy R, Lucas WJ (1991) Plasmodesmatal function is probed using transgenic tobacco plants that express a virus movement protein. Plant Cell 3: 593-604

232. Xiong, Z., Kim, K.H., Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S.A. (1993). The roles of the red necrotic mosaic virus capsid and cell-to-cell movement proteins in systemic infection. Virology, 192,27-32.

233. Xu, R.M., Carmel, G., Sweet, R.M., Kuret, J., Cheng, X., 1995. Crystal structure of casein kinase-1, a phosphate-directed protein kinase. EMBO J. 14,1015-1023.

234. Yamakawa, H., Seog, D. H., Yoda, K., Yamasaki, M. and Wakabayashi, T. (1996). Usol protein is a dimer with two globular heads and a long coiled-coil tail. J Struct Biol 116,356-65.

235. Yahalom, A., Lando, R., Katz, A., Epel, B.L., 1998. A calcium-dependent protein kinase is associated with maize mesocotyl plasmodesmata. J. Plant Physiol. 153, 354-362.

236. Yahalom A., Warmbrodt R.D., Laird D.W., Traub O., Revel J.P., Willecke K, Epel B.L.(1991). Maize mesocotyl plasmodesmata proteins cross-react with connexin gap junction protein antibodies. Plant Cell 3:407-417.

237. Yang, P., Wang, Z., Fan, B., Chen, C. and Chen, Z. (1999) A pathogen- and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of the tobacco class I chitinase gene promoter. Plant Cell 13: 1779-1790

238. Yoo, B.C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y.M., Lough, T.J., Lucas, W.J., 2004. A systemic small RNA signaling system in plants. Plant Cell 16,1979-2000.

239. Youn B , Camacho R, Moinuddin SG, Lee C , Davin LB, Lewis NG , Kang C ( 2006 ). Ciystal structures and catalytic mechanism of the Arabidopsis cinnamyl alcohol dehydrogenases AtCAD5 and AtCAD4 . Org. Biomol. Chem.,4: 1687- 1697.

240. Zambiyski, P., and K. Crawford. 2000. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 393^121.

241. Zheng H.„ Wang G.„ and Zhang L., (1997) Alfalfa Mosaic Virus Movement Protein induces yubules in plant protoplasts. MPMI 10 (No. 8): pp. 1010-1014

242. Zerial, M. and McBride, H. (2001). Rab proteins as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol 2,107-17.

243. Zhao, L., Helms, J. В., Brugger, В., Harter, C., Martoglio, В., Graf, R., Brunner, J. and Wieland, F. T. (1997). Direct and GTP-dependent interaction of ADP ribosylation factor 1 with coatomer subunit beta. Proc Natl Acad Sci U S A 94,4418-23.

244. Zhao, L., Helms, J. В., Brunner, J. and Wieland, F. T. (1999). GTP-dependent binding of ADP-ribosylation factor to coatomer in close proximity to the binding site for dilysine retrieval motifs and p23. J Biol Chem 274,14198-203.