Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений

Гасанова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений"

На правах рукописи

ГАСАНОВА Татьяна Владимировна

Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□31бвааь

Москва-2008

003168938

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета им МВ Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Дорохов Юрий Леонидович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Вартапетян Андрей Борисович

доктор биологических наук, профессор

Романов Георгий Александрович

Ведущая организация

Институт общей генетики РАН

Защита состоится "

2008 г. в

на заседании совета Д 501 001 76 по защите

докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского, лабораторный корпус "А", ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан "_" апреля 2008 года

кандидат биологических наук

Ученый секретарь диссертационного совета,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы широкую известность получило явление "умолкания" генов (УГ) или РНК-интерференции, которое представляет собой защитную реакцию клетки и включает в себя механизм нуклеотид-специфической регуляции транскриптома эукариот РНК-интерференция (РНКи) - это общее название процессов регуляции или подавления экспрессии генов за счет гомологичных коротких РНК размером 21-25 нт Цель УГ - поддержание стабильности транскриптома Известно, по крайней мере, три механизма УГ у растений (а) вирус-индуцируемое "умолкание" РНК, сопровождающееся образованием коротких интерферирующих РНК (siPHK), (б) "умолкание" эндогенной мРНК, связанное с образованием микроРНК (raiPHK) из генов предшественников, (в) метилирование ДНК в области промотеров и подавление транскрипции Во всех этих процессах ключевую роль играют два фермента, относящиеся к семейству РНКаз III, которые называются дайсер (DCR) и белок ARGONAUTE Дайсеры, обнаруженные в растениях, получили название DCR-like (DCL), в том числе DCL1

У растений одним из факторов УГ является псктшгметилэстераза (ПМЭ), участвующая в процессах биогенеза клеточной стенки (КС), развитии корневой системы, стебля, в росте пыльцевой трубки и созревании плодов при морфогенезе высших растений Первичная клеточная стенка растений содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин, который состоит из разветвленных цепей полигалактуроновой кислоты ПМЭ деметилирует полигалактуроновую кислоту с образованием метанола Геном растительной клетки кодирует несколько изоформ генов ПМЭ Фермент синтезируется в виде предшественника, проПМЭ Предшественник ПМЭ состоит из ферментативной (зрелой) и лидерной частей Несколько лет назад стало очевидным, что ПМЭ участвует в клеточном контроле вирусной инфекции Оказалось, что фермент взаимодействует с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) m vitro и играет роль в распространении вирусной инфекции по растению Однако, участие ПМЭ в вирусной инфекции этим не ограничивается Повышение активности ПМЭ в клеточной стенке сопровождается индукцией умолкания генов ВТМ Интенсивное разрушение вирусной РНК приводит к значительному накоплению коротких siPHK длиной 21 нт Более того, УГ, вызванное ПМЭ, распространяется и на мРНК трансгенов, что сопровождается подавлением транспорта белка DCL1 в ядро В конечном итоге это приводит к быстрому накоплению в цитоплазме miPHK Важная роль DCL1 в жизни растительной клетки подтверждена экспериментально Этот Dicer принимает участие не только в синтезе miPHK, но и в контроле уровня накопления мРНК pn-raiPHK и длинные мРНК (вирусные или клеточные) содержат шпилечные структуры, которые и служат субстратом для DCL1 Введение в клетку pn-miR171 «оттягивает на себя» DCL1 и резко увеличивает накопление вирусной РНК Поскольку ПМЭ располагается на

границе клетки, ее можно рассматривать как один из факторов, контролирующих стабильность клеточного транскриптома, который генерирует сигнал "тревоги" о вторжении в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты и индуцирует УГ

Данная работа посвящена изучению функциональных особенностей ПМЭ, ее роли в поддержании постоянного уровня клеточной транскрипции, а также в защите растения от распространения в нем чужеродной генетической информации Цели исследования.

1 Определение роли лидерной части ПМЭ в созревании белка и доставке его в клеточную стенку

2 Анализ механизма синтеза ПМЭ и его влияние на инфекцию ВТМ при использовании стабильно трансформированных растений и временной системы экспрессии

3 Изучение взаимосвязи между уровнем транскрипции гена ПМЭ и ее ферментативной активностью при стрессах, вызванных освещением, травмой листа, агроинфекцией а также введением трансгена в ядро

4 Участие ПМЭ в модификации ядерно-цитоплазматического транспорта в растениях МсоЛшпа ЪепЛатшпа

5 Изучение роли ПМЭ в поддержании стабильности растительного транскриптома Научная новизна и практическая значимость работы.

В этой работе мы исследовали механизм синтеза ПМЭ и ее влияние на инфекцию ВТМ при использовании трансгенных растений и временной системы экспрессии Показано, что ПМЭ - это мембранный белок II типа, для экспорта которого в клеточные стенки и апопласт необходим трансмембранный 24-аминокислотный (а/к) участок в лидерной части проПМЭ В стабильно трансформированных по ПМЭ растениях при заражении ВТМ происходит эффективное подавление как ближнего (межклеточного), так и дальнего (системного или по сосудистой системе растений) транспорта вирусной инфекции При анализе нескольких линий трансгенных растений установлено, что ферментативная активность ПМЭ возрастает в сравнении с контрольными растениями Повышение активности наблюдается и в растениях, несущих только Т-ДНК из бинарного вектора (контрольная Т-ДНК), экспрессирующую ген устойчивости к антибиотику Это сопровождается накоплением 51РНК в трансфецированных клетках

Показано, что транскрипционная активность гена ПМЭ возрастает при стрессовых воздействиях, таких как механическое повреждение листа, проникновение вируса или перенесения из темноты на свет В последнем случае был определен пик транскрипционной активности через 10 часов после фотоиндукции При повреждении ласта транскрипционная активность гена ПМЭ достигает максимума к 24 часам и возвращается на прежний уровень через 72-96 часов после воздействия

Для химерного белка ЗФБ СЯЛ, содержащего зеленый флуоресцирующий белок и сигнал ядерной локализации (СЯЛ), а также ядерного белка А1у, ответственного за экспорт мРНК, доказано, что ПМЭ блокирует ядерный импорт белков Это приводит к усилению супрессорного действия белка Р19 вируса карликовой кустистости томатов (TBSV) на УГ При этом, совместная экспрессия проПМЭ и р19 приводит к неожиданно высокому уровню синтеза маркерного белка ЗФБ

Практическая значимость работы заключается в развитии технологии накопления целевых белков и их доставки в клеточную стенку и апопласт с использованием свойств лидерной последовательности ПМЭ Анализ ферментативной активности ПМЭ позволяет разработать тест-систему для определения-эффективности стабильной трансформации различных видов растений

Апробация работы Диссертация была апробирована на заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ 12 февраля 200В года. Материалы работы докладывались на международных конференциях

1 7th International Congress of Plant Molecular Biology, Barcelona, June 23-28, 2003

2 II Московский Международный Конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003

3 XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», Москва, 12-15 апреля, 2004

4 XII Международная научпая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Москва, 12-15 апреля, 2005

5 XII International Congress of Molecular Plant-Microbe Interactions, Mexico, December 14-17,

2005

6 Конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика А Н Белозерского, 22 декабря, 2005

7 International Symposium "Signalling systems of plant cells role in adaptation and immunity",

Kazan, 27-30 June, 2006

8 EMBO Workshop m Plant Virology Suppression and Circumvention of Host Defence by Plant

Viruses Finland, July 1-5,2006

9 IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, II-

IS мая, 2008

Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ Структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы и содержит страниц, таблиц и рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы табака

Ранее, в нашей лаборатории с помощью RT-PCR был клонирован 3'-концевой фрагмент гена пектинметилэстеразы (ПМЭ), нуклеотидная последовательность которого соответствовала зрелой части белка Мы выделили и секвенировали 12 клонов из библиотеки кДНК цветов табака Nicotiana tabacum Анализ нуклеотидной последовательности показал, что все они принадлежат к мультигенному семейству растительной ПМЭ Ген ПМЭ кодирует профермент, который состоит из двух частей ферментативной части, в которой находится активный центр и сигнальной (пре-про) последовательности, который, согласно программе SignalP (http //www cbs dtu dk/services/SignalP). заканчивается сайтом процессинга (разрезания) На N-конце проПМЭ находится гидрофобный участок размером 24 а/к (предположительно трансмембранный домен (ТМД)) Слева от ТМД находятся отрицательно заряженные аминокислоты После ТМД располагаются положительно заряженные аминокислоты Из компьютерного анализа (SOSUI) следует, что белок должен встраиваться в мембраны по так называемому второму типу, т е N-конец аминокислотной цепи находится снаружи, а С-конец внутри мембранных везикул Секреторный путь и внутриклеточный транспорт растительных белков в клеточную стенку или в вакуоли проходит через эндоплазчатический ретикулум (ЭПР) и аппарат Гольджи Заякоривание белков в мембранах ЭПР зависит от наличия N-концевой лидерной (сигнальной) последовательности Данная последовательность играет важную роль в топогенезе белков за счет их ориентации в мембранах

Использование трансгенных по ПМЭ растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке

Для изучения внутриклеточного транспорта нами были созданы трансгенные растения N tabacum var Samsun NN содержащие ген проПМЭ (полноразмерный, непроцессированный) слитый с зеленым флуоресцирующим белком (ЗФБ) (на N и С конце) и зрелый (без лидерной последовательности) ПМЭ, слитый с ЗФБ (рис 1А) С помощью флуоресцентного микроскопа в эпвдермальных клетках трансгенных растений проПМЭ ЗФБ и ЗФБ проПМЭ было показано наличие свечения ЗФБ на периферии клетки (рис 1Б) Напротив, в случае трансгенных Табаков, экспрессирующих зрелый ПМЭ, это свечение отсутствовало

Рис. 1 Накопление и распределение полноразмерной и зрелой форм ПМЭ, слитых с ЗФБ в листьях трансгенных растений КгаЬасит уаг. вашвип NN.

(А). Схемы бинарных векторов для получения трансгенных растений.

(Б). Флуоресцентная микроскопия эпидермальных клеток трансгенных растений, экспрессируюших проПМЭ:ЗФБ, ПМЭ:ЗФБ и ЗФБ:проПМЭ. Снимки сделаны на лазерном конфокальном микроскопе с фильтрами (470/40 ЬР495 525/50), пропускающими флуоресценцию ЗФБ Длина линейки равна 20мкм.

Эти данные подтверждаются и в экспериментах по бомбардменту листьев ГЛсоНапа ЬшИатгапа микрочастицами золота с ДНК соответствующих конструкций. В случае использования плазмиды проПМЭ:ЗФБ флуоресценция наблюдалась на периферии клеток, при этом в ядре она не обнаруживалась (Рис 2).

ар: проПМЗЗФБ

ше ЗФБ у|

Рис.2 Лазерная конфокальная микроскопия эпидермальных клеток КЬемИатшпа после бомбардмента конструкциями, экспрессирующими проПМЭ:ЗФБ (А) и ПМЭ:ЗФБ (Б). Длина линейки 10 и 5 мкм соответственно.

Для лучшего понимания внутриклеточного распределения ПМЭ мы провели Вестерн блот анализ нескольких клеточных фракций из трансгенных растений проПМЭ:ЗФБ, ЗФБ:проПМЭ и растений, содержащих Т-ДНК исходного вектора. Детекцию проводили с помощью антител к ЗФБ, зрелой части ПМЭ и к лидерной части ПМЭ (пре-проПМЭ) (рис. ЗА). Результаты иммуноблота с использованием антител к ЗФБ показывают наличие белков 90кДа и бОкДа во фракциях Р! (1000>^) и РЗО (30,000>^). Зона в 90кДа соответствует белку проПМЭ, слитому с ЗФБ. Зона белка размером бОкДа совпадает с молекулярной массой зрелого белка ПМЭ:ЗФБ (33+27кДа) без процессированной в предполагаемом сайте (RRLL-QSS) пре-про последовательности в 25кДа. Во фракции, обогащенной клеточными стенками (КС), для проПМЭ.ЗФБ основным является белок с молекулярной массой бОкДа, что соответствует зрелой форме ПМЭ:ЗФБ. С другой стороны, иммуноблот двух линий трансгенных растений ЗФБ-.проПМЭ выявил также одну полосу в 43кДа, которая меньше, чем зона ЗФБ:пре-проПМЭ с предполагаемой молекулярной массой (27+25кДа). Возможно, это связано с активацией внутреннего сайта разрезания в сигнальной части ПМЭ (Рис ЗБ). Результаты Вестерн блот анализа с использованием антител к лидерной части ПМЭ, показали для обоих видов трансгенных растений (проПМЭ:ЗФБ и ЗФБ:проПМЭ) диффузные области, которые, по- 1 видимому, соответствуют продуктам деградации лидерной части ПМЭ (Рис ЗВ). Использование антител к зрелой части ПМЭ позволило выявить двойную полосу размером 34кДа, соответствующую зрелой форме ПМЭ. Такие полосы, скорее всего, представляют собой 1 изоформы одного и того же белка.

Таким образом, оба вида химерных белков (проПМЭ:ЗФБ и ЗФБ:проПМЭ) ведут себя как мембранные белки II типа и способны доставлять ЗФБ в клеточную стенку.

Клет(инйв сгаиги (КС)

Ьвнторныйконц&лЬ 2.проЛМЭ:3<а5

Рис. 3 Вестерн блот анализ клеточных фракций из трансгенных растений ПМЭ:ЗФБ я растений, содержащих Т-ДНК из бинарного вектора рВт19 с помощью антител к ЗФБ,

(A). Результаты Вестерн блот анализа фракций Р1 (100(^) и РЗО (ЗООООхц) из трансгенных растений и растений векторного контроля с помощью агггител к ЗФБ.

(Б). Иммуноблот фракции клеточных стенок (КС) трансгенных растений проПМЭ:ЗФБ, ЗФБ:проПМЭ и растений векторного контроля с антителами к ЗФБ.

(B). Результаты Вестерн блот анализа фракций клеточных стенок (КС) трансненных растений проПМЭ:ЗФБ. ЗФБ.проПМЭ и растений векторного контроля с помощью антител к лидерной (пре-проПМЭ) части ПМЭ.

(Г). Вестерн блот анализ фракции клеточных стенок (КС) из трансгенных растений проПМЭ:ЗФБ, ЗФБ:проПМЭ и растения векторного контроля с помощью антител к зрелой части ПМЭ. Стрелки слева показывают молекулярные массы и положение белковых маркеров.

Роль лидерной последовательности ПМЭ в процессе доставки белка в клеточную стенку

Для анализа структуры протяженной лидерной области ПМЭ и ее роли в топогенезе белка при помощи метода перекрывающегося ПЦР на основе бинарного вектора рСатЫа1300 с геном пре-проПМЭ:ЗФБ были получены две серии делеционных мутантов. Мутанты серии А содержали делеции в гидрофобной трансмембранной части ПМЭ: А1:ЗФБ с удаленными аминокислотами 17 - 23, А2:ЗФБ - с 17 по 29 а/к, АЗ:ЗФБ мутант с полностью убранным трансмембранным доменом (ТМД). Мутанты серии В имели протяженные делеции в спейсерной части лидерной последовательности ПМЭ между трансмембранньм доменом и сайтом отщепления зрелой части ПМЭ (-РвБ). В1 :ЗФБ содержит делецшо с 40 по 125 а/к, В2:ЗФБ - с 40 по 148 а/к, ВЗ:ЗФБ-с 190 по 248 а/к и В4:ЗФБ с полностью убранным спейсерным участком (Рис. 4).

I ГЦ—-Р

пмэ Пре-пролмэ ЭФ&

Рис 4 Схематическое изображение полноразмерного гена ПМЭ и серии делеционных мутантов лидерной последовательности ПМЭ, слитой с ЗФБ в С-концевой области

Через 4 дня после агроинъекции эпидермапьных клеток листьев ЫЬеМкаттапа конструкциями делеционных мутантов, с помощью лазерной конфокальной микроскопии были получены следующие результаты На рисунке 5 показано, что делеция 7 а/к у мутанта А1 ЗФБ частично ограничивает доставку ЗФБ в клеточную стенку, при этом ЗФБ обнаруживается и в ядре Сходная картина наблюдалась для мутантов А2 ЗФБ и АЗ ЗФБ, у которых доставка ЗФБ в КС также нарушена и наблюдается фл>оресценция ядра В качестве контроля листья ЫЬепЛатгапа инфильтрировали конструкцией с геном ЗФБ, который в обычных условиях локализуется в ядре и цитоплазме При экспрессии мутантов с делениями в спейсерном участке (В1 ЗФБ, В2 ЗФБ ВЗ ЗФБ и В4 ЗФБ) локализация ЗФБ в КС не менялась и была сходной с проПМЭ ЗФБ и пре-проПМЭ ЗФБ

Для изучения временного связывания лидерной части ПМЭ с ЭПР мембранами мы использовали ВгеГеМт А (ВБА), блокирующий внутриклеточный транспорт белков из аппарата Готьджи Свечение структур ЭПР наблюдалось при совместной инкубации ВРА с пре-проПМЭ ЗФБ, экспрессированной в эпидермальных клетках листьев ЫЬеЫкатшпа Эти результаты позволяют говорить о том, что по пути пре-проПМЭ в КС происходит его заякоривание в эндоплазматическом ретикулуме

Сходные результаты были получены и при совместной инкубации мутанта В4 ЗФБ с ВБА Напротив, при экспрессии мутанта А2 ЗФБ, добавление ВБА изменяло картину свечения

Вместо выраженной структурной сетки ЭПР мы наблюдали флуоресцирующие белковые агрегаты в цитоплазме.

Рис. 5 Результаты лазерной конфокальной микроскопии с фильтрами, пропускающими флуоресценцию ЗФБ. Снимки эпидермальных клеток N.benthamiana сделаны через четыре дня после инъекции культурой агробактерий, содержащих конструкции проПМЭ:ЗФБ или делеционные варианты лидерной (пре-про) части ПМЭ, слитые с ЗФБ. Демонстрация временного связывания с ЭПР с помощью BFA (Г, Ж, О).

Для подтверждения полученных данных о способности ТМД ПМЭ связываться с мембранами, мы провели следующий эксперимент. Листья N. benthamiana инокулировали культурой агробактерии, содержащей плазмиду В4.3ФБ. В процессе центрифугирования в градиенте сахарозы, были получены ¡6 фракций из клеточного сока, образующегося после фильтрации. Далее эти градиентные фракции путем Вестерн блот анализа тестировали с помощью антител к ЗФБ и белку BIP, который постоянно локализован в мембранах ЭПР. Основное количество белка В4:ЗФБ обнаруживалось с помощью антител к ЗФБ во фракциях 10 -16. При анализе тех же фракций с помощью антител к BIP, данный белок обнаруживался во фракциях 11 - 15. Было показано, что белок BIP и белок В4:ЗФБ соосаждаются при

центрифугировании в градиенте сахарозы Таким образом, можно предположить, что В4 ЗФБ связывается с мембранами ЭПР (Рис 6)

ф]мп«м свхорвмшо ГРЗДННМ

ЭОкДа ——► J 20кДа ;

Рис 6 Вестерн блот анани фракций сахарозного градиента из листьев N benthamiana, инокулированных культурой агробактерии, содержащей

плазмпду В4 ЗФБ при испо1Ьзовании антител к ЗФБ и BIP.

Полученные результаты о функционировании пре-про части ПМЭ позволяют допустить, что при агроинфичьтрации и временной экспрессии конструкций проПМЭ ЗФБ и пре-проПМЭ ЗФБ, ЗФБ накапливается в апопластном пространстве Для подтверждения этого предположения, из агроинокулированных листьев ЫЬеМкагтапа были выделены фракции апопластных и растворимых клеточных белков Вестерн блот анализ этих фракций с моноклональными антителами к ЗФБ показал, что, в случае временной эспрессии пре-проПМЭ, кроме слабой полосы с молекулярной массой 40кДа две основные полосы, соответствующие зрелой форме ЗФБ (27кДа), а также зону пре-проПМЭ ЗФБ с молекулярной массой бОкДа (ЗЗкДа+27кДа) (Рис 7А) После временной экспрессии мутантов лидерной части ПМЭ (серии А) Вестерн блот анализ также показал наличие двух основных полос с молекулярными массами 27кДа (ЗФБ) и бОкДа При инфильтрации мутанта В4 ЗФБ, у которого отсутствовал спейсерный участок между ТМД и ЗФБ, также наблюдалась полоса ожидаемого размера (31кДа)

Анализ апопластной фракции из листьев N Ьеп&атшпа, инфильтрированныхконструкцией пре-проПМЭ ЗФБ и мутантом А1 ЗФБ, показал после Вестерн блот анализа наличие полос, соответствующих зрелой форме ЗФБ с массой 27кДа Однако, анализ апопластной фракции из листьев, инфильтрированных А2 ЗФБ и АЗ ЗФБ, не выявил наличия ЗФБ В случае мутанта В4 ЗФБ после проведения иммуноблота мы снова наблюдали полосу ЗФБ (Рис 7Б)

А.

66--» ¿А. 45— ""

фатат

Рис. 7 Роль "ПОД лазерной часта ПМЭ в доставке белка в КС и апопластное пространство.

30— '^рк м* ш 20- "

растворимых

клагочих

белков

(А). Вестерн блот анализ растворимой клеточной фракции пре-проПМЭ:ЗФБ и делеционных мутантов, при использовании антител к ЗФБ.

66-

45»

(Б). Иммуноблот апопластной фракции пре-проПМЭ:ЗФБ и делеционных мутантов с антителами к ЗФБ.

Эти результаты совпадают с полученными ранее данными конфокальной микроскопии, представленными на рисунке 5. Можно утверждать, что лишь 24 а/к ТМД, а не вся лидерная часть ПМЭ, необходимы для доставки белка ПМЭ в апопластное пространство и клеточную стенку.

ПМЭ подавляет межклеточный и системный транспорт вирусной инфекции

Для изучения роли ПМЭ в антивирусной защите, мы использовали созданные ранее трансгенные растения ШаЬасит, уаг. Батзип NN. экспрессирующий ПМЭ, слитый с ЗФБ (проПМЭ:ЗФБ). Флуоресцентная микроскопия клеток эпидермиса таких трансгенных растений выявила ЗФБ в клеточных стенках, что свидетельствует о способности проПМЭ доставлять целевой белок на поверхность клетки (Рис. 8А). Мы обнаружили, что экстракт клеточных стенок трансгенного растения обладает повышенной активностью ПМЭ, выявляемой в специфическом тесте. Рисунок 8Б показывает зоны в виде концентрических кругов вокруг лунок в агаре с пектином, куда были нанесены клеточные экстракты растений. Диаметр этих кругов демонстрирует наличие ПМЭ и его активность. В отличие от контрольных растений, экстракт трансгенного по ПМЭ растения имел повышенную активность фермента. Интересно, что растения векторного контроля также проявляет заметно более высокую активность ПМЭ по сравнению с исходным растением. Растения табака с генотипом NN реагируют на инфекцию ВТМ образованием некрозов на поверхности листа в местах инокуляции суспензией вируса. Размер некрозов отражает способность вируса осуществлять транспорт по плазмодесмам. Измерения диаметра некрозов показывает заметное подавление межклеточного транспорта вируса в трансгенных по ПМЭ растениях по сравнению с растениями векторного контроля (Рис.

8В и 8Г). Это отчетливо видно на диаграмме (Рис. 8Д), где показана обратная корреляция между уровнем активностью ПМЭ и размером некрозов (Рис. 8Д).

Ч 1

□

листьях прсПМЭ:

Рис. 8. Анализ трансгенных по ПМЭ растений табака N.шbacum \аг. £а[шип NN. экспрессирующих проПМЭ, слитый с ЗФБ (ироПМЭ:ЗФБ), иа чувствительность к ВТМ.

(А). Флуоресцентная микроскопия эпидермиса листьев трансгенного табака проПМЭ:ЗФБ (размер линейки равен 40 микрон). (Б). Измерение активности ПМЭ, основанное на диффузии белка в геле. 1 - контрольное растение табака: 2 - векторный контроль; 3-трансгенный по ПМЭ табак. (В) и (Г). Фотографии листьев трансгенного табака проПМЭ:ЗФБ и исходного растения после инокуляции ВТМ. Размер линейки равен 7 мм. (Д). Диаграмма, показывающая зависимость между ферментативной активностью ПМЭ в и размером некрозов, вызванных инфекцией ВТМ. 1- векторный контроль; 2 - трансгенный табак ЗФБ.

Активность ПМЭ в клеточной стенке («катали Х1(Н > 3 4 6 6 ?

i 1 I.....I L_.l_

D -Ш

3- -

t'.

I I i I

, 2,0 1,5 1,0 0.6 Диаметр некроза в ш

На следующем этапе мы создали растения трансгенного по ПМЭ табака варианта Sarnsun nn, который, в отличие от сорта Samsun NN, может обеспечивать системное распространение инфекции ВТМ по растению.

В этих растениях измеренная активность ПМЭ была в 7 раз выше по сравнению с исходными растениями генотипа NN (Рис. 9). Следует обратить внимание на то, что, как и в предыдущей серии экспериментов, растения векторного контроля также обладали повышенной активностью ПМЭ. Мы использовали вирусный вектор на основе генома ВТМ, экспрессирующий ЗФБ (Рис, 9Б). С его помощью в реакции in vitro при использовании Т7 РНК-полимеразы получали транскрипты, которыми инокулировади листья растений. Образовавшиеся инфекционные локусы фотографировали в свете ультрафиолетовой (УФ) лампы (Рис. 9В и 9Г), измеряли и оценивали эффективность межклеточного транспорта в трансгенном по ПМЭ растении (Рис. 9Д). Снова наблюдалась обратная зависимость между активностью ПМЭ и размером локусов инфекции. Мы заключили, что повышение активности ПМЭ приводит к подавлению межклеточного транспорта.

Рис. 9. ПМЭ подавляет транспорт ВТМ по плазмодесмам в трансгенных по проПМЭ растениях табака.

(Л). Активность ПМЭ в листьях трансгенного по ПМЭ (проПМЭ) табака N.tabacltln, сорт Батзип пп. (Б). Схема транскрипционного вектора ВГМ, используемого для заражения зрансгенного табака проПМЭ. Т7 -транскрипционный промотер; вРР - зеленый флуоресцентный белок; г]ША-1|ке - 3' нетранслируемая область ВТМ; Еелки ВТМ: ЛаЯр - регатаказа, МР - транспортный белок, СР - белок оболочки.

(В) и (Г). Локусы инфекции ВТМ, видимые под ультрафиолетовым светом и развившиеся на листьях контрольного (В) и трансгенного по ПМЭ табака (Г).

(Д). Статистический анализ размеров локусов инфекции ВТМ.

В дальнейшем мы провели опыты с целью оценить влияние ПМЭ на системный транспорт вирусной инфекции по сосудистой системе зрансгенного растения. Нижние листья растений инокулировали суспензией ВТМ и регистрировали появление вируса в верхних листьях. С помощью Вестерн блот анализа белка оболочки ВТМ (СР) (Рис. 10А-В). Последующий денситометрический анализ зон на автографе показал, что в трансгенном по ПМЭ растении наблюдается существенная задержка в появлении вируса в неянокулированных листьях (Рис. ЮГ). Сходный, хотя и менее выраженный, эффект подавления системного транспорта ВТМ был отмечен также и в растениях векторного контроля, которые, как уже было показано (Рис. 9Б), имеют повышенное содержание ПМЭ.

Рис. 10. Накопление ВТМ в системных листьях N.tabacum, трансгенных по ПМЭ.

(А) - (В). Результаты Вестерн блот анализа белка оболочки ВТМ в системных листьях исходных растений (А), трансгенных по ПМЭ (В), а также растений векторного контроля рВхШ, несущего Т-ДНК pBinl9 (Б).

(Г). График накопления белка оболочки ВТМ, который получен на основании денситометр™ иммуноблотов (А) - (В).

Цифрами обозначены дни после заражения нижних листьев.

Мы заключили, что ПМЭ подавляет не только межклеточный, но и системный транспорт

ВТМ.

Экспрессия чужеродных генов в растении сопровождается повышенной активностью ПМЭ.

В предыдущих сериях экспериментов растения векторного контроля всегда имели повышенную активность ПМЭ. Для правильной интерпретации этих фактов надо обратить внимание на особенности конструкции бинарной плазмиды pBinl9, которая использовалась для создания трансгенных векторов. Эта плазмида направляет синтез в растении пеомицинфосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость трансгенных растений к канамицину. Можно предположить, что экспрессия любого чужеродного гена индуцирует ПМЭ. Для проверки этой гипотезы мы тестировали имеющиеся в нашем распоряжении растения табака, экспрессирующие различные гены. Проверку проводили в сравнении с исходными растениями N.tabacum. Следует отметить, что уровень экспрессии ПМЭ зависит от размера листа и возраста растения, поэтому для анализа опытных и контрольных растений мы отбирали пробы листьев одного яруса и сходного возраста, выращенных в одинаковых условиях. В первую очередь мы тестировали трансгенный табак, экспрессирующий ген GUS. В соответствии с ожиданиями, эти растения обладали повышенной активностью ПМЭ, которая на 50-60% превышала активность ПМЭ контрольных растений. Затем мы анализировали растения табака, трансформированные геном транспортного белка ВТМ (ТБ). Эти табаки (линия 2005) были созданы в лаборатории R.Beachy и отобраны по способности обеспечивать высокий уровень

Ч 10 11 13 !5

синтеза транспортного белка ВТМ. Мы убедились, что листья растений, выращенных из семян линии 2005, действительно синтезировали большое количество ТБ ВТМ (результаты не показаны). В этих растениях активность ПМЭ превосходила значения контроля (Рис. 11 А), которым был некротический табак варианта Xanthi пс - исходный сорт для получения линии 2005. Ранее нами было показано, что ПМЭ обладает способностью связывать ТБ ВТМ in vitro, при этом ТБ подавляет активность ПМЭ. Поэтому не исключено, что истинный вклад данного трансгена в индукцию ПМЭ может быть еще выше. В качестве дополнительного контроля мы использовали растения N.benthamiana, трансгенные по ЗФБ. Семена этих растений (линия !6С) были получены из лаборатории D.Baulcombe и проявляли высокий уровень экспрессии ЗФБ. В среднем данные растения имели на 50% более высокую активность ПМЭ (Рис. 11Б). Ранее мы доказали, что повышение активности ПМЭ приводит к умолканию генов (УГ). 3 соответствии с этими данными, следует ожидать, что линия 16С может показывать более высокий уровень накопления коротких интерферирующих РНК (siPHK). Действительно, уровень содержания siPHK в таких растениях был заметно выше, чем в исходной N. benthamiana (Рис. 11В). Растения векторного контроля также имели достаточно высокую активность ПМЭ и характеризовались более высоким уровнем накопления siPHK.

Рис. 11. Стабильная трансформация растений сопровождается повышен -ной активностью ПМЭ.

(А) и (Б). Активность ПМЭ в растениях табака, трансформированных геном транспортного белка ВТМ (линия 2005)

(A) или трансгенных по ЗФБ N.benthamiana (линия 16С) (Б).

(B). Анализ фракции siPHK, выделенной из растений линии 16С. Нижняя панель показывает рнбосомалъную РНК (рРНК) как контроль нанесения.

Исходное растение

Пиния 16С

Наконец, для подтверждения прямой корреляции между уровнем экспрессии трансгена и активностью ПМЭ мы тестировали растения томатов, трансформированных геном полигалактуроназы (ПГ) (линия РОБ), созданные в лаборатории О.Спегзоп. На этом экспериментальном материале исследовали косупрессию эндогенной и привнесенной ПГ, как частный случай УГ. В этих опытах введение дополнительных копий растительного гена полигалактуроназы приводило к подавлению накопления транскриптов как трансгена, так и

собственного растительного гена. Важно отметить, что именно на этих растениях было показано существование порогового уровня транскрипции, выше которого включается УГ. Мы исследовали линию Рвв, в которой уровень экспрессии гена полигалактуроназы был настолько высок, что вновь синтезирующиеся транскрипты ПГ интенсивно разрушались с образованием большого количества специфических з1РНК, по накоплению которых, и можно судить об уровне транскрипции гена полигалактуроназы. Нами показано, что по сравнению с растениями контрольной линии (Ас++), которая была использована для получения линии РОЗ, активность ПМЭ была выше на 50% (Рис. 12А), что связано с более высоким уровнем накопления мРНК ПМЭ (Рис. 12Б).

Контроль (Ас»»)

ЧШ рвэ

Рис. 12. Анализ активности ПМЭ (А) и уровня накопления мРНК ПМЭ (Б) в трансгенных по полигалактуронидазе томатах (линия Рвв). Нижняя панель -контроль нанесения.

Таким образом, экспрессия чужеродных генов в растении сопровождается повышенной ферментативной активностью ПМЭ.

Транскрипционная активность гена ПМЭ возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией

Стресс, сопровождающий проникновение в растение любого патогена или атаку насекомого, приводит к активизации транскрипции не менее 50 генов, включая гены антипатогенной защиты (РЫ-белки) и протеинкиназы. Среди этих генов выявлен также ген ПМЭ. Ранее мы показали, что только секретируемая и ферментативно-активная ПМЭ подавляет репродукцию ВТМ. Этот процесс сопровождается интенсивным разрушением вирусной РНК с одновременным накоплением коротких интерферирующих РНК ^РНК). Установлено, что подобное действие ПМЭ не ограничивается подавлением вирусной инфекции, но распространяется и на трансформированные растения, вызывая деградацию мРНК трансгена с одновременным накоплением специфических 31РНК.

Возникло предположение, что ПМЭ является одним из индукторов стрессового состояния клетки, очевидно, через цепочку вторичных метаболитов. Продуктами ферментативной реакции.

осуществляемой ПМЭ, являются деэтерифицированиый пектин и метанол. Для подтверждения гипотезы, что синтез ПМЭ усиливается при стрессах, было проведено несколько опытов с измерением количества ее транскрипта в различных условиях. Например, листья М.Ьеп1Ьат1апл подвергали механическому воздействию с помощью натирания листовой пластины целитом и бентонитом. Пробы отбирали через 30 минут, 1 час, 3 часа и 8 часов после инокуляции. Аналогичные временные интервалы были выбраны при заражении листьев КЬепМатгапа ВТМ Ш (Рис. 13).

Рис. 13. Влияние механического стресса на

1час Зчаса 8часов „___

К транскрипцию ПМЭ в листьях N.

ЬепЛатгапа. Нозерн блот анализ РНК,

выделенной из листьев, инокулированных

водной суспензией целлита и бентонита

(дорожки 2, 4, 6) или препаратом ВТМ

(дорожки 3,5,7). Контрольный лист

(дорожка!).

мРНК

пмэ

Нозерн блот анализ мРНК ПМЭ, при использовании специфического ПЦР-зонда к ПМЭ, показал повышение уровня транскрипции ПМЭ уже через полчаса как после инокуляции целитом, так и после заражения ВТМ.

Повышенный уровень транскрипции растительных генов в некоторых случаях может быть явно избыточным и приводить к УГ. Этот эффект также может наблюдаться и в нормальных условиях. Известно, что механический стресс, сопровождающий агроинъекцию, приводит к повышению активности ПМЭ в листе. Любое механическое воздействие на лист приводит к разрушению клеточной стенки и, возможно, высвобождению ПМЭ и ее метаболитов. Идея, что ПМЭ, по-видимому, играет важную роль в поддержании стабильности транскриптома, может получить дополнительную поддержку в опытах, выявляющих согласованную транскрипцию фотоиндуцируемого растительного гена и гена ПМЭ. Мы выбрали ядерный ген рзЬО, принадлежащий к фотосистеме II, который направляет синтез белка с молекулярной массой 33 кДа. Сигнальная последовательность белка рэЬО обеспечивает его доставку в тилакоидные мембраны хлоропластов. При переносе растений из темноты на свет транскрипция рвЬО резко возрастает. Мы предположили, что при фотоиндукции в клетках возрастает уровень экспрессии как гена рвЬО, так и гена ПМЭ. Растения N.ЬепЛапйапа выдерживали в темноте в течение 4 суток, затем переносили их на свет и отбирали пробы. Уровень экспрессии генов рзЬО и ПМЭ оценивали с помощью метода полуколичественного ЯТ-РСЯ.

время после перенос! 0 2 4 8 10 28 32 48 и» свет (часы)

Рис. 14. Определение уровня транскрипции генов рчЬО. ПМЭ и актина методом полуколичественного КТ-РСК в растениях .\.1ичи/1апиапа после выдерживания их в темноте в течение 4 суток и переносе на свет в сравнении с контрольными растениями

Результаты экспериментов (Рис. 14) показывают, что транскрипты гена рэЬО впервые выявляются через 8 часов после переноса растений на свет. В соответствии с нашими ожиданиями, к 10 часу достигается максимальный уровень транскрипции гена ПМЭ, который в последующем снижается. Количество мРНК гена актина остается на неизменном уровне. Это свидетельствует о том, что в условиях этих опытов не происходит общего повышения уровня транскрипции всего генома.

На основании полученных результатов был сделан вывод о согласованной транскрипции генов ПМЭ и рвЬО при резком переносе растений из темноты на свет,

Эффект "синергизма" при совместной агроинфильтрации кДНК генов проПМЭ и р19 ТВвУ с различными вирусными векторами

Мы исследовали влияние ПМЭ на репродукцию ВТМ. Для этой цели в листья КЬемИа/тапа вводили смесь культур агробактерий, экспрессирующих ген ПМЭ или его производные, а также вектор крВТМ:ЗФБ, у которого ген БО был заменен на ЗФБ. Ранее было показано, что экспрессия ЗФБ совпадает с уровнем накопления вируса, что позволяет оценивать влияние ПМЭ на синтез вирусных РНК. Оказалось, что ПМЭ подавляет репродукцию ВТМ в такой системе более чем в 4 раза по сравнению с контрольной инфильтрацией бинарным вектором рВш19. При совместной агроинфильтрации вирусных векторов с ПМЭ в антисмысловой ориентации (асПМЭ) или ПМЭ с мутированным активным центром (ПМЭ-БЭА), накопление ЗФБ увеличивалось. Подобное действие оказывает и ген-супрессор УГ Р19 ТВЭУ.

Нозерн блот анализ вирусных РНК при совместной агроинфильтрации крВТМ:ЗФБ и ПМЭ показал значительное снижение накопления вирусспецифических РНК. При подавлении

синтеза эндогенного ПМЭ после введения в клетки асПМЭ данный эффект снимается. Совместная экспрессия крВТМ-ЗФЕ и проПМЭ вызывает резкое увеличение количества 21 -нт коротких siPHK. В присутствии асПМЭ или PI9 количество коротких РНК уменьшается. Таким образом, экспрессия ПМЭ приводит к умолканию генов ВТМ.

При совместной агроинокуляции вирусного вектора с проПМЭ и геном-супрессором р 19 мы заметили неожиданно высокий уровень стимуляции крВТМ:ЗФБ. Репродукция вирусного вектора при инфильтрации агробактериальной смесью крВТМ:ЗФБ/р19/проПМЭ возрастала в несколько раз в сравнении с агроинфильтрацией смесью крВТМ:ЗФБ/р19 (Рис. 15).

Рис. 15. Повышение эффективности вирусного вектора крВТМ:ЗФБ при совместной экспрессии с конструкциями, содержащими проПМЭ и р19 TBSV.

(A). Свечение в эпидермальных клетках N.benthamiana на 4-й день после агроинокуляции. (Б). Количество светящихся клеток в зонах инфильтрации вирусного вектора проПМЭ и р19 TBSV.

(B). Измерение флуоресценции в зонах инфильтраций крВТМ-ЗФБ /р 19 и крВТМ-ЗФБ /р! 9/проПМЭ.

Количество светящихся эпидермальных клеток в зонах инфильтрации смесью крВТМ:ЗФБ/проПМЭ/р19 возрастало примерно в 2,5 раза по сравнению с инфильтрацией двумя культурами крВТМ:ЗФБ/р!9 (Рис.15Б). Измерения флуоресценции ЗФБ подтвердили эти результаты (Рис. 15В). Таким образом, гены, по отдельности оказывающие противоположное воздействие на вирусный вектор, в тройной системе инфильтрации приводят к эффекту "синергии".

Подобный "синергидный" эффект наблюдался и для других вирусных векторов таких как Х-вирус картофеля, содержащий ЗФБ (ХВК:ЗФБ), вирусный вектор крВТМ(1:8):ЗФБ со сдвигом рамки трансляции в гене транспортного белка и вектор крВТМ.ЗФБ-пП с интроном в гене ЗФБ (Рис. 16А-В).

—

щ-

1: —

ГТИ

// ¥

Рис. 16 Влияние совместной экспрессии проПМЭ и р19 на другие вирусные векторы

(Л). Свечение в зонах инфильтрации на 4-й день после агроинокуляции вирусным вектором крВТМ(Г5):ЗФБ/р19/проПМЭ и крВТМ(Г$):ЗФБ/р19; измерение флуоресценции в зонах инфильтрации. (Б). Агроинокуляция тройной смесью крВТМ:ЗФБт1/проГ1МЭ/р19.

(В) Свечение в зонах инфильтрации и измерения флуоресценции для смесей агробактериальных культур крВТМ^):ЗФБ/р 19/проПМЭ и крВТМ(ГБ):ЗФБ/р19.

Специфичность действия р19 при возникновении эффекта "синергизма"

Будет ли эффект "синергизма" проявляться и в случае других белков-супрессоров РТСБ? Для этого с помощью метода временной экспрессии в листья N.ЪепЛатхапа вводили агробактерии, содержащие вирусный вектор крВТМ:ЗФБ, ген проПМЭ и слитый ген Р!/НсРю из У-вируса картофеля.

кр8ТМ;ЗФ&

Рис. 17. Свечение в эпидермадьных клетках N.ЬепИтт'шпа на 4-й день после агроинфильтрации крВТМ:ЗФБ, РШсРго.

(А). Лист Н.Ьеткаппапа с флуоресценцией в зонах инфильтрации агробактериями. Состав смесей конструкций указан рядом с фотографией. (Б). Измерение флуоресценции ЗФБ, выделенного из зон инфильтрации, в условных единицах (УЕ).

На четвертый день после агроинфильтрации изучаемый эффект отсутствовал, даже наблюдалось некое снижение экспрессии ЗФБ из вирусного вектора (Рис. 17).

Влияние проПМЭ на перемещение клеточных А1у белков и ЗФБ-СЯЛ из ядра в цитоплазму

С чем же связан этот эффект? Развитие механизма умолкания генов зависит от активности ядерных факторов и их экспорта из ядра в цитоплазму. Некоторые из ключевых клеточных белков, принимающих участие в развитии УГ, обнаружены в ядре. Например, белок DCL1 имеет сигнал ядерной локализации (СЯЛ). Этот фермент принимает участие в процессинге микроРНК (ппРНК). В развитии умолкания генов также участвуют белки других типов, например HEN1 и AG04, которые также обнаруживаются в ядре. При суперэкспрессии ПМЭ наблюдается перемещение DCL1 из ядра в цитоплазму. При этом мутанты ПМЭ, такие как асПМЭ, ПМЭ-БЭА и А2ПМЭ не изменяли ядерную локализацию DCL1. Недавно было показано, что белок р19 TBSV, который является наиболее хорошо изученным супрессором умолкания генов, взаимодействует с факторами экспорта РНК из ядра в цитоплазму, такими как семейство А1у белков. Такое взаимодействие было показано в дрожжевой двугибридной системе.

Для более детального изучения механизмов действия ПМЭ. мы использовали слитый с ЗФБ ген А1у617, выделенный из N.benthamiana. Конструкции кДНК А1у белков были любезно предоставлены лабораторией S.MacFarlane. Цель эксперимента состояла в том, чтобы выяснить, не изменяется ли локализация А1у617-ЗФБ при суперэкспрессии ПМЭ.

Рис. 18. Изменение локализации ядерного белка А1у при совместной экспрессии с проПМЭ.

Снимки, сделанные на лазерном конфокальном микроскопе с фильтрами, пропускающими флуоресценцию ЗФБ, и itx сопоставление с фазово-контрастньши изображениями (А,Б,В,Г,Д,Е). Листья N.benthamiana инфильтрировали А1у-ЗФБ совместно с р19, геном ПМЭ или его производными. Длина линейки равна 20мкм. (А). Агроинфильтрация А1у-ЗФБ флуоресценция видна только в ядре. (Б). Флуоресценция Aly-ЗФБ в присутствии р!9 наблюдалась в цитоплазме. (В). В присутствии ПМЭ Aly-ЗФБ перемешается в цитоплазму. (Г). В случае Aly-ЗФБ с р19 и с ПМЭ флуоресценция обнаруживается в цитоплазме. (Д) В случае Aly-ЗФБ с асПМЭ флуоресценция обнаруживалась только в ядре. (Е). В присутствии ПМЭ-БЭА (ПМЭ396А397А) локализация Aly-ЗФБ не меняется, флуоресценция обнаруживается в ядре).

На микрофотографиях видно, что после агроинфильтрации кДНК А1у 617-ЗФБ флуоресценция обнаруживается только в ядре (Рис.18А). Напротив, совместная экспрессии А1у617 с р19 TBSV выявляет флуоресценцию А1у617-ЗФБ в цитоплазме (Рис. 18Б). При совместной агроинфильтрации с ПМЭ флуоресценция ЗФБ обнаруживалась только в цитоплазме, а в ядре свечение не наблюдалось (Рис. 18В). Мутанты ПМЭ, такие как асПМЭ (рис. 17Д), ПМЭ-БЭА (Рис. 18Е), не изменяли ядерную локализацию А1у617-ЗФБ.

Подобное действие ПМЭ оказывала и в экспериментах с использованием сигнала ядерной локализации (СЯЛ) слитого с ЗФБ. При экспрессии ЗФБ-СЯЛ флуоресценция обнаруживалась только в ядре (Рис. 19А). Однако, при совместной экспрессии ЗФБ-СЯЛ с ПМЭ свечение обнаруживалось в цитоплазме, а в ядре флуоресценция отсутствовала (Рис. 19Б).

Рис. 19. Перемещение ЗФБ-СЯЛ в цитоплазму при экспрессии полноразмерного ПМЭ.

Снимки, сделанные на лазерном конфокальном микроскопе с фильтрами, пропускающими флуоресценцию ЗФБ, и их сопоставление с фазово-контрастными изображениями (А, Б). Листья N.benthamianu инфильтрировали ЗФБ-СЯЛ в отсутствие ПМЭ и его производных или вместе с ними. (А). Флуоресценция при инфильтрации ЗФБ-СЯЛ. (Б). Свечение ЗФБ-СЯЛ в присутствии ПМЭ.

Таким образом, перемещение ядерных белков в цитоплазму при повышенной экспрессии ПМЭ может быть одним из важных моментов в понимании механизма умолкания генов в растении.

Динамика транскрипционной активности генов ПМЭ и А1у при механической иифильтрации листьев N.Ъenthamiana или агроинокуляции р19

Можно ли утверждать, что изменение ядерно-цитоплазматического транспорта связанно с повышенной экспрессией мРНК ПМЭ в клетке?

Мы провели серию опытов, в которых растения Ы.ЬепЛат1апа подвергали следующим воздействиям:

1. механическая инфильтрация буфером

2. агроинокуляция р19 ТВЭУ Из этих растений отбирали пробы во временном интервале от 0 до 72 часов после воздействия для последующего выделения тотальной РНК. Уровень экспрессии генов ПМЭ и А1у оценивали методами Нозерн блот анализа и полуколичественного КТ-РСЯ.

Результаты экспериментов (Рис.20) показывают, что количество транскрипта гена А1у незначительно увеличивается через 24 часа после агроинокуляции с дальнейшим возвращением к обычному уровню транскрипции. В случае инокуляции буфером, предельный уровень транскрипции гена ПМЭ достигается к 28 часам и в последующем снижается до прежнего значения. Для растений, агроинфильтрированных геном р19, уровень транскрипции ПМЭ существенно выше и достигает максимального значения к 24 часам с поддержанием этого уровня в течение 12 часов и дальнейшим снижением количества транскрипта. Уровень транскрипции контрольного гена актина, остается на неизменном уровне. Это свидетельствует о том, что в условиях этих экспериментов не происходит общего увеличения уровня транскрипции всего генома.

еоон ПМЭ

1200и

аюнн

150>1,

«сок

750 Й 800 260

кЩЦ

2ч 6ч 24ч 28ч...... 38ч '

№

ШЙ

Рис. 20. Определение уровня транскрипции генов А1у, ПМЭ, и актина методом полуколичественного ИТ-РСК-анализа.

(А). Уровень транскрипционной активности гена ПМЭ на 4-й день после инокуляции листьев N. ЬетИаггаапа буфером. (Б). Транскрипционная активность гена ПМЭ на 4 день после агроинфильтрации р19 ТВЭУ. (В.) Уровень транскрипционной активности гена А1у на 4-й день после инокуляции агробактериапьным буфером листьев Н.Ъепйиитапа.

жвяйж^

800н

- А1у

_1гаон ахпш

2®

К ^ ^ 24ч 28ч 36ч ?2ч

Таким образом, уровень транскрипции А1у увеличивается к 24 часам после стрессового воздействия и характеризуется менее длительным и не таким выраженным ответом на стресс, чем в случае ПМЭ.

выводы.

1 Исследован механизм синтеза ПМЭ при использовании стабильно трансформированных растений и временной системы экспрессии Показано, что ПМЭ - это мембранный белок II типа, для экспорта которого в клеточные стенки и апопласт необходим 24 а к -трансмембранный домен в лидерной части проПМЭ

2 В трансгенных растениях, при повышенной ферментативной активности ПМЭ наблюдается задержка как системного (по флоэме), так и межклеточного (по плазмодесмам) транспорта вируса

3 Анализ различных линий стабильно трансформированных растений продемонстрировал, что ферментативная активность ПМЭ возрастает независимо от последовательности трансгена Это сопровождается накоплением коротких интерферирующих 51РНК

4 Показано, что транскрипционная активность гена ПМЭ возрастает при стрессовых воздействиях, таких, как механическое повреждение листа, проникновение вируса или фотоиндукция В последнем случае был определен 10-часовой временной максимум транскрипционной активности

5 На примере химерного белка ЗФБ-СЯЛ, содержащего сигнал ядерной локализации и ядерного белка А1у, ответственного за экспорт мРНК, установлено, что ПМЭ влияет на ядерно-цитоплазматический транспорт белков

6 Уровень транскрипции гена А1у увеличивается к 24 часам после стрессового воздействия и характеризуется менее длительным и не таким выраженным ответом на стресс, чем в случае ПМЭ

7 Совместная экспрессия генов проПМЭ и р19, оказывающих противоположное воздействие на УГ, приводит к необычно высокому уровню синтеза репортерного белка ЗФБ Это приводит к усилению супрессорцого действия белка Р19 вируса карликовой кустистости томатов

8 На основании полученных результатов сделан общий вывод, что ПМЭ - один из факторов стабильности транскриптома растений

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гасанова ТВ, Скурат ЕВ, Фролова ОЮ, Семашко МА, Дорохов ЮЛ (2008) Пектинметалэстераза как фактор стабильности растительного транскриптома Молекулярная Биология, том 42, № 3, стр 1 -9

2 Dorokhov, Y L , Skurat, Е V , Frolova, О Y, Gasanova, Т V, Ivanov, Р А, Ravin N V, Skryabm К G, Makinen, К, Klimyuk V, Gleba Y Y and Atabekov, J G (2006) Role of the leader sequences in tobacco pectin methylesterase secretion FEBS Letters 580, 3329-3334

3 Dorokhov, Y L, Frolova, О Y, Skurat, E V, Ivanov, P A Gasanova, T V, ShevelevaP A, Ravin NV, Makinen, K, Klimyuk V , Skryabm К G, Gleba Y Y and Atabekov, J G (2006) A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase the enhancer of RNA silencing FEBS Letters, 580,3872-3878

4 Дорохов Ю JI, Скурат E В, Фролова О Ю , Гасанова Т В , Смирнов А А, Зверева С Д, Иванов П А, Равин Н В , Замчук Л И, Атабеков И Г (2004) Обратная зависимость между экспрессией гена пектинметилэстеразы и эффективностью репородукции тобамовируса в растениях Nicotiana benthamiana Доклады Академии Наук, том 394, №2,269-271

5 Dorokhov Y L, Ivanov Р А, Skurat Е V, Frolova О Y, Ravin N V, Zvereva S D , Gasanova T V, Makinen К, Klimyuk V , Gleba Y Y and Atabekov J G (2003) Pectin methylesterase as putative movement protein reseptor exerts negative effect on tobacco mosaic virus multiplication and movement Abstracts of 7th International Congress of Plant Molecular Biology, Barselona, June 2328 S25-5, p 360

6 Дорохов Ю Л , Скурат E В , Фролова О Ю , Иванов П А, Равин Н В , Гасанова Т В , Зверева С Д, Мякинен К М , Климюк В И, Скрябин К Г, Глеба Ю Ю , Атабеков И Г (2003) Синтез пектинметилэстеразы интерферирует с транспортом и репликацией вируса табачной мозаики II Московский Международный Конгресс "Биотехнология состояние и переспективы развития", Москва, 10-14 ноября, стр 169-170

7 Гасанова Т В (2004) Влияние пектинметилэстеразы на репликацию РНК вируса табачной мозаики и межклеточный транспорт Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", Москва, 12-15 апреля, стр 30-31

8 Гасанова Т В (2005) Изучение механизмов секреции пектинметилэстеразы в растительной клетке Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005", Москва, 12-15 апреля, стр 55

9 Dorokhov Y, Skurat E, Frolova О , Ivanov P, Ravin N, Gasanova T, Zvereva S, Makinen К, Klimyuk V, Skrjabin К, Gleba Y, and Atabekov J (2005) Transient expression of pectin methylesterase gene enhances virus-induced gene silencing XII International Congress of Molecular Plant-Microbe Interactions, Mexico, December 14-17, p 146

10 Gasanova T V,Skurat E V, Ivanov P A, Dorokhov Y L, (2006) Stress induce additional synthesis of pectin methylesterase that influences the expression of foreign genes in plants International Symposium "Signalling systems of plant cells role in adaptation and immunity", Kazan, 27-30 June, p 24

11 Ivanov PA, Skurat EV, OYu Frolova, Gasanova TV, Dorokhov YL (2006) Transient expression of pectin methylesterase increases synthesis of short RNAs and changes intracellular localization of gene silencing factor International Symposium "Signalling systems of plant cells role in adaptation and immunity", Kazan, 27-30 June, p 47

12 Gasanova T V, Skurat E V, Ivanov P A, Frolova О Yu, Makinen К M, Dorokhov Yu L , Atabekov J G (2006) Tobacco pectin methylesterase is a stress-related protein that influences the expression of foreign genes and viral systemic movement EMBO Workshop m plant Virology Suppression and Circumvention of Host Defence by Plant Viruses Finland, July 1-5, p 47

13 Ivanov PA, Frolova OYu, Skurat EV, Gasanova TV, Sheveleva A A, Makinen KM, Dorokhov Yu L , Atabekov J G (2006) Transient expression of tobacco pectin methylesterase leads to enhanced production of virus-specific short RNAs and induces relocalization of DCL1 from nucleus to the cytoplasm EMBO Workshop in plant Virology Suppression and Circumvention of Host Defence by Plant Viruses Finland, July 1-5, p 66

14 Гасанова ТВ и Дорохов ЮJI (2008) Роль пектинметилэстеразы в процессе защиты растительного транскриптома от стрессорных воздействий IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая

Подписано в печать 11 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 263 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гасанова, Татьяна Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II.1. РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПЕКТИНМЕТИЛЭСТЕРАЗЫ.

II. 1.1. Структура клеточной стенки растений.

II. 1.2. Пектины как компоненты клеточной стенки.

II. 1.3. Пектинметилэстеразы и их роль в формировании клеточной стенки.14 II. 1.4. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстераз .19 II.1.5.Взаимодействие пектинметилэстеразы с транспортным белком вируса табачной мозаики.

II.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ.

11.2.1. Открытие явления РНК- интерференции.

11.2.2. Роль коротких двухнитевых РНК в процессе умолкания генов.

11.2.3. Вирус-индуцируемое "умолкание" РНК.

П.2.4."Умолкание" эндогенной мРНК, связанное с образованием микроРНК (miPHK).

11.2.5. Метилирование в области промотеров и подавление транскрипции.

11.2.6. Дайсеры.

11.2.7. Аргонавты и эффекторный комплекс умолкания генов.

11.2.8. РНК-зависимая РНК-полимераза растений.

11.2.9. Системное умолкание генов в растениях.

11.2.10. Метилирование ДНК и участие РНК -полимеразы.

11.2.11. Вирусные супрессоры умолкания генов.

11.2.12. Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

IV. 1. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы табака.

IV.2. Использование трансгенных по пектинметилэстеразе растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке.

IV.3. Роль лидерной последовательности пектинметилэстеразы в процессе доставки белка в клеточную стенку.

IV.4. Пектинметилэстераза подавляет межклеточный и системный транспорт вирусной инфекции.

IV.5. Экспрессия чужеродных генов в растении сопровождается повышенной активностью пектинметилэстеразы.

IV.6. Транскрипционная активность гена пектинметилэстеразы возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией.

IV.7. Эффект "синергизма" при совместной агроинфильтрации кДНК генов проПМЭ и р19 TBSV с различными вирусными векторами.

IV.8. Специфичность действия р19 при возникновении эффекта синергизма".

IV.9. Влияние проПМЭ на перемещение клеточных белков из ядра в цитоплазму.

IV. 10. Динамика транскрипционной активности генов ПМЭ и А1у при механической инфильтрации листьев N. benthamiana или агроинокуляции р19.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений"

У растений одним из факторов УГ является пектинметилэстераза (ПМЭ), участвующая в процессах биогенеза клеточной стенки (КС), развитии корневой системы, стебля, роста пыльцевой трубки и созревания плодов при морфогенезе высших растений. Первичная клеточная стенка растений содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин, состоящий из разветвленных цепей полигалактуроновой кислоты. ПМЭ деметилирует полигалактуроновую кислоту с образованием метанола. Геном растительной клетки кодирует несколько изоформ ПМЭ. Фермент синтезируется в виде предшественника, проПМЭ, включаещего ферментативную (зрелую) и лидерную части. Несколько лет назад стало очевидным, что ПМЭ участвует в клеточном контроле вирусной инфекции. Данный фермент взаимодействует с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) in vitro и играет роль в распространении вирусной инфекции по растению. Однако, участие ПМЭ в вирусной инфекции этим не ограничивается. Повышение активности ПМЭ в клеточной стенке сопровождается индукцией умолкания генов ВТМ. Интенсивное разрушение вирусной РНК приводит к увеличению количества специфических коротких siPHK длиной 21 нт. Более того, УГ, вызванное ПМЭ, распространяется и на мРНК трансгенов, что сопровождается подавлением транспорта белка DCL1 в ядро. В конечном итоге это приводит к быстрому накоплению в цитоплазме miPHK. Важная роль DCL1 в жизни растительной клетки подтверждена экспериментально. Этот Dicer принимает участие не только в синтезе miPHK, но и в контроле уровня синтеза мРНК. pri-miPHK и длинные мРНК (вирусные или клеточные) содержат шпилечные структуры, которые и служат субстратом для DCL1. Введение в клетку pri-miR171 «оттягивает на себя» DCL1 и резко увеличивает накопление вирусной РНК.

Поскольку ПМЭ располагается на границе клетки, ее можно рассматривать как один из факторов, контролирующих стабильность клеточного транскриптома, который генерирует сигнал "тревоги" о вторжении в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты и индуцирует процесс умолкания генов.

II. Обзор литературы

11.1. Растительные пектинметилэстеразы 11.1.1. Структура клеточной стенки растений

Клеточная стенка является важнейшим компонентом растительной клетки. Она образует внешний "скелет" клетки, определяет её форму, обеспечивает адгезию соседних клеток (Iwai et al., 2002; Parre and Geitmann, 2005). Клеточная стенка играет важную роль в межклеточной сигнальной системе, определяет направление роста клетки и участвует в ее дифференцировке (Carpita and Gibeaut, 1993). Растения должны защищать себя не только от поедания животными и насекомыми, которых можно отпугнуть шипами, стрекательными клетками, алкалоидами или горьким вкусом, но и от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. У животных хорошо развита иммунная и лимфатическая системы, включая макрофаги, лейкоциты или антитела, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений такие системы отсутствуют и каждая отдельная клетка должна автономно содержать основной набор защитных механизмов. Клеточная стенка растений является важнейшим элементом защиты против внешних воздействий.

Содержимое растительной клетки ограничено липидной мембраной, за которой следует первичная клеточная стенка, толщиной около 1 мкм. После того, как клетка практически перестает расти и переключается на выполнение опорной функции, начинает формироваться вторичная клеточная , стенка, более толстая и жесткая (Varner and Lin, 1989). Дополнительную прочность клеточной стенке придают целлюлозные кристаллические фибриллы, уложенные в несколько параллельных слоев. Они соединяются между собой гемицеллюлозными цепочками, образуя целлюлозный каркас (Engelsen et al., 1996). Схематичное строение клеточной стенки представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Схематическое расположение основных компонентов первичной клеточной стенки (по Taiz Zeiger "Plant Physiology" 3d ch. 15 p.4).

На этом рисунке отмечены целлюлозные микрофибриллы, связанные с гем и целлюлозой (ксилоглюканами). Пектины различных классов образуют гелеобразный матрикс, а структурные белки придают дополнительную жесткость целлюлозному каркасу (Marga et al., 2005). Щеточки на схеме показывают сложные разветвленные цепи пектиновых молекул, которые могут исполнять роль рецепторов. Точками обозначены ионы которые связывают параллельные линейные участки пектиновых цепей, таким образом уплотняя гель.

Целлюлозные фибриллы могут скользить друг относительно друга при растяжении стенки, так как соединение между ними не жесткое. (Brummell and Harpster, 2001). Они располагаются в геле, образованном высокогидратированным олигосахаридным матриксом, состоящим в основном из пектина, который препятствует слипанию целлюлозных фибрилл (Thakur et al., 1997). Пектиновый гель также регулирует проницаемость клеточной стенки (Dourado et al., 2004; Nergard et al, 2005), a структурные белки необходимы для дополнительной жесткости целлюлозного каркаса (Roberts et al,, 1985). Известно, что, несмотря на свою жесткость, клеточная стенка обладает достаточной пористостью. Размер пор составляет 4 нм, и через них могут проходить различные молекулы и белки с молекулярной массой до 60 кДа (Anisimov et al., 1998).

Первичная клеточная стенка состоит, относительно собственного сухого веса, из 25% целлюлозы, 25% гемицеллюлозы, 35% пектина (с вариациями +/- 10%) и содержит от 1 до 8% структурных белков (Keller and Lamb, 1989). Содержание воды в ней составляет 78-80% (Fry, 1994). Во вторичной клеточной стенке содержание целлюлозы несколько выше, чем в первичной.

11.1.2. Пектины как компоненты клеточной стенки

Пектины - это гетерологичная группа полимеров, которые состоят из кислых Сахаров, таких как галактуроновая кислота и нейтральных Сахаров -рамнозы, галактозы и арабинозы. На рис. 2 изображена химическая формула пектина, который имеет линейные участки, состоящие из остатков полигалактуроновых кислот, связанных а-1—>4 связью, и разветвленные области, в которых к основной полигалактуроновой цепи присоединены боковые цепи, состоящие из различных Сахаров. Основными сахарами боковых цепей являются арабинаны и арабиногалактаны, которые имеют общее название рамнозил. R I

Остатки дигалактуроновой кислоты

Рис. 2. Структура пектина. Линейные участки цепи состоят из 70-100 остатков галактуроновой кислоты, соединенных a-J—>4 связью. Линейные участки разветвляются боковыми цепями, состоящими преимущественно из остатков рамнозила-R (Round et al., 2001).

Пектины - наиболее растворимый компонент клеточной стенки, легко вымываются горячей водой или хелатирующими реагентами, связывающими ионы кальция. Некоторые пектины имеют относительно простую линейную структуру, например гомогалактуронан с редкими боковыми цепями, состоящими из остатков рамнозила (Bailey et al1978). Среди пектинов наиболее распространенным являются рамногалактуронаны I типа (RG I) с длинной главной цепью, состоящей из дисахарида рамнозы и гал акту роковой кислоты, и многочисленными боковыми цепями из арабинанов, галактанов, арабиногалактанов и галактуронанов (McNeil et al, 1984). В молекуле RG I ветвистые области перемежаются с длинными линейными участками, состоящими из гомогалактуронанов (Limberg et al., 2000). Самый сложный класс пектинов RG II состоит, по меньшей мере, из 10 различных Сахаров и имеет очень разветвленную структуру, отличную от RG I. Ввиду своей сложности и непохожести на другие пектины, RG II, вероятно, выполняет какие-то сигнальные функции.

Рис. 3. Образование гидратированного геля и ионной связи между карбоксильными группами галактуроновых остатков в параллельных пектиновых цепях с участием катионов Са2+ (Taiz Zeiger "Plant Physiology " 3d ch. 15 p. 12).

Помимо электростатического взаимодействия анионов карбоксильных групп галактуронанов с катионами Са , молекулы пектина могут быть связаны ковалентно (Bednarska et al., 2005) (рис. 3).

Во время биосинтеза в аппарате Гольджи пектины частично эстерифицируются метальными, ацетильными и другими группами, при этом отрицательный заряд карбоксильной группы галактуроновой кислоты маскируется, что препятствует гелеобразованиго пектина через ионы кальция (MacDougall et al, 2001) (рис. 4).

Рис. 4. Секреция пектиновых Сахаров. Электронная микрофотография аппарата Гольджи из Micrasterias sp. Препарат был обработан антителами Jim 7, коньюгированными с золотом, которые реагируют только с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000).

Эстерифицированный пектин секретируется в клеточную стенку по актиновым микрофиламентам. Такой пектин считается химически инертным и не может вступать в метаболические реакции (MacKinnon et al, 2002; Wakabayashi et al., 2003) (рис. 5).

Рис. 5. Локализация эстерифицированного пектина. Электронная микрофотография первичной клеточной стенки Micrasterias sp. (PW). Препарат был обработан антителами Jim7, коныогированными с золотом, которые связываются с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). На фотографии видно, что после секреции эстерифицированный пектин равномерно распределяется по первичной клеточной стенке.

После попадания в клеточную стенку пектин может деметилироваться. Этот процесс проиллюстрирован на рисунке 6.

Рис. 6. Распределение деэстерифицированного пектина. На фотографии препарата первичной клеточной стенки Micrasterias (PW) видно, что пектин деметилируется на самой границе стенки (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). Препарат был обработан антителами Jim5, которые 'Узнают" только деметилированный пектин.

11.1.3. Пектинметилэстеразы и их роль в формировании клеточной стенки

Деэстерификация пектина происходит с помощью фермента пектинметилэстеразы (ПМЭ) (ЕС 3.1 Л .11), который катализирует реакцию отщепления метальной группы из гомогалактуронового эфира в клеточной стенке (рис. 7).

СООСНз

2 HjO 2 CHjOH \

СООН О

О РМЕ О он он

Рис. 7. Реакция деэстерификации дигалактуроновых сложных эфиров, катализируемая пектинметилэстеразой (McFeeters and Armstrong, 1984; Micheli, 2001).

Ферменты ПМЭ, как правило, проводят модификацию пектина в местах, распределенных случайным образом. Такая деэстерификация характерна в большей степени при атаке фитопатогенов (Shevchik and Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2003). При этом происходит протонный дрейф, приводящий к понижению рН вблизи клеточной стенки, что вызывает активацию полигалактуронидаз, как клеточных, так и фитопатогенных, которые разрушают пектиновые цепи (Arancibia and Motsenbocker, 2006). После действия полигалактуронидаз пектиновый гель становится более жидким, а клеточная стенка более проницаемой (Dobies et al., 2004), при этом образуются короткие 15-членные олигосахариды, которые активируют защитные механизмы клетки (Walker-Simmons et al, 1984) (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение защитных реакций клетки в ответ на образование 15-членных галактуроновых остатков (Birch et al., 1998).

Клеточные ПМЭ могут работать и линейным образом, последовательно отщепляя метильные группы (рис. 9). В этом случае параллельные пектиновые цепи взаимодействуют друг с другом через ионы Са , происходит загустение пектинового геля и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Marudova et al., 2004).

Цитоплазма о rt т

5 5 5)

Апопласт

ПреПро / \ пмэ

Секреция ПреПроПМЭ и пектина в клеточную стенку

Случайная деэстери фи нация а) о

Caz+ УМ пг О

ОО АвО AJ о о

Размягчение клеточной стенки

П оследовател ьная деэстерификация б)

А Л / юоооос ц

OOOOOOf

Саа+ - -. пг

ОСЮО

Са2+Саг+Саг+Са 2*

WOCKDGOj#

Саг* Са2+Са2+Са2+ Са 2* Са2+

Уплотнение клеточной стенки ф Метилированный остаток галактуроновой кислоты О" Деэстерифицированный остаток галактуроновой кислоты ПГ-полигалакгуронидаэа

Рис. 9. Две модели действия пектинметилэстераз (Capel et al., 2005).

Таким образом, пектинметилэстераза является важнейшим ферментом клеточной стенки, действие которого может локально контролировать жесткость клеточной стенки, позволяя ей растягиваться в нужном направлении и регулировать проницаемость (Baskin, 2005; Bosch et al., 2005). В зависимости от состояния клеточной стенки ПМЭ может деэстерифицировать пектин случайным образом (рис.9а), после чего деметилированные галактуроновые кислоты становятся мишенью для эндополигалактуроназ. Вследствие этого происходит разрыв пектиновых цепей и клеточная стенка размягчается (Wakabayashi et al., 2003). При деметилировании нескольких близко расположенных цепей (рис.9б) пектиновые нити взаимодействуют через ион Са2+ и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Micheli, 2001).

Фитопатогены, грибы и бактерии с помощью собственной ПМЭ стремятся проникнуть сквозь клеточную стенку, что приводит к индукции различных защитных реакций клетки (McGurl et al., 1994; Oelofse and Dubery, 1996). При этом образуется перекись водорода (Mellersh et al., 2002; Troshina et al., 2006; Wojtaszek, 1997), а также происходит индукция фитоалексинов, активация SIPK киназ, секреция каллозы в места проникновения гаусторий гриба (de Torres et al., 2006; Moscatiello et al., 2006; Ndimba et al., 2003; Truman et al., 2006) (рис. 8). В ответ на экспрессию чужеродной нуклеиновой кислоты патогенов, которые проникают через поврежденную клеточную стенку, активизируются процессы, связанные с умолканием генов или РНК-интерференцией.

11.1.4 Структурные и функциональные особенности пектинметилэстераз

В пыльцевых трубках табака было найдено 7 изоформ ПМЭ, отличающихся по подвижности в фокусирующем геле с изоэлектрическими точками от 5.5 до 7.8 (Li et al., 2002). Считается, что случайную деэстерификацию катализируют ПМЭ диапазона 5.5 - 7.0, а линейную -изоформы с pi 7.0 - 7.8. Активность ПМЭ увеличивается в присутствии дивалентных и, в еще большей степени, тривалентных катионов (Nari et al., 1991; Yoo etal., 2003).

При секвенировании генома Arabidopsis было обнаружено 67 генов, которые содержат последовательности, характерные для ПМЭ (Theologis et al., 2000). Матричные РНК этих генов кодируют ПМЭ в виде предшественника (пре-проПМЭ). Ферменты, выделенные из других видов растений, имеют схожую структуру. На рисунке 10 приведены результаты выравнивания последовательностей, а также вторичная структура ПМЭ из различных видов растений (Johansson et al, 2002).

ВА1

Рис. 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей ПМЭ из моркови, картофеля, томатов, ивы и erwinia. Коричневым цветом обозначены а/к активного центра. Желтым цветом выделены гомологичные блоки по пять а/к, а голубым - участки полной гомологии. Анализ последовательностей проводили с помощью программы Blast.

Аминокислотная последовательность пре-про участка содержит сигнальный пептид, который требуется для встраивания в эндоплазматический ретикулум (ЭР). Этот пептид состоит из N-концевых положительно заряженных аминокислот, трансмембранного домена (ТМД) и отрицательно заряженной аминокислотной последовательности. Подобная структура характерна для белков, встраивающихся в мембраны по второму типу, при этом N-конец полипептида находится в цитоплазме, а С-конец оказывается в люмене эндоплазматического ретикулума (Spiess et al., 1995) (рис. 11).

I тип II тип III тип IV тип

Рис. 11. Типы встраивания белков в ЭПР. Спиралью обозначен трансмембранный домен. Положительно заряженная область аминокислот экспонирована в цитоплазму, отрицательно заряженная последовательность а/к находится в люмене ЭПР.

Наличие у белка аминокислоткой последовательности K/HDEL позволяет предположить, что ПМЭ способна перемещаться в аппарат Гольджи, где происходит окончательное созревание белка. При секреции ПМЭ в клеточную стенку осуществляется отщепление пре-про области и в апопласте пре-проПМЭ не обнаруживается.

При анализе последовательностей различных генов ПМЭ из Arabidopsis выяснилось, что их можно разделить на две группы (Gaffe et al., 1997) (рис. 12).

Группа I I и

М-конец ТИД Q11 ЗА OT39D1WOl97Fi R22SP с-коней

Группа II

N-квнец

27,7-45,3 кДа

VIGW

RRLLQS

Q113A Q1Э501360157F R225P

С-конец

52,4-105,6 кДа ipe npo последовательное ть ПМЭ зрелая час<ь ПМЭ

17-70 иДэ 32-53,3 кДа

Рис. 12. Схематическое изображение структурных доменов двух групп ПМЭ (Pelloux et al., 2007). Нумерация аминокислот активного центра приведена для ПМЭ моркови.

Гены первой группы имеют пять-шесть интронов и короткую пре-про область или не содержат её вовсе. На N-конце обеих групп ПМЭ находятся лидерная последовательность, включающая в себя сигнал встраивания в ЭПР, после которого располагается трансмембранный домен. Данная последовательность отщепляется в сайте VIGVV. При окончательном созревании белка предшественник подвергается протеолизу по сайту RRLLQS. ПМЭ первой группы имеют структуру, похожую на ПМЭ фитопатогенов (Christgau et al., 1996; Draborg et al., 1995) и участвуют в размягчении клеточной стенки (Duvetter et al., 2006). Гены второй группы содержат только два-три интрона и длинную пре-про область. Выдвигаются различные гипотезы, зачем нужна пре-про область ПМЭ. Одна из них основана на том, что третичные структуры пре-про области и ингибитор инвертаз имеют значительное сходство (Rausch and Greiner, 2004). Следовательно, ПМЭ секретируется в клеточную стенку в неактивном состоянии, поскольку ее ферментативная часть связана со своим же ингибитором в соотношении 1:1 (Di Matteo et al., 2005). Пути секреции ПМЭ и пектинов совпадают, поэтому пре-про область, являясь cis-ингибитором ферментативной области ПМЭ, предотвращает преждевременную деэстерификацию Сахаров (Camardella et al, 2000). Известно, что большинство фитопатогенов не секретируют пектины, поэтому, возможно, их ПМЭ в большинстве случаев не имеют протяженных пре-про областей (Khanh et al., 1991). Другая гипотеза предполагает, что пре-про область может служить шапероном для правильной укладки ферментативной части белка. В наших экспериментах ПМЭ с делениями в пре-про области не обладали ферментативной активностью, поэтому можно предположить, что способы созревания ПМЭ фитопатогенов и ПМЭ растений различаются. Ферментативная часть ПМЭ имеет размер 33-53 кДа и представляет собой бочкообразную глобулу, сложенную из 29 |3-слоёв, на С-конце имеются 3 а-спирали (Рис. 13).

L Г- у*. ам> 1 ь -Z,

C-trrm

N~4rlrn

Рис. 13. Схематическое изображение 3D структуры ПМЭ моркови (Daucus carota) (Pelloux et al., 2007). Бочкообразная форма белка образована /?-слоями. На С-конце расположены а-спирали.

Такая структура характерна для многих бактериальных и растительных ферментов, гидролизующих пектины: пектинлиаз, пектатлиаз, полигалактуроназ и рамногалактуроназ (Ding et al., 2002). Вдоль молекулы фермента проходит желобок, образованный (З-слоями. Он является местом связывания субстрата - полигалактуроновой цепи (рис. 14). В средней части желобка расположены остатки ароматических аминокислот, которые связывают карбогидраты: Phe84, Tyrl39, Phel60, Tyr222, Trp227, Phe250 и Тгр252.

Рис. 14. Трехмерная модель зрелой части ПМЭ моркови (Daucus с a rota), полученная на основе рентгеноструктурного анализа.

В узкой части субстрат-связывающего желобка находится активный центр фермента. В него входят две карбогидрат-связывающие аминокислоты Asp 136 и Asp 157 и пять аминокислот активного центра: Gin 113, Gin 135, Phe 160, Arg 225 и Trp 227, которые осуществляют реакцию деметилирования (рис. 15).

Рис. 15. Реконструкция активного центра ПМЭ, взаимодействующего с метилированной галактуроновой кислотой (Johansson et al., 2002).

11.1.5. Взаимодействие ПМЭ с транспортным белком вируса табачной мозаики

Во время инфекции вирусы растений в своей транспортной форме переходят из клетки в клетку через особые контакты - плазмодесмы, перемещаясь по мезофиллу листа, пока не достигнут клеток обкладки проводящего пучка и флоэмы. Ранее считалось, что движение вирусов по сосудистой системе растения, которое называется дальним (системным) транспортом, осуществляется пассивным способом вместе с током клеточных Сахаров, которые синтезируются в процессе фотосинтеза (Leisner and Howell, 1993). В противоположность дальнему транспорту, межклеточный (ближний) транспорт осуществляется активно. Для эффективного межклеточного транспорта вирусной инфекции необходимо значительное расширение пропускной способности плазмодесм, которое осуществляется транспортными белками вирусов (Carrington et al., 1996). Вирус табачной мозаики (ВТМ) имеет один транспортный белок (ТБ), в отличие от, например, Х-вируса картофеля, которому для межклеточного транспорта необходимо четыре белка (Howard et al., 2004; Schepetilnikov et al., 2005; Tamai and Meshi, 2001). В настоящее время наиболее детально изучен транспортный белок ВТМ. Было показано, что ТБ локализуется в плазмодесмах (Atkins et al, 1991; Ding et al, 1992) и увеличивает их пропускную способность, как минимум, в десять раз (Wolf et al., 1989; Wolf et al, 1991). Кроме этого, ТБ ВТМ способен кооперативно связываться с однонитевыми нуклеиновыми кислотами (Citovsky et al, 1990; Citovsky et al, 1992; Kiselyova et al, 2001) и взаимодействовать с актином и тубулином (McLean et al, 1996; Heinlein et al, 1996). Исходя из этих данных, считается, что ТБ переносит вирусную РНК из зон репликации в соседние клетки, используя клеточный цитоскелет и модифицированные плазмодесмы (Citovsky and Zambryski, 1993; Ghoshroy et al, 1997). Dorokhov et al, (1999) и Chen et al, (2000) показали, что, помимо взаимодействия с белками цитоскелета (Heinlein et al., 1995; McLean et al, 1995) транспортный белок

ВТМ взаимодействует с белком клеточной стенки - пектинметилэстеразой in vitro (рис.16). Транспортный белок ВТМ также связывается с ПМЭ и в дрожжевой двугибридной системе, причем взаимодействуют только функционально-активные по транспорту мутанты ТБ (Chen et al., 2000).

BSA ззкм 97К * 66К

55К -42К —40К

ЗОК 21К

14.4К

Рис. 16. Результаты элюции фракции белков из клеточных стенок с аффинной по ТБ колонки. ПААГгель окрашен по Кумасси.

На рисунке 16 показаны результаты экстракции белков из клеточных стенок с помощью 1М NaCl. На третьей дорожке видна двойная полоса, которая соответствует белкам с молекулярными массами в районе ЗЗкДа. Данные белки из двойной зоны были выделены и секвенированы.

Сравнение аминокислотных последовательностей ПМЭ и пептидов из этих зон показало, что они имеют существенную гомологию между собой (Dorokhov etal., 1999).

На рисунке 17 хорошо заметно накопление ПМЭ в районе плазмодесмы (ПД). Там же локализуется ТБ ВТМ, при этом его количество намного превышает содержание ТБ в окружающей ПД клеточной стенке.

Рис. 17. Электронная микрофотография среза клеточной стенки, который был обработан антителами к ПМЭ, конъюгированными с золотом. Детекция ПМЭ в клеточной стенке мезофилла табака. V -вакуоль, PD - плазмодема, CW - клеточная стенка, CHL - хлоропласт, N -ядро, С - цитоплазма (Chen et al, 2000).

11.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гасанова, Татьяна Владимировна

VI. выводы

1. Исследован механизм синтеза ПМЭ с использованием стабильно трансформированных растений и временной системы экспрессии. Показано, что ПМЭ - это мембранный белок II типа, для экспорта которого в клеточные стенки и апопласт необходим 24 а.к.-трансмембранный домен в лидерной части проПМЭ.

2. В трансгенных растениях, при повышенной ферментативной активности ПМЭ наблюдается задержка как системного (по флоэме), так и межклеточного (по плазмодесмам) транспорта вируса.

3. Анализ различных линий стабильно трансформированных растений продемонстрировал, что ферментативная активность ПМЭ возрастает независимо от последовательности трансгена. Это сопровождается накоплением коротких интерферирующих siPHK.

4. Показано, что транскрипционная активность гена ПМЭ возрастает при стрессовых воздействиях, таких, как механическое повреждение листа, проникновение вируса, агроинокуляция или фотоиндукция. В последнем случае был определен 10-часовой временной максимум транскрипционной активности.

5. На примере химерного белка ЗФБ-СЯЛ, содержащего сигнал ядерной локализации и ядерного белка А1у, ответственного за экспорт мРНК, установлено, что ПМЭ влияет на ядерно-цитоплазматический транспорт белков.

6. Уровень транскрипции гена А1у увеличивается к 24 часам после стрессового воздействия и характеризуется менее длительным и не таким выраженным ответом на стресс, чем в случае ПМЭ.

7. Совместная экспрессия генов проПМЭ и р19, оказывающих противоположное воздействие на УГ, приводит к необычно высокому уровню синтеза репортерного белка ЗФБ из вирусного вектора. Это приводит к значительному усилению супрессорного действия белка Р19 вируса карликовой кустистости томатов.

8. На основании полученных результатов сделан общий вывод, что ПМЭ — один из факторов стабильности транскриптома растений.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность за постоянную помощь, поддержку и внимание к моей работе академику РАН И.Г.Атабекову. Также глубоко признательна за многолетнюю помощь и поддержку моему научному руководителю, профессору Ю.Л.Дорохову. Хотела бы выразить особую благодарность к.б.н. П.А.Иванову за безотказное участие в обсуждении и интерпретации результатов экспериментов и за огромную помощь в подготовке диссертации. Выражаю признательность моим коллегам к.б.н. Е.В.Скурату и О.Ю.Фроловой за непосредственное участие и помощь в проведении многих экспериментов; к.б.н. В.К.Новикову за консультации в процессе работы; к.б.н. Л.Г.Тюлькиной за критический взгляд на постановку и проведение экспериментов, а также доброжелательное отношение. Благодарна всем сотрудникам Кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова за годы общей совместной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гасанова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Allen, Е., Xie, Z., Gustafson, А. М., and Carrington, J. С. (2005). microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121(2), 207-21.

2. Anisimov, A. V., Sorokina, N. Y., and Dautova, N. R. (1998). Water diffusion in biological porous systems: a NMR approach. Magn Reson Imaging 16(5-6), 565-8.

3. Arancibia, R. A., and Motsenbocker, С. E. (2006). Pectin methylesterase activity in vivo differs from activity in vitro and enhances polygalacturonase-mediated pectin degradation in tabasco pepper. J Plant Physiol 163(5), 488-96.

4. Atkins, D., Hull, R., Wells, В., Roberts, K., Moore, P., and Beachy, R. N. . (1991). The tobacco mosaic virus 30K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. J Gen Virol 72 ( Pt 1), 209-11.

5. Bailey, R. W., Chesson, A., and Monro, J. (1978). Plant cell wall fractionation and structural analysis. Am J Clin Nutr 31(10 Suppl), S77-S81.

6. Baskin, Т. I. (2005). Anisotropic expansion of the plant cell wall. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 203-22.

7. Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431(7006), 356-63.

8. Baulcombe, D. (1996). RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants. Plant Mol Biol 32(1-2), , 79-88.

9. Baulcombe, D., Chapman, S., and Santa Cruz, S. (1995). Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J 7(6), 1045-53.

10. Baumberger, N., and Baulcombe, D. C. (2005). Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 102(33), 11928-33.

11. Bayne, E. H., Rakitina, D. V., Morozov, S. Y., and Baulcombe, D. C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J 44(3), 471-82.

12. Bednarska, E., Lenartowska, M., and Niekras, L. (2005). Localization of pectins and Ca2+ ions in unpollinated and pollinated wet (Petunia hybrida Hort.) and dry (Haemanthus albiflos L.) stigma. Folia Histochem Cytobiol 43(4), 249-59.

13. Belostotsky, D. (2004). mRNA turnover meets RNA interference. Mol Cell 16(4), 498-500.

14. Berna, A., Gafny, R., Wolf, S., Lucas, W. J., Holt, C. A., and Beachy, R. N. * (1991). The TMV movement protein: role of the C-terminal 73 amino acidsin subcellular localization and function. Virology 182(2), 682-9.

15. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409(6818), 363-6.

16. Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12(22), 8711-21.

17. Bickel K. S., Morris D. R. (2006). Silencing the transcriptome's dark matter: mechanisms for suppressing translation of intergenic transcripts. Mol Cell 5, 22(3), 309-16.

18. Birch, P. J., Avrora, A. O., Duncan, J. M., Lyon, G. P., Toth, R. L. (1999). Isolation of potato gene that are induced during an early stage of the hypersensitive response to phytophthora infestans. Mol. Plant-Microbe Interaction 4, 356-361.

19. Bollman, К. M., Aukerman, M. J., Park, M. Y., Hunter, C., Berardini, T. Z., and Poethig, R. S. (2003). HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase change and morphogenesis. Development 130(8), 1493-504.

20. Borsani, O., Zhu, J., Verslues, P. E., Sunkar, R., and Zhu, J. K. (2005). Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123(7), 1279-91.

21. Bosch, M., Cheung, A. Y., and Hepler, P. K. (2005). Pectin methylesterase, a regulator of pollen tube growth. Plant Physiol 138(3), 1334-46.

22. Bouche, N., Lauressergues, D., Gasciolli, V., and Vaucheret, H. (2006). An * antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. Embo J25(14), 3347-56.

23. Bowman, J. L. (2004). Class III HD-Zip gene regulation, the golden fleece of ARGONAUTE activity? Bioessays 26(9), 938-42.

24. Brandizzi, F. (2004). Endoplasmic reticulum export sites and Golgi bodies behave as single mobile secretory units in plant cells. Plant Cell 16(7), 1753-71.

25. Brandizzi, F., Hanton, S., DaSilva, L. L., Boevink, P., Evans, D., Oparka, K., Denecke, J., Hawes, C. (2003). ER quality control can lead to retrograde transport from the ER lumen to the cytosol and the nucleoplasm in plants. Plant J 34(3), 269-81.

26. Brodersen, P., and Voinnet, O. (2006). The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet 22(5), 268-80.

27. Brummell, D. A., and Harpster, M. H. (2001). Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants. Plant Mol Biol 47(1-2), 311-40.

28. Canizares, M. C., Taylor, К. M., and Lomonossoff, G. P. (2004). Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic , virus are required for suppression of silencing. J Gen Virol 85(Pt 11), 34315.

29. Capel, F., Nicolai, Т., Durand, D., Boulenguer, P., and Langendorff, V. . (2005). Influence of chain length and polymer concentration on the gelation of (amidated) low-methoxyl pectin induced by calcium. Biomacromolecules 6(6), 2954-60.

30. Cardon, G. H., Hohmann, S., Nettesheim, K., Saedler, H., and Huijser, P. (1997). Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3: a novel gene involved in the floral transition. Plant J 12(2), 367-77.

31. Carpita, N. C., and Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant /3(1), 1-30.

32. Carrington, J. C., Kasschau, K. D., Mahajan, S. K., and Schaad, M. C. (1996). Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell 8(10), 1669-1681.

33. Chan, S. W., Zilberman, D., Xie, Z., Johansen, L. K., Carrington, J. C., and Jacobsen, S. E. (2004). RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303(5662), 1336.

34. Chapman, S., Kavanagh, Т., and Baulcombe, D. (1992). Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J 2(4), 549-57.

35. Chen M. H., Citovsky V. (2003). Systemic movement of a tobamovirus requires host cell pectin methylesterase. Plant J 35(3), 386-92.

36. Chen, J., Li, W. X., Xie, D., Peng, J. R., and Ding, S. W. (2004). Viral virulence protein suppresses RNA silencing-mediated defense but upregulates the role of microrna in host gene expression. Plant Cell 16(5), 1302-13.

37. Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A. K., and Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBOJ 19(5), 913-20.

38. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., and Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell 60(4), 637-47.

39. Citovsky, V., Wong, M. L., Shaw, A. L., Prasad, В. V., and Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell 4(4), 397-411.

40. Citovsky, V., and Zambryski, P. (1993). Transport of nucleic acids through membrane channels: snaking through small holes. Annu Rev Microbiol 47, 167-97.

41. Cohen, Y., Gisel, A., and Zambryski, P. C. (2000). Cell-to-cell and systemic movement of recombinant green fluorescent protein-tagged turnip crinkle viruses. Virology 273(2), 258-66.

42. Cohen, Y., Qu, F., Gisel, A., Morris, T. J., and Zambryski, P. C. (2000). Nuclear localization of turnip crinkle virus movement protein p8. Virology 273(2), 276-85.

43. Deom, C.M., Wolf, S., Holt, C.A., Lucas, W.J., Beachy, R.N. (1991). ' Altered function of the tobacco mosaic virus movement protein in a hypersensitive host. Virology 180(1), 251-6.

44. Demburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line. Genes Dev 14(13), 1578-83.

45. Ding, В., Haudenshield, J. S., Hull, R. J., Wolf, S., Beachy, R. N., and Lucas, W. J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell 4(8), 915-28.

46. Ding, J. L., Hsu, J. S., Wang, M. M., and Tzen, J. T. (2002). Purification and glycosylation analysis of an acidic pectin methylesterase in jelly fig (Ficus awkeotsang) achenes. JAgric Food Chem 50(10), 2920-5.

47. Dlakic, M. (2006). DUF283 domain of Dicer proteins has a double-stranded RNA-binding fold. Bioinformatics.

48. Dobies, M., Kozak, M., and Jurga, S. (2004). Studies of gelation process investigated by fast field cycling relaxometry and dynamical rheology: the case of aqueous low methoxyl pectin solution. Solid State Nucl Magn Reson 25(1-3), 188-93.

49. Draborg, H., Kauppinen, S., Dalboge, H., and Christgau, S. (1995). Molecular cloning and expression in S. cerevisiae of two exochitinases from Trichoderma harzianum. Biochem Mol Biol Int 36(4), 781-91.

50. Dunoyer, P., Himber, C., and Voinnet, O. (2005). Dicer-like 4 is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal. Nat Genet 37(12), 135660.69.

51. Dunoyer, P., and Voinnet, O. (2005). The complex interplay between plant viruses and host RNA-silencing pathways. Curr Opin Plant Biol 8(4), 41523. '

52. Duvetter, Т., Fraeye, I., Sila, D. N., Verlent, I., Smout, C., Hendrickx, M., and Van Loey, A. (2006). Mode of de-esterification of alkaline and acidic pectin methyl esterases at different pH conditions. J Agric Food Chem 54(20), 7825-31.

53. Ebhardt, H. A., Thi, E. P., Wang, M. В., and Unrau, P. J. (2005). Extensive 3' modification of plant small RNAs is modulated by helper component-proteinase expression. Proc Natl Acad Sci USA 102(38), 13398-403.

54. Engdahl, H. M., Hjalt, Т. A., and Wagner, Е. G. (1997). A two unit antisense RNA cassette test system for silencing of target genes. Nucleic Acids Res 25(16), 3218-27.

55. Engelsen, S. В., Cros, S., Mackie, W., and Perez, S. (1996). A molecular builder for carbohydrates: application to polysaccharides and complex carbohydrates. Biopolymers 39(3), 417-33.

56. Epel, B. L., Padgett, H. S., Heinlein, M., and Beachy, R. N. (1996). Plant virus movement protein dynamics probed with a GFP-protein fusion. Gene 173(1 Spec No), 75-9.

57. Fagard, M., and Vaucheret, H. (2000). (TRANS)GENE SILENCING IN PLANTS: How Many Mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51, 167-194.

58. Finnegan, E. J., Margis, R., and Waterhouse, P. M. (2003). Posttranscriptional gene silencing is not compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE 1) mutant, a homolog of Dicer-1 from Drosophila. Curr Biol 13(3), 236-40.

59. Frenkel, C., Peters, J. S., Tieman, D. M., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1998). Pectin methylesterase regulates methanol and ethanol accumulation in ripening tomato (Lycopersicon esculentum) fruit. J Biol Chem 273(8), 4293-5.

60. Fridborg, I., Grainger, J., Page, A., Coleman, M., Findlay, K., and Angell, S.2003). TIP, a novel host factor linking callose degradation with the cell-to-cell movement of Potato virus X. Mol Plant Microbe Interact 16(2), 132-40.

61. Fry, S. C. (1994). Plant cell expansion. Unzipped by expansins. Curr Biol 4(9), 815-7.

62. Gaffe, J., Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Pectin Methylesterase Isoforms in Tomato (Lycopersicon esculentum) Tissues (Effects of Expression of a Pectin Methylesterase Antisense Gene). Plant Physiol ^ 105(1), 199-203.

63. Gaffe, J., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1997). Characterization and functional expression of a ubiquitously expressed tomato pectin methylesterase. Plant Physiol 114(4), 1547-56.

64. Gafny, R., Lapidot, M., Berna, A., Holt, C. A., Deom, С. M., and Beachy, R. N. (1992). Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology 187(2), 499-507.

65. Gao, M. J., Parkin, I., Lydiate, D., and Hannoufa, A. (2004). An auxin-responsive scarecrow-like transcriptional activator interacts with histone deacetylase. Plant Mol Biol 55(3), 417-31.

66. Gasciolli, V., Mallory, A. C., Battel, D. P., and Vaucheret, H. (2005). Partially redundant functions of Arabidopsis Dicer-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs. Curr Biol 15(16), 1494-500.

67. Gatfield, D., and Izaurralde, E. (2002). REFl/Aly and the additional exon junction complex proteins are dispensable for nuclear mRNA export. J Cell Biol 159(4), 579-88.

68. Gazzani, S., Lawrenson, Т., Woodward, C., Headon, D., and Sablowski, R.2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis. Science 306(5698), 1046-8.

69. Ghoshroy, S., Lartey, R., Sheng, J., and Citovsky, V. (1997). Transport of Proteins and Nucleic Acids through Plasmodesmata. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 27-50.

70. Gleba, Y., Klimyuk, V., and Marillonnet, S. (2005). Magnifection--a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23(17-18), 2042-8.

71. Gleba, Y., Marillonnet, S., and Klimyuk, V. (2004). Engineering viral expression vectors for plants: the 'full virus' and the 'deconstructed virus' strategies. Curr Opin Plant Biol 7(2), 182-8.

72. Goder, V., Junne, Т., Spiess, M. (2004). Sec61p contributes to signal sequence orientation according to the positive-inside rule. Mol Biol Cell 15(3), 1470-8.

73. Goder, V., Spiess, M. (2003). Molecular mechanism of signal sequence orientation in the endoplasmic reticulum. EMBO J 15, 22(14), 3645-53.

74. Goelet, P., Lomonossoff, G. P., Butler, P. J., Akam, M. E., Gait, M. J., and Karn, J. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 79(19), 5818-22.

75. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, С. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287(5462), 2494-7.

76. Guo, H. S., Fei, J. F., Xie, Q., and Chua, N. H. (2003). A chemical-regulated inducible RNAi system in plants. Plant ./34(3), 383-92.

77. Hartmann, E., Rapoport, T. A., and Lodish, H. F. (1989). Predicting the orientation of eukaryotic membrane-spanning proteins. Proc Natl Acad Sci USA 86(15), 5786-90.

78. Hartmann, E., Wiedmann, M., and Rapoport, T. (1989). A membrane component of the endoplasmic reticulum that may be essential for protein translocation. EMBO J 8(8), 2225-9.

79. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., and Beachy, R. N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science 270(5244), 1983-5.

80. Henderson, I. R., Zhang, X., Lu, C., Johnson, L., Meyers, В. C., Green, P. J., and Jacobsen, S. E. (2006). Dissecting Arabidopsis thaliana DICER functionin small RNA processing, gene silencing and DNA methylation patterning. Nat Genet 38(6), 721-5.

81. Himber, C., Dunoyer, P., Moissiard, G., Ritzenthaler, C., and Voinnet, O. (2003). Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. Embo У22(17), 4523-33.

82. Но, Т., Pallett, D., Rusholme, R., Dalmay, Т., and Wang, H. (2006). A simplified method for cloning of short interfering RNAs from Brassica juncea infected with Turnip mosaic potyvirus and Turnip crinkle carmovirus. J Virol Methods 136(1-2), 217-23.

83. Han, Y., Grierson, D. (2002). The influence of inverted repeats on the production of small antisense RNAs involved in gene silencing. Mol Genet Genomics 267(5), 629-35.

84. Han, Y., Griffiths, A., Li, H., Grierson, D. (2004). The effect of endogenous mRNA levels on co-suppression in tomato. FEBSLett 563(1-3), 123-8.

85. Huettel, В., Kanno, Т., Daxinger, L., Aufsatz, W., Matzke, A. J., and Matzke, M. (2006). Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis. EMBO J25(12), 2828-36.

86. Ivanov, P. A., Karpova, О. V., Skulachev, M. V., Tomashevskaya, O. L., Rodionova, N. P., Dorokhov Yu, L., and Atabekov, J. G. (1997). A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology 232(1), 32-43.

87. Iwai, H., Masaoka, N., Ishii, Т., and Satoh, S. (2002). A pectin glucuronyltransferase gene is essential for intercellular attachment in the plant meristem. Proc Natl Acad Sci USA 99(25), 16319-24.

88. Janowski, B. A., Huffman, К. E., Schwartz, J. C., Ram, R., Nordsell, R., Shames, D. S., Minna, J. D., and Corey, D. R. (2006). Involvement of AGO 1 and AG02 in mammalian transcriptional silencing. Nat Struct Mol Biol 13(9), 787-92.

89. Johansson, K., El-Ahmad, M., Friemann, R., Jornvall, H., Markovic, O., and Eklund, H. (2002). Crystal structure of plant pectin methylesterase. FEBS Lett 514(2-3), 243-9.

90. Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas, A., Jr., Zhu, J. K., Staskawicz, B. J., and Jin, H. (2006). A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc Natl Acad Sci USA.

91. Kavi, H. H., Fernandez, H. R., Xie, W., and Birchler, J. A. (2005). RNA silencing in Drosophila. FEBS Lett 579(26), 5940-9.

92. Keller, В., and Lamb, C. J. (1989). Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Dev 3(10), 1639-46.

93. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans. Nature 404(6775), 296-8.

94. Khanh, N. Q., Ruttkowski, E., Leidinger, K., Albrecht, H., and Gottschalk, M. (1991). Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene 106(1), 71-7.

95. Kim, J., and Kim, H. Y. (2006). Molecular characterization of a bHLH transcription factor involved in Arabidopsis abscisic acid-mediated response. Biochim Biophys Acta 1759(3-4), 191-4.

96. Kim, J. H., Choi, D, and Kende, H. (2003). The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis. Plant J36{\), 94-104.

97. Klahre, U., Crete, P., Leuenberger, S.A., Iglesias, V.A., Meins, FJ. (2002). High molecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic posttranscriptional gene silencing in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 11981-11986.

98. Kraft, E., Stone, S. L., Ma, L., Su, N., Gao, Y., Lau, O. S., Deng, X. W., and Callis, J. (2005). Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis. Plant Physiol 139(4), 1597-611.

99. Krishnamurthy, K., Heppler, M., Mitra, R., Blancaflor, E., Payton, M., Nelson, R. S., and Verchot-Lubicz, J. (2003). The Potato virus X TGBp3 protein associates with the ER network for virus cell-to-cell movement. Virology 309(1), 135-51.

100. Kubota, K., Tsuda, S., Tamai, A., and Meshi, T. (2003). Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing. J Virol 77(20), 11016-26.

101. Kurihara, Y., Takashi, Y., and Watanabe, Y. (2006). The interaction between DCL1 and HYLl is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. RNA 12(2), 206-12.

102. Kurihara, Y., and Watanabe, Y. (2004). Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions. Proc Natl Acad Sci USA 101(34), 12753-8.

103. Kwong, R. W., Bui, A. Q., Lee, H., Kwong, L. W., Fischer, R. L., Goldberg, R. В., and Harada, J. J. (2003). Leafy cotyledon 1-like defines a class of regulators essential for embryo development. Plant Cell 15(1), 5-18.

104. Lander, E. S., Linton, L. M., Birren, В., Nusbaum, C., Zody, M. S., Baldwin, J., Devon, K., Dewar, K., Doyle, M., FitzHugh, W. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921.

105. Lartey, R., Ghoshroy, S., Ho, J., and Citovsky, V. (1997). Movement and subcellular localization of a tobamovirus in Arabidopsis. Plant J 12(3), 53745.

106. Lartey, R. Т., Lane, L. C., and Melcher, U. (1994). Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch Virol 138(3-4), 287-98.

107. Lartey, R. Т., Voss, Т. C., and Melcher, U. (1995). Completion of a cDNA sequence from a tobamovirus pathogenic to crucifers. Gene 166(2), 331-2.

108. Lazo, G. R., Stein, P. A., and Ludwig, R. A. (1991). A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology (N Y) 9(10), 963-7.

109. Lecellier, С. H., Dunoyer, P., Arar, K., Lehmann-Che, J., Eyquem, S., Himber, C.3 Saib, A., and Voinnet, O. (2005). A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 308(5721), 557-60.

110. Leisner, S. M., and Howell, S. H. (1993). Long-distance movement of viruses in plants. Trends Microbiol 1(8), 314-7.

111. Li, J., Yang, Z., Yu, В., Liu, J., and Chen, X. (2005). Methylation protects miRNAs and siRNAs from a З'-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr 5zo/15(16), 1501-7.

112. Lindbo, J. A., and Dougherty, W. G. (1992). Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189(2), 725-33.

113. Lingel, A., Simon, В., Izaurralde, E., and Sattler, M. (2003). Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature 426(6965), 465-9.

114. Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X., and Ding, S. W. (2000). Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. EMBO J 19(7), 1672-80.

115. Luo, M. L., Zhou, Z., Magni, K., Christoforides, C., Rappsilber, J., Mann, M., and Reed, R. (2001). Pre-mRNA splicing and mRNA export linked by direct interactions between UAP56 and Aly. Nature 413(6856), 644-7.

116. Lutz-Meindl, U., and Brosch-Salomon, S. (2000). Cell wall secretion in the green alga micrasterias. JMicrosc 198(Pt 3), 208-17.

117. MacDougall, A. J., Rigby, N. M., Ryden, P., Tibbits, C. W., and Ring, S. G. (2001). Swelling behavior of the tomato cell wall network. Biomacromolecules 2(2), 450-5.

118. MacKinnon, I. M., Jardine, W. G., O'Kennedy, N., Renard, С. M., and Jarvis, M. C. (2002). Pectic methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. JAgric Food Chem 50(2), 342-6.

119. Macrae, I. J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A. N., Cande, W. Z., ' Adams, P. D., and Doudna, J. A. (2006). Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311(5758), 195-8.

120. Makeyev, E. V., and Bamford, D. H. (2001). Primer-independent RNA sequencing with bacteriophage phi6 RNA polymerase and chain terminators. RNA1{5\ 774-81.

121. Makeyev, E. V., and Grimes, J. M. (2004). RNA-dependent RNA polymerases of dsRNA bacteriophages. Virus Res 101(1), 45-55.

122. Mallory, A. C., Bartel, D. P., and Bartel, B. (2005). MicroRNA-directed regulation of Arabidopsis auxin response factor 17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes. Plant Cell 17(5), 1360-75.

123. Mallory, A. C., and Vaucheret, H. (2004). MicroRNAs: something important between the genes. Curr Opin Plant Biol 7(2), 120-5.

124. Marga, F., Grandbois, M., Cosgrove, D. J., and Baskin, Т. I. (2005). Cell wall extension results in the coordinate separation of parallel microfibrils: evidence from scanning electron microscopy and atomic force microscopy. Plant J 43(2), 181-90.

125. Margis, R., Fusaro, A. F., Smith, N. A., Curtin, S. J., Watson, J. M., Finnegan, E. J., and Waterhouse, P. M. (2006). The evolution and diversification of Dicers in plants. FEBS Lett 580(10), 2442-50.

126. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2005). Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat Biotechnol 23(6), 718-23.

127. Markovic, O., and Janecek, S. (2004). Pectin methylesterases: sequence-structural features and phylogenetic relationships. Carbohydr Res 339(13), 2281-95.

128. Martin, C., and Paz-Ares, J. (1997). MYB transcription factors in plants. Trends Genet 13(2), 67-73.

129. Marudova, M., MacDougall, A. J., and Ring, S. G. (2004). Pectin-chitosan interactions and gel formation. Carbohydr Res 339(11), 1933-9.

130. McFeeters, R. F., and Armstrong, S. A. (1984). Measurement of pectin methylation in plant cell walls. Anal Biochem 139(1), 212-7.

131. McGurl, В., Pearce, G., and Ryan, C. A. (1994). Polypeptide signalling for plant defence genes. Biochem Soc Symp 60, 149-54.

132. McLean, B. G., Zupan, J., and Zambryski, P. C. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cells. Plant Cell 7(12), 2101-14.

133. McNeil, M., Darvill, A. G., Fry, S. C., and Albersheim, P. (1984). Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu Rev Biochem 53, 62563.

134. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15(2), 185-97.

135. Meister, G., Landthaler, M., Peters, L., Chen, P. Y., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2005). Identification of novel argonaute-associated proteins. Curr Biol 15(23), 2149-55.

136. Mellersh, D. G., Foulds, I. V., Higgins, V. J., and Heath, M. C. (2002). H202 plays different roles in determining penetration failure in three diverse plant-fungal interactions. Plant/29(3), 257-68.

137. Micheli, F. (2001). Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important . roles in plant physiology. Trends Plant Sci 6(9), 414-9.

138. Mis, J., Ner, S. S., and Grigliatti, T. A. (2006). Identification of three histone methyltransferases in Drosophila: dG9a is a suppressor of PEV and is required for gene silencing. Mol Genet Genomics 275(6), 513-26.

139. Molnar, A., Csorba, Т., Lakatos, L., Varallyay, E., Lacomme, C., and Burgyan, J. (2005). Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly structured single-stranded viral RNAs. J Virol 79(12), 7812-8.

140. Moscatiello, R., Mariani, P., Sanders, D., and Maathuis, F. J. (2006). Transcriptional analysis of calcium-dependent and calcium-independent signalling pathways induced by oligogalacturonides. J Exp Bot 57(11), 2847-65.

141. Nakayashiki, H. (2005). RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett 579(26), 5950-7.

142. Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2(4), 279-289.

143. Nari, J., Noat, G., and Ricard, J. (1991). Pectin methylesterase, metal ions and plant cell-wall extension. Hydrolysis of pectin by plant cell-wall pectin methylesterase. Biochem J279 ( Pt 2), 343-50.

144. Ndimba, В. K., Chivasa, S., Hamilton, J. M., Simon, W. J., and Slabas, A. R. (2003). Proteomic analysis of changes in the extracellular matrix of Arabidopsis cell suspension cultures induced by fungal elicitors. Proteomics 3(6), 1047-59.

145. Nemhauser, J. L., and Chory, J. (2005). A new FronTIR in targeted protein degradation and plant development. Cell 121(7), 970-2.

146. Oelofse, D., and Dubery, I. A. (1996). Induction of defence responses in cultured tobacco cells by elicitors from Phytophthora nicotianae. Int J Biochem Cell Biol 28(3), 295-301.

147. Padgett, H. S., Epel, B. L., Kahn, T. W., Heinlein, M., Watanabe, Y., and Beachy, R. N. (1996). Distribution of tobamovirus movement protein in infected cells and implications for cell-to-cell spread of infection. Plant J 10(6), 1079-88.

148. Palauqui J.-C. and Vaucheret H. 1998. Transgenes are dispensable for the RNA degradation step of cosuppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 9675-9680.

149. Palauqui J.C., Balzergue S. 1999. Activation of systemic acquired silencing by localised introduction of DNA. Curr. Biol. 9, 59-66.

150. Parre, E., and Geitmann, A. (2005). Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta 220(4), 582-92.

151. Pfeffer, S., Dunoyer, P., Heim, F., Richards, К. E., Jonard, G., and Ziegler-Graff, V. (2002). P0 of beet Western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing. J Virol 76(13), 6815-24.

152. Pillai, R. S., Artus, C. G., and Filipowicz, W. (2004). Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. RNA 10(10), 1518-25.

153. Pirrotta, V., and Gross, D. S. (2005). Epigenetic silencing mechanisms in budding yeast and fruit fly: different paths, same destinations. Mol Cell 18(4), 395-8.

154. Preall, J. В., and Sontheimer, E. J. (2005). RNAi: RISC gets loaded. Cell 123(4), 543-5.

155. Qiu, W., Park, J. W., and Scholthof, H. B. (2002). Tombusvirus PI 9-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact 15(3), 269-80.

156. Qu, F., and Morris, T. J. (2005). Suppressors of RNA silencing encoded by plant viruses and their role in viral infections. FEBSLett 579(26), 5958-64.

157. Rausch, Т., and Greiner, S. (2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochim Biophys Acta 1696(2), 253-61.

158. Reddy, M. S., Dinkins, R. D., and Collins, G. B. (2003). Gene silencing in transgenic soybean plants transformed via particle bombardment. Plant Cell Rep 21(7), 676-83.

159. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12(4), 340-9.

160. Roberts, К., Grief, С., Hills, G. J., and Shaw, P. J. (1985). Cell wall glycoproteins: structure and function. J Cell Sci Suppl 2, 105-27.

161. Roth, В. M., Pruss, G. J., and Vance, V. B. (2004). Plant viral suppressors of RNA silencing. Virus Res 102(1), 97-108.

162. Round, A. N., Rigby, N. M., MacDougall, A. J., Ring, S. G., and Morris, V. J. (2001). Investigating the nature of branching in pectin by atomic force microscopy and carbohydrate analysis. Carbohydr Res 331(3), 337-42.

163. Sarmiento, C., Gomez, E., Meier, M., Kavanagh, T. A., and Truve, E. (2006). Cocksfoot mottle virus PI suppresses RNA silencing in Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum. Virus Res.8(3), 47-52.

164. Schauer, S. E., Jacobsen, S. E., Meinke, D. W., and Ray, A. (2002). Dicerlike 1: blind men and elephants in Arabidopsis development. Trends Plant Sci 7(11), 487-91.

165. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993a). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties. J Biol Chem 268(16), 11851-7.

166. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993b). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. J Biol Chem 268(16), 11858-67.о

167. Schiebel, W., Pelissier, Т., Riedel, L., Thalmeir, S., Schiebel, R., Kempe, D., Lottspeich, F., Sanger, H. L., and Wassenegger, M. (1998). Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10(12), 2087-101.

168. Shevchik, V. E., and Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (2003). PaeX, a second , pectin acetylesterase of Erwinia chrysanthemi 3937. J Bacteriol 185(10), 3091-100.

169. Shivprasad, S., Pogue, G. P., Lewandowski, D. J., Hidalgo, J., Donson, J., Grill, L. K., and Dawson, W. O. (1999). Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. Virology 255(2), 312-23.

170. Simon-Mateo, C., and Garcia, J. A. (2006). MicroRNA-guided processing impairs Plum pox virus replication, but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism. J'Virol 80(5), 2429-36.

171. Sleat, D. E., Gallie, D. R., Jefferson, R. A., Bevan, M. W., Turner, P. C., and Wilson, Т. M. (1987). Characterisation of the 5-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. Gene 60(2-3), 217-25.

172. Steele, N. M., McCann, M. С., and Roberts, К. (1997). Pectin Modification in Cell Walls of Ripening Tomatoes Occurs in Distinct Domains. Plant Physiol 114(1), 373-381.

173. Stephenson, M. В., and Hawes, M. C. (1994). Correlation of Pectin Methylesterase Activity in Root Caps of Pea with Root Border Cell Separation. Plant Physiol 106(2), 739-745.

174. Takeda, A., Sugiyama, K., Nagano, H., Mori, M., Kaido, M., Mise, K., Tsuda, S., and Okuno, T. (2002). Identification of a novel RNA silencing suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Lett 532(1-2), 75-9. .

175. Takeda, A., Tsukuda, M., Mizumoto, H., Okamoto, K., Kaido, M., Mise, K., and Okuno, T. (2005). A plant RNA virus suppresses RNA silencing through viral RNA replication. EMBOJ24(17), 3147-57.

176. Tamai, A., and Meshi, T. (2001). Cell-to-cell movement of Potato virus X: the role of pl2 and p8 encoded by the second and third open reading frames of the triple gene block. Mol Plant Microbe Interact 14(10), 1158-67.

177. Thakur, B. R., Singh, R. K., and Handa, A. K. (1997). Chemistry and uses of pectin—a review. Crit Rev Food Sci Nutr 37( 1), 47-73.

178. Thomas, C. L., Leh, V., Lederer, C., and Maule, A. J. (2003). Turnip crinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana. Virology 306(1), 33-41.

179. Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Reduction in Pectin Methylesterase Activity Modifies Tissue Integrity and Cation Levels in Ripening Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Fruits. Plant Physiol 106(2), 429-436.

180. Tieman, D. M., Harriman, R. W., Ramamohan, G., and Handa, A. K. (1992). An Antisense Pectin Methylesterase Gene Alters Pectin Chemistry and Soluble Solids in Tomato Fruit. Plant Cell 4(6), 667-679.

181. Timmermans, M. C., Maliga, P., Vieira, J., and Messing, J. (1990). The pFF plasmids: cassettes utilising CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. JBiotechnol 14(3-4), 333-44.

182. Truman, W., de Zabala, M. Т., and Grant, M. (2006). Type III effectors orchestrate a complex interplay between transcriptional networks to modify basal defence responses during pathogenesis and resistance. Plant J 46(1), -14-33.

183. Tyulkina, L. G., Skurat, E. V., Zvereva, A. S., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2006). Movement protein stimulates tobacco mosaic virus reproduction in infected cells. Dokl Biochem Biophys 409, 253-6.

184. Ueki, S., and Citovsky, V. (2002). The systemic movement of a tobamovirus is inhibited by a cadmium-ion-induced glycine-rich protein. Nat Cell Biol 4(7), 478-86.

185. Ueki, S., and Citovsky, V. (2005). Identification of an interactor of cadmium ion-induced glycine-rich protein involved in regulation of callose levels in plant vasculature. Proc Natl Acad Sci USA 102(34), 12089-94.

186. Uhrig, J. F., Canto, Т., Marshall, D., and MacFarlane, S. A. (2004). Relocalization of nuclear ALY proteins to the cytoplasm by the tomato bushy stunt virus P19 pathogenicity protein. Plant Physiol 135(4), 2411-23.

187. Vaistij, F. E., Jones, L., and Baulcombe, D. C. (2002). Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell 14(4), 857-67.

188. Varner, J. E., and Lin, L. S. (1989). Plant cell wall architecture. Cell 56(2), . 231-9.

189. Vaucheret, H., Mallory, A. C., and Bartel, D. P. (2006). AGOl homeostasis entails coexpression of MIR168 and AGOl and preferential stabilization of miR168 by AGOl. Mol Cell 22(1), 129-36.

190. Vaucheret, H., Nussaume, L., Palauqui, J. C., Quillere, I., and Elmayan, T. (1997). A Transcriptionally Active State Is Required for Post

191. Transcriptional Silencing (Cosuppression) of Nitrate Reductase Host Genes and Transgenes. Plant Cell 9(8), 1495-1504.

192. Vaucheret, H., Palauqui, J. C., Elmayan, Т., and Moffatt, B. (1995). Molecular and genetic analysis of nitrite reductase co-suppression in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet 248(3), 311-7.

193. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P., and Bartel, D. P. (2004). The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev 18(10), 1187-97.

194. Vazquez, F., Vaucheret, H., Rajagopalan, R., Lepers, C., Gasciolli, V., Mallory, A. C., Hilbert, J. L., Bartel, D. P., and Crete, P. (2004). Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol Cell 16(1), 69-79.

195. Vitale, A., Denecke, J. (1999). The endoplasmic reticulum-gateway of the secretory pathway. Plant Cell 11(4), 615-28.

196. Voinnet, O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17(8), 449-59.

197. Voinnet, O. (2005a). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nat Rev Genet 6(3), 206-20.

198. Voinnet, O. (2005b). Non-cell autonomous RNA silencing. FEBS Lett 579(26), 5858-71.

199. Walter, P., Johnson, A. E. (1994). Signal sequence recognition and protein targeting to the endoplasmic reticulum membrane. Annu Rev Cell Biol 10, 87-119.

200. Waring, D. A., and Kenyon, C. (1990). Selective silencing of cell communication influences anteroposterior pattern formation in C. elegans. Cell 60(1), 123-31.

201. Wassenegger, M., and Pelissier, T. (1998). A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol 37(2), 349-62.

202. Wojtaszek, P. (1997). Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem J322 ( Pt 3), 681-92.

203. Wolf, S., Deom, С. M., Beachy, R. N. and Lucas, W. G. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 246, 377-379.

204. Wolf, S., Deom, С. M., Beachy, R., Lucas, W. J. (1991). Plasmodesmatal function is probed using transgenic tobacco plants that express a virus movement protein. Plant Cell 3(6), 593-604.

205. Wright, S. I., and Gaut, B. S. (2005). Molecular population genetics and the search for adaptive evolution in plants. Mol Biol Evol 22(3), 506-19.

206. Wu, G., Kaper, J. M., and Jaspars, E. M. (1991). Replication of cucumber mosaic virus satellite RNA in vitro by an RNA-dependent RNA polymerase from virus-infected tobacco. FEBSLett 292(1-2), 213-6.

207. Xie, Z., Allen, E., Fahlgren, N., Calamar, A., Givan, S. A., and Carrington, J. C. (2005a). Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiol 138(4), 2145-54.

208. Xie, Z., Allen, E., Wilken, A., and Carrington, J. C. (2005b). Dicer-like 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 102(36), 12984-9.

209. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic andfunctional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2(5), E104.

210. Xie, Z., Kasschau, K. D., and Carrington, J. C. (2003). Negative feedback regulation of Dicer-Like 1 in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Curr Biol 13(9), 784-9.

211. Yamada, K.(2003). Emperical analysis of transcriptional activity in Arabidopsis genome. Science 302, 842-846.

212. Yamazaki, H., Tasaka, M., and Shikanai, T. (2004). PPR motifs of the nucleus-encoded factor, PGR3, function in the selective and distinct steps of chloroplast gene expression in Arabidopsis. Plant J38(1), 152-63.

213. Yan, K. S., Yan, S., Farooq, A., Han, A., Zeng, L., and Zhou, M. M. (2003). Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature 426(6965), 468-74.

214. Ye, K., and Patel, D. J. (2005). RNA silencing suppressor p21 of Beet yellows vims forms an RNA binding octameric ring structure. Structure 13(9), 1375-84.

215. Yoo, S. H., Fishman, M. L., Savary, B. J., and Hotchkiss, А. Т., Jr. (2003). Monovalent salt-induced gelation of enzymatically deesterified pectin. J Agric Food Chem 51(25), 7410-7.

216. Yu, В., Chapman, E. J., Yang, Z., Carrington, J. C., and Chen, X. (2006). Transgenically expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in Arabidopsis. FEBS Lett 580(13), 3117-20.

217. Zandueta-Criado, A., and Bock, R. (2004). Surprising features of plastid ndhD transcripts: addition of non-encoded nucleotides and polysomeassociation of mRNAs with an unedited start codon. Nucleic Acids Res 32(2), 542-50.

218. Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299(5607), 716-9.

219. Zvereva, S. D., Ivanov, P. A., Skulachev, M. V., Klyushin, A. G., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2004). Evidence for contribution of an internal ribosome entry site to intercellular transport of a tobamovirus. J Gen Virol 85(Pt 6), 1739-44.

220. Winston, W., Molodowitch, Ch., Hunter, C. (2002). Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane pretein SID-1. Science 29, 259-9.150

Информация о работе

Гасанова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы