Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур

Лойко, Наталия Геннадиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур"

На правах рукописи

ЛОЙКО НАТАЛИЯ ГЕННАДИЕВНА

АУТОРЕГУЛЯТОРНЫЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им Д И. Менделеева совместно с Институтом

микробиологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Акопян Валентин Бабкенович доктор биологических наук, Складнее Дмитрий Анатольевич

Ведущая организация: НТЦ «Лекбиотех»

Защита диссертации состоится: « 2003 г в_часов

на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д И Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан «3/» 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук ¿¿'ага^ И В Шакир

¿¿¿О ö ~ ">

¿¿8Мб 3

12.00 2 ,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Развитие биотехнологии, направленное на внедрение в промышленность новых и постоянное повышение эффективности существующих микробных процессов, обуславливает необходимость изучения закономерностей роста культур микроорганизмов и механизмов саморегуляции их развития, в которых, согласно современным представлениям, большую роль играют специфические внеклеточные метаболиты, обеспечивающие межклеточные взаимодействия и объединяемые термином ауторегуляторы [Хохлов, 1988]. Успешное решение многих конкретных задач биотехнологии зависит от выявления и изучения механизмов прямого или косвенного действия этих веществ, контролирующих физиологическую активность клеток и их цито-дифференцировку. Актуальными представляются исследования возможности применения принципов ауторегуляции для решения проблем диссоциативных переходов промышленных штаммов, приспособления сапрофитов к нестабильным условиям роста, эффективности микробных промышленных консорциумов, стимуляции роста культур, включая сокращение лаг-фазы и увеличение выхода биомассы продуцентов, разработки новых способов поддержания промышленных штаммов, получения продуктов микробного синтеза и др. В этой связи особый интерес представляет изучение влияния на развитие микроорганизмов ауторегуляторов полимодального типа, контролирующих физиологическое состояние микроорганизмов на всем протяжении онтогенетического развития их культур. Такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндукто-ры анабиоза - фаеторы di (производиые алкилоксибензолов (АОБ)) и аутоиндукторы автолиза - факторы d2 (свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК)), выделенные и описанные для широкого крута микроорганизмов [Коновалова с соавт., 1985; Эль-Регистан, 1988; Бабусенко с соавт., 1991; Мупюкин с соавт, 1996; Демкина с соавт., 2000]. Для расширения представлений о возможности использования этих ауторегуляторов в биотехнологических производствах, в качестве объектов исследований в данной работе рассматривались бактерии Bacillus cerevs, шт. 504, применяемые на практике для утилизации бытовых отходов и относящиеся к группе бацилл с энтомопатогенными свойствами; и экстре-мофильные галоалкалофильные сероокисляющие бактерии Thtoalkalmbrto versutos, шт. AL2 и Ibioalkalimicrobium aerophilum, шт. AL3, участвующие в промышленном процессе нефтепереработки на стадии очистки содового буфера от серосодержащих соединений

Цель работы - изучить возможности использования ауторегуляторных факторов di и

для направленной регуляции фенотипической диссоциации микр<#ф£айкймй! tox-i

EKÍWIMOUKA С. Петербург

образования покоящихся форм на примере бактерий Bacillus cereus, Thioalkalivibrio versutus и Thioalkahmicrobium aerophilum

Задачи исследования:

1. Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий В cereus с помощью факторов di и dj.

2 Исследовать участие факторов di в процессах прорастания спор бактерий В cereus

3 Выявить наличие системы ауторегуляции, включающей факторы di и dz, у галоалка-лофильных сероокисляющих бактерий для возможностей регуляции процессов роста этих промышленных штаммов

4 Выявить условия образования покоящихся форм у неспорообразующих галоалка-лофильных сероокисляющих бактерий для разработки способов их хранения ex situ

5. Изучить возможные механизмы действия факторов di - аутоиндукторов анабиоза в процессах развития покоящегося состояния бактерий.

Научная новизна.

1 Впервые показано, что создание дисбаланса внеклеточных факторов d]/d2 изменяет диссоциативный индекс в популяции прорастающих спор В cereus

2 Показано, что факторы di имеют функции ингибиторов прорастания бактериальных

спор

3 У галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Т versutus, шт AL2 и Т. aerophilum, шт. AL3 обнаружена система ауторегуляции, включающая факторы di -аутоиндукторы анабиоза, предположительно отнесенные к АОБ; и ¿2 - аутоиндукторы автолиза, активным началом которых являются СНЖК.

4 Впервые у экстремофильных бактерий Т. versutus, шт AL2 и Т aerophilum, шт AL3 показано образование покоящихся форм типа цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), контролируемое уровнем внеклеточных факторов d. Выявлены различия в жизнеспособности и терморезистентности у образующихся в разных условиях ЦРК

5 Установлено, что микробные АОБ обладают свойствами структурных модификаторов ферментов, обуславливающих их стабилизацию и изменение каталитической активности, а также влияют на структуру моноламелярных липосом

Практическая ценность работы.

1 Разработаны приемы направленного изменения диссоциативной способности бактерий В cereus, шт 504 (ВКМ), основанные на создании дисбаланса внеклеточных факторов di/d2, что позволяет быстро (в первом пассаже) проявлять спектр диссоциантов

для скрининга вариантов с желаемыми свойствами или, напротив, стабилизировать определенный фенотип, особенно с видоопределяющими признаками, для целей хранения микроорганизмов ex situ

2 Разработаны приемы стимуляции роста сероокисляющих бактерий (сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде дисбаланса внеклеточных факторов &J&2

3 Для разработки способов хранения неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий подобраны условия образования покоящихся форм в циклах развития их культур, в их автолизирующихся клеточных суспензиях, а также под действием экзогенно вносимых химических аналогов аутоиндукторов анабиоза - АОБ.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х региональных, всероссийских и международных конференциях По материалам диссертации опубликовано 11 работ1 из них 5 статей и 6 тезисов.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 177 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 305 публикаций отечественных и зарубежных авторов Материал иллюстрирован 30 таблицами и 16 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Бактерии Bacillus, cereus, штамм 504 (ВКМ) выращивали на среде Агреса [Мулюкин с соавт., 1996] Добавки' 10-20% МПБ, 0.4-60 г/л глюкозы, 2 г/л бактопептона варьировали количественно в зависимости от целей эксперимента. рН после стерилизации 7 0 ± 0.1 Галоадкалофильные облигатно автотрофные сероокисляющие бактерии Thioalkalmbrio versutus, шт. AL2 и Thioalkahmicrobium aerophilum, шт. AL3, любезно предоставленные д.б н Д.Ю Сорокиным (ИНМИ РАН), выращивали на минеральной среде согласно [Sorokin et al, 2000]. Культивирование проводили в колбах на 250 мл (50 мл среды) или 2000 мл (450 мл среды) на качалке (140 об/мин) при температуре 28°С.

Микробиологические методы. Жизнеспособность бактерий определяли методом предельных разведений при высеве в жидкую среду или путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве на агаризованные среды Микроскопические исследования проводили на микроскопе "Amplival" (ГДР) с фазово-контрастным устройством Оптическую плотность (ОП) суспензий измеряли нефелометрически на

спектрофотометре "Specord" (X = 660 им, 1 = 10 мм). Термоустойчивость клеток определяли при подсчете числа бактерий, оставшихся жизнеспособными после прогревания клеточных суспензий в ультратермостате "UV-10". Эндогенное дыхание определяли полярографически [Шопьц, Островский, 1975] Для ультрамикроскопических исследований осажденные клетки фиксировали по методу [Spurr et al, 1980] Улътратонкие срезы получали на микротоме LKB-IIT (Швеция) и просматривали на микроскопе JEM-100B (Япония) при инструментальном увеличении 20000-30000 раз Электронно-микроскопическую криофрактографиго осуществляли по методу [Фихте с соавт, 1973] Индексы диссоциации популяций В. cereus определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний

Биохимические и биофизические методы анализа Выделение ауторегуляторных факторов Ai и d- проводили, как описано ранее [Светличный с соавт, 1986] За единицу активности принимали количество препарата, которое подавляет эндогенное дыхание клеток на 50% В качестве химических аналогов факторов d^ использовали гексилрезорцин (Sigma) - амфифильное соединение с рКа = 9 0, который вносили в реакционные смеси в виде раствора в этаноле так, чтобы конечная концентрация спирта в рабочем объеме равнялась 3-5% (об/об), а также метилрезорцин (Fluka). Жирнокислотный состав в препаратах факторов d^rocneflOBanH на хромато-масс-спектрометре НР-5973 Hewlett-Packard (США) [Осипов с соавт, 1985]. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базами данных масс-спектров nbs75k и wiley275 Активность q-химотрипсина (Merck) определяли по скорости гидролиза этилового эфира М-бензоил-1,-тирозина (ВТЕЕ) [Айста с соавт, 1976] Активность трипсина (Sigma) определяли по скорости гидролиза казеина, растворенного в фосфатном буфере, pH 7 8 Количество белка в клетках определяли по методу Лоури. Критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) фактора di в водных растворах определяли по точке излома изотермы поверхностного натяжения растворов, измеряемого с помощью пластинки Вильгельми, как описано в [Бабак с соавт, 1996] Моноламелярные липосомы (ЮОнм) получали из 10% спиртового раствора яичного фофатидилхолина (яФХ) методом замораживания - оттаивания, с дальнейшей экструзией через ядерную мембрану

Статистическая обработка. Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов (t-теста Стьюдента) в программе Microsoft Excel-2000 (критерий вероятности Р<0 05 принимали достаточным для достоверной разницы групп данных).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Регуляция фенотипической изменчивости Bacillus cereus, шт. 504 Изучение регуляции развития микробных популяций мы начали с рассмотрения фенотипической изменчивости, создающей большие трудности для биотехнологических производств, в связи с неконтролируемым замещением высоко продуктивных вариантов менее эффективными Объектом исследований служила спорообразующая бактерия В cereus, шт 504 Методом многократных пассажей [Кузнецов, 1974] были выделены и описаны диссо-цианты этой культуры с устойчивыми колониально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, доминантный (Д), микоидный (М), белый (Б) и прозрачный (П), которые различались ростовыми характеристиками и активностью экзопротеаз, убывающей в порядке: прозрачный > доминантный > белый > микоидный, а также показателями развития культур: выход зрелых эндоспор наблюдался у доминантного и белого вариантов на 4-е, у микоидного - на 2-е, у прозрачного - на 6-е сутки культивирования.

Ранее было установлено, что в условиях репрессии эндоспорообразования бациллы образуют другие, альтернативные формы покоя - анабиотические цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК), которые формируются при развитии культуры в средах с избытком глюкозы, лимитом азота или фосфора, или кислорода [Мучюкин с соавт, 1996], что способствует повышенному биосинтезу факторов di - алкилоксибензолов (АОБ), имеющих функции аутоиндукторов анабиоза [Элъ-Регистан, 1988]. В этих работах было обнаружено, что ЦРК характеризовались нестабильностью фенотипа Наши исследования вариабельности популяций вегетативных клеток и покоящихся форм разных морфотипов (табл 1) показали, что доля минорных вариантов была всегда выше при рассеве последних, а в категории вегетативных клеток - больше в популяциях пролиферативно покоящихся стационарных, чем экспоненциально растущих Так как стадийность развития микобных культур, включая прорастание и образование покоящихся форм, контролируется

Таблица 1. Соотношение вариантов в первом пассаже рассева вегетативных клеток и покоящихся форм разных __типов В. сегеш, шт. 504._

Формы клеток Содержание вариантов, % от общего числа колоний

Д М П Б Доля мин вар

Клетки фазы экспоненциального роста 99.6 04 0 0 0.4

Клетки стадион, фазы 95.5 4.4 0.1 0 4.5

ЦРК естественного цикла развития (1мес) 51.0 46.0 3.0 0 49 0

ЦРК при действии фё] (6 5 ед/мл, 1 5 мес.) 44.9 28 3 26.6 02 55 1

Эндоспоры (14 суток) 89,4 10.0 0.6 0 10.6

(в том числе) ауторегуляторной системой, осуществляющейся с участием аутоиндукторов анабиоза (факторов <!]) и аутоиндукторов автолиза (факторов Аг), можно было предположить их участие в контроле (де)стабилизации морфологических вариантов Индукция развития того или иного фенотипа, в этом случае, должна зависеть от уровня аутоиндукторов в среде. Исследования проводили с эндоспорами В сегеиз, которые в отличие от ЦРК характеризовались высокой степенью стабильности фенотипа (табл 1), что снижало вероятность влияния на диссоциацию иных причин, кроме как концентраций ауторе1уляторов

Таблица 2. Диссоциация доминантного варианта под действием фактора (Ь*

Концентр. аь % 011=0.6-0.7,1 =1 ч 011=0.6-0.7, г = 2 сут

КОЕ* 107 Индекс диссоциации,% КОЕхЮ7 Индекс диссоциации, %

Д . м П д м П

Контр. 9.2±1 8 78.3 14.8 6.9 8.5±1.6 76.3 16.0 77

Контр.** 7.9±1.8 75.0 15.1 99 6 6±1.6 76.2 15 2 8.6

X 9.2±1 7 80.1 19.9 0 6.9±1.5 73 0 27.0 0

2Х 9 0±1 5 78 0 22.0 0 6 9±1.3 68 1 31 9 0

10Х 7.6±1.3 70.5 29.5 0 5.1±1 0 77.0 23.0 0

20Х 4.7±1.0 86.0 14.0 0 1.8±0.2 83.8 16.2 0

100Х 3.5±0 5 89.2 10 8 0 1.1±0.2 91 7 8.3 0

200Х 2.9±0.5 96.0 4.0 0 1.0±0.1 91 9 8.1 0

Концентр. а,, % 011=0.6-0.7,1 = 6 сут 011=0.6-0.7,1 = 14 сут

КОЕ* 107 Индекс диссоциации,% КОЕ* 10' Индекс диссоциации,%

Д М п д М п

Контр.** 6 2±1.1 85 3 82 65 5 9±0.9 79 7 12 1 82

X 6.8±1.0 78.7 21.3 0 0.02±0.001 100 0 0

2Х 6.4±1.3 88.3 11.7 0 - - - -

* в автореферате приведены данные только для доминантного варианта,

** в таблицах 2 и 4 в среду роста вносили этиловый спирт до концентрации 5% об,

*** втаблицах2иЗ X - определенная концентрация фактора с! 1

Таблица 3. Влияние экзогенного фактора с!] на диссоциативную активность колониально-морфологических вариантов

Варианты В сегеш Концентрация с1ь %

стабилизирующие индуцир диссоциац

Доминант 20Х-200Х 2Х-10Х

Микоидный 10Х-20Х Х-2Х

Белый 20Х-200Х Х-10Х

Прозрач Л4 Х-20Х 0.5Х

Прозрач П1 при Сй,> 0 4Х эндоспоры не прорастают

Прединкубация эндоспор с фактором до их высева на плотные среды существенно влияла на индекс диссоциации развивающихся популяций (табл. 2,3) Так, стабилизация доминантного варианта наблюдалась при обработке спор фактором <11 в концентрациях (20Х-200Х)% в течение часа; (10Х-20Х)% - 2 суток; >2Х% - 6 суток, Х% - 14 суток.

Дозозависимость была показана также для микоидного и прозрачного вариантов Исключение составлял белый вариант - при увеличении времени экспозиции стабильность его фенотипа снижалась (увеличивался индекс диссоциации) Между колониально-морфологическими вариантами существовала определенная зависимость диссоциативных переходов Так, диссоциация доминантного варианта шла за счет увеличения доли микоидного и в небольшом проценте прозрачного вариантов, микоидный и белый ревертировали к доминантному, наиболее стабильным был прозрачный диссоциант Прединкубация эндоспор различных вариантов с фактором с!г оказывала менее существенное влияние на диссоциацию отдельных вариантов В. cereus Так как эксперименты всегда проводили в стандартных условиях (среды, ОП споровых суспензий), обнаруженное действие фактора di относится преимущественно к эффекту индукции диссоциации, а не к селекции развития отдельных, уже имеющихся в популяции спор вариантов.

Таблица 4. Диссоциация колониально-морфологических вариантов В. сегеш, пгг. 504 при их развитии на твердой питательной среде с внесенным фактором

Конц. Индекс диссоциации на различные колониально-морфологические варианты, %

db % доминантный 011=0.6-0.7 микоидный М1 011=0.7

КОЕ, % к контр. Д М П КОЕ, % к контр. Д М П

Контр 100.0 89.8 10 2 0 100.0 19 8 79.7 0.5

Контр** 73 2 91.6 1.7 6.7 80.9 80.0 19.3 0.7

0.0005 7.0 83 6 10.2 6.2 21.3 75 1 22 0 29

0.001 5.6 97.0 2.5 0.5 3.4 87.0 11.9 1.1

0.0025 отсутствие роста

белый 011=0.7-0.8 прозрачный 0п=0.6

КОЕ, % к контр Д М Б КОЕ, % к контр д П Б

Контр 100.0 6.0 4.4 89.6 100.0 0 L 100.0 0

Контр** 50.9 1.8 0 98 2 100.0 78.7 14 2 7.1

0 0005 70.2 9.8 0.8 894 83.3 80.0 20.0 0

0 001 отсутствие роста 75.0 75.0 25.0 0

0 0025 отсутствие роста

Для выяснения возможного селектирующего действия фактора его вносили в агаризованную среду для рассева эндоспор (табл. 4). Повышение концентраций ауторегулятора приводило к снижению (по сравнению с контролем) числа проросших спор, вплоть до полного ингибирования их прорастания (при концентрации 0.0025%).

Таблица 5 Чувствительность дис-

социантов к действию факторов dj и d2.

Дис-соци ант Концентрация фактора, соответствующая ед. дыхательной активности

db х Ю'5М d2, х 10'УМ

Д 20.0 17.5

М 9.0 11.0

Б 17.0 15.6

П1 14.0 16.4

Более чувствительными по этому показателю оказались доминантный и белый варианты, однако они сохраняли стабильность морфотипа, тогда как микоидный и прозрачный диссоцианты во всех опытных вариантах ревертировали к доминантному морфотипу Отмеченные зависимости коррелировали с чувствительностью клеток экспоненциальной фазы различных диссоциантов к действию факторов di и d~ (табл 5)

На стабильность фенотипа эндоспор различных диссоциантов не влияло повышение уровня фактора d| при их образовании (ауторегулятор вносили в жидкую среду одновременно с инокулятом в концентрации, не влияющей на рост культур) На 5-тые сутки развитие опытных культур завершалось образованием такого же как и в контроле количества спор, с незначительно более стабильным морфотипом (за счет уменьшения доли прозрачного варианта) Споры возрастом 14 суток имели более низкую прорастаемость при рассеве на плотные среды, а их диссоциативная способность не отличалась от 5-ти суточных

Таким образом, обнаружено, что повышение степени вариабельности популяции или, напротив, стабилизация фенотипов диссоциантов В сегеич, шт 504 контролируются балансом внеклеточных ауторегуляторов факторов &\!&г Направленным изменением концентраций факторов d;/d2 на стадии прорастания покоящихся форм бактерий можно индуцировать вьпцепление минорных вариантов для быстрого скрининга диссоцианта с желаемыми свойствами, или стабилизировать определенные варианты, особенно с видоопределяющими признаками, что может быть использовано в биотехнологических целях или для хранения коллекционных штаммов микроорганизмов

Глава 2. Функции факторов di как ингибиторов спорового прорастания

Показанное выше ингибирующее споровое прорастание действие фактора di при его внесении в питательную среду (табл 4) или при обработке спор перед рассевом (табл 2) было подтверждено методом дисков, а также в специальных экспериментах с внесением в жидкую питательную среду химического аналога фактора d! Повышение уровня ауторегулятора приводило к ингибированию прорастания спор и роста культур В cereus вплоть до полного подавления прорастания при концентрации 0.01% Анализ этих результатов позволил предположить, что факторы di обладают функциями аутоингибиторов спорового прорастания Прямые доказательства этому были получены в биотестах для этой группы ауторегуляторов [Allen, Dunkle, 1971], Было показано, что при повышении плотности споровых суспензий В cereus уменьшается как численность, так и скорость прорастания эндоспор Так, в суспензии с ОП 0,2 эндоспоры через 1 час наблюдений теряли рефрактерность и набухали, через 2 часа - все споры прорастали, а

через 5 часов - обнаруживались цепочки клеток В суспензиях с ОП 0 7 и 1 4 через 5 часов наблюдений основное количество эндоспор оставалось рефрактерными' 71,7 и 84,0 % соответственно (табл. 6). Наблюдаемые эффекты были обусловлены, в том числе, действием внеклеточных факторов <1ь реализуемых из спор, концентрация которых зависела от плотности споровых суспензий и составляла' при ОП 1,4 - 50 ед/л, а при ОП 0 2 и 0 7 значительно меньше - 12 5 и 13.8 ед/л Так как факторы ¿1 проявляют бблыпую биологическую активность в закисленных средах (растворах), вследствие протонирован-ности их молекул и лучшей транслокации в клетке [Светличный, 1986], была исследована зависимость спорового прорастания от рН среды (табл 7). Оказалось, что в кислой среде (рН 3), при прочих стандартных условиях, прорастание спор (ОП=0 2) ингибируется Полученные результаты согласуются с одной из гипотез, объясняющей присущее спорам состояние покоя наличием в них аутоингибиторов, блокирующих метаболические процессы \Sussman. ЯоиЛи, 1973] Прорастание спор сопряжено с выходом из них ауторегуляторов, что рассматривается как "разрешение" к цитодифференцировке, завершающейся образованием вегетативных клеток В плотных споровых суспензиях повышающиеся концентрации выходящих из спор аутоингибиторов, в данном случае факторов <1ь также как и закисление среды, препятствующее этому выходу, являются причиной ингибирования спорового прорастания

В биотехнологическом аспекте полученные данные следует учитывать для повышения эффективности использования биоцидных средств на начальных стадиях контаминации.

Таблица 6. Прорастание эндоспор В сегет в суспензиях с различной ОП

Стадия прорастания эндоспор % от общего числа клеток

ОП

0.2 0.7 1 4

рефрактерные 0 71.7 84.0

набухшие и потемневшие 0 12.6 12.0

проросшие 0 64 1 0

одиночные клетки 0 46 2.3

цепочки клеток 100 0 47 07

Таблица 7 Влияние рН на прорастание эндоспор В. сегеиБ в суспензиях с

Стадия % от общего числа

прорастания клеток

эндоспор РН

3 5 7 9

рефрактерные 100 50 1 1

набухшие и

проросшие 0 49 4 4

одиночные

клетки 0 1 90 80

поделивш.

пополам 0 0 5 15

Глава 3. Влияние факторов d] и d2 на рост микробных популяций

Объектами исследований этой части работы были два штамма экстремально галоал-калофильных литоавтотрофных сероокислягощих грамотрицательных бактерий Thioalkalivibrio versutus, пгг AL2 и Thioalkahmicrobium aerophilum, шт AL3, которые 01личались рядом ростовых характеристик [Сорокин, 2000]

Выделение и исследование биологического действия ауторегуляторн ых факторов dt и d2

Ауторегуляторные факторы di и d2 выделяли из КЖ культур бактерий начала стационарной фазы роста по методике [Светличный с соавт, 1986] В водно-метанольных фракциях обнаружили биологическую активность, свойственную факторам di - ингибирование эндогенного дыхания бактерий и индукцию образования цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК) (табл. 8).

Таблица 8. Характеристики фракций

Таблица 9 Содержание внеклеточных

Характеристика фактор di из штамма

AL2 AL3

Ингибирование дыхания, мл/мг белка, в отнош клеток АТ.2 (1 ед ) в отнош. клеток АЬЗ (1 ед.) 0 27 0.31 0.36 0.33

Накопление фактора ёь ед /мг белка 10.3 7.2

Накопление ф<1ь ед/мл 0 93 0 87

Образование ЦРК, ед 5 8 4.9

Культура Содержание АОБ,

мг/г белка мг/лКЖ

Т versutus шт AL2 0 53 0 048

Т aerophilum шт АЬЗ 0 29 0.034

Pseudomonas aurantiaca* 0.35 0 10

Micrococcus luteus** 4.76 5.00

M roieus*** 1 86 1 20

M sp.*** 3.14 2.00

* Неопубликованные данные ** Данные из [Муяюкин с соавт, 1996] *** Данные из [Мулютн с соавт, 2001]

Таблица 10. Влияние микробных и химически синтезированных АОБ ____на дыхание клеток бактерий. __

Препарат АОБ Концентрация, вызывающая 50% ингибирование дыхания клеток, мг АОБ/мг белка

клетки шт AL2 клетки шт. АЬЗ клеткиМ. luteus*

АОБ из шт. AL2 0.051 0 059 -

АОБ из шт. АЬЗ 0.043 0.040 -

АОБ из М luteus - 0.056 0.015

4-н гексилрезорцин 0 40 0.36 0015

4-н децилрезорцин - 0.11 0 095

5-н децилрезорцин 0.68 0.075 0 012

2,5 дибутилрезорцин - 0.089 0.027

2-нонил-5-децилрезорцин >1 66 0 45 0.10

♦Данные взяты из [Мулютн с соавт., 2001].

Применение высоко специфичного для обнаружения алкилрезорцинов модифицированного колориметрического метода (реакция с FBB) [Мулюкин с соавт, 1996] показало их наличие в составе факторов di обеих бактерий (табл 9), аналогично обнаруженным ранее у бактерий родов Pseudomonas [Осипов с соавт., 1993; Kozubek, Тутап, 1999], Micrococcus [;Мулюкин с соавт., 1996], Azotobacter [Батраков с соавт, 1993] Определение концентрации АОБ в выделенных фракциях факторов di позволило количественно сравнить их действие на электрон-транспортную цепь с действием химически синтезированных АОБ с известной структурой, различающихся между собой положением заместителей в кольце (табл 10) Короткоцепочечные химические аналоги были менее активны по сравнению с АОБ, содержащимися в фракциях факторов di шт AL2 и AL3. Это предполагает наличие в них длинноцепочечных АОБ, подобно синтезируемым псевдомонадами или азотобактером [Осипов с соавт., 1985, Батраков с соавт., 1993, Kozubek, Тутап, 1999].

В хлороформенно-спиртовых фракциях, выделенных из КЖ обеих культур, обнаружили активность, свойственную факторам dг• В низких концентрациях (до 0 031 мл/мкг белка) они стимулировали, а в высоких - ингибировали дыхание клеток продуцентов Единицы активности (50% ингибирование дыхания клеток) составили 0.35 мл/мкг белка для шт. AL2 и 0.30 мл/мкг белка для шт. AL3 Внесение фактора d2 в количестве 4-5 ед. акт. в суспензии бактерий вызывало их быстрый автолиз.

Таблица 11. Компонентный состав хлороформенно-спиртовых фракций КЖ шт. AL2 и AL3.

Компонент Содержание (%)

шт AL2 шт AL3

16 1 1 29 -

118 1 23 94 2146

182 0 76 -

19 1 - 1 38

Z СНЖК 25.99 22.84

18:1сгшрт 3.36 8.97

моноглицерид-С 18.1 1 76 -

£ всех ненасыщ. соед. 31.11 31.81

£ насыщенных ЖК 43 18 37 25

I и углеводородов С22-29 11.04 10.65

Другие компоненты 14 67 20 29

2 всех компонентов 100.00 100.00

Физиологический эффект факторов <12 у обоих штаммов определялся действием свободных ненасыщенных жирных кислот (СНЖК), аналогично показанному ранее для других микроорганизмов [Светличный с соавт., 1986; Бабусенко с соавт., 1991 и др ] Хромато-масс-спектрометрический анализ (табл. 11) выявил преобладание во фракции СНЖК обоих штаммов изомеров олеиновой кислоты. Отметим наличие в факторах d2 обеих культур ненасыщенных С181 спиртов, которые не встречались у ранее исследованных микроорганизмов, что может быть использовано в целях хемотаксономии

Таким образом, у исследуемых экстремофильных сероокислягощих бактерий была обнаружена система ауторегуляции роста и развития микробных культур, осуществляющаяся с участием внеклеточных факторов (11 - аутоиндукторов анабиоза (по-видимому, АОБ), и факторов <12 аутоиндукторов автолиза (СНЖК), что еще раз подтверждает её универсальность для микроорганизмов различных таксономических групп

Регуляция процессов роста галоалкалофильных сероокисляющих бактерий

Способность СНЖК - активного начала факторов <3з - увеличивать до критических концентраций жидкостность клеточных мембран, тем самым повышая их функциональную активность, была использована для интенсификации процессов роста бактерий шт АЬЗ В качестве химического аналога фактора применяли олеиновую кислоту, которая в концентрациях до 8 мкМ стимулировала дыхание клеток шт АТ.З фазы линейного роста

Концентрация С18 1, мкМ 0 02 06 1 2 20 40 60 80 100 12 0 J

Дыхание, % к контролю 100 107 131 150 144 118 109 105 100 75 1

* в контрольный вариант вносили этиловый спирт (до 5 %об).

Олеиновую кислоту вносили в среду роста бактерий одновременно с инокулятом. Наиболее эффективной была концентрация 1 мкМ (табл 12): по показателям сокращения длительности лаг-фазы (на 15%); увеличения максимальной удельной скорости роста (в 1.6 раза); повышения численности жизнеспособных клеток (КОЕ) за 28 часов культивирования (на 92%) Вариант с внесением С181 в количестве 0.05 мкМ имел отличия: при наименьшей длительности лаг-фазы (80 4% от контр.) отсутствовала диауксия, что обеспечивало равномерность нарастания количества жизнеспособных клеток Действие С 18.1 в количестве 0 005 мкМ практически не влияло на рост бактерий, однако, увеличивало в среднем в два раза количество жизнеспособных клеток через месяц хранения культур в условиях, способствующих автолизу (без консервирующих добавок и при температуре 20°С), что важно с позиций биотехнологического производства.

Таблица 12 Влияние олеиновой кислоты на рост бактерий шт АЬЗ.

Количество вносимой С18 1, мкМ Показатели роста (% от контр.)

Лаг-фаза, ч Макс, ц, ч1 Количество клеток в мл через

10 ч, х108 28 ч, х10"

Контроль 1 02(100 0) 1 01 (100.0) 2 0(100 0) 1 3 (100 0)

5 0 98 (96 0) 1 38 (136 6) 2.7 (135 0) 1 5 (115 4)

1 0.87 (85.3) 1 66(164.4) 2 5 (125.0) 2.5 (192.3)

02 1.71 (167.6) 1 16(114.9) 3.3 (165.0) 1 0 (76.9)

0 05 0 82 (80 4) 0 57 (56 4) 22(1100) 1 2 (92 3)

0.005 0 92 (90 2) 1.21(119.8) 2.5 (125.0) 1.3 (100.0)

Таблица 13 Влияние С7-АОБ на рост бактерий шт АЬЗ

Количество вносимого С7-АОБ, мкМ Показателироста (% от контр.)

лаг-фазы, ч Макс, ц, ч 1 Количество клеток в мл. через

10 ч, х108 28 ч, хЮ"

Контроль 0 98 (100.0) 0 77 (100.0) 2 5 (100 0) 1 3 (100 0)

50 0 93 (94 9) 0 51 (66 2) 3 5 (140 0) 2 4 (184 6)

5 0.72 (73.5) 101(131.2) 2.7 (108.0) 1.5(115.4)

1 0.66 (67.3) 0.77 (100.0) 2.5 (100.0) 1.6(123 1)

Так как АОБ обладают выраженной антиоксидантной активностью [Вострокнутова с соавт, 1983], они могут в низких концентрациях обладать ростостимулирующим действием [Бурлакова с соавт, 1995] Внесение химического аналога фактора С7-АОБ в среду роста одновременно с инокулятом (табл 13) сокращало продолжительность лаг-фазы (на 32 7%) эффективнее, чем внесение олеиновой кислоты (на 19 6%), но в меньшей степени влияло на увеличение удельной скорости роста. Это объясняется различным механизмом действия факторов (11 и ¿2 увеличение жидкостности мембран клеток с помощью СНЖК обуславливает повышение их функциональной активности и, таким образом, клеточного метаболизма в целом, тогда как антиоксидантная защита, обеспечиваемая факторами по-видимому, позволяет снизить стресс, вызванный попаданием бактерий в новую среду

Таким образом, применение мембранотропных ауторегуляторов факторов с!] и &2 для стимуляции роста культур экстремофильных микроорганизмов в условиях лабораторного эксперимента оказалось успешным. Это предполагает целесообразность использования предложенных приемов для интенсификации промышленных микробных процессов, но потребует контролируемого подбора концентраций вносимых ауторегуляторов с учетом специфичности микроорганизмов.

Глава 4. Регуляция процессов цитодифференцировки сероокисляющих бактерий

Образование покоящихся форм в циклах развития и в автолизирующихся суспензиях бактерий

Поддержание культур экстремофильных грамотрицателышх сероокисляющих

бактерий Пюа1ка1тЬгю уегэшич, шт АЬ2 и ТЫоа1ка\ткгоЬтт аегорИг/ит, шт АЬЗ, для

которых не описаны специализированные покоящиеся формы, представляет большие

трудности Даже в случае рекомендованного [Сорокин, 2000] способа их хранения (в виде

жидких суспензий бактерий с добавлением при Т = 5-10°С), подавляющее

большинство клеток лгоировалось (рис 1, кривые 1,2), оставшиеся клетки уменьшались в

размерах и приобретали частичную рефрактерность.

Рис. 1. Динамика снижения числа жизнеспособных клеток в суспензиях галоалка-лофильных бактерий, хранившихся в течение 9 нед.

1 - культура Т. versutus, шт AL2, цикл развития;

2 - культура Т. aerophilum, шт AL3, цикл развития;

3 - культура Т. versutus, шт. AL2, сгущение в 20 раз;

4 - культура Т. 3 4 8 6 7 8 9 aerophilum, шт. AL3,

сгущение в 20 раз.

Недели

Эти наблюдения и наличие системы ауторегуляции, включающей факторы di и dj, обусловили постановку следующей задачи - доказательство и изучение условий образования в циклах развития галоалкалофильных бактерий покоящихся цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), обнаруженных ранее у ряда неспорообразующих микроорганизмов. Электронно-микроскопические исследования длительно хранящихся бактериальных суспензий штаммов AL2 и AL3 выявили наличие в них интактных клеток двух типов с измененной, по сравнению с вегетативными формами, ультраструктурной организацией У клеток первого типа не выявлялся нуклеоид, цитоплазма теряла гранулярность и становилась менее электронно плотной, наблюдалось сжатие протопласта и расширение периплазматического пространства, особенно, на одном из полюсов клетки. Клетки другого типа имели коккоидную форму с утолщенными клеточными стенками, капсульным слоем и не прокрашиваемой осмием сердцевиной протопласта, что напоминало дегидратированный споропласт мутантных форм эндоспор В mbtihs с нарушенным синтезом кортекса [Driks, 1999]. У исследуемых клеточных суспензий отсутствовал экспериментально измеряемый уровень эндогенного или экзогенно стимули-руемого (тиосульфатом натрия) дыхания. Отмеченные признаки были характерны для ЦРК.

Для увеличения количества покоящихся интактных клеток использовали модель "сгущенной автолизирующейся суспензии", позволяющей за счет высвобождения факторов d] из автолизирующихся клеток одной части популяции (под действием внеклеточных факторов d2 - аутоиндукторов автолиза) повысить общий уровень внеклеточных ауторегулято-ров, способствующих образованию покоящихся форм неавтолизированными клетками другой части популяции В экспериментах клеточные суспензии (стационарная фаза) сгущали в

]0, 20 и 30 раз в нативной среде роста, что имитировало природную ситуацию повышения бактериальной плотности в придонных слоях водоемов После 2 месячного хранения количество жизнеспособных клеток в сгущенных (оптимально для обоих штаммов в 20 раз) образцах шт АЬ2 оказалось на пять порядков больше, чем в контроле, а в автолизирующих-ся суспензиях шт АЬЗ - на два порядка (рис. 1) Микроскопирование в фазовом контрасте выявило большое количество интактных клеток, уменьшенных размеров, частично или полностью рефрактерных. По своей ультраструктурной организации интактные клетки шт АЬ2 и АЬЗ, полученные в сгущенных в 20 раз суспензиях, были аналогичны клеткам, образовавшимся в естественном цикле развития этих бактерий и описанным выше Экспериментально определяемый уровень эндогенного или экзогенно стимулируемого дыхания отсутствовал. Полученные ЦРК обоих штаммов обладали важной характеристикой покоящихся форм - повышенной устойчивостью к летальным воздействиям' высокой температуре (табл. 14), осмотическому и кислотному шоку, что особенно актуально для представителей галоалкалофилов Так, после 2-часового экспонирования в воде при рН 5.5 жизнеспособными оставались 20.3% стационарных клеток контрольного варианта шт АЬ2 и 80% клеток, полученных при сгущении в 10 раз и хранившихся в течение месяца. Экспонирование в растворе НС1 при рН 2.4 в течение 1.5ч показало сходную тенденцию: жизнеспособными оставалось 0 038% стационарных клеток контрольного варианта шт АЬ2 и 2% клеток, полученных при сгущении в 20 раз и хранившихся в течение месяца.

Таблица 14 Термоустойчивость ЦРК, полученных в цикле развития и в сгущенных _суспензиях, число клеток/мл (% от исходного)__

Воздействие Контроль (2-сут стац. культуры) Ц ,РК после 1 мес хранения, полученные в

цикле развития суспензиях, сгущеных в

10 раз | 20 раз | 30 раз

Т. \епиш, шт. АЫ

Нет (2.5±0.2)х109 (100.0) (3,8±0 4)х108 (100 0) (0.9±0.2)хЮ10 (100.0) (2.4±0.3)хЮ10 (100 0) (2.2±0.3)хЮ10 (100.0)

60°С, 15мин (1 4±0.2)х105 (5.6 х 10"3) (3 0±0 5)х104 (7.9 х 10'3) (4.8±0 6)х105 (5.3 х 10"3) (1 2±0.2)х106 (5 0x10"3) (1.1±0.1)х106 (5.0x10"3)

60°С, ЗОмин (6 3±0.7)х104 (2 5 х Ю-3) (4.1±0 8)х104 (1.1 х 10"2) (1.2±0.2)х106 (1.3 х 10'2) (4.3±0.6)х106 (1.8 хЮ'2) (1.3±0 2)х106 (6 0 х Ю"3^

80°С, 15мин 0 (0) (5 0±0.7)х10° (1.3 х 10*) (2 0±0.4)х103 (2 2 х 10"5) (7.9±0.7)х104 (3 3 х 10"4) (4.4±0 4)х104 (2.0 х 10'4)

Т. аегорИПит, шт. АО

Контроль (2-сут. стационар культуры) ЦРК после 2 мес хранения, полученные в

цикле развития сгущ. в 20 раз суспензии

Нет (6.2 ±0 8)х108(100 0) 65 0± 12.0(100.0) (2 3 ±0.4)х103( 100.0)

60°С, 30 мин (2 0±0.5)х103 (3.2x1с4) 37.5 ±7.0 (57 7) (1.5 ±0.2)х102(6.5)

Сравнение процессов образования покоящихся форм у двух исследуемых культур, имеющих разные ростовые характеристики (nrr. AL2 (K-стратег), пгг AL3 (г-стратег)) [Sorokin et al., 2003], показало, что количество (как абсолютное, так и удельное) образующихся покоящихся форм у шт AL3 на несколько порядков меньше, чем у пгг AL2, тогда как процент остающихся жизнеспособными после термообработки ЦРК шт AL3 существенно выше, чем у шт AL2 Это указывает на возможную сопряженность стратегий роста и переживания' бактерии шт AL3 (r-стратег), характеризующиеся высокой скоростью роста и быстрым автолизом культуры, образуют небольшое количество, но очень устойчивых покоящихся форм, в отличие от медленно растущих бактерий шт AL2 (K-стратег), формирующих большее количество покоящихся форм, лишь незначительная часть из которых устойчива к повреждающим (термоинактивация) воздействиям

Образование покоящихся форм под воздействием экзогенно вносимого фактора di В первом блоке экспериментов химический аналог фактора di - С12-АОБ (5х10'3 -5x10"6 М) вносили в клеточные суспензии шт AL2 и AL3 начала стационарной фазы, что вызывало сжатие клеток и быстрое развитие рефрактерности, а также полное ингибирова-ние эндогенного и экзогенно стимулируемого дыхания бактерий Рефрактерные формы сохраняли клеточную целостность на протяжении всего периода наблюдений (до 2 лет) Индукция образования метаболически неактивных, но сохранивших жизнеспособность (анабиотических) форм зависела от концентрации вносимого аналога фактора di, а также формы его диспергирования Жизнеспособные клетки были обнаружены при внесении С12-АОБ в водорастворимой форме в концентрации 2x10"3 М. Ультраструктура таких форм была сходной со строением клеток 1-го типа, образовавшихся в цикле развития или полученных в сгущеннных суспензиях. В других вариантах - под воздействием высоких концентраций аналога (выше SxlO^M для шт AL2 и 2х10"4М для шт. AL3) и внесении его в виде растворов в этаноле или ДМСО - рефрактерные формы полностью утрачивали пролиферативную способность. Цитоплазма таких клеток плохо прокрашивалась и имела низкую электронную плотность Эмиссионная электронная микроскопия и криофракгогра-фия показали, что структура наружной мембраны и ЦПМ были нарушены, что явилось причиной необратимой потери жизнеспособности. Подобные рефрактерные клетки сохраняли внешнюю форму в течение всего периода наблюдений (2 года) и были устойчивы к биологической деструкции (лизоциму, протеазам, микробной контаминации) Акцентируя внимание на этом свойстве, такие формы было предложено называть мумифицированными

клетками или "микромумиями" Аналогичные мумифицированные клетки были получены нами для других бактерий и дрожжей, а также обнаружены в природных образцах (волокнистых керитах) возрастом около 2 млн лет [Герман, 1990, ОоНепко е! а1, 2000]

Новая модель получения покоящихся форм (ЦРК) предусматривала развитие культур бактерий в условиях повышенной концентрации аутоиндукторов анабиоза, когда в свежую среду роста одновременно с инокулятом вносили химический аналог фактора - С7-АОБ, в концентрациях (5x10"5 - 10"6) М Цикл развития опытных культур завершался образованием рефрактерных клеток в количестве большем, чем в контрольном варианте (табл 15) Эти формы по всем необходимым признакам (сохранение жизнеспособности, отсутствие экспериментально определяемого дыхания, термостабильность, характерная ультраструктурная организация) были отнесены к покоящимся клеткам Образование большего количества покоящихся форм в этой модели можно объяснить изменением метаболизма клеток при развитии культур в присутствии дополнительных (к нативному уровню) концентраций фактора <1! или заменой одного фенотипа на другой, клетки которого обладают большей потенцией перехода в покоящееся состояние (см главу 1) (второе представляется более вероятным)

Таблица 15 Влияние С7-АОБ в составе среды роста на жизнеспособность клеток шт. АЬЗ.

Концентрация С7-АОБ, М Титр жизнеспособности, число кл/мл (% от контр.) через

1 мес хранения 1 5 мес хранения

Контроль (без С7-АОБ) (6,9 ± 0.9) хЮ2 (100.0) (3 0 + 0.5) х 102(100.0)

5 х 10"5 (1.9±0.1)х 103 (275.4) (7.1+0.7) хЮ2 (236.7)

5х Ю-6 (3.5 ± 0.4) х 102(50.7) (0.5 ± 0.08) хЮ2 (16.7)

10"6 (2.8 ± 0.3) х 103 (405.8) (5.0 ±0.4) х 102(166.7)

Таким образом, установлено, что неспорообразующие экстремофильные бактерии Т. аегорИг1ит, шт АЬЗ и Т уегяшш, шт АЬ2 способны к образованию в циклах развития их культур, в сгущенных автолизирующихся суспензиях, а также под воздействием экзогенно вносимых химических аналогов фактора б] покоящихся форм типа ЦРК, для которых характерны' морфологические изменения - уменьшение размера клеток и повышение степени их рефраггерности; резко сниженный уровень метаболической активности; повышенная устойчивость к повреждающим и летальным воздействиям; специфическая для ЦРК ультраструктурная организация клеток и сохранение жизнеспособности в течение длительного времени Полученные результаты важны для разработки новых способов хранения культур галоалкалофштьных бактерий, а также других неспорообразующих микроорганизмов.

Глава 5. Исследование некоторых аспектов механизма действия факторов анабиоза

Аутоиндукторы анабиоза как структурные модификаторы белков Действие факторов dL в создании метаболического блока при развитии и поддержании анабиотического состояния должно бьгть обусловлено, в числе прочих причин, неспецифическим и обратимым ингибированием каталитических активностей клетки. Обнаруженные нами эффекты драматических изменений в субклеточной организации бактерий, зависящие от концентраций факторов di (химических аналогов) в клеточных суспензиях, обусловили необходимость изучения действия АОБ на белковые макромолекулы, а также липидные компоненты клеточных мембран

Рассмотрение кривых поверхностного натяжения водно-спиртовых растворов (5% спирта) химического аналога фактора d! - С6-АОБ - позволило выяснить зависимость форм его молекулярного диспергирования в воде от концентраций В диапазоне до 0 05% (2.5мМ) АОБ представлял собой стабильный раствор; в интервале концентраций до 0.09% (4.5 мМ) - истинный раствор; при концентрациях свыше 0.09% (4.5мМ) (критическая концентрация мицеллообразования (ККМ)), начиналось образование мицелл (рис. 2, кривая 2).

£ « §

i ® £ х К х

Е £

о> Ь ч I?

о 1 с

-2.8 -2.6 -2.4 -2.2 -2 -1.8 !

Концентрация Сб-АОБ, lg(C , М) |

— -------------i

Рис. 2 Зависимость поверхностного натяжения водно-спиртовых растворов смеси трипсин (2 5мг/мл) - С6-АОБ (1) от его концентрации в сравнении с индивидуальным раствором Сб-АОБ (2).

В модельных экспериментах in vitro с использованием индивидуальных ферментов, химотрипсина, РНК-азы, глюкозооксидазы, инвертазы и др. было показано, что взаимодействие белков с АОБ в широком диапазоне его концентраций (0 01-0 2%) приводит к изменению каталитических активностей ферментов. Так Ce-АОБ ингибировал активность химотрипсина в концентрации 0.05% (2 5 мМ) на 26 %, 0 2% (ЮмМ) - на 50%; в концентрации 0 09% (4 5мМ), соответствующей ККМ, - на 34% Следовательно, Сб-АОБ взаимодействовал с белками как в виде истинного раствора, так и в виде мицелл.

Механизм действия АОБ при концентрациях ниже ККМ можно объяснить их способностью образовывать межмолекулярные водородные связи за счет гидроксилъных групп ароматического ядра и функциональных ( КН2 и -СООН) групп белков, а также гидрофобными взаимодействиями с белком при участии алкильных радикалов Когда уровень АОБ выше ККМ, его функция как ингибитора ферментов, возможно, связана со способностью образовывать стабильные мицеллярные системы, где мицеллы могут служить иммобилизационной матрицей для белка \Reusch й а1, 1979]

Об изменении конформации макромолекул в составе комплексов с фактором (1] косвенно можно судить по смещению ККМ смеси "АОБ-трипсин" в сторону более высоких концентраций (рис 2, кривая 1). Сложный характер изотермы поверхностного натяжения смеси отражает, вероятно, несколько событий, связанных с образованием различных конформеров белка (2 5 - 45 мМ), а при возрастании концентрации АОБ от 0 1 до 0 2 % (от 5 до 10 мМ), возможно, с укрупнением комплексов, что визуально проявляется в опалесценции раствора и сопровождается сопутствующем снижением поверхностного натяжения вплоть до 10 мМ Другим доказательством способности факторов с!] (АОБ) к комплексообразованию с белками было изменение спектра флуоресценции комплекса "Сб-АОБ-РНК-аза (биназа)" по сравнению со спектрами индивидуальных белка и АОБ.

Таблица 16 Влияние Сб-АОБ на устойчивость химотрипсина _к термообработке (т/о) (60°; 15 мин)._

Концентрация Сб-АОБ, % Активность химотрипсина, ммоль/с (% к контролю]

Дот/о После т/о

Контроль (без Сб-АОБ) 0 88 (100.0) 0(0)

0 05 0 69(100 0) 0 66 (95.6)

0.1 0.56(100.0) 0.35 (62.5)

Как правило, модификация конформации белков сопровождается изменением стабильности макромолекул к денатурирующим воздействиям Наши эксперименты продемонстрировали повышение термостабильности ферментов при их комплексообразовании с АОБ (табл 16), что говорит о протекторной функции АОБ (факторов di) и позволяет отнести их по механизму своего действия к естественным химическим шаперонам [Tatzelt at al, 1996] При взаимодействии макромолекулы белка с Сб-АОБ происходит такое изменение структуры фермента, которое предполагает увеличение "жесткости" глобулы полимера [Марголин с соавт., 1983], в результате чего мы фиксируем снижение скорости катализа и сопряженное с этим существенное повышение устойчивости фермента в денатурирующих условиях

Таким образом, показано, что микробные АОБ (факторы di) являются естественными

структурными модификаторами макромолекул ферментов и могут обуславливать неспецифическое ингибирование метаболизма при формировании покоящихся клеток я повышение их устойчивости к экстремальным воздействиям. Аналогичная защитная функция была продемонстрирована нами для глицин-бетаина, являющегося осмопротектором галоалкалофильных бактерий, исследуемых в настоящей работе [Сорокин, 2000] (табл 17). На фоне постоянно присутствующих в клетках галоалкалофилов осмопроте кторов (глицин-бетаин, эктаин), обеспечивающих возможность их существования в экстремальных условиях, накопление факторов <!), с описанной выше функцией химических шаперонов и индуцирующих дегидратацию клетки и ее переход в гипометаболическое или анабиотическое состояние, может обеспечивать бактериям дополнительную защиту при стрессовых воздействиях.

Таблица 17. Влияние глицин-бетаина на устойчивость трипсина к термообработке _(Т= 60°С; 15-30 мин)._

Конц. глицин-бетаина в прединкуба-ционном растворе с ферментом, % Активность трипсина, % к контролю

До т/о Т/о 60иС, 15мин. Т/о 60°С, ЗОмин

Контроль (0) 100.0 46.5 10.3

0.007 100.8 104.5 52.9

0.017 104.9 108.4 80.6

0.033 108.1 107.1 68.4

0.067 98.4 105.8 78.7

0.17 90.0 103.2 76.1

Таким образом, можно заключить, что ауторегуляторные факторы <1ь синтезируемые микроорганизмами, являются полифункционалышми соединениями, а их действие следует рассматривать в комплексе с действием других низкомолекулярных регуляторов, в частности, осмопротекторного типа. Полученные в работе данные важны не только для понимания механизмов развития и поддержания анабиотического состояния у микроорганизмов, но и для выявления регуляторных функций аутоиндукторов анабиоза на популяционном уровне при межклеточных взаимодействиях в развивающихся микробных культурах и промышленных консорциумах.

Воздействие микробных алкилрезорцинов налипидные компоненты клеточных мембран

Для объяснения механизмов структурной реорганизации клеточных мембран в процессе перехода вегетативных клеток бактерий в анабиотическое или "мумифицированное" состояние, было изучено воздействие химического аналога фактора (1. - Сб-АОБ на липид-ный бислой с использованием модели моноламелярных липидных везикул ("диаметр 100 нм), сформированных из яичного фософатидилхолина (яФХ) различной концентрации (0,2; 0,4; 0,5; 1,0 мгяФХ/мл) Происходящие структурные изменения регистрировали спектрофо-

1 ометрически при длине волны 450 нм Внесение АОБ в возрастающих концентрациях в липосомные суспензии вызывало увеличение ОП, степень которого резко возрастала после добавления определенной (для каждой концентрации яФХ) критической дозы ауторегулятора Установлено, что в такой критической точке соотношение молекул Сб-АОБ и яФХ составляло примерно 1 1 для всех исследуемых концентраций яФХ (табл 18)

Таблица 18 Расчет соотношений числа молекул Сб-АОБ и яФХ в критической точке

Конц. Число Количество Конц Количество Отношение

липосом, мг/мл липосом, х1014 молекул яФХ, хЮ20 Сб-АОБ, хЮ_4М молекул Сб-АОБ, хЮ20 числа молекул Сб-АОБ/ яФХ

0,2 15 1.57 3,0 1,8 1.14

0,4 30 3.14 4,75 2.85 0.91

0,5 37 3,92 6,0 3.6 0.92

1,0 75 7.86 12,3 7.4 0.94

Электронная микроскопия липосомных суспензий, в различной степени нагруженных Сб-АОБ, показала, что в интервале до критического уровня Сб-АОБ происходит увеличение размеров липосом и ближе к критической точке - частичное слипание их в агрегаты. Вероятно, на данном этапе молекулы Сб-АОБ, также как и их более длинноцепочечные аналоги [ОиЬегпаЮг ах а1, 1999], встраиваются в бислой, но при этом не изменяют его структуру Это подтверждается устойчивостью везикул к действию лизирующего агента -2% раствора твина лизис контрольных везикул и нагруженных Сб-АОБ в указанных концентрациях происходил одинаковыми темпами Увеличение концентрации АОБ до критической (Сб-АОБ яФХ = 1 1) и выше приводит к разрушению структуры липосом и образованию конгломератов Выявленные закономерности взаимодействия липосом и Сб-АОБ, согласуются с результатами, полученными при воздействии этого химического аналога фактора (1! на клетки исследуемых нами бактерий, когда в зависимости от концентрации Сб-АОБ клетки или приобретали обратимое анабиотическое состояние с сохранением жизнеспособности (при формировании ЦРК), или происходила необратимая деградация мембранных структур с образованием "микромумий". Следует отметить, что этот пороговый (для сохранения стабильности мембран) уровень АОБ несколько различался для разных видов микроорганизмов.

Дальнейшее изучение эффектов и механизмов регуляторного действия микробных АОБ - аутоиндукторов анабиоза - составляет перспективу в понимании общих тенденций развития и старения культур, а также формирования клеточного ответа к стрессам, наиболее выраженным проявлением которого является образование покоящихся анабиотических форм.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что создание дисбаланса внеклеточных факторов di и d2 изменяет диссоциативный индекс в популяции прорастающих спор В cereus Разработаны приемы, позволяющие проявлять широкий спектр диссоциантов для скрининга наиболее эффективных продуцентов микробных синтезов, или, напротив, стабилизировать определенный фенотип с необходимыми признаками для биотехнологических целей или хранения микроорганизмов ex situ.

2 Обнаружена функция факторов d¡ - аутоиндукторов анабиоза, как ингибиторов прорастания спор бактерий В cereus, пгг 504

3 Впервые у галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Thioalkalmbrio versutas, шт AL2 и Thioalkahmicrobium aerophilum, шт AL3 обнаружена система ауторегуляции, включающая факторы di - аутоиндукторы анабиоза, в состав которых входят АОБ (на основании специфической качественной реакции), и факторы d2 - аутоиндукторы автолиза, активным началом которых являются свободные ненасыщенные жирные кислоты.

4 Впервые у неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Т versutos, шт AL2 и Т aerophilum, шт AL3 показано образование покоящихся форм типа цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), контролируемое уровнем внеклеточных факторов di, обладающих функциями аутоиндукторов анабиоза. Подобраны условия образования ЦРК- 1) в циклах развития культур сероокисляющих бактерий; 2) в их автолизирующихся сгущенных клеточных суспензиях; 3) а также под действием экзогенно вносимых химических аналогов аутоиндукторов анабиоза - АОБ Выявлены различия образующихся в разных условиях ЦРК по показателям их жизнеспособности и терморезистентности.

5. Предложены новые способы поддержания культур неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий, основанные на получении ЦРК.

6 Разработаны способы стимуляции роста галоалкалофильных сероокисляющих бактерий (сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде дисбаланса факторов d]/d2

7 Установлено, что микробные алкилоксибензолы обладают свойствами естественных структурных модификаторов ферментов и могут обуславливать ингибирование клеточного метаболизма при формировании покоящихся клеток Показано действие С6-АОБ -химического аналога фактора di - на структуру моноламелярных липосом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Беспалов М.М, Колпаков А.И, Лойко Н.Г, Дорошенко ЕВ, Мулюкин A.JL, Козлова А.Н., Варламова Е А., Курганов Б.И., Эль-Регистан Г.И. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке // Микробиология 2000. Т. 69. №2. С. 217-223.

2. Дорошенко Е.В., Лойко НГ, Ильинская ОН, Колпаков А.И, Горнова ИБ, Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология 2001 Т 70 №6 С. 811-819.

3. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г И. Низкомолекулярные ауторегуляторы бактерий Thioalkahvibrio versutus и Thioalkahmicrobium aerophilum II Микробиология 2002. Т. 71. №3. С. 308-315.

4 Сузина Н Е, Мулюкин А Л, Лойко Н Г, Козлова А.Н, Дмитриев В В., Шорохова А П., Горленко В М , Дуда В.И , Эль-Регистан Г.И. Тонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндуктора анабиоза//Микробиология 2001. Т 70. №5. С. 1-11

5. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю, Митюшина Л.Л. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkahvibrio versutus и Thioalkahmicrobium aerophilum II Микробиология. 2003. Т. 72 №3 С 328-337

6 Беспалов М М, Лойко Н.Г, Демкина Е.В , Дорошенко Е В., Мулюкин А.Л., Козлова А Н, Варламова Е А, Курганов Б.И., Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф Г., Эль-Регистан Г И Роль аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов в ингибировании ферментов при развитии покоя // Доклады XI Всероссийской конференции "Ферменты микроорганизмов". Казань-УНИПРЕСС 1998. С 191-200.

7 Дорошенко Е.В., Лойко НГ, Демкина Е.В , Мулюкин АЛ. Изучение регуляции диссоциации культур микроорганизмов на колониально-морфологические варианты // Матералы Международной конференции стран СНГ "Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития: Проблемы и решения". 29 ноября - 3 декабря 1999. Москва. Т.2 С 26-27.

8. Мулюкин А Л, Дорошенко Е.В, Демкина Е.В., Лойко Н.Г, Сорокин В В. Исследование биоразнообразия покоящихся форм микроорганизмов для повышения эффективности экологического мониторинга// Матералы 1— Международной конференции стран СНГ "Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития' Проблемы и решения" 29 ноября - 3 декабря 1999. Москва. Т 2 С 48-50.

9 Дорошенко Е В., Лойко Н Г, Мулюкин А.Л Биоразнообразие покоящихся форм микроорганизмов // Матералы конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" 2000 Пущино 28 мая 2 июня Т.1.С. 195-196.

10. Мулюкин АЛ., Дорошенко ЕВ., Лойко Н.Г, Карпекина ТА. К вопросу о механизмах анабиоза микроорганизмов // Матералы конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии". 2000 Пупщно. 28 мая - 2 июня Т 1 С. 104-

11. Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В, Карпекина ТА., Мулюкин А. Л. Стимуляция промышленных микробных процессов мембранотропными ауторегуляторами // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых "Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов" Москва 2000 С 117-118

105

РНБ Русский фонд

2006-4 32002

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лойко, Наталия Геннадиевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Межклеточная коммуникация у микроорганизмов.

7.7 Бактерии — как мулыпиклеточные организмы.

1.2 Исследования межклеточной коммуникации у микроорганизмов

1.3 Язык, на котором микроорганизмы "разговаривают друг с другом ".

2. Ауторегуляторы микроорганизмов.

2.1 Общие понятия.

2.2 Система ауторегуляции миксобактерий.

2.3 Ауторегуляторные факторы d/ udj.

2.4 Эффекты кворума.

3. Сигнальные системы грамотрицательных бактерий с участием ацилированных лактонов гомосерина.

3.1 Регуляция биолюминесценции у морских бактерий.

3.2 " Quorum sensing"у Pseudomonas aeruginosa.

3.3 " Quorum sensing " у бактерий рода Erwinia.

3.4 " Quorum sensing "у клубеньковых бактерий рода Rhizobium.

3.5 Двухкомпонентные сигнальные системы.

4. Сигнальные системы грамположительных бактерий. t 4.1 Феромоны компетентности в Streptococcus pneumoniae.

4.2 Индукция компетентности и споруляции у Bacillus subtilis.

4.3 Регуляция вирулентности у Staphylococcus aureus.

4.4 Коньюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Регуляция фенотипической изменчивости Bacillus cereus, шт.

Глава 2. Функции факторов d| как ингибиторов спорового прорастания.

Глава 3. Влияние ауторегуляторных факторов d| и на рост микробных популяций.

Глава 4. Регуляция процессов цитодифференцировки сероокисляющих бактерий.

Глава 5. Исследование некоторых аспектов механизма действия факторов анабиоза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур"

Актуальность проблемы. Развитие биотехнологии, направленное на внедрение в промышленность новых и постоянное повышение эффективности существующих микробных процессов, обуславливает необходимость изучения закономерностей роста культур микроорганизмов и механизмов саморегуляции их развития, в которых, согласно современным представлениям, большую роль играют специфические внеклеточные метаболиты, обеспечивающие межклеточные взаимодействия и объединяемые термином ауторегуляторы [Хохлов, 1988]. Успешное решение многих конкретных задач биотехнологии зависит от выявления и изучения механизмов прямого или косвенного действия этих веществ, контролирующих физиологическую активность клеток и их цито-дифференцировку. Актуальными представляются исследования возможности применения принципов ауторегуляции для решения проблем диссоциативных переходов промышленных штаммов, приспособления сапрофитов к нестабиль

• ным условиям роста, эффективности микробных промышленных консорциумов, стимуляции роста культур, включая сокращение лаг-фазы и увеличение выхода биомассы продуцентов, разработки новых способов поддержания промышленных штаммов, получения продуктов микробного синтеза и др. В этой связи особый интерес представляет изучение влияния на развитие микроорганизмов ауторегуляторов полимодального типа, контролирующих физиологическое состояние микроорганизмов на всем протяжении онтогенетического развития их культур. Такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндукторы анабиоза - факторы d| (производные алкилоксибензолов (АОБ)) и аутоиндукторы автолиза - факторы d2 (свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК)), выделенные и описанные для широкого круга микроорганизмов [Коновалова с соавт., 1985; Эль-Регистан, 1988; Бабусенко с соавт., 1991; Мулюкин с соавт., 1996; Демкина с соавт., 2000]. Для расширения представлений о возможности использования этих ауторегуляторов в биотехнологических производствах, в качестве объектов исследований в данной работе рассматри вались бактерии Bacillus cereus, шт. 504, применяемые на практике для утилизации бытовых отходов и относящиеся к группе бацилл с энтомопатогенными свойствами; и экстремофильные галоалкалофильные сероокисляющие бактерии Thioalkalivibrio versutus, шт. AL2 и Thioalkalimicrobium aerophilum, шт. AL3, участвующие в промышленном процессе нефтепереработки на стадии очистки содового буфера от серосодержащих соединений.

Цель работы - изучить возможности использования ауторегуляторных факторов di и сЬ для направленной регуляции фенотипической диссоциации микроорганизмов, их роста и образования покоящихся форм на примере бактерий Bacillus cereus, Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum.

Задачи исследования:

1. Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий В. cereus с помощью факторов d| и 62.

2. Исследовать участие факторов d| в процессах прорастания спор бактерий В. cereus.

3. Выявить наличие системы ауторегуляции, включающей факторы d| и d2, у галоалкалофильных сероокисляющих бактерий для возможностей регуляции процессов роста этих промышленных штаммов.

4. Выявить условия образования покоящихся форм у неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий для разработки способов их хранения ex situ.

5. Изучить возможные механизмы действия факторов d| - аутоиндукторов анабиоза в процессах развития покоящегося состояния бактерий.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что создание дисбаланса внеклеточных факторов di/d2 изменяет диссоциативный индекс в популяции прорастающих спор В. cereus.

2. Показано, что факторы d| имеют функции ингибиторов прорастания бактериальных спор.

3. У галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Т. versutus, шт. AL2 и Т. aerophilum, шт. AL3 обнаружена система ауторегуляции, включающая факторы di - аутоиндукторы анабиоза, предположительно отнесенные к АОБ; и d2-ayтoиндyктopы автолиза, активным началом которых являются СНЖК.

4. Впервые у экстремофильных бактерий Т. versutus, шт. AL2 и Т. aerophilum, шт. AL3 показано образование покоящихся форм типа цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), контролируемое уровнем внеклеточных факторов d|. Выявлены различия в жизнеспособности и терморезистентности образующихся в разных условиях ЦРК.

5. Установлено, что микробные АОБ обладают свойствами структурных модификаторов ферментов, обуславливающих их стабилизацию и изменение каталитической активности, а также влияют на структуру моноламелярных липосом.

Практическая ценность работы.

1. Разработаны приемы направленного изменения диссоциативной способности бактерий В. cereus, шт. 504 (ВКМ), основанные на создании дисбаланса внеклеточных факторов dt/d2, что позволяет быстро (в первом пассаже) проявлять спектр диссоциантов для скрининга вариантов с желаемыми свойствами или, напротив, стабилизировать определенный фенотип, особенно с видоопределяющими признаками, для целей хранения микроорганизмов ex situ.

2. Разработаны приемы стимуляции роста сероокисляющих бактерий (сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде дисбаланса внеклеточных факторов d|/d2.

3. Для разработки способов хранения неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий подобраны условия образования покоящихся форм в циклах развития их культур, в их автолизирующихся клеточных суспензиях, а также под действием экзогенно вносимых химических аналогов аутоиндукторов анабиоза - АОБ.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х региональных, всероссийских и международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 11 работ: из них 5 статей и 6 тезисов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лойко, Наталия Геннадиевна

выводы

1. Впервые установлено, что создание дисбаланса внеклеточных факторов di и ёг изменяет диссоциативный индекс в популяции прорастающих спор В. cereus. Разработаны приемы, позволяющие проявлять широкий спектр диссоциантов для скрининга наиболее эффективных продуцентов микробных синтезов, или, напротив, стабилизировать определенный фенотип с необходимыми признаками для биотехнологических целей или хранения микроорганизмов ex situ.

2. Обнаружена функция факторов di - аутоиндукторов анабиоза, как ингибиторов прорастания спор бактерий В. cereus, шт. 504.

3. Впервые у галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Thioalkalivibrio versutus, шт. AL2 и Ibioalkalimicrobium aerophilum, шт. AL3 обнаружена система ауторегуляции, включающая факторы dj — аутоиндукторы анабиоза, в состав которых входят АОБ (на основании специфической качественной реакции), и факторы Аг - аутоиндукторы автолиза, активным началом которых являются свободные ненасыщенные жирные кислоты.

4. Впервые у неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Т. versutus, шт. AL2 и Т. aerophilum, шт. AL3 показано образование покоящихся форм типа цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), контролируемое уровнем внеклеточных факторов di, обладающих функциями аутоиндукторов анабиоза. Подобраны условия образования ЦРК: 1) в циклах развития культур сероокисляющих бактерий; 2) в их автолизирующихся сгущенных клеточных суспензиях; 3) а также под действием экзогенно вносимых химических аналогов аутоиндукторов анабиоза — АОБ. Выявлены различия образующихся в разных условиях ЦРК по показателям их жизнеспособности и терморезистентности.

6. Разработаны способы стимуляции роста галоалкалофильных сероокисляющих бактерий (сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде дисбаланса факторов di/cfe.

7. Установлено, что микробные алкилоксибензолы обладают свойствами естественных структурных модификаторов ферментов и могут обуславливать ингибирование клеточного метаболизма при формировании покоящихся клеток. Показано действие Сб-АОБ - химического аналога фактора di - на структуру моноламелярных липосом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактериальная культура не является простой суммой клеток, а обладает рядом свойств и особенностей, которые у отдельно взятых клеток отсутствуют. Понимание сложной структурированной организации природной бактериальной популяции в пространстве и во времени базируется на изучении различных механизмов взаимодействия клеток. Функционирование бактериальной культуры как единой саморегулируемой системы определяется, в том числе, влиянием ауторегуляторных метаболитов, среди которых большой интерес представляют аутоиндукторы анабиоза (факторы d|) и аутоиндукторы автолиза (факторы d2), контролирующие рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития.

В нашей работе было продолжено успешное изучение механизмов действия этих ауторегуляторов и выявление их регуляторных функций на популяционном уровне при межклеточных взаимодействиях в развивающихся микробных культурах и их ассоциациях. Мы обнаружили, что наряду с уже исследованными свойствами (описанными в литобзоре), факторы d| являются естественными структурными модификаторами макромолекул ферментов. Поэтому изменение свойств ферментов в их комплексах с факторами d| (АОБ) и лабильность самих комплексов в зависимости от изменений молярных соотношений белок-АОБ, качественного состава АОБ, а также физико-химических условий окружения могут определять новый уровень регуляции физиологической активности микробных культур и их функционирования in situ.

Выбранные объекты исследования являлись важными биотехнологическими культурами. Так, регуляция фенотипической диссоциации была исследована на бактериях Bacillus cereus, шт. 504, относящихся к группе бацилл с энтомопатогенными свойствами и применяемых на практике для утилизации бытовых отходов. Регуляторные механизмы реализующие диссоциативные переходы до сих пор неизвестны. Мы предположили, что фактор d| может проникать с определенной скоростью внутрь эндоспоры и, обладая функциями химических шаперонов, изменяющих конформацию белковых биополимеров и, таким образом, их функциональную активность, регулировать экспрессию определенных регулонов по средствам структурной модификации о-факторов РНК-полимеразы, или непосредственно взаимодействовать с ДНК. Возможно также, что, обладая функциями естественных структурных модификаторов мембран и влияя на липид-белковые взаимодействия в репликативных центрах, ассоциированных с мембранной, факторы d| тем самым могут передавать сигнал внутрь эндоспоры. В результате проведенных исследований нам удалось разработать приемы позволяющие проявлять широкий спектр диссоциантов для скрининга наиболее эффективных продуцентов микробных синтезов, и, напротив, стабилизировать определенный фенотип с необходимыми признаками для биотехнологических целей или хранения микроорганизмов ex situ.

Для исследования регуляции роста и образования покоящихся форм были использованы экстремофильные галоалкалофильные сероокисляющие бактерии Thioalkalivibrio versutus, шт. AL2 и Thioalkalimicrobium aerophilum, шт. AL3, участвующие в промышленном процессе нефтепереработки на стадии очистки содового буфера от серосодержащих соединений. Обнаружение системы ауторегуляции, включающей факторы d| и d2 у этих бактерий ещё раз подтвердило ее универсальность для микроорганизмов различных таксономических групп. Наряду с этим удалось разработать способы стимуляции роста галоалкалофильных сероокисляющих бактерий (сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде дисбаланса факторов d|/d2, что имеет огромный практический интерес, так как позволяет повысить эффективность промышленного процесса. Была решена еще одна биотехнологическая задача: это поддержание культур сероокисляющих бактерий, для которых не описаны специализированные покоящиеся формы. Были подобраны условия образования покоящихся форм (типа ЦРК) в циклах развития культур сероокисляющих бактерий, в их автолизирующихся клеточных суспензиях, а также под действием экзогенно вносимых химических аналогов аутоиндукторов анабиоза (АОБ).

Таким образом, изучение ауторегуляторной системы с участием факторов d| и d2 позволило предложить схемы практического использования этих биологически активных веществ (их химических аналогов) для направленной регуляции фенотипической диссоциации микроорганизмов, их роста и образования покоящихся форм. Использование выявленных закономерностей ауторегуляции развития микробных культур расширяет перспективы биотехнологических производств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лойко, Наталия Геннадиевна, Москва

1. Aizenmctn Е., Engelberg-Kulka Н., Glaser G. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death // Proc. Nail. Acad Sci. USA. 1996. V. 93. P. 6059-6063.

2. Allen P.J., Dunkle LD. Natural activators and inhibitors of spore germination. Morphological and biochemical events in plant-parasite interaction. Tokio: Phytopathol. Soc. Japan. 1971. P. 23-58.

3. AUoingG., Martin В., Granadel C., Claveris J.P. Development of competence in Streptococcus pneumoniae: pheromone autoinduction and control of quorum-sensing by the oligopeptide permease // Mol. Microbiol. 1998. V. 21. № l.P. 75-83.

4. Arakawa Т., Timasheff S. N. Preferential interactions of proteins with solvent components in aqueous amino acid solutions I I Arch. Biochem. Biophys. 1983. V. 224. P. 169-177

5. Bacteria as multicellular organisms / Eds. Shapiro J.A., Dworkin M. New York: Oxford. Univ. Press, 1997.

6. Bainton N.J., Stead P., Chhabra S.R, Bycroft B.W., Salmond G.P.C., Stewart G.S.A.B., Williams P. N-(3-Oxohexa-noyl)-L-homoserine lactone regulates carbapenem antibiotic production in Erwinia carotovora И Biochem. J. 1992a. V. 288. P. 997-1004.

7. Bakal С. J., Davies J.E. No longer an exclusive club: eukaryotic signalling domains in bacteria// Trends in Cell Biology. 2000. V. 10. № 1. P. 32-38.

8. Bassler B.L., Wright M., Silverman M.R. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway // Mol. Microbiol. 1994a. V. 13. P. 273-286.

9. Bassler B.L, Wright M., Silverman. M.R. Sequence and function of LuxO, a-negative regulator of luminescence in Vibrio harveyi II Mol. Microbiol. 19946. V. 12.P.403-412.

10. Biochemistry of bacterial growth / Eds. Mandelstam J., McQuillen K., Daves I. London etc.: Blackwell Sci. Publ., 1982.

11. Biophoton emission. Multi-author review // Experientia. 1988. V. 44. № 7. P. 543-630.

12. Biophotonics (Non-equilibrium and coherent systems in biology, biophysics and biotechnoligy) // Proc. Int. Conf. Dedicated 120th birthday in A.G. Gurwitsh. Moscow: Bioinform cervices Co., 1995.

13. Boettcher K.J., Ruby E.G. Detection and quantification of Vibrio fischeri autoinducer from symbiotic squid light organs // J. Bacteriol. 1995. V.177. P. 1053-1058.

14. Bowden M.G., Kaplan H.B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development // Mol. Microbiol. 1998. V. 30. № 2. P. 275-284.

15. Boylan M., Graham A.F., Meighen E.A. Functional identification of the fatty acid reductase components encoded in the luminescence operon of Vibrio fischeri U J. Bacteriol. 1985. V. 163. P. 1186-1190.

16. Bridges B.A. DNA turnover and mutation in resting cells // BioEssays. 1998. V. 19. P. 347-351.

17. Brown L.H., Williams K.L. Gradients in the expression of cell surface glycoprotein in a simple tissue, the Dictyostellium discoideum slug // J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 847-853.

18. Burbulys D., Trach K.A., Hoch J.A. Initiation of sporulation in B. subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay // Cell. 1991. V. 64. P. 545-552.

19. Callahan S.M., Dunlap P.V. LuxR- and acyl-homoserine lactone-controlled non-lux genes define a quorum-sensing regulon in Vibrio Jischeri И J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 2811-2822.

20. Cha С., Gao P., Chen Y.C., Shaw P.D., Farrand S.K. Production of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Gram-negative plant-associated bacteria //Mol. Plant-Microbe Interact. 1998. V. 11. P. 1119-1129.

21. Charpac M., Dedonder R. Production d'un "facteur competence" soluble par Bacillus subtilis Marburg 168 // Compt. Rend. Acad. Sci. 1965. V. 260. №21. P. 5638-5641.1..Clewell D.B. Bacterial Conjugation. New York: Plenum.1991.

22. Сlewell D.B. Bacterial sex pheromone-induced plasmid transfer // Cell. 1993. V. 73. P. 9-12.

23. Dibb N.J., Downie J.A., Brewin NJ. Identification of a rhizosphere protein encoded by the symbiotic plasmid of Rhizobium leguminosarum И J. Bacteriol. 1984. V. 158. P. 621-627.

24. Dobrzanski W., Osowiecku H. Isolation and some properties of the competence factor from group H Streptococcus strain Challis И J. Gen. Microbiol. 1967. V. 48. № 2. P. 299-304.

25. Driks A. Bacillus subtilis spore coat // Microbiol. Molecular Biol. Rev. 1999. V. 63. № l.P. 1-20

26. Dubncru D. Genetic competence in Bacillus subtilis //Microbiol. Rev. 1991. V. 55. № 3. P. 395-424.

27. AO.Dunlap P. V., Greenberg E.P. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-LuxR protein regulatory circuit // J. Bacteriol. 1988. V. 70. P. 4040-4046.

28. Dunlap P. V., RayJ.M. Requirement for autoinducer in transcriptional negative autoregulation of the Vibrio fischeri luxR gene in Escherichia coli И J. Bacterial. 1989. V.171. P. 3549-3552.

29. Dunn O.K., Michaliszyn G.A., Bogacki l.G., Meighen E.A. Conversion of aldehyde to acid in the bacterial bioluminescent reaction // Biochemistry. 1973. V. 12. P. 4911-4918.

30. Dunny G.M., Craig R.A., Carron R.L.t Clewell D.B. Plasmid transfer in Streptococcus faecalis: Production of multiple pheromones by recipients // Plasmid. 1979. V. 2. P. 454-465.

31. Dunny G.M., Funk C., Adsit J. Direct stimulation of the transfer of antibiotic resistance by sex pheromones in Streptococcus faecalis II Plasmid. 1981. V. 6. P. 270-278.

32. AS.Dunny G.M., l^eonard B.A.B. Cell-cell communication in gram-positive bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. P. 527-564.

33. Dunny G.M., Leonard B.A.B., Hedberg P.J. Pheromone-inducible conjugation in Enterococcus faecalis: interbacterial and host-parasite chemical communication II J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 1-2.

34. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the myxobacteria II Microbiol Rev. 1996. V. 60. C. 70-102.

35. Dworkin M, Gibson S.M. A system for studying rapid microbial morphogenesis: Rapid formation of mycrocysts in Myxococcus xanthus II Science. 1964. V. 146. P. 243-245.

36. A9.Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 2444-2449.

37. Errington J. Sporulation in Bacillus subtilis: regulation of gene expression and control of morphogenesis // Microbiol. Rev. 1993. V. 57.№ 1. P. 1-33.

38. Freeman J.A., Bassler B.L. A genetic analysis of the function of LuxO, a two-component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi H Mol. Microbiol. 19996. V. 31. P. 665-677.

39. Freeman J.A., Bassler B.L. Sequence and function of LuxU: a two-component phosphorelay protein that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi // J. Bacteriol. 1999a. V. 181. P. 899-906.

40. Freeman J.A., Lilley B.N., Bassler. B.L. A genetic analysis of the functions of LuxN: a two-component hybrid sensor kinase that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi/I Mol. Microbiol. 2000. V. 35. P. 139-149.

41. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-Luxl family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. BacterioL 1994. V. 176. № 2. P. 269-275.

42. Gazotti P., Peterson S. W. Lipid requirement of membrane-bound enzymes II J. Bioenerg. Biomembr. 1977. V. 9. № 6. P. 373-386.

43. Gerth K., Metzger R., Reichenbach H. Induction of in Stigmatella aurantiaca (myxobacteria): Inducers and inhibitors of myxospore formation, and mutants with a changed sporulation behavior H J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. №4. P. 865-871.

44. Gerth K.t Reichenbach H. Induction of myxospore formation in Stigmatella aurantiaca (Myxobacteriales). General characterization of the system II Arch. Microbiol. 1978. V. 117. P. 173-179.

45. Gilson L., Kuo A., Dunlap P. V. AinS and a neiw family of autoinducer synthesis proteins//./. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 6946-6951.

46. A.Govan J.R.W., Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia II Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 539-574.

47. Graf J., Ruby E.G. Host-derived amino acids support in proliferation of symbiotic bacteria// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. P. 1818-1822.

48. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. 1998. V. 94. P. 695698.

49. Greenberg E.P., Winans S., Fuqua C. Quorum sensing by bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1996. V. 50. P. 727-751.

50. Gubernator J., Stasiuk M., Kozubek A. Dualeffect of alkylresorcinols, natural amphiphilic compounds, upon liposomal permeability // Biochim. Biophys. Acta. 1999 № 1418 C. 253-260.

51. Hamilton W.D. The genetical evolution of social behaviour // J. Ibeor. Biol. 1964. V. 7. P. 1-52.

52. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: an overview // Methods Enzymol. 1978. V. 57. P. 125-135.

53. Havarstein L.S, Morrison D.A. Quorum-sensing and peptide pheromone in streptococcal competence for genetic transformation // Eds. Dunny C.M., Winans S.C. Washington: American Society for Microbiology Press. 1999. P. 9-26.

54. Janzon L., Lofdahl S., Arvidson S. Evidence for the coordinate control of alpha-toxin and protein A in Staphylococcus aureus H FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 33. P.193-198.

55. Kaiser D. Control of multicellular development: Dictyostelium and Myxococcus H Annu. Rev. Genet. 1986. V. 20. C. 539-566.

56. Kaiser D., Losick R. How and why bacteria talk to each other // Cell. 1993. V. 79. P. 873-885.

57. Kaplan H.B., Eberhard A., Widrig C., Greenberg E.P. Synthesis of N-3-oxo4,5-3H2.-hexanoyl-homoserine lactone: biologically active tritium-labelled Vibrio Jischeri autoinducer // J. Labelled Compounds and Radiopharm. 1985. V. 22. P. 387-395.

58. Kell D.G., Kaprelyants A.S., Grafen A. Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria // Tree. 1995. V. 10. P. 126-129.

59. Kennedy B.K., Guartente L. Genetic analysis of aging in Saccharomyces cerevisiae // Trends Gen. 1996. V. 12. P. 355-359.

60. S6.Kim S.K., Kaiser D. C-factor has distinct aggregation and sporulation thresholds during Myxococcus xanthus development II J. Bacterial. 1991. V. 173. P. 1722-1728.

61. W.Kim S.K., Kaiser D. Purification and properties of Myxococcus xanthus C-factor, an intercellular signaling protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 3635-3639.

62. Kornblum J., Kreiswirth ВProjan S., Ross H., Novick R. agr: a polycistronic locus regulating exoprotein synthesis in Staphylococcus aureus I I In Molecular Biology of Staphylococci. / eds. Novick R.P. New York: VCH, 1990. pp. 373402.

63. Kozubek A., Stanisxaw P., Czerwonka A. Alkylresorcinols are abundant lipid components in different strains of Azotobacter chroococcum and Pseudomonas spp. II J. Bacteriol. 1996. V. 178. №14. P. 4027-4031.

64. Kozubek A., Tyman John H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity I I Chemical Rev. 1999. V. 99. P.l-31.

65. Kuo A., Callahan S.M., Dunlap P.V. Modulation of luminescence operon expression by N-octanoyl-L-homoserine lactone in ainS mutants of Vibrio fischeri II J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 971-976.

66. Lebeau C., Vandenesch F., Greenland T.t Novick R.P., Jerome E. Coagulase expression in Staphylococcus aureus is positively and negatively modulated by an agr-dependent mechanism II J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 5534-5536.

67. Lee M., Morrison D.A. Identificstion of a new regulator in in Streptococcus pneumoniae linking quorum sensing to competence for genetic transformation II J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 16. P. 5004-5016.

68. Lipkin R. Bacterial chatter. How patterns reveal clues about bacteria's chemical communication I I Sci. News. 1995. V. 147. P. 136-141.

69. Lithgow J.K., Wilkinson A., Hardman A., Rodelas В., Wisniewski-Dye F., Williams P., Downie J.A. The regulatory locus cinRI in Rhizobium leguminosarum controls a network of quorum-sensing loci // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. P. 81-97.

70. Lorenz M.G., Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the enviroment // Microbiol. Rev. 1994. V. 5. № 3. P. 563602.

71. Losick R., Kaiser IX Why and how bacteria communicate // Sci. Amer. 1997. February. P. 68-73.

72. Lowry ()., Rosebrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

73. Magnuson R., Solomon J., Grossman A.D. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from B. subtilis II Cell. 1994. V. 77. P. 207-216.

74. Mamson M.D., Armitage J.D., Hoch J.A., Macnab R.M. Bacterial locomotion and signal transduction II J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 5. P. 10091022.

75. Manvil C., Kaiser D. Purinecontaining compounds, including с AMP, induce fruiting of Myxococcus xanthus by nutritional imbalance II J. Bacteriol. 1980. V. 141 P. 374-377.

76. McGowan S.J., Sebaihia M., Porter L.E., Stewart G.S.A.B., Williams P., Bycroft B.W., Salmond, G.P.C. Analysis of bacterial carbapenem antibiotic production genes reveals a novel p-lactam biosynthesis pathway // Mol. Microbiol. 1996. V. 22. P. 415-426.

77. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 2702-2708.

78. Miyamoto C.M., Lin Y.H., Meighen E.A. Control of bioluminescence in Vibrio fischeri by the LuxO signal response regulator I I Mol. Microbiol. 2000. V. 36. P. 594-607.

79. Morfelclt E., Taylor D., Gabain A.V., Arvidson S. Activation of alpha-toxin translation in Staphylococcus aureus by the trans-encoded antisense RNA, RNA111 // EMBOJ. 1995. V. 14(18) P. 4569-4577.

80. Mori M., Sakagami Y., Ishii Y., Isogai A., Kitada C. Structure of cCFlO, a peptide sex pheromone which induces conjugative transfer of the Streptococcus faecalis tetracycline resistance plasmid, pCFlO J! J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 14574-14578.

81. Mutzel R. Introduction. Molecular biology, growth and development of the cellular slime mold Dictyostellium discoideum // Experientia. 1995. V. 51. № 12. P. 1103-1110.

82. Nasser W, Bouillant M.L., Salmond G.t Reverchon S. Characterization of the Erwinia chrysanthemi expI-expR locus directing the synthesis of two N-acyl-homoserine lactone signal molecules // Mol. Microbiol. 1997. V. 29. P. 1391-1405.

83. Nealson K.H. Autoinduction of bacterial luceferas: Occurence, mechanism and significance 11 Arch. Microbiol. 1977. Bd. 122. S. 73-79.

84. Nealson K.H. Isolation, indentification and manipulation of luminous bacteria II Meth. Enzymol. 1978. V. 57. P. 153-166.

85. Nealson K.H., Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance I I Microbiol. Rev. 1979. V. 43. P. 496-518.

86. Nicas T.I., Iglewski B.H. The contribution of exoproducts to virulence of Pseudomonas aeruginosa II Can. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 387-392.

87. Оке V., Long S.R. Bacteroid formation in the Rhizobium-legume symbiosis // Curr. Opin. Microbiol. 1992. V. 2. P. 641-646.

88. Orr W.C. Senescence: In search of causality // Develop. Genetics. 1996. V. 18. P.93-98.

89. Pakula R., Cybulska J., Walczak W. The effect of environmental factors on transformability of a Streptococcus U Acta Microbiol. Polonica. 1963. V. 12. № 4 P. 245-258.

90. Pakula R., Piechovska M., Bankowska E., Walczak W. A characteristic of DNA mediated transformation of two streptococcal strains // Acta Microbiol. Polonica. 1962. V. 11. №3 P. 205-221.

91. Pape H., Rehm H.-J., eds. Biotechnology. Vol. 4. Microbial Products II / Series eds. Rehm H.-J., Reed G. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft, 1986. 673pp.

92. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signalling proteins И Annu. Rev. Genet. 1992. V. 26. P. 71-112.

93. Peng H.L., Novick R.P., Kreiswirth В., Kornblum J., Schlievert P. Cloning characterization, and sequencing of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus I I J. Bacteriol. 1988. V. 170(9). P. 4365—4372.

94. Perego M. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. №16. P. 8612-8617.

95. Perombelon M.C.M., Kelman A. Ecology of the soft rot erwinias II Annu. Rev. Phytopathol. 1980. V. 18. P. 361-387.

96. Perret X., Staechelin C., Broughton W.J. Molecular basis of symbiotic promiscuity И Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 180-201.

97. Pesci E.C., Milbank J.B.J., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11229-11234.

98. Pesci E.C., Pearson J.P., SeedP.C., Iglewski B.H. Regulation of las and rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 3127-3132.

99. Pestova E. V., Havarstein L.S., Morrison D.A. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an autoinduced peptide and a two-component regulatory system H Mol. Microbiol. 1996. V. 21. № 4. P. 853-862.

100. Pfenning N., Lippert K.D. Uber das Vitamin B12 bedurfnis phototropher Schwefel bacterien// Arch. Microbiol. 1966. V. 55. P. 245-256.

101. Plaza del Pino I. M, Sanchez-Ruiz J. M. An osmolyte effect on the heat capacity change for protein folding // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 8621-8634.

102. Pontius L.T., Clewell D.B. Regulation of the pADl-encoded sex pheromone response in Enterococcus faecalis: Nucleotide sequence analysis of traA // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 1821-1827.

103. Popp F.A., Li K.H., Mei W.P., Galle M., Neurohr R. Physical aspects of biophotons // Experientia. 1988. V. 44. № 7. p. 576-585.

104. Py В., Barras F., Harris S., Robson N., Salmond G.P.C. Extracellular enzymes and their role in Erwinia virulence // Methods Microbiol. 1998. V. 27. P. 158-168.

105. QuY., Bolen C. L., Bolen D. W. Osmolyte-driven contraction of a random coil protein// Proc. Natl. Acad. Set. USA. 1998. V. 95. P. 9268-9273.

106. Quickenden T.I., Tilbury R.N. An attempt to stimulate mitosis in Saccharomuces cerevisiae with the ulltraviolet luminescence from exponential phase cultures of this yeast // Radiation Res. 1985. V. 102. P. 254-263.

107. RaffM. Cell suicide for beginners // Nature. 1998. V. 396. P. 119-122.

108. Rahn O. Invisible radiations of organisms. Berlin: Gebruder Borntaeger, 1936.

109. Rahn O. Uber den Einfluss der Stoffwechselprodukte auf das Wachstum der Bacterien. // Zbl. Bakteriol. Parasitenk. 1906. B. 16. S. 417-429.

110. Raina J., Ravin A. Switches in macromolecular synthesis during induction of competence for transformation of Streptococcus sanguis H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. № 10. P. 6062-6066.

111. ReissingJ.L, Glasgow I.E. Mucopolysaccharide which regulates growth in NeurosporaltJ. Bacteriol. 1971. V. 106. P. 882-889.

112. Reusch R.N., Sadoff H.L. 5n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: Izolation and characterization H J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 448453.

113. Reverchon S., Bouillant M. L., Salmond G., Nasser W. Integration of the quorum-sensing system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemi II Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 14071418.

114. Rivet M.M. Investigation into the Regulation of Exoenzyme Production in Erwinia carotovora subspecies carotovora. PhD Thesis. University of Warwick. 1998.

115. Rosenbluh A., Rosenberg E. Role of autocide AMI in development of Myxococcus xanthus И J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4307-4314.

116. Rosson R.A., Nealson K.H. Autoinduction of bacterial bioluminescence in a carbon limited chemostat I I Arch. Microbiol. 1981. Bd. 129. S. 299-304.

117. Ruby E.G., Nealson K.H. Symbiotic association of Photobacterium fischeri with the marine luminous fish Monocentris japonica: a model of symbiosis based on bacterial stadies I I Biol. Bull. 1976. V. 151. P. 574-586.

118. Ruby E.G. The Euprymna scolopes Vibrio fischeri simbiosis a biomedical model for the study of bacterial colonization of ani tissue // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 1. P. 13-21.

119. Sadoff H.L. Heat resistance of spore enzymes // J. Appl. Bacteriol. 1970. V. 33. P. 130-140.

120. Salmond G.P.C., Bycroft ВЖ, Stewart C.S.A.B., Williams P. The bacterial "enigma": cracking the code of cell-cell communication // Mol. Microbiol. 1995. V. 16. №4. P. 615-624.

121. Sandermann H. Regulation of membrane enzymes by lipids // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 515. № 3. P. 209-237.

122. Santor M. M., Liu Y., Khan S. M. A., Hou L. and Bolen D. W. Increased thermal stability of proteins in the presence of naturally occurring osmolytes. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5278-5283.

123. Shadel G.S., Baldwin Т.О. The Vibrio fischeri LuxR protein is capable of bidirectional stimulation of transcription and both positive and negative regulation of the luxR gene II J. Bacterial. 1991. V. 173. P. 568-574.

124. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. 1995. V. 17. № 7. P. 597-607.

125. Shimkets L.J. Social developmental biology of the myxobacteria // Microbiol. Rev. 1990. V. 54. P. 473-501.

126. Shimkets L.J., Dworkin M. Excreted adenosine is a cell-density signal for the initiation of fruiting body formation in Myxococcus xanthus H Devel. Biol. 1981. V. 84. P. 51-60.

127. Shub A.B. Bacterial altruism? // Curr. Biol. 1994. V. 4. № 6. P. 555-556.

128. Solomon J.M., Grossman A.D. Who's competent and when: regulation of natural genetic competence in bacteria I I Trends Genet. 1996. T. 12. № 1. P. 150-155.

129. Solomon J.M., Magnuson R., Srivastava A., Grossman A.D. Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis I I Gene Dev. 1995. V. 9. P. 547-558.

130. Sorokin D.Yu., Bonciu H., Van Loosdrecht M, Kuenen J.G. Growth physiology and competitive interaction of obligately chemolithoautotrophic, haloalkaliphilic, sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes I I Extremophiles. 2003. {in press).

131. Sorokin D.Yu., Robertson L.A., Kuenen J.G. Isolation and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulphur-oxidizing bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. 20006. V. 77. P. 251-260.

132. Stephens K. Pheromones among prokaryotes // CRC Grit. Rev. Microbiol. 1986. V. 13. №4., P. 308-344.

133. Stok J.B., Ninfa A.J., Stosk A.N. Protein phosphorilation and regulation of adaptive responses in bacteria II Microbial. Rev. 1989. V. 53. № 4. P. 450-490.

134. Sussman A.S., Southit H.A. Dormancy in microbial spores // Annu. Rev. Plant. Physiol. 1973. V. 24. P. 311-315.

135. Swartzman E., Kapoor S., Graham A.F., Meighen E.A. A new Vibrio fischeri lux gene precedes a bidirectional termination site for the lux operon // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 6797-6802.

136. Taddei F., Halliday J.A., Matic I., Radman M. Genetic analysis of mutagenesis in aging Escherichia coli colonies // Mol. Gen. Genet. 1997. V. 256. P. 277-281.

137. TatzeltJ., Prusiner S.B., Welch W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // EMBO J. 1996. V. 15. № 23. P. 63636373.

138. Taya Y., Tanaka Y., Nishimura S. 5'-AMP is a direct precursor of cytokinin in Dictyostelium discoideum И Nature. 1978. V. 271. P. 545-546.

139. The bacterial spore I I Eds. Gould G.W., Hurst A. London: Academic Press, 1969. P. 369-381.

140. Thomson N.R., Thomas J.D.t Salmond G.P.C. Virulence determinants in the bacterial phytopathogen Erwinia // Methods Microbiol. 1999. V. 29. P. 347426.

141. Tomasz A., Hotchkiss R. Regulation of the transformability of pneumococcal cultures by macromolecular cell products // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1964. V. 51. № 3. P. 480-486.

142. Tomasz A., Mosser J. On the nature of the pneumococcal activator substance I I Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1966. V. 55. № 1. P. 58-66.

143. Tomich P.K., An F.Y., Damle S.P., Clewell D.B. Plasmid related transmissibility and multiple drug resistance in Streptococcus faecalis subspecies zymogenes strain DS16 I I Antimicrob. Agents Chemother. 1979. V. 15. P. 828-830.

144. Traynor D., Kay R.R. The D.IF-1 signalling system in Dictyostelium -metabolism of the signal 11 J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 5291-5297.

145. Varon M, Teitz A., Rosenberg E. Myxococcus xanthus autocide AMI I I J. Bacteriol. 1986. V. 167. P. 356-361.

146. Velicer G., Kroos L.t Lenski R.E. Developmental cheating in the social bacterium Myxococcus xanthus H Nature. 2000. V. 404. C. 598-601.

147. Vijayakumar M.N., Morrison D.A. Localization of competence-induces proteins in Streptococcus pneumoniae II J. Bacteriol. 1986. V. 165. № 2. P. 689-695.

148. Vining L.C. Secondary metabolites II Annu.Rev. Microbiol. 1990. V. 44. P. 395-427.

149. Visick K.L., McFall-Ngai M.J. An exclusive contrast specificity in the Vibrio fischeri Euprymna scolopes partnerst. I I J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1779-1787.

150. Wainwright M. Microbiology's "misterious raysn 11SGM Quarterly. 1994. Febr. 3-5.

151. Wainwright M., Killham K., Russell C.t GravstonJ. Partial evidence for the existence of mitogenetic radiation II Microbiology. 1997. V. 143. № 1. P. 1-3.

152. Wang N., Soderbom F., Anjard C„ Shaulsky G., Loom is W.F. SDF-2 induction of terminal differentiation in Dictyostelium discoideum is mediated by the membrane-spanning sensor kinase DhkA // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 4750-4756.

153. Ween O., Gaustad P., Havarstein L.S. Identification of DNA binding sites for ComE, a key regulator of natural competence in Streptococcus pneumoniae И Mol. Microbiol. 1999. V. 33. №4. P. 817-827.

154. Whitehead N.A., Barnard A.M.L., Slater H., Simpson N.J.L., Salmond G.P.S. Quorym-sensing in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 365-404.

155. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 13904-13909.

156. Wiggins P. M. Role of water in some biological processes I I Microbiol. Rev. 1990. V.54.P. 432-449.

157. Will D., Wu S.S., Kaiser D. Contact stimulation of Tgll and type IV pili in Myxococcus xanthus И J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 3. P. 759-761.

158. Wireman, J. W., Dworkin M. Developmentally induced autolysis during fruiting body formation by Myxococcus xanthus. II J. Bacteriol. 1977. V. 129. P. 798-802.

159. Wirth R., Friesenegger A., Horaud T. Identification of newsex pheromone plasmids in Enterococcus faecalis I I Mol. Gen. Genet. 1992. V. 233. P. 157— 160.

160. Wirth R., Muschall A., Wanner G. The role of pheromones in bacterial interactions 11 Trends Microbiol. 1996. V. 4. №. 3. P. 96-103.

161. Yagi Y., Kessler R.E., Shaw J.H., Lopatin D.E., An F, Clewell D.B. Plasmid content of Streptococcus faecalis strain 39-5 and identification of a pheromone (cPDl)-induced surface antigen И J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. P. 12071215.

162. Yarmolinsky M.B. Programmed cell death in bacterial populations // Science. 1995. V. 267. P. 836-837.

163. Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Луксшева E.B., Березин И.В. Получение и свойства микрокапсулированного а-хим отри пси на // Биохимия. 1976. Т. 41. №9. С. 1656-1661.

164. Акайзин E.G., Воскун С.Е., Панова JI.А., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза // Микробиология. 1990. Т. 59. С. 283-288.

165. Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10.С. 10-17.

166. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых преврщениях. М.: Наука, 1992. С. 125

167. Ануфриев Л.Ф. К вопросу о диссоциации в культуре В. thuringiensis var. dendrolimus в жидких и твердых средах. В кн. Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск. 1979. С. 118-121.

168. Бабский В.Г. Явление самоорганизации у бактерий на клеточном и популяционном уровнях // Нелинейные волны. Динамика и эволюция. 1989. С. 299-303.

169. Бабусенко Е. С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н. Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. Т. 60. Вып. 11. С. 2362-2373.

170. Батраков С.Г. Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашев В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тирозол — ауторегуляторный фактор dj дрожжей Saccharomyces cerevisiae Н Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 4. С. 633-638.

171. Батраков С.Г., Придачина Н.Н., Кругляк Е.Б. и др. Необычный полиольный липид, 2-С-с1-талопиранозил-5-алкил-(С19-С21)-резорцин, из азотфиксирующей бактерии Azotobacter chroococcum tt Биоорг. химия. 1982. Т. 8. С. 980-986.

172. Билич Г.Л., Катинас Г.С., Назарова Л.В. Цитология. СПб.: Деан, 1999. 112 с.

173. Биология Bacillus brevis var G.-B. М.: Изд-во МГУ. 1968. С. 191.

174. Биохимия гормонов и гормональной регуляции. / Под. Ред. Н.А. Юдаева. М.: Наука, 1976.

175. Браупштет А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма. М.: Наука, 1987. 548 с.

176. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа, 1990. 296с.

177. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: "Мир". 1997. 624 с.

178. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е., Примакова Г.А., Барцев С.И., Кратасюк Г.А., Петушков В.Н., Межевикин В.В., Высоцкий Е.С., Заворцев В.В., Кратасюк В.А. Светящиеся бактерии. Новосибирск: Наука, 1984. 278с.

179. Головлев Е.Л. Академик Николай Дмитриевич Иерусалимский (19011967) И Микробиология. 1999а. Т. 68. № 6. С. 800-808.

180. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы И Микробиология. 19996. Т. 68. № 5. С. 623-631.

181. Головлев ЕЛ. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. № 2. С. 149-155.

182. Гордеев К.Ю., Битков В.В., Придачииа И.И., Ненашев В.А., Батраков С.Г. Бактериальные 5-н-алкил-(С19-С21)резорцины неконкурентные ингибиторы фосфолипазы Аг // Биоорг. химия. 1991. Т. 17. №10. С. 13571364.

183. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1982. С. 41-43.

184. Гурвич А.А. Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии. М.: Медицина, 1968.

185. Гурвич А.Г., Гурвич А.Д. Митогенетическое излучение: физико-химические основы и приложения в биологии и медицине. М.: Медгиз, 1945.

186. ГусевМ. В., Минеева JI.A. Микробиология. М.: МГУ, 1992. 448 с.

187. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.

188. Дуда В.И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий // Успехи микробиологии. 1982. Выпуск 17. С. 87-117.

189. Дуда В.И., Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Шорохова А.П., Мишина Г.В. Ультраструктурная организация газовых баллонов и поверхностных пленок в колониях у грамотрицательной бактерии Alcaligenes sp., пггамм d2 ИМикробиология. 1996. Т. 65. № 2. С. 222-227.

190. Блинов И.П. Основы биотехнологии. СПб.: Наука, 1995. 600 с.

191. Елинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высш. шк., 1989. 448с.

192. Завильгельский Г.К, Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 2. С. 268-277.

193. Захаров А.А. Организация сообществ у муравьев. М. Наука. 1991.

194. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. М.: Наука. 1981. 296 с.

195. Иерусалимский Н.Д. О физиологических стадиях в развитии бактерий //Микробиология. 1946. Т. 15. С. 405-416.

196. Иерусалимский Н.Д. Онтогенетическое развитие культур маслянокислых бактерий //Микробиология. 1951а. Т. 20. С. 205-216.

197. Иерусалимский Н.Д. Проблема онтогенеза бактерий и пути к ее разрешению // Тр. ИНМИ АН СССР, 19516. С. 5-43.

198. Иерусалимский Н.Д. Физиология развития чистых бактериальных культур: Дис. докт. биол. наук. М.: ИНМИ АН СССР, 1952. 787 с.

199. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. Новосибирск: Наука, 1985.

200. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабое излучение в межклеточных взаимодействиях. Новосибирск: Наука, 1981.

201. Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М.: Наука, 1977. 286 с.

202. Капрелъянц А.С., Скрыпин В.И., Эль-Регистан Г.И., Островский Д.Н., Дуда В. И. Изменение структурного состояния мембран М. lysodeikticus под влиянием препаратов ауторегуляторных факторов di // Прикл. биохим. и микробиол. 1985. Т. 21. №31. С. 378-381.

203. Кац JJ.H. Субмикроскопическая структура микроорганизмов с дефектной клеточной стенкой И Успехи микробиологии. 1980. Вып. 15. С. 180-196.

204. Киркин А.Ф. Нехимические (дистантные) взаимодействия между клетками в культуре И Биофизика. 1981. Т. 26. № 5. С. 839-843.

205. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа. 1998.

206. Кокоева М.В., Плакунов В.К. Возможность модификации осмочувствительности экстремально-галофильных архебактерий // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 5. С. 825-834.

207. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бабьева И.П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов di и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides Н Биотехнология. 1985. №3. С. 71-74.

208. Костяев В.Я. Биология и экология азотфиксирующих синезеленых водорослей. Л.: Наука, 1986. 135 с.

209. Красилъников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд-во АН СССР, 1958. 463с.

210. Кретович В.Л. Основы биохимии растений. М.: Высшая школа, 1986.

211. Кузин А.М. Вторичные биогенные излучения — лучи жизни. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997.

212. Куприянова-Ашина Ф.Г., Колпаков А.И., Луцкая А.Ю., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г. И, Дужа М.В. Действие мембранотропных физиологически активных веществ на рост культуры Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 1995. Т. 64. №5. С. 596-600.

213. Максимов В.Н., Милько Е.С., Ильиных И.А. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa И Микробиология. 1999. Т.68. С.206-210.

214. Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В.А., Швядас В.Ю., Зезин А.Б., Кабанов В. А. Фазовые превращения в растворах полиэлектролитовых комплексов как модель спорообразования // Докл. АН СССР. 1983. Т. 272. № 1. С. 230-233

215. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: "Наука", 1986. 240с.

216. Медников Б.М. Истоки альтруизма // Человек. 1995. № 6. С. 26-36.

217. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ. 1991. с.143.

218. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996а. Т. 65. №1. С. 20-25.

219. Мулюкин А.Л., Jlycma К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 19966. Т. 65. № 6. С. 782789.

220. Ненашев Е.А., Придачина Н.Н., Эль-Регистан Г.И., Золотарева И.Н., Батраков С.Г. Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крысы // Биохимия. 1994. Т. 59. Вып. 1.С. 1511-1515.

221. Николаев Ю.А. Дистантные информационные взаимодействия у бактерий И Микробиология. 2000а. Т. 69. № 5. С. 597-605.

222. Николаев ЮЛ. Регуляция адгезии у бактерий Pseudomonas jluorescens под влиянием дистантных межклеточных взаимодействий // Микробиология. 20006. Т. 69. № 3. С. 356-361.

223. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum Н Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. С. 222-227.

224. Новогрудский Д.М. Внутривидовые и межвидовые взаимоотношения почвенных микроорганизмов и некоторые вопросы бактериальных удобрений И Изв. АНКаз. ССР. 1950. С. 10-120.

225. Олескин А. В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // Микробиология. 1993. Т. 62. № 3. С.389-403.

226. Олескин А.В. Политический потенциал современной биологии // Вести. Росс. Акад. Наук. 1999. № 1. С.35-41.

227. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Кировская Т.А. Микробная эндокринология и биополитика // Вести. Моск. Ун-та. Сер. Биология. 19986. №4. С. 3-10.

228. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 309-327.

229. Олескин А.В., Кировская Т.А., Ботвинко И.В., Лысак Л.В. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов ПМикробиология. 1998а. Т. 67. № 3. С. 305-312.

230. Осипов Г.А. , Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда А. И., Капрелъянц А. С., Помазанов Т. В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. 1985. Т. 54. Вып. 2. С. 186-190.

231. Павлова И.Б., Куликовский А.В., Ботвинко И.В., Джентемирова К.М., Дроздова Т.И. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Морфология колоний бактерий // Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. 1990. № 12. С. 15-20.

232. Парийская А.А., Пухова П.С. О "факторе компетентности" у Bacillus subtilis И Микробиология. 1967. Т. 36. № 3. С. 456-463.

233. Пирт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. 331с.

234. Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос, 2001. 128 с.

235. Прозоров А. А. Трансформация у бактерий. М.: Наука, 1988. 255с.

236. Прозоров А. А. Феромоны компетентности у бактерий. // Микробиология. 2001. Т. 70 . № 1. С. 5-14.

237. Прозоров А.А. Дифференцировка клеток и ее регуляция при генетической трансформации у бактерий // Микробиология. 1997. Т. 66 . № 1. С. 5-13.

238. Прозоров А.А. Поглощение ДНК бактериальной клеткой: естественный процесс и лабораторные приемы // Генетика. 1998. Т. 34. № 5. С. 581-592.

239. Пронин С.В. Образование специфических покоящихся форм бактерий под влиянием ауторегуляторных факторов // Дисс. . канд. биол. наук, Москва, 1981. С. 154.

240. Розен В.Б. Основы эндокринологии. М. Изд-во МГУ, 1994.

241. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литотрофном росте Pseudomonas carboxydojlava Н Микробиология. 1986. Т. 55. Вып. 1. С. 5559.

242. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И. Характеристика ауторегуляторного фактора сЬ, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydojlava и Bacillus cereus И Микробиология. 1983. Т. 52. С. 33-38.

243. Сорокин Д.Ю. Биология морских гетеротрофных и алкалофильных сероокисляющих бактерий. Авт. докт. дисс. М., 2000.

244. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Каплун А.П. ФОСФОЛИПИДЫ. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсии в воде. М.: МИТХТ, 2000. 100с.

245. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Л.: Наука, 1987.

246. Филиппова С.Н., Кузнецов В.В., Бадяутдинов Д.Н., Рысков А.Н. Изучение внутрилопуляционных спонтанных морфологических вариантов Streptomyces oligocarbophilus ISPS 5589 И Микробиология. 1999. Т. 68. № 3. С. 375-382.

247. Фихте Б.А., Заичкин Э.И., Ратпер Е.Н. Новые методы физического препарирования биологических объектов для электронной микроскопии. М.: Наука, 1973.148 с.

248. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: Наука, 1988. 272с.

249. Чизмаджев Ю.А., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф. Биофизика мембран. М.: Наука, 1981. С. 207-229.

250. Шолъц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода И Методы современной биохимии. М.: Наука. 1975. С. 52-58.

251. Элъ-Регистан Г. И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов // Дисс. . докт. биол. наук, Москва, 1988. С.507.

252. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. СТАТЬИ:

253. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus И Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 811-819.

254. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И. Низкомолекулярные ауторегуляторы бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum IУ Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 308315.

255. Дорошенко Б.В., Лойко Н.Г., Мулюкин АЛ. Биоразнообразие покоящихся форм микроорганизмов // Матералы конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии". 2000. Пущино. 28 мая 2 июня. Т. 1.С. 195-196.

256. Мулюкин АЛ., Дорошенко Б.В., Лойко Н.Г., Карпекина Т.А. К вопросу о механизму анабиоза микроорганизмов // Матералы конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии". 2000. Пущино. 28 мая -2 июня. Т. 1. С. 104-105.

Информация о работе

Лойко, Наталия Геннадиевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы