Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами

Трофимов, Антон Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами"

Трофимов Антон Андреевич

СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ ВОСЬМИГЕМОВОЙ ЦИТОХРОМ С НИТРИТРЕДУКТАЗЫ ИЗ THIOALKAUVIBRIOJÍlTRATIREDUCENS С СУБСТРАТАМИ, ПРОДУКТАМИ И ИНГИБИТОРАМИ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2011

2 А О7?

• ¿и ц

4855970

Работа выполнена в Лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

кандидат физико-математических наук K.M. Поляков

доктор химических наук, профессор В.О. Попов

доктор физико-математических наук В.Р. Мелик-Адамян доктор химических наук, профессор Т.В. Демидкина

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

GH-OD

tv—■'

2011 г. на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. л

Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится

«и»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Выяснение принципов функционирования ферментов на основе знания их пространственной структуры является одной из основых задач молекулярной биологии. На сегодняшний день надежную информацию о структурно-функциональных закономерностях ферментативных реакций предоставляет метод рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением, который позволяет изучать связывание лигандов в активном центре фермента.

Объектом настоящей работы является цитохром с нитритредуктаза. Данные ферменты катализируют восстановление нитрита и гидроксиламина до аммония и сульфита до сульфида.

Ы02- + 8Н+ + бе = 1МН4+ + 2Н20

ЫН2ОН + ЗН+ + 2е = ЫН/ + Н20

НБОз" + 6Н+ + бе = НБ" + ЗН20 Цитохром с нитритредуктазы выполняют важную функцию в биологическом цикле азота, катализируя последнюю стадию анаэробного дыхательного процесса аммонификации нитрита.

На сегодняшний день наиболее изученной группой ферментов данного класса являются пятигемовые цитохром с нитритредуктазы бактерий (ША). Определены кристаллические структуры 1Чг1А из различных бактерий, в том числе структуры комплексов с субстратами и ингибиторами. На основании структурных данных и квантовохимических расчетов предложен механизм восстановления нитрита для этих ферментов.

Из галоалкалофильной сероокисляющей у-пр°теобактерии Шоа1ка1МЬпо п'ЛгаШебисепз была выделена восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза (ТуМР). Фермент имеет молекулярную массу 64 кДа. Нитритредуктазная активность ТуЬШ существенно выше активности 1\1г1А. Решены структуры свободной формы ТуЬШ и комплексов фермента с нитритом и азидом, характеризующиеся неполной заселенностью лиганда. Мономер ТуМЯ состоит из двух доменов - уникального М-концевого и каталитического, который похож на мономер ША. Активные центры ТуМК и ША устроены аналогичным образом. Важным отличием ТуМР от ША является наличие ковалентной связи между СЕ2-атомом каталитического остатка ТугЗОЗ и атомом серы соседнего остатка СуэЗОб, место которого в структуре ГМА занимает остаток фенилаланина.

В данной работе проведены систематические структурные исследования связывания субстратов, продуктов и ингибиторов в активном центре ТуМЯ и ряд кинетических экспериментов, что необходимо для понимания принципов функционирования фермента. Работа важна как с точки зрения изучения представителя сравнительно мало охарактеризованной группы восьмигемовых цитохром с нитритредуктаз, так и с точки зрения изучения свойств ферментов класса цит<

нитритредуктаз.

Цель работы. Целью данной работы является структурно-функциональное исследование TvNiR на основе рентгеноструктурных данных. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получение кристаллов комплексов TvNiR с субстратами и ингибиторами.

2. Определение пространственных структур комплексов TvNiR методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.

3. Измерение активностей TvNiR по отношению к нитриту и сульфиту.

4. Сравнительный анализ структур комплексов TvNiR и NrfA.

Научная новизна. Определены структуры комплексов TvNiR с субстратами нитритом, сульфитом и гидроксиламином. В структуре комплекса TvNiR с гидроксиламином положение молекулы NH2OH в активном центре отличается от ее положения в структуре комплекса NrfA. Комплекс TvNiR с сульфит-ионом получен восстановлением кристаллов белка дитионитом натрия. Впервые для цитохром с нитритредуктаз определены структуры комплексов с продуктом сульфидом и ингибиторами цианидом и фосфатом. Определена структура модифицированной формы белка (TvNiRb), в которой СЕ1-атом каталитического остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с CG-атомом остатка Gln360. Определены структуры комплексов TvNiRb с сульфитом, гидроксиламином и фосфатом. Форма TvNiRb получена в результате сокристаллизации нативного TvNiR с гидроксиламином. Количественно охарактеризованы нитрит- и сульфитредуктазные активности TvNiR и TvNiRb. Обсуждается влияние связей Tyr-Cys и Tyr-GIn на катализ. Личный вклад автора. Участие в выделении и очистке белка. Получение кристаллов комплексов TvNiR и TvNiRb, участие в сборе дифракционных данных и их обработка. Уточнение структур и их анализ. Измерение активностей TvNiR и TvNiRb.

Практическая значимость работы. Структуры комплексов TvNiR с целыми заселенностями лигандов предоставляют надежную информацию о связывании лигандов в активном центре фермента, которая может быть использована в квантовохимических расчетах для более глубокого изучения механизма действия TvNiR и родственных ферментов. Предложенные методики для определения активностей фермента дают более надежные результаты, чем используемые ранее.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007) (Москва, 2007), Recent Developments in Macromolecular Crystallography (India, Pune, 2008). Публикации. По метериалам настоящей диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов

и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 99 ссылок. Работа изложена на 87 страницах, содержит 48 рисунков и 9 таблиц.

ВВЕДЕНИЕ

Обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Суммирована структурная информация по TvNiR, NrfA и комплексам NrfAc субстратами, ингибиторами и физиологическими донорами электронов - NrfH и NrfB. Приводятся данные по кинетике для TvNiR и NrfA. Рассмотрен механизм восстановления нитрита для NrfA. Приведены структурные особенности связывания лигандов в активном центре сирогем-содержащей сульфитредуктазы из Е. coli и механизм восстановления сульфита для этого фермента. Суммирована информация по посттрансляционным ковалентным связям между боковыми цепями остатка тирозина и соседнего аминокислотного остатка в активных центрах ферментов. Обсуждается влияние таких модификаций на каталитическую реакцию.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объекты исследования

Объекты исследования — восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens (TvNiR) и ее модифицированная форма (TvNiRb). Белок экспрессировали, выделяли и очищали сотрудники Лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

2. Кристаллизация

Кристаллизацию фермента проводили методом висячей капли при комнатной температуре или при 4°С. Капли создавали из равных количеств раствора белка и противораствора. Раствор белка содержал 9-15 мг/мл TvNiR и либо 0.1 М К-фосфатный буфер (рН 7.0), либо 0.05 М Tris-HCI (рН 8.7, 8.0, 7.2). Противораствор содержал либо 0.2 М тринатриевую соль лимонной кислоты, 0.1 М Tris-HCI, 30 % v/v PEG 400 (рН 8.7), либо 0.2 М ацетат аммония, 0.1 М тринатриевую соль лимонной кислоты, 30 % 2-метил-2,4-пентандиол (рН 6.4), либо 0.09 М HEPES/NaOH, 1.26 М тринатриевую соль лимонной кислоты, 10 % v/v глицерин (рН 7.8) (условия Сгуо 13, Сгуо 26 и Сгуо 38 Hampton Research Crystal Screen Сгуо, соответственно). Время роста кристаллов составляло 3-14 дней.

В таблицах 1 и 2 приведена информация по получению комплексов TvNiR сокристаллизацией и выдерживанием, соответственно. В случае получения комплексов сокристаллизацией противораствор содержал необходимый лиганд (кроме получения фосфатных комплексов). В случае получения комплексов выдерживанием необходимые компоненты

растворяли в соответствующем противорастворе, а затем кристалл помещали в полученный раствор.

Таблица 1. Условия получения комплексов ТуМИ сокристаллизацией. Указана концентрация необходимого компонента в капле.

Комплекс

ТуЫ^+РО.

ТуШ+Б

Ту^Ь+Н20

Препарат белка

9.3 мг/мл ТуМЯ, 0.1 М К! фосфатный буфер, ' рН 7.0

11.6 мг/мл TvN¡Rl 0.02 М тетраборат натрия, 0.05 М Тпэ-НС1, рН 8.0

ТУШЬ+Р04

ТуГШЬ+ЭОз ТуМРЬ+ЫНгОН

Противораствор, исходный рН

Сгуо 26, 6.4

Сгуо 26, 6.4 Сгуо 38, 7.8

I Необходимый компонент, мМ

КН2Р04 (из препарата белка), 50

№N02, 50 N32$, 50

9.3 мг/мл ТуГШЬ, 0.1 МК-

фосфатный буфер, рН 7.0

10.0 мг/мл ТуМЯЬ*, 0.05 М Тпв-НС!, рН 7.2

Сгуо 13, 8.7 МН2ОН, 50

КН2Р04 (из

Сгуо 13, 8.7 препарата белка),

Сгуо 26, 6.4 МагЭОз, 50

Сгуо 38, 7.8 ЖгОИ, 50

* Белок был переведен из К-фосфатного буфера в Тпэ-буфер.

Кристаллы комплексов Ъ/МР+Э и Т\/1\ПКЬ+50з росли в анаэробных условиях. Кристаллы ТуЬШЬ+Н20 были получены сокристаллизацией немодифицированного ТуМИ с гидроксиламином. Таблица 2. Условия получения комплексов выдерживанием.

Комплекс

ТуШ+ЫН2ОН

ТуШ+ЭОэ

ТУ№Я+803(?)

ТчЫМ+СЫ

^ЫШ+РО^Оз

Ту№1*+Р04+Еи

ТуШ+Р04+СМ

ТуГШЬ+303(МУ)

Препарат белка

14.5 мг/мл ТуМЯ, 0.02 М тетраборат натрия, 0.05 М Тпэ-НС1, рН 8.7

9.3 мг/мл ^N¡13, 0.1 М К-

фосфатный буфер, рН 7.0

9.3 мг/мл Ту№№, 0.1 М К-

фосфатный буфер, рН 7.0

Противораствор, Необходимый Время вы-

исходный рН компонент, мМ держивания

Сгуо 13, 8.7 МН2ОН, 100 30 мин

Сгуо 13, 8.7 №25204, 100 10 мин

Сгуо 13, 8.7 N82503, Ю0 1 час

Сгуо 13, 8.7 кем, 100 1 час

Сгуо 38, 7.8 Ма23204,100 10 мин

Сгуо 26, 6.4 ЕиС12* 15 мин

Сгуо 38, 7.8 КСЫ, 100 7 часов

№2503, 0.08

Сгуо 13, 8.7 ЫаВН„, 0.13 10 мин

МУ, 0.02

* Раствор для восстановления кристаллов ТуЬШ ионами Еи(И) был приготовлен разбавлением 7 цл насыщенного водного раствора ЕиС12 40 ^л противораствора Сгуо 26.

Дитионит натрия, боргидрид натрия и хлорид европия (II) восстанавливают ТуЫК в растворе, что доказано наличием характеристических пиков гемов на спектре поглощения белка (525 и 554 нм). При получении комплекса ТуЫКЬ+50з(М\/) синяя окраска метилвиологена (МУ) доказывала наличие восстановительной среды в течение всего времени выдерживания.

3. Сбор и обработка данных, уточнение структур

Дифракционные данные были собраны на станции К4.4 Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий, на станциях Х11, Х13 и В\/У7В синхротрона РЕБУ в Гамбурге и на станции £31.41X11 синхротрона ЗРппд-8 в Киото с использованием ССЭ-детекторов при охлаждении до 100К. Статистические характеристики наборов дифракционных данных представлены в таблице 3.

Таблица 3. Статистические характеристики наборов дифракционных данных и

уточнения структур.

Структура Разрешение, A Число измеренных/уникальных рефлексов Полнота, % Rmeas I/C7(l) Rfactor / Rfree RMSD длин валентных связей, А Средневзвешенная ошибка координат атомов (DPI), А Станция Код PDB

TvNiR+P04 1.79 960895/ 226620 97.8 0.096 10.0 0.159/ 0.172 0.019 0.082 К4.4 3GM6

TvNiRb+P04 1.45 3195990/ 464187 99.9 0.110 11.1 0.128/ 0.144 0.017 0.035 SPring-8 BL41XU

TvNiR+PO<+Eu 2.00 562369/ 154540 92.9 0.080 12.8 0.167/ 0.188 0.020 0.104 К4.4

TvNiR+POi+CN 1.76 1329081/ 229152 99.2 0.078 19.2 0.165/ 0.179 0.019 0.070 DESY Х13

TvNiR+CN 1.55 1716259/ 350257 99.9 0.047 40.1 0.148/ 0.162 0.020 0.044 DESY Х11 3MMO

TvNiR+S 1.79 1421157/ 225618 99.9 0.102 13.9 0.156/ 0.176 0.020 0.068 SPring-8 BL41XU

TvNiR+SOj 1.40 2620951/ 468027 99.7 0.055 33.1 0.126/ 0.140 0.018 0.032 DESY BW7B 3F03

TvNiRb+S03 1.80 666945/ 221170 96.6 0.066 15.1 0.151/ 0.168 0.018 0.065 DESY X13 3LGQ

TvNiR+POi+SOj 1.67 1443574/ 248892 96.6 0.074 18.6 0.172/ 0.192 0.019 0.065 DESY X13

TvNiRb+S03(MV) 1.95 1273148/ 171512 99.7 0.144 12.4 0.161/ 0.183 0.018 0.087 K4.4 3LG1

TvNiR+S03(?) 2.00 915373/ 157823 97.6 0.072 21.0 0.154/ 0.174 0.012 0.047 DESY BW7B 3F29

TvNiR+N02 1.83 2710187/ 208153 99.8 0.120 20.0 0.139/ 0.158 0.020 0.065 K4.4

TvNiR+NH2OH 1.65 1633825/ 281694 99.9 0.058 44.0 0.139/ 0.156 0.019 0.050 DESY X11 30WM

TvNiRb+NH2OH 1.79 707572/ 223578 97.2 0.071 12.6 0.157/ 0.175 0.019 0.070 DESY X13

TvNiRb+H20 2.20 512662/ 117683 99.8 0.161 7.6 0.178/ 0.196 0.019 0.126 K4.4

Дифракционные данные для структур ТуМК+ЖгОН, Ту|\Ш+50з, ТуМИ+БОз*?), ТуМК+СМ, ТуМЯ+Р04+СЫ и ТуМК+Р04+803 были обработаны по программам ОЕЫгО и 5СА1-ЕРАСК. Дифракционные данные для всех остальных структур были обработаны по программам ХйЭ и

XSCALE. Группа симметрии кристаллов TvNiR - Р2Д Все кристаллы были изоморфны с параметром элементарной ячейки около 194 А. В качестве исходной модели при уточнении структур комплексов использовали структуру свободного TvNiR [PDB-код 20Т4]. Уточнение проводили по программе REFMAC5, минимизируя одновременно рентгеновскую и геометрическую части функционала. В случае структур комплексов TvNiR+S03 и TvNiRb+P04 температурные параметры уточняли анизотропно для всех неводородных атомов. В случае комплекса TvNiR+CN анизотропное уточнение было применено только для ионов железа гемов. Использовали установленное по умолчанию ограничение на сферичность тензора анизотропии. Остальные структуры уточняли в изотропном приближении. Вклад атомов водорода в рассеивание учитывался для структур, определенных с разрешением лучше, чем 1.8 А. Ручную корректировку моделей в соответствии с картами электронной плотности проводили в программе COOT. Статистические характеристики уточнения структур приведены в таблице 3.

4. Измерение активности

Нитритредуктазная активность

Нитритредуктазную активность TvNiR определяли двумя способами — по скорости расходования нитрита и по скорости окисления метилвиологена (MV). В первом случае каталитическую реакцию проводили в герметично закрытом пузырьке при температуре 30°С в 0.05 М К-фосфатном буфере (рН 7.0). В качестве восстановителя использовали либо дитионит натрия, либо MV, предварительно восстановленный хлоридом европия (II). В зависимости от метода реакцию инициировали либо добавлением дитионита, либо добавлением нитрита натрия. Концентрацию нитрита в образцах реакционной смеси измеряли по образованию окрашенного диазосоединения (нитрит + NEDA + сульфаниламид).

В случае определения активности TvNiR по скорости окисления MV каталитическую реакцию восстановления нитрита проводили в анаэробном боксе при остаточном давлении кислорода не более 2 ррт и температуре 20°С в 0.05 М К-фосфатном буфере (рН 7.0). В качестве восстановителя использовали MV, предварительно восстановленный хлоридом европия (II). Реакцию инициировали добавлением нитрита натрия. Начальная концентрация нитрита натрия - 91 рМ, что примерно равно значению Км TvNiR для нитрита. Скорость окисления MV измеряли спектрофотометрически по уменьшению поглощения реакционной смеси при Л = 601 нм. В данных условиях скорость окисления MV нитритом значительно ниже скорости его окисления ферментом.

Сульфитредуктазная активность

Каталитическую реакцию восстановления сульфита проводили в анаэробном боксе при температуре 20°С в 0.05 М К-фосфатном буфере. В

качестве донора электронов использовали MV, предварительно восстановленный хлоридом европия (II). Реакцию инициировали добавлением сульфита натрия.

Сульфитредуктазную активность TvNiR определяли двумя способами. Первый - по скорости окисления MV, измеряемой спектрофотометрически по уменьшению поглощения реакционной смеси при Л = 601 нм. Второй - по скорости образования продукта реакции - сульфид-иона, при этом реакцию останавливали добавлением концентрированного раствора гидроксида натрия, а концентрацию сульфид-иона измеряли по образованию метиленового синего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Общая характеристика структур TvNiR

В независимой части элементарной ячейки находятся два мономера TvNiR (А и В). Мономеры TvNiR образуют гексамер с точечной группой симметрии 32. Ось симметрии третьего порядка гексамера является кристаллографической и связывает между собой три мономера А и три мономера В. Кристаллографически независимые мономеры в гексамере связаны между собой некристаллографическими поворотными осями второго порядка.

Различия структур TvNiR и TvNiRb, связанные с разными условиями роста кристаллов и выдерживанием кристаллов в растворах, содержащих дополнительные компоненты, незначительны (RMSD при совмещении мономеров по эквивалентным Са-атомам составляет 0.2-0.5 А) и носят локальный характер. Максимальные отклонения Са-атомов (1-2 А) наблюдаются для остатков, участвующих в контакте гексамер-гексамер.

Активный центр TvNiR образуют остатки His361, ТугЗОЗ и Arg131 и гем 4, который координирован NH2-rpynnon остатка Lys188 и имеет свободную для взаимодействия с субстратом шестую координационную позицию (например рис. 2, слева). СЕ2-атом остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с атомом серы остатка Cys305. Остаток Gln360 участвует в образовании полости активного центра и координирует ион кальция. В структуре свободной формы TvNiR данный остаток характеризуется двумя конформациями боковой цепи. Одна из конформаций - такая же, как в других структурах TvNiR. Во второй конформации боковая цепь остатка глутамина не участвует в координации иона кальция и направлена в сторону гема 4. На рисунке 1 слева показана модель активного центра для структуры TvNiR+S03 с электронной плотностью для остатков ТугЗОЗ, Cys305 и Gln360.

В структурах TvNiRb обнаружена необычная ковалентная связь между боковыми цепями остатков ТугЗОЗ и Gln360. Надежность такой интерпретации структур TvNiRb очевидна из рисунка 1 справа, где представлена модель активного центра структуры TvNiRb+P04 с электронной плотностью для остатков ТугЗОЗ, Cys305 и Gln360. Связь между sp2-гибридизованным СЕ1 -атомом остатка тирозина и зр3-гибридизованным CG-

атомом остатка глутамина отклонена от плоскости ароматического кольца на ~ 19°. Во всех структурах TvNiRb боковая цепь остатка ТугЗОЗ расположена одинаково. Она значительно отклонена от ее положения в структуре свободной формы TvNiR. При этом кольцо тирозина поворачивается так, что CG-атом почти не меняет своего положения и максимально смещаются СЕ1-и ОН-атомы тирозина (0.5-0.8 А). В структурах TvNiRb боковая цепь остатка Gln360 также координирует ион кальция, хотя ее положение отличается от положения боковой цепи этого остатка в структурах немодифицированного TvNiR.

В структурах TvNiRb+P04, TvNiRb+S03(MV) и TvNiRb+NH2OH конформация остатка Lys188 отличается от его конформации в структурах немодифицированного TvNiR (например рис. 2). СЕ-Атом остатка лизина здесь смещен на 0.8-1 А относительно его позиции в TvNiR при том, что позиция NZ-атома лизина здесь та же и расстояние Fe-NZ составляет около 1.9 А.

Вблизи дистальной координационной позиции гема 4 может находиться пять молекул воды, способных образовывать водородные связи с координированным лигандом. Молекула воды W1 связана с карбоксильными группами гема, молекула W2 находится над координационной позицией, молекулы W3, W4 и W5 расположены у входа в активный центр. Молекула W5 образует водородную связь с гидроксильной группой остатка ТугЗОЗ, молекулы W3 и W4 взаимодействуют с гуанидиновой группой остатка Агд131 (например рис. 3, слева).

В структуре TvNiR помимо каналов для транспорта субстрата и продукта, которые для всех цитохром с нитритредуктаз устроены сходным образом, имеется дополнительный канал, ведущий от поверхности белка к активному центру. В канале расположена цепочка из пяти молекул воды, по которой возможна передача протонов с поверхности белка молекулам воды у входа в активный центр и гидроксильной группе остатка ТугЗОЗ. В структуре NrfA из W. succinogenes данный канал не выходит к поверхности белка из-за близкого расположения здесь гидрофобных боковых цепей остатков Туг255 и Leu273, положения которых в структуре TvNiR занимают остатки Ala339 и Рго357, соответственно.

2. Связывание лигандов в активном центре фермента

Связывание фосфат-иона

Были определены четыре структуры, содержащие фосфат-ион в активном центре фермента - TvNiR+P04, TvNiRb+P04, TvNiR+P04+Eu и TvNiR+P04+CN (таблицы 1 и 2).

Фосфат-ион связывается в активном центре TvNiR, образуя семь водородных связей (рис. 2). 02-Атом фосфат-иона координирован ионом железа гема 4 и образует водородную связь с NE2-aTOMOM остатка His361; ОЗ-атом образует водородные связи с гидроксилом остатка ТугЗОЗ и с амидной группой остатка Gln360; 01-атом имеет две водородные связи - с

гуанидиновой группой остатка Агд131 и с молекулой воды W4; 04-атом образует водородные связи с двумя молекулами воды - W1 и W6.

В структуре ТуМРЬ+РОд электронная плотность лиганда в дистальной координационной позиции была интерпретирована фосфат-ионом и молекулой воды с заселенностями У2. Вблизи 04-атома фосфата была помещена вторая молекула воды с заселенностью аналогичная молекуле УЧ2 в свободной форме фермента (рис. 2, справа).

Фосфат-ион в активном центре ТуМИ связан аналогично сульфат-иону в структуре комплекса ЬМА из I//. висс/поденев. Различия в расположении дистального лиганда и уменьшение длин контактов для лиганда в активном центре Ту№Я при сравнении с активным центром ША вызваны различными положениями боковой цепи каталитического остатка тирозина в данных структурах из-за наличия связи Туг-Суэ в активном центре ТуЬШ.

При восстановлении комплекса ТуМК+РС^ ионами Еи(И) фосфат-ион остается в активном центре фермента (структура Ту№Р+Р04+Еи), причем его положение и положение каталитических остатков не изменяются. Фосфат-ион лишь частично замещается на цианид при 7-часовом выдерживании кристаллов комплекса фермента в 0.1 М растворе КСМ (рН 7.8, структура ТуЬШ+Р04+СМ).

Устойчивость фосфатного комплекса ТуГ-Ш объясняется способностью фосфат-иона (при рН 7.8 находится преимущественно в формах НР042" и Н2Р04") образовывать водородные связи в активном центре фермента. Выдерживание кристаллов сульфатного комплекса ША в растворе со значением рН 7.5 приводит к полному замещению сульфат-иона в активных центрах фермента на молекулу воды, что, видимо, связано с кислотной диссоциацией имидазольной группы каталитического остатка гистидина. Комплексы ТуЬШ с фосфат-ионом были получены при трех значениях рН -6.4, 7.8 и 8.7. При рН 6.4 фосфат-ион связался во всех активных центрах ТуЬШ, при рН 8.7 - в половине активных центров.

Связывание цианид-иона

Комплекс ТуМЯ+СЫ с целой заселенностью лиганда получен выдерживанием кристалла свободной формы фермента в 0.1 М растворе КС1\|. Цианид-ион в активном центре комплекса связан атомом углерода с ионом железа гема и почти перпендикулярен к пиррол-пирролиновой плоскости гема (рис. 3, слева). Угол Ре-С-Ы составляет 171°, что близко значениям данного угла для комплексов гем-содержащих белков с цианидом. Атом азота цианида образует водородные связи с гидроксильной группой остатка ТугЗОЗ и с молекулой воды \И2. Расстояние между атомом азота цианида и МЕ2-атомом остатка Шз361 составляет около 3.1 А. Видимо, водородной связи между этими атомами не образуется из-за депротонированного состояния имидазольной группы остатка гистидина при рН 8.7.

Рис. 1. Активные центры ТуМЯ (слева, комплекс с сульфит-ионом) и ТуМЯЬ (справа, комплекс с фосфат-ионом). Показана электронная плотность 2Р0-РС (1 ст).

Рис. 2. Связывание фосфат-иона в активных центрах ТуМЯ (слева) и ТуМЯЬ (справа). Координационные связи и водородные связи для фосфат-иона показаны пунктирными линиями.

Рис. 3. Связывание цианид-иона (слева) и сульфид-иона (справа) в активном центре ТуМЯ. Координационные связи и водородные связи для лиганда показаны пунктирными линиями.

I Рис. 4. Связывание сульфит-иона в активных центрах ТуМК (слева) и Ту1\Н№ (справа). Координационные связи и водородные связи для сульфит-иона показаны пунктирными линиями.

Рис. 5. Связывание нитрит-иона в активном центре ТуМР. Координационные связи и водородные связи для нитрит-иона показаны пунктирными линиями.

Рис. 6. Связывание молекулы гидроксиламина в структурах комплексов ТуМР+ЫНгОН (слева) и Ту^РЬ+ЫИгОН (справа). Координационные связи и водородные связи для молекулы гидроксиламина показаны пунктирными линиями.

Комплекс ТуМИ с цианид-ионом также был получен в других условиях (комплекс ТуМ^+Р04+СМ). Цианид-ион в соответствующей структуре связан аналогичным образом, но характеризуется неполной заселенностью.

Связывание сульфид-иона

В структуре ТуМИ+Б электронная плотность лиганда в дистальной координационной позиции была интерпретирована сульфид-ионом с заселенностью Уг (рис. 3, справа). Расстояние Ре-Б здесь (2.37 А) близко такому расстоянию в структуре комплекса сирогем-содержащей сульфитредуктазы с сульфидом. Сульфид-ион находится на расстояниях водородных связей от гидроксильной группы остатка ТугЗОЗ, ЫЕ2-атома остатка Н1э361 и молекулы воды \Л/2. Электронная плотность лиганда может быть также интерпретирована молекулой воды с полной заселенностью. Тогда относительно большое расстояние Ре-Н20 (2.39 А) может быть связано с тем, что ион железа гема 4 восстановлен и находится в высокоспиновом состоянии (известно, что сульфид натрия частично восстанавливает белок в растворе). Но данная интерпретация представляется менее вероятной в силу того, что в случае свободной формы ТуМР координированная в активном центре молекула воды образует одну прочную водородную связь (с молекулой \Л/3) и три слабые водородные связи (с МЕ2-атомом остатка Н|'з361 и молекулами У\/1 и ЧЧ2), в то время как в данном случае молекула воды образует две слабые водородные связи (с ЫЕ2-атомом остатка Н1э361 и с Ш).

Связывание сульфит-иона

Были определены пять структур комплексов ТуМК содержащих сульфит-ион в активном центре фермента - ТуМК+БОз, ТуМГЧЬ+БОз, ТуР^+РС^+ЭОз, ТуМНЬ+ЗОзСМУ) и ТуМК+ЭСЫ?) (таблицы 1 и 2).

В активном центре комплекса ТуМК+ЭОз локализован сульфит-ион (рис. 4, слева), связанный атомом серы с ионом железа гема 4 и образующий пять водородных связей. 01-Атом сульфита взаимодействует с молекулой воды 02-Атом взаимодействует с МЕ2-атомом остатка Н!з361 и с гидроксильной группой остатка ТугЗОЗ. ОЗ-Атом сульфита образует две водородные связи - с Ж2-атомом остатка Агд131 и с молекулой воды - либо \Л/3, либо \Л/5. Эти молекулы характеризуются неполными заселенностями позиций и в структуре может присутствовать лишь одна из них. Аналогичная картина связывания сульфита наблюдается в структуре комплекса Г\МА из № эисс'тодепез с тем лишь отличием, что у входа в активный центр здесь отсутствует молекула и молекула ^Л/З характеризуется целой

заселенностью позиции.

Связывание сульфит-иона в активном центре Ту№К приводит к следующим значительным изменениям в структуре по сравнению со свободной формой фермента: МЕ2-атом остатка Н!э361 смещается на 0.3 А

от дистальной координационной позиции, молекулы воды \Л/1 и \Л/3 смещаются на 0.5 и 1.3 А, соответственно, от дистальной позиции и вытесняется молекула воды \Л/2.

В структуре ТуМгаэ+ЗОз (рис. 4, справа) сульфит-ион и боковые цепи остатков Ыз361 и Агд131 расположены так же, как в случае нативного фермента. Молекулы воды \Л/3 и \Л/5 у входа в активный центр здесь отсутствуют и есть молекула воды \Л/2, которая образует водородную связь с 01-атомом сульфита. Молекула \Л/2 здесь смещена на 0.7 А относительно ее позиции в структуре свободной формы ТуМЯ. В случае нативного ТуМЯ такое смещение молекулы \Л/2 невозможно из-за возникающего неблагоприятного контакта между \Л/2 и Св-атомом остатка ФпЗбО.

Видимо, сульфит-ион связывается в активных центрах ТуМЯ и ША в форме НЭОз", причем протонирован атом кислорода сульфита, взаимодействующий с молекулой воды У\/1 (01-атом сульфита). Данное предположение основано на том, что атомы водорода молекулы \Л/1 должны быть задействованы в образовании водородных связей с карбоксильными группами гема 4, когда те депротонированы, а в условиях получения комплексов ТуМЯ карбоксильные группы гема 4, скорее всего, преимущественно депротонированы. В структурах ТуЬШ+ЗОз и Ъ/ЬШЬ+БОз водородная связь между 01-атомом сульфита и молекулой воды \Л/1 является самой короткой среди водородных связей, образуемых сульфит-ионом в активном центре ферментов. Высокое разрешение для структуры комплекса Ъ/МИ+ЗОз позволило описать температурные колебания атомов при помощи эллипсоидов (анизотропное приближение). 01-Атом сульфита характеризуется эллипсоидом колебаний с более вытянутой формой по сравнению с эллипсоидами двух других атомов кислорода сульфита.

Согласно принципу жестких и мягких кислот и оснований сульфит- и цианид-ионы должны лучше взаимодействовать с восстановленным ионом железа гема, чем с окисленным. Это объясняет быстрое замещение фосфат-ионов на цианид-ионы в активных центрах сирогем-содержащей сульфитредуктазы при восстановлении белка и замещение фосфатов в течение многих дней, когда белок находится в окисленном состоянии. Комплекс ТуМЯ+ЭОз получен быстро и с целой заселенностью лиганда, благодаря восстановлению белка. Сульфит-ион в данном случае является продуктом окисления дитионита, который, как известно, восстанавливает ТуМЯ в растворе. Доказательством восстановления гема 4 при обработке дитионитом может служить полное замещение фосфат-ионов на сульфит-ионы в активных центрах ТуМЯ в результате выдерживания кристалла фосфатного комплекса фермента в 0.1 М растворе дитионита натрия в течение 10 минут (структура ТуЬШ+РО^+ЗОз). Более короткое расстояние Яе-Б в структуре комплекса ТуМИ+ЗОз (2.24 А) по сравнению с сульфитным комплексом ША (2.28 А) может быть связано с восстановленным состоянием каталитических гемов в первом случае, но разница между расстояниями Ре-Э в данных структурах сравнима с ошибкой

в определении координат атомов. Структура Ту№Р+803 подтверждает ингибирование нитритредуктазной реакции Ту1\Ш сульфитом при использовании дитионита в качестве восстановителя белка.

Комплекс Ту1\ШЬ+503(М\/) был получен в результате выдерживания кристалла фосфатного комплекса ТуЬШЬ в растворе, содержащем МаВН4 и МЧ в течение 10 мин. Электронная плотность лиганда в дистальной координационной позиции тема 4 в структуре полученного комплекса была интерпретирована сульфит-ионом и молекулой воды с заселенностями Уг. Как и в случае получения комплекса ТуЬЩ+РО^+БОз, фосфат-ион был полностью удален из активного центра фермента, что является надежным подтверждением восстановления гема 4 в процессе выдерживания. Сульфит-ион в данной структуре связан так же, как в рассмотренных выше структурах сульфитных комплексов, но расстояние между его 01-атомом и молекулой воды составляет всего 2.4 А при том, что молекула У\/1 характеризуется целой заселенностью. На карте 2Р0-РС при уровне о = 1 01-атом сульфит-иона и молекула \Л/1 соединены электронной плотностью. Неполная заселенность сульфита и невысокое разрешение для структуры ТуЬШЬ+5О3(М\0 не позволяют уверенно оценивать связи, образуемые сульфитом в активном центре. Тем не менее, картина, наблюдаемая в активном центре в данной структуре, может являться отражением начальной стадии каталитического процесса, когда перенос заряда с иона железа на сульфит и дополнительное протонирование 01-атома сульфита ослабляют связь 5-01. Возможно, неполная заселенность сульфита в данном комплексе связана с протеканием каталитической реакции.

Таким образом, короткая водородная связь между 01-атомом сульфита и молекулой воды \Л/1 и вытянутая форма эллипсоида колебаний 01-атома сульфита в структуре восстановленного комплекса ТуМК+БОз, а также электронная плотность между 01-атомом сульфита и молекулой воды \Л/1 в структуре восстановленного комплекса Ту№ЯЬ+503(М\/) дают основания полагать, что связь Б-01 сульфита разрывается первой при восстановлении сульфита цитохром с нитритредуктазой.

Связывание нитрит-иона

Ранее была определена структура комплекса Ъ/МЯ с нитрит-ионом, где электронная плотность лиганда в дистальной координационной позиции была интерпретирована нитрит-ионом и молекулой воды с заселенностями Уг (разрешение 1.78 А). Положение нитрит-иона в данной структуре значительно отличается от положения нитрита в структуре комплекса ША, что можно было связать с разными положениями боковой цепи каталитического остатка тирозина в ТуМЯ и 1М|1А. Сомнения вызывало короткое расстояние от 02-атома нитрита до ЫЕ2-атома остатка Н1э361 (2.4А).

Структура ТуЬШ+Ы02 характеризуется полной заселенностью координированного нитрит-иона и предоставляет надежную информацию о

связывании субстрата в активном центре фермента. В целом картина связывания нитрита в ТчМИ+МОг (рис. 5) аналогична наблюдаемой в структуре ТуМК с неполной заселенностью лиганда. 02-Атом нитрита образует водородные связи с ОН-атомом остатка ТугЗОЗ, ЫЕ2-атомом остатка Н1з361 (расстояние 2.6 А) и с молекулой воды \Л/2. 01-Атом нитрита образует водородные связи с ЫН2-атомом остатка Агд131 и молекулой \Л/2. Связывание нитрит-иона в активном центре свободной формы ТуМИ приводит к следующим значительным изменениям в структуре: ОН-атом остатка ТугЗОЗ смещается на 0.4 А к дистальной позиции, ЫЕ2-атом остатка Н1э361 - на 0.3 А от дистальной позиции и молекула \Л/2 - на 0.3 А к нитрит-иону.

Положение нитрит-иона одинаково в активных центрах и мутанта У218Р ЫНА, в котором каталитический остаток тирозина замещен на остаток фенилаланина, и отличается от его положения в структуре нативного ША, где 02-атом нитрита смещен на 0.7 А в сторону каталитического остатка тирозина по сравнению с его положением в структурах ТуМИ и мутанта ША. Нитрит-ион в структуре комплекса нативного ША (разрешение 1.6 А) характеризуется искаженной геометрией и существенно отличающимися значениями В-фактора для атомов. Максимальное значение В-фактора имеет 02-атом нитрита (почти в два раза выше его значения для иона железа гема). Структура комплекса мутанта ША (разрешение 1.75 А) характеризуется целой заселенностью нитрит-иона, который корректно описывает электронную плотность лиганда в дистальной координационной позиции. Несмотря на разные положения боковой цепи катилитического остатка тирозина в ТуМЯ и ША, нитрит ион, по-видимому, одинаково связывается в активных центрах данных ферментов.

Атомы кислорода нитрит-иона в структуре ТvN¡R+N02 близки к позициям атомов 02 и 03 сульфит-иона в структуре Ту№Р+503, что говорит в пользу предположения о том, что при каталитическом восстановлении сульфит-иона ферментом первой разрывается связь 5-01.

Неполную заселенность нитрит-иона в комплексе Ъ/МРЧ, полученном ранее, можно объяснить кислотной диссоциацией остатков Н1э361 и ТугЗОЗ в условиях получения комплекса (рН 8.7).

Связывание гидроксиламина

Гидроксиламин — субстрат Ту№Р и возможный интермедиат восстановления нитрита до аммония. Были определены две структуры комплексов ТуМР, содержащие гидроксиламин в активном центре фермента - ТуМК+ЫНгОН и ТуМРЬ+ЫНгОН. В структуре Ту1\Ш+1МН2ОН дистальная координационная позиция была описана молекулами гидроксиламина и воды с заселенностями (рис. 6, слева). Гидроксиламин связан атомом азота с ионом железа гема 4 и образует водородные связи с остатками Н1з361 и ТугЗОЗ и с молекулой воды №2. Каталитические остатки и молекула \Л/2 в данной структуре имеют те же положения, что и в случае свободной формы

фермента. В структуре комплекса ЫИА с гидроксиламином молекула 1МН2ОН наклонена в сторону остатка аргинина (образует с ним водородную связь). Возможно, разные положения молекул гидроксиламина в структурах ТуЬШ+ЫНгОН и комплекса ША связаны с разными значениями рН, при которых получали комплексы (8.7 и 5.7, соответственно).

В структуре ТуЬШЬ+МНгОН (комплекс получен при рН 7.8) дистальная координационная позиция была описана молекулой гидроксиламина, развернутой в сторону остатка Агд 131, и молекулой воды с заселенностями Уг (рис. 6, справа). В процессе уточнения на разностном синтезе был локализован сильный пик электронной плотности, расположенный вблизи Св-атома остатка С!п360. Этот пик был интерпретирован атомом кислорода с заселенностью 1А, ковалентно-связанным с Св-атомом остатка глутамина (гидроксильная группа, длина связи Св-ОН -1.43 А). Атом кислорода МН2ОН находится на расстояниях водородных связей от гидроксильной группы остатка в1п360 и молекулы воды \Л/3. Молекула воды \Л/2 здесь характеризуется заселенностью Уг и присутствует в структуре, когда дистальную координационную позицию занимает молекула воды.

Таким образом, гидроксиламин может связываться в активном центре цитохром с нитритредуктазы двумя способами. Вероятно, эффективный катализ возможен только в случае одного определенного положения молекулы гидроксиламина в активном центре фермента, что объясняет низкое значение гидроксиламинредуктазной активности по сравнению с нитритредуктазной.

Неполная заселенность молекулы ЫН2ОН в структуре ТуЫ1ИЬ+ЫН2ОН может быть связана как со слабощелочным значением рН, при котором получали комплекс, так и с тем, что гидроксиламин может расходоваться на восстанавление молекулярного кислорода и ионов Ре(Ш). Хотя обработка ТуМК гидроксиламином в растворе не приводит к изменению спектра белка, при сокристаллизации белка с 1МН2ОН в присутствии кислорода в течение нескольких дней могли образоваться высокореакционноспособные соединения (в том числе непосредственно в активном центре фермента), которые способны окислить Св-атом остатка С1п361. Данный атом склонен к окислению благодаря тому, что фенольное кольцо остатка ТугЗОЗ и амидная группа, координирующая ион кальция, создают не нем частичный положительный заряд.

3. Получение Ту1\ШЬ

Форма ТуМРЬ исходно была получена в результате одного из выделений. Затем кристаллы этой формы были получены при сокристаллизации свободной формы ТуЫК с гидроксиламином (Ту1\ПНЬ+Н20). Несмотря на относительно невысокое разрешение для структуры Ту№РЬ+Н20, электронная плотность для ковалентной связи Туг-ап не вызывает сомнений. Дистальная координационная позиция в структуре занята молекулой воды с полной заселенностью. Расположение

боковых цепей остатков Н1э361 и Агд131 и молекул воды в активном центре Т\МРЬ+Н20 такое же, как в структуре свободной формы немодифицированного ТуМР.

Видимо, причины образования связи Туг-Фп в данном эксперименте и окисления Св-атома остатка С1п360 (связь Св-ОН) в ТуМ1КЬ+1ЧН2ОН одни и те же. Известно, что гидроксиламин медленно окисляется в растворе молекулярным кислородом с образованием нитрит-иона и пероксида водорода. Возможно, именно пероксид окисляет остатки ТугЗОЗ и С1п360 с образованием тирозил-радикала, стабилизированного делокализацией по орто- и пара-положениям в кольце, и радикала при Св-атоме остатка С1п360 и затем эти радикалы соединяются друг с другом.

4. Активности Ту1\Ш и ТуМВД

Нитритредуктазная активность ТуГ\Ш при рН 7.0 и 20°С, измеренная по корости окисления восстановленного МУ, составила 2680 ± 270 рмоль Ы02" / (мин*мг ТуЬШ). Данное значение отличается от определенного ранее по скорости расходования нитрита с использованием дитионита натрия для восстановления МУ и белка (2080 рмоль Ы02' / (мин*мг Ту^И)). Метод, используемый ранее, менее надежен из-за ингибирования нитритредуктазной активности сульфитом, который образуется при окислении дитионита.

Нитритредуктазная активность ТуГ^ШЬ, измеренная по скорости окисления восстановленного МУ в тех же условиях, что и активность немодифицированного ТуМЯ, составила 1120 ± 90 рмоль Ы02" / (мин*мг ТуМЯ), что близко значению нитритредуктазной активности 1МНА из Э. с/е/еу/'алш? (1050 рмоль Ы02" / (мин*мг)) (максимальное значение нитритредуктазной активности для ША).

Сульфитредуктазная активность ТуЬШ при рН 7.0 и 20°С, определенная по скорости окисления восстановленного МУ, составила 0.22 ± 0.04 рмоль МУ / (мин*мг ТуЬШ). Сульфитредуктазная активность ТуЬШ в 3.6 раза меньше сульфитредуктазной активности ША из \Л/. зисаподепеэ (минимальное значение активности для ША), но сравнима с активностью сирогем-содержащей сульфитредуктазы из О. безиИипсапз.

Сульфитредуктазная активность ТуМИЬ при рН 7.0 и 20°С, измеренная по первой и второй методикам, составила 0.13 ± 0.02 рмоль МУ / (мин*мг ТуГ^Ш) и 0.02 ± 0.005 цмоль НБ" / (мин*мг ТуЬШ), соответственно. Эти анные подтверждают шестиэлектронное восстановление сульфита до сульфида. При значениях рН ниже 7.0 не удалось получить стабильных результатов. При рН 7.0 было получено максимальное значение сульфитредуктазной активности ТуМЯЬ. Активность, измеренная при рН 7.8, составляет 20% от активности, измеренной при рН 7.0. При рН 9.0 не было зафиксировано сульфитредуктазной активности.

Наблюдалось уменьшение сульфитредуктазной активности ТуМРЬ с увеличением концентрации субстрата, начиная с концентраций сульфита 6-7

мМ. При концентрации сульфита 0.2 М наблюдалось полное ингибирование каталитической реакции ТуМЯЬ. Форма зависимости активности от концентрации субстрата в данном случае похожа на кривую ингибирования нитритредуктазной активности ТуМЯ сульфитом.

5. Структурно-функциональные аспекты катализа и Ту1уШЬ

Анализ данных по структурам цитохром с нитритредуктаз и их активностям позволяет высказать ряд предположений о деталях ферментативного катализа. Видимо, при восстановлении сульфита первой разрывается связь 5-01, что приводит к образованию интермедиата, связанного в активном центре фермента аналогично нитрит-иону в соответствующей структуре. Дальнейшее восстановление данного интермедиата приводит к образованию двухатомного интермедиата, связанного аналогично молекуле гидроксиламина. Вероятно, стадия разрыва связи Б-01 сульфит-иона является лимитирующей скорость стадией и объясняет низкую скорость восстановления сульфита по сравнению со скоростью восстановления нитрита. Данное предположение согласуется тем, что в структуре восстановленного комплекса ТуЬШ с сульфит-ионом (Ту№РЬ+503(М\/)) мы наблюдаем в активном центре сульфит-ион, характеризующийся неполной заселенностью.

Для ША из УК висстодепез ранее было предположено, что положение нитрита в структуре комплекса мутанта У218р которое отличается от его положения в структуре комплекса нативного фермента, является причиной сильного падения нитритредуктазной активности ША при замене каталитического остатка тирозина на фенилаланин. Но в структуре ТуМК+ЫОг нитрит характеризуется таким же положением, как в случае мутанта Ы^ГА, а активность ТуЫК в 6.5 раз выше активности нативного Ш" из висаподепез, что опровергает данное предположение. Видимо, нитрит-ион связывается одинаково в активных центрах ТуМЯ и Ы^А и, скорее всего, также связывается в случае ТуМРЬ.

Ранее было предположено, что высокая нитритредуктазная активность ТуМЯ по сравнению с ША связана с наличием в активном центре фермента связи Туг-Суэ, которая приводит к понижению рКа остатка тирозина. Данное предположение подразумевает важность для катализа остатка тирозина, который может выступать в роли донора протона, и согласуется с тем, чт активность мутанта ША составляет всего 0.7 % от активности нативного фермента. Падение активности ТуМЯ в 2.4 раза при образовании связи Туг-С1п и близость активностей ТуМЯЬ и ША подтверждают предположение о влиянии рКа тирозина на активность фермента, поскольку положительный индуктивный эффект Св-атома глутамина в орто-положении к гидроксильной группе кольца тирозина должен компенсировать влияние атома серы в другом орто-положении, приближая модифицированный остаток тирозина ТуМЯЬ по кислотно-основным свойствам к обычному остатку тирозина ^А.

Сульфит-ион связывается одинаково в активных центрах ТуМЯ,

ТуМЯЬ, ША и мутанта ША. Падение сульфитредуктазной активности ТуМЯ в 1.7 при образовании связи Туг-С1п также можно объяснить уменьшением рКа тирозина. Но для ША было показано, что замена тирозина на фенилаланин не влияет на сульфитредуктазную активность. Видимо, в случае относительно медленной реакции восстановления сульфита быстрая передача протона от гидроксильной группы остатка тирозина субстрату не ак важна для эффективного катализа, как в случае быстрой реакции восстановления нитрита, и молекула воды \А/5 у входа в активный центр может выполнять функцию донора протона вместо остатка тирозина.

В случае ТуМЯ эффективнось транспорта протонов к активному центру может быть значительно выше, чем в случае ША, в связи с наличием ополнительного канала, по которому протоны с поверхности белка могут передаваться молекуле воды \/\/5 и гидроксильной группе остатка ТугЗОЗ.

Отсутствие сульфитредуктазной активности у Ту№Я при рН 9.0 объясняется как низкой концентрацией протонов, необходимых для превращения сульфита в сульфид, так и ухудшением связывания сульфит-ионов в активных центрах фермента из-за депротонирования остатков Н1э361 и ТугЗОЗ при рН 9.0. Нам не удалось получить комплекс ТуМЯ с однозначно определяемым положением сульфит-иона выдерживанием кристалла фермента в растворе сульфита натрия при рН 8.7 (структура Ту№Я+30з(?)). Уменьшение сульфитредуктазной активности ТуМЯ при высоких концентрациях субстрата может быть связано с тем, что отрицательно-заряженные продукт (НБ") и субстрат конкурируют за положительно-заряженный канал транспорта субстрата. Хотя в структуре ТуМЯ+БОз в канале транспорта субстрата сульфит-ионов не было обнаружено.

Низкое значение сульфитредуктазной активности ТуМТ? и отсутствие активности при щелочных значениях рН, которые являются физиологическими для фермента, дают основания полагать, что восстановление сульфита до сульфида не является функцией ТуМЯ в клетке.

ВЫВОДЫ

1. С высоким разрешением определены структуры комплексов ТуМИ с субстратами (нитрит, сульфит и гидроксиламин), с продуктом (сульфид) и с ингибиторами (цианид и фосфат). Комплексы ТуМЯ с нитритом, сульфитом, цианидом и фосфатом характеризуются целой заселенностью лиганда и предоставляют надежную информацию о связывании лигандов в активном центре фермента.

2. Определены структуры модифицированной формы ТуМРЬ, в которой Сватом остатка ФпЗбО ковалентно связан с СЕ1-атомом каталитического остатка ТугЗОЗ, в свободном состоянии и ее комплексов с субстратами (сульфит и гидроксиламин) и с ингибитором (фосфат). Форму ТуМИЬ удалось получить из нативного ТуМЯ при сокристаллизации белка с

гидроксиламином.

3. Количественно охарактеризованы нитрит- и сульфитредуктазные активности TvNiR и TvNiRb. Нитритредуктазная активность TvNiR значительно выше, а сульфитредуктазная — значительно ниже, чем соответствующие активности NrfA. В результате появления связи Tyr-Gln нитритредуктазная активность TvNiR понижается в 2.4 раза, а сульфитредуктазная — в 1.7 раза.

4. В структурах TvNiR был обнаружен новый для цитохром с нитритредукта-» канал, который связывает активный центр фермента с поверхностью. Высказано предположение, что данный канал служит для транспорт-протонов в активный центр.

5. На основании данных по структурам цитохром с нитритредуктаз и и активностям были сделаны предположения о функции каталитическог остатка тирозина и о последовательности превращений для субстрата в ход катилитического процесса.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТРАЦИИ

Статьи

Trofimov A.A., Polyakov K.M., Boyko K.M., Tikhonova T.V., Safonova T.N., Tikhonov A.V., Popov A.N. and Popov V.O. Structures of complexes of octahaem cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfite and cyanide. 2010. Acta Cryst. D, V. 66, P. 1043-1047.

Трофимов A.A., Поляков K.M., Бойко K.M., Филимоненков A.A., Дороватовский П.В., Тихонова Т.В., Попов В.О. и Ковальчук М.В. Структур-комплекса восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibri nitratireducens с фосфат-ионом. 2010. Кристаллография, том 55, С. 61-67. Тихонова Т.В., Слуцкая Э.С., Филимоненков A.A., Бойко K.M., Клеймено С.Ю., Конарев П.В., Поляков K.M., Свергун Д.И., Трофимов A.A., Хоменко В.Г., Звягильская P.A. и Попов В.О. Выделение и олигомерный соста цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibri nitratireducens. 2008. Биохимия, том 73, С. 202-209.

Тезисы докладов

Trofimov A., Polyakov К., Tikhonova Т. and Popov V. Unique eight hae cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBO World Lecture Course "Recent Developments in Macromolecular Crystallography", 2008, Pune, India, P. 32.

Трофимов A.A., Поляков K.M., Бойко K.M., Филимоненков A.A., Дороватовский П.В., Тихонова Т.В., Попов В.О. и Ковальчук М.В. Структур комплекса восьмигемовой нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens сульфат-ионом. VI Национальная конференция по применени рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для

исследования материалов (РСНЭ-2007), Москва, С. 64. Структуры, депонированные в Protein Data Bank (www.pdb.org)

1. Код PDB 3F03. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase reduced by sodium dithionite (sulfite complex).

2. Код PDB 3MM0. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase in a complex with cyanide.

3. Код PDB 3GM6. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase in a complex with phosphate.

4. Код PDB 3LGQ. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase in a complex with sulfite (modified Tyr-303).

5. Код PDB 30WM. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase in a complex with hydroxylamine.

6. Код PDB 3LG1. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase reduced by sodium borohydride (in a complex with sulfite).

7. Код PDB 3F29. Structure of the Thioalkalivibrio nitratireducens cytochrome nitrite reductase in a complex with sulfite.

Заказ К» 163-АЛ2/2010 Подписано в печать 28.12.2010 Тираж 110 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифроиичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:'т/о(а)/ф\ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Трофимов, Антон Андреевич, Москва

61 11-2/257

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РАН

Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук K.M. Поляков

На правах рукописи

Трофимов Антон Андреевич

Москва-2011 г.

Содержание

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ ....

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5 7

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

Выделение Ту№11 . Кристаллизация .

Сбор и обработка данных, уточнение структур Измерение активности .

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .

5.1. Общая характеристика структур Ту]>Ш

5.2. Каналы ТуМЬ* .

58 58 60 62

3.1. Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из ТМоа1ка1МЬгю пкгаигейисет 7

3.1.1. Структура Ту№Я ...... 8

Структура мономера ...... 8

Гексамер ........ 9

Гемы . . . . . . . . 10

Активный центр . . . . . . . 12

Каналы ........ 14

Ионы кальция . . . . . . . 15

3.1.2. Активность Ту№Я . . . . . . 16

3.2. Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы 1Уг£А

3.2.1. СтруктураША ....... 19

Структура мономера . . . . . . 19

Димер . . . . . . . . 20

Гемы ........ 21

Активный центр и комплексы с субстратами и ингибиторами 21

Ионы кальция ....... 26

Каналы ........ 28

3.2.2. Активность ША ...... 30

3.2.3. Механизм восстановления нитрита ШГА ... 32

3.2.4. Физиологические доноры электронов ША ... 34

3.3. Цитохром с гидроксиламиноксидоредуктаза из ^гоьотопав еигораеа

3.4. Цитохром с тетратионатредуктаза из 8Ъ.емапе11а опе1йетЫ .

3.5. Сирогем-содержащие сульфитредуктазы ....

3.6. Модификация остатка тирозина в активном центре ферментов Связь Туг-Шэ в цитохром с оксидазе .... 48 Связь Туг-Шэ в каталазе из Е. соИ ..... 50 Связь Туг-СуБ в каталазе из Ыеигоярога сгаияа . . . 51 Связь Туг-Тгр в мутанте цитохром с пероксидазы ... 52 Связь Туг-Туг в гемоглобине О ..... 54 Связь Туг-СуБ в галактозоксидазе ..... 54 Связь Туг-Сув в цистеиндиоксигеназе .... 56 Связи Тгр-Туг-Ме1 в каталазе-пероксидазе из На1оагси1а тапятоПш 57

43 48

5.3. Связывание лигандов в активном центре фермента ... 67

Связывание фосфат-иона ...... 67

Связывание цианид-иона . . . . . . 69 Связывание сульфид-иона ...... 69

Связывание сульфит-иона ...... 70

Связывание нитрит-иона ...... 73

Связывание гидроксиламина ...... 75

5.4. Получение TvNiRb ........ 76

5.5. Активности TvNiR и TvNiRb......77

5.6. Структурно-функциональные аспекты катализа TvNiR и TvNiRb 79

6. ВЫВОДЫ.........81

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......82

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

NrfA - пятигемовая цитохром с нитритредуктаза

TvNiR - восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из Thioalkalivibrio nitratireducens

TvNiRb - модифицированная форма TvNiR, в которой СЕ 1-атом каталитического остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с CG-атомом остатка Gln360 НАО - цитохром с гидроксиламиноксидоредуктаза

OTR - цитохром с тетратионатредуктаза

NrfH и NrfB - физиологические доноры электронов NrfA SiR - сирогем-содержащая сульфитредуктаза

СсР - цитохром с пероксидаза

RMSD - среднеквадратичное отклонение PFV - циклическая вольтамперометрия в белковых пленках

MV - метилвиологен

ПЭГ - полиэтиленгликоль

NEDA - N-( 1 -нафтил)этилендиамин

2. ВВЕДЕНИЕ

Выяснение принципов функционирования ферментов на основе знания их пространственной структуры является одной из основых задач молекулярной биологии. На сегодняшний день надежную информацию о структурно-функциональных закономерностях ферментативных реакций предоставляет метод рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением, который позволяет изучать связывание лигандов в активном центре фермента.

N02" + 8Н+ + бе = NH4+ + 2Н20 NH2OH + ЗН* + 2е = NH4+ + Н20 HS03' + 6Н+ + бе = HS" + ЗН20 Цитохром с нитритредуктазы выполняют важную функцию в биологическом цикле азота, катализируя последнюю стадию анаэробного дыхательного процесса аммонификации нитрита.

На сегодняшний день наиболее изученной группой ферментов данного класса являются пятигемовые цитохром с нитритредуктазы бактерий (NrfA). Скорость восстановления нитрита для NrfA на три порядка выше скорости восстановления сульфита. Относительно высокое значение сульфитредуктазной активности для NrfA из сульфат-восстанавливающей бактерии Desulfovibrio desulfuricans может быть связано с тем, что данный фермент выполняет также функцию сульфитредуктазы. В некоторых сульфат-восстанавливающих бактериях, которые не могут расти за счет аммонификации (например Desulfovibrio vulgaris), NrfA, вероятно, отвечает за удаление токсичного для них нитрита, который производят другие бактерии, окисляющие сульфид и восстанавливающие нитрат.

Определены кристаллические структуры NrfA из различных бактерий. Мономер NrfA представляет собой а-спиральный белок с молекулярной массой 55-65 кДа. Функциональной единицей NrfA является гомодимер. Определены структуры комплексов NrfA с субстратами нитритом, гидроксиламином и сульфитом и с ингибиторами азидом и сульфатом. На основании структурных данных и квантовохимических расчетов предложен механизм восстановления нитрита для этих ферментов, подразумевающий последовательные стадии протонирования и восстановления субстрата. Показаны важность каталитического остатка тирозина для нитритредуктазной активности NrfA и

отсутствие влияния мутации этого остатка на остаток фенилаланина на сульфитредуктазную активность.

Из галоалкалофильной сероокисляющей у-протеобактерии ТЫоа1ка1тЪпо Шгайгейисет была выделена восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза (Ту№11). Фермент имеет молекулярную массу 64 кДа. Нитритредуктазная активность Ту№11 существенно выше активности №ГА. Следует отметить, что анаэробный рост клеток Т. пЫгайгесклсет в присутствии нитрата приводит к накоплению нитрита в среде.

Решены структуры свободной формы Ту№11 и комплексов фермента с нитритом и азидом, характеризующиеся неполной заселенностью лиганда. Функциональной единицей Ту№11 является гексамер. Мономер Ту№Ы состоит из двух доменов - уникального Н-концевого и каталитического, который похож на мономер Активные центры Ту№11 и №£А образованы лизин-координированным гемом и остатками гистидина, тирозина и аргинина. Важным отличием Ту№11 от №£А является наличие ковалентной связи между СЕ2-атомом каталитического остатка ТугЗОЗ и атомом серы соседнего остатка Суз305, место которого в структуре №ГА занимает остаток фенилаланина.

В данной работе проведены систематические структурные исследования связывания субстратов, продуктов и ингибиторов в активном центре ТуМШ, измерены скорости восстановления нитрита и сульфита нативным Ту№11 и его модифицированной формой, и проведено детальное сравнение структур комплексов ТуМЯ и №£А. Это позволило сделать предположения о функции каталитического остатка тирозина и о последовательности превращений субстрата в ходе каталитического процесса для цитохром с нитритредуктаз. Работа важна как с точки зрения изучения представителя сравнительно мало охарактеризованной группы восьмигемовых цитохром с нитритредуктаз, так и с точки зрения изучения свойств ферментов класса цитохром с нитритредуктаз.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 3.1. Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из Thioalkalivibrio nitratireducens

Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза TvNiR была вьщелена из галоалкалофильной у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens [1]. Молекулярная масса мономера TvNiR составляет 64 кДа. Последовательность TvNiR (AJ880678 в EMBL Nucleotide Sequence Database) идентична на ~ 50 % десяти последовательностям цитохромов с из 5-протеобактерий, которые содержат семь классических гем(с)-связывающих мотивов СХХСН и один мотив СХХСК [2,3].

TvNiR катализирует реакции восстановления нитрита и гидроксиламина до аммиака и сульфита до сульфида [4].

N02" + 8Н+ + бе = NH4+ + 2Н20 NH2OH + ЗН+ + 2е = NH4+ + Н20 HS03" + 6Н+ + бе = HS" + ЗН20

Нитритредуктазная активность TvNiR выше активностей пятигемовых цитохром с нитритредуктаз NrfA, которые структурно близки TvNiR. Ранее решены структуры свободной формы TvNiR и комплексов фермента с субстратом нитрит-ионом и ингибитором азид-ионом [5,2] (таблица 1).

Таблица 1. Структуры TvNiR. N - число мономеров в независимой части ячейки.

Лиганд в активном центре Код PDB Разрешение, А R-фактор/ Rfree RMSD связей, А Группа симметрии N

Н20 20Т4 1.5 0.126/0.141 0.019 Р2,3 2

NCV 3D1I 1.78 0.149/0.166 0.021 Р2,3 2

N3" 2Z05 1.67 0.158/0.174 0.017 Р2(3 2

3.1.1. Структура ТуМЯ Структура мономера

Мономер ТуМЯ. образован 525 аминокислотными остатками. В нем можно выделить два домена — N-концевой и каталитический (рис. 1). N-концевой домен (остатки 1-69 и 269-287) содержит пять а-спиралей, два (3-лист а и первые три по последовательности гемовые группы типа с. Третичная структура этого домена не имеет аналогов среди известных структур белков. Каталитический домен (остатки 70-268 и 288525) подобен мономеру пятигемовой цитохром с нитритредуктазы МгГЛ [6] и, как и КгГЛ, содержит пять гемовых групп типа с, включая лизин-коордипированный Рем активного центра (рис. 2). Около 200 Си-атомов каталитического домена ТуМК и мономера NrfA могут быть совмещены с ЯМ Б О менее ] А. При этом совмещаются пять гемов ТуМК с темами К[гГА и 19 из 30 а-спиралей Ту№Я с соответствующими спиралями 1МгГА (в том числе три длинные спирали на С-конпе) (рис. 2).

Рис. I. Слева. Мономер TvNiR. N-конпевой домен показан фиолетовым. В каталитическом домене a-спирали показаны желтым, ¡i-листы — синим. Нумерация гемов соответствует расположению гем-связывающих мотивов в последовательности. Каталитический гем показан красным. Справа. Топологическая карта TvNiR. Мономер содержит 30 а-спиралей и 13 (3-тяжей, расположсниыйх в 6 аптипараллельных [3-листах: al (остатки 11-15), п2 (1925), аЗ (35-37), а4 (42-47), а5 (64-67), аб (71-78), а7 (100-104), а8 (108-111), а9 (119-120), аЮ (122-129), all (142-146), а12 (148-153), а13 (155-158), а14 (182-187), al5 (198-200), aló (214-219), «17 (227-229), al8 (243-249), al9 (261-266), «20 (292-296), a21 (322-323), a22 (332-341). a23 (363-367), a24 (371-374), a25 (379-383), a26 (403-405), oil (407-410), a28 (420-457), a29 (462-484), a3(? (493-523); {pi (39-40), (32 (58-59)}, {(33 (137-139), [34 (159-161)}, Íp5 (239-240), (36 (269-276), ¡37 (279-287)}, {p§ (303-305), (39 (308-309)}, {(310 (316-317), (311 (325-327)}, {(312 (347-348), pl3 (355-356)}. Рисунки взяты из [5].

Рис. 2. Структуры мономеров TvNiR (слева) и NrfA из W. succinogenes (справа). Структурно эквивалентные элементы показаны синим. Каталитические гемы показаны красным. Рисунок взят из [5].

Гексамер

Независимая часть элементарной ячейки TvNiR содержит два мономера (мономеры А и В), связанные i ^кристаллографической поворотной осью второго порядка. Мономеры TvNiR образуют гексамер с точечной группой симметрии 32 (рис. 3). Ось симметрии третьего порядка гексамера является кристаллографической и связывает между собой три мономера А и три мономера В. Кристаллографически независимые мономеры в гексамере связаны между собой некристаллографическими поворотными осями второго порядка. Форма гексамера напоминает тригональную бипирамиду с основанием в ~ 120 А и высотой - 150 А. Гексамер TvNiR может быть описан как «димер тримеров». Каждый мономер TvNiR образует 36 водородных связей с соседними мономерами в три мере (площадь поверхности контакта составляет 3200 А2 на мономер) и 13 водородных связей с мономерами соседнего тримера в гексамере (площадь поверхности контакта — (650 А2).

В центре гексамера TvNiR находится большая полость, форму которой можно описать при помощи трех пересекающихся сфер. Большая сфера с радиусом 19 А расположена в центре гексамера, и две малые сферы с радиусом 12 А каждая расположены внутри гримеров. Расстояние между центрами большой и малой сфер составляет 17 А. Поверхность полости, соответствующая малой сфере, образована остатками 82-95, 114-116, 402-404 (а26) и 421-435 (а28) каждого мономера в гримере. Поверхность полости, соответствующая большой сфере, образована остатками 83, 404408, 419-421, 486-488 и пропиопатами гемов 6 и 7 всех мономеров. Растворитель

проникает в полость через три овальных отверстия размером 9*16 А, расположенных на некристаллографических осях гексамера.

Рис. 3. Гексамер TvNiR. Кристаллографическая ось симметрии третьего порядка проходит вертикально в плоскости рисунка. Кристаллографически независимые мономеры показаны одним цветом. Рисунок взят из [2].

Гемы

Семь гемов из восьми мономера TvNiR ковалеитно связаны с атомами серы остатков цистеина из классических ге м( с) - с вяз ы в а ю щ и х мотивов СХХСН. Гем 4 связан с остатками цистеина из мотива СХХСК. Остатки гистидина и лизина этих мотивов играют роль проксимального лиганда иона железа гема. Дистальную координационную позицию у гемов 1-3 и 5-8 занимает боковая цепь еще одного остатка гистидина. У гема 4 данная позиция свободна для взаимодействия с субстратом.

Гемы в мономере TvNiR располагаются парами в типичных для цитохромов с дигемовых мотивах (рис. 4). Гемы в парах 1/2, 3/5 и 6/7 параллельны друг Другу (стекинг), в то время как гемы в парах 2/3, 5/6 и 7/8 почти перпендикулярны друг другу, Гем 4 находится в группе с темами 6 и 7 и почти параллелен им. Расстояния Fe-Fe между соседними темами в моцвмере TvNiR составляют 9-13 Á, чего достаточно для эффективной передачи электронов между ними.

Гемы TvNiR 4-8 могут быть совмещены с пятью темами NrfA по эквивалентным атомам со значениями RMSD от 0.5 Á для фермента из S. deleyianum [6] до 0,6 Л для фермента из D. desuifuricans [7] (рис. 5, слева). Восемь гемов TvNiR можно совместить с восемью темами гидроксиламиноксидоредуктазы НЛО [8] со значением RMSD 1.3 А, В обоих случаях совмещаются друг с другом темы активных центров ферментов. Семь гемов TvNiR можно совместить с семью темами тетратионатредуктазы OTR [9] так, что каталитические гемы не участвуют в этом совмещении и оказываются по разные стороны

от цепи совмещенных гемов (рис. 5, справа). Такое совмещение дает значение КМБЭ 3.4

А.

Рис. 4. Гемы в мономере TvNiR. Гемьт пронумерованы в соответствии с порядком следования г ем-связывающих мотивов в последовательности. Показаны расстояния между ионами железа гемов.

Ё гсксамере TvNiR прямой перенос электронов между темами возможен только между мономерами А и В независимой части элементарной ячейки благодаря взаимодействию гемов 3 этих мономеров (расстояние Fe-Fe 13.1 А). Таким образом, в гексамере TvNiR присутствуют три обособленные группы гемов — каждая из 16 гемов.

Рис. 5. Слева. Совмещение гемов TvNiR (красный) и №£А (зеленый). Справа. Совмещение гемов Ту.^Л (красный) и OTR (синий).

Активный центр

Активный центр TvNiR находится в 10 Â от поверхности белка. Он включает в себя гем 4, координированный остатком Lys 188 (расстояние NZ-Fe 1.9 À), и каталитические остатки His361, ТугЗОЗ и Argl31 (рис. 6). СЕ2-атом остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с атомом серы остатка Cys305. В структуре свободной формы TvNiR дистальная координационная позиция гема 4 занята молекулой воды (расстояние HiO-Fe 2.1 À), которая образует водородную связь с остатком His361.

Рис. 6. Активный центр свободной формы ТуШ*. Координационная связь и водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [2].

Активный центр №1А подобен активному центру Ту№Кп по отличается от него отсутствием связи Туг-С-ук. В структуре ГЧНА место остатка цистеина занимает остаток фенилаланина. Совмещение структур свободных форм TvNiR и NrfA по эквивалентным атомам каталитических гемов (ЯМБО 0.2 А) приводит к совмещению боковых цепей каталитических остатков аргинина и гистидина (рис. 7). При этом боковые цепи каталитического остатка тирозина совмещаются хуже (расстояние между ОН-атомами 1.2 А), что связано с наличием в структуре Т\г№К ковалентной связи Туг-Су5 (см. раздел 3.6). Координирующий гем остаток лизина имеет разные конфирмации в структурах и

Были определены структуры комплексов TvNiR с нитритом и азидом. Для получения комплексов кристаллы свободной формы фермента выдерживали в течение часа и 12 часов, соответственно, в растворах, приготовленных растворением нитрит или азида натрия в противорастворе Сгуо 13 (Hampton Research Crystal Screen Cryo № 13, pH 8.7). Концентрации нитрита и азида натрия в растворах для выдерживания составляли 100

NrfA.

и 10 мМ, соответственно. В структурах данных комплексов дистальная координационная позиция была описана молекулой воды и ионом л и ганда с заселенности ми 1/2 (рис. 8).

Рис. 7. (Совмещение активных центров структур Тл'МП1 (зеленый) и >ЗНА (черный) по эквивалентным атомам гемов. Показаны остатки гистиднна, тирозина и аргинина, остаток лизина, координирующий тем, остаток цистеина ТуИЖ. и тем TvNiR (серый).

Рис. 8. Связывание нитрит-иона (слева) и азид-иона (справа) в активном центре ТуМЯ. Координационная связь и водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [2].

Нитрит-иоп связывается атомом азота с ионом железа каталитического гема. 02-

Атом нитрит-иона образует водородные связи с боковыми цепями остатков Н1з361 и

ТутЗОЗ. 01-Атом образует водородную связь с боковой цепью остатка А)^ 131.

Связывание нитрита в активном центре ТуМЯ аналогично связыванию нитрита в

активном центре [10]. Но в последнем случае 02-атом нитрита образует водородную

связь только с остатком гиетидина.

Ингибитор азид-ион также связывается с ионом железа тема 4. Ш-Атом азида образует водородные связи с боковыми цепями остатков Н153б1 и Ту

Информация о работе