Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens

Бойко, Константин Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens"

На правах рукописи „

Бойко Константин Михайлович

Структурно-функциональные исследования цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии ТМоа1ка!МЬпо ШШ!гес!исепз

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2006

Работа выполнена в. лаборатории, инженерной энзимшогш Института биохимии им. АЛ, Баха РАН' :

Научные руководители доктор химических наук,

профессор В.О. Полов кандидат физико-математических наук '..'■■. К.М.; Поляков

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор Д.И. Левицкий доктор физико-математических наук В.Р. Мелик-Адамян

Ведущая организация Институт белка РАН, г. Пущино

Защита состоится «_»__2006 г. в__ч. _мин. на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, дом 33, корп. 2

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, дом 33, корп. 1

Автореферат разослан «__»__2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Орловский А.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Цитохром с нитритредуктазы являются ключевыми ферментами биологического цикла азота. Они катализируют реакцию респираторной аммонификации нитрита, а именно восстановление нитрита до аммония без высвобождения промежуточных продуктов реакции. Эти ферменты обнаружены у многих аммонифицирующих бактерий, принадлежащих к различным подкласам протеобактерий и достаточно хорошо изучены. Все известные цитохром с нитритредуктазы обладают близкими молекулярными и физико-химическими свойствами. Эти ферменты как в кристалле, так и в растворе существуют в виде гомодимеров. Мономеры массой 53-61 кДа содержат 5 гемов типа с в качестве простетических групп. Пространственное расположение гемов в мономере консервативно. Активные центры ферментов представлены консервативным набором остатков, а каналы для транспорта продукта и субстрата образованы схожим образом,

В 2000 году гомологичная цитохром с нитритредуктаза была впервые выделена из неаммонифицирующей сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfovibrío vulgaris Hildenborough, которая не использует ни нитрат, ни нитрит в качестве акцептора электронов в процессе анаэробного роста. Предполагаемая роль этого фермента в клеточном метаболизме состоит в детоксикации образующегося в цитозоле нитрита и в восстановлении сульфита.

В 2003 году в содовом озере Fazda в Египте была обнаружена нитратвосстанавливающая неаммонифицирующая облигатная хемолито-автотрофная и гапоалкапофильная сероокисляющая у-п ротеобактерия Thioalkallvibno nitratireducens (штамм ALEN 2), клеточные экстракты которой обладали высокой нитритредуктазной активностью. Выделенная из экстракта цитохром с нитритредуктаза существенно отличается от всех известных ферментов этого типа. Этот фермент характеризуется повышенно высокой нитритредуктазной активностью в сочетании с низким сродством к нитриту. В растворе он существует преимущественно в виде гексамера и, согласно данным металлоанализа, содержит от 8 до 10 атомов железа на субъединицу белка с молекулярной массой около 64 кДа. Однако, детальное изучение структуры и свойств этого фермента до настоящего времени не проводилось и его роль в клеточном метаболизме не установлена.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось структурно-функциональное исследование цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной у-протеобактерии ThioaJkalivibrío nitratireducens. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Локализовать и сиквенировать ген цитохром с нитритредуктазы (TvNiR) из галоалкалофильной бактерии Thioaikalivibrio nitratireducens;

2. Получить кристаллы TvNiR, пригодные для рентгеноструктурного эксперимента;

3. Решить структуру TvNiR и провести ее детальный анализ;

4. Выявить структурные отличия между TvNiR и известными цитохром с нитритредуктазами (NrfAs) и попытаться сопоставить их с различиями в каталитических свойствах этих ферменто j.poc. национальная ?

БИБЛИОТЕКА f €„0*герфург < 09 тг»,ф

Научная новизна. В настоящей работе впервые получена с высоким разрешением структура апо-формы цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной у-протеобактерии Thioaikalivibrio nitratireducens. Показано, что структура этого фермента существенно отличается от структур известных цитохром с нитритредуктаз. В кристалле и растворе TvNiR существует в виде гексамера. Мономер TvNiR имеет 8 гемов с в качестве простетических групп, на 3 гема больше, чем мономеры известных NrfAs. Пространственное расположение пяти из восьми гемов TvNiR совпадает с расположением всех гемов известных цитохром с нитритредуктаз. В активном центре TvNiR обнаружена уникальная для цитохром с нитритредуктаз ковалентная связь между атомом серы остатка цистеина и атомом углерода боковой цепи каталитически важного остатка тирозина. Предполагаемая роль этой связи в повышении нитритредуктазной активности фермента обсуждается. Для гексамера TvNiR предложена уникальная схема электрон-транспортной цепи, замыкающейся при связывании белка-донора электронов.

Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы дополняют имеющиеся данные в области изучения мультигемовых цитохромов - быстро пополняющегося класса белков, играющих ключевую роль в метаболических процессах, связанных с переносом электронов и являющихся предметом повышенного интереса. Цитохром с нитритредуктаза из галоалкалофильного организма является ферментом с уникальными свойствами, отличающими ее от других ферментов этого класса. В работе проведен детальный анализ структуры этого фермента и сделаны предположения, касающиеся механизмов его функционирования.

Аппробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Structural Biology at Crossroads: From Biological Molecules to Biological Systems» (Hamburg, Germany, 2004), международная конференция «Biocatalysis-2005» (Москва, 2005), седьмая международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), а также на конкурсе аспирантских работ на соискание стипендии имени B.J1. Кретовича (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 2004).

Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (2 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 151 ссылку. Работа изложена на 111 страницах, содержит 46 рисунков и 23 таблицы.

Материалы и методы

1. Объекты исследования

В качестве объекта исследования была выбрана цитохром с нитритредуктаза (TvNiR) из штамма ALEN 2 нитратвосстанавливающей галоалкалофильной сероокисляющей у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens.

2. Получение и анализ нуклеотидной последовательности TvNiR

Для получения нуклеотидной последовательности гена, кодирующего цитохром с нитритредуктазу из штамма ALEN 2 организма Thioalkalivibrio nitratireducens, был использован известный N-концевой фрагмент аминокислотной последовательности этого белка [Antipov, A.N., Sorokin, D.Y., L'Vov, N.P. and Kuenen, J.G. Biochem. J. (2003) 369,185-189 ].

Наличие сигнального пептида в аминокислотной последовательности TvNiR и аминокислотных последовательностях некоторых других ферментов, использовавшихся для аминокислотного выравнивания, было предсказано программой SignalP v1.3 [http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP].

Молекулярную массу зрелого белка TvNiR, а также его изоэлектрическую точку рассчитывали при помощи программы PEPSTATS [http://www.ebi.ac.uk/emboss/pepinfo].

Поиск последовательностей, имеющих наибольшую гомологию с последовательностью TvNiR, проводился при помощи программы BLAST. Множественное аминокислотное выравнивание (multiple alignment) выбранных аминокислотных последовательностей и последовательности TvNiR было проведено при помощи программы ClustalW [http://www.ebi.ac.uk/clustalw].

3. Кристаллизация TvNiR

Кристаллизация очищенного до гомогенного состояния фермента проводилась с использованием набора Hampton Research Crystal Screen Cryo. Кристаллизация проводилась методом диффузии в парах (hanging-drop vapor diffusion) при температуре 278 К. Кристаллы росли около двух месяцев, имели красный цвет, обусловленный присутствием гемов в белке, и максимальный размер около 300 рм.

Кристаллы комплексов были получены настаиванием кристаллов апо-фермента в растворе лигандов.

4. Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение структуры апо-формы TvNiR и комплексов

Данные рентгеноструктурного эксперимента были получены на синхротроне Гамбургского отделения EMBL, на станции BW7A, с использованием детектора MarCCD (MAR Research, Germany). Съемка была проведена при температуре жидкого азота -100 К, для чего была использована установка Oxford Cryosystems cooling device (Oxford Cryosystems Ltd, UK).

Все полученные кристаллы принадлежали к пространственной группе симметрии P2t3 и имели сходные параметры элементарной ячейки. Данные рентгеноструктурного эксперимента были собраны для двух длин волн: пиковой (А=1.7375 А, вклад Г максимален) и удаленной (А=0.9600 А) до разрешения соответственно 2.36 А и 1.50 А. Статистика собранных рентгеновских данных

приведена в (Таблице 1). Полученные данные были обработаны при помощи программ DENZO и SCALEPACK. Структура TvNiR была решена методом одноволновой аномальной дисперсии (SAD) с использованием данных, собранных на пиковой длине волны. Положения 16 атомов железа были получены при помощи програмы SHELXD. Расчет фаз был проведен при помощи программы MLPHARE из комплекса ССР4. Независимая часть элементарной ячейки содержала два мономера TvNiR с высоким содержанием растворителя (70%). Модель белка была построена автоматически, используя программный комплекс ARP/WARP, при этом полученная модель содержала лишь 4 разрыва на два мономера из независимой части элементарной ячейки. Высокое качество карты электронной плотности позволило построить модель независимой части без разрывов, а также включить в модель 8 гемов типа с на один мономер фермента. Положения пяти из восьми гемов, с четвертого по восьмой (нумерация гемов здесь и далее соответствует положению гем-связывающих мотивов в первичной последовательности фермента), были получены наложением структуры TvNiR на структуру пятигемовой цитохром с нитритредуктазы из W. succinogenes [1FS7] при помощи программы MOLREP. Три оставшихся гема были встроены в электронную плотность вручную.

Таблица 1. Статистика данных рентгеноструктурного анализа апо-формы TvNiR.

Набор данных Пик железа (SAD) Нативный

26.3% МПД, 0.09 М 27% ПЕГ 400, 0.09

Условия Na-цитрэтный буфер М TRIS буфер (pH

кристаллизации (pH 5.6), 0.175 М 8.5), 0.18 М цитрат

ацетат аммония натрия

Длина волны, А 1.7375 0.9600

Разрешение, А 2.36 1.50

(last shell), А (2.39-2.36) (1.52-1.50)

Rsvmm 0.063 (0.273) 0.036 (0.476)

Полнота, % 99.8 97.4

I/ Sigl 29.20 (7.76) 29.0 (3.37)

Группа симметрии

и параметры P2i3 Р2-|3

кристаллическом a=b=c=193.7 а=Ь=с=193.9

ячейки (А)

Число

измеренных 4616298 7027135

рефлексов

Число

уникальных 97669 383704

рефлексов

Финальная модель, использованная для уточнения структуры, включала 520 аминокислотных остатков и 8 гемов с на мономер. Уточнение проводилось с помощью программы REFMAC1 при этом были использованы данные, полученные для удаленной длины волны. Структура была уточнена до значения Rf=14.4%, Rfree=15.6%.

Данные рентгеноструктурного эксперимента для комплексов TvN¡R с различными лигандами были собраны и обработаны аналогично предыдущим. Получены данные для девяти различных комплексов: с субстратами - нитритом,

гидроксиламином и сульфитом, с проверенными и предполагаемыми ингибиторами - нитратом, сульфатом, азидом, цианидом и тиоцианатом. Концентрации лигандов и время настаивания приведены в (Таблице 2). Пространственная группа у всех полученных комплексов была Р2-|3. В качестве исходной модели для уточнения полученных комплексов была использована структура апо-формы

Таблица 2. Параметры настаивания кристаллов апо-фермента TvNiR для получения комплексов

Лиганд Концентрация лиганда, M Время настаивания, часы

Нитрит 0.1 1

Гидроксиламин 0.1 0.5

Сульфит 0.1 1

Нитрат 0.1 1

Сульфат 0.1 12

Цианид 0.1 1

Азид 0.01 12

Тиоцианат 0.1 1

5. Анализ структуры TvNiR

Анализ пространственной укладки полипептидной цепи N-концевого и каталитического доменов, а также их сравнение с укладками различных белков производился при помощи программы DALI [http://www.ebi.ac.uk/dali] и программы ТОРР из комплекса ССР4.

Структуру TvNiR анализировали по базе данных для пространственных укладок белков - SCOP [http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop].

Совмещение мономеров из независимой части элементарной ячейки кристалла по координатам Са-атомов, совмещение мономера TvNiR и мономеров NrfAs, а также гемов TvNiR и восьмигемовых белков с известной пространственной структурой: гидроксиламиноксидоредуктазы (НАО) и тетратионатредуктазы - по атомам всех гемов проводили при помощи программы LSQKAB из комплекса ССР4. При помощи этой же программы проводилось и совмещение активных центров TvNiR и NrfAs.

Расчет рКа для ОН-группы остатка Туг-304, ковалентно связанного с остатком Cys-306 в активном центре TvNiR, проводили при помощи программы ACD/pKa DB v4.56 [www.acdlabs.com].

Анализ контактов между мономерами TvNiR в кристалле проводили с помощью программ из комплекса ССР4. Программа Contact использовалась для обнаружения водородных связей между субъединицами TvNiR. Программа AREAIMOL использовалась для расчета площади контактов между субъединицами TvNiR, NrfAs и НАО, а также для вычисления доступной для растворителя поверхности гемов указанных ферментов. Расчет проводился модифицированным методом Лии-Ричардсона [B.Lee and F.M.Richards, J.Mol.Biol. (1971), 55, 379 - 400]. Для идентификации ионов кальция в структурах TvNiR использовался так называемый «bond-valence method» [P. Muller, S. Корке and G.M. Sheldrick, Acta Cryst (2003), D59, 32-37].

Распределение зарядов на поверхности и во внутренней части гексамера TvNiR, а также NrfA из W. succinogenes рассчитывали программами: CCP4MG v

0.12 [Е. Potterton, S. McNicholas, Е. Krissinel, К. Cowtan and M. Noble Acta Cryst. (2002). D58, 1955-1957] и DeLano Scientific LLC PyMol v0.99rc2 [www.pymol.org]. Таким же образом рассчитывалось распределение заряда в активном центре TvNiR, а также в каналах для транспорта продукта и субстрата.

Результаты и обсуждение

1. Аминокислотная последовательность TvNiR

Транслированная нуклеотидная последовательность фермента содержит 553 аминокислотных остатка, включая сигнальный пептид из 28-и остатков, необходимый для экспорта белка в периплазму. Рассчетная молекулярная масса зрелого белка составляет 59,5 кДа.

Анализ первичной последовательности фермента (Рис. 1) позволил выявить 7 характерных мотивов для связывания гемов типа с (СХХСН), а также один мотив СХХСК, обнаруженный в известных бактериальных цитохром с нитритредуктазах (NrfAs), где этот мотив связывает каталитический гем.

Поиск последовательностей, имеющих наибольшую гомологию с последовательностью TvNiR, выявил 9 белков с максимальной степенью гомологии к TvNiR.

Множественное аминокислотное выравнивание (multiple alignment) выбранных последовательностей показало, что наибольшую гомологию TvNiR имеет с белком, определяемым нуклеотидной последовательностью из генома 5-протеобактерии Geobacter sulfurreducens штамм РСА [код в базе данных Swiss-prot - Q74G90] (Рис. 1, Таблица 3). Идентичность составляет 46%. Функция белка, кодируемого этой последовательностью в G. sulfurreducens, на настоящий момент неизвестна. Эта последовательность, также как и TvNiR, содержит 8 характерных мотивов для связывания гемов с: 7 мотивов СХХСН и один - СХХСК.

Идентичность последовательности TvNiR с последовательностями представителей семейства NrfAs не превышает 21 %. Тем не менее, несмотря на низкую степень гомологии, все остатки, являющиеся критическими для катализа, консервативны как в последовательностях NrfAs, так и в последовательности TvNiR. Остатки, формирующие активный центр NrfAs, идентичны на 100% остаткам в последовательности TvNiR: Туг 303, His 361, Arg 131 и Lys188 (нумерация в соответствии с последовательностью TvNiR). Также идентичны остатки, координирующие каталитически важный ион кальция, расположенный вблизи активного центра известных NrfAs. Присутствие этого иона в структуре TvNiR было подтверждено металлоанализом (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry - ICPMS).

Последовательность TvNiR не имеет гомологии с последовательностями других 8-и гемовых белков с известной пространственной структурой: гидроксиламиноксидоредуктазой (НАО) из Nitrosomonas europae [1FGJ], катализирующей обратную реакцию окисления гидроксиламина до нитрита, и тетратионатредуктазой из Shewanella oneidens [1SP3].

ai 1 ей

-27 MNDLNRLGRVGRWIAGAACLFLASAAHAEPGENLKPVDAMQCPDCHTQIEDMHTVGKHAT 32

2 аЗ _В1 а4 В2 aS 3 аб î î t t t ♦

33 V N С V H CHI A TEHVETASSRRMGER PM|R HD L E AC AT CHT AQF NS F VE VR HES H P RL EK AT 92

f a7 4aMl Off a9 ♦ ß3 «10 all

93 PTSRSPMFDKL t AGHGFAFEHAEPRS HAFMLVDH FVVDRAYGG R—К NWQKV T DOMG AV 152

n12 p4 f. 4 4 o13 ♦ o14

153 RG AWT VHÜ|A DPESSDQRRF L S QT AT A AN P VC LN С К TQDH I LDWAYMGDEHEAAKWSRTS 212

015 5 а16 ß5 a17 a18 ß6

213 EVVEFARDLNHPLNCFMCHDPH S AG PflV RD6 L I N A V V D R G L G T Y P H D P V К S £ Q Q GflfHBI 272

___ _p7 019 в »ß8»44t pt sßl** «20 P11

273 МИДа Я|ИИДИИИИИИИ1Р TAD8HVMCAQC HVEMÉMN PHQ L S D G S—M D P R R АИД F W А N V 332

a21 444P1<. ß13 ф фф a22 a23 7 «24

333 FDYKEAAQE I D F F РИНАТ TQA—P KLQH P E AET FWGS VHERN G V AC AOCHHPKVQL ENS 392

f a25 8 a26

393 KVYT3HSQRT PRDMMOQAC LNCHAEWTEDQALYA I D Y I KNYTHGK I VKSE YWLAKM I D L F 452

a27 1111 t «28

453 PVAKRAGVSEDVLNQARELHYDAHUYWEWWTAENS VGFHNPDQARESLMT8 I SKSKEAVS 512

513 Ц L N D A I О AQ V AS R

525

Рис. 1. Аминокислотная последовательность TvNiR. Нумерация для TvNiR не учитывает сигнальный пептид, последняя аминокислота которого указана серым цветом. Остатки, формирующие ct-спирали указаны желтым фоном, а ß-слои - синим, при этом номер соответствующего элемнта вторичной структуры указан над последовательностью. Гем-связывающие мотивы показаны красным, номер связываемого гема указан курсивом над соответствующим мотивом. Остатки субстратного канала обозначены красными стрелками, канала для продукта - синими, а остатки активного центра показаны голубыми ромбиками.

Таблица 3, Попарное аминокнслотное сравнение последовательности TvNiR и 9-и последовательностей, имеющих наибольшую с ней гомологию. Типы протеобактерий обозначены различным цветом: £-протеобактерии - желтым, 5-протеобактерии - зеленым и у-протеобактерии - красным. Для организма Simbiobacterium thermophüum классификация не определена. В таблице представлены следующие организмы: 7V. nitratireducens, W. succinogeties, S. deleyianum, С jejuni (strain RM1221), D. vulgaris Hildenborough, D. desulfuricans, G. sulfurreducens PCA, E. coli и S, thermophilum.

2. Пространственная структура TvNiR

2.1 Мономер TvNiR

Схема хода полипептидной цепи и топологическая карта мономера TvNiR показана на (Рис. 2А). Мономер состоит из 28 а-спиралей: а1 (остатки 11-15), а2 (26-29), аЗ (35-37), а4 (42-47), а5 (64-67), аб (71-78), а7 (100-104), а8 (107-110), а9 (119-128), аЮ (142-144), а11 (147-154), а12 (156-158), а13 (182-187), а14 (197-199), a15 (214-219), «16 (227-229), a17 (243-249), a18 (261-268), a19 (292-296), a20 (322324), a21 (333-341), a22 (363-368), cx23 (371-374), a24 (379-383), a25 (403-410), a26 (420-457), a27 (462-483), a28 (492-524) и 6-и антипараллельных (3-слоев: {(31 (3940), (32 (58-59)}; $3 (137-139), (34 (159-161)}; {05 (239-240), (36 (269-276), (37 (279287)}; {(38 (303-305), (39 (308-309)}; {(310 (316-318), (311 (325-327)}; {(312 (347-348), (313 (355-356)}. Фигурными скобками выделены отдельные (3-слои.

Рис. 2. (А) Мономер ТуМЯ. ^концевой домен показан розовым цветом. Для каталитического домена о-спиралн показаны желтым, а |1-слои - синим. Гемы показаны зеленым, за исключением каталитического -показанного красным. Здесь же приведена нумерация гемов в соответствии с положением гемсвязывающих мотивов в последовательности. С- и 1Ч-концевые участки белка указаны соответствующими символами. (Б) Топологическая схема укладки полипептидной цепи мономера Ту]ЧЖ.

Фермент стоит из двух доменов - ^концевого (остатки 5-69 и 269-287) и каталитического (остатки 70-268 и 288-524). Анализ пространственной укладки полипептидной цепи М-концевого домена показал, что этот домен имеет уникальную пространственную структуру, не имеющую аналогов в банке данных по белковым структурам. Этот домен обеспечивает связывание ферментом трех гемов - 1, 2 и 3. Каталитический домен обеспечивает связывание остальных пяти гемов мономера, включая каталитический гем 4.

Ход полипептидной цепи каталитического домена TvNiR имеет общие мотивы с ходом цепи известных цитохром с нитритредуктаз. Сравнение фолдингов каталитического домена ТуЫ^ и NrfA из ИV. висстодепез приведено на (Рис. 3). Среднеквадратичное отклонение (КМБО) между Са-атомами структурно эквивалентных фрагментов составляет величину 0.94А. Характерным мотивом как

ТуМН так и ЫНАв являются длинные С-концевые а-спирали, которые структурно эквивалентны в этих ферментах. На Рис. 3 изображены также остальные структурно эквивалентные участки этих ферментов. Несмотря на это, структура Ту1\Ш не настолько схожа со структурами ШАв, как представители этой группы между собой.

Рис. 3. Сравнение мономеров (А) и РИА из IV. $исс 'тоцепев (Б). Структурно эквивалентные участки

последовательности покрашены синим, не эквивалентные - оранжевым. Каталитический гем показан красным, остальные темы - зеленым. Нумерация гемов совпадает с нумерацией в соответствующих РБВ.

Сравнение фолдингов мономера "NN¡14 и мономеров известных восьмигемовых цитохромов: гидроксиламиноксидоредуктазы (НАО) и тетратионатредуктазы показало, что эти ферменты не имеют никаких общих структурных мотивов за исключением длинных С-концевых а-спиралей у НАО.

Для всех 8-и гемов расстояния между атомами железа соседних гемов варьируются от 9 до 11 А, что является достаточным для прямого электронного переноса (Рис. 2А). Сравнение расположения гемов в мономере ТуМЯ и мономерах известных ЫНАб показало, что взаимная ориентация и расположение пяти из восьми гемов (гемы 4, 5, 6, 7 и 8) совпадает с таковыми для всех

пяти гемов в Г^Аб (Рис. 4). (ЧМЭР по всем атомам наложенных гемов приведены в (Таблица 4). Оставшиеся гемы ТуМЯ - 1, 2 и 3 расположены в М-концевом домене фермента, отсутствующем у указанных белков (Рис.2А). Было проведено сравнение гемовых укладок ТуЫИЧ и восьмигемовых цитохромов: НАО и тетратионат редуктазы. В случае НАО совпадают взаимная ориентация и расположение всех восьми гемов (Рис. 4) (Таблица 4). Сравнение гемов ТуМЯ с темами тетратионатредуктазы показало, что в этом случае совпадают только гемы 4-8 (нумерация по ^N¡14), которые совпадают и для известных ЫИАэ (Рис. 4) (Таблица 4). Несмотря на похожий принцип гемовой укладки, пространственные структуры НАО и тетратионатредуктазы отличны как от структуры ТуМИ, так и друг от друга.

Рис. 4. Сравнение взаимного расположения гемов TvNiR, NrfAs, НАО и тетратионатредуктазы. Нумерация дана для гемов TvNiR. Гемы TvNiR обозначены красным цветом, НАО - синим и тетратионатредуктазы - черным. Гемы для различных NrfAs имеют следующие цвета: W. succinogenes - зеленый, Е. coli - розовый, D. desulfuricans - кораловый и S. deleyiaitum - фиолетовый.

Таблица. 4. Сравнение взаимного расположения гемов для TvNiR, NrfAs, НАО и тетратионат редуктазы. Для всех NrfAs в сравнении участвовали все 5 гемов, в этом случае у TvNiR и НАО сравнивались гемы с 4 по 8 (здесь и далее нумерация по соответствующим PDB), а у тетратионат редуктазы - гемы с 802 по 806. В сравнении гемов TvNiR с темами НАО участвовали все 8 гемов, а в случае сравнения гемов TvNiR и НАО с темами тетратионат редуктазы участвовали гемы 4,5, 6,7 и 8 (нумерация по TvNiR). Цифрами в таблице показано RMSD по всем атомам используемых в сравнении гемов.

TvNiR D.desulf. D.deley. E.coli W.succ. HAO S.oneidens

TvNiR 0,6 0,5 0,5 0,5 1,3 2,2

D.desulf. 0,6 0,4 0,5 0,4 1,3 2,5

D.deley. 0,5 0,4 0,3 0,2 1,2 2,3

E.coli 0,5 0,5 0,3 0,3 1,1 2,2

W.succ. 0,5 0,4 0,2 0,3 1,2 2,3

НАО 1,3 1,3 1,2 1,1 1,2 2,1

S.oneidens 2,2 2,5 2,3 2,2 2,3 2,1

2.2 Четвертичная структура ТуМ!?

В кристалле, как и в растворе, ТуЫИЧ существует в форме гексамера (Рис. 5). Две кристаллографически независимые молекулы фермента (молекулы А и В) выбраны в элементарной ячейке кристалла так, что они образуют димер, в котором молекулы А и В связаны между собой некристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка. Некристаллографическая поворотная ось симметрии перпендикулярна и пересекает кристаллографическую ось симметрии третьего порядка. Гексамер (Рис. 5) образован за счет взаимодействия димеров (состоящих из молекул А и В), связанных осью симметрии третьего порядка. Таким образом каждый из мономеров (например А1), входящих в гексамер, имеет контакты с двумя кристаллографически ему эквивалентными мономерами (для А1 это А2 и АЗ) с образованием 18 водородных связей и площадью контактной поверхности 3113 А2, одним кристаллографически не эквивалентным мономером (В1) с образованием 9 водородных связей и площадью контактной поверхности 2096 А2 и дополнительный контакт с мономером (В2), принадлежащим другому тримеру и не образующим с исходным мономером димера, с образованием двух водородных связей и площадью контактной поверхности 299 А2.

Рис, 5. Стереоизображение гексамера Ту1>ЭД1. Мономеры, образующие димерные контакты, показаны одинаковым цветом. Мономеры А1, А2, АЗ (В1, В2, ВЗ) образуют тримерные контакты.

Гексамер ТуМЯ имеет вид двух одинаковых усеченных пирамид (тримеров), соединенных друг с другом основаниями (Рис. 5). Тримеры в основном формируются за счет контактов, образованных длинными С-концевыми а-спирапями, принадлежащими каждому из составляющих тример мономеров. Каждый из тримеров имеет характерные размеры: высоту (размер вдоль С-концевых а-спиралей) - 70 А и длину ребра основания (расстояние между N1-концевыми доменами двух любых мономеров в тримере) -120 А. Внутри гексамера была обнаружена обширная полость, которая захватывает также внутренние области образующих гексамер тримеров (Рис. 5). Внутри каждого из тримеров эта полость имеет сферическую форму диаметром 35 А (Рис. 6). Полость образована полипептидными цепями, состоящими из остатков: 80-98; 113-118; 401-405 (а25); 420-438 (а26); 483-488, а также заряженными боковыми группами гемов 6 и 7. В нижней части тримера (ближе к области его контакта с другим тримером в гексамере) полость имеет сужение диаметром 25 А, образованное остатками в1и-83, Азр-405 и Азр-421 каждого из трех разных мономеров, образующих тример (Рис. 11). Со стороны растворителя доступ во внутреннее пространство гексамера частично закрыт полипептидными цепями мономеров, образованными остатками, находящимися между спиралями а25 и а26, а также остатками 387-392, образующими большую петлю, расположенную между темами 5 и 8 (Рис. 2А). Получающийся «вход» во внутренее пространство гексамера имеет овальную форму с размерами 9 х 16 А.

Рис. 6. Стереоизображение внутренней полости в тримере, образующем гексамер ТЧ-МЛ. (А) - Остатки полости показаны серым цветом в виде ленточной модели. (Б) - Остатки полости показаны в виде сетчатой поверхности. Ориентация на обоих рисунках идентична. Мономеры показаны разными цветами. Для наглядности показаны только два мономера из трех.

2.3 Активный центр TvNiR

Активный центр TvNiR находится внутри молекулы, на расстоянии около 10 А от поверхности. Он образован каталитическим гемом 4, координированным остатком Lys-188 (Рис. 7А). Гем 4 ковалентно связан с полипептидной цепью фермента за счет цистеиновых остатков: Cys-184 и Cys-187. В дистальном положении каталитического гема в кристаллической структуре апофермента находится молекула воды - L-450. В непосредственной близости от атома железа каталитического гема находятся остатки Arg-131, Tyr-303, Gln-360 и His-361. Вода, занимающая шестое координационное положение гема 4, образует водородные связи с остатками Arg-131, Tyr-303 и His-361, а также с другими молекулами воды в активном центре фермента.

Практически все остатки активного центра TvNiR гомологичны остаткам активных центров NrfAs. Пространственное наложение остатков, формирующих активные центры у TvNiR и NrfAs, дает величину RMSD по всем атомам этих остатков, не превышающую 0.5 А.

Gln-360

1 Lys-188

НЕМ-4

Рис. 7. (А) - Активный центр TvNiR. Молекулы воды в активном центре показаны красными сферами и имеют название, начинающееся с литеры "Ь". (Б) - Электронная плотность (синтез 2Ро-Рс, уровень 1 <т) вокруг ковалентной связи, обнаруженой в активном центре ТуМЛ.

Основным отличием активного центра TvNiR от активных центов NrfAs является замена консервативного в NrfAs остатка фенилапанина на цистеин. Этот остаток (Cys-305) образует своим атомом серы ковалентную связь с атомом (СЕ2) боковой цепи каталитически важного остатка тирозина (Туг-303), в орто-положении по отношению к фенольному атому кислорода (Рис. 7 А). Расстояние между этими атомами составляет 1.7 А (Рис. 7Б). Образование этой связи приводит к изменению ориентации и к более жесткой фиксации остатка тирозина в TvNiR по сравнению с NrfAs, что в свою очередь приводит к изменению размеров активного центра. Так для активного центра TvNiR расстояние между атомом ОН остатка Туг-303 и атомом NH2 Arg-131 равно 6.2 А, а между этим же атомом тирозина и атомом NE2 остатка His-361 равно 4.6 А. Для всех NrfAs указанные расстояния примерно равны друг другу и превышают аналогичные расстояния в TvNiR. Например, для NrfA из W. succinogenes эти расстояния равны соответственно 6.9 А и 5.4 А.

Ранее подобная связь была обнаружена в активных центрах сирогем-содержащих сульфитредуктаз и галактозидаз. Активные центры этих ферментов существенно отличаются от активного центра TvNiR. В случае сирогем-содержащих сульфитредуктаз образование такой связи считается важным для катализа, однако, согласно данным сайт-направленного мутагенеза, реакция протекает и в отсутствие этой связи, но с меньшей скоростью. Расчет показывает, что присутствие подобного рода ковалентной связи увеличивает кислотность ОН-группы тирозина, сдвигая ее рКа в область более низких рН, по сравнению с ОН-группой остатка тирозина, не имеющего такой связи. Согласно расчетам, рКа ОН-группы свободного тирозина составляет величину 10.11 ±0.15, тогда как рКаэтой группы для случая ковалентной связи тирозина с цистеином составляет 9.22 ± 0.5. Молекулярный механизм действия, предложенный для цитохром с нитритредуктаз, предполагает, что ОН-группа гомологичного остатка тирозина в активном центре

этих белков участвует в протонировании атома кислорода молекулы нитрита, тем самым способствуя расщеплению N-0 связи молекулы субстрата. Учитывая это, предполагается, что наличие ковалентной связи между тирозином и цистеином в активном центре ТуЬШ способствует протеканию реакции. Такое предположение подтверждается данными по кинетике согласно которой нитритредуктазная

активность Ту№1Ч выше, чем аналогичные активности известных ЫгГАз.

2.4 Межгемовые взаимодействия в гексамере ТуГ^Ш

Цитохром с нитритредуктазы в растворе существуют в виде гомодимеров (Рис. 8). При этом гемы 5 из разных мономеров образуют межсубъединичный гемовый контакт - расстояние между атомами железа в этих гемах составляет 12

Рис. 8. Димер №£А из 5. йе\еу1апит (е). Все гемы показаны синим за исключением каталитических, показанных красным. Нумерация гемов приведена в соответствии с положением гемсвязывающих мотива в последовательности (показана только для одного мономера).

В отличие от димера ЫНАв, димерный контакт в гексамере ТуМЯ образован иначе (Рис. 9). Тем не менее, между мономерами, образующими димерный контакт в гексамере ТуГ^Щ, также обнаружены межсубъединичные гемовые контакты. Место контакта образуют гемы 3, принадлежащие разным мономерам. Расстояние между атомами железа в этих гемах в димере равно 13,1 А, а между их боковыми группами -4,1 А. Это расстояние является достаточным для прямого электронного переноса между этими темами.

А.

4 > < ^ А^

V.' лл

Рис. 9. (А) Димерный контакт в гексамере TvNiR. Каталитические темы показаны красным, остальные черным. (Б) Расположение гемов в димере ТуМ11, Ориентация гемов и цвета совпадают с правым рисунком. Для одного из мономеров показана нумерация гемов. Также обозначен гем 3' из другого мономера, образующий

димерный межгемовый контакт с гемом 3.

Прямого контакта между темами в тримере ТуЬШ не обнаружено (Рис. 10 А,В)- Наиболее близкими темами являются темы 8 и 4, принадлежащие разным мономерам. Расстояние между атомами железа этих гемов превышает 30 А. Таким образом, в гексамере Ту№1Ч перенос электронов между субьединицами возможен только между мономерами в соответствующих димерах. В то же время, гидроксиламиноксидоредуктаза, существующая в растворе в виде сходного с ТуЬШ тримера, имеет замкнутую электрон-транспортную цепь. С-концевые а-спирали в НАО, так же как и в ТуМК, участвуют в образовании тримерного контакта, однако различная упаковка мономеров в тримерах этих ферментов ведет в случае НАО к образованию кольцевой структуры из гемов, принадлежащих трем разным мономерам (Рис.10 Б,Г).

Таким образом, за счет различий в пространственной структуре, один и тот же гемовый мотив образует различные цепи электронного транспорта в совершенно разных белках.

-Л? $

Рис. 10. Межгемовые взаимодействия в тримере ТуГЧЖ, образующем гексамер, и в тримере НАО. (А) - Тример Ту1МШ. с темами (вид вдоль оси третьего порядка из внутренней части гексамера). Мономеры показаны различными цветами. Каталитические темы показаны красным, остальные - черным. (Б) - Тример НАО с темами (вид аналогичен рисунку А). Мономеры показаны различными цветами. Каталитические гемы показаны красным, остальные - черным. (В) - Расположение гемов в тримере Ту№11. Ориентация идентична таковой на Рис. 10А. Гемы из разных мономеров показаны разным цветом. Для одного мономера приведена нумерация гемов. (Г) - Расположение гемов в тримере НАО. Ориентация идентична таковой на Рис. 10Б. Гемы из разных мономеров показаны разным цветом. Дня одного мономера приведена нумерация гемов (в

соответствии с РЮВ).

2.5 Предполагаемое место связывания физиологического донора электронов в гексамере "МШ

Для выяснения того, какой из гемов наиболее доступен для растворителя, было проведено вычисление доступной поверхности каждого из гемов для гексамера ТуМЯ (Таблица 5). Как известно, донором известных цитохром с нитритредуктаз является 4-х или 5-и гемовые цитохромы. Доступная поверхность для гемов ТуМЯ* была вычислена при различных радиусах сферы, апроксимирующей молекулу донора. Радиус сферы варьировался от 5 А до 15 А, моделируя доступность этих гемов для белков характерных размеров. Выяснилось, что единственным доступным гемом при радиусе сферы, равном 15 А, является гем 8. Данный радиус примерно соответствует размерам небольших цитохромов. Более того, значение доступной поверхности для гема 8 при радиусе

сферы 15 А составляет величину 77 А2, что говорит о прямой доступности этого гема для предполагаемого донора электронов.

Таблица 5. Доступность гемов в гексамере Ту№Я при различных радиусах сферы, апроксимирующей молекулу

Радиус сферы, А Гем Доступная поверхность, А2

1 9

5 3 14

5 43

8 162

о 5 16

8 145

10 5 5

8 127

15 8 77

Для подтверждения того, что гем 8 действительно является местом входа электронов в электрон-транспортную цепь фермента, был проведен анализ распределения заряда на поверхности гексамера ТуМР. Размеры внутренней полости каждого из тримеров (Рис. 11), составляющих гексамер, позволяют позволяют проникнуть туда небольшой белковой молекуле, однако доступ туда со стороны растворителя частично закрыт полипептидными цепями мономеров (Рис. 12). Учитывая приблизительные размеры цитохромов, было предположено, что молекула донора связывается на поверхности гексамера, а не проникает во внутреннюю его полость. Предполагаемое место связывания физиологического донора электронов расположено в центральной части гексамера (Рис. 12). Окрестность гемов 8 имеет отрицательный заряд, что является типичным для предполагаемого места связывания донора электронов в Ыг1А8. Гексамер является симметричным телом, поэтому в нем существуют еще два места связывания донора, идентичных указанному (Рис. 11). Для каждого такого места, заряженные боковые группы гемов 8 из двух мономеров, не принадлежащих одновременно одному димеру и тримеру, экспонированы в эту область так, что при связывании донора электронов с гексамером, эти темы, вероятно, будут образовывать с ним тесный контакт. (Рис. 12). Расстояние между атомами железа этих гемов составляет величину около 30 А.

Таким образом, при связывании донора становится возможно кооперативное взаимодействие между разными тримерами в гексамере ТуЬЩ, опосредованное электрон-транспортной системой донора, а гем 8 таким образом является наиболее вероятным кандидатом на роль гема-акцептора электронов. Предполагается, что связывание донора электронов с молекулой фермента ведет к замыканию электрон-транспортной цепи и к образованию гемовых контактов между всеми субъединицами гексамера. Таким образом, одним из возможных объяснений такой сложной олигомерной структуры ТуКНИ является необходимость связывания физиологического донора электронов.

Рис. И. (А) - Распределение заряда в нижней части тримера, составляющего гексамер Т^Ш. Вид вдоль С-концевых ос-спиралей тримера из внутренней части гексамера. Гемы показаны желтым цветом. Области отрицательного заряда показаны красным, положительного - синим. Предполагаемые места связывания донора электронов указаны черными стрелками. В центре рисунка видна внутренняя полость тримера, а остатки, образующие ее сужение имеют отрицательный заряд. (Б) - Ленточная модель тримера Ту1ЧЖ в той же ориентации, что и на рисунке слева. Мономеры показаны различными цветами.

Рис. 12. (А) - Распределение заряда на поверхности гексамера ТуШ*. Цвета аналогичны рисунку 11. Черными стрелками указаны гемы 8. (Б) - Ленточная модель гексамера ТуРШ1 в такой же ориентации, как и на рисунке слева. Мономеры, составляющие димер, покрашены различными цветами.

2.6 Каналы для транспорта продукта и субстрата в ТуКШ

Субстратный канал Ту№1Ч расположен на противоположной стороне от С-концевых а-спиралей мономера (Рис. 13). Такое расположение канала аналогично его расположению в структурах ШАв. Диаметр канала около 6 А, что позволяет молекулам субстрата диффундировать в активный центр. В целом, распределение заряда в субстратных каналах ЫИАв и сходно. Около входа в канал ТуГ\МК

находится область положительного заряда, образованная остатком Агд-348, который в известных ШАв заменен на остаток треонина. В Ту№1Ч остаток Агд-348,

по-видимому, способствует проникновению отрицательно заряженой молекулы субстрата в канал. Сам канал большей частью образован остатками, присущими только TvNiR: Phe-111, Ala-177, Thr-178, Ala-179, Asn-181, Val-183, Asn-306, Pro-307, Gly-308, Tyr-309, Arg-316, GIy-318, Met-319, Ala-350. Исключением являются остатки Gly-106 и Asp-346 - консервативные в NrfAs, а также остаток Phe-347, который в NrfAs заменен на гомологичный остаток триптофана. Канал имеет практически нейтральный потенциал за исключением одной небольшой отрицательно заряженой области в районе остатка Asp-346. О важной роли этого остатка говорит то, что он консервативен в NrfAs. Asp-346 расположен в углублении одной из сторон канала и может играть роль в отталкивании отрицательно заряженой молекулы субстрата, что в свою очередь вызовет попадание последней непосредственно в активный центр. На входе в активный центр субстратный канал за счет остатков активного центра (Arg-131 и His-361) приобретает положительный потенциал, притягивающий молекулу субстрата.

Практически весь активный центр TvNiR имеет положительный потенциал, обусловленный основными остатками: His-107, His-361, Lys-358, Gln-360, Arg-131, а также остатком His-113. Такое распределение заряда в активном центре типично и для NrfAs и, по-видимому, способствует протеканию каталитического акта. Все указанные остатки в NrfAs консервативны за исключением остатков His-107 и His-113, которые в нитритредуктазах заменены на тирозины. Помимо указанных остатков активный центр TvNiR формируют остатки: Phe-109, Lys-90 и Cys-305, ковалентно связанный сТуг-303. При этом остаток Phe-109 строго консервативен и в NrfAs. Роль этого остатка заключается, по-видимому, в образовании гидрофобной стенки в активном центре этих ферментов.

Вблизи входа в активный центр канал для транспорта продукта имеет отрицательный электростатический потенциал. Такой потенциал формируют остаток Glu-115 и пропионовые группы гемов 4, 6 и 7. Аналогичный остаток глутаминовой кислоты также был обнаружен в канале для продукта в NrfA из D. desulfuricans. Канал для продукта в TvNiR немного меньше, чем субстратный, и имеет характерный размер порядка 5 А в диаметре. Помимо указанных остатков в образовании канала для продукта в TvNiR участвуют неконсервативные в NrfAs остатки: Arg-81, Glu-83, Ser-84, His-85, Leu-88, Arg-96, Ala-114, Arg-404, Thr-483 и Val-488, а также остатки, консервативные для ряда NrfAs: AIa-484, Glu-485 и Asn-486. Вблизи выхода на поверхность канал имеет области положительного потенциала, образованные остатками Arg-404, Arg-96 и Arg-81. Роль этих остатков неясна, возможно, за счет электростатического отталкивания они задают определенное направление, в котором диффундирует молекула продукта. Несмотря на это отличие, распределение электростатического потенциала у выхода из этого канала для TvNiR и NrfAs в целом схоже, хотя в случае NrfAs отрицательный заряд вокруг канала выражен более явно. Следует однако заметить, что в случае TvNiR продукт ферментативной реакции, выходя из канала, попадает не в окружающую среду, как это происходит в известных NrfAs, а во внутреннюю сферическую полость одного из тримеров, составляющих гексамер (Рис. 14). Нижняя часть этой полости (нижняя часть тримера) в этом месте имеет сужение, ведущее в пространство внутри гексамера, что фактически означает выход в окружающую среду. Это сужение имеет отрицательный заряд, образованный остатками Glu-83, Asp-405 и Asp-421, что может способствовать выводу положительно заряженой молекулы продукта из внутренней части тримера в окружающую среду (Рис. 14).

Рис. 13. (А) - Стереоизображение положения каналов для транспорта субстрата и продукта в мономере ТуМЯ. Остатки, образующие каналы и активный центр фермента, показаны зеленым цветом и сетчатой поверхностью. Зелеными стрелками показаны места входов в каналы. (Б) - Распределение заряда на поверхности тримера, образующего гексамер Ту№1* (вид вдоль С-концевых а-спиралей). Места входа в субстратные каналы показаны зелеными кругами. (В) - Ленточная модель тримера, образующего гексамер, в ориентации, аналогичной таковой на рисунке Б. На рисунках Б и В каталитические гемы показаны зеленым цветом, остальные - желтым.

Рис. 14. (А)—Распределение заряда на выходе из канала для продукта в тримере, образующем гексамер Ту№Я.

Для наглядности показаны только два из трех мономеров тримера. Место выхода из канала для продукта показано желтым кругом. (Б) - Рисунок, аналогичный рисунку А, но третий мономер показан в виде ленточной

модели.

2.7 Предварительный рентгеноструктурный анализ комплексов ТуЬПН.

Для выявления остатков активного центра Ъ/МК, принимающих непосредственное участие в процессе катализа были получены наборы дифракционных данных для комплексов ТуМК с различными субстратами (нитритом, гидроксиламином и сульфитом) и предполагаемыми ингибиторами (азидом, цианидом, тиоцианатом, нитратом и сульфатом). Предварительное рентгеноструктурное исследование структур комплексов показало, что во всех случаях, за исключением комплекса с сульфатом, в активном центре фермента находится молекула соответствующего лиганда. Уточнение большинства комплексов на момент написания работы еще не завершено.

Выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего цитохром с нитритредуктазу ("[>/N¡{4).

2. Методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением определена структура апо-формы Структура уточнена до ^=14.4%. Для комплексов ТуКШ^ с субстратами (нитритом, гидроксиламином и сульфитом) и ингибиторами (азидом, цианидом, тиоцианатом, нитратом) собраны наборы дифракционных данных и проведено предварительное ренггеноструктурное исследование.

3. Проведен анализ пространственной структуры фермента. Мономер ТуЬШ содержит 8 гемов типа с в качестве простетических групп и состоит из двух доменов. Ы-концевой домен имеет уникальный ход полипептидной цепи и связывает три первых гема фермента. Ход полипептидной цепи второго домена сходен с фолдингом 5-ти гемовых цитохром с нитритредуктаз (ЫНАэ). Этот домен связывает пять остальных гемов ТуМЯ (включая каталитический гем 4), причем расположение этих гемов совпадает с расположением всех пяти гемов известных цитохром с нитритредуктаз (ШАв).

4. Проведен анализ чевертичной структуры фермента. В кристалле как и в растворе ТуМК существует в виде гомогексамера. В центре гексамера обнаружена обширная полость.

5. Проведен анализ активного центра фермента. Активный центр образован каталитическим гемом, в котором атом железа координирован остатком лизина в дистальном положении, и аминокислотными остатками аргинина, тирозина и гистидина. Он структурно гомологичен активным центрам ЫНАб. Существенным отличием активного центра ТуЬШ от активных центров ЫгТАэ является обнаруженая в ТуЬШ уникальная ковалентная связь атома СЕ2 каталитического тирозина с атомом серы остатка цистеина (в структурах ЫгГА остаток цистеина заменен на фенилаланин). Эта ковалентная связь обеспечивает дополнительную фиксацию боковой цепи каталитического тирозина и уменьшает рК его ОН-группы, что может облегчать перенос протона от тирозина к субстрату. Проведен анализ каналов для входа субстрата в активный центр фермента и вывода из него продукта. Канал для транспорта продукта выходит во внутреннюю полость гексамера Ту1\Ш.

6. Проведен анализ укладки гемов в гексамере ТуЖ. Показано, что в гексамере межсубъединичный гемовый контакт возможен только между темами в димере, прямых контактов между темами в тримере не обнаружено. Проведено

сравнение укладки гемов с укладками гемов в других мультигемовых

ферментах с известной структурой.

7. На основе анализа доступности гемов и распределения заряда на поверхности гексамера предположено, что местом связывания белка-донора электронов с ТуМЯ является окрестность гема 8. Предположено, что связывание этого белка может обеспечивать образование электрон-транспортной цепи между всеми темами в гексамере ТуМИЧ.

Список работ по теме диссертации

1. Boyko.K.M., Tikhonova.T.V., SIutsky.A., Antipov.A.N., Polyakov.K.M., Sorokin.D.Y.; Zvyagilskaya,R.A.; Popov,V.O. Molecular and catalytic properties of a novel cytochrome с nitrite reductase from nitrate-reducing haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens. Biochim. Biophys. Acta., 2006, 1764, 4, 715-723.

2. Boyko K.M., Polyakov K.M., Antipov A.N., Zvyagilskaya R.A., Bourenkov G.P., Lamzin V.S., Popov A.N., Slutskaya E.S, Tikhonova T.V. and Popov V.O. Crystallization and preliminary X-Ray analysis of cytochrome с nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. Acta Cryst Section F, 2006, F62, 215-217.

3. Boyko K.M., Polyakov K.M., Antipov A.N., Bourenkov G.P., Lamzin V.S., Popov A.N., Slutskaya E.S, Tikhonova T.V. and Popov V.O. Structure of oxoanion polyreductase from Thioalkalivibrio nitratireducens and its complexes. International Conference "Structural Biology at Crossroads: From Biological Molecules to Biological Systems", Hamburg, Germany, 2004, 15-18 September, 2.

4. Boiko, K.M., Polyakov, K.M., Tikhonova, T.V., Stekhanova, T.N., Antipov, A.N., Bourenkov, G.P., Popov, A.N., Lamzin, V.S., Popov, V.O. Crystal structure of oxoanion polyreductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBL Annual Reports, 2003, 2, 101-102.

5. Boyko, K.M., Polyakov, K.M., Tikhonova, T.V., Slutskaya, E.S., Antipov, A.N., Popov, A.N., Lamzin, V.S., Popov, V.O. Crystal structures of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBL Annual Reports, 2004, 2, 79-80.

6. Boyko, K.M., Tikhonova, T.V., Slutsky, A., Antipov, A.N., Zvyagilskaya, R.A., Konarev, P.V., Svergun, D.I., Popov, V.O. Small-angle X-ray scattering investigation of an oligomeric composition of cytochrome с nitrite reductase from haloalkalophilic bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBL Annual Reports, 2005, 2, 409-410.

7. Boyko, K.M., Tikhonova, T.V., Slutsky, A., Antipov, A.N., Zvyagilskaya, R.A., Popov, V.O. Crystal structure of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfide and nitrate. EMBL Annual Reports, 2005, 2, 91-92.

Для заметок

Дня заметок

Заказ № 171/04/06 Подписано в печать 25.04.2006 Тираж 80 экз. Ус;?. п.л. 0,92

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 wmv.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бойко, Константин Михайлович

введение.з

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОПЮР.

1.1>иоло| ический цикл азота.

2. респираторная аммонификация 11ипч1га: структура ')т11.

3. Цшохром с содержащие питршредуктазы: локализация, выделение ii свойства.

3. /. Локализация в тетке.

3.2. Каталитические свойства.

3.3. Свойства UV-спектров.

3.4. Структура.

3.4.1. Первичная структура NrfAs.

3.4.2. Структурные исследования цитохром с нитритредуктаз.

3.4.2.1. Третичная и четвертичная структуры NrfA.

3.4.2.2. Расположение гемов в мономере и димере NrfA.

3.4.2.3. 0111', Мессбау >ровская спектроскопия и потеициометрическне исследования NrfA.

3.4.2.4. С'вя !ыванис донора >.ickiроно».

3.4.2.5. Структура активною центра.

3.4.2.6. Центры связывания ионов Са2+.

3.4.2.7. Каналы для транспорта субстрата и продукта.

3.4.2.8. Молекулярный механизм действия NrfA.

4. Цитохром спиттлтедуктлзл in i 'ллоллкллофилы юй бактерии Тшомжлшшю мтлттЕоисЕЮ.ЗЬ

4.1 Ooufue сведения о бактерии Thioalkalivibrio nitvatireducens.

4.2 Выделение и характеристика цитохром с нитритредуктазы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1 Получение нуклеошдной последовательности TvNiR.

1.2 Амллиз аминокислотной последовательности TvNiR.

1.3 Кристаллизация TvNiR.

1.4 Pit I гг п 10Структу рнля съемка, решением уточни in г структуры апо формы TvNiR и комплексов

1.5 Анализ мономера TvNiR.

1.6 Анализ олиеомерпых структур TvNiR.

1.7 Идентификация ионон кальция в структурах TvNiR.

1.8 расчетдпстугшостей гемов TvNiR для растворителя и донора 'электронов.

1.9 расчет распределения зарядов iia поверхности еексамера TvNiR, it о 111 iv i pit 1111.Й час 111, л тлк/ке i.i о kai1алов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. 1 1укдеотпдпля и аминокислотная последовательности tvNir.

2. I lp< )с i pai 1с i вг.н11ая структура TvNiR.

2.1 Анализ независимой части элементарной ячейки кристалла TvNiR.

2.2 Мономер TvNiR.

2.3 Четвертичная структура TvNiR.

2.4. Расположение гемов в мономере TvNiR.

2.5 Меж-гемовые взаимодействия в геттере TvNiR.

2.6 Активный центр TvNiR.

2.7.Кальций вблизи активного центра TvNiR.

2.Х. Доступности гемов для растворителя и физиологического донора электронов.

2.9. Распределение заряда на поверхности и во внутренней части гексамера TvNiR. Сайт связывания физиологического донора электронов.МО

2. К). Каналы для транспорта продукта и субстрата в TvNiR.ИЗ

2. / I. Структуры комплексов TvNiR.cSW

2.12. Заключительные замечания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens"

Биологический цикл азота является одним из важнейших биохимических циклов в природе. Он объединяет большое количество различных организмов, осуществляющих в процессе своего функционирования окисление/восстановление различных соединений азота. Одним из ключевых ферментов этого цикла является цитохром с нитритредуктаза (NrfA), катализирующая реакцию респираторной аммонификации нитрита, а именно восстановление нитрита до аммония без высвобождения каких-либо промежуточных продуктов реакции. Цитохром с нитритредуктазы обнаружены у аммонифицирующих бактерий, принадлежащих к различным подкласам протеобактерий. Эти ферменты досточно хорошо изучены: в литературе имеется большое количество данных по их каталитическим и спектральным свойствам, ЭПР и мессбауэровской спектроскопии, а для ряда ферментов описана пространственная структура и предложен молекулярный механизм действия. В зависимости от типа протеобактерии NrfAs выделяют как из мембранной, так и из растворимой фракций в виде мономера или комплекса с белком-донором электронов. Помимо нитритредуктазной активности эти ферменты обладают также способностью к восстановлению гидроксиламина - предполагаемого промежуточного продукта процесса восстановления нитрита. Для NrfA из е- и 6-протеобактерий показана также сульфит редуктазная активность. В растворе эти ферменты существуют в виде сходным образом сформированных гомодимеров. Мономеры, NrfAs выделенные из разных протеобактерий имеют молекулярный вес порядка 53-61 кДа, а пространственная укладка составляющих их полипептидных цепей в целом гомологична. Мономеры NrfAs содержат по 5 гемов типа с в качестве простетических групп. Расстояния между этими темами предполагают возможность прямого электронного переноса! Характерной особенностью мономеров известных NrfAs является консервативность взаимного расположения и ориентации в пространстве всех 5-и гемов. Важной особенностью известных NrfAs является также наличие в их структурах ионов кальция, занимающих консервативное положение.

Не так давно, из растворимой фракции нитрат восстанавливающей облигатной хемолитоавтотрофной и галоалкалофильной сероокисляющей у-протеобактерии Thioalkalovibrio nitratireducens (штамм ALEN 2), обнаруженной в содовом озере Fazda в Египте, был выделен фермент, обладающий нитритредуктазной активностью. Кинетические исследования этого фермента, названного TvNiR, показали, что помимо нитритредуктазной активности он способен восстанавливать гидроксиламин и сульфит, используя дитионит в качестве донора электронов. Было показано, что единственным продуктом нитрит и гидроксиламин редуктазной активностей является аммоний. При этом TvNiR обладал более высокой нитритредуктазной активностью по сравнению с известными NrfAs. Молекулярная масса мономерной формы TvNiR составляла величину около 60 «Да. Эксперименты по гель-фильтрации продемонстрировали, что TvNiR в растворе преимущественно существует в форме гомогексамера, с небольшой долей тримерной и мономерной форм, при этом активностью обладали только гексамерная и тримерная формы. Анализ на металлы показал, что этот фермент содержит атомы железа и кальция, а спектрофотометрические исследования показали, что TvNiR имеет характерный спектр цитохром с белков. Помимо этого фермент характеризовался высокой термостабильностью.

Таким образом, было показано, что новая цитохром с нитритредуктаза из у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens, несмотря на имеющиеся сходства с известными NrfAs из различных протеобактерий, имеет ряд уникальных признаков, свойственных только этому ферменту и резко выделяющих его на фоне других известных цитохром с нитритредуктаз. Поэтому цель данной работы заключалась в детальном исследовании методом рентгеноструктурного анализа пространственной структуры TvNiR для того, чтобы понять в чем причина указанных выше отличий в свойствах этого фермента от известных NrfAs, а также чтобы выяснить накладывают ли экстремальные условия существования родительского организма отпечаток на структуру функционирующего в нем фермента.

Литературный обзор

1. Биологический цикл азота

Нитрит широко используется различными бактериями в качестве акцептора электронов в анаэробных условиях. В этих организмах он является компонентом биологического цикла азота, который заключается в восстановлении нитрата (денитрификация) или в окислении аммония (нитрификация) (Рис. 1.). Цикл азота представляет из себя каскад реакций, катализируемых ферментами с различными металл-содержащими кофакторами и простетическими группами, при этом осуществляется редокс переход азота между его окисленным (+5), как в нитрате, и восстановленным (-3), как в аммонии, состояниями.

Первичным процессом денитрификации является процесс восстановления нитрата до нитрита, который катализуируется молибден-содержащими нитрат редуктазами [1].

Восстановление нитрита можно рассматривать как ассимиляторный, диссимиляторный и респираторный процесс [2].

Ассимиляторное восстановление заключается в образовании аммония, для последующего его включения в клеточный материал. Этот процесс позволяет организмам использовать нитрат и нитрит в качестве источников питания. Данный механизм используется различными бактериями, а также растениями и грибами и катализируется цитоплазматической сирогем-содержащей нитритредуктазой, использующей либо NAD(P)H, либо ферредоксин в качестве донора электронов [3,4,5]. Указанный процесс можно рассматривать и как диссимиляторное восстановление, так как он сопровождается регенерацией кофактора - NAD(P).

Респираторное восстановление нитрита сопровождается генерацией электрохимического протонного потенциала на мембране, что является необходимым условием для производства АТР, в соответствии с хемиосмотическим механизмом. Рост с использованием респираторного восстановления нитрита описан только для бактерий, в которых он ведет к образованию либо N2 (респираторная денитрификация), либо аммония (респираторная аммонификация) (Рис.1). Оба процесса проходят при анаэробных условиях и не встречаются одновременно ни у одного вида бактерий.

Респираторная денитрификация катализируется либо цитохром cd, либо медьсодержащими нитритредуктазами [6,7]. Оба фермента катализируют реакцию превращения нитрита в N0, которая затем последовательно, с использованием других ферментов, восстанавливается до N2. Последний усваивается прокариотическими азот-фиксирующими организмами и восстанавливается ими до аммония (Рис.1). Таким образом, аммонификацию нитрита можно рассматривать как укороченный цикл, исключающий денитрификацию и фиксацию азота (Рис.1) [8].

Цикл азота завершается респираторной нитрификацией - процессом, в результате которого, аммоний окисляется до нитрата, при этом в качестве акцептора электронов выступает кислород (Рис.1). Этот процесс катализируется организмами рода Nitrosomonas, при этом в качестве промежуточного соединения образуется гидроксиламин.

Nitrate reduction

Assimilatory: Nas Respiratory: Nar Nap Dissimilatory: Nap

Respiratory denitrificotion

Respiratory nitrification V

Respiratory nitrification

Respiratory denitnfication

Respiratory aenitnfication

Nitrogen fixation

Nitrite ammonification

Assimilatory: Nir Respiratory: Nrf

Fermentative (dissimilatory):Nir/NrF

Respiratory nitrification nh4

Рис. I Биологический цикл азота. Аммонификация нитрита подразделяется на три типа: ассимиляторная, респираторная и диссимиляторная. Процессы денитрификации и аммонификации показаны желтыми стрелками, процессы нитрификации - зелеными. Аббревиатуры: Nas -ассимиляторная нитрат редуктаза, Nar - респираторная нитрат редуктаза, Nap - периплазматическая низ раз редуктаза, Nir - NADH-зависимая низ риз редуктаза, Nrf - цитохром с нитритредуктаза. Рисунок с незначительными модификациями взят из |1|.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бойко, Константин Михайлович

Основные выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего цитохром с нитритредуктазу (TvNiR).

2. Методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением определена структура апо-формы TvNiR. Структура уточнена до Rf=14.4%. Для комплексов TvNiR с субстратами (нитритом, гидроксиламином и сульфитом) и ингибиторами (азидом, цианидом, тиоцианатом, нитратом) собраны наборы дифракционных данных и проведено предварительное ренггеноструктурное исследование.

3. Проведен анализ пространственной структуры фермента. Мономер TvNiR содержит 8 гемов типа с в качестве простетических групп и состоит из двух доменов. N-концевой домен имеет уникальный ход полипептидной цепи и связывает три первых гема фермента. Ход полипептидной цепи второго домена сходен с фолдингом 5-ти гемовых цитохром с нитритредуктаз (NrfAs). Этот домен связывает пять остальных гемов TvNiR (включая каталитический гем;4), причем расположение этих гемов совпадает с расположением всех пяти гемов известных цитохром с нитритредуктаз (NrfAs).

4. Проведен анализ чевертичной структуры фермента. В кристалле как и в растворе TvNiR существует в виде гомогексамера. В центре гексамера обнаружена обширная полость.

5. Проведен анализ активного центра фермента. Активный центр TvNiR образован каталитическим гемом, в котором атом железа координирован остатком лизина в дистальном положении, и аминокислотными остатками аргинина, тирозина и гистидина. Он структурно гомологичен активным центрам NrfAs. Существенным отличием активного центра TvNiR от активных центров NrfAs является обнаруженая в TvNiR уникальная ковалентная связь атома СЕ2 каталитического тирозина с атомом серы остатка цистеина (в структурах NrfA остаток цистеина заменен на фенилаланин). Эта ковалентная связь обеспечивает дополнительную фиксацию боковой цепи каталитического тирозина и уменьшает рК его ОН-группы, что может облегчать перенос протона от тирозина к субстрату. Проанализированы каналы для входа субстрата в активный центр фермента и вывода из него продукта. Канал для продукта выходит во внутреннюю полость гексамера TvNiR.

6. Проведен анализ укладки гемов в гексамере TvNiR. Показано, что в гексамере межсубъединичный гемовый контакт возможен только между темами в димере, при этом прямых контактов между темами в тримере не обнаружено. Проведено сравнение укладки гемов TvNiR с укладками гемов в других мультигемовых ферментов с известной структурой.

На основе анализа доступности гемов и распределения заряда на поверхности гексамера предположено, что местом связывания с TvNiR белка-донора электронов является окрестность гема 8. Предположено, что связывание этого белка может обеспечивать образование электрон-транспортной цепи между всеми темами в гексамере TvNiR.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бойко, Константин Михайлович, Москва

1. Simon, J. Enzymology and bioenergetics of respiratory nitrite ammonification. FEMS Microbiology Reviews, 2002, 26, 285-309.

2. Moreno-Vivian, C., Ferguson, S.J. Denitrification and distinction between assimilatory, dissimilatory and respiratory pathways. Mol. Microbiol., 1998, 29, 661669.

3. Lin, J.T., Stewart, V. Nitrate assimilation by bacteria. Adv. Microbiol. Phys., 1998, 39, 1-30.

4. Campbell, W.H., Kinghorn, J.R. Functional domains of assimilatory nitrate reductases and nitrite reductases. Trends Biochem. Sci., 1990, 15, 315-319.

5. Cole, J. Nitrate reduction to ammonia by enteric bacteria: redundancy, or a strategy for survival during oxygen starvation? FEMS Microbiol. Lett, 1996, 136, 1-11.

6. Zumft, W.G. Cell biology and molecular basis of denitrication. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997, 61, 533-616.

7. Moura, I, Moura, J.J.G. Structural aspects of denitrifying enzymes. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 168-175.

8. Cole, J.A., Brown, C.M. Nitrite reduction to ammonia by fermentative bacteria: a short circuit in the biological nitrogen cycle. FEMS Microbiol. Lett., 1980, 7, 65-72.

9. Fujita, T. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. I. Detection, purification, and properties of cytochrome c-552 in anaerobically grown cells. J. Biochem., 1966, 60, 204-215.

10. H.Kajie, S., Anraku, Y. Purification of a hexaheme cytochrome c552 from Escherichia coli K12 and its properties as a nitrite reductase. Eur. J. Biochem., 1986, 154, 457463.

11. Liu, M.-C., Peck Jr., H.D. The isolation of a hexaheme cytochrome from Desulfovibrio desulfuricans and its identification as a new type of nitrite reductase. J. Biol. Chem., 1981, 256, 13159-13164.

12. Liu, M.-C., Liu, M.-Y., Payne, W.J., Peck Jr., H.D., LeGall, J. Wolinella succinogenes nitrite reductase: purification and properties. FEMS Microbiol. Lett., 1983, 19, 201206.

13. Schroder, I., Roberton, A.M., Bokranz, M., Unden, G., Bocher, R. and Kroger, A. The membraneous nitrite reductase involved in the electron transport of Wolinella succinogenes. Arch. Microbiol., 1985, 140, 380-386.

14. Prakash, O., Sadana, J.C. Purification, characterization and properties of nitrite reductase of Achromobacter fischeri. Arch. Biochem. Biophys., 1972, 148, 614-632.

15. Liu, M.-C., Bakel, B.W., Liu, M.-Y., Dao, T.N. Purification of Vibrio fischeri nitrite reductase and its characterization as a hexaheme c-type cytochrome. Arch. Biochem. Biophys., 1988, 262, 259-265.

16. Shumacher, W., Kroneck, P.M.H. Dissimilatory hexaheme с nitrite reductase of "Spirillum" strain 5175: purification and properties. Arch. Microbiol., 1991, 156, 7074.

17. Wolin, M.J., Wolin, E.A., Jacobs, N.J. Cytochrome-producing anaerobic vibrio, Vibrio succinogenes sp. n. J. Bacterid., 1961, 81, 911-917.

18. Simon, J., Pisa, R., Stein, Т., Eichler, R., Klimmek, O., Gross, R. The tetraheme cytochrome с NrfH is required to anchor the cytochrome с nitrite reductase in the membrane of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem., 2001, 268, 5776-5782.

19. Bokranz, M., Katz, J., Schroder, I., Roberton, A.M., Kroger, A. Energy metabolism and biosynthesis of Vibrio succinogenes growing with nitrate or nitrite as terminal electron acceptor. Arch. Microbiol., 1983, 135, 36-41.

20. Bokranz, M., Gutmann, M., Kortner, C., Kojro, E., Fahrenholz, F., Lauterbach, F., Kroger, A. Cloning and nucleotide sequence of the structural genes encoding formate dehydrogenase of Wolinella succinogenes. Arch. Microbiol., 1991, 156, 119128.

21. Jankielewicz, A., Schmitz, R.A., Klimmek, O., Kroger, A. Polysulphide reductase and formate dehydrogenase from Wolinella succinogenes contain molybdopterin guanine dinucleotide. Arch. Microbiol., 1994, 162, 238-242.

22. Unden, G., Kroger, A. Reconstitution in liposomes of the electron transport chain catalyzing fumarate reduction by formate. Biochim. Biophys. Acta, 1982, 682, 258263.

23. Unden, G., Kroger, A. Low-potential cytochrome b as an essential electron-transport component of menaquinone reduction by formate in Vibrio succinogenes. Biochim. Biophys. Acta, 1983, 725, 325-331.

24. Kroger, A., Dorrer, E., Winkler, E. The orientation of the substrate sites of formate dehydrogenase and fumarate reductase in the membrane of Vibrio succinogenes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, 589, 118-136.

25. Dross, F., Geisler, V., Lenger, R., Theis, F., Krat, Т., Fahrenholz, F., Koj'ro, E., Duchene, A., Tripier, D., Juvenal, K. and Kroger, A. The quinone-reactive Ni/Fe-hydrogenase of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem., 1992, 206, 93-102.

26. Kroger, A., Biel, S., Simon, J., Gross, R., Unden, G. and Lancaster, C.R.D. Fumarate respiration of Wolinella succinogenes: enzymology, energetics, and coupling mechanism. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1553, 23-38.

27. Pisa, R., Stein, Т., Eichler, R., Gross, R., Simon, J. The nrfl gene is essential for the attachment of the active site haem group of Wolinella succinogenes cytochrome с nitrite reductase. Mol. Microbiol., 2002, 43, 763-770.

28. Pereira, I.A.C., LeGall, J., Xavier, A.V., Teixeira, M. Characterisation of a heme с nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism, Desulfovibro vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1481, 119-130.

29. Steenkamp, D.J., Peck Jr., H.D. The association of hydrogenase and dithionite reductase activities with the nitrite reductase of Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 94, 41-48.

30. Liu, M.-C., DerVartanian, D.V., Peck Jr., H.D. On the nature of the oxidation-reduction properties of nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 96, 278-285.

31. Pereira, I.A.C., Abreu, I.A., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira, M. Nitrite reductase from Desulfovibro desulfuricans (ATCC 27774) a heterooligomer heme protein with sulfite reductase activitiy. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 224, 611618.

32. Pereira, I.A.C., Romao, C.V., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira, M. Electron transfer between hydrogenases and mono- and multiheme cytochromes in Desulfovibrio spp. J. Biol. Inorg. Chem., 1998, 3, 494-498.

33. Nicolet, Y., Piras, C., Legrand, P., Hatchikian, C.E., Fontecilla-Camps, J.C. Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure shows unusual coordination to an active site Fe binuclear center. Structure, 1999, 7, 13-23.

34. Matias, P., Saraiva, L.M., Soares, C.M., Coelho, A.V.J., LeGall, J., Carrondo, M.A.

35. Nine-haem cytochrome с from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: primaryisequence determination, crystallographic refinement at 1.8 AV and modelling studies of its interaction with the tetrahaem cytochrome C3. J. Biol. Inorg. Chem., 1999,4,478-494.

36. Saraiva, L.M., da Costa, P.N., LeGall, J. Sequencing the gene encoding Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 nine-heme cytochrome c. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 262, 629-634.

37. Abou-Jaoude, A., Chippaux, M., Pascal, M.-C. Formate-nitrite reduction in Escherichia coli K12. 1. Physiological study of the system. Eur. J. Biochem., 1979, 95, 309-314.

38. Gray, C.T., Wimpenny, J.W.T., Hughes, D.E., Ranlett, M. A soluble c-type cytochrome from anaerobically grown Escherichia coli and various Enterobacteriaceae. Biochim. Biophys. Acta, 1963, 67, 157-160.

39. Fujita, Т., Sato, S. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. IV. Possible involvement of cytochrome c-552 in anaerobic nitrite metabolism. J. Biochem., 1966, 60, 691-700.

40. Fujita, Т., Sato, S. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. III. Localization of cytochrome c-552 in the surface layer of cells. J. Biochem., 1966, 60, 568-577.)

41. Cole, J.A. Cytochrome C552 and nitrite reduction in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1968, 162, 356-368.

42. Rehr, В., Klemme, J.-H. Metabolic role and properties of nitrite reductase of nitrate-ammonifying marine Vibrio species. FEMS Microbiol. Lett., 1986, 35, 325-328.

43. Bamford, V.A., Angrove, H.C., Seward, H.E., Thomson, A.J., Cole, J.A., Butt, J.N., Hemmings, A.M., Richardson, D.J. Structure and spectroscopy of the periplasmic cytochrome с nitrite reductase from Escherichia coli. Biochemistry, 2002, 41, 29212931.

44. Grove, J., Busby, S., Cole, J. The role of the genes nrfEFG and ccmFH in cytochrome с biosynthesis in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 1996, 252, 332341.

45. Hussain, H., Grove, J., Grffiths, L., Busby, S., Cole, J. A seven-gene operon essential for formate-dependent nitrite reduction by enteric bacteria. Mol. Microbiol.,. 1994, 12, 153-163.

46. Berks, В. C., Ferguson, S. J., Moir, J. W., Richardson, D.J. Enzymes and associated electron transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and oxyanions. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1232, 97-173.

47. Hussain, H., Grove, J., Griffiths, L., Busby, S., Cole, J. A seven-gene operon essential for formate-dependent nitrite reduction to ammonia by enteric bacteria. Mol. Microbiol., 1994, 12, 153-63.

48. Darwin, A., Tormay, P., Page, L., Griffiths, L., Cole, J. Identification of the formate dehydrogenases and genetic determinants of formate-dependent nitrite reduction by Escherichia coli K12. J. Gen. Microbiol., 1993, 139, 1829-1840.

49. Berks, B.C., Page, M.D., Richardson, D.J., Reilly, A., Cavill, A., Outen, F., Ferguson,i

50. S.J. Sequence analysis of subunits of the membrane-bound nitrate reductase from a denitrifying bacterium: the integral membrane subunit provides a prototype for the dihaem electron-carrying arm of a redox loop. Mol. Microbiol., 1995, 15, 319-331.

51. Jones, R.W. Proton translocation by the membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli. FEBS Microbiol. Lett., 1980, 8, 167-171.

52. Jormakka, M., Tornroth, S., Byrne, В., Iwata, S. Molecular basis of proton motive force generation: Structure of formate dehydrogenase-N. Science, 2002, 295, 18631868.

53. Stanley, N.R., Sargent, F., Buchanan, G., Shi, J., Stewart, V., Palmer, Т., Berks, B.C. Behaviour of topological marker proteins targeted to the Tat protein transport pathway. Mol. Microbiol., 2002, 43, 1005-1021.

54. Stach, P., Einsle, O., Schumacher, W., Kurun, E., Kroneck, P.M.H. Bacterial cytochrome с nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem., 2000, 79, 381-385.

55. Newton, N. The two-haem nitrite reductase of Micrococcus denitrificans. Biochim. Biophys. Acta, 1969, 185, 316-331.

56. Nicholas, D.J.D., Nason, A. Determination of nitrate and nitrite. Methods Enzymol., 1957, 3, 981-984.

57. Stach, P.; Einsle, O.; Schumacher, W.; Kurun, E.; Kroneck, P. M. Bacterial cytochrome с nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem., 2000, 79, 381-385.

58. Rudolf, M., Einsle, O., Neese, F., Kroneck, P.M.H. Pentahaem cytochrome с nitrite reductase: reaction with hydroxylamine, a potential reaction intermediate and substrate. Biochemical Society, 2002, 649-653.

59. Einsle, O.; Messerschmidt, A.; Huber, R.; Kroneck, P. M. H.; Neese, F. Mechanism of six-electron reduction of nitrite to ammonia by cytochrome с nitrite reductase. J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 39, 11737-11745.

60. Barker, P.D., Ferguson, S.J. Still a puzzle: why is haem covalently attached in c-type cytochromes? Structure, 1999, 7, R281-R290.

61. Murzin, A. G., Brenner, S. E., Hubbard, Т., Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J. Mol. Biol., 1995, 247, 536-540.

62. Page, C.C.; Moser, C.C.; Chen, X.; Dutton, P.L. Natural engineering principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction. Nature, 1999, 402, 47-52.

63. Haladjian, J.; Bianco, P.; Guerlesquin, F.; Bruschi, M. Electrochemical study of the electron exchange between cytochrome c3 and hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans Norway. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1987, 147, 3, 1289-1294.

64. Moura, I., Bursakov, S., Costa, C., Moura, J.J.G. Nitrate and nitrite utilization in sulfate-reducing bacteria. Anaerobe, 1997, 3, 279-290.

65. Britain, Т., Blackmore, R., Greenwood, C., Thomson, A.J. Bacterial nitrite-reducing enzymes. Eur. J. Biochem., 1992, 209, 793-802.

66. Liu, M.-C., Liu, M.-Y., Payne, W.J., Peck Jr., H.D., LeGall, J. and DerVartanian, D.V. Comparative EPR studies on the nitrite reductase from Escherichia coli and Wolinella succinogenes. FEBS Lett., 1987, 218, 227-230.

67. Blackmore, R.S., Brittain, Т., Gadsby, P.M., Greenwood, C. and Thomson, A.J. Electron paramagnetic resonance and magnetic circular dichroism studies of a hexaheme nitrite reductase from Wolinella succinogenes. FEBS Lett., 1987, 219, 244248.

68. Costa, C., Moura, J.J.G., Moura, I., Wang, Y. and Huynh, B.H. Redox properties of cytochrome с nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. J. Biol. Chem., 1996, 271, 23191-23196.

69. Blackmore, R.S., Gadsby, P.M., Greenwood, C., Thomson, A.J. Spectroscopic studies of partially reduced forms of Wolinella succinigenes nitrite reductase. FEBS Lett., 1990, 264, 257-262.

70. Gwyer, J.D., Angove H.C., Richardson, D.J., Butt, J.N. Redox-triggered events in cytochrome с nitrite reductase. Bioelectrochemistry, 2004, 63, 43-47.

71. Eaves,D.; Grove,J.; Staudenmann,W.; James.P.; Poole.R.; White,S.; Griffiths,L.; Cole,J. The nrfEFG gene products are required for the activity of the cytochrome c552 nitrite reductase from Escherichia coli. Biochem.Soc.Trans., 1998, 26, 3, S216.

72. Einsle, О., Messerschmidt, A., Stach, P., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., Huber, R., Kroneck, P.M.H. Structure of cytochrome с nitrite reductase. Nature, 1999, 400, 476-480.

73. Poulos, T.L.; Freer, S.T.; Alden, R.A.; Edwards, S.L.; Skogland, U.; Takio, K.; Eriksson, В.; Xuong, N.; Yonetani, Т.; Kraut, J. The crystal structure of cytochrome с peroxidase. J. Biol. Chem., 1980, 255, 575-580.

74. Poulos, T.L.; Edwards, S.L.; Wariishi, H.; Gold, M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. J. Biol. Chem., 1993, 268, 4429-4440.

75. Sundaramoorthy, M.; Kishi, K.; Gold, M.H.; Poulos, T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-A resolution. J. Biol. Chem., 1994, 269, 32759-32767.

76. Schuller, D.J.; Ban, N.; Huystee, R.B.; McPherson, A.; Poulos, T.L. The crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 1996,4, 311-321.

77. Gajhede, M.; Schuller, D.J.; Henriksen, A.; Smith, A.T.; Poulos, T.L. Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nat. Struct. Biol., 4, 1032-1038.

78. Sutherland, G.R.; Zapanta, L.S.; Tien, M.; Aust, S.D. Role of calcium in maintaining the heme environment of manganese peroxidase. Biochemistry, 1997, 36, 3654-3662.

79. Sorokin, D.Y., Antipov, A.N., Kuenen, J.G. Complete denitrification in coculture of obligately chemolithoautotrophic haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria from a hypersaline soda lake, Arch. Microbiol., 2003, 180, 127-133.

80. Sorokin, D.Y., Touruva, T.P., Sjollema, K.A., Kuenen, J.G. Thioalkalivibrio nitratireducens sp. nov., a nitrate-reducing member of an autotrophic denitrifying consortium from a soda lake, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53, 1779-1783.

81. Antipov, A.N., Sorokin, D.Y., L'Vov, N.P., Kuenen, J.G. New enzyme belonging to the family of molybdenum-free nitrate reductases. Biochem. J., 2003, 369, 185— 189.

82. Sayavedra-Soto, L.A., Hommes, N.G., Arp, D.A. Characterization of the gene encoding hydroxylamine oxidoreductase in Nitrosomonas europaea, J. Bacterid., 1994, 176, 504-510.

83. Pereira, C., LeGall, J., Xavier, A.V.M., Teixeira, M. Characterization of a heme с nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1481, 119-130.

84. Bendtsen, J.D., Gunnar von Heijne, H.N., Brunak, S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol., 2004, 340, 783-795.

85. Roger, G.H. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations, 2000, 4-7.

86. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410.

87. Altschul, S.F. Amino acid substitutions matrices from an information theoretic perspective. J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-665.

88. Ducruix, A., Giege, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A practical approach. EMBL, Hamburg, 2000.

89. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology, 1997, 276: Macromolecular Crystallography, part A, 307-326.

90. Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 1968, 33, 2, 491-497.

91. Vagin, A., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst., 1997, 30, 1022-1025.

92. Schneider, T.R.; Sheldrick, G.M. Substructure solution with SHELXD. Acta Cryst. D„ 2002, 58, 1772-1779.

93. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst., 1994, D50, 760-763.

94. Zwart, P.H., Langer, G.G. & Lamzin, V.S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr., 2004, D60, 2230-2239.

95. Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Cryst., 1997, D53, 240-255.

96. Carson, M. Ribbon models of macromolecules. J. Mol. Graphics, 1987, 5, 103106.

97. Воуко, K.M., Polyakov, K.M., Tikhonova, T.V., Slutskaya, E.S., Antipov, A.N., Popov, A.N., Lamzin, V.S., Popov, V.O. Crystall structures of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBL Annual Reports, 2004, 2, 7980.i

98. Воуко, K.M., Tikhonova, T.V., Slutsky, A., Antipov, A.N., Zvyagilskaya, R.A., Popov, V.O. Crystal structure of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfide and nitrate. EMBL Annual Reports, 2005, 2, 91-92.

99. Holm, L., Sander, C. Searching protein structure databases has come of age. Proteins, 1994, 19, 165-173.

100. Lu G. A WWW service system for automatic comparison of protein structures, Protein Data Bank Quarterly Newsletter, 1996, 78, 10-11.

101. Kabsch, W.; Kabsch, H.; Eisenberg, D. Packing in a new crystalline form of glutamine synthetase from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1976, 100, 3, 283-291.

102. Lee, В., Richards, F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. J.Mol.Biol., 1971, 55, 379-400.

103. Muller, P., Корке, S., Sheldrick, G.M. Is the bond-valence method able to identify metal atoms in protein structures? Acta Cryst. D„ 2003, 59, 32-37.

104. Brown, I.D., Altermatt, D. Bond-valence parameters obtained from a systematic analysis of the Inorganic Crystal Structure Database. Acta Cryst. В., 1985, 41, 244247.

105. Potterton, E„ McNicholas, S„ Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Cryst., 2002, D58, 1955-1957.

106. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA, 2002.

107. Mowart, C.G., Chapman, S.K. Multi-heme cytochromes new structures, new chemistry. Dlaton Trans., 2005, 3381-3389.

108. Whittaker, M.M., Chuang, Y.Y., Whittaker, J.W. Models for the redox active site in galactose oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115,10029-10035.

109. Ito, N.; Phillips, S.E.; Stevens, C.; Ogel, Z.B.; McPherson, M.J.; Keen, J.N.; Yadav, K.D.; Knowles, P.F. Novel thioether bond revealed by a 1.7 A crystal structure of galactose oxidase. Nature, 1991, 350, 6313, 87-90.)

110. Whittaker, J.W. Free radical catalysis by galactose oxidase. Chem. Rev., 2003, 103, 6, 2347-2363.

111. Ostermeier, С., Harrenga, A., Ermler, U., Michel, H. Proc. Structure at 2.7 A resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome с oxidase complexed with an antibody FV fragment. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94, 1054710553.

Информация о работе

Бойко, Константин Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы