Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Светоадресуемый потенциометрический сенсор для исследования кинетики ферментативных реакций

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Светоадресуемый потенциометрический сенсор для исследования кинетики ферментативных реакций"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТАМ. М.ВЛОМОНОСОВА ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ :

На правах рукописи УДК 621.315:547.814+577.150.87

КОНДРАТЬЕВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

СВЕТОАДРЕСУЕМЫЙ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ.

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1995

Р Г Б ОД

о ,0 [}""[

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ

им.М.В Ломоносова.

Научные руководители: кандидат физико-математических наук, ст.науч.

сотрудник кафедры биофизики Л.В.Яковенко, доктор химических наук, профессор, завлаб, института биохимии имА.Н.Баха РАН А-И.Ярополов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, завлаб, института

химической физики им.Н. Н.Семенова РАН А.Ф.Ванин, доктор физико-математических наук, Г.С.Плотников.

Ведущая организация: Гематологический научный цетр РАМН

Защита диссертации состоится ". ¿СУсМ'/сЛ' 1995 г.

в 7& час, на заседании диссертационного совета .№ З.ОФТТ /К.053.05.77/ в МГУ им.М.В Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, аудитория

СФА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им.М.В Ломоносова. Автореферат разослан

СХсГаЯ^ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета N 3 ОФТТ /К.053.05.77/ в МГУ им.М.В.Лош>носова ,

Л

кандидат физико-математических наук /) • /рЛ. Котсльникова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Для решения широкого круга задач, связанных с детекцией биологически активных соединений, необходимо , создание высокочувствительных методов анализа, отличающихся простотой,' доступностью, возможностью автоматизации. Указанным выше требованиям отвечают биосенсоры - устройства, включающие чувствительный элемент биологического происхождения, тесно связанный с • физическим преобразователем или интегрированный с ним.

Использование полупроводниковых структур с иммобилизованными ферментами позволяет достичь высокой селективности и миниатюризации сенсоров. На сегодняшний день известно 2 типа преобразователей, являющихся основой полупроводниковых потенциомстрических биосенсоров: ион-селективный полевой транзистор (ИСПТ) и кремниевый светоадресуемый сенсор. Ион-сслехтивный полевой транзистор с иммобилизованными на затворе ферментами в настоящее время достаточно широко используется в качестег биосенсора при определении различных органических веществ. Светоадресуемый потенцкометрический ■ сенсор (СПС), или LAPS в оригинальной транскрипции (light-addressable potentiometric sensor), создан на основе принципа управления параметрами полупроводника внешним электрическим полем к исследуется в качестве основы биосенсоров последние 5 лет. СПС функционально аналогичен полевому транзистору, но, вместе с тем, обладает рядом преимуществ - более прост конструктивно, дешев и позволяет на одном полупроводниковом кристалл? формировать большое число

ч

различных биосенсорных зон, содержащих ферменты, клетки и другие

г

компоненты биологических систем. Именно эта свойства датчика и обеспечивают интерес к разработкам биосснсоров на его основе.

Цель работы. Целью диссертационной работы являлось создание нового-автономного г прибора на основе свсгоадресуемого потенциометр ического

сенсора, изучение его характеристик и разработка4методики использования

N

СПС для исследования кинетики ферментативных реакций в водных и неводных растворах и при иммобилизации ферментов на поверхности датчика. Научная новизна работы заключается *в следующем:

- В работе впервые исследованы физико-химические характеристики нового кремниевого свсгоадресуемого преобразователя с диэлектриком из TajOj, являющегося сенсорной частью автономного прибора. Показано, что СПС имеет высокую рН-чувствительность и селективность к протонам.

- Разработаны методики регистрации кинетических параметров ДрН-генерирующих реакций для ферментов различных классов (оксидоредуетаз, гидролаз) в водных растворах с использованием СПС.

- Разработаны методы иммобилизации ферментов различных классов в матрице, сформированной на поверхности СПС из раствора полиэтиленимина, модифицированного цетил- и этилбромидом (CE-PEI). Определены кинетические параметры иммобилизованных на поверхности полупроводника ферментов.

- Впервые показана принципиальная. возможность регистрации кинетики биохимических реакций в негодных средах (органических растворителях) с помощью СПС и с использованием иммобилизоваш&к ферментов.

Практическая ценность. Полученные в диссертации результаты могут служить основой для создания высокочувствительных биосенсоров нового типа

на баз: СПС для детекции органических соединений (углеводов, пестицидов, асиров и т.д.) * в водных и неводных средах, а также дм разработки новых методик исследования механизмов ферментативных реакций, протекающих с образованием протонов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на конференции "ВюсаЫуз^ 95", Суздаль, 27 августа - 1 сентября 1995 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения,

Во введении показана актуальность темы, научная новизна, сфсрмулирозаны цель к задачи диссертационной работы, кратко изложены основные направления исследований.

В обзоре литературы, состоящем из трех глав, приведены основные результаты экспериментальных работ по исследованию полупроводниковых потентдюлетрггчеекзе: преобразователей в качестве основы биосенсоров; представлены данные об использовании различных биологических объектов как компонентов бкосенсоров; рассмотрены основные методы иммобилизации,

выводов и списка литературы. Диссертация изложена

включающих 30 рисунков таблиц. Список литературы состоит

наименований.

II. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

V

используемые при создании.биосенсоров.

N

р первой главе проводится сравнение физико-химических характеристик полупроводниковых потенциометрических сенсоров: чувствительности, стабильности, ионной селективности. Рассмотрены оба типа потенциометрических сенсоров - ион-селективные полевые транзисторы и светоадресуемые потенциометрические сенсоры. Показано, что обычно в качестве рН-чувсгвительного диэлектрика в СПС используются нитрид кремния 51зИ4 или оксид кремния БЮг, реже АДОз и практически отсутствуют данные об использовании в качестве рН-чувствительного слоя в СПС диэлектрика Та205, хотя данный диэлектрик довольно часто применяется в ИСПТ. Рассмотрены основные физические процессы, происходящие в структуре "металл-диэлектрик-полупроводник", аналоге структуры "элгкгролит-- диэлектрик-полупроводник" в СПС.

Во второй главе приведены данные об использовании в сенсорах чувствительных элементов биологического происхождения (ферментов, клеток, антител и др.). Подробно рассмотрены условия, в которых функционируют иммобилизованные на поверхности сенсора биологические объекты - интервал температур, рН среды и т.д. Описаны основные классы ферментов, используемый при создании полупроводниковых биосенсоров и приведены данные об уже существующих сенсорах с использованием этих ферментов.

В третьей пгаве представлены методы сопряжения физических преобразователей с биологическими компонентами, позволяющие обосновать как выбор полимерного носителя в качестве ферментсодержащей матрицы, так и выбор способа иммобилизации на поверхности сенсора; обсуждены преимущества использования гидрофобного полимерного носителя.

Анализ литературных данных показывает, чтг. в настоящее время

отсутствует информация о биосенсорах, совмещающих в своей конструкции полупроводниковый преобразователь и ферментсодержащие полимерные мембраны для анализа в органических средах. В связи с этим, представляет интерес изучение возможностей создания сенсоров на основе СПС с полимерными мембранами, содержащими ферменты, приходных для использования в водных и органических средах, а также выяснение роли различных физических и химических факторов, влияющих на каталитические свойства ферментов, иммобилизованных в полимерных структурах.

Четвертая глава "Методы и материалы" посвящена методике экспериментов. В ней описаны разработанные методики иммобилизации ферментов на поверхности сенсора в полимерных матрицах, полученных из бычьего сывороточного альбумина (БСА) с глутаровым алвдегидом, а также сформированных из раствора полимера на основе полиэтиленимина, модифицированного цетил- и этилбромвдом; рассмотрены конструктивные особенности автономного прибора.

В разработанном устройстве предусмотрены два режима работы - режим, при котором происходит периодическая регистрация вольт-амперных характеристик "(ВАХ) с регулируемым (от 30 с до 2 мин) периодом и режим регистрации потенциала смещения во времени, который соответствует предварительно заданному значению фототека, выбранному на линейном участке ВАХ. Этот режим удобно использовать при регистрации изменений рН раствора. При этом величина потенциала смещения (исм) фиксируется на блоке цифровой индикации. Данный режим работы прибора- использовался при исследовании кинетических параметров нативных и иммобилизованных ' ферментов. Измерения каталитических активностей нативных и

иммобилизованных ферментов были проведены с использованием амперометрических и спектрофотометр ических методик регистрации для сравнения с данными, полученными с "помощью СПС, что позволило подтвердить достоверность интерпретации полученных результатов.

Кремниевые полупроводниковые сенсоры Ъ., рН-чувствительным диэлектриком Та205 были получены в НПО "Авангард" (г.Сашсг-Петербург).

Экспериментальные результаты приведены в разделе "Результаты и их обсуждение", содержащем четыре главы - с пйтой по восьмую.

В пятой главе изложены полученные автором результаты исследования физико-химических характеристик светоадресуемого сенсора: вольт-амперные характеристики в буферных растворах в интервале значений рН 4.0 - 9.0 , влияние ионной силы и ионного состава электролитов на отклик СПС, временные характеристики сенсора.

Представленный в данной работе прибор состоит из функционального блока, задающего режимы измерений и кюветы, содержащей собственно сенсор - кремниевую пластину с рН-чувствительным диэлектриком (см.рис.1 и рис.2).

Вольт-амперные характеристики сенсора можно интерпретировать на основе аналогии между СПС и структурой "металл-дгюлектрик-палупроводник".

Для СПС, рассматриваемого в настоящей работе и изготовленного из кремния п-типа, положительный потенциал смещения 11см, приложенный К электроду сравнения, концентрирует электроны у границы "полупроводник-диэлектрик" и обогащает основными носителями эту зону. В таком состоянии система аналогична конденсатору, емкость Сд которого (рис.1) зависит только от толщины диэлектрического слоя, площади и свойств диэлектрика. В случае отрицательного потенциала исм электроны смещаются в противоположном

Со

Рис.1. Упрощенная эквивалентная электрическая цепь СПС.

исм - потенциал смешения; - сопротивление электролита; Цш,, - потенциал на границе "элек-тролиг-дкэлекгрюс"; Сл - емкость диэлектрика; С0 - емкость обедненного слоя полупроводника; Д - диод; 1ф - внутренний генератор фототока; РУ - регистрирующий усилитель; I - фототек, протекающий во-внешней цепи.

Рис.2. Измерительная ячейка, содержащая СПС.

1 - свегоадресуемый сенсор;

2 - уплотняющая прокладка;

3 - элехтролит; 4 - электрод сравнения; 5- корпус измерительной ячейки (разъемные части А и Б); б - светсдиод;

7 - оправа светодиода.

часть Б

направлении, обедняя границу "диэлектрик-полупроводник". Обедненный слой можно представить как диэлектрик, формирующий другой конденсатор С„, последовательно включенный с Сд. При увеличении отрицательного значения исм величина О, будет, снижаться до тех пор, пока не будет достигнуто состояние максимального обеднения.

Облучение поверхности кремния ИК-светом вызывает генерацию элеюрон-дырочных пар, которые могут диффундировать в объем полупроводника, рекомбинировать и разделяться электрическим полем. Таким образом, включение освещения приводит к возникновению импульса тока, связанного с дополнительной зарядкой емкости С0. Величина тока со временем уменьшается до нуля по мере того как ширина зоны обеднения достигает нового стационарного значения. Выключение света приводит к появлению импульса тока противоположной полярности и восстановлению исходного состояния зоны обеднения. В цепи, содержащей СПС, генерируется переменный ток, который может быть зарегистрирован внешним измерительным усилителем. Измеряемым параметром является амплитуда тока I, протекающего во внешней цепи (рис.1). В режиме максимального обеднения в широком диапазоне частот модуляции светового потока (до 10 кГц) величина I пропорциональна 1ф (1ф- фототок. в полупроводнике, обусловленный образованием электрон-дырочных пар) и определяется величинами Ся и С0 (рис.1):

I = 1фСд/(Сд + С„) (1)

В режиме насыщения, несмотря на генерацию электрон-дырочных пар и разделение зарядов, ток во внешней цепи мал, поскольку в этом случае величина шунтирующей емкости О, велика, а сопротивление для рекомбинации зарядов (представлено диодом на рис.1) мало.

Описанный выше характер процессов в СПС приводит к тому, что типичные ВАХ кремниевых пластин п-типа имеют вид, показанный на рис.3.

Кроме того, ЭДС, соответствующая разности химичеж« потенциалов, возникающей на границе "дизлектрик-элсктрэдит" (и,о,м), цюиочгна последова-

ЬсЮ5,Л к Рис.3.

Вольт-амперные

характеристики, полученные в 0.1М

3

растворах нитратного буфера для

2 значений рН: 1 - 4,1; 2 - 5,1; 3 -6,1; 4 - 7,5. Обозначения: I -

4

фототок, А ; иси - потенциал

'см

-ис». мВ 600 4.00 200

О смещения, мВ.

тсльно с иси. Это означает, что при наличии у диэлектрика химической чувствительности к определенному типу ионов, возникающий на границе электрохимический потенциал алгебраически суммируется с потенциалом смещешм, вызывая параллельный сдвиг В АХ вдоль оси потенциалов в сторону

положительных или отрицательных значений в зависимости от полярности ишм. На рис.3 показан последовательный сдвиг ВАХ (кривые 1-4), записанных в растворах цитратного буфера со значениями рН, изменяющимися от 4,1 до 7,5. Сдвиг ВАХ обусловлен различными величинами Цщм, соответствующими различным значениям рН измеряемых растворов.

Была исследована рН-чувствительносгь сенсоров в диапазоне рН от 4.1 до 5.0. Растворы с различными значениями рН для диапазона 4.1-7.5 были приготовлены на основе 0.1М цитратного буфера, а для диапазона рН 7.5-9.0 -на основе 0.1М Трис-НС1 буфера. Чувствительность сенсора к рН. (арН)

ч

оценивали ках отношение4 изменения потенциала смешения к изменению рН раствора;

арН = лисм5ож/ДрН (2)

где изменение ис.ч50% определяли для точки ВАХ соответствующей 50% фототока насыщения. Зависимость исм5оя рН буферных растворов приведена на рис.4.

и,

смзоа,

700-.

мВ

500-

300

0

• а ■ 4 ■ б а

Рис.4. Зависимость исм50Ж от величины рН (рН-

чувствительносгь) : для 0.1 М цитратных буферных растворов (1) и 0.1 М Трис-НС1 буферных растворов (2).

РН

Видно, что в диапазоне рН 4.1-7.5 для растворов нитратного буфера рН-чувсгвительность практически постоянна и составляет 45 мВ на единицу изменения рН. Для диапазона рН 7.5-9.0 (растворы на основе Трис-НС1 буфера) рН-чувствитеяьность также постоянна и равна 55 мВ/рН. Следует отметить при этом, что переход от нитратного Трис-НС1 буферу нарушает непрерывность зависимости иСк50Я> огг рН и приводит к сдвигу калибровочной кривой в область более высоких значений исМ5о<5> что мозкег бьгть вызвано, на наш взгляд, химической чувствительностью Та^ к аниону используемого буфера.

Нами была также исследована зависимость показаний сенсора от состава и ионной силы среды. Этот вопрос актуален в связи с тем, что в рецепторном элементе биосенсора в результате биохимических р": ашй м введешгя проб

может происходить изменение не только рН, но также ионной силы и состава среды.

Для оценки указанной выше зависимости использовали растворы солей (ЫаС1, КС1, ИЬЦО) с возрастающей от 1 до 500 мМ концентрацией ионов на основе 1 мМ Тркс-НС1 буферного (рН 8,0) раствора. Значение рН каждого из растворов измеряли параллельно как с помощью СПС, так и иономера И-120. Результаты приведены на рис.5.

Видно, что значения рН, полученные с помощью СПС, уменьшаются при увеличении ионной силы и, кроме того, зависят от типа катиона - снижаются в ряду К+, Ка+, Сравнивая эти данные с зависимостями, полученными с

помощью иономера на стеклянном электроде, можно отметить, что снижение величины рН действительно имело место для растворов №С1 и Т^НцО, т.е. с помощью СПС произведено определение величины рН, при этом влияния катионов и ИЩ4" на сигнал СПС не наблюдалось. Однако, хотя для

хлористого калия значения рН не изменялись с увеличением ионной силы раствора (измерения с помощью И-120), данные, полученные на СПС, показывали снихсенпе значений рН. Это объясняется тем, что селективность сенсора к протонам не абсолютна.

Измерения временных характеристик сенсора показали, что в режиме регистрации зависимости фототока от времени при заданном потенциале смещения, отклик сенсора на изменение концентрации протонов в среде при первоначально заданном значении рН в ячейке и постоянном перемешивании составляет 2-3 секунды. Конструкция данного прибора позволяет проводить

ч

измерения в условиях этого режима (изменение значений рН во времени) для детекции реакций в различных временных диапазонах.

Кроме того, СПС обладает высокой стабильностью при измерении потенциала - дрейф поверхностного потенциала при неизменных внешних условиях не превышает 0,4 мВ/час, что соответствует около 0,006 рН/час.

рН

8-

7-

1 '6-

"2*

1Р 5-

4-

1 з-

V

г 2'

0.2

0.4

Л)

©

Рис.5. Зависимости значений рН от ионной силы (ц) растворов одновалентных катионов Ка+, К+, МН,(+, полученные с помощью: а) СПС; б) иономера на стеклянном электроде; 1 и 1' - К+; 2 и 2' - Иа^З и 3' - Ш4+.

В шестой главе представлены результаты исследования кинетических

зависимостей ДрН-генерирующих ферментативных реакций. В гомогенных условиях нами были измерены начальные скорости реакций окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы, гидролиза этилового эфира ЭД-ацетил-Ь-тирозина (АТЭЭ) в присутствии а-химотрипсина и ацетилхолина йодистого (АХ1) в присутствии бутирилхолинэсггеразы (БуХЭ). У. всех исследованных нативных ферментов зависимости начальных скоростей реакций У0 от концентрации субстрата [Э] соответствовали уравнению Михаэлиса-Ментен (см.рис.б).

V«,. мМ/мип

12т

Рис.6. Зависимости начальных скоростей реакций У0 от концентрации субстратов |5], измеренные с помощью СПС: I -окисление глюкозы, катализируемое глюкозооксидазой (рН 6,9; 25° С); 2 -гидролиз АТЭЭ, катализируемый а-химотрипсином (рН 7,5; 25°С); 3 -

..........гидролиз АХ1, катализируемый

~3§ § 12 15

[$] , тМ бутирилхолинэсгеразой (р'Н 7,8; 25°С).

Кинетические параметры Кт и У0 определяли в обратных координатах Лайнуивера-Берка, что показано на рис.7.

Полученные значения констант Михаэлиса хорошо согласуются с литературными данными. В таблице 1 представлены для сравнения значения констант, определенных с помощью СПС и имеющиеся литературные данные, полученные с использованием других методов.

1/Уо

2.5

2.0-

/з

1.5

/ 1

1.0 -

0.5,/- 1 " /^Т"'

Рис.7. Результаты, приведенные на рис.6, в обратных координатах Лайнуивера-Берка для:

1 - глнжозооксидазы;

2 - а-химотрипсина;

3 - бутирилхолинэстеразы.

1/ И"

Минимальное количество субстрата, определяемое с помощью СПС, для ГОД и БуХЭ составило Ю-4 М, а для а-химотрипсина - Ю"5 "М. Каждое значение начальной скорости реакции при определении субстрата определялось не менее трех раз, среднеквааратическая ошибка в данном случае составляла 10-12%.

Таблица 1

Исследованные ферменты Кт, полученные на СПС (мМ) ' Кт, по литературным дашшм (мМ)

Глюкозооксидаза 1.00 ± 0.05 0.96 [1]

а-химотрипсин 0.55 + 0.05 0.5 [2]

Бугирилхолинэстераза 1.00 + 0.05 1.0 |3]

|1] - Eriksson К-Е., Petteison В., Vole J., Musilek V., Appl. Microbiol, and

Biotechnol., 1986. 23. N 3-4, p.257-262. \2] - Jnagami Т., Sturtewant J. M., J. Biol. Chem. I960. 235. p.1019-1025. [3] -Р.И.Волкова, Е.Н.Дмитриева, "Биохимия", 1976, 41, N 2, c.264-275.

Полученные нами зависимости активностей нативных ферментов от рН также согласуются с уже известными данными. Результаты представлены на рис.10 и 11 в сравнении с данными, полученными для иммобилизованных ферментов.

В седьмой главе представлены результаты исследования кинетических зависимостей иммобилизованных в полимерных матрицах фермектез на поверхности СПС.

Создание современных типов высокочувствительных биссенсоров -требует не только новых преобразователей, но и нозьк материалов, из которых формируется матрица, содержащая биологически активные компоненты

биосенсора. В качестве такого материала нами был выбран полимер -полиэтиленимин, последовательно модифицированный цетил- и этнпбромидом, который имеет рад преимуществ при использовании его в качестве ферментсодержащей матрицы на поверхности сенсора: Данный полимер в смеси органических растворителей, содержащей определенное количество воды или буферного раствора, способен образовывать обращенные полимерные мицеллы. Молекула фермента, находясь во внутренней полости гидратированных обращенных ' мицелл, защищена от денатурирующего воздействия органического растворителя оболочкой из молекул полимера. Кроме того, как было уже показано в ряде работ, ферменты в данных системах сохраняют высокую каталитическую активность. Следует отметить, что гидрофобная ферментсодержащая матрица может служить также для концентрирования органических субстратов при их слабой растворимости в водных растворах или низкой первоначальной концентрации. Тем' самым' можно повысить чувствительность при детектировании минимальных количеств определяемого соединения. Систему обращенных мицелл, с включенными в них ферментами* и полимерные матрицы, сформированные из таких растворов, можно использовать дня проведения реакций как в водных средах, так и в органических растворителях. Помимо этого, совместное использование СПС и полимерной ферментсодержащей матрицы из CE-PEI позволяет регистрировать кинетические параметры ферментативных реакций, не детектируемых амперометрически.

В данной работе впервые была применена иммобилизация ферментов в полимерной матрице CE-PEI на поверхности СПС, поэтому необходимо было ■ учесть возможные изменения активности ферментов в результате такой

процедуры. Для сравнения нами был выбран наиболее известный и часто используемый метод иммобилизации ферментов в матрице бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием глутарового альдегида.

Результаты измерений кинетических параметров иммобилизованной глюкозооксидазы в БСА в сравнении с характеристиками нативного фермента и иммобилизованного в модифицированном полиэтиленимине представлены на рис.8.

Сравнение удельных каталитических активностей нативной и иммобилизованной в БСА глюкозооксидазы показывает, что активность иммобилизованного фермента уменьшается по сравнению с нативным приблизительно в 3 раза (см.рис.8). Однако, стабильность фермента при хранении такой мембраны на поверхности датчика остается довольно высокой -Уо, мМ/мин

через 2 недели сохранялось 90% от первоначальной активности иммобилизованного фермента.

Из полученных результатов стало очевидно, что ■ данный. способ формирования ферментсодерэкащей матрицы в качестве составляющей биосенсора не является оптимальным и, кроме того, не применим ¡с

15п

Рис.8. Зависимости начальных скоростей реакций V0 . окисления глюкозы в присутствии ГОД от начальной концентрации глюкозы [SJ (рН 7.0, 25-С) : 1 - нативный фермент; 2 - иммобилизованный в матрице CE-PEI фермент; 3 -иммобилизованный в матрице БСА с плутаровым альдегидом.

1

а-химотрипсину из-за разрушения белковой матрицы в' результате протеолиза БСА.

В ходе экспериментов нами было установлено, что мембрана, образуемая из раствора полимерных обращенных мицелл, содержащих буферный раствор фермента, плохо удерживает фермент. Поэтому при измерениях происходит частичное вымывание фермента в анализируемую среду. Для устранения этого, полимерная мембрана, нанесенная на поверхность датчика, дополнительно покрывалась тонким защитным слоем триацетатцеллюлозы (ТАЦ), который предотвращал вымывание фермента в анализируемый раствор, но не препятствовал прохождению молекул субстрата к иммобилизованному ферменту. В таблице 2 представлены экспериментальные данные полученные при регистрации амплитуды фототока в зависимости от потенциала смещения для сенсора с иммобилизованной ГОД в матрице CE-PEI с нанесенными поверх нее пленками - триацетйгцеяяюлозьг" из ее растворов различной концентрации в хлороформе. Как видно из таблицы, наиболее оптимальным раствором, из которого формировалась триацетатцеялюлозная пленка, оказался 0.1% раствор ТАЦ в хлороформе. Формирование такой пленки поверх полимерной ферментсодержащей матрицы из CE-PEI предотвращало вымывание фермента, с одной стороны, и, с другой стороны, не влияло на сигнал СПС при регистрации кинетических параметров ферментов. При более высоких концентрациях ТАЦ в растворе хлороформа наблюдалось искажение сигнала СПС, при более низких концентрациях ТАЦ происходило вымывание фермента. Во всех случаях объем • раствора ТАЦ в хлороформе, из которого формировался поверхностный слой, был постоянным и составлял 8 цл

Таблица 2.

%-ное содержание ТАЦ в хлороформе Фототок сенсора при изменении толщины пленки, А*10-5 1п/1о'

0,0 (без ТАЦ) 4,0 -

0,1 4,0 1,0

0,25 3,2 0,8

0,5 2,6 0,65

1,0 1,0 0,25

2,5 0,1 0,025

* - 10 -фототок сенсора без пленки ТАЦ; 1п - фототок сенсора с пленкой ТАЦ. •

Кинетические характеристики иммобилизованных ферментов в мембране модифицированного полиэтилекимика представлены на рис. 8 для глюкозобкеидазы и на рис. 9 - для а-хкмотрипсина.

Рис.9. Зависимости начальных скоростей реакции (У0) гидролиза АТЭЭ в присутствии а-химотрипсина от концентрации субстрата [8] (АТЭЭ): I - нативный фермент; 2 - фермент, иммобилизованный в матрице СЕРЕ! (рН 7,5; 25°С).

Полученные результаты позволяют определить Кте£Г и Ут иммобилизованных ферментов, а также их соотношение \а/Ктеа, характеризующее эффективность ферментативного катализа. Значения констант

для иммобилизованной глюкозооксидазы и а-химотрипсина в сравнении с константами этих же ферментов в водном растворе (в нативном состоянии) представлены в таблице 3.

Как видно из полученных данных, в результате включения ферментов в полимерную матрицу полиэтиленимина, произошло увеличение констант Михаэлиса, что обычно и наблюдается у иммобилизованных ферментов. Отношение \'т/Кт для натавных и иммобилизованных ферментов в 4,3 раза больше для глюкозооксидазы и в 5,-6 раз - для а-химсггрипсина.

Таблица 3

Исследованные ферменты Кинетические параметры ферментов в водных растворах Кинетические параметры иммобилизованных ферментов

Глюкозоокси-даза Km. мМ" V пз* мМ/мин Va/Km К е(г мМ vm, мМ/мин

1,0 10,0 10,0 в БСА и ГА

8,0 2,8 0,35

в GE-PEI

6,0 14,0 2,33

а-химотрипсин 0,55 11,0 20,0 3,1 11,0 3,55

Важным параметром, характеризующим фермент в анализируемой системе является оперативная стабильность, т.е. количество рабочих циклов-иммобилизованного фермента с сохранением его первоначальной активности. Для шохозооксидазы эта величина равна 25 и 20 - для а-химотрипсина. Минимальные концентрации определяемых субстратов с помощью иммобилизованных ферментов составили 0,5 мМ для глюкозы и 0,25 мМ для АТЭЭ, что превышает чувствительность ранее созданных сенсоров подобного

типа. Активность мембран с иммобилизованными ферментами при хранении (температура комнатная) через 2 недели составила 80% для глюкозооксидазы и 70% для а-химотрипсина от их первоначальных значений. Полученные данные свидетельствуют о том, что при таком способе иммобилизации сохраняется достаточно высокая активность фермента.

Измерение рН-зависимостей для нативных и иммобилизованных ферментов показало, что при встраивании фермента в полимерную матрицу модифицированного полиэтиленимина происходило некоторое расширение рН-профилей активностей ферментов (см. рис.10 и 11).

Уо, иИД

15т 12

6-

3-

Уо, мМ/юш 12т

^рн

96

1-Г

рн

Рис.10. Зависимость V,, от рК для Рис.11. Зависимость \'0 от рН для

реакции окисления глюкозы в реакции гидролиза АТЭЭ' в

присутствии ГОД (¡5о]=10 мМ): присутствии а-химотрипсина

1 - нативкый фермент, (|50]=5 мМ):

2 - иммобилизованный фермент в СЕ- 1 - нативный фермент;

РЕ1; 2 - иммобилизованный фермент в

3 - иммобилизованный фермент в БСА СЕ-РЕ1.

3

Это может быть объяснено сохранением рН микросреды внутри полимерной мембраны за счет ее буферных свойств на оптимальном уровне и достаточно хорошей изоляцией от • внешней анализируемой среды с отличающимися значениями рН. Приведенные факты указывают на перспективность использования таких амфифильных полимеров, как модифицированный полиэтиленимин, при создании стабильных высокочувствительных сенсоров.

Восьмая глава посвящена проблеме детекции органических соединений в неводных средах с помощью СПС.

В качестве органической среды нами была выбрана, смесь толуола и н-бутанола в соотношении 2:1. Для создания проводимости в данной среде использовались ионы перхлората лития (иСЮ«) - соли, диссоциирующей в органичесхой смеси на ионы и СЮ4". Исследование вольт-амперных характеристик растворов перхлората лития в вышеуказанной органической смеси показало следующее: величина регистрируемого фототока в зависимости от потенциала смещения возрастает с ростом концентрации ионов перхлората лития в органической смеси и достигает своего максимального значения 4*10"5 А при 50 мМ концентрации раствора УСЮ4. При более низких концентрациях амплитуда фототека составляла 1-1,5*10"5 А и линейный участок ВАХ практически отсутствовал, из-за чего регистрация фототока в зависимости от времени при постоянном значении потенциала смещения была невозможной.

^ Для оценки чувствительности сенсора к изменениям концентрации протонов в смеси толуола и н-бутанола к исследуемой смеси добавляли водные буферные растворы на основе Трис-НС1 (6.25 объемных процента) с различными значениями рН. Отклик сенсора на введение буферных растворов

регистрировался в режиме записи значений фототока в зависимости от времени который составлял 40-50 мВ/рН.

Впервые получены экспериментальные данные о кинетических параметрах реакции гидролиза АТЭЭ а-химотрипсином в смеси органических растворителей (толуол/буганол). В этих экспериментах был использован а-химотрипсин в иммобилизованной форме - в виде раствора обращенных мицелл модифицированного полиэтиленимина, содержащих буферный раствор фермента. Концентрация АТЭЭ составляла 5' мМ, начальная скорость реакции 10 мМ/мин, что практически совпадает с начальной скоростью реакции для иммобилизованного на поверхности сенсора фермента в водном растворе. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования СПС для анализа органических соединений в неводных средах. Таким образом, впервые показана принципиальная возможность использования СПС для анализа

неводных растворов биологически важных соединений. В целом, использование

/

ферментсодсржаших обращенных полимерных мицелл, сохраняющих свою структуру в неводных растворах, можно считать одним из наиболее перспективных подходов к созданию новых высокочувствительных и универсальных биосенсоров.

В заключении даны оснсзные выводы по результатам диссертационной работы.

1. Разработан новый автономный прибор на основе светоадресуемого потенциометрического сенсора с рН-чувствительным диэлектриком из Та2С>5. Исследованы его физико-химические характеристики. Использование диэлектрика Таг05 качестве рН-чувствягельного элемента сенсора имеет

преимущества по сравнению с диэлектриками такого же типа ^¡з^, /М2О3) -высокую рИ-чувствительность и селективность к протонам, что позволяет регистрировать рН растворов и локальные изменения рН, происходящие в зонах иммобилизованных биокатализаторов на поверхности сенсора в результате ферментативных реакций.

2. Разработаны и оптимизированы методики регистрации ДрН-генерирующ!« ферментативных реакций с помощью СПС для ферментов различных классов (оксиредуктаз, гидролаз, эстераз). Оптимизированы методики сопряжения СПС с иммобилизованными ферментами с целью разработки биосенсоров. Установлено, что при иммобилизации ферментов в матрице амфифильного ' полимера - модифицированного полиэтиленимина сохраняется высокая

каталитическая активность и стабильность иммобилизованных ферментов. Показана возможность использования такого типа детектора для создания биосенсоров на основе ферментов гидролитического действия, что расширяет круг анализируемых соединений по сравнению с использованием амперометрическсй регистрацией сигнала. Проведено сравнение различных методов иммобилизации ферментов на поверхности СПС.

3. Впервые показана принципиальная возможность регистрации кинетики биохимических реакций протекающих в неводных средах с образованием протонов с помощью СПС и создания на его основе нового биосенсора для анализа органических соединений в водных и оргашпеских средах.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах: 1. А.Н.Решетилов, ЕГ.Крндрать'ева, - А-И.Ярополов, чл.-корр.РАН Г.Р.Иваницкий. "Регистрация ДрН-генерирующих биохимических реакций

светоадресуемым сенсором с диэлектриком из Та20< Доклады РАН, т.342, N5, с.1-3, 1995 г.

2. Е.Г.Кондратьева, А.Н.Решетилов, Л.В.Яковенко, В-А-Твердислоз, А.И.Яропсшов. "Характеристики и применение электрохимического светоадресуемого сенсора на основе кремния с диэлектриком из ТазС^ для регистрации биохимических реакций", Электрохимия, 1995 г. (принято в печать в 1994 г.)

3. Е.Г.Кондратьева, ВА-Твердислов, Л.В.Якойенко, А.И.Ярополов. "Биосенсоры на основе рН-чувствигельного полупроводникового светоадресуемого детектора с иммобилизованными ферментами."- Препринт Физического факультета МГУ, 1995, N 40.

Список сокращении -

СПС - светоадресуемый потснциомстрический сенсор

ИСПТ - ион-селективный полевой транзистор

ВАХ - вольт-амперная характеристика

ИК-свет - инфракрасный свет

БСА - бычий сывороточный альбумин

CE-PEI - полиэтиленимин, последовательно модифицированный цетил- и

этилбромидом ГОД - глюкозооксидаза АТЭЭ - Ы-ацетил-Ь-тирозин этиловый эфир БуХЭ - бутирилхолинзстераза AXI - ацетилхолин йодистый