Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование каталитических свойств мультигемовой нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование каталитических свойств мультигемовой нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens"

На правах рукописи

Слуцки Алвира

«Исследование каталитических свойств мультигемовой нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии ТЫоа1ка1МЬпо пНгаИгебисепв»

Специальность 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

(¡111111111111111111

□□3168587

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им А Н Баха РАН

Научные руководитель

доктор химических наук, профессор В О. Попов

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор А И Ярополов доктор биологических наук, профессор Г И Эль-Регистан

Ведущая организация

Российский химико-технологический университет им Д И Менделеева

Защита состоится « » 2008 г в

■(Н ч ° ^ мин на заседании диссертационного совета О 002 247 01 при Институте биохимии им А Н Баха РАН по адресу 119071 Москва, Ленинский проспект, дом 33, корп 2

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071 Москва, Ленинский проспект, дом 33, корп 1

Автореферат разослан «_ О-Ь^^иЯ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А Ф Орловский

Актуачьность проблемы. Биогеохимический цикл азота связан с взаимопревращением соединений азота в широком интервале степеней окисления (от +5 до -3) и характеризуется

металлосодержащими оксидоредуктазами Системное исследование совокупности термодинамических, кинетических и структурных свойств этих ферментов, а также их комплексов с искусственными и физиологическими субстратами, ингибиторами, донорами и акцепторами электронов - это путь к пониманию механизмов действия и регуляции как отдельных ферментов, так и в целом процессов массо- и энергопереноса в клетках бактерий, участвующих в азотном обмене

Нитрит является одним из ключевых компонентов этого цикла Основная роль в процессах его потребления принадлежит нитритредуктазам различного строения и локализации Восстановление нитрита может осуществляться в ходе ассимиляторных, респираторных или диссимиляторных процессов, протекающих в клетках бактерий Ассимиляторное восстановление нитрита приводит к образованию иона аммония, который включается клеткой в синтез биомассы Этот процесс катализируется цитоплазматической сирогем-содержащей нитритредуктазой, которая использует НАД(Ф)Н или ферредоксин в качестве доноров электронов Респираторное восстановление нитрита может катализироваться тремя классами ферментов Цитохром (^-содержащая и медь-содержащая нитритредуктазы катализируют одноэлектронное восстановление нитрита до окиси азота N0, которая затем восстанавливается до N2 путем последовательного действия нескотьких редуктаз Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (ccNiR) катализируют шестиэлектронное восстановление нитрита непосредственно до аммиака без выделения промежуточных продуктов в окружающую среду

Мономеры ccNiR имеют молекулярную массу около 50 кДа, являются однодоменными белками и содержат пять гемов с, один из которых, координированный в проксимальном положении аминогруппой Lys, является каталитическим, остальные - принимают участие в переносе электронов Структурные исследования показали, что функциональной единицей ccNiR является димер, его образование приводит к образованию единой электрон-транспортной цепи, состоящей из 10 гемов с и позволяет осуществлять передачу электронов с одного мономера на другой, повышая таким образом эффективность работы фермента Предаю тагается, что помимо участия в дыхательных процессах в клетках бактерий ccNiR выполняет функции детоксикации клетки от избытка нитрита и N0

В Институте биохимии им АН Баха из растворимой фракции клеточного экстракта галоалкалофильной серуокисляющей бактерии Thioalkahvibrio mtratireducens была выделена новая цитохром с нитритредуктаза (TvNiR) [Tikhonova TV et al, 2006] Определение пространственной структуры TvNiR показало, что фермент существенно оттичается от ранее описанных в литературе ccNiR мономер TvNiR представляет собой двухдоменный белок, содержащий восемь гемов с, пять из которых, включая каталитический, гомологичны пяти гемам известных ccNiR, а дополнительные три гема расположены на отдельном домене В кристалле TvNiR существует как высокосимметричный гексамер с молекулярной массой 380 кДа Образование гексамера, содержащего 48 гемов с, не приводит к образованию коллективной электрон-транспортной цепи, связывающей несколько активных центров В связи с этим возникает вопрос о роли столь сложной структуры в катализе, а также об отигомерном состоянии белка в растворе и в клетке Для понимания связи между структурой и функцией фермента, а также понимания физиотогического состояния и роти фермента в клетке

разнообразием

окислительно-восстановительных

реакций, катализируемых

предполагается провести комплексное исследование кинетических, термодинамических и структурных свойств различных олигомеров TvNiR

Цель работы Целью настоящей работы являлась характеристика физико-химических и каталитических свойств цитохром с нигритредукгазы из бактерии Thioalkahvibrto mtralireducens

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1) Разработка и оптимизация процедуры выделения и очистки TvNiR хроматографическими методами, оптимизация методов определения активности фермента в растворе с различными субстратами

2) Характеристика физико-химических свойств олигомерного состава и субстратной специфичности TvNiR

3) Исследование модельных систем транспорта электрона в активный центр нитритредуктазы (фото- и электрохимические системы восстановления активного центра фермента)

Научная новизна Настоящая работа посвящена изучению новой гексамерной 48-гемовой цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной 7-протеобактерии 7v mtralireducens, представляющей собой уникальную высокоорганизованную систему, обеспечивающую эффективный направленный транспорт электронов и протонов Предложена двухстадийная схема вьщеления TvNiR, позволившая значительно повысить выход белка по сравнению с ранее применявшимся методом препаративного электрофореза Охарактеризован олигомерный состав TvNiR в растворе с применением хроматографических методов и метода малоуглового рентгеновского рассеяния Показано, что в растворе фермент существует в виде высокосгабильного гексамера с молекутярной массой около 380 кДа Охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства T\NiR Показано, что фермент катализирует реакции восстановления нитрита, гидроксиламина, сульфита и пероксида водорода Исследовано функционирование эчектрон - транспортной цепи TvNiR в условиях ее обеспечения электронами, поступающими от фотокаталитической системы, использующей доноры электронов флавиновой или птериновой природы или непосредственно от электрода, на который был иммобилизован фермент Показано, что флавины и/или флавосодержащие белки могут рассматриваться как потенциальные физиологические доноры электронов для TvNiR Практическая значимость работы Результаты настоящей работы расширяют имеющиеся сведения о свойствах мультигемовых цитохромов, играющих ключевую роль в метаболических процессах, связанных с переносом электронов Установление структурно-функциональных связей и закономерностей функционирования электрон-транспортной цепи гемов в гексамере может быть использовано для развивающейся сейчас биоэлектроники создания электронопроводящих материалов на основе биомолекул

Высокая стабильность иммобилизованных на электроде препаратов TvNiR в сочетании с широким рабочим интервалом рН, ионной силы, температуры, а также высокой активностью определяет перспективность использования фермента в качестве биосенсора при определении нитрита

Апробация работы Основные результаты диссертационнои работы были представлены на следующих конференциях международная конференция «Structural Biology at Crossroads From Biological Molecules to Biological Systems» (Germany, Gamburg, 2004), международная конференция «Biocatalysis-2005» (Москва, 2005), и "Biocatalysis - 2007" (Москва, 2007),

международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 32-й меяедународный конгресс FEBS «Molecular machines» (Austria, Vienna, 2007)

Публикации По материалам настоящей диссертации опубликованы_3_статьи

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 179 ссылок Работа изложена на 116 страницах, содержит 53 рисунка и 10 таблиц

Материалы и методы

TvNiR выделяли из растворимого экстракта клеток Tv mtratireducens, выращенных при 28°С в микроаэрофильных условиях, как описано ранее [Tikhonova TV et al, 2006]

Процедура выделения включала стадии анионообменной и гель - фильтрационной хроматографии Анионообменную хроматографию проводили при 4°С на колонке с сорбентом ДЭАЭ - сефароза (Fast Flow) объемом 35 мл, предварительно уравновешенной 25 мМ К+-фосфатным буфером, pH 7,0, на хроматографе BioLogic LP фирмы Bio-Rad (США) Белки элюировали линейным градиентом концентрации NaCl 0 -1 М

Гель-фильтрационную хроматографию проводили при 25°С на хроматографе АКТА FPLC фирмы "Amersham Biosciences" (США) с использованием колонки Superdex™200 10/300, уравновешенной 50 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,0, содержащим 0,15 М NaCl,

Каталитическую активность фермента в реакциях с различными субстратами контролировали спектрофотометрическими и электрохимическими методами

При спектрофотометрическом методе анализа нитритредуктазной и гидроксиламинредукгазной активностей в качестве донора электронов использовали восстановленный дитионитом метилвиологен Реакционная смесь содержала 0,1 М калий-фосфатный буфер, pH 7,0, 1 мМ NaNC>2, 1,6 мМ метилвиологен и исследуемый фермент (2-20 мкл раствора концентрации 0,1-0,2 мг/мл) Реакцию инициировали добавлением дитионита до концентрации 15 мМ Все реакции проводили во флаконах для газовой хроматографии в анаэробных условиях, для чего реакционную смесь и раствор дитионита предварительно продували аргоном высокой чистоты в течение 15 мин Содержание нитрита в реакционной смеси определяли по методу [Nicolas, 1957]

Циклическая вольтамперометрия проводилась в анаэробной ячейке, снабженной 3 электродами платиновым, хлорсеребряным и рабочим электродом с поверхностью из пиролитического графита (PGE) для иммобилизации TvNiR [Angove et al ,2002] Поверхность графитового электрода перед экспериментами полировали AI2O3, затем промывали деионизированной водой Модификацию графитового электрода осуществили нанесением капли раствора нитритредуктазы (1-2 мкл, 10 мг/мл) на полированную поверхность электрода и оставляли в течение 2-3 минут для адсорбции, избыток фермента осторожно смывали деионизированной водой

Циклические вольтамперограммы записывали с использованием вольтамперометрического анализатора Autolab Все потенциалы в работе приведены относительно нормального водородного электрода, pH 7,0,25°С

Пероксидазную активность измеряли по реакции окисления АБТС в присутствии пероксида водорода Реакционная смесь содержала 0,05 М Hepes буфер, pH 7,0 (или 0,05 М калий-фосфатаый буфер, pH 7,0), 0,4 мМ раствор АБТС и 5 мМ раствор пероксида водорода, реакцию инициировали добавлением фермента Каталитическую активность контролировали спектрофотометрически на длине волны 4)4 нм (£4м(АБТС) = 31100 М"'*с~') Скорость реакции окисления субстрата вычисляли по начальному линейному участку кинетической кривой Все измерения проводили при температуре 30°

Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом малоуглового рентгеновского рассеяния проводили в Гамбургском филиале Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (EMBL), на станции ХЗЗ накопительного кольца DORIS синхротронного центра DESY

Для фотовосстановления TvNiR в качестве доноров электронов использовали восстановленные соединения птеридинового ряда Восстановленные формы птеринов и флавинов получали, облучая пробу видимым или УФ светом в присутствии ЭДТА как источника электронов Источником света для проведения реакции фотовосстановления в видимой области спектра служила лампа накаливания мощностью 600 Вт Свет с помощью линзового конденсора фокусировали на поверхность 1 см кварцевой кюветы с исследуемым раствором Область спектра от 400 до 500 нм выделяли фильтрами ЖС-12 и СЗС-22 Для проведения реакции фотовосстановления в ультрафиолетовой области спектра (270 - 380 нм) использовали ртутную лампу ДРК-120 (осветитель ОИ-18А) Для выделения спектральной области 280-390 нм для сенсибилизации рибофлавина использовали фильтр ФС-6 Интенсивность света измеряли с помощью радиометра «Аргус-04» (Россия) Непосредственно перед добавлением белка окисленные формы флавинов или птеринов подвергали фотохимическому восмановлению Реакционная смесь содержала 0,1М К+ - фосфатный буфер, pH 7,2, 44 мкМ птерин (или 38 мкМ флавин) и 5мМ EDTA, и предварительно была деаэрирована аргоном Интенсивность света обеих ламп составляла 3,2 Вт*м2 Снижение интенсивности максимумов поглощения окисленных форм флавинов и птеринов при 445 нм и 346 нм, соответственно, свидетельствовало о том, что условия опыта обеспечивали их восстановление с образованием дигидроформ флавинов и, согласно результатам ВЭЖХ-анализа, смеси тетрагидро- и дигидроформ птеридинов Добавление в пробы с восстановленным донором (без нарушения их герметичности) TvNiR и последующая инкубация при 20°С в темноте приводили к окислению донора и параллельному восстановлению гемов в белке Степень восстановления TvNiR контролировали по увеличению поглощения на 421 нм и 554 нм В ряде опытов в пробы с восстановленным таким образом ферментом вносили NaNOj (концентрация в кювете 1 мМ) и после инкубации измеряли изменение содержания нитрита

Спектральные исследования проводили на спектрофотометрах СФ-2000 (ОКБ «СПЕКТР», Россия) и Helios а (Thermospectromc, USA)

Результаты и обсуждение

Выделение, очистка и жарактеристика олигомерного состава TvNiR.

Для выделения нитритредуктазы из растворимой фракции клеточного экстракта 7V mtrattreducens первоначально применялся метод препаративного электрофореза с добавлением в reib 2М мочевины Основным недостатком этого метода был низкий выход целевого белка В

данной работе для выделения нитритредуктазы была предложена новая двухстадийная схема очистки, включающая анионообменную и гель - фильтрационную хроматографии (Рис 1А,В,С) Чистоту получаемых препаратов TvNiR контролировали методом SDS-PAGE (Рис 1D)

Анионообменную хроматографию проводили на колонке с ДЭАЭ-сефарозой (Рис 1А) Белковые фракции с нитритредуктазной активностью элюировались при концентрации NaCl 0,5-0,58 М (Рис 1А, пик II, Рис 1D, дорожка 3) Фракции с максимальной удельной нитритредуктазной активностью и спектром, характерным для цитохромов с, были объединены, сконцентрированы и нанесены на гель - фильтрационную колонку Superdex™200 10/300 (Рис 1В) В результате фракционирования получены две фракции, видимые спектры которых имеют максимумы поглощения, характерные для цитохромов с (410 и 530 нм) Фракция с объемом удерживания 10,6 мл (Рис 1В, пик 1), обладающая нитритредуктазной активностью, соответствовала белку с молекулярной массой около 380-400 кДа Фракция с объемом удерживания 14,2 мл (Рис 1В, пик 2), не обладала нитритредуктазной активностью

Фракции с максимальной удельной нитритредуктазной активностью были объединены, сконцентрированы и охарактеризованы Гомогенность полученного препарата была подтверждена повторной гель - фильтрацией и ДДС-Na - электрофорезом (Рис 1С, Рис 1D, дорожка 6) Молекулярная масса очищенного белка (380-390 кДа) соответствовала гексамерному составу TvNiR (молекулярная масса мономера TvNiR, рассчитанная из ранее определенной аминокислотной последовательности, составляет 62345 Да), что согласовывалось с четвертичной структурой белка, наблюдаемой в кристалле [Воуко, 2006] Другие олигомерные формы TvNiR при хроматографическом выделении получены не были Методом MALDI-TOF была доказана идентичность фермента полученному ранее методом препаративного электрофореза Удельные активности ферментов, выделенных обоими методами, совпадали и были равны 150-180 мкмоль NO2" мин"1 намг белка (при [N02']=1mM)

Следует отметить, что выход гомогенного активного белка (23 %) при использовании новой схемы выделения оказался значительно выше, чем при получении TvNiR методом препаративного электрофореза (около 5 %)

Характеристика олпгомерного состава TvNiR методом малоуглового рентгеновского

рассеяния.

При использовании хроматографической схемы очистки TvNiR выделяется только в форме гексамера Однако, при электрофоретическом способе выделения кроме гексамера в геле присутствовала и полоса тримера Образование тримера, по-видимому, являлось следствием достаточно жесткой обработки нативного белка 2 М мочевиной, что приводило к разрушению водородных связей между тримерами в молекуле гексамера с последующим разделением тримеров в электрическом поле

5т А «- Í i

2 - Sxt^J •

• ■ I i :

ПО I

100 Е

80 ¿

60 §

40 I

20 8

D

30D 400 500 Объем элюгнта, мл

t ' I 1 I ' I ' I ' ¡"»-FT

6 e 10 12 H IS (8 20 22 2A

10,6

Объем элюента. мл

10 12 M 16 18 20 22 24

Объем элюента, мл

¡■¿да;». | В> '.'ЩЩ'ЩЩ:**"- "

Рис. 1. Двухстадпйная схема очистки TvNiR методами ионообменной хроматографии н гель -фильтрации; А) Профиль элюции клеточного экстракта Tv. nitratireducens в градиенте NaCI на колонке с сорбентом ДЭАЭ - сефароза (Fast Flow): 1 - оптическое поглощение на 280 нм, 2 -проводимость (градиент концентрации NaCI). В) Гель-фильтрация фракции II на колонке Superdex 200™ 10/300 GL. Условия: 50 мМ калий - фосфатный буфер, рН 7,0 (0,15 М NaCI). Пик 1 соответствует белковой фракции с молекулярной массой 380-390 кДа (гексамер TvNiR), пик 2 соответствует белковой фракции с молекулярной массой 60 - 70 кДа. С) Повторная гель -фильтрация гомогенного препарата TvNiR. Условия аналогичны (В). D) Электрофореграмма фракций TvNiR на разных стадиях очистки: дорожка I - маркеры молекулярного веса; 2 -клеточный экстракт; 3 - фракция II после анионообменной хроматографии (Рис. 1 А,); 4 -фракция 1 после гель - фильтрации (Рис. 1В,); 5 - фракция 2 после гель - фильтрации (Рис.1В,); 6 -гомогенный препарат TvNiR (Рис.1С).

Для дополнительной характеристики четвертичной структуры в растворе был

применен метод малоуглового рентгеновского рассеяния (вАХв), позволяющий проводит!, исследование объектов в условиях, максимально приближенных к условиям существования белка в клетке. На Рис. 2 представлена зависимость интенсивности углового рассеяния в диапазоне вектора рассеяния от 0 до 0,3 А"1.

Igl, relative

5 -

2 -

3 -

4 -

1

0 05 0 10 0 15 0 20 0 25

s, a1

Рис 2 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния TvNiR (концентрация белка 1,5 - 15 мг/мл) Экспериментальные данные показаны точками, величины экспериментальных ошибок указаны тонкими вертикальными линиями (1). Кривая, потученпая с помощью программы OLIGOMER, показана сплошной линией (2) Теоретическая кривая, рассчитанная из координат атомов кристаллической структуры гексамера TvNiR, показана пунктирной линией (3) График представлен в полулогарифмических координатах интенсивности рассеяния (в относительных единицах) от величины вектора рассеяния s = 4nsin(B)A (2в - угол рассеяния, А - длина волны рентгеновского пзлучевня, равная 1 5 А)

С помощью программы CRYSOL [Svergun et al, 1995] было проведено сравнение полученных экспериментальных кривых рассеяния с теоретическими кривыми, рассчитанными для различных олигомерных состояний TvNiR (гексамер, тример, димер, мономер) Анализ показал, что экспериментальная кривая достаточно хорошо описывается теоретической кривой, полученной для гексамерной формы (Рис 2, кривая 3), однако имеется небольшое несоответствие по глубине первого максимума с экспериментальной кривой рассеяния При учете с помощью программы OLIGOMER [Konarev et al, 2003] возможного присутствия небольшой доли (около 10% объемных долей) диссоциированных частей гексамера (мономеров, димеров и тричеров), теоретическая кривая гораздо лучше описала экспериментальные данные в области первого максимума Радиус инерции и максимальный размер белка, определенные из экспериментальных данных, оказались равными (46±1) А и (130±10) А Эти значения близки к рассчитанным по данным рентгеносгруктурного анализа для кристаллов гексамера TvNiR значениям радиуса инерции и максимального размера для гексамера TvNiR (47 А и 142 А, соответственно)

Таким образом, метод малоуглового рентгеновского рассеяния подтвердил, что TvNiR в растворе существует преимущественно в виде гексамера (около 90%) Однако теоретические расчеты указывают на возможность присутствия небольшого количества других олигомерных форм TvNiR в растворе (мономерных, димерных и тримерных)

Попытки вызвать диссоциацию гексамера с образованием тримеров (димеров или мономеров) в других, кроме электрофореза, условиях (разбавление, изменение рН и температуры) показали, что разбавление TvNiR до концентраций 0,7-1,5 мкМ не приводит к заметной диссоциации гексамера Длительная (20-80 часов) инкубация разбавленных растворов

ТуШ1 при повышенных температурах (50-70°С) приводит к необратимой 10-15 % диссоциации гексамера до тримера, что было зарегистрировано с использованием метода гель-фильтрации Других продуктов диссоциации - димеров или мономеров - обнаружено не бьио Таким образом, тримерная форма Ту№Я обнаруживается при жестком методе выделения фермента -электрофорезом в присутствии 2М мочевины, а также при тепловой диссоциации фермента

Спектральные свойства Ту1ЧШ

В растворе очищенный гомогенный препарат Т\'№И имеет красно-коричневый цвет Спектр фермента характеризуется типичными полосами поглощения для белков, содержащих гемы с в дополнение к белковому пику (А,=280 нм), наблюдаются два максимума поглощения при 410 нм (БогсО и 532 нм, характерных для электронного перехода в железо -протопорфирине IX Восстановление нитритредуктазы дитионитом приводит к характерному для гемов с сдвигу спектральных линий максимумы поглощения наблюдаются при 423, 525 и 554 нм (Рис 3) Спектр ТуМИ. совпадает со спектрами пятигемовых цитохром с нитритредуктаз из других бактерий за исключением одной важной особенности Для пятигемовых ссИШ. характерно присутствие в спектрах окисленных ферментов плеча при длине волны 610 или 630 нм, которое связывают с поглощением высокоспинового каталитического тема В спектре окисленной формы ТуШ1 такое плечо отсутствует

длина волны, нм

Рис.3 Спектр гомогенного препарата TvNiR (0,12 мг/мл) Жирной линией показан спектр восстановленного дитионитом фермента, тонкой линией - спектр окисленного фермента. 0ДМ К+-фосфатный буфер, pH 7,0,25°С

Миллимолярный коэффициент экстинкции (с) при 554 нм восстановленной TvNiR, равный 135 мМ 'см'1, показал наличие 7-7,5 гемов типа с на мономер белка (£55з = 98 мМ "см"1 для ccNiR из 5 deleyianum и 89 мМ^см"1 для ccNiR из W succmogenes, при этом каждый из этих белков имеет по 5 гемов с на мономер [Schumacher, W ,1994], что коррелирует с данными, полученными рентгеноструктурным анализом [Бойко К, 2006]

Характеристика субстратной специфичности Ту№11

Для предварительной характеристики субстратной специфичности было проведено окислительное титрование восстановленной дитионитом Ту№Я потенциальными субстратами нитритом, падроксиламином, нитратом и рядом других оксоанионов (Рис 4)

Проведенные эксперименты показали полное окисление нитритом с концентрацией

1-3 мМ (Рис 4а) Другие оксоанионы, такие как нитрат, бромат и хлорат, не окисляли восстановленный дитионитом фермент в диапазоне концентраций до 40 мМ (Рис 4с для нитрата) Гидроксиламин (1-10 мМ) полностью окислял восстановленный фермент, но скорость процесса была значительно ниже, чем в случае нитрита (Рис 4Ь) Известно, что в реакциях с комплексами железа гидроксиламин обычно является восстановителем, а не окислителем, как следует из Рис 4Ь Например, восьмигемовый фермент - гидроксиламиноксидоредуктаза (НАО) из Иигозотопсн еигорае, пространственная укладка гемов которой гомологична таковой у ТуМЯ, катализирует реакцию восстановления гидроксиламина до нитрита Эксперименты по восстановительному титрованию ТуК^Я гидроксиламином (1-10 мМ) показали, что фермент в этих условиях не восстанавливается, соответственно, нитрит не образуется

Рис 4 Окислительное титрование восстановленной дитионитом Ту1\7111 нитритом натрия (а), гпдроксн тамином (Ь) и нитратом патрия (с) Концентрация фермента составляла 8 мкг/мл в 0,1 М К*- фосфатном буфере, рН 7,0, [Дитпонит] = 2 тМ, 25°С, анаэробные условия а - Спектры поглощения фермента в диапазоне 505-570 нм ох - исходная окисленная форма, / -восстановленная форма; 2 и 3 - сняты через 3 и 5 мин после добавления к ферменту нитрита (3 мМ).

Ь - Спектры поглощения 2, 3, 4, 5 получены через 1, 10, 15 и 30 мин после добавления гидроксиламина (10 мМ) к восстановленному ферменту (/)

с - спектры 2-5 получены через 1, 20, 40 и 120 мин после добавления нитрата (40 тМ) к восстановленному ферменту (1) с последующим через 1 (спектр б) и 10 мин (спектр 7) , добавлением нитрита (1мМ).

Для реакции восстановления нитрита и гидроксиламина Ту^иК. бьши охарактеризованы конечные продукты Методами газовой хроматографии и ЭПР показано, что N20 и N0 в ходе реакции ферментативного восстановления нитрита не образуются

время, мин

Рис 5 Убыль концентрации нитрита (►) и накопление аммиака (О) в процессе ферментативного восстановления нитрита Коннентрация ТуГ^Я 0,48 мкг/мл, концентрация ГУ'аКОг 1мМ, 30°С Реакция проводилась в анаэробных условиях, для восстановления фермента применялась система дитионит - метилвиологен

Накопление аммиака в ходе реакции стехиометрично убыли концентрации нитрита (11) (Рис 5), при этом на восстановление одной молекулы нитрита расходуется 6 молекул метилвиологена (Ж)2' МУ = 1 6-7), что соответствует процессу 6-электронного восстановления нитрита, характерному для цитохром с нитритредуктаз В отсутствие фермента КН/ не образуется

Таким образом, единственным продуктом реакции восстановления нитрита является аммиак

Аналогичным образом было показано, что единственным продуктом реакции восстановления гидроксиламина является аммиак

При использовании в качестве субстрата Ту№11 аниона сульфита удалось показать образование сероводорода (сульфида) только на качественном уровне Количественно охарактеризовать восстановление сульфита, используя для восстановления фермента дитионит, оказалось невозможно Дитионит, разлагаясь с образованием соединений серы разных степеней окисления, препятствует точному определению сульфида и сульфита в реакционной смеси

Полученные данные позволили предложить следующие схемы реакций, катализируемых ТуШ1

ш2-+бё+8н+ Ш4++2Н2О (ур 1)

Ш2ОН + 25 + ЗН+ -> ЫН/ + Н20 (ур 2)

БОз2 + 65 + 6Н+ Б2' + ЗН20 (ур 3)

ю

Зависимость активности нптритредуктазы от рН среды.

Зависимость скорости нитритредуктазной реакции от рН описывается колоколообразной зависимостью с рКа 5,9 и рКь 8,5 (Рис 6)

? 120

5

3 20

2

х

é 40

о

160

о

5

6

7

В

9

10

11

рН

Рис 6 рН-Зависимость скорости нитритредуктазной реакции, катализируемой TvNiR ([NO2 ] = 1 мМ, [MV] = 0,8 мМ, [DT] = 15 мМ, [TvNiR] = 0,4 - 1,3 мкг/мл, 30°С, ОДМ MES (рН 5,0-6,6), 0,1 M К*- фосфатный буфер (рН 6,6 -8,0); 0,1М (Na2COj+ NalICOj) (рН 8,0 - 10,8)

Согласно механизму восстановления нитрита, предложенному для пятигемовых ccîNiR [Emsle О et al, 2002], существенными для катализа группами активного центра являются консервативные остатки Туг, His и Arg Такие же остатки обнаружены и в каталитическом центре TvNiR [Бойко, 2006] Можно предположить, что рН-зависимость отражает влияние на нитритредуктазную активность состояния ионизации остатков His-361 и Туг-303, образующих водородные связи с молекулой нитрита и участвующих в протонировании атома кислорода нитрита, предшествующем гетеролитическому разрыву связи N-0

Определение кинетических параметров реакции, катализируемых TvNiR.

Кинетические параметры восстановления нитрита TvNiR, определенные спектрофотометрически по убыли нитрита, приведены в Таблице 1 По сравнению с другими, изученными на сегодняшний день нитритредуктазами TvNiR, наряду с наибольшей каталитической активностью (2000 мкмоль/мин на мг белка), характеризуется наименьшей аффинностью к субстрату - нитриту (Км = 6 тМ)

Было сделано предположение, что столь высокое значение Км является результатом конкурентного ингибирования реакции восстановчения нитрита продуктами разложения дитионита (анионами сульфита и сульфата) Позже это предположение было подтверждено методом электрохимического анализа

Для сравнения была проанализирована в одинаковых условиях нитритредуктазная активность других олигомерных форм TvNiR Удельная активность тримера, выделенного методом препаративного электрофореза в качестве минорного компонента, совпала с удельной активностью гексамера и составила 150 мкмоль нитрита/мин на мг белка при [N02']=l мМ

Связывание гидроксиламина с TvNiR характеризуется несколько большей константой Михаэлиса-Ментен (Км), чем связывание нитрита (16 мМ и 6 мМ, соответственно) Удельная активность TvNiR в реакции восстановления гидроксиламина (45 ±6 мкмоль NH/Adih на мг белка) составила около 2,5 % от скорости восстановления нитрита в аналогичных условиях Вычисленные из полученных данных константы специфичности ксат/Км равны 347 и 2,8 мМ" 'с'1 для нитрита и гидроксиламина Из этого следует, что нитрит, а не гидроксиламин является специфическим субстратом TvNiR Низкая активность TvNiR по отношению к гидроксиламину в сравнении с другими ccNiR может быть результатом различной ориентации субстрата в активных центрах этих ферментов, что подтверждается данными рентгеноструктурного анализа комплексов TvNiR [Бойко, 2006] и ccNiR [Einsle О et al, 2002] с гидроксиламином

Электрохимическое исследование кинетики реакций, катализируемых цитохром с

нитритредуктазой.

Широкое распространение для исследования окислительно-восстановительных ферментов в последние годы получил метод вольтаммометрии в белковых пленках (protein film voltammetry (PFV)) Метод применим для ферментов, способных к прямому обмену электронами с электродом при сорбции их на поверхности электрода Преимуществами этого метода является возможность использования широкого интервала потенциалов (-1,2 - +0,8 V), позволяющих активировать практически все возможные редокс-группы в белках, а также возможность регистрации различных редокс-центров независимо от их спектральных свойств

Сочетание PFV с традиционно используемыми для исследования оксидоредуктаз методами позволяет по-новому взглянуть на свойства активных центров, охарактеризовать механизмы регуляции и каталитического действия ферментов, изучить пути внутри- и межсубъединичного транспорта электронов

Активный центр TvNiR локализован внутри белковой глобулы [Бойко К , 2006] Однако, наличие расположенного на поверхности белковой глобулы гема 8, экспонированного в раствор и тот факт, что для всех восьми гемов TvNiR расстояния между атомами железа гемов варьируются от 9 до 11 А, допуская прямой обмен электронами между темами, является достаточным условием образования эффективной цепи переноса электронов между электродом и каталитическим центром фермента

Для иммобилизации TvNiR использовали электрод с рабочей поверхностью из пиролитического графита Предварительная проверка показала, что сорбированная на электроде TvNiR активна и стабильна активность изменяется не более чем на 20 % за 10 циклов сканирования потенциала от +200 mV до -800 mV Определение кинетических параметров иммобилизованной на электроде TvNiR в реакциях с нитритом, гидроксиламином и сульфитом проводили в двух вариантах циклической вольтаммометрии и амперометрии

На Рис 7 представлены циклические вольтамперограммы восстановления нитрита в разных концентрациях ферментом, нанесенным на поверхность графитового электрода Рассчитанная из полученных данных величина Км составила (0,1 ±0,01) мМ, что оказалось в 60 раз ниже величины Км, рассчитанной из спектрофотометрических данных и вполне укладывается в интервал значений, полученных для других нитритредуктаз (Таблица 1)

Таблица 1 Кинетические параметры реакций, катализируемых 1\№К и пятигемовыми цитохром с питритредуктазами из других бактерий

Источник NrfA Восстановление нитрита Восстановление гидроксиламина Восстановление сульфита

Ауд*, ед/мг kcat, с' Км, мМ kcat/Км, мМ 1*с1 Ауд", ед /мг kcat, с1 Км, мМ kcat/Км, mM'V Ауд"*, ед/мг kcat, с1 Км, мМ kcat/Км, мМ1 *с"1

S deleyianum 1,05 900 0,45 387 1,1*10' 0,95

W succmogenes 0,85 810

D desulfuricans 1,31 1 350 1,14 1 200 10,50 10 900 110 95

D desulfuncans 0,45 470 1,14 410 2,06*10"3 2,10 0,75 2,84

В coli 0,87 750 0,03 25 100 2,7 2350 30 80 0,14

D vulgaris 0,69 640 0,001 0,90

Tv nitratireducens спектрофотометрия 2,0 2080 6,00 350 0,045 47 16,4 2,8 60,0

Tv nitratireducens электрохимия 0,10 20800 45 48 0,30

*ед = ммоль N027mhh **ед = ммоль NIVVmhii ***ед = ммоль Нг/мин

А В

Рис 7 Определение константы Михаэлиса - Ментен для реакции электрохимического восстановления нитрита Ту№В; А - циклические вольтамперограммы восстановления нитрита иммобилизованной на электроде ТуШ1 при разных исходных концентрациях нитрита (мкМ) Скорость сканировании 20 мВ/с. Скорость вращения электрода 1000 об/мин, Б - зависимость скорости реакции электрохимического восстановления нитрита от концентрации нитрита

Помимо кинетических параметров электрохимический метод позволил рассчитать потенциал каталитического гема как потенциал точки перегиба на вольтамперограмме каталитического процесса Для Ту№И потенциал каталитического гема составил -180 ± 10 тУ, что значительно ниже потенциалов каталитических гемов сс>Ж Совпадение потенциалов точек перегиба прямой и обратной волн свидетельствует о равновесном протекании процесса

В отличие от нитрита, гидроксиламин подвергается неферментативному восстановлению на электроде Скорость неферментативного процесса не превышает 30% от общей скорости восстановления МНгОН в присутствии фермента Км для гидроксиламина составила (48 ± 7) мМ Высокое значение Км согласуется с константой, полученной ранее спектрофотометрическим методом Столь же высокие значения Км для гидроксиламина известны и для других цитохром с нитритредуктаз (Таблица 1) Поскольку предполагается [Еиик О е! а1, 2002], что гидроксиламин является промежуточным продуктом реакции восстановления нитрита и не диссоциирует из активного центра в процессе реакции, как должно было бы происходить при такой высокой константе Михаэлиса, можно предположить, что способы связывания ГЧЦОН в активном центре как промежуточного соединения и как субстрата различны

Попытки зарегистрировать сульфитредуктазную активность электрохимическим способом оказались безуспешными, так как сульфит восстанавливался на электроде в отсутствие фермента со скоростью, значительно превышающей ожидаемую скорость восстановления сульфита Т\'№Я Однако, удалось показать, что сульфит является конкурентным ингибитором восстановления нитрита Из линейной зависимости Км,каж для нитрита от концентрации ингибитора следует, что константа ингибирования сульфитом составила (0,3 ±0,01) мМ (Рис 8) Величина Км для восстановления нитрита при концентрации сульфита 15 мМ (такая концентрация сульфита возможна в реакционной смеси при разложении 15 мМ дитионита) составила около 5-6 мМ, что соответствует значению Км для нитрита, полученному из

спектрофотометрических данных Таким образом, значения кинетических констант, полученных разными методами, не противоречат друг другу, что, по-видимому, дает основание утверждать, что фермент не претерпевает значительной деформации при сорбции на электроде

Электрохимическим методом было также проанализировано влияние других ингибиторов - ионов нитрата и азида (рис 9) Оба оказались существенно ботее слабыми ингибиторами, чем сульфит 150 для нитрата и азида составила 17 и 28 мМ, соответственно, при ненасыщающей концентрация нитрита 0,1 мМ Для сравнения 150 для сульфита в этих условиях составляет 0,6 мМ При насыщающей концентрации субстрата 50 % ингибирование анионами нитрата и азида не достигалось вплоть до концентраций 150-200 мМ Продукт реакции - аммоний также не ингибировал восстановление нитрита при концентрациях до 200 мМ

А Б

Рис 8 Определение константы ингибирования сульфитом реакции электрохимического восстанов 1ения нитрита ТуМЯ, [КОг 1 = 0,1мМ; А - циклические польтамперограммы восстановления нитрита при разных концентрациях сульфита (мкМ) Скорость сканирования 20 мВ/с Скорость вращения электрода 1000 об/мин, Б - зависимость кажущейся константы Михаэлиса восстановления нитрита от концентрации сульфита

Таким образом, восстановление нитрита Ту№11, иммобилизованной на электроде, подтвердило доступность каталитического редокс-центра фермента для прямого обмена электронами с электродом через цепочку гемов

о

о

О 20 40 60 80

[Анион], мМ

0 20 40 60 80

[Анион], мМ

Рис. 9. Ингибирование нитритредуктазиоб активности анионами азидом (О), нитратом (О) и сульфитом (+) А - при ненасыщающей концентрации нитрита 0,1 мМ (Км), Б - при насыщающей концентрации нитрита 5 мМ, 0,025М Hepes буфер, pH 7,0.

Определение пероксидазной активности нитритредуктазы из Tv. mtratireducens.

По аналогии с известными гем-содержащими белками, существование пятикоординированного каталитического гема с в молекуле TvNiR позволило предположить, что TvNiR может катализировать не только нитритредуктазную, но и пероксидазную реакцию Потенциал каталитического гема TvNiR оказался близким к потенциалу гема в цитохром с пероксидазе (ССР) из дрожжей (-180-190 мВ) Дополнительным доводом для проверки пероксидазной активности является присутствие в активном центре TvNiR каталитически активных остатков His и Arg, консервативных как для нитритредуктаз, так и для пероксидаз, а также консервативного иона Са2+, расположенного в непосредственной близости от каталитического центра

Пероксидазную активность TvNiR измеряли в реакции окисления АБТС (Ур 4) в присутствии пероксида водорода

Все кинетические эксперименты проводились в условиях линейной зависимости скорости реакции от концентрации фермента (0,0025 - 0,075 мг/мл) Для оптимизации условий определения пероксидазной активности TvNiR были проварьированы последовательно концентрации субстрата АБТС (0,01-2 тМ) и ко-субстрата Н2О2 (0,12 тМ - 5 тМ) при постоянной концентрации второго субстрата, соответственно Константа Михаэлиса для пероксида водорода при постоянной, насыщающей концентрации АБТС 0,2 мМ составила (0,96 ±0,14) мМ (Рис 11 А) Константа Михаэлиса для АБТС при насыщающей концентрации пероксида (5 мМ) составила (0,025 ±0,005) мМ (Рис 11Б)

АБТСюсст + н202 ЕАБТСок + Н20

•восст

(УР 4)

Рис 11 Пероксидазная активность ТуЛ"|1{ А) Зависимость пероксндазной активности ТучХЛ от концентрации Н1О2, Б) Зависимость пероксндазной активности ТуГ^И от концентрации АБТС Условия реакций А) ОДМ Иерея буфер, рН 7,0, [АБТС) = 0,2 иМ, 30"С. Концентрация фермента 8,5 мкг/мл Б) 0,05М Нерея буфер, рН 7,0, [Н2Ог| = 5мД1,30°С Концентрация фермента 5мкг/мл

Профиль рН - зависимости скорости пероксидазной реакции, катализируемой TvNiR, описывается кодоколообразной кривой с максимумом при рН 4,7-5,0 и дополнительным плечом в области рН 6,0- 7,0 Ионизация двух групп с рК около 4,3 и 5,6 определяет форму рН-зависимости Группа с рК 5,6 может быть азиногруппой АБТС, которая должна быть гротонирована в ходе реакции [Kamal J К A ct al, 2003] Отнесение группы с рК 4,3 не очевидно, однако большинство авторов потагает, что в пероксидазах группа с рК 4,3 - остаток His, расположенный на дистальной стороне каталитического тема и осуществляющий кислотно-основной катализ в процессе реакции

Рис. 12. рН - зависимость скорости пероксидазной реакций, катализируемых гексамерной н тримерной формой TvNiR, 30°С [АВТС] = 0,2 мМ, [Н202] = 1 мМ, [TvNiR] = 8 мкг/мл, (0,2 М CH3COONa - СН3СООН) (рН 4,0 - 6,0), 0,1 М Hepes (рН 7,0 - 8,0)

Рис. 13 Строение активных центров TvNiR (А) и цитохром с пероксидазы из Saccharomyces cerevisiae (Б). Показаны важные для катализа аминокислотные остатки. Нумерация аминокислотных остатков представлена в соответствии с PDB.

Как следует из данных таблицы 2, TvNiR на несколько порядков превосходит по пероксидазной активности цитохром с и его карбоксиметилированное производное с пятикоординированным гемом с (CM-cyt с), но уступает природным пероксидазам, что, по-видимому, объясняется различиями в пространственном расположении каталитически важных остатков His и Arg активного центра обоих ферментов (Рис. 13) и подтверждает тезис о | важности тонкой настройки активного центра в пероксидазном катализе [Газарян И.Г, и др., 2006].

Таблица 2. Кинетические параметры пероксидазной реакции (субстрат - АВТС), i катализируемой различными цитохром с содержащими белками.

Перокси дазная активность

pH Субстрат Ауд, мкмоль/мин*мг kcat, с"1 Км, мМ kcat/Км, мМ"'* с"1

Tv. nitratireducens гексамер (380кДа) 7,0 АБТС 0,17 0,17 0,02 8,5

Tv. nitratireducens гексамер (380кДа) 5,0 АБТС 1,41 1,38 0,02 70

Tv. nitratireducens тример (190кДа) 7,0 АБТС 6,60 6,50

Tv. nitratireducens тример (190кДа) 5,0 АБТС 17,45 17,1 (855)

HPR* 6,8 АБТС 1045 750 0.18 4,1 * 10J

HRP 5,0 АБТС 1150 810 0.27 3,0*10'

SBP** 6,8 АБТС 2110 1230 173 7,1

SBP 5,0 АБТС 4565 2660 45 59,2

S. cerevisiae CCP АБТС 4,5*104

CM-cyt с 7,0 АБТС 66 0,017

[Prasad S. et al, 2002] 5,0 АБТС 0,072

3,5 АБТС 202 0,21

native cytc 6,0 Н202 0,24* I0"J

His-175

*HRP - пероксидаза из корней хрена [Kama! J К.А. et я/, 2003], **SBP - пероксидаза из бобов сои [KamalJKA etal,2003J

Также в работе была охарактеризована пероксидазная активность тримера TvNiR Формы рН-профилей пероксидазных активностей тримера и гексамера совпадают Однако, скорость окисления АБТС пероксидом водорода в присутствии тримера TvNiR выше, чем в присутствии гексамера (Таблица 2, [АБТС]=0,2 мМ, [Нг02]=5 мМ, 30°С), причем это различие значительно выше при рН 7,0 (40 раз), чем при рН 5,0 (около 10 раз) Из расчетов структуры активного центра TvNiR и диаметра субстратного канала очевидно, что АБТС не входит в активный центр фермента, те возможность протекания пероксидазной реакции определяется наличием цепи переноса электронов от АБТС на поверхности фермента к пероксиду водорода в каталитическом центре фермента Такая цепь, как и в электрохимических исследованиях, возможна благодаря гемовым контактам внутри мономера и наличию на поверхности белковой глобучы гемов, экспонированных в растворитель Если скорость-имитирующей стадией пероксидазной реакции является перенос электрона от АБТС на фермент (а для большинства пероксидаз показано, что скорость реакции зависит от природы субстрата - донора электрона), то скорость реакции будет тем выше, чем больше гемов доступно для взаимодействия с АБТС В гексамере TvNiR АБТС может взаимодействовать точько с одним гемом (гем 8, доступная площадь контакта для сферы диаметром 10 Á 127 Á 2) в каждой субъединице В тримере, согласно расчетам, доступными для взаимодействия с АБТС становятся еще гемы 3, что может приводить к увеличению скорости реакции

Как отмечалось выше, нитритредуктазная активность тримера и гексамера одинаковы По-видимому, для этой реакции при использовании в качестве донора электронов восстановленного метилвиологена скорость-лимитирующая стадия связана не с транспортом электронов, а с каталитическими процессами, протекающими в активном центре, одинаковом для гексамера и тримера

Поскольку восстановление нитрита и пероксидазкая реакция протекают на одном пятикоординированном теме, нитрит должен быть эффективным конкурентным ингибитором пероксидазной активности Увеличение концентрации нитрита в среде действительно приводит к ингибированию пероксидазной реакции TvNiR (Рис 14 А) Полученные данные указывают на конкурентный тип ингибирования (Рис 14В), рассчитанная из них константа ипгибирования пероксидазной реакции нитритом составила 2 ± 0,2 мМ Полученная константа характеризует взаимодействие нитрита с окисленньм гемом активного центра, она в 20 раз выше константы Михаэлиса, характеризующей взаимодействие нитрита с восстановленной формой фермента, что подтверждает ранее высказанное предположение, что нитрит, равно как и ингибиторы ccNiR (цианид и азид-ионы), намного прочнее связываются с восстановленной формой активного центра, чем с окисленной

А

4,0

Б

100 -

о

о о

о

2 3 4 S нитрит мМ

о

4

S

нитрит, ММ

Рис 14. Конкурентное ингибирование пероксидазной активности нитритом Условия 0,05 М Hcpes буфер, pH 7,0, [АБТС] = 0,02 мМ, [Н202] = 0,25-2 мМ, 30°С

Поиск возможного редокс - партнера и У или физиологического донора элеетронов TvNiR посредством скрининга панели биологических производных птеридииа

Фотовосстановление питритредуктазы из Tv. nitraiireducens, сенсибилизированное флавинами и птеринами

Природный донор электронов для TvNiR не установлен Из литературных данных известно, что некоторые мультигемовые белки [Stewart, 1988, Brzezmski, 1997], образуют в клетке единую электрон-транспортную цепь с флаводоксинами На основании этих данных нами была предпринята попытка смоделировать подобную систему in vitro с TvNiR Известно, что в флаводоксинах флавин экспонирован в среду, поэтому на первом этапе работы была проверена возможность восстановления TvNiR свободными молекулами кофакторов

В качестве доноров электронов для TvNiR исследовали производные изоаллоксазина рибофлавин, ФМН и ФАД, а также структурно близкие изсаллоксазину и фотохимически активные птеридины - люмазин и 6,7-диметилптерин (ДМП) Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что восстановленные флавины, но не птерияы, служат донором электронов для гемов TvNiR Наиболее активным донором был ФМН-Нг, восстановленные рибофлавин и ФАД-Н2 проявляли более низкую активность Способность ДМП, как и флавинов, восстанавливать TvNiR коррелировала с наличием в молекуле этого птерина такого же как у флавина гидрофобного участка (метая-замещенные атомы С7 и С8 изоаллоксазинового цикла или, соответственно Сб и С7 атомы в ДМП) Можно предположить, что данный участок молекулы активен во взаимодействии молекулы восстановителя с белком Люмазин, у которого отсутствует данный мотив, электрон-донорную активность не проявлял Можно также полагать, что присутствующий в люмазине, как и в изоаллоксазине флавинов, полярный участок NI-C2-N3-C4 с присоединенными кето-группами, не несет нагрузки в донор-белковом взаимодействии

Таблица 3. Восстановление флавпновых кофакторов н ннтритредуктазы под действием видимого и УФ света

Кофактор Структурная формула Степень восстановления кофактора, источник Степень восстановления белка ,%

6,7-DMP 0 XXX 75% УФ 75-85%

Люмазин 0 н 75% УФ нет

Рибофлавин О ОН ОН 85-95 % видимый свет 80-85%

Флавия -мононуклеотид (FMN) «V0 сн, I 2 но чс л н2с он НзСуу^у^0 0 85-95 % видимый свет 80-85%

Флавинаденин-динуклеотид (FAD) цА/ - - Р™1, н н <25% видимый свет нет .....

* - по сравнению со степенью восстановления ннтритредуктазы дитионнтом

В ряде опытов в пробы с восстановленным ферментом вносили МаК02 (концентрация в кювете 1 мМ) и после инкубации измеряли изменение содержания нитрита Оказалось, что в условиях постоянной освещенности скорость реакции восстановления нитрита с ФМН-Нг примерно на два порядка выше скорости реакции при участии РбфлН2, причем нитритредуктазная активность восстановленной ФМН-Н2 Ту№Я была в несколько раз выше активности фермента, восстановленного дитионитом (см таблицу 4) По-видимому, при использовании ФМН-Н2 в качестве восстановителя снимается ингибирующее влияние на процесс продуктов разложения дитионита В присутствии ФАДНг каталитическая активность восстановленного фермента не проявлялась

При проведении опыта в темновых условиях (восстанавливали определенное количество флавина видимым светом, который далее использовали для ферментативного восстановления нитрита в темноте) ферментативное восстановление нитрита происходило только при использовании в качестве донора ФМН-Нг, Проявление каталитической активности фермента в темновых условиях может быть связано с участием в процессе реакции химически-активных свободно-радикальны форм (ФИНН*), а не продуктов двухэлектронного восстановления (ФМНН2) [Нее1и, 1982]

Таблица 4. Сравнение скорости восстановление нитрита, катализируемое нитритредуктазой 7\> мйаигеЛисет, с различными донорами электронов

Субстрат Донор е Область спектра Скорость реакции мкмоль [Ж>2"]/мин на мг

нитрит Дитионит 150

нитрит Рбфл + ЕОТА Видимый свет 6,1-6,5

нитрит ФМН + ЕОТА Видимый свет 600

Полученные данные указывают, что ФМННг может функционировать в качестве природного донора электрона для Ту№Н, возможно, в качестве простетической группы редокс-белка флаводоксинового типа Этот донор может как восстанавливать фермент, так и обеспечивать электронами его каталитическую функцию - восстановление нитрита Результаты, полученные при исследовании восстановления Ту№11 фотосенсибилизированными молекулами флавинов, могут быть применимы для конструирования электронопроводящего наноустройства с фоторегулируемой инжекцией электрона, возможный механизм действия которого представлен на гипотетической схеме (Рис 15)

Е0' V -0 3

°"1

Фотоинжектор

ПН

Р-СООН

я+соде

+2 01

\

Внутримолекулярная Акцептор электрои-транспортнахцепь электронов

Е

'нете ре3+ Ч • Нете

. ЕоШ М

рез+ ^

Нете '

*

I МОг

Рис 15 Схема светозависимого перекоса этектрона от флавннов (птеринов) ва Т\Х|Г{ и далее на

субстрат (нитрит)

Выводы

1. Предложена новая схема выделения цитохром с ннтритредуктазы из галоалкалофичьной бактерии ПпоЫкаЫчЬпо т1г01гес1исегк, позволившая значительно повысить выход фермента в процессе очистки

2 Методами гель-фильтрации и малоуглового рентгеновского рассеяния показано, что основной структурной единицей фермента в растворе является гексамер

3. Охарактеризована субстратная специфичность цитохром с нитритредуктазы из Ту т1гаиге(Ьлсет Показано, что помимо нитрятредуктазной, фермент обладает гидроксиламинредуктазной и пероксидазной активностями

4. Электрохимические исследования фермента подтвердили эффективность прямого переноса электронов с электрода на каталитичекий гем и далее на субстрат через электрон-транспортную цепь, образованную темами в гексамере Методом вольтаммометрии в белковых пленках определены потенциал каталитического гема (-180мВ) и кинетические параметры реакций восстановления нитрита и гидроксиламина

5 Исследовано фунционирование электроя-переносящей цепи Ту№11 в условиях обеспечения ее электронами, поступающими от фотокаталитической системы с флавиновым сенсибилизатором Каталитическая активность ТуШ1 в отсутствие света проявлялась только при использовании в качестве донора ФМНН2, что позволяет предположить возможность участия фдавнновых коферментов или флавобелков в качестве физиологических доноров электронов для цитохром с нитритредуктазы из Ту пПгаПгейисет

Список работ по теме диссертации

1 Тихонова Т В, Слущсая Э С , Филимоненков А А, Бойко К M, Клейменов С Ю , Конарев П В, Поляков К M, Свергун Д И, Трофимов А.А, Хоменков В Г, Звягильская Р А., Попов В О, Выделение и олигомерный состав цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalmbrio mtratireducens Биохимия, 2008, № 2 , Т 73 , стр 202-209

2 Tikhonova, Т V, Slutskv. А, Antipov, А N, Poiyakov, К M, Boyko, К M , Sorokm, D Y, Zvyagilskaya, R A , Popov, V О , Molecular and catalytic properties of a novel cytochrome с nitrite reductase from nitrate-reducing haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalmbrio mtratireducens Biochim Biophys Acta, Protein Structure and Molecular Enzymology, 2006, V 1764 (4), p 715-723

3 Boyko К M, Poiyakov К M, Tikhonova T V , Slutskv A, Antipov A N, Zvyagilskaya R A , Bourenkov G P , Lamzin V S , Popov A N and Popov V О , Crystallization and preliminary X-Ray analysis of cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalmbrio mtratireducens Acta Cryst Section F, 2006, F62, p 215-217

4 Slutskava E S , Tikhonova T V, Boyko К M and Popov V О, From structure to function Cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalmbrio mtratireducens, 32 International Conference «Molecular machines», Vienna, Austria, 2007, V 274, S 1, p 222

5 Слуцкая Э С , Тихонова T В , Бойко К M, Поляков К M , Филлимоненков А , Попов А H, Ламзин В С, Попов В О, Каталитические свойства цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalmbrio mtratireducens, Международный конгресс «Биотехночогия состояние и перспективы развития», 2007, Москва, стр 307

6 Slutskava E S, Tikhonova T V, Boyko К M, Poiyakov К M, Antipov A N, Popov A N, Lamzin V S and Popov V О , The novel cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalmbrio mtratireducens catalytic properties and high resolution structure, Proceedings of the conference "Biocatalysis", 2005, St Petersburg, p 112

7 Boyko К M, Poiyakov К M, Antipov A N, Bourenkov G P , Lamzm V S , Popov A N , Slutskava E S. Tikhonova T V and Popov V О Structure of oxoamon polyreductase from Thioalkalmbrio mtratireducens and its complexes International Conference "Structural Biology at Crossroads From Biological Molecules to Biological Systems", Hamburg, Germany, 2004,15-18 September, 2

Подписано в печать 25 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 339 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слуцки Алвира

Введение

Литературный обзор

1. Биологический цикл азота

2. Восстановление нитрата и нитрита в бактериях. Транспорт через периплазматическую мембрану. з! Нитратредуктаза - ключевой фермент азотного метаболизма Нитритредуктаза - ключевой фермент последней стадии восстановления нитрата бактериями

3.1 Цитохром сс/? нитритредуктазы 15 !

3.2 Си - содержащие нитритредуктазы (Си-НиР)

3.3 Диссимиляторные цитохром с нитритредуктазы

3.3.1 Механизм респираторной аммонификации нитрита в бактериях

3.3.2 Структура цитохром с нитритредуктазного комплекса в протеобактериях

3.3.3 Строение и каталитические свойства цитохром с нитритредуктаз различных видов протеобактерий

3.3.4 Механизм реакции, катализируемой цитохром с нитритредуктазами

4.1 " " Исследование белков с помощью методов электрохимии. Исследование каталитических свойств нитритредуктаз с помощью методом вольтамперометрии.

5. Поиск возможного физиологического донора электронов "^N¡[

6. Характеристика экстремофильной бактерии ТЫоа1ка1МЬпо пИгаИгебисепБ.

Материалы и методы

1. Реактивы, используемые в работе

2. Объект исследования и условия его культивирования

3. Выделение цитохром с нитритредуктазы методом ВЭЖХ

4. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом ВЭЖХ

5. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом малоуглового рассеяния.

6. Определение субъединичного состава нитритредуктазы методом аналитического ультрацентрифугирования.

7. Определение нитритредуктазной активности (по методу Грисса)

8. Определение активности нитритредуктазы методом циклической вольтамперометрии

9. Определение нитрит- и гидроксиламинредуктазных активностей по окислению метилвиологена

10. | Определение конечного продукта реакции

11. | Определение пероксидазной активности 12. | Фотовосстановление нитритредуктазы "NN¡[4, 1 сенсибилизированное флавинами и птеринами 51 51 "

13. | Спектральные исследования

14. | Определение молекулярной массы и субъединичного состава 1 1 | белков методом электрофореза

15. Определения рН-оптимума нитритредуктазной и пероксидазной реакций

16. Масс-спектрометрический анализ

Результаты

1. Выделение, очистка и характеристика нитритредуктазы из клеток галоалкалофильной бактерии Гу.пИгаИгебисепэ.

2. Исследование олигомерного состава нитритредуктазы

3. Спектральные свойства ТуГ^Ш

4. 5" 6. 7." Характеристика субстратной специфичности "П/Ы^ Зависимость активности нитритредуктазы от рН среды Определение кинетических параметров реакций, катализируемых Т\/№1Ч Влияние различных ионов на активность "NN¡[4 61 64 65~~ '

8. Изучение термостабильности и температурного оптимума нитритредуктазой реакции

9. Электрохимическое исследование кинетических параметров ' 69 | ТуГ^ I I

10. Определение пероксидазной активности Тх/Г^Ш

11. Фотовосстановление сенсибилизированное флавинами и птеринами Выводы 98 |

Список публикаций Список литературы 99 |

Список сокращений.

ТУГУ!« Цитохром с нитритредуктаза ТЫоа1ка1мЬп'о пИгаИгеёисепз

N1^ МВ АБТС цитохром с нитритредуктаза Метилвиологен 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислота) диаммонийная соль

НАДН НАД(Ф)Н Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный Никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ФАД Флавинадениндинуклеотид

Ыа-ЭДТА Этилендиаминтетраацетат натрия

Рбфл РбфлНг ~ ЫЕЬА Рибофлавин Рибофлавин восстановленный N-(1 -нафтилэтилендиамин) дигидрохлорид

АТФ Аденозинтрифосфат

ФМН | Флавинмононуклеотид

ФМНН2 дт Флавинмононуклеотид восстановленный Дитионит натрия

ДСК Дифференциальная сканирующая калориметрия дмп 6,7-диметилптерин дмпн4 бДТ.в-тетрагидро-б.У-диметилптерин

Км Константа Михаэлиса-Ментен

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование каталитических свойств мультигемовой нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens"

Актуальность проблемы. Биогеохимический цикл азота связан с взаимопревращением соединений азота в широком интервале степеней окисления (от +5 до -3) и характеризуется разнообразием окислительно-восстановительных реакций, катализируемых металлосодержащими оксидоредуктазами. Системное исследование совокупности термодинамических, кинетических и структурных свойств этих ферментов, а также их комплексов с искусственными и физиологическими субстратами, ингибиторами, донорами и акцепторами электронов - это путь к пониманию механизмов действия и регуляции как отдельных ферментов, так и в целом процессов массо- и энергопереноса в клетках бактерий, участвующих в азотном обмене. Нитрит является одним из ключевых компонентов этого цикла. Основная роль в процессах его потребления принадлежит нитритредуктазам различного строения и локализации. Восстановление нитрита может осуществляться в ходе ассимиляторных, респираторных или диссимиляторных процессов, протекающих в клетках бактерий. Ассимиляторное восстановление нитрита приводит к образованию иона аммония, который включается клеткой в синтез биомассы. Этот процесс катализируется цитоплазматической сирогем-содержащей нитритредуктазой, которая использует НАД(Ф)Н или ферредоксин в качестве доноров электронов. Респираторное восстановление нитрита может катализироваться тремя классами ферментов. Цитохром ccfi-содержащая и медь-содержащая нитритредуктазы катализируют одноэлектронное восстановление нитрита до окиси азота NO, которая затем восстанавливается до N2 путем последовательного действия нескольких редуктаз. Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (NrfA) катализируют шестиэлектронное восстановление нитрита непосредственно до аммиака без выделения промежуточных продуктов в окружающую среду.

Мономеры NrfA имеют молекулярную массу около 50 «Да, являются однодоменными белками и содержат пять гемов с, один из которых, координированный в проксимальном положении аминогруппой Lys, является каталитическим, остальные - принимают участие в переносе электронов. Структурные исследования показали, что функциональной единицей NrfA является димер, его образование приводит к образованию единой электрон-транспортной цепи, состоящей из 10 гемов с и позволяет осуществлять передачу электронов с одного мономера на другой, повышая таким образом эффективность работы фермента

Предполагается, что помимо участия в дыхательных процессах в клетках бактерий выполняет функции детоксикации клетки от избытка нитрита и N0.

В Институте биохимии им. А.Н.Баха из растворимой фракции клеточного экстракта галоалкалофильной серуокисляющей бактерии ТЫоа1ка1МЬпо пНгаИгебисепз была выделена новая цитохром с нитритредуктаза ("NN¡(4)

Пк1топоуа 1М. а/, 2006]. Определение пространственной структуры ТуМК показало, что фермент существенно отличается от ранее описанных в литературе ША: мономер ТуМК представляет собой двухдоменный белок, содержащий восемь гемов с, пять из которых, включая каталитический, гомологичны пяти гемам известных ША, а дополнительные три гема расположены на отдельном домене. В кристалле ТуМК существует как высокосимметричный гексамер с молекулярной массой 380 кДа. Образование гексамера, содержащего 48 гемов с, не приводит к образованию коллективной электрон-транспортной цепи, связывающей несколько активных центров. В связи с этим возникает вопрос о роли столь сложной структуры в катализе, а также об олигомерном состоянии белка в растворе и в клетке. Для понимания связи между структурой и функцией фермента, а также понимания физиологического состояния и роли фермента в клетке предполагается провести комплексное исследование кинетических, термодинамических и структурных свойств различных олигомеров .

Цель работы. Целью настоящей работы являлась характеристика физико-химических и каталитических свойств цитохром с нитритредуктазы из бактерии Шоа1ка1МЬпо пИгаИгейисепБ

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработка и оптимизация процедуры выделения и очистки хроматографическими методами, оптимизация методов определения активности фермента в растворе с различными субстратами.

2) Характеристика физико-химических свойств, олигомерного состава и субстратной специфичности ТуМР.

3) Исследование модельных систем транспорта электрона в активный центр нитритредуктазы (фото- и электрохимические системы восстановления активного центра фермента).

Научная новизна. Настоящая работа посвящена изучению новой гексамерной 48-гемовой цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной у-протеобактерии

Tv. nitratireducens, представляющей собой уникальную высокоорганизованную систему, обеспечивающую эффективный направленный транспорт электронов и протонов. Предложена двухстадийная схема выделения TvNiR, позволившая значительно повысить выход белка по сравнению с ранее применявшимся методом препаративного электрофореза. Охарактеризован олигомерный состав TvNiR в растворе с применением хроматографических методов и метода малоуглового рентгеновского рассеяния. Показано, что в растворе фермент существует в виде высокостабильного гексамера с молекулярной массой около 380 кДа. Охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства TvNiR. Показано, что фермент катализирует реакции восстановления нитрита, гидроксиламина, сульфита и пероксида водорода. Исследовано функционирование электрон - транспортной цепи TvNiR в условиях ее обеспечения электронами, поступающими от фотокаталитической системы, использующей доноры электронов флавиновой или птериновой природы или непосредственно от электрода, на который был иммобилизован фермент. Показано, что флавины и/или флавосодержащие белки могут рассматриваться как потенциальные физиологические доноры электронов для TvNiR. Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы расширяют имеющиеся сведения о свойствах мультигемовых цитохромов, играющих ключевую роль в метаболических процессах, связанных с переносом электронов. Установление структурно-функциональных связей и закономерностей функционирования электрон-транспортной цепи гемов в гексамере может быть использовано для развивающейся сейчас биоэлектроники: создания электронопроводящих материалов на основе биомолекул.

Высокая стабильность иммобилизованных на электроде препаратов TvNiR в сочетании с широким рабочим интервалом рН, ионной силы, температуры, а также высокой активностью определяет перспективность использования фермента в качестве биосенсора при определении нитрита. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Structural Biology at Crossroads: From Biological Molecules to Biological Systems» (Germany, Gamburg, 2004), международная конференция «Biocatalysis-2005» (Москва, 2005), и "Biocatalysis - 2007" (Москва, 2007), международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 32-й международный конгресс FEBS «Molecular machines» (Austria, Vienna, 2007).

Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликованы 3 статьи.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 179 ссылок. Работа изложена на 116 страницах, содержит 53 рисунка и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Слуцки Алвира

Выводы

1. Предложена новая схема выделения цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии ТЫоа1каЫЬпо пИгаИгедисепБ, позволившая значительно повысить выход фермента в процессе очистки.

2. Методами гель-фильтрации и малоуглового рентгеновского рассеяния показано, что основной структурной единицей фермента в растворе является гексамер.

3. Охарактеризована субстратная специфичность цитохром с нитритредуктазы из Тч. пИгаИгес1исепз. Показано, что помимо нитритредуктазной, фермент обладает гидроксиламинредуктазной и пероксидазной активностями.

4. Электрохимические исследования фермента подтвердили эффективность прямого переноса электронов с электрода на каталитичекий гем и далее на субстрат через электрон-транспортную цепь, образованную темами в гексамере. Методом вольтамперометрии в белковых пленках определены кинетические параметры реакций восстановления нитрита и гидроксиламина.

5. Исследовано фунционирование электрон-переносящей цепи ТуЫ^ в условиях обеспечения ее электронами, поступающими от фотокаталитической системы с флавиновым сенсибилизатором. Каталитическая активность "Ь/МК в отсутствие света проявлялась только при использовании в качестве донора ФМННг, что позволяет предположить возможность участия флавиновых коферментов или флавобелков в качестве физиологических доноров электронов для цитохром с нитритредуктазы из ТУ. пИгаНгес1исепз.

Список работ по теме диссертации

1. Тихонова Т.В., Слуцкая Э.С., Филимоненков А.А, Бойко K.M., Клейменов С.Ю., Конарев П.В., Поляков K.M., Свергун Д.И., Трофимов A.A., Хоменков В.Г., Звягильская P.A., Попов В.О., Выделение и олигомерный состав цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens. Биохимия, 2008, № 2 , Т.73., стр.202-209

2. Tikhonova, T.V., Slutsky, A. Antipov, A.N., Polyakov, K.M., Boyko, K.M., Sorokin, D.Y.; Zvyagilskaya, R.A.; Popov, V.O., Molecular and catalytic properties of a novel cytochrome с nitrite reductase from nitrate-reducing haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens. Biochim. Biophys. Acta, Protein Structure and Molecular Enzymology, 2006, V.1764 (4), p. 715-723.

3. Boyko K.M., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Slutsky A. Antipov A.N., Zvyagilskaya R.A., Bourenkov G.P., Lamzin V.S., Popov A.N. and Popov V.O., Crystallization and preliminary X-Ray analysis of cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. Acta Cryst. Section F, 2006, F62, p. 215-217.

4. Slutskava E.S., Tikhonova T.V., Boyko K.M and Popov V.O., From structure to function: Cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens,32 International Conference «Molecular machines», Vienna, Austria, 2007, V.274, S.1, p.222

5. Слуцкая Э.С., Тихонова T.B., Бойко K.M., Поляков K.M., Филлимоненков А., Попов А.Н., Ламзин B.C., Попов В.О., Каталитические свойства цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens, Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2007, Москва, стр. 307

6. Slutskava E.S. Tikhonova T.V., Boyko K.M., Polyakov K.M., Antipov A.N., Popov A.N., Lamzin V.S. and Popov V.O., The novel cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens: catalytic properties and high resolution structure, Proceedings of the conference "Biocatalysis", 2005, St. Petersburg, p.112

7. Boyko K.M., Polyakov K.M., Antipov A.N., Bourenkov G.P., Lamzin V.S., Popov A.N., Slutskava E.S, Tikhonova T.V. and Popov V.O. Structure of oxoanion polyreductase from Thioalkalivibrio nitratireducens and its complexes. International Conference "Structural Biology at Crossroads: From Biological Molecules to Biological Systems", Hamburg, Germany, 2004, 15-18 September, 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слуцки Алвира, Москва

1. Бойко, К.М. (2006) Структурно-функциональные исследования цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии thioalkalivibrio nitratireducens Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

2. Газарян, И. Г., Хушпульян, Д. М. Тишков, В. И. (2006) Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений. Успехи биологической химии, 46, 303-322

3. Королева О.В., Явметдинов И.С., Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова

4. B.П. (2001) Биохимия, 66, 618-622

5. Морозкина Е.В., Звягильская Р.А. (2007) Нитратредуктазы: структура, функции, влияние факторов стресса. Биохимия, 72(10), 1413-1424,

6. Тихонова, Т.В., Слуцкая, Э.С., Филимоненков, А.А, Бойко, К.М., Клейменов,

7. Шумянцева В.В., Булко Т.В., Шмид Р.Д., Арчаков А.И. (2000) Фотовосстановление флавоцитохрома Р450 2В4. Биофизика, 45(6), 1013-1018

8. Adar, F. (1978) in: D. Dolphin (Ed.), The Porphyrins, Vol. II, Physical Chemistry, Part A, Academic Press, New York, 167-209

9. Adman, E.T., Godden, J.W., Turley S. (1995) The Structure of copper-nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes at five pH values, with N02 bound and with type II copper depleted. J. Biol. Chem., 270, 27458-27474

10. Almeida, M. G., Silveira, C. M., Guigliarelli, B., Bertrand, P., Moura, J.J., Moura, I., Léger, C. (2007) A needle in a haystack: the active site of the membrane-bound complex cytochrome c nitrite reductase. FEBS Lett., 581, 284-288

11. Angove, H.C., Cole, J.A., Richardson, D.J., Butt, J.N. (2002) Protein film voltammetry reveals distinctive fingerprints of nitrite and hydroxylamine reduction by a cytochrome c nitrite reductase. J. Biol Chem., 277, 23374-23381

12. Antipov, A. N., Sorokin, D. Y. L'vov, N. P., Kuenen J.G. (2003) New enzyme belonging to the family of molybdenum-free nitrate reductases. Biochem. J., 369, 185-189

13. Bamford, V.A., Angrove, H.C., Seward, H.E., Thomson, A.J., Cole, J.A., Butt, J.N., Hemmings, A.M., Richardson, D.J. (2002) Structure and spectroscopy of the periplasmic cytochrome c nitrite reductase from Escherichia coli. Biochemistry, 41, 2921-2931

14. Bard, A.J. and Faulkner, L.R. (2001) Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. 2nd edition. John Wiley &Sons, New York

15. Bedzyk, L., Wang, T., Ye, R. W. (1999) The periplasmic nitrate reductase in Pseudomonas sp. strain G-179 catalyzes the first step of denitrification. J. Bacteriol., 181, 2802-2806

16. Bell, L. C., Richardson, D. J. and Ferguson, S. J. (1990) Periplasmic and membrane-bound respiratory nitrate reductases in Thiosphaera pantotropha. The periplasmic enzyme catalyses the first step in aerobic denitrification. FEBS Lett, 265, 85-87

17. Bertero, M. G., Rothery R.A., Palak M., Hou C., Lim D., Blasco F., Weiner J. N., Strynadka N.C. (2003) Insights into the respiratory electron transfer pathway from the structure of nitrate reductase A. Nat Struct Biol., 10(9), 681-687

18. Boulanger, M.J., Kukimoto, M., Nishiyama, M., Horinouchi, S., Murphy, M.E.2000) Catalytic roles for two water bridged residues (Asp-98 and His-255) in the active site of copper-containing nitrite reductase. J. Biol. Chem., 275, 23957-23964

19. Bradford, M. (1976) A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal.Biochem., 72, 248-254

20. Brondijk, T.H.C., Fiegen, D, Richardson, D.J., Cole, J.A. (2002) Roles of NapF, NapG and NapH, subunits of the Escherichia coli periplasmic nitrate reductase, in ubiquinol oxidation. Molecular Microbiology, 44, 245-255

21. Bruck TB, Fielding RJ, Symons MC, Harvey PJ. (2001) Mechanism of nitrite-stimulated catalysis by lactoperoxidase. Eur J Biochem., 268(11), 3214-22

22. Brzezinski P, Wilson MT. (1997) Photochemical electron injection into redox-active proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 94(12), 6176-6179

23. Burlat B, Gwyer JD, Poock S, Clarke T, Cole JA, Hemmings AM, Cheesman MR, Butt JN, Richardson DJ. (2005) Cytochrome c nitrite reductase: from structural to physicochemical analysis. Biochem Soc Trans., 33(1),137-40

24. Butt, J. N., Anderson, L. J., Rubio, L. M., Richardson D. J., Flores, E., Herrero,

25. A. (2002) Enzyme-catalysed nitrate reduction—themes and variations as revealed by protein film voltammetry. Bioelectrochemistry, 56, 17-18

26. Butt, J. N. (2003) Fresh perspectives on nitrogen cycle enzymes from protein film voltammetry. Recent. Res. Devel. Biochem., 4, 4159-180

27. Campbell, W.H. (2001) Structure and function of eukaryotic NAD(P)H : nitrate reductase. Cell. Mol. Life Sci., 58, 194-204

28. Choi H.-G., Min J., Choi J.-W., Lee W.H. (1998) Molecular photoreceptor consisting of bacteriorhodopsin / flavin complex Langmuir-Blodgett films. Biosensors and Bioelectronics, 13, 1069-1075

29. Clarke, T.A., Cole, J.A., Richardson, D.J., Hemmings, A.M. (2007) The crystal structure of the pentahaem c-type cytochrome NrfB and characterization of its solution-state interaction with the pentahaem nitrite reductase NrfA.Biochem J. , 406(1), 19-30

30. Clegg, S., Feng, Y., Griffiths, L. and Cole, J.A. (2002) The roles of the polytopic membrane proteins NarK, NarU and NirC in Escherichia coli K-12: two nitrate and three nitrite transporters, Mol. Microbiol., 44, 143-155

31. Correia, C., Monzani, E., Moura, I., Lampreia, J., Moura, J.J. (1999) Cross-linking between cytochrome c3 and flavodoxin from Desulfovibrio gigas. Biochem Biophys Res Commun., 256(2), 367-71

32. Costa C, Moura JJ, Moura I, Wang Y, Huynh ВН. (1996) Redox properties of cytochrome с nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. J Biol Chem., 271(38), 23191-23196

33. Cutruzzola, F. (1999) Bacterial nitric oxide synthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1411 (2-3), 231-249

34. Cutruzzola, F., Rinaldo, S., Centola, F., Brunori, M. (2003) NO production by Pseudomonas aeruginosa cd1 nitrite reductase. IUBMB Life, 55 (10-11), 617-621

35. Daly, M.J. (2001) The emerging impact of genomics on the development of biological weapons. Threats and benefits posed by engineered extremophiles.Clin Lab Med., 21(3), 619-629

36. Daniel-Vedele, F., Filleur, S., Caboche, M. (1998) Nitrate transport: a key step in nitrate assimilation. Curr. Opin. Plant Biol., 1,235-239

37. Dobao, M. M., Martinez-Luque, M., Moreno-Vivian, C. and Castillo, F. (1994) Effect of carbon and nitrogen metabolism on nitrate reductase activity of Rhodobacter capsulatus E1F1. Can. J. Microbiol., 40, 645-650

38. Einsle, O., Messerschmidt, A., Huber, R., Kroneck, P.M.H., Neese, F. (2002) Mechanism of the six-electron reduction of nitrite to ammonia by cytochrome c nitrite reductase. J. Amer. Chem. Soc., 124, 11737-11745

39. Einsle, O., Messerschmidt, A., Stach, P., Bourenkov, G. P., Bartunik, H. D., Huber, R. and Kroneck, P. M. H. (1999) Structure of cytochrome c nitrite reductase. Nature, 400, 476-480

40. Eisenmann, E., Beuerle, J., Sulger, K., Kroneck, P.M.H., Schumacher, W. (1995) Lithotrophic growth of Sulfurospirillum deleyianum with sulfide as electron donor coupled to respiratory reduction of nitrate to ammonia. Arch. Microbiol., 164, 180185

41. Farver, O., Kroneck, P.M.H., Zumft, W.G., Pecht, I. (2002) Intramolecular electron transfer in cytochrome cd1 nitrite reductase from Pseudomonas stutzeri; kinetics and thermodynamics. Biophys. Chem., 98, 27-34

42. Farver, O., Kroneck, P.M.H., Zumft, W.G., Pecht, I. (2003) Allosteric control of internal electron transfer in cytochrome cd1 nitrite reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 100, 7622- 7625

43. Fukuzumi S., Tanii K., Tanaka T. (1989) Formation of radical cations of dihydropteridine and dihydroflavin in the photoreduction of pteridine and flavin analogues by benzyl alcohol derivatives. Chem. Letts, 1, 35-38

44. Fiilop, V., Moir, J.W.B., Ferguson, S.J., Hajdu, J. (1995) The anatomy of a bifunctional enzyme: structural basis for reduction of oxygen to water and synthesis of nitric oxide by cytochrome cd1. Cell, 81, 369-377

45. Gadda, G., Fitzpatrick, P.F. (1998) Biochemical and Physical Characterization of the Active FAD-Containing Form of Nitroalkane Oxidase from Fusarium oxysporum. Biochemistry, 37(17), 6154-64

46. Gajhede, M., Schuller, D. J., Henriksen, A., Smith, A. T., Poulos, T. L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase c at 2.15 A resolution. Nat. Struct. Biol., 4, 1032-1038

47. Gavira, M., Roldan, M. D., Castillo, F., Moreno-Vivian, C. (2002) Regulation of nap gene expression and periplasmic nitrate reductase activity in the phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides DSM158. J Bacteriol, 184, 1693-1702

48. Gebicka, L. (1999) Kinetic studies on the oxidation of nitrite by horseradish peroxidase and lactoperoxidase. Acta Biochim. Pol., 46, 919-927

49. Gilardi G, Meharenna YT, Tsotsou GE, Sadeghi SJ, Fairhead M, Giannini S. (2002) Molecular Lego: design of molecular assemblies of P450 enzymes for nanobiotechnology. Biosens Bioelectron., 17(1-2), 133-45

50. Glockner, A.B., Jiingst, A., Zumft, W.G. (1993) Copper-containing nitrite reductase from Pseudomonas aureofaciens is functional in a mutationally cytochrome cd1-free background (NirS-) of Pseudomonas stutzeri, Arch Microbiol., 160(1), 18-26

51. Greene, E.A., Hubert, C., Nemati, M., Jenneman, G.E., Voordouw, G. (2003) Nitrite reductase activity of sulphate-reducing bacteria prevents their inhibition by nitrate-reducing, sulphide-oxidizing bacteria. Environ Microbiol., 5, 607-617

52. Gu, Y., Li, P., Sage. J.T., Champion, P.M. (1993) Photoreduction of heme proteins: spectroscopic studies and cross-section measurements. J. Am. Chem. Soc., 115, 4993-5004

53. Gwyer, J.D., Angove, H.C., Richardson, D.J., Butt, J.N. (2004) Redox-triggered events in cytochrome c nitrite reductase. Bioelectrochemistry, 63, 43-47

54. Gwyer, J.D., Zhang, J., Butt, J.N., Ulstrupy, J. (2006) Voltammetry and In Situ Scanning Tunneling Microscopy of Cytochrome c Nitrite Reductase on Au(111) Electrodes. Biophys. J., 91, 3897-3906

55. Heelis, P.R., 1982 The Photophysical and Photochemical Properties of Flavins1.oalloxazines). Chem. Soc. Rev., 1982, 11, 15-39

56. Henry, E.R., Eaton, W.A., Hochstrasser, R.M. (1986) Molecular dynamics simulations of cooling in laser-excited heme proteins. Proc Natl Acad Sci USA., 83(23), 8982-8986

57. Hirst, J. (2006) Elucidating the mechanisms of coupled electron transfer and catalytic reactions by protein film voltammetry. Biochimica et Biophysica Acta, 1757, 225-239

58. Jia, W. and Cole, J.A. (2004) Nitrate and nitrite transport in Escherichia coli, 10th Nitrogen Cycle Meeting, 159-161

59. Kajie, S., Anraku, Y. (1986) Purification of a hexaheme cytochrome c552 from Escherichia coli K 12 and its properties as a nitrite reductase. Eur. J. Biochem., 154, 457-463

60. Kamal, J.K.A., Behere, D.V. (2003) Activity, stability and conformational flexibility of seed coat soybean peroxidase. J Inorg Biochem. 94(3), 236-242

61. Kataoka, K., Furusawa, H., Takagi, K., Yamaguchi, K., Suzuki, S. (2000) Functional analysis of conserved aspartate and histidine residues located around the type 2 copper site of copper-containing nitrite reductase. Biochem. J., 127(2), 345350

62. Katz, E. (2006) Bioelectronics. Bectroanalysis, 18(19-20), 1855 1857

63. Kennis, J.T., Crosson, S., Gauden, M., van Stokkum, I.H., Moffat, K., van Grondelle, R. (2003) Primary reactions of the LOV2 domain of phototropin, a plant blue-light photoreceptor. Biochemistry, 42(12), 3385-92

64. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I.2003) PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J. Appl. Cryst., 36, 1277

65. Kritsky, M.S., L'vov, N.P. (1992) Flavoproteins as natural prototypes of molecular electronic devices with photocontrolled conductivity. J. Brit. Interplane. Soc., 45, 421-426

66. Kritsky, M.S., Lyudnikova, T.A., Mironov, E.A., Moskaleva, I.V. (1997) The UV radiation driven reduction of pterins in aqueous solution. J. Photochem. Photobiol., B (Biol.), 48 (1), 43-48

67. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685

68. Lawson DM, Stevenson CE, Andrew CR, Eady RR. (2000) unprecedented proximal binding of nitric oxide to heme: implications for guanylate cyclase. EMBO J., 19(21), 5661-5671

69. Le'ger, C., Elliott, S. J., Hoke, K. R., C. Jeuken L. J., Jones, A. K., Armstrong, F.

70. A. (2003) Enzyme electrokinetics: using protein film voltammetry to investigate redox enzymes and their mechanisms. Biochemistry, 42(9), 8653-8662

71. Le'ger, C., Lederer, F., Guigliarelli, B., Bertrand, P. (2006) Electron Flow in Multicenter Enzymes: Theory, Applications, and Consequences on the Natural Design of Redox Chains. J. Am. Chem. Soc., 128, 180-187

72. Leys, D., Backers, K., Meyer, T. E., Hagen, W. R., Cusanovich, M. A., and van Beeumen, J. J. (2000) Crystal structures of an oxygen-binding cytochrome c from Rhodobactersphaeroides, J. Biol. Chem., 275, 16050-16056

73. Lin L., Sulea T., Szittner R., Vassilyev V., Purisima E. O., Meighen E. A. (2001) Modeling of the bacterial luciferase-flavin mononucleotide complex combining flexible docking with structure-activity data. Protein Science, 10, 1563-1571

74. Lin, J. T. and Stewart, V. (1998) Nitrate assimilation by bacteria. Adv. Microbial. Physiol., 39,1-30

75. Liu, M.-C., Liu, M.-Y., Payne, W.J., Peck Jr., H.D., LeGall, J. (1983) Wolinella succinogenes nitrite reductase: purifcation and properties. FEMS Microbiol. Lett., 19, 201-206

76. Liu, M.C., Peck, H.D. (1981) The isolation of a hexaheme cytochrome from Desulfovibrio desulfuricans and its identification as a new type of nitrite reductase. J. Biol. Chem., 256, 13159-13164

77. Lorenzen, J.P., Kroger, A. and Unden, G. (1993) Regulation of anaerobic pathways in Wolinella succinogenes by the presence of electron acceptors. Arch. Microbiol., 159, 477-483

78. Lovley, D.R. (2003) Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nat. Rev. Microbiol., 1, 35-44

79. Meighen, E.A., Mac-Kenzie, R.E. (1973) Flavine specificity of enzyme-substrate intermediates in the bacterial bioluminescent reaction. Structural requirements of the flavine side chain. Biochemistry, 12 (8), 1482-1491

80. Mitchell, G.J., Jones, J.G. and Cole, J.A. (1986) Distribution and regulation of nitrate and nitrite reduction by Desulfovibrio and Desulfotomaculum species. Arch. Microbiol., 144, 35-40

81. Moir J. W. B. and Wood N. J. (2001) Nitrate and nitrite transport in bacteria, Cell. Mol. LifeSci., 58, 215-224

82. Murphy, L.M., Dodd, F.E., Yousafzai, F.K., Eady, R.R., Hasnain, S.S. (2002) Electron donation between copper containing nitrite reductases and cupredoxins: the nature of protein protein interaction in complex formation. J. Mol. Biol., 315, 859871

83. Murphy, M.E.P., Lindley, P.F., Adman, E.T. (1997) Structural comparison of cupredoxin domains: domain recycling to construct proteins with novel functions. Prof. Sci., 6, 761-770

84. Nicolas D.J.D., Nason A. (1957) Determination of nitrate and nitrite. Meth. Enzymol., 3, 981-954

85. Nurizzo D., Cutruzzola F., Arese M., Bourgeois D., Brunori M., Cambillau C., Tegoni M. (1998) Conformational changes occurring upon reduction and NO binding in nitrite reductase from Pseudomonas aeruginosa. Biochemistry , 37(40), 1398713996

86. Otto, K., Jayaram, M., Hamilton, R. M., Delbruck, M. (1981) Replacement of Riboflavin by an Analogue in the Blue-Light Photoreceptor of Phycomyces. PNAS, 78, 266-269

87. Palma, N., Moura, I., LeGall, J., Beeumen, V., Wampler, J., Moura, J.J.G. (1994) Evidence for a ternary complex formed between flavodoxin and cytochrome c3: 1H-NMR and molecular modeling studies. Biochemistry, 33, 6394-6407

88. Pereira, C., LeGall, J., Xavier, A.V.M., Teixeira, M. (2000) Characterization of a heme c nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism, Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta, 1481(1), 119-130

89. Pereira, I.C., Abreu, I.A., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira M. (1996) Nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774)-a heterooligomer heme protein with sulfite reductase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 224(3), 611-618

90. Philippot, L., Hojberg, O. (1999) Dissimilatory nitrate reductases in bacteria. Biochim Biophys Acta, 1446, 1-23

91. Pisa, R., Stein, T., Eichler, R., Gross, R. and Simon, J. (2002) The nrfl gene is essential for the attachment of the active site haem group of Wolinella succinogenes cytochrome c nitrite reductase. Moi. Microbiol., 43, 763-770

92. Pittman, M.S., Kelly D.J. (2005) Electron transport through nitrate and nitrite

93. Plaut, G. W. E. (1971) Metabolism of water soluble vitamins. The biosynthesis of riboflavin, in Florkin, M., and Stotz, E. H. (Eds.), Comprehensive Biochemistry, 1145, Elsevier, Amsterdam

94. Potter, L., Angove, H., Richardson, D., Cole, J. A. (2001) Nitrate reduction in the periplasm of Gram-negative bacteria. Advances in Microbial Physiology, 45, 51-112

95. Poulos, T. L. (1993) Peroxidases. CurrOpin Biotechnol., 4(4), 484-489

96. Prasad S., Nakul C. Maiti, Mazumdar S., Mitra S. (2002) Reaction of hydrogen peroxide and peroxidase activity in carboxymethylated cytochrome c: spectroscopic and kinetic studies. BBA, 1596, 63-75

97. Radi, R., Thomson, L., Rubbo, H., Prodanov, E. (1991) Cytochrome c-catalyzed oxidation of organic molecules by hydrogen peroxide. Arch. Biochem. Biophys., 288, 112-117

98. Reyes, F., Gavira, M., Castillo, F. and Moreno-Vivian, C. (1998) Periplasmic nitrate-reducing system of the phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides

99. DSM 158: transcriptional and mutational analysis of the napKEFDABC gene cluster. Biochem. J., 331, 897-904

100. Richardson D.J. (2000) Bacterial respiration: a flexible process for a changing environment. Microbiology, 146 (Pt 3), 551-571

101. Richardson, D. J., Berks, B. C., Russell, D. A., Spiro S. and Taylor C. J. (2001) Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases. Cell. Mol. Life Sci., 58, 165-178

102. Richter, C.D., Allen, J.W.A., Higham, C.W., Koppenhofer, A., Zajicek, R.S., Watmough, N.J., Ferguson, S.J. (2002) Cytochrome cd1, reductive activation and kinetic analysis of a multifunctional respiratory enzyme. J. Biol. Chem., 277(5), 3093-3100

103. Rodriques, M. L., Oliveira, T. F., Pereira, I. A. C., Archer, M. (2006) X-ray structure of the membrane-bound cytochrome c quinol dehydrogenase NrfH reveals novel haem coordination. EMBO J. , 25, 5951-5960

104. Roman, R., Dunford, H.B. (1973) Studies on horseradish peroxidase. XII A kinetic study of the oxidation of sulfite and nitrite by compound I and II. Can. J. Chem., 51, 588-596

105. Rudolf, M., Einsle, O., Neese, F., and Kroneck, P. M. H. (2002) Pentahaem cytochrome c nitrite reductase: reaction with hydroxylamine, a potential reaction intermediate and substrate. Biochem. Soc. Trans., 30, 649-653

106. Sadeghi, S.J., Meharenna, Y.T., Fantuzzi, A., Valetti, F., Gilardi G. (2000) Engineering artificial redox chains by molecular 'Lego'. Faraday Discuss., 116, 135153; discussion 171-90

107. Saier, M.H. Jr. (2000) Vectorial metabolism and the evolution of transport systems. J. Bacterid., 182(18), 5029-35

108. Sakharov, I.Yu., Vesga M.K., Galaev , I.Yu., Sakharova, I.V., Pletjushkina, O.Yu.2001) Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and some properties. Plant Science, 161, 853-860

109. Salomon, M., Christie, J.M., Knieb, E., lempert, U., Briggs, W.R. (2000) Photochemical and Mutational Analysis of the FMN-Binding Domains of the Plant Blue Light Receptor, Phototropin. Biochemistry, 39(31), 9401-9410

110. Schuller, D. J., Ban, N., Huystee, R. B., McPherson, A., Poulos, T. L. (1996) The crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 4, 311-321

111. Seitz, H.-J., Cypionka, H. (1986) Chemolithotrophic growth of Desulfovibrio desulfuricans with hydrogen coupled to ammonification of nitrate or nitrite. Arch. Microbiol., 146, 63-67

112. Sellars, M.J., Hall, S.J., Kelly, D.J. (2002) Growth of Campylobacter jejuni supported by respiration of fumarate, nitrate, nitrite, trimethylanine-N-oxide, or dimethyl sulfoxide requires oxygen. J. Bacteriol., 184(15), 4187-4196

113. Sharma, V., Noriega, Chris E., John, J. (2006) Involvement of NarK1 and NarK2 Proteins in Transport of Nitrate and Nitrite in the Denitrifying Bacterium Pseudomonas aeruginosa PA01, Rowe, applied and environmental microbiology, 72(1), 695-701

114. Sharp, E., Moser, C. C., Rabanal, F., Leslie Dutton, P. (1998) Design, synthesis, and characterization of a photoactivatable flavocytochrome molecular maquette. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10465-10470

115. Schuck P. (2000) Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling. Biophys J., 78(3),1606-19

116. Shumyantseva VV, Bulko TV, Schmid RD, Archakov Al. (2002) Photochemical properties of a riboflavins/cytochrome P450 2B4 complex. Biosens Bioelectron., 17(3), 233-238

117. Siddiqui, R.A., Warnecke-Eberz, U., Hengsberger, A., Schneider, B. and Friedrich, B. (1993) Structure and function of a periplasmic nitrate reductase in Alcaligenes eutrophus H16, J. Bacterid., 175, 5867-5876

118. Silvestrini, M. C., Falcinelli, S., Ciabatti, I., Cutruzzola, F., Brunori M. (1994) Pseudomonas aeruginosa nitrite reductase (or cytochrome oxidase): an overview. Biochimie, 76(7), 641-54

119. Simon, J. (2002) Enzymology and bioenergetics of respiratory nitrite ammonification. FEMS Microbiol. Rev., 26, 285-309

120. Simon, J., Pisa, R., Stein, T., Eichler, R., Klimmek, O., Gross, R. (2001) The tetraheme cytochrome c NrfH is required to anchor the cytochrome c nitrite reductase (NrfA) in the membrane of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem., 268, 5776-5782

121. Sorokin, D. Y., Tourova, T. P., Sjollema, K. A., Kuenen, J. G. (2003) Thialkalivibrio nitratireducens sp. nov., a nitrate-reducing member of an autotrophic denitrifying consortium from a soda lake. IJSEM, 53, 1779-1783

122. Stach, P., Einsle, O., Schumacher, W., Kurun, E., Kroneck, P.M.H. (2000) Bacterial cytochrome c nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem., 79, 381-385.

123. Stewart, V., Lu, Y., Darwin, A.J. (2002). Periplasmic nitrate reductase (NapABC enzyme) supports anaerobic respiration by Escherichia co//'K-12. J. Bacteriol., 184, 1314-1323

124. Stolz, J.F., Basu, P. (2002) Evolution of nitrate reductase: molecular and structural variations on common function. ChemBioChem., 3, 198-206

125. Sundaramoorthy, M., Kishi, K., Gold, M.H., Poulos, T.L. (1994) The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-A resolution. J Biol Chem., 269(52), 32759-32767

126. Suruga, K., Murakami, K., Taniyama, Y., Hama, T., Chida, H., Satoh, T., Yamada, S., Hakamata, W., Kawachi, R., Isogai, Y., Nishio, T., Okua, T. (2004)

127. A novel microperoxidase activity: methyl viologen-linked nitrite reducing activity of microperoxidase, BBRC, 315, 815-822

128. Suzuki, S., Kataoka, K., Yamaguchi, K. (2000) Metal coordination and mechanism of multicopper nitrite reductase. Acc. Chem. Res., 33, 728-735

129. Svergun D. I., Barbareto C., Koch M. H. J. (1995) CRYSOL a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. J. Appl. Cryst., 28, 778

130. Svergun, D.I. (1992) Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr., 25, 495-503

131. Tanner, J., Mitchell. D., Miller, S., Wilson, K. S., Tu, S.-C., Krause K. L. (1997) Structure of bacterial luciferase beta 2 homodimer: implications for flavin binding. Biochemistry, 36(4), 665-672

132. Tavares, P., Pereira, A.S., Moura, J.J.G., Moura, I. (2006) Metalloenzymes of the denitrification pathway. J. Inorg. Biochem., 100(12), 2087-2100

133. Tosques, I. E., Kwiatkowski, A. V., Shi, J., Shapleigh, J. P. (1997) Characterization and Regulation of the Gene Encoding Nitrite Reductase in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3, J. Bacteriol., 179 (4), 1090-1095

134. Widdel, F., Pfennig, N. (1982) Studies on dissimilatory sulfatereducing bacteria that decompose fatty acids. II. Incomplete oxidation of propionate by Desulfobulbus propionicus gen. nov., sp. nov. Arch. Microbiol., 131, 360-365

135. Williams, P.A., Fülöp, V., Garman, E.F., Saunders, N.F.W., Ferguson, S.J., Hajdu, J. (1997) Haem-ligand switching during catalysis in crystals of a nitrogen-cycle enzyme. Nature, 389, 406-412

136. Williams, R.M., Braslavsky, S.E. (2003) Photosensors triggering photomovement chromophores and their photochemistry.http://www.photobiology.info/develop/AdvModsPMoveBraslavsky.htm

137. Wolin, M.J., Wolin, E.A., Jacobs, N.J. (1961) Cytochrome-producing anaerobic vibrio, Vibrio succinogenes sp. n. J. Bacteriol., 81, 911-917

138. Yamada, S., Suruga, K., Ogawa, M., Hama, T., Satoh, T., Kawachi, R., Nishio, T., Oku, T. (2002) Appearance of nitrite reducing activity of cytochrome c upon heat denaturation. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2044-2051

139. Zajicek, R.S., Allen, J.W., Cartron, M.L., Richardson, D.J., Ferguson, S.J. (2004) Paracoccus pantotrophus NapC can reductively activate cytochrome cdi nitrite reductase. FEBS Letters, 565, 48-52

140. Zumft, W.G. (1997) Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 533-616