α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция

Чеченова, Мария Барасбиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция"

На правах рукописи

ЧЕЧЕНОВА Мария Барасбиевна

(Х-СУБЪЕДИНИЦА КОМПЛЕКСА СОР I ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha:

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РОЛЬ В ГОМЕОСТАЗЕ КАЛЬЦИЯ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор М.Д. Тер-Аванесян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Калебина Т. С

кандидат биологических наук Эльдаров М.А.

Ведущая организация: ФГУП ГосНИИ Генетика

Защита состоится 21 апреля 2004 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Автореферат разослан «.....» марта 2004 года.

Ученый секретарь диссертациооного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, задачи работы. Изучение процессов секреции является одной из основных областей современной биологии клетки. Помимо фундаментального интереса, изучение механизмов секреции белков имеет и прикладное значение для медицины и биотехнологии. Известно, что ряд заболеваний человека, таких как, например, инсулин-зависимый сахарный диабет, недостаточность -антитрипсина и некоторые другие, связаны с нарушениями секреции белков и пептидов. Изучение молекулярных основ дефектов процесса секреции позволяет находить более эффективные способы лечения этих заболеваний. Кроме того, получение на основе клеток дрожжей продуцентов, способных секретировать рекомбинантные белки, имеющие медицинское значение, является приоритетным направлением биотехнологии.

Поскольку клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеют характерную для всех эукариот компартментализованную внутриклеточную структуру, и вместе с тем, весьма удобны для молекулярно-генетических манипуляций, они являются широко распространённой модельной системой для изучения происходящих в клетке процессов, и в частности, процесса секреции. В связи с этим, неудивительно, что генетические исследования процесса секреции, в основном, проводились при использовании именно этих дрожжей. Тем не менее, для выявления общих закономерностей процесса секреции необходим сравнительный анализ данных, полученных при изучении разных организмов. Важность такого анализа очевидна, поскольку использование одной модельной системы может привести к выявлению особенностей, специфичных лишь для этого организма. В настоящее время, в связи с появлением работ по секвенированию геномов и функциональному анализу генов у многих видов дрожжей, имеется возможность изучения процессов секреции у альтернативных модельных организмов. Благодаря интенсивной разработке генетических систем метилотрофных дрожжей ШтвшЬ polymorpha, которые проводились, в основном, в биотехнологических целях, этот организм стал достаточно удобным и для фундаментальных исследований.

В нашей работе исследован мутант ^1-27, из коллекции мутантов Я. polymorpha, с увеличенной способностью к секреции гетерологичного белка, урокиназы человека (иРА), который наряду со сверхсекреторным фенотипом, имел сниженную скорость роста на полной среде и был чувствителен к пониженному содержанию Са2+ в среде. Ионы кальция необходимы для многих процессов в клетке, в том числе и для процесса секреции, например, при формировании правильной конформации молекул белков в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), их модификации в аппарате Гольджи, а также для слияния мембран везикул. Изучение причин возникновения Са2+-зависимого фенотипа мутанта кй-27 могло бы выявить механизмы взаимосвязи между гомеостазом Са2+ в секреторных путях и процессом секреции. В задачи нашей работы входило клонирование гена Н. polymorpha,

ИИШ"Ределеиие

комплементирующего проявление феноти

нуклеотидной последовательности клс нйроцэдр^ф^^на | и анализ

СПетсрбу

о»

аминокислотной последовательности соответствующего белка показали, что продукт этого гена гомологичен белку Retlp cerevisiae, который представляет собой а-субъединицу комплекса СОР I . Этот белковый комплекс принимает непосредственное участие в формировании одного из типов транспортных везикул клеток эукариот - СОР I везикул.

Изучение транспорта белков и липидов между компартментами секреторных путей (ЭР и аппаратом Гольджи), а также транспорта из аппарата Гольджи к плазматической мембране и вакуоли/лизосоме, является одним из приоритетных направлений в исследовании процесса секреции. Такой транспорт осуществляется с помощью замкнутых мембранных структур - везикул. Везикулярный транспорт в клетках эукариот был открыт в 1976 году и на сегодняшний день охарактеризовано несколько типов везикул. Везикулы СОР I транспортируют молекулы белков и липидов из аппарата Гольджи в ЭР, что позволяет резидентным белкам ЭР возвращаться к месту своей нормальной локализации. Комплекс СОР I состоит из так называемого коатомера -цитозольного белкового комплекса из 7 субъединиц

СОР, 5-СОР, Е-СОР, и ¡¡-СОР), и малой ГТФазы ARF. Описанные ранее мутации сегеушяе в генах, кодирующих субъединицы комплекса СОР I , не приводили к возникновению Саг+-зависимого и сверхсекреторного фенотипа, характерного для мутанта ш1-27Н. ро1утогрка, и до сих пор в литературе не было указаний на взаимосвязь СОР I -зависимого транспорта и гомеостаза кальция в клетке. В связи с этим, основные задачи нашей работы состояли в: идентификации нуклеотидной замены в мутантной аллели гей-27; изучении молекулярных основ возникновения плейотропных эффектов мутации гей-27; идентификации генов, увеличение копийности которых супрессирует Са2+-зависимый фенотип мутанта гвй-27.

Научная новизна работы. В процессе работы впервые клонирован ген Н. ра1утагрка, кодирующий а-субъединицу комплекса СОР I, и показано, что С-концевая область этого белка, в отличие от гомологичного белка 5. cerevisiae, не является жизненно-важной. Вместе с тем, нарушение этой области приводит к возникновению характерного фенотипа - чувствительности к пониженному содержанию Са2+ в среде и сверхсекреции гетерологичного белка иРА. Впервые выявлена функциональная взаимосвязь между белком и Фазой

аппарата Гольджи дрожжей Ршг1р. Белок Ршг1р является единственной известной на сегодняшний день помпой, осуществляющей транспорт из цитозоля в секреторные компартменты дрожжей. В нашей работе было показано, что дефект СОР I -зависимого везикулярного транспорта приводит к нарушению распределения белка Pmrlp в клетке и уменьшению его количества. Кроме того, впервые обнаружен эффект комбинативной летальности при совмещении в одном штамме двух нелетальных мутаций - гей-27 и Дртг1. Эти данные указывают на то, что клетки с дефектом СОР I -зависимого транспорта не способны выживать в условиях снижения количества Са2+ в секреторных путях. Полученные данные позволили высказать гипотезу о роли СОР I -зависимого везикулярного транспорта в доставке Са2+ в ЭР. В процессе работы был также клонирован ген Н. ро1утогрка 5Е51, который в мультикопийном состоянии

супрессирует Са2+ -зависимый фенотип мутанта с дефектом а-СОР. Показано, что делеция гена SES1 у H. polymorpha приводит к нарушению формирования нормальных вакуолей.

Практическая ценность работы. Дрожжи Н. polymorpha широко используются как организм-хозяин для продукции рекомбинантных белков в промышленных масштабах, начиная от фармакологически важных белков до ферментов, использующихся в промышленности. Изучение механизмов, лежащих в основе увеличения секреции того или иного гетерологичного белка клетками дрожжей, позволяет находить способы более эффективной и качественной продукции белков для каждой конкретной цели.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: Итоговая конференция по результатам Российского конкурса на лучшую научную работу студентов 1998 года по разделу "Медицинские науки" (Москва, Россия, 1999); 21 - International specialized symposium on yeasts: "Biochemistry, genetics, biotechnology and ecology of non-conventional yeasts" (Lviv, Ukraine, 21-25 August, 2001); III съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 26 июня - 1 июля 2002 года), 2nd Hansenula polymorpha worldwide network conference (Tenerife, Canary Islands, 26-29 September, 2002).

Публикации. По материалам работы опубликованы 2 статьи и 4 тезисных сообщения.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 140 страницах и включает 26 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 207 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе применяли стандартные методы генетики дрожжей (Sherman et al., 1986) и молекулярного клонирования (Sambrook et al., 1989); биохимические методы, такие как белковый гель-электрофорез и иммуноблоттинг (Laemmli, 1970; Towbin et al., 1979), окрашивание белков в геле солями серебра, выделение экспрессированных белков из клеток бактерий, методы для изучения подвижности нативных белков, такие как зимография урокиназы (Astrup and Muellerts, 1952) и инвертазы (Ballou et al., 1990); методы клеточной биологии - микроскопия клеток дрожжей, иммунофлуоресцентное окрашивание клеток дрожжей (Pringle et al., 1991), прижизненное окрашивание мембран вакуолей дрожжей (Vida and Emr, 1995). В процессе работы была получена антисыворотка к белку Pmrlp Я. polymorpha.

В работе использовали штаммы дрожжей Н. polymorpha, происходящие от штаммов CBS4732 (АТСС 34438) и DL-1 (АТСС 26012). Использованные штаммы были получены в ходе работы или любезно предоставлены Агафоновым М.О. (лаборатория молекулярной генетики ИЭК РКНПК МЗРФ, Москва) и Плотниковой Т.А (кафедра молекулярной биологии

МГУ, Москва). В работе также использовали штамм S. cerevisiae RSY372 (МАТа итЗ-52 Ieu2-3,112 seel8-1), любезно предоставленный R. Schekman (University of California, Berkeley). Гены и белки дрожжей Я. polymorpha и S. cerevisiae помечены в работе Нр и Sc, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование и секвенирование гена RET1Н. polymorpha.

Ген, комплементирующий мутацию ret1-27, был клонирован следующим образом. Штамм 2dMA63 с данной мутацией трансформировали мультикопийной библиотекой геномных последовательностей штамма Я. polymorpha CBS4732, сконструированной на основе плазмиды AMIpSLl (Agaphonov et al., 2001). Трансформанты отбирали на синтетической среде без добавления солей кальция, содержащей 25mM EGTA. При этом предполагали, что клетки мутантного штамма, получившие плазмиду с соответствующим геном дикого типа, способны вырастать на среде с пониженным содержанием кальция. Проверка трансформантов, не чувствительных к EGTA, выявила клон, потерявший способность сверхсекретировать иРА. ДНК, выделенной из этого клона, трансформировали клетки E.coli. Полученная таким образом плазмида, названная p27OPU8, содержала вставку хромосомной ДНК размером ~6kb. Эта плазмида комплементировала все проявления мутации retl-27.

На основе плазмиды p27OPU8 был получен ряд делеционных вариантов вышеуказанной вставки, анализ которых показал, что для комплементации мутантного фенотипа необходим фрагмент ВатШ-Narl размером ~4.1kb. Секвенирование нуклеотидной последовательности этого фрагмента выявило наличие единственной открытой рамки считывания размером 3666 пар нуклеотидов. м-РНК клонированного гена кодирует белок, состоящий из 1206 аминокислотных остатков, который гомологичен a-субъединице комплекса СОР I из разных организмов. Сходство аминокислотной последовательности полученного белка с гомологичными последовательностями из других организмов варьирует от 61% до 74%. Наибольшая степень гомологии была обнаружена при сравнении с а-СОР S. cerevisiae, аминокислотная последовательность которого на 74% сходна и на 58% идентична последовательности продукта клонированного гена Я. polymorpha. Поскольку а-СОР S. cerevisiae кодирует ген RET1, мы использовали такое же обозначение для клонированного нами гена Я. polymorpha.

2. Делеция 3 -концевой части кодирующей области гена HpRETl не летальна для клеток дрожжей.

Фрагмент геномной ДНК Я. polymorpha с мутацией ret1-27, был изолирован следующим образом. Мутантный штамм 2dMA63 трансформировали плазмидой р27КМ, несущей ген HpRETl, лишённый 5'-концевой области. Перед трансформацией плазмиду разрезали по одному из

сайтов рестрикции, находящихся внутри кодирующей области гена HpRETl. При этом исходили из предположения, что если мутация расположена после сайта разрезания, гомологичная рекомбинация мутантного гена с плазмидной копией должна привести к образованию полноразмерной копии гена HpRETl дикого типа и нетранслируемой мутантной копии без 5'-концевой области. Соответствующий штамм должен проявлять фенотип дикого типа: расти на среде с низким содержанием кальция и не сверхсекретировать иРА. Действительно, такие клоны были получены при трансформации плазмидой, разрезанной по сайту Eco47lШ. Хромосомную ДНК, выделенную из одного из них, разрезали по сайту ВатШ. После лигирования и трансформации этой ДНК в клетки E.coli, была получена плазмида рАМ409, содержащая ген с мутацией гей-27 без 5'-концевой области (Рис. 2).

Чтобы проверить, действительно ли плазмида рАМ409 содержит фрагмент мутантного гена, её разрезали по сайту Есо4Ш, и линеаризованной ДНК трансформировали штамм дикого типа DLU происходящий от штамма DL-1. Штаммы Н. polymorhpa DL-1 и CBS4732 отнесены к одному виду дрожжей, однако, по генетическим и физиологическим характеристикам их, скорее, можно выделить в два близкородственных вида. Штамм DL-1 отличается от штамма CBS4732 более высокой частотой гомологичной рекомбинации, поэтому в некоторых экспериментах мы использовали штаммы, происходящие от DL-1, для повышения вероятности получения трансформантов, содержащих единичные копии генов, интегрированных в строго определённый локус. В результате гомологичной рекомбинации в геноме штамма DLU должна была появиться полноразмерная мутантная копия гена HpRETl и нетранслируемая копия дикого типа, лишённая 5'-концевой области. Такой штамм должен проявлять мутантный фенотип. В результате трансформации были получены медленно растущие клоны, сверхсекретирующие иРА и чувствительные к 25 mM EGTA в среде. Таким образом, мы показали, что плазмида рАМ409 содержит фрагмент ДНК с мутацией, отвечающей за фенотип мутанта кй-27, и что эта мутация вызывает сходные проявления в штаммах Н. polymorpha разного происхождения.

Секвенирование мутантного гена выявило наличие нуклеотидной замены, которая приводила к появлению нонсенс кодона TGA вместо кодона TGG (Тгр) в 818 положении аминокислотной последовательности соответствующего белка. Таким образом, охарактеризованная нами мутантная аллель гена HpRETl, продукт трансляции которой не содержит последних 389 аминокислотных остатков, способна поддерживать жизнь клеток Н. polymorpha. Чтобы подтвердить, что мутантный фенотип возникает в результате удаления С-концевой области белка HpRetlp, был сконструирован штамм DLU-СД с делецией З'-концевой области гена НрКЕТ1. Для этого штамм дикого типа DLU трансформировали плазмидой рСОР^Е, разрезанной по сайту Есо47Ш. В результате гомологичной рекомбинации в геноме штамма DLU должна была появиться копия гена НрКЕТ1 с делецией 3'-концевой области, соответствующей последним 305 аминокислотным остаткам, и нетранслируемая копия с делецией 5'-концевой и промоторной области. В

TpG ^ Рисунок 1. Варианты

RET1 -' гена- RETI в

WB1«

W818

i использованных

ЫЬ --'С штаммах Н. ро1утогрЬа.

тса 1206

—' Голубыми

^ прямоугольниками

N1' 1С обозначены варианта белка

818 НрЯсИр, кодируемые

ret1-27

retí-АС | |-| данными аллелями гена

У^- HpRET¡ (RETI). Серым MI ' прямоугольником обозначен

901 ген LEU2 S. cerevisiae. Серой

ост4 стрелкой обозначен

MKfc/1 -промотор гена

метанолоксвдазы (МОХр). Звёздочкой указано

положение мутации retí-27.

Ml 1С

1206

Рисунок 2. Стратегия клонирования фрагмента ДНК с мутацией т&1-27.

Объяснения в тексте.

Сайты рестрикции обозначены следующим образом: Ее - Ехр1, К - Крп1, В - Bgйl, Б -Есо4ТШ, Ее - Ее! 136, Ва - ВатН1. Незакрашенные области соответствуют хромосомной копии гена НрЛЕТ!; Голубым цветом обозначены области, соответствующие плазмидной копии гена НрЛЕТ]', серыми прямоугольниками обозначены гены НрЬЕШ и а/ярг. Звёздочкой обозначено положение мутации геИ-27.

Es К ВЕ Ее Ва

"г j

-—^ YnoM

v Хромосома

р27КМ

ampr LEU2

Es К ВЕ Ее ВаВа ^ (К) ВЕ Ее

-i' ■'. ' sU—»-г—J—ц '

" I d п amrtt

LEU2 атрг I_

ВЕ Ее ■ ■ ■

рАМ409

атрг LEU2

результате трансформации, действительно, были отобраны клоны с делецией

3'-концевой области гена HpRETl, проявляющие мутантный фенотип, характерный для мутантного штамма 2dMA63.

3. Ген ИрЯБИ И. ро1утогрЪ.а является жизненно важным.

У cerevisiae С-концевая область белка Retlp является существенной для поддержания жизнеспособности, и делеционный вариант гена RET1 без 3'-концевой области, соответствующей последним 170 аминокислотным остаткам, был способен обеспечивать рост клеток лишь в мультикопийном состоянии (Eugster et al., 2000). Поэтому то, что удаление с 3'-конца гена НрКЕТ1 почти третьей части его кодирующей области не приводит к гибели клеток, позволило нам предположить, что у Н. ро1ушогрка этот ген либо не является жизненно важным, либо для поддержания жизнедеятельности клеток его 3'-концевая область несущественна. Для проверки этих предположений был сконструирован штамм DL1-LA/MC, содержащий ген НрКЕТ1 под контролем регулируемого промотора гена метанолоксидазы (МОХ) (Рис.1). Для этого штамм DL1-LA трансформировали плазмидой pMCOPl-L, содержащей 5'-концевую область гена HpRETl, соответствующую первым 270 аминокислотным остаткам, под контролем промотора МОХ. Перед трансформацией плазмиду разрезали по сайту ШМШ внутри последовательности фрагмента гена HpRETl. Гомологичная рекомбинация плазмидной ДНК с геномной копией HpRETl должна была привести к появлению в геноме штамма DL1-LA полноразмерной копии HpRETl под контролем промотора МОХ и копии гена с делецией большей части нуклеотидной последовательности.

Фермент метанолоксидаза участвует в метаболизме метанола в клетках Н. ро1ушогрка. Промотор гена этого белка активируется при отсутствии в среде других источников углерода, кроме метанола, и репрессируется глюкозой. В случае правильной интеграции плазмиды pMCOPl-L и при условии, что ген HpRETl является жизненно-важным, трансформанты должны расти на среде, содержащей метанол, и погибать на среде, содержащей глюкозу. Примерно 70% трансформантов, полученных на минимальной среде, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода были не способны расти на среде, содержащей глюкозу. Один из этих трансформантов был назван DL-LA/MC. Несколько независимых клонов этого штамма трансформировали плазмидой pCHA6-27OPU, содержащей ген HpRETl дикого типа. Отобранные трансформанты были способны расти на среде с глюкозой, тогда как трансформанты с пустым вектором не вырастали (Рис.3). Полученные данные позволили нам сделать вывод, что ген НрКЕТ1 является жизненно важным у Н. ро1ушогрка.

Описанные в Разделах 2 и 3 данные свидетельствуют, что 3'-концевая область жизненно-важного гена RET1 у Н. ро1ушогрка, в отличие от 5. cerevisiae, не является существенной для жизни клетки, но нарушение этой области приводит к появлению характерных мутантных проявлений -сверхсекреции гетерологичного белка иРА и чувствительности к пониженному содержанию Са2+ в среде.

вектор РЕП —^—II-1

МЕТАНОЛ

ГЛЮКОЗА

Рисунок 3. Ген HpRETl является жизненно-важным.

Штамм DL-LA/MC с геном IlpRETl под контролем промотора гена МОХ трансформировали вектором р2С11А6 и плазмвдой p2CHA6-270PU, содержащей ген HpRETl. Полученные трансформаты отсевали штрихами и делали отпечатки на минимальную среду, содержащую необходимые аминокислотные добавки, а также метанол или глюкозу в качестве источников углерода.

Обозначения: вектор - трансформанты с вектором р2СНА6, RET1 - трансформанты с плаэмидой р2СНА6-270PU, метанол - среда содержащая метанол, глюкоза - среда, содержащая глюкозу.

4. Дефект a-СОР приводит к секреции неправильно свёрнутых форм урокиназы человека.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что гетерологичный белок иРА плохо секретируется клетками дрожжей Н. polymorpha из-за нарушения формирования правильной конформации этого белка в ЭР. Неправильно свёрнутая урокиназа задерживается в ЭР, агрегирует и деградирует за счет системы деградации белков, ассоциированной с ЭР (ER-associated degradation, ERAD) (Agaphonov et al., 2002). При фракционировании лизатов клеток дрожжей с мутацией retl-27 было выявлено, что в этих клетках значительно снижено количество агрегированной иРА (Рис.4А). иРА, секретируемая в культуральную среду клетками мутанта также отличалась по своим свойствам от иРА, секретируемой клетками дикого типа. Это было выявлено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих для иРА условиях с последующим анализом зон лизиса на фибриновом геле (Рис.4Б). Перед электрофорезом образцы были обработаны эндогликозидазой Н, которая удаляет N-связанные олигосахаридные цепи гликопротеидов, влияющие на их подвижность в полиакриламидном геле. иРА, секретируемая клетками дикого типа, мигрировала в геле двумя полосами. Полоса с более низкой подвижностью соответствовала полноразмерной форме урокиназы, известной в литературе как «50kD»-форма, соответствующая одно- или двуцепочечной молекуле uPA (Lijnen. and Collen, 1991). Полоса с более высокой подвижностью соответствовала форме урокиназы без N-концевых доменов, несущественных для её фибринолитической активности, образующейся в результате протеолиза. Клетки мутанта retl-27 секретировали дополнительные формы иРА, выявляемые на зимограмме как высокомолекулярное диффузное пятно (шмер). Появление медленно мигрирующих форм могло быть следствием неполного удаления N-гликозидных цепей эндогликозидазой Н, однако, такой же шмер был обнаружен в случае урокиназы, секретируемой мутантом retl-27, экспрессирующим урокиназу человека с нарушенным сайтом N-гликозилирования (uPA-Q302) (данные не приведены). Интересно, что активность иРА, соответствующей «50kD»-форме, оказалась примерно

одинаковой как у клеток дикого типа, так и у мутанта, тогда как общая активность секретируемой иРА, измеренная в фибринолитическом тесте, и её количество в культуральной среде, измеренное с помощью иммуноблоттинга,

RET1 Р S СЭ

retí Р s — -» » О

retí 10PMR1 Р S

■<-50kDa

retl-AC

RET1 По-

Медленно

J мигрирующие формы

i "50kDa"

retl-AC

было примерно в 9 раз выше в

Рисунок 4. Анализ урокиназы в Д штаммах IL polymorpha с

нарушенным геном HpRETl.

(A) Анализ внутриклеточной агрегации урокиназы. Осветлённые клеточные лизаты фракционировали с помощью центрифугирования. Фракции супернатанта (S) и осадка (Р) анализировали методом иммуноблоттинга с использованием антител к иРА. Обозначения дорожек: RETI - штамм 2d-C с геном HpRETl дикого типа; retí - штамм 2d-L с мутацией retl-27; retl/lOPMRl -пгтамм 2d-P10, несущий мутацию retl-27 и 10 дополнительных копий гена HpPMRl.

(Б) Зимография иРА, секретированной клетками штамма дикого типа OLU-L (RETI) и клетками штамма DLU-CA с делецией 5*-концевой области гена HpRETl (retl-AC)• 1/2 - образец перед нанесением был разведён в 2 раза.

(B) Иммуноблоттинг иРА, секрета рованной клетками штамма дикого типа DLU-L (RETI) и клетками штамма DLU-СД с делецией 5'-концевой области гена HpRETl (retl-AC). IIS - образец перед нанесением был разведбн в 8 раз. Белки культур альных сред переосаждали 10%ТХУ.

(Рис.4В). Это позволило нам сделать вывод, что фенотип мутанта retl-27 обусловлен секрецией высокомолекулярных форм иРА. Мы предположили, что такие формы соответствуют неправильно свёрнутой и, возможно, агрегированной иРА, которая задерживается в ЭР в клетках дикого типа. Нарушение задержки неправильно свёрнутой иРА и секреция их в культуральную среду может объяснять снижение количества агрегированной внутриклеточной иРА в случае мутанта по сравнению с диким типом. Низкая активность неправильно свёрнутых форм иРА в условиях зимографии может объясняться как тем, что они плохо мигрируют из полиакриламилного геля в фибриновый, так и тем, что концентрация этих молекул в каждой точке шмера не достаточна для проявления фибринолитической активности, так как по нашим наблюдениям области лизиса фибрина не проявляются при низких концентрациях иРА.

(•<- 50kDa

случае мутанта сверхсекреторный

5. O-СОР H. polymorpha участвует в транспорте GPI-заякоренного* белка Gas 1р.

У S. cerevisiae мутация в гене а-СОР приводит к нарушению транспорта GPI-заякоренных белков (GPI, glycosyl Ahosphatidylmositol) из ЭР в Гольджи (Sutterlin et al., 1997). В данной работе мы исследовали транспорт GPI-заякоренного белка Gaslp в клетках мутанта Н. polymorpha retl-27. У дрожжей при прохождении секреторных путей Gaslp подвергается ряду модификаций, в результате которых происходит изменение его молекулярного веса. Как и все N-гликозилированные секреторные белки дрожжей, в ЭР Gaslp подвергается начальному этапу гликозилирования, когда к молекуле белка присоединяется так называемый «коровый» олигосахарид. Молекулярный вес Gaslp при прохождении ЭР составляет 105 kDa. После дальнейшего гликозилирования в средних компартментах Гольджи молекулярный вес зрелого белка увеличивается до 125 kDа (Herscovics and Orlean, 1993). При исследование клеточных лизатов методом иммуноблоттинга с использованием антител к Gaslp S. cerevisiae, мы обнаружили появление незрелой (105 Ша) формы Gaslp в случае мутантного штамма 2d-L (retl-27) (Рис.5), тогда как в случае штамма дикого типа 2d-C выявлялась только зрелая (125 Ша)

Рисунок 5. Анализ подвижности белка Gaslp

Белки клеточных лизатов анализировали методом иммуноблоттинга с использованием антител к белку Gaslp S. cerevisiae. Обозначения дорожек: RET1 - штамм 2d-C с геном HpRETl дикого типа; retl - пггамм 2d-L с мутацией retl-27; secl8 - штамм RSY372 S. cerevisiae с мутацией sec!8-l.

форма этого белка. Эти данные говорят о том, что мутация retl-27 приводит к задержке транспорта Gaslp из ЭР в Гольджи. В качестве контроля на наличие дефекта транспорта был взят температурочувствительный мутант S. cerevisiae sec 18-1.

Дефект белка Secl8p, ортолога белка NSF у млекопитающих, приводит к нарушению слияния мембран, а следовательно и к дефекту транспорта белков, на всех этапах секреторного пути, в том числе и на этапе транспорта из ЭР в Гольджи. В лизатах клеток с мутацией sec18-l, выращенных при 37°С, также появлялась незрелая (105 Ша) форма Gaslp, тогда как в лизатах клеток, выращенных при 27°С, наблюдалась только зрелая (125 Ша) форма этого белка. Полученные данные позволяют сделать вывод, что также как у S. cerevisiae, в клетках Н. polymorpha дефект а-СОР приводит к нарушению транспорта GPI-заякоренного белка Gaslp из ЭР в Гольджи. Как

и в случае 5. севшие, можно предполагать, что такие нарушения у Н. ро1ушогрка связаны с дефектом возврата в ЭР в составе СОР I везикул компонентов системы, участвующей в прямом транспорте белка Gas 1р.

6. Функциональное взаимодействие между а-СОР и Рmг1р И. ро[утогрка,

6.1 Сверхэкспрессия ИрРЫШ супрессирует фенотипические проявления мутации гей-27.

Делеция гена 5. севшие PhfRl, кодирующего Са2+/Мп2+ - АТФазу Pmrlp, также как и мутация Н. polymorpha геи-27 приводит к чувствительности к пониженному содержанию Са2+ в среде и сверхсекреции урокиназы клетками дрожжей. Кроме того, известно, что мутации в генах, кодирующих субъединицы комплекса СОР I , приводят у 5. cerevisiae к нарушению функционирования некоторых ферментов Гольджи (Gaynor et al., 1997, Todorow et а1., 2000). Сходство фенотипических проявлений упомянутых мутаций позволили предположить, что мутация геЛ-27 приводит к нарушению нормального функционирования белка Pmrlp у Н. polymorpha, в связи с чем и возникает характерный фенотип. Действительно, введение 10 дополнительных копий гена HpPMRl, полученного из штамма DL-1 Н. polymorpha (Ка^ et а1., 1998), приводило к компенсации некоторых фенотипических проявлений мутации гей-27, а именно, к снижению EGTA-чувствительности, уменьшению секреции иРА и увеличению количества внутриклеточной агрегированной иРА (Рис.6). Однако, супрессия Са2+-зависимости и сверхсекреции урокиназы была неполной. Кроме того, введение дополнительных копий гена HpPMRl не приводило к супрессии других фенотипических проявлений мутации геЛ-27 (снижение скорости роста на полной среде и дефект созревания белка Gaslp).

6.2 Мутация в гене ИрШЕТ1 приводит к снижению количества белка Pmгlp и нарушению его распределения в клетках Н. ро[утогрка.

Анализ клеточных лизатов с помощью иммуноблоттинга показал, что в штаммах 2d-pL {гей-27) и ОЬЧ-СД (Ш1-АС) количество Рт^р снижено

Рисунок 6. Сверхэкспрессия гена HpPMRl супрессирует Са2*-зависимостъ и сверхсекрецию иРА в штамме с мутацией retl-27.

Обозначении: RETI - штамм 2d-C с геном HpRETl дикого типа; retí - штамм 2d-L с мутацией retl-27: relJ/PMRl н retl/lOPMRl -штаммы, несущие мутацию retl-27, и одну (2d-P) или 10 (2d-P10) дополнительных копий гена HpPMRl соответственно; вРА -зоны лизиса на среде, содержащей фибрин; EGTA • рост на среде, содержащей 25 шМ EGTA; Pmrlp - иммуноблотганг белков клеточных лизатов с использованием антисыворотхи к белку Pmrlp Н potymorpha.

retí retí RET1 retí PMR1 10PMR1

Pmrlp

uPA

EGTA

FJ Щ

[Т.

Pmrlp светлое поле

Рисунок 7. Мутация retl-27 приводит к нарушению распределения белка Pmrlp в клетках H. pofymorpha.

Иммунофлуоресцектпое окрашивание клеток H pofymorpha дикого типа (RETI, штамм 2d-C) и мутанта retU 27 (ral, штамм 2d-L) с »(пользованием ангисыворотки к белку Pmrlp H polymorpha и антител, конъюгнрованных с Alexa Fluor (Molecular Probes). Maprfp = 1.2 мкм

в -4 раза по сравнению с диким типом (Рис.6). Количество Pmrlp было снижено на посттрансляционном уровне, поскольку анализ с помощью полуколичественного RT-PCR не выявил уменьшения уровня м-РНК для HpPMRL

Белок Pmrlp в клетках S. cerevisiae колокализуется с резидентными белками аппарата Гольджи, что было продемонстрировано с помощью методов фракционирования клеток (Fink et al., 1992, Sorin et al., 1997). Методом иммунофлуоресценции было показано также, что он колокализуется с белком средних компартментов Гольджи - Emp47p (Schroder et al., 1995). Считается, что комплекс СОР I принимает участие в поддержании структуры аппарата Гольджи. Кроме того, по некоторым данным, мутация sec23-l в гене, кодирующем у-СОР приводит к нарушению структуры цис-Гольджи (Gaynor et al., 1997). Это позволило нам предположить, что мутация ret 1-27 вызывает нарушение распределения белка Pmrlp, что и приводит к его ускоренной деградации и уменьшению количества. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Н. polymorpha дикого типа с помощью антител к HpPmrlp показало, что распределение этого белка сходно с распределением Pmrlp в клетках S. cerevisiae. Однако, окрашивание клеток с мутацией retl-27 теми же

антителами показало, что данная мутация приводит к изменению распределения белка Pmrlp, который в этом случае распределён дисперсно по всей клетке (Рис.7). Полученные данные позволяют нам предполагать, что Са2+-зависимый фенотип мутанта ret1-27 связан, в основном, со снижением количества белка Pmrlp, что должно приводить к уменьшению количества Са + в секреторных путях Я. polymorpha.

63 Мутация retl-27 не приводит к нарушению гликозилирования" секретируемых белков.

Мутанты S. cerevisiae с делецией гена PMR1 жизнеспособны, однако содержат в ЭР примерно половину от физиологической нормы Са2+ (Strayle et al., 1999), и имеют фенотипические проявления, характерные для уменьшения количества Са2+ в секреторных путях, в том числе и нарушение процесса гликозилирования белков. Уменьшение количества Pmrlp в клетках с мутацией retl-27 может также приводить к снижению содержания Са2+ в Гольджи и появлению дефектов гликозилирования.

Инвертазу часто используют как белок-репортер для изучения N-гликозилирования у дрожжей S. cerevisiae. Этот белок осуществляет расщепление сахарозы на фруктозу и глюкозу. В зависимости от положения точки начала транскрипции, с одного гена SUC2 в дрожжах S. cerevisiae экспрессируются две формы инвертазы: негликозилированная внутриклеточная и периплазматическая инвертаза, которая проходит секреторные пути и гликозилируется (Gascon et al., 1968, Carlson et al., 1982). По нарушению подвижности периплазматической инвертазы судят о нарушении N-гликозилирования в секреторных путях клеток дрожжей. Дрожжи Я. polymorpha не имеют гена, кодирующего инвертазу. Гидролиз сахарозы и мальтозы осуществляется за счёт продукта гена мальтазы НрМАЬ1 (Рагп et al., 2002). В связи с этим, для изучения N-гликозилирования у дрожжей Я. polymorpha мы использовали гетерологичный белок - инвертазу S. cerevisiae. Штамм 34IA, с мутацией retl-27 и штамм дикого типа 34IAC, несущие ген SUC2 S. cerevisiae, выращивали в среде без глюкозы, и секретируемую инвертазу анализировали в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. При сравнении инвертазы, секретируемой клетками дикого типа и мутанта retl-27, мы не выявили отличий в подвижности этого белка. В качестве контроля мы использовали штамм 24-8V, трансформированный плазмидой pLDIN (содержит ген SUC2), с мутацией ори24 в гене PSA1, который проявлял дефект как N-, так и О-гликозилирования белков (Agaphonov et al., 2001).

Поскольку хитиназа является белком, имеющим исключительно О-гликозидные цепи (Kuranda and Robbins, 1991), этот белок является удобным репортером для изучения процесса О-гликозилирования в клетках дрожжей. Анализ хитиназы из культуральных сред штамма 2d-L с мутацией retl-27 и штамма дикого типа 2d-C не выявил различий в подвижности этого белка. В качестве контроля мы также использовали штамм 24-8V с мутацией ори24 в гене PSA1. Полученные данные свидетельствуют, что уменьшение количества белка Pmrlp в клетках Я. polymorpha с мутацией retl-27 не приводит к

нарушению функционирования резидентных белков аппарата Гольджи, как это происходит при полном отсутствии Pmrlp.

6.4 Летальность сочетания мутации гвА-27 с делецией- гена ИрРЫШ.

Для дальнейшего анализа функционального взаимодействия белков Retlp и Pmrlp мы решили исследовать, не приводит ли фенотипические одновременное нарушение обоих генов к потере жизнеспособности. Для этого штамм Н. polymorpha 1MA.77.12 с делецией гена HpPMRl, трансформированный плазмидой рСАТ1, содержащей ген HpPMRl, скрестили со штаммом Н. polymorpha 10сМА82 с мутацией кй-27. Штамм 1МА77.12 обладал фенотипическими проявлениями, характерными для делеции гена PMR1 S. cerevisiae: сверхсекретировал иРА и был чувствителен к пониженному содержанию ионов Са2+ в среде (М.О.Агафонов, неопубликованные данные). Плазмида рСАТ1 была сконструирована на основе вектора р2СНА6, содержащего последовательность 2ц ДНК S. cerevisiae и HARS6 Н. polymorpha. Последовательность 2]Х ДНК обладает центромероподобными свойствами в клетках дрожжей Я. polymorpha, и придаёт вектору стабильность (Вс^ёапоуа et а1., 1998). Плазмида рСАТ1 полностью комплементировала проявления штамма 1МА77.12. Гибриды отбирали по способности расти на минимальной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода и анализировали методом тетрадного анализа. Если плазмида рСАТ1 обладает центромероподобными свойствами, то у сегрегантов, полученных в данном скрещивании, возможны 8 комбинаций аллелей генов НрРМШ, НрЯЕТ1 и плазмиды рСАТ1. Все возможные классы сегрегантов и их фенотипы представлены в Таблице 1. Класс ге11-27Дртг1 фенотипически неотличим от класса и может существовать

только в том случае, если сочетание двух мутаций не летально. Если сочетание мутаций летально, то сегреганты, содержащие обе эти мутации

могут существовать только при наличии плазмиды с геном НрРМШ. Сегреганты класса геИ-27Артг! [НрРМШ] отличается от класса НрЯЕТ1^ртг1[РМК1] наличием чувствительности к 25тМ БОТА в среде и способностью сверхсекретировать иРА. Если сочетание двух мутаций Лртг1 и ш1-27 не летально, то сегреганты геИ-27Артг1 [НрРМК1] должны терять плазмиду рСАТ1 на неселективной для плазмиды среде, если же сочетание этих мутаций летально, то такие сегреганты терять плазмиду не будут.

Было проанализировано 17 тетрад и отобраны споры с фенотипом Adc l.cn (то есть классы Ш1-27Дртг1[НрРМК1] и НрКЕПЛртгЦРМШ]). Наличие у таких спор сверхсекреторного фенотипа и чувствительности к БОТА должно указывать, что они принадлежат к классу кй-27Дртг1[НрРМ111]. Действительно, 4 из 9 спор с фенотипом Аёе+Ьеи+ сверхсекретировали урокиназу человека и были чувствительны к пониженному содержанию Са2+ в среде. При клонировании БОТА-чувствительных сегрегантов с фенотипом Аёе+Беи+ на неселективной для

Таблица 1. Схема анализа сегрегантов из скрещивания штаммов 1МА77.12 и 10сМА82.

1 генотипы . сегрегантов С генотипы

Leu Ade EGTA uPA потеря-pCATl

| RETI РНК! pt/Щ - + - - +

RET1PMRI- - - - - -

РЕП ЛртП ¡FTJR11 + + - - +

FETidfxrrl + - + + -

retl-27 РШ1[РШ1] - + + + +

ГВИ-2ТРШ1 - - + + -

retU37Apnr1[PMH] + + + + ?

retl-274M"' 1" + - + + --

Обозначения: Leo4, Leo", Ade*, Ader - наличие или отсутствие хромосомного маркера HpLEU2 или плазмидного маркера HpADE2, EGTA наличие чувствительности к 25mMEGTA в срезе, иРА ■ сверхсекреция иРА. Ген HpPMRl был разрушен вставкой IIpLEU2. Плазмнда pCATl с геном HpPMRl лихого типа несет также ген HpADE2.

плазмиды pCATl среде мы не наблюдали потери плазмиды. В качестве контроля мы использовали EGTA-нечувствительные сегреганты с фенотипом Ade+Leu+. В этом случае клетки теряли плазмиду с частотой 17-20%.

Чтобы проверить, что клетки EGTA-чувствительных сегрегантов не теряют плазмиду pCATl в результате совмещения мутации retl-27и Apmrl, а не в результате, например, негомологичной интеграции этой плазмиды в геном, мы произвели замену плазмиды с геном HpPMRl на плазмиду с геном HpRETL Для этого клетки трансформировали плазмидой рСОР-МОХ, несущей ген HpRETl дикого типа. В качестве контроля использовали плазмиду рМОХ-Н36. Трансформанты отбирали на минимальной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода. При клонировании на неселективной среде трансформанты с плазмидой рСОР-МОХ теряли плазмиду pCATl с частотой 29-32%, тогда как трансформанты с плазмидой рМОХ-НЗ6 не теряли плазмиду pCATl (Рис.8).

Таким образом, сочетание мутаций retl-27 и Apmrl летально. Полученные данные позволяют сделать вывод, что существует функциональная связь между поступлением ионов Са2+ в Гольджи и везикулярным транспортом из Гольджи в ЭР.

Интересно, что при добавлении в неселективную среду 20тМ СаСЬ,

сегреганты с двойной мутацией гвй-27 Дртг! и вектором рМОХ-НЗ6 также начинали терять плазмиду рСАТ1 (Рис.8). Таким образом, в условиях увеличения содержания Са2+ в среде снимался комбинативный летальный эффект двойной мутации твй-27Лртг1. Штамм Н. ро1ушогрка 1МА77.12

1вЧАрпг1 геПАрпг1 [РМЯ] [РШ1][ЯЕП]

Ш9 Л" " * " 1 Г—С^-ЧИ >

Рисунок 8. Способность штаммов с двойной мутацией Ш1-27 Лртг! терять плазмиду с геном НрРММ.

Обозначения тч1Лртг1ДРМЮЦШТ1] - штамм с двойной мутацией ге11-27 Артг1 и плазмидами рСАТ1 и рСОР-МОХ, тгЧЛртгЩРМЯЦ -пгтамм с двойной мутацией ге>1-27 Артг1, ппазмидой рСАТ1 и пустым вектором рМОХ-Ш6, УРО - полна* среда, УРО+ОСЦ - полна* среда, содержащая 20шМ СаС^

с делецией гена HpPMRl помимо сверхсекреторного фенотипа и чувствительности к пониженному содержанию ионов Са2+ в среде, обладал сниженной скоростью роста по сравнению с диким типом (М.О.Агафонов, неопубликованные данные). Добавление 20тМ СаСЬ в среду выращивания подавляло проявление данного мутантного фенотипа. Полученные нами данные позволяют предполагать, что клетки Н. polymorpha с дефектным СОР I -зависимым везикулярным транспортом не способны выживать в условиях пониженного содержания Са2+ в секреторных путях. Увеличение концентрации Са2+ в среде, вероятно, приводит к повышению его количества в секреторных путях и восстанавливает жизнеспособность клеток.

7. Идентификация генов Н. polymorpha, в мультикопнйном состоянии супрессирующих мутантные проявления retl-27.

Для идентификации новых белков, взаимодействующих с мы

произвели работу по выявлению генов, способных в мультикопийном состоянии супрессировать фенотипические проявления мутации retl-27. Для этого штамм с мутацией retl-27, 6dMA63, трансформировали мультикопийной библиотекой геномных последовательностей штамма Н. polymorpha DL1, сконструированной на основе мультикопийного вектора AMIpLl (Agaphonov et al., 2001). Трансформанты отбирали по комплементации Са2+-зависимости на синтетической среде без добавления солей кальция, содержащей 25тМ EGTA, как было описано в Разделе 1. Были отобраны 4 трансформанта, не чувствительных к EGTA, которые, однако, проявляли сверхсекреторный фенотип. ДНК, выделенной из этих клонов, трансформировали клетки Ecoli.

Полученные таким образом 4 плазмиды при рестрикционном анализе образовывали фрагменты ДНК одинаковой длины, то есть, скорее всего, были идентичны. Анализ одной из этих плазмид выявил наличие в её составе фрагмента геномной ДНК размером ~3,2 kb. Данную плазмиду назвали pSES23 (supression of EGTA sensitivity).

Секвенирование нуклеотидной последовательности фрагмента геномной ДНК выявило в её составе две открытые рамки считывания. Анализ аминокислотных последовательностей продуктов этих генов показал, что у S. cerevisiae один из них кодирует белок кальмодулин (ген CMD1), а другая открытая рамка считывания YPL246c кодирует белок с неизвестной функцией. Изолированные гены субклонировали по отдельности в мультикопийный вектор AMIpSLl. Введение этих плазмид в клетки штамма 6dMA63 и последующая проверка трансформантов показали, что за комплементацию EGTA-чувствительного фенотипа была ответственна открытая рамка считывания YPL246c. Белковый продукт YPL246c H. polymorpha на 53% гомологчен и на 36% идентичен соответствующему белку S. cerevisiae. Этот ген был назван HpSESl в соответствии с названием плазмиды

Делеция гена HpSESl в клетках Н. polymorpha не приводила к гибели клеток. Штамм с делецией гена HpSESl не проявлял EGTA-чувствительного фенотипа и не сверхсекретировал урокиназу человека (данные не приведены).

Открытая рамка считывания YPL246c S. cerevisiae кодирует белок с неизвестной функцией длиной в 262 аминокислотных остатка (29.5 kDa), имеющий в своём составе 4 трансмембранных домена. Делеция этого белка у S. cerevisiae также не приводит к гибели клеток. В двугибридном анализе (Uetz et al, 2000) было показано, что этот белок взаимодействует с белком Yptlp, Rab-ГТФазой, участвующей в транспорте между ЭР и Гольджи и локализованной в мембранах ЭР и Гольджи, а также с белком Vam7p, v-SNARE, являющимся партнёром вакуолярного синтаксина Vam3p. Vam7p участвует в транспорте белков из Гольджи в вакуоль и локализован в вакуолярной мембране. Недавно было показано, что химерный белок Ypl246p-GFP локализован в СОР I везикулах (Huh et al., 2003).

8. Изучение влияния сверхэкспрессии гена- SES1 на фенотипические проявления мутаций retl-27и Apmrl.

При сверхэкспрессии гена HpSESl в штамме с мутацией retl-27 мы наблюдали супрессию EGTA-чувствительности клеток, а также восстановление скорости роста на YPD, но не наблюдали супрессии сверхсекреторного фенотипа. Исследование белка Gaslp у мутанта retl-27 при сверхэкспрессии HpSESl также не выявило восстановления его нормального созревания. Кроме того, мы не обнаружили восстановления количества белка HpPmrlp и нормализацию его распределения в штамме 6d-Sl со сверхэкспрессией HpSESl на фоне мутации retl-27 (данные не приведены). Поскольку сверхэкспрессия HpSESl супрессировала Са2+-зависимый фенотип мутанта retl-27, возникло предположение, что подобный эффект можно наблюдать и в штамме с делецией гена HpPMRl. Однако, введение мультикопийной плазмиды pHA-Sl с геном HpSESl в штамм 1МА77.12 не

привело к комплементации EGTA-чувствительного фенотипа, а также восстановлению скорости роста клеток с делецией гена HpPMRl на полной среде (данные не приведены). Эти данные указывают, что белок Seslp не может быть компонентом альтернативной системы доставки Са2+ в аппарат Гольджи в условиях отсутствия Са2+-АТФазы Pmrlp. В ином случае, увеличение копийности гена HpSESl на фоне делеции гена HpPMRl должно было бы приводить к увеличению количества Са2+ в секреторных путях и супрессии Са2+-зависимого фенотипа. Поскольку белок Seslp S. cerevisiae взаимодействует с белками, принимающими непосредственное участие в процессах слияния мембран, и кроме того, локализован в СОР I везикулах, он сам, возможно, также является компонентом системы слияния мембран и его сверхэкспрессия хотя бы частично способствует восстановлению СОР I -зависимого транспорта.

9. Делеция гена ИрБЕБ1 приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. ро1ушогрка.

Как было уже сказано выше, белок Seslp S. cerevisiae взаимодействует с белком Vam7p. Ген VAM7, также как УАМ3 был выявлен при поиске генов, необходимых для морфогенеза вакуолей в клетках S. cerevisiae (Wada et al, 1992). Мутации в этих генах приводили к нарушению формирования зрелых вакуолей и появлению в клетках видоизмененных вакуолярных структур. В связи с этим, мы решили проверить, не приводит ли нарушение гена HpSESl к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. ро1утогрка.

Для прижизненного окрашивания вакуолей используют липофильный флуоресцентный краситель FM 4-64, который избирательно встраивается в вакуолярную мембрану. Штамм с делецией HpSESl, трансформированный плазмидой pHA-SESl с геном HpSESl (lB-dS-S), и такой же штамм, трансформированный пустым вектором (lB-dS-A) инкубировали в среде, содержащей краситель FM 4-64, промывали свежей средой и исследовали клетки этих штаммов с помощью флуоресцентной микроскопии. В клетках дрожжей с геном HpSESl дикого типа в стационарной фазе роста мы обычно наблюдали одну крупную вакуоль и несколько мелких, тогда как в штамме с делецией гена HpSESl, мы обнаружили множество мелких вакуолей без формирования крупной вакуоли. Таким образом, делеция гена HpSESl приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. ро1утогрка (Рис.9).

FM4-64 светлое поле

Рисунок 9. Делеция гена HpSESl приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках II. polymorpha.

Визуализация вакуолей в клетках Н. pofymorpha дикого типа (SES1, штамм lB-dS-S) и мутанта с делецией гена HpSESl (Asesl, штамм lB-dS-A) с использованием флуоресцентного красителя FM 4-64. Маркер = 2мкм

ВЫВОДЫ:

1. По комплементации Са2+-зависимого и сверхсекреторного фенотипа мутации ret1-27 клонирован ген RET1 Н. polymorpha, который кодирует a-субъединицу комплекса СОР I.

2. Аллель retl-27 содержит нонсенс-мутацию и кодирует a-СОР, лишённый 389 С-концевых аминокислотных остатков.

3. Мутация retl-27 приводит к дефекту созревания белка Gaslp и секреции неправильно свёрнутых форм урокиназы.

4. Идентифицирован мультикопийный супрессор SES1 Са2+-зависимого фенотипа мутации retl-27. Показано, что делеция гена SES1 приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. polymorpha.

5. Мутация retl-27 приводит к уменьшению количества белка Pmrlp и нарушению его локализации в клетках Я. polymorpha.

6. Увеличение количества белка Pmrlp в клетках Н. polymorpha супрессирует некоторые проявления мутации retl-27, а сочетание делеции гена PMR1 и мутации retl-27 летально. Полученные данные

указывают на роль везикулярного транспорта в поддержании гомеостаза Са2+ в секреторных путях дрожжей.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ: Чеченова М.Б. Влияние сверхсекреторных мутаций в клетках дрожжей на свойства секретируемых гомологичных и гетерологичных белков. Итоговая конференция по результатам Российского конкурса на лучшую научную работу студентов 1998 года по разделу "Медицинские науки". Москва, Россия, 1999. Тезисы конференции, стр. 23-24.

Agaphonov M.O., Romanova N.V., Chechenova M.B. and Ter-Avanesyan M.D. Secretion of the human urokinase by yeasts Saccharomyces cerevisiae and Hansenula polymorpha. 2 1a International specialized symposium on yeasts: "Biochemistry, genetics, biotechnology and ecology of non-conventional yeasts". 21-25 August, 2001, Lviv, Ukraine. Book of Abstracts, p. 109.

Agaphonov M.O., Packeiser A.N., Chechenova M.B.; Eui-Sung Choi and Ter-Avanesyan M.D. (2001). Mutation ofthe homologue of GDP-mannose phosphorylase alters cell wall sructure, protein glycosylation and secretion in Hansenula polymorpha. Yeast; V.I 8, p.391-402.

Чеченова М.Б. Романова Н.В. Агафонов М.О. Урокиназа человека как модель для изучения механизмов секреции у дрожжей. Ш съезд Биохимического общества 26 июня-1 июля 2002 года, Санкт-Петербург, Россия. Тезисы научных докладов, стр. 124. Agaphonov M.O., Romanova N.V., Chechenova M.B; and Ter-Avanesyan M.D. Heterologous protein secretion in Hansenula polymorpha as a model for study of eukaryotic secretory pathway. 2nd Hansenula polymorpha worldwide network conference. 26-29 September, 2002, Tenerife, Canary Islands. Program and Abstracts, p. 17.

Chechenova M.B., Romanova N.V., Deev A.V, Packeiser A.N., Smirnov V.N., Agaphonov M.O. and Ter-Avanesyan M.D. (2004). C-terminal truncation of a-COP affects functioning of secretory organelles and calcium homeostasis in Hansenula polymorpha. Eukaryotic Cell; V.3, p.52-60.

Qjf.fey^

а» - 5 5 a i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чеченова, Мария Барасбиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ТРАНСПОРТ В КЛЕТКАХ

ЭУКАРИОТ».

1. Организация путей секреции в клетках дрожжей.

2. Транспортные везикулы.

2.1 СОРИ везикулы.

2.1.1 Структура комплекса СОРИ.

2.1.2 Сортировка белков в СОРИ везикулы.

2.2 COPI везикулы.

2.2.1 Структура комплекса COPI.

2.2.2 Участие COPI везикул в прямом транспорте между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи.

2.2.3 Участие COPI везикул в обратном транспорте между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи.

2.2.2.1 Транспорт белков, содержащих дилизиновый сигнал.

2.2.2.2 Транспорт белков, содержащих сигнал K/HDEL и белка Seel2р.

2.2.3 Модели COPI-зависимого транспорта между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи.

2.3 Клатриновые везикулы.

3. Транспорт между цистернами аппарата Гольджи.

3.1 Структура аппарата Гольджи.

3.2 Модели транспорта белков между цистернами аппарата Гольджи.

4. Слияние мембран.

4.1 Молекулы SNARE.

4.2 Регуляция сборки комплекса SNARE.

4.2.1 SM-белки - семейство белков Secl/Muncl8.

4.2.2 Белок Seel8р.

4.3 Система связывающих белков.

5 Роль ионов кальция в секреторных путях.

5.1 Кальциевые помпы.

5.2.1 Кальциевые помпы дрожжей.

5.3 Ответ клетки на снижение Са2+ в секреторных путях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция"

Транспорт белков по секреторным путям в клетках эукариот осуществляется с помощью везикул. «Жизненный цикл» везикулы в общих чертах состоит из трёх стадий: формирование везикулы на донорской мембране; слияние везикулы с мембраной-мишеныо; и рециркуляция компонентов, осуществляющих первые две стадии. Первая стадия инициируется цитозольными белковыми комплексами, окаймляющими эти везикулы (coated complexes - «окаймляющие комплексы»), которые связываются с донорской мембраной, участвуют в формировании и отпочковывании везикул, а также в сортировке переносимых молекул, и диссоциируют при слиянии везикулы с мембраной-мишенью. Сейчас хорошо охарактеризованы три основных типа транспортных везикул, и они описаны как в клетках высших эукариот, так и у дрожжей. Первыми были описаны клатриновые везикулы в клетках млекопитающих, образующиеся за счёт клатрипового комплекса и осуществляющие эпдоцитоз и транспорт белков из я;/?ш/с-Гольджи-сети (TGN, /ra/w-Golgi-network) к эпдосомам (Pearse, 1976; Pearse and Robinson, 1990). Другой тип везикул, формирующихся с помощью цитозольного белкового комплекса COPI, был также впервые открыт в клетках млекопитающих. Было показано, что эти везикулы отпочковываются от цистерн Гольджи и направляют белки к клеточной поверхности (Orci et al., 1986; Orci et al., 1997). Однако до конца роль COPI везикул не исследована. Благодаря генетическим исследованиям, выполненным при использовании клеток дрожжей, точно известно, что эти везикулы осуществляют обратный транспорт белков из Гольджи в эндоплазматический ретикулум (ЭР), тогда как их участие на других этапах транспорта в секреторных путях остаётся спорным. Третий тип везикул формируется за счёт белков комплекса COPII и осуществляет транспорт белков из ЭР в Гольджи. Эти везикулы были впервые охарактеризованы в клетках дрожжей (Barlowe et al., 1994).

Процесс слияния мембран везикул и секреторных органелл также является немаловажным в жизнедеятельности клетки. Его можно разделить на несколько этапов: инициирующий этап (priming), этап связывания (tethering) и стыковка (docking) мембран с последующим объединением липидного бислоя и содержимого везикул. Многие компоненты, участвующие в этом процессе, уже идентифицированы как в клетках млекопитающих, так и у дрожжей: Secl8/NSF, Secl7/a-SNAP, молекулы SNARE, связывающие комплексы, Rab-ГТФазы и т. д.

Помимо белковых компонентов, немаловажную роль в везикулярном транспорте играют ионы кальция. Гомеостаз Са2+ поддерживается в клетке за счёт транспорта его из окружающей среды и высвобождения из внутриклеточных депо, аккумулирующих ионы Са2+ в ответ на различные физиологические сигналы. Поддержание постоянного л I внутриклеточного уровня Са необходимо для процессов транспорта из ЭР в Гольджи (Beckcrs and Balch, 1989; Baker et al., 1990), транспорта между цистернами Гольджи (Schwaninger et al., 1991) экзоцитоза и эндоцитоза (Burgoyne and Clague, 2003). Ионы Ca2+ играют важную роль в процессе слияния мембран на всех этих этапах.

Данная работа посвящена изучению функционирования а-субъединицы окаймляющего комплекса COPI в клетках дрожжей Hansenula polymorpha. Впервые был охарактеризован ген HpRETl, ортолог гена RET1 S. cerevisiae, кодирующего этот белок. Изучение мутанта retl-27 позволило предположить существование взаимосвязи между везикулярным транспортом и гомеостазом кальция в секреторных путях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ТРАНСПОРТ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чеченова, Мария Барасбиевна

112 ВЫВОДЫ:

1. По комплементации Са2+-зависимого и сверхсекреторного фенотипа мутации retl-27 клонирован ген RET1 Н. polymorpha, который кодирует а-субъединицу комплекса COPI.

Аллель retl-27 содержит нонсенс-мутацию и кодирует а-СОР, лишённый 389 С-концевых аминокислотных остатков.

Мутация retl-27 приводит к дефекту созревания белка Gaslp и секреции неправильно свёрнутых форм уроки назы. л I

Идентифицирован мультикопийный супрессор SES1 Са -зависимого фенотипа мутации retl-27. Показано, что делеция гена SES1 приводит к нарушению морфологии вакуолей в клетках Н. polymorpha.

Мутация retl-27 приводит к уменьшению количества белка Pmrlp и нарушению его локализации в клетках Н. polymorpha.

Увеличение количества белка Pmrlp в клетках Н. polymorpha супрессирует некоторые проявления мутации retl-27, а сочетание делеции гена PMR1 и мутации retl-27 летально. Полученные данные указывают на роль везикулярного транспорта в поддержании гомеостаза Са2+ в секреторных путях дрожжей.

113

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наряду с клетками млекопитающих, дрожжи S. cerevisiae являются классическим модельным организмом для изучения общих закономерностей процесса секреции в клетках эукариот. Вместе с тем, сравнительный анализ участвующих в этих процессах гомологичных белков из разных организмов немаловажен для понимания их функционирования в клетке. В настоящее время, в связи с появлением работ по секвенированию геномов и анализу генов у многих видов дрожжей, имеется возможность изучения процессов секреции на альтернативных модельных системах. Успехи в разработке молекулярной биологии и генетики метилотрофных дрожжей II. polymorpha сделали их привлекательными не только с точки зрения биотехнологии, но и для проведения фундаментальных исследований.

Одним из способов изучения белков, принимающих участие в процессе секреции, является получение мутантов дрожжей как с блоком секреции, так и мутантов со способностью секретировать белки, которые в норме задерживаются внутри клетки. В нашей лаборатории ранее была получена коллекция мутантов дрожжей Н. polymorpha, с улучшенной способностью секретировать гетерологичный белок - урокиназу человека. Наше внимание привлёк мутант из этой коллекции, обладающий Са2+-чувствительным фенотипом. Одна из задач дайной работы состояла в клонировании гена, дефект которого приводит к мутаитному фенотипу. В процессе работы был клонирован ген HpRETl, комплементирующий все фенотипические проявления мутантного штамма, и определена его нуклеотидная последовательность. Оказалось, что этот ген кодирует а-субъединицу комплекса COPI. Следующей нашей задачей было определение структурных нарушений в гене HpRETl, приводящих к появлению мутантного фенотипа. Мы показали, что мутантные проявления обусловлены нуклеотидной заменой в гене HpRETl, приводящей, по-видимому, к синтезу укороченного белкового продукта. Замена дикой копии гена HpRETl на укороченный с 3*-конца вариант также приводила к появлению мутантного фенотипа.

Анализ мутантного штамма выявил нарушения, которые могут указывать на то, что дефект а-СОР H.polymorpha, также как и у S. cerevisiae, приводит к нарушению обратного транспорта белков из Гольджи в ЭР, однако, дефект одинаковых областей белков HpRetlp и Retlp приводит к разным мутантным проявлениям.

Следующим этапом нашей работы было выяснение причин возникновения Са2+-зависимого фенотипа у мутанта H.polymorpha с дефектом а-СОР. Мы показали, что нарушение а-СОР в клетках H.polymorpha приводит к снижению количества Са2+-помпы HpPmrlp и изменению нормального распределения в клетке. Можно считать, что это и является основной причиной возникновения Са2+-зависимого фенотипа. Помимо этого, мы показали, что совмещение мутаций retl-27 и Apmrl в одном штамме летально. Эти данные позволяют нам предполагать существование функциональной взаимосвязи между везикулярным транспортом и гомеостазом Са2+ в секреторных путях.

В задачи нашей работы входило также и выявление других белков, взаимодействующих с а-СОР Н. polymorpha. При клонировании генов, которые в мультикопийном состоянии супрессируют Са2+-зависимый фенотип мутанта retl-27, был выявлен белок HpSeslp, функция которого ранее была неизвестна. Супрессия Са2+-зависимого фенотипа и дефекта скорости роста мутанта retl-27 при сверхэкспрессии гена HpSESl, а также нарушение морфологии вакуолей у мутанта Asesl позволили нам предположить, что белок HpSeslp участвует в везикулярном транспорте и, возможно, является компонентом системы слияния мембран.

Принципиально новым в данной работе является следующее: (1) впервые клонирован ген Н. polymorpha, кодирующий а-субъединицу комплекса COPI и изучены его структурные особенности; (2) выявлена функциональная взаимосвязь между белками HpRetlp и HpPmrlp - в нашей работе было впервые показано, что дефект СОР I -зависимого везикулярного транспорта приводит к нарушению распределения белка Pmrlp в клетке и уменьшению его количества; кроме того, впервые обнаружен эффект комбинативной летальности при совмещении в одном штамме двух нелетальных мутаций - retl-27 и Apmrl; (4) в работе

2+ впервые показано, что ген HpSESl, который является мультикопийным супрессором Са -зависимого фенотипа, возникающего вследствие дефекта гена а-СОР, участвует в контроле морфогенеза вакуолей дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеченова, Мария Барасбиевна, Москва

1. Агафонов,М.О., Деев,А.В., Kim,S.Y., Sohn,J.H., СЬо1,Е.8.,Тер-Аванесян,М.Д. (2003). Новый подхок к клонированию и функциональному анализу геномной ДНК метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Молекулярная биология 37, 81-87.

2. Богданова,А.И., Агафонов,М.О., Тер-Аванесян,М.Д. (2000а). Нестабильность плазмид у метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha: захваты фрагментов хромосомной ДНК интегративными плазмидами. Молекулярная биология 34, 28-35.

3. Богданова,А.И., Агафонов,М.О., Тер-Аванесян,М.Д. (2000b). Нестабильность плазмид у метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha: захваты фрагментов хромосомной ДНК репликативными плазмидами. Молекулярная биология 34, 36-40.

4. Захаров,И.А., Кожин,С.А., Кожина,Т.Н., Фёдорова,И.В. (1984). Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л:Наука.

5. Красатюк,Г.А., Якубов,Л.3., Синицын,В.В., Домогатский,С.П., Рохлин,О.В., Кольцова,С.В., Быняева,Н.А., Фёдорова,З.Д., Самсонов, Г.В. (1989) Моноклональные антитела для одностадийного получения высокоочищенной урокиназы. Биополимеры и клетка 5;3, 95-101.

6. Agaphonov,М.О., Beburov.M.Y., Ter-Avanesyan,M.D., and Smirnov,V.N. (1995). A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast 11, 1241-1247.

7. Agaphonov,M.O., Romanova,N.V., Trushkina.P.M., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan.M.D. (2002). Aggregation and retention of human urokinase type plasminogen activator in the yeast endoplasmic reticulum. BMC. Mol. Biol. 3, 15.

8. Agaphonov,M.O., Trushkina.P.M., Sohn,J.H., Choi,E.S., Rhee,S.K., and Ter-Avanesyan.M.D. (1999). Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorphaDW. Yeast 15, 541-551.

9. Ahluwalia,J.P., Topp.J.D., Weirather,K., Zimmerman,M., and Stamnes.M. (2001). A role for calcium in stabilizing transport vesicle coats. J. Biol. Chem. 276, 34148-34155.

10. Antebi,A. and Fink,G.R. (1992). The yeast Ca(2+)-ATPase homologue, PMR1, is required for normal Golgi function and localizes in a novel Golgi-like distribution. Mol. Biol. Cell 3, 633-654.

11. Aridor,M., Fish,K.N., Bannykh,S., Weissman.J., Roberts,Т.Н., Lippincott-Schwartz,J., and Balch,W.E. (2001). The Sari GTPase coordinates biosynthetic cargo selection with endoplasmic reticulum export site assembly. J. Cell Biol. 152, 213-229.

12. Aridor,M. and Traub,L.M. (2002). Cargo selection in vesicular transport: the making and breaking of a coat. Traffic. 3, 537-546.

13. Astrup T. and Muellerts S. (1952). Fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochcm. Biophys 40, 346-351.

14. Axelsen,K.B. and Palmgren.M.G. (1998). Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. J. Mol. Evol. 46, 84-101.

15. Axelsen,K.B. and Palmgren,M.G. (2001). Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. Plant Physiol 126, 696-706.

16. Baker,D., Wuestehube,L„ Schekman,R., Botstein,D., and Segev,N. (1990). GTP-binding Yptl protein and Ca2+ function independently in a cell-free protein transport reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 355-359.

17. Ballou C.E. (1990). Isolation, characterisation and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects. In Methods in Ensymology, Academic Press, Inc.), pp. 440-470.

18. Bannykh,S.I., Nishimura,N., and Balch,W.E. (1998). Getting into the Golgi. Trends Cell Biol. 5,21-25.

19. Bannykh,S.I., Rowe,T., and Balch,W.E. (1996). The organization of endoplasmic reticulum export complexes. J. Cell Biol. 135, 19-35.

20. Banta,L.M., Robinson,J.S., Klionsky,D.J., and Emr,S.D. (1988). Organelle assembly in yeast: characterization of yeast mutants defective in vacuolar biogenesis and protein sorting. J. Cell Biol. 107,1369-1383.

21. Barlowe,C. (1997). Coupled ER to Golgi transport reconstituted with purified cytosolic proteins. J. Cell Biol. 139, 1097-1108.

22. Barlowe,C. and Schekman,R. (1993). SEC12 encodes a guanine-nucleotide-exchange factor essential for transport vesicle budding from the ER. Nature 365, 347-349.

23. Barr,F.A., Nakamura,N., and Warren,G. (1998). Mapping the interaction between GRASP65 and GM130, components of a protein complex involved in the stacking of Golgi cisternae. EMBO J. 17, 3258-3268.

24. Barrowman.J., Sacher,M., and Ferro-Novick,S. (2000). TRAPP stably associates with the Golgi and is required for vesicle docking. EMBO J. 19, 862-869.

25. Beams,H.W. and Kessel,R.G. (1968). The Golgi apparatus: structure and function. Int. Rev. Cytol. 23:209-76., 209-276.

26. Becker,B. and Melkonian,M. (1996). The secretory pathway of protists: spatial and functional organization and evolution. Microbiol. Rev. 60, 697-721.

27. Beckers,C.J. and Balch,W.E. (1989). Calcium and GTP: essential components in vesicular trafficking between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. J. Cell Biol. 108, 12451256.

28. Bednarek.S.Y., Ravazzola,M., Hosobuchi,M., Amherdt,M., Perrelet,A., Schekman,R., and Orci,L. (1995). COPI- and COPII-coated vesicles bud directly from the endoplasmic reticulum in yeast. Cell 83, 1183-1196.

29. Belden,W.J. and Barlowe.C. (2001). Role of Erv29p in collecting soluble secretory proteins into ER-derived transport vesicles. Science 294, 1528-1531.

30. Bennett,M.K., Garcia-Arraras,J.E., Elferink,L.A., Peterson,K., Fleming,A.M., Hazuka,C.D., and Scheller,R.H. (1993). The syntaxin family of vesicular transport receptors. Cell 74, 863873.

31. Boehm,J., Letourncur,F., Ballensiefen,W., Ossipov,D., Demolliere,C., and Schmitt,H.D. (1997). Secl2p requires Rerlp for sorting to coatomer (COPI)-coated vesicles and retrieval to the ER. J. Cell Sci. 110,991-1003.

32. Boehm,M. and Bonifacino,J.S. (2001). Adaptins: the final recount. Mol. Biol. Cell 12, 29072920.

33. Bogdanova,A.I., Agaphonov,M.O., and Ter-Avanesyan,M.D. (1995). Plasmid reorganization during integrative transformation in Hansenula polymorpha. Yeast 11, 343353.

34. Bogdanova,A.I., Kustikova,O.S., Agaphonov,M.O., and Ter-Avanesyan,M.D. (1998). Sequences of Saccharomyces cerevisiae 2 microns DNA improving plasmid partitioning in Hansenula polymorpha. Yeast, 15; 14(l),\-9.

35. Booth,C. and Koch,G.L. (1989). Perturbation of cellular calcium induces secretion of luminal ER proteins. Cell 59, 729-737.

36. Brigance,W.T., Barlowe,C., and Graham,T.R. (2000). Organization of the yeast Golgi complex into at least four functionally distinct compartments. Mol. Biol. Cell 11,171-182.

37. Bryant,N.J. and James,D.E. (2001). Vps45p stabilizes the syntaxin homologue Tlg2p and positively regulates SNARE complex formation. EMBO J. 20, 3380-3388.

38. Burgoyne,R.D. and Clague,M.J. (2003). Calcium and calmodulin in membrane fusion. Biochim. Biophys. Acta 1641, 137-143.

39. Burk,S.E., Lytton,J., MacLennan,D.H., and ShuIl,G.E. (1989). cDNA cloning, functional expression, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 264, 18561-18568.

40. Button,D. and Eidsath,A. (1996). Aequorin targeted to the endoplasmic reticulum reveals heterogeneity in luminal Ca++ concentration and reports agonist- or IP3-induced release of Ca++. Mol. Biol. Cell 7,419-434.

41. Cao,X., Ballew,N., and Barlowe,C. (1998). Initial docking of ER-derived vesicles requires Usolp and Yptlp but is independent of SNARE proteins. EMBO J. 17, 2156-2165.

42. Carafoli,E. and Brini,M. (2000). Calcium pumps: structural basis for and mechanism of calcium transmembrane transport. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 152-161.

43. Carlson,M. and Botstein,D. (1982). Two differentially regulated mRNAs with different 5' ends encode secreted with intracellular forms of yeast invertase. Cell 28, 145-154.

44. Carr,C.M., Grote,E., Munson,M., Hughson,F.M., and Novick,P.J. (1999). Scclp binds to SNARE complexes and concentrates at sites of secretion. J. Cell Biol. 146, 333-344.

45. Cosson,P., Demolliere,C., Hennecke,S., Duden,R., and Letoumeur,F. (1996). Delta- and zeta-COP, two coatomer subunits homologous to clathrin-associated proteins, are involved in ER retrieval. EMBO J. 15,1792-1798.

46. Cosson,P. and Letoumeur,F. (1994). Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. Science 263, 1629-1631.ft

47. Cox,J.S., Chapman,R.E., and Walter,P. (1997). The unfolded protein response coordinates the production of endoplasmic reticulum protein and endoplasmic reticulum membrane. Mol. Biol. Cell 8, 1805-1814.

48. Cronin,S.R., Khoury,A., Ferry,D.K., and Hampton,R.Y. (2000). Regulation of HMG-CoA reductase degradation requires the P-type ATPase Codlp/Spflp. J. Cell Biol. 148, 915-924.

49. Cronin,S.R., Rao,R., and Hampton,R.Y. (2002). Codlp/Spflp is a P-type ATPase involved in ER function and Ca2+ homeostasis. J. Cell Biol. 157, 1017-1028.

50. Cunningham,K.W. and Fink,G.R. (1994a). Ca2+ transport in Saccharomyces cerevisiae. J. Exp. Biol. 196:157-66., 157-166.

51. Cunningham,K.W. and Fink,G.R. (1994b). Calcineurin-dependent growth control in Saccharomyces cerevisiae mutants lacking PMC1, a homolog of plasma membrane Ca2+ ATPases. J. Cell Biol. 124, 351-363.

52. Cunningham,K.W. and Fink,G.R. (1996). Calcineurin inhibits FCA7-dependent H+/Ca2+ exchange and induces Ca2+ ATPases in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 16, 22262237.

53. Donaldson,J.G. and Jackson,C.L. (2000). Regulators and effectors of the ARF GTPases. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 475-482.

54. Duden,R., Hosobuchi,M., Hamamoto,S., Winey.M., Byers,B., and Schekman.R. (1994). Yeast beta- and beta'-coat proteins (COP). Two coatomer subunits essential for endoplasmic reticulum-to-Golgi protein traffic. J. Biol. Chem. 269, 24486-24495.

55. Duden,R., Kajikawa,L., Wuestehube,L., and Schekman,R. (1998). epsilon-COP is a structural component of coatomer that functions to stabilize а-СОР. EMBO J. 17, 985-995.

56. Dulubova,I., Sugita,S., Hill,S., Hosaka,M., Fernandez,I., Sudhof,T.C., and Rizo,J. (1999). A conformational switch in syntaxin during exocytosis: role of Muncl8. EMBO J. 18, 43724382.

57. Dumas,J.J., Merithew,E., Sudharshan,E., Rajamani,D., Hayes,S., Lawe,D., Corvera,S., and Lambright,D.G. (2001). Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol. Cell 8, 947-958.

58. Dunn,Т., Gable,К., and Beeler,T. (1994). Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J. Biol. Chem. 269, 7273-7278.

59. Eugster,A., Frigerio,G., DaIe,M., and Duden,R. (2000). COP I domains required for coatomer integrity, and novel interactions with ARF and ARF-GAP. EMBO J. 19, 39053917.

60. Farquhar,M.G. and Palade,G.E. (1998). The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy. Trends Cell Biol. 8, 2-10.

61. Fasshauer.D. (2003). Structural insights into the SNARE mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1641, 87-97.

62. Fasshauer.D., Sutton,R.B., Brunger,A.T., and Jahn,R. (1998). Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95 , 15781-15786.

63. Fernandez,С J. and Warren,G. (1998). In vitro synthesis of sulfated glycosaminoglycans coupled to inter-compartmental Golgi transport. J. Biol. Chem. 273, 19030-19039.

64. Fiedler,K., Veit,M., Stamnes,M.A., and Rothman,J.E. (1996). Bimodal interaction of coatomer with the p24 family of putative cargo receptors. Science 273, 1396-1399.

65. Gascon,S., Neumann,N.P., and LampenJ.O. (1968). Comparative study of the properties of the purified internal and external invertases from yeast. J. Biol. Chem. 243, 1573-1577.

66. Gaynor,E.C. and Emr,S.D. (1997). COPI-independent anterograde transport: cargo-selective ER to Golgi protein transport in yeast COPI mutants. J. Cell Biol. 136, 789-802.

67. Gaynor,E.C., Graham,T.R., and Emr,S.D. (1998). COPI in ER/Golgi and intra-Golgi transport: do yeast COPI mutants point the way? Biochim. Biophys. Acta 1404, 33-51.

68. Gaynor,E.C., te,H.S., Graham,T.R., Aebi,M., and Emr,S.D. (1994). Signal-mediated retrieval of a membrane protein from the Golgi to the ER in yeast. J. Cell Biol. 127, 653665.

69. Gerst,J.E. (2003). SNARE regulators: matchmakers and matchbreakers. Biochim. Biophys. Acta 1641, 99-110.

70. Gething,M.J. and Sambrook,J. (1992). Protein folding in the cell. Nature 355, 33-45.

71. Gietz,R.D., Schiestl.R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast 11, 355360.

72. Gietz,R.D. and Woods,R.A. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350:87-96., 87-96.

73. Gill,D.L., Waldron,R.T., Rys-Sikora,K.E., Ufret-Vincenty,C.A., Graber.M.N., Favre,C.J., and Alfonso,A. (1996). Calcium pools, calcium entry, and cell growth. Biosci. Rep. 16, 139157.

74. Gleeson M.A. and Sudbeiy P.E. (1988). The Methylotrophic Yeasts. Yeast 4, 1-15.

75. Glick,B.S. (2000). Organization of the Golgi apparatus. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 450-456.

76. Greene,В., Liu,S.H., Wilde,A., and Brodsky,F.M. (2000). Complete reconstitution of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control of clathrin self-assembly. Traffic. 1, 69-75.

77. Gunteski-Hamblin,A.M., Clarke,D.M., and Shull,G.E. (1992). Molecular cloning and tissue distribution of alternatively spliced mRNAs encoding possible mammalian homologues of the yeast secretory pathway calcium pump. Biochemistry 31, 7600-7608.

78. Hauri,H.P., Kappeler,F., Andersson,H., and Appenzeller,C. (2000). ERGIC-53 and traffic in the secretory pathway. J. Cell Sci. 113, 587-596.

79. Herbert, D, Phipps P.J., and Strange R.E. Chemical analysis of microbial cells. Methods Microbiol 5,244-249. 1971.

80. Herscovics,A. and Orlean.P. (1993). Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7, 540550.

81. Hollander,I.J. (1987). Plasminogen activators and their potential in therapy. Crit Rev. Biotechnol. 6,253-271.

82. Holroyd,C., Kistner,U., Annaert,W., and Jahn,R. (1999). Fusion of endosomes involved in synaptic vesicle recycling. Mol. Biol. Cell 10, 3035-3044.

83. Hosobuchi,M., Kreis,T., and Schekman,R. (1992). SEC21 is a gene required for ER to Golgi protein transport that encodes a subunit of a yeast coatomer. Nature 360, 603-605.

84. Hsu,S.C., Ting.A.E., Hazuka.C.D., Davanger,S., Kenny,J.W., Kee,Y., and Scheller,R.H. (1996). The mammalian brain rsec6/8 complex. Neuron 17,1209-1219.

85. Huh,W.K., Falvo,J.V., Gerke.L.C., Carroll,A.S., Howson,R.W., Weissman,J.S., and 0'Shea,E.K. (2003). Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature 425, 686-691.

86. Inoue,H., Nojima,H., and Okayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.

87. Iodice,L., Sarnataro,S., and Bonatti,S. (2001). The carboxyl-terminal valine is required for transport of glycoprotein CD8 alpha from the endoplasmic reticulum to the intermediate compartment. J. Biol. Chem. 276,28920-28926.

88. Itin,C., Kappeler,F., Linstedt,A.D., and Hauri,H.P. (1995). A novel endocytosis signal related to the KKXX ER-retrieval signal. EMBO J. 14, 2250-2256.

89. Jackson,С.L. and Casanova,J.E. (2000). Turning on ARF: the Sec7 family of guanine-nucleotide-exchange factors. Trends Cell Biol. 10, 60-67.

90. Jedd,G., Richardson,C., Litt,R., and Segev.N. (1995). The Yptl GTPase is essential for the first two steps of the yeast secretory pathway. J. Cell Biol. 131, 583-590.

91. Kaiser,C.A. and Schekman,R. (1990). Distinct sets of SEC genes govern transport vesicle formation and fusion early in the secretory pathway. Cell 61, 723-733.

92. Kang,H.A., Kim,J.Y., Ko,S.M., Park,C.S., Ryu,D.D., Sohn,J.H., Choi,E.S., and Rhee,S.K. (1998a). Cloning and characterization of the Hansenula polymorpha homologue of the Saccharomyces cerevisiae PMR1 gene. Yeast 14, 1233-1240.

93. Kang,H.A., Sohn,J.H., Choi,E.S., Chung,B.H., Yu,M.H., and Rhee,S.K. (1998b). Glycosylation of human alpha 1-antitrypsin in Saccharomyces cerevisiae and methylotrophic yeasts. Yeast 14, 371-381.

94. Kim,M.D., Kang,H.A., Rhee,S.K., and Seo,J.H. (2001). Effects of methanol on expression of an anticoagulant hirudin in recombinant Hansenula polymorpha. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 27,58-61.

95. Klumperman,J. (2000). Transport between ER and Golgi. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 445449.

96. Kornfeld,R. and Komfeld,S. (1985). Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Arinu. Rev. Biochem. 54:631-64., 631-664.

97. Kushnirov,V.V. (2000) Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 30;16(9), 857-60.

98. Kuranda,M.J. and Robbins,P.W. (1991). Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 19758-19767.

99. Ladinsky,M.S., Mastronarde,D.N., Mcintosh,J.R., Howell,K.E., and Staehelin,L.A. (1999). Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell. J. Cell Biol. 144, 1135-1149.

100. Laemmli,U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

101. Lavoie,C., Paiement,J., Dominguez,M., Roy,L., Dahan,S., Gushue,J.N., and Bergeron,J.J. (1999). Roles for a(2)p24 and COPI in endoplasmic reticulum cargo exit site formation. J. Cell Biol. 146, 285-299.

102. Letourneur,F., Gaynor,E.C., Hennecke,S., Demolliere,C., Duden,R., Emr,S.D., Riezman,H., and Cosson,P. (1994). Coatomer is essential for retrieval of dilysine-tagged proteins to the endoplasmic reticulum. Cell 79, 1199-1207.

103. Lewis,M.J., Nichols,B.J., Prescianotto-Baschong,C., Riezman,H., and Pelham.H.R. (2000). Specific retrieval of the exocytic SNARE Snclp from early yeast endosomes. Mol. Biol. Cell 77,23-38.

104. Lewis,M.J. and Pelham,H.R. (1996). SNARE-mediated retrograde traffic from the Golgi complex to the endoplasmic reticulum. Cell %19;85, 205-215.

105. Lewis,M.J., Rayner,J.C., and Pelham,H.R. (1997). A novel SNARE complex implicated in vesicle fusion with the endoplasmic reticulum. EMBO J. 16, 3017-3024.

106. Lijncn,H.R. and Collen,D. (1991). Strategies for the improvement of thrombolytic agents. Thromb. Haemost. 66, 88-110.

107. Lin,R.C. and Scheller,R.H. (2000). Mechanisms of synaptic vesicle exocytosis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:19-49., 19-49.

108. Locke,E.G., Bonilla,M., Liang,L., Takita,Y., and Cunningham,K.W. (2000). A homolog of voltage-gated Ca24" channels stimulated by depletion of secretory Ca24" in yeast. Mol. Cell Biol. 20, 6686-6694.

109. Lodish,H.F. and Kong,N. (1990). Perturbation of cellular calcium blocks exit of secretory proteins from the rough endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 265, 10893-10899.

110. Lowe,M. and Kreis,T.E. (1995). In vitro assembly and disassembly of coatomer. J. Biol. Chem. 270, 31364-31371.

111. Martinez-Menarguez,J.A., Geuze,H.J., Slot,J.W., and Klumperman,J. (1999). Vesicular tubular clusters between the ER and Golgi mediate concentration of soluble secretory proteins by exclusion from COPI-coated vesicles. Cell 98, 81-90.

112. Matsuoka,K., Orci,L., Amherdt,M., Bednarek,S.Y., Hamamoto,S., Schekman,R., and Yeung,T. (1998). COPII-coated vesicle formation reconstituted with purified coat proteins and chemically defined liposomes. Cell 93, 263-275.

113. Mayer,A., Wickner,W., and Haas,A. (1996). Secl8p (NSF)-driven release of Seel7p (a-SNAP) can precede docking and fusion of yeast vacuoles. Cell 85, 83-94.

114. Meldolesi,J. and Pozzan,T. (1998). The endoplasmic reticulum Ca2+ store: a view from the lumen. Trends Biochem. Sci. 23, 10-14.

115. Mellman,I. and Simons,K. (1992). The Golgi complex: in vitro Veritas? Cell 68, 829-840.

116. Mironov,A.A., Beznoussenko,G.V., Nicoziani,P., Martella,0., Trucco,A„ Kweon,H.S., Di Giandomenico,D., Polishchuk,R.S., Fusella,A., Lupetti,P., Berger,E.G., Geerts,W.J.,

117. Koster.A.J., Burger,K.N., and Luini,A. (2001). Small cargo proteins and large aggregates can traverse the Golgi by a common mechanism without leaving the lumen of cisternae. J. Cell Biol. 155,1225-1238.

118. Misura,K.M., Scheller,R.H., and Weis,W.I. (2000). Three-dimensional structure of the neuronal-Secl-syntaxin la complex. Nature 404, 355-362.

119. Miyawaki,A., Llopis,J., Heim,R., McCaffery,J.M., Adams,J.A., Ikura,M., and Tsien,R.Y. (1997). Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, 882-887.

120. Mollenhauer,H.H. and Morre,D.J. (1991). Perspectives on Golgi apparatus form and function. J. Electron Microsc. Tech. 17, 2-14.

121. Morin-Ganet,M.N., Rambourg,A., Deitz,S.B., Franzusoff,A., and Kepes,F. (2000). Morphogenesis and dynamics of the yeast Golgi apparatus. Traffic. 1, 56-68.

122. Mousavi,S.A., Malerod,L., Berg,Т., and Kjeken,R. (2004). Clathrin-dependent endocytosis. Biochem. J. 377, 1-16.

123. Muniz,M., Nuoffer,C., Hauri,H.P., and Riezman,H. (2000). The Emp24 complex recruits a specific cargo molecule into endoplasmic reticulum-derived vesicles. J. Cell Biol. 148, 925930.

124. Musacchio,A., Smith,C.J., Roseman,A.M., Harrison,S.C., Kirchhausen,T., and Pearse.B.M. (1999). Functional organization of clathrin in coats: combining electron cryomicroscopy and X-ray crystallography. Mol. Cell 3, 761-770.

125. Neer,E.J. and Smith,T.F. (2000). A groovy new structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 960-962.

126. Nicholson,K.L., Munson,M., Miller,R.B., Filip.T.J., Fairman,R., and Hughson,F.M. (1998). Regulation of SNARE complex assembly by an N-terminal domain of the t-SNARE Ssolp. Nat. Struct. Biol. 5, 793-802.

127. Novick,P., Field,C., and Schekman,R. (1980). Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell 21, 205-215.

128. Nufer,0., Guldbrandsen,S., Degen,M., Kappeler,F., Paccaud,J.P., Tani,K., and Hauri,H.P. (2002). Role of cytoplasmic C-terminal amino acids of membrane proteins in ER export. J. Cell Sci. 115,619-628.

129. Odorizzi,G., Babst,M., and Emr,S.D. (1998). Fablp PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell 95, 847-858.

130. Ohno,H., Stewart,J., Fournier,M.C., Bosshart,H., Rhee,I., Miyatake,S., Saito,T., Gallusser,A., Kirchhausen,T., Bonifacino,J.S. (1995). Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins. Science 269, 1872-1875.

131. Orci,L., Glick,B.S., and Rothman,J.E. (1986). A new type of coated vesicular carrier that appears not to contain clathrin: its possible role in protein transport within the Golgi stack. Cel \46, 171-184.

132. Orci,L., Perrelet,A., Ravazzola,M., Amherdt,M., Rothman,J.E., and Schekman,R. (1994). Coatomer-rich endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91, 11924-11928.

133. Orci,L., Stamnes,M., Ravazzola,M., Amherdt,M., Perrelet,A., Sollner,T.H., and Rothman,J.E. (1997). Bidirectional transport by distinct populations of COPI-coated vesicles. Cell 90, 335-349.

134. Packeiser,A.N., Urakov,V.N., Polyakova.Y.A., Shimanova,N.I., Shcherbukhin,V.D., Smirnov,V.N., and Ter-Avanesyan,M.D. (1999). A novel vacuolar protein encoded by SSU21 /MCD4 is involved in cell wall integrity in yeast. Yeast 15,1485-1501.

135. Pavel,J., Harter,C., and Wieland,F.T. (1998). Reversible dissociation of coatomer: functional characterization of a р/5-coat protein subcomplex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 2140-2145.

136. Pearse,B.M. (1976). Clathrin: a unique protein associated with intracellular transfer of membrane by coated vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 73, 1255-1259.

137. Pearse,B.M. and Robinson,M.S. (1990). Clathrin, adaptors, and sorting. Annu. Rev. Cell Biol. 6:151-71., 151-171.

138. Pelham,H.R. (1994). About turn for the COPs? Cell 79, 1125-1127.

139. Pelham,H.R. (1999). SNAREs and the secretory pathway-lessons from yeast. Exp. Cell Res. 247,1-8.

140. Pelham,H.R. (2002). Insights from yeast endosomes. Curr. Opin. Cell Biol. 14,454-462.

141. Pelham,H.R. and Rothman,J.E. (2000). The debate about transport in the Golgi two sides of the same coin? Cell 102, 713-719.

142. Peter,F., Plutner,H., Zhu,H., Kreis.T.E., and Balch.W.E. (1993). p-COP is essential for transport of protein from the endoplasmic reticulum to the Golgi in vitro. J. Cell Biol. 122, 1155-1167.

143. Peters,C. and Mayer,A. (1998). Ca2+/calmodulin signals the completion of docking and triggers a late step of vacuole fusion. Nature 396, 575-580.

144. Pinton,P., Pozzan,T., and Rizzuto,R. (1998). The Golgi apparatus is an inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. EMBO J. 17, 5298-5308.

145. Porat,A. and Elazar,Z. (2000). Regulation of intra-Golgi membrane transport by calcium. J. Biol. Chem. 275, 29233-29237.

146. Powers,J. and Barlowe,C. (2002). Ervl4p directs a transmembrane secretory protein into COPII-coated transport vesicles. Mol. Biol. Cell 13, 880-891.

147. Pozos,T.C., Sekler,I., and Cyert,M.S. (1996). The product of HUM1, a novel yeast gene, is required for vacuolar Ca2+/H+ exchange and is related to mammalian Na+/Ca2+ exchangers. Mol. Cell Biol. 16, 3730-3741.

148. Pringle,J.R., Adams,A.E., Drubin,D.G., and Haarer,B.K. (1991). Immunofluorescence methods for yeast. Methods Enzymol. 194:565-602., 565-602.

149. Pryor,P.R., Mullock,B.M., Bright,N. A., Gray,S.R., and Luzio,J.P. (2000). The role of intraorganellar Ca2+ in late endosome-lysosome heterotypic fusion and in the reformation of lysosomes from hybrid organelles. J. Cell Biol. 149, 1053-1062.

150. Putney,J.W., Jr. (1986). A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium 7, 1-12.

151. Putney,J.W., Jr. (1990). Capacitative calcium entry revisited. Cell Calcium 11, 611-624.

152. Raymond,C.K., Howald-Stevenson,I., Vater,C.A., and Stevens,Т.Н. (1992). Morphological classification of the yeast vacuolar protein sorting mutants: evidence for a prevacuolar compartment in class E vps mutants. Mol. Biol. Cell 3, 1389-1402.

153. Rexach,M.F. and Schekman,R.W. (1991). Distinct biochemical requirements for the budding, targeting, and fusion of ER-derived transport vesicles. J. Cell Biol. 114, 219-229.

154. Rieckmann.P., Albrecht,M., Ehrenreich,H., Weber,Т., and Michel,U. (1995). Semiquantitative analysis of cytokine gene expression in blood and cerebrospinal fluid cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction. Res. Exp. Med. (Berl) 195,17-29.

155. Rothman,J .E. and Warren, G. (1994). Implications of the SNARE hypothesis for intracellular membrane topology and dynamics. Curr. Biol. 4, 220-233.

156. Rothman,J.E. and Wieland,F.T. (1996). Protein sorting by transport vesicles. Science 272, 227-234.Щ

157. Rudolph, H.K., Antebi,A., Fink,G.R„ Buckley,C.M., Dorman,T.E., LeVitre,J., Davidow,L.S., Mao,J.I., and Moir,D.T. (1989). The yeast secretory pathway is perturbed by mutations in PMR1, a member of a Ca2+ ATPase family. Cell 58, 133-145.

158. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press.

159. Sambrook,J.F. (1990). The involvement of calcium in transport of secretory proteins from the endoplasmic reticulum. Cell 20;61, 197-199.

160. Sapperstein,S.K., Walter,D.M., Grosvenor,A.R., Heuser,J.E., and Waters,M.G. (1995). pi 15 is a general vesicular transport factor related to the yeast endoplasmic reticulum to Golgi transport factor Usolp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 522-526.

161. Sato,Т.К., Darsow.T., and Emr,S.D. (1998). Vam7p, a SNAP-25-like molecule, and Vam3p, a syntaxin homolog, function together in yeast vacuolar protein trafficking. Mol. Cell Biol. 18, 5308-5319.

162. Scarborough,G.A. (1999). Structure and function of the P-type ATPases. Curr. Opin. Cell Biol. 77,517-522.

163. Schekman,R. and Orci,L. (1996). Coat proteins and vesicle budding. Science 271, 15261533.

164. Schindler,R., Itin,C., Zerial,M., Lottspeich,F., and Hauri,H.P. (1993). ERGIC-53, a membrane protein of the ER-Golgi intermediate compartment, carries an ER retention motif. Eur. J. Cell Biol. 61, 1-9.

165. Schmid,S.L. (1997). Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process. Annu. Rev. Biochem. 66:511-48., 511-548.

166. Schroder-Kohne,S., Letoumeur,F., and Riezman,H. (1998). a-COP can discriminate between distinct, functional di-lysine signals in vitro and regulates access into retrograde transport. J. Cell Sci. Ill, 3459-3470.

167. Schroder,S., Schimmoller,F., Singer-Kruger,B., and Riezman,H. (1995). The Golgi-localization of yeast Emp47p depends on its di-lysine motif but is not affected by the ret 1-1 mutation in a-COP. J. Cell Biol. 131, 895-912.

168. Schwaninger.R., Beckers,C.J., and Balch,W.E. (1991). Sequential transport of protein between the endoplasmic reticulum and successive Golgi compartments in semi-intact cells. J. Biol. Chem. 266, 13055-13063.

169. Seals,D.F., Eitzen,G., Margolis,N., Wickner.W.T., and Price,A. (2000). A Ypt/Rab effector complex containing the Seel homolog Vps33p is required for homotypic vacuole fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 9402-9407.

170. Segev,N. (1991). Mediation of the attachment or fusion step in vesicular transport by the GTP-binding Yptl protein. Science 252, 1553-1556.

171. Shaywitz,D.A., Espenshade,P.J., Gimeno,R.E., and Kaiser,C.A. (1997). COPII subunit interactions in the assembly of the vesicle coat. J. Biol. Chem. 272, 25413-25416.

172. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press).

173. Short,B. and Barr,F.A. (2002). Membrane traffic: exocyst III makes a family. Curr. Biol. 12, R18-R20.

174. Sogaard,M., Tani,K., Ye,R.R., Geromanos,S., Tempst,P., Kirchhausen,T., Rothman,J.E., and Sollner,T. (1994). A rab protein is required for the assembly of SNARE complexes in the docking of transport vesicles. Cell 78, 937-948.

175. Sohn,J.H., Choi,E.S., Kim,C.H., Agaphonov,M.O., Ter-Avanesyan,M.D., Rhee,J.S., and Rhee,S.K. (1996). A novel autonomously replicating sequence (ARS) for multiple integration in the yeast HansemdapolymorphaDL-l. J. Bacteriol. 178, 4420-4428.

176. Sonnichsen.B., Lowe,M., Levine,T., Jamsa,E., Dirac-Svejstrup,B., and Warren,G. (1998). A role for giantin in docking COPI vesicles to Golgi membranes. J. Cell Biol. 140, 1013-1021.

177. Sorin,A., Rosas,G., and Rao,R. (1997). PMR1, a Ca2+-ATPase in yeast Golgi, has properties distinct from sarco/endoplasmic reticulum and plasma membrane calcium pumps. J. Biol. Chem. 272, 9895-9901.

178. Stenbeck,G., Schreiner,R., Herrmann,D., Auerbach,S., Lottspeich,F., Rothman,J.E., and Wieland,F.T. (1992). y-COP, a coat subunit of non-clathrin-coated vesicles with homology to Sec21p. FEBS Lett. 314 , 195-198.

179. Strayle,J., Pozzan.T., and Rudolph,H-K. (1999). Steady-state free Ca2+ in the yeast endoplasmic reticulum reaches only 10 цМ and is mainly controlled by the secretory pathway pump Pmrlp. EMBO J. 18, 4733-4743.

180. Sutterlin,C., Doering,T.L., Schimmoller,F., Schroder,S., and Riezman,H. (1997). Specific requirements for the ER to Golgi transport of GPI-anchored proteins in yeast. J. Cell Sci. 110, 2703-2714.

181. Suzuki,C. and Shimma,Y.I. (1999). P-type ATPase spfl mutants show a novel resistance mechanism for the killer toxin SMKT. Mol. Microbiol. 32, 813-823.

182. TerBush,D.R., Maurice,Т., Roth,D., and Novick,P. (1996). The Exocyst is a multiprotein complex required for exocytosis in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15, 6483-6494.

183. Todorow,Z., Spang,A., Carmack,E., Yates,J., and Schekman,R. (2000). Active recycling of yeast Golgi mannosyltransferase complexes through the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97,13643-13648.

184. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 76, 4350-4354.

185. Vida,T.A. and Emr,S.D. (1995). A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J. Cell Biol. 128, 779-792.

186. Vieira,J. and Messing,J. (1991). New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100:189-94., 189-194.

187. Voos,W. and Stevens,Т.Н. (1998). Retrieval of resident late-Golgi membrane proteins from the prevacuolar compartment of Saccharomyces cerevisiae is dependent on the function of Grdl9p. J. Cell Biol. 140, 577-590.

188. Wada,Y., Ohsumi,Y., and Anraku,Y. (1992). Genes for directing vacuolar morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. I. Isolation and characterization of two classes of vam mutants. J. Biol. Chem. 267, 18665-18670.

189. Waters,M.G. and Hughson,F.M. (2000). Membrane tethering and fusion in the secretory and endocytic pathways. Traffic. 1, 588-597.

190. Weimbs,T., Mostov,K., Low,S.H., and Hofmann,K. (1998). A model for structural similarity between different SNARE complexes based on sequence relationships. Trends Cell Biol. 8, 260-262.

191. Whyte,J.R. and Munro,S. (2001). The Sec34p/Sec35p Golgi transport complex is related to the exocyst, defining a family of complexes involved in multiple steps of membrane traffic. Dev. Cell 1, 527-537.

192. Whyte,J.R. and Munro,S. (2002). Vesicle tethering complexes in membrane traffic. J. Cell Sci. 115,2627-2637.

193. Wickner,W. and Haas,A. (2000). Yeast homotypic vacuole fusion: a window on organelle trafficking mcchanisms. Annu. Rev. Biochem. 69:247-75., 247-275.

194. Wileman,T., Kane,L.P., Carson,G.R., and Terhorst,C. (1991). Depletion of cellular calcium accelerates protein degradation in the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 266, 45004507.

195. Wuestehube,L.J., Duden,R., Eun,A., Hamamoto,S., Korn.P., Ram,R., and Schekman,R. (1996). New mutants of Saccharomyces cerevisiae affected in the transport of proteins from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex. Genetics 142, 393-406.

196. Yamakawa,H., Seog.D.H., Yoda.K., Yamasaki,M., and Wakabayashi,T. (1996). Usol protein is a dimer with two globular heads and a long coiled-coil tail. J. Struct. Biol. 116, 356-365.1381. БЛАГОДАРНОСТИ

197. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю М.Д.Тер-Аванесяну за проявленный интерес к данной работе, ценные советы при проведении экспериментов и помощь при обсуждении результатов.

Информация о работе

Чеченова, Мария Барасбиевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы