Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов

Скурат, Евгений Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов"

На правах рукописи

СКУРЛТ Евгений Владимирович Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре вирусология биологического факультета Московского Государственного Университета им. М,В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Дорохов Юрий Леонидович

Белозерский Михаил Андреевич Копылов Алексей Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор химических наук

Ведущая организация:

Институт вирусологии Д.И.Ивановского РАМН *

Защита состоится " 2^) " ноября 2006 г. в /0 на заседании диссертационного совета Д501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В, Ломоносова.

Автореферат разослан октября 2006 года.

л.

Ученый секретарь диссертационного совета, /^¿-г? <___,

доктор биологических наук Калинина Н.О.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Умолкание генов (gene silencing), посттранскрипционное умолкание генов или РНК интерференция (RNAi) - все эти термины обозначают механизм регуляции активности генов, заключающийся в нуклеотид-специфическом контроле активности мРНК, включающем в себя вирус-индуцируемое умолкание генов (ВИУГ) и трансген-идуцируемое умолкание генов (ТИУГ). ВИУГ и ТИУГ имеют общие черты для всех эукариот. Молекулярный механизм умолкания генов включает: (а) нарезание двухнитевой РНК на короткие (21-25 нт) интерферирующие РНК, siRNA; (б) включение одной из нитей siRNA в так называемый РНК-индуцируемый комплекс умолкания, RISC, где происходит взаимодействие с мРНК-мишенью, приводящее к ее деградации или ингибированию трансляции. В настоящее время известно, по крайней мере, три уровня умолкания РНК: ВИУГ, ТИУГ и умолкание эндогенной РНК с помощью так называемых микро-РНК (miRNA), которые структурно не отличаются от siRNA. Во всех этих процессах ключевую роль играют два фермента, относящиеся к семейству РНКаз Ш, которые называются: (а) дайсер (DCR) и (б) белок ARGONAUTE. Последний из них способен разрушать мРНК-мишень в RISC. Дайсеры, найденные в растениях, получили название DCR-like (DCL). Они подразделены на 4 типа: (1) DCL1, участвующий в биогенезе miRNA; (2) DCL2, образующий siRNA из вирусных днРНК; (3) DCL3, образующий эндогенные siRNA, ответственные за модификацию хроматина; (4) DCL4, ответственный за образование ta-siRNA.

Идентификация новых клеточных факторов, участвующих в ВИУГ и ТИУГ,

расширяет наши представления об этих важных общебиологических явлениях.

Одним из таких факторов является пектинметилэстераза (ПМЭ). Этот фермент

катализирует деэстерификацию пектина и участвует в биогенезе клеточной стенки

(КС), развитии корневой системы, стебля, участвует в росте пыльцевой трубки и

созревании плодов. Однако, в последнее время становится все более очевидным,

что роль ПМЭ в жизни растения этим не ограничивается. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ табака способна взаимодействовать с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ), Полагают, что ПМЭ КС может выполнять функцию клеточного рецептора ТБ. Считают также, что ПМЭ-ТБ взаимодействие требуется для эффективного вирусного транспорта.

В данной работе проведено выделение полноразмерного гена ПМЭ табака и исследована его роль в ВИУГ и ТИУГ. Цели исследования.

1. Выделение кДНК гена табачной пектинметилэстеразы (ПМЭ) и его анализ.

2. Разработка метода транзиентной (временной) репродукции вирусов, таких

как ВТМ и Х-вирус картофеля (ХВК) при агроинфекции листьев ЩсоИапа

Ьеп&атгапа.

3. Изучение влияния ПМЭ на репродукцию ВТМ и ХВК и развитие ВИУГ.

4. Изучение роли ПМЭ в развитии ТИУГ.

5. Изучение роли ПМЭ в биогенезе гшЮЧА.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В этой работе выделена кДНК гена табачной ПМЭ, определены его структурные элементы, ответственные за функциональную активность ПМЭ, Для изучения роли ПМЭ в репродукции вирусов разработан метод транзиентной (временной) репродукции ВТМ и ХВК при агроинфекции листьев МсоНапа ЪеМЬатгапа, позволяющий изучать уровень репродукции вирусов по способности накапливать в клетках зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ). Показано, что только секретируемая и ферментативно-активная ПМЭ подавляет репродукцию ВТМ. Этот процесс сопровождается интенсивным разрушением вирусной РНК с одновременным накоплением коротких интерферирующих РНК (вПША). Аналогичный эффект ПМЭ наблюдается и при инфекции ХВК, когда его белок с молекулярной массой 25 кДа, ответственный за подавление умолкания генов, инактивирован. Установлено, что действие ПМЭ не ограничено подавлением

ВИУГ, но распространяется и на ТИУГ, вызывая интенсивное разрушение трансгенной мРНК с одновременным накоплением siRNA.

При исследовании молекулярных механизмов показано, что ПМЭ вызывает активацию ядерного фермента дайсера DCL1, ответственного за образование коротких клеточных РНК (miRNA). Показано, что в присутствии ПМЭ происходит накопление ядерного DCLl в цитоплазме клеток. Показано, что ПМЭ стимулирует пррцессинг miRNA. РНК-предшественник miRNA как субстрат DCL1, снимает ингибирующий эффект ПМЭ в репродукции вируса. Показана взаимосвязь между биогенезом miRNA и репродукцией ВТМ: оба процесса, по-видимому, конкурируют за DCL1.

Практическая значимость работы заключается в развитии системы экспрессии целевых белков с помощью вирусных векторов в условиях подавления активности ПМЭ и, следовательно, ВИУГ.

Апробация работы. Диссертация была апробированы на заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ 6 февраля 2006 года. Материалы работы докладывались на международных конференциях:

1. The XII International Congress of Virology, París, July 27-August 1,2002.

2. 7* Internationa! Congress of Plant Molecular Biology, Barselona, June 23-28, 2003.

3. II Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября, 2003.

4. Конференции, посвященной 100-летию со дня рождения выдающегося российского биолога, профессора Московского университета, академика АНДРЕЯ НИКОЛАЕВИЧА БЕЛОЗЕРСКОГО, 22 декабря 2005.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и 2 патента.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение кДНК полноразмерного гена ПМЭ. из табака (ШаЬасит) и его экспрессия в экспериментах по агроинфилырации листьев бентамнаны (М ЬеШкатгапа),

Ранее, в нашей лаборатории с помощью КТ-РСЯ анализа была выделена кДНК зрелого фермента ПМЭ табака. Наше исследование мы начали с выделения кДНК гена. Для этой цели мы использовали фаговую библиотеку табачной кДНК и применили гибридизацию с клоном, выделенным ранее. Мы выделили и секвенировали 12 клонов. Анализ их нуклеотидной последовательности показал, что все они принадлежат к мультигенному семейству растительной ПМЭ. В начале аминокислотной последовательности ПМЭ находится трансмембранный домен. Компьютерный анализ окружающих его аминокислот показывает, что белок должен встраиваться в мембраны как мембранный белок второго типа. За трансмембранным доменом следует протяженная про- последовательность, которая служит одновременно и шапероном и ингибитором фермента.

На следующем этапе нашего исследовании было проведено тестирование биологической активности полноразмерного гена ПМЭ табака и его мутантных вариантов.

Различные варианты кДНК ПМЭ клонировали в экспрессионную кассету на основе рБР, кассету затем переносили в бинарный вектор рВ1Ш9, которым трансформировали агробактерии штамма вУЗЮ!. Были созданы следующие конструкции:

1. ПМЭ, кДНК ПМЭ в плюс ориентации относительно 35Б промотора;

2. ПМЭ(СРТ), ПМЭ со сбитой рамкой трансляции;

3. асПМЭ, ПМЭ в антисмысловой ориентации;

4. ПМЭ-БЭА, ген ПМЭ без энзиматической активности (БЭА) с двумя

аминокислотными заменами в активном центре 3950~* А и 396Б-» А.

£ £ 300

I § р h 250

го 5 сс ? 200

2 X 2 ё 150

S "

h 100

0> ж 50

о. О

z.-

1 К

1 СО

Шп— ■ JBf' 1.

-Vo

<е

чР

Рис.1. Тестирование биологической активности гена ПМЭ.

Ферментативную активность определяли во фракции клеточных стенок в ферментативном тесте. На всех графиках приведена нормализованная относительно контроля активность ПМЭ. Каждый столбик гистограммы отражает среднее из 3-5 независимых экспериментов.

Через три дня после агроинфильтрации листьев N. benthamiana конструкцией ПМЭ (рис. 1-2) тест на ПМЭ показал ее возросшую активность в клеточной стенке по сравнению с pBIN19 (векторный контроль) (рис. 1-1). кДНК, соответствующая процессированной части ПМЭ не оказывала влияния на уровень ферментативной активности ПМЭ КС, что указывает на важную роль лидерной части ПМЭ в ее процессинге и биогенезе. ПМЭ со сбоем рамки трансляции (СРТ) тоже не оказывала влияния, а асПМЭ и ПМЭ без энзиматической активности (БЭА) сильно понижали активность ПМЭ в клеточной стенке. Вестерн блот на ПМЭ после инфильтрации белка с заменами Asn395 -Ala и Asp396-Ala показал, что белок хорошо накапливается и стабилен, при этом энзиматическая активность ПМЭ в КС падает. Таким образом, впервые была экспериментально подтверждена расчетная модель активного центра, в который должны входить эти аминокислоты ПМЭ.

Подавление репродукции ВТМ-ЗФБ при совместной агроинъекции с кДНК ПМЭ.

На следующем этапе мы исследовали влияние ПМЭ на репродукцию ВТМ. Для этой цели в листья бентамианы вводили смесь агробакгерий, содержащих ген ПМЭ или его производных, а также вектор крВТМ:ЗФБ, у которого ген БО заменен на ЗФБ. Важная особенность метода агроинъекции состоит в его способности инфицировать, по крайней мере, 94% клеток листа. С другой стороны, известно, что уровень экспрессии ЗФБ коррелирует с уровнем накопления вируса, что позволяет в этом тесте оценивать влияние ПМЭ на уровень накопления вирусных РНК. На третий - пятый день после агроинъекции в свете ультрафиолетовой лампы можно было видеть локусы эпидермальных клеток с флуоресцирующим ЗФБ (рис. 2 А).

Из зон инфильтрации делали высечки, экстрагировали из них ЗФБ и измеряли его флуоресценцию. Оказалось, что ПМЭ ингибирует репродукцию ВТМ в такой системе более чем в 4 раза сильнее по сравнению с контрольной инфильтрацией, когда агробактерии с ПМЭ заменяли на агробактерии с рВГЫ19 (пустой вектор - векторный контроль). Агробактерии, несущие кДНК зрелой части ПМЭ или ПМЭ(СРТ), не оказывали влияния на накопление ЗФБ. Напротив, при совместной агроинфильтрации вирусных векторов с асПМЭ или ПМЭ-БЭА накопление ЗФБ увеличивалось (рис. 2А). Очевидно, для проявления ингибирующего эффекта важна ферментативная активность ПМЭ, т.к. СРТ в гене ПМЭ отменяло ингибирующий эффект ПМЭ (рис. 2Б).

Рис.2. Совместная агроинфильтрация ПМЭ и крВТМ-ЗФБ ингибирует накопление ЗФБ в листьях А/.АелГ/таш/апа.

(А) В верхней части показаны'фотографии листьев с флуоресцирующим ЗФБ в локусах вирусной репродукции, снятые при облучении ультрафиолетовой лампой. Воспроизводимость эксперимента иллюстрируют фотографии трех листочков Ы.ЬвпШат1апа. На листочке можно увидеть четыре зоны агроинфильтрации: (1) инфильтрация крВТМ-ЗФБ с рВ1Ы19, (2) крВТМ-ЗФБ с кДНК ПМЭ, (3) крВТМ-ЗФБ со зрелым ПМЭ и (4) крВТМ-ЗФБ с асПМЭ. После инфильтрации растения выдерживались около 5 дней, затем в листьях делали высечки одинаковой площади, откуда экстрагировали ЗФБ. Накопление ЗФБ измеряли на флуориметре. В каждом эксперименте флуоресценция ЗФБ нормализовалась отосительно крВТМ-ЗФБ+рВ1К119. Каждый столбик гистограммы содержит результаты 5-8 независимых экспериментов.

(Б) Ко-экспрессия крВТМ-ЗФБ и ПМЭ(СРТ) не влияла на накопление ЗФБ. Слева на листочке показаны локусы, образованные при репродукции крВТМ-ЗФБ (1), справа крВТМ-ЗФБ с ПМЭ(СРТ) (2).

(В) ТБ ВТМ снимает ингибирующиЙ эффект ПМЭ, в то время как ЫрвиИ, А2-ПМЭ, дефектный по внутриклеточному транспорту, и мутант ПМЭ-БЭА не влияют на накопление ЗФБ.

Этот вывод подтверждается в экспериментах с мутантами ПМЭ. А2-ПМЭ и ПМЭ-БЭА, у которых частично удален ТМД. Они даже стимулировали накопление ЗФБ (рис. 2 В), по-видимому, из-за конкуренции с эндогенным ПМЭ. Особенно ясно взаимосвязь между ферментативной активностью ПМЭ и уровнем накопления ЗФБ видна по результатам, представленным на рисунке 3.

ш $

I £

5.1

г?

Ш 40сН

8 350Н 5 300Н

■О

_ _ ОС

-50 | -100 | -1501 •2001

-2501 -3001

о о

я а.

-е-

о О

0 £

х 3 х

1 2 3 4

Рис. 3. Обратная корреляция между ферментативной активностью ПМЭ и уровнем репродукции ВТМ (в относительных единицах).

Действие ПМЭ помимо деэстерификации пектина оказывает влияние иа экспрессию вновь синтезируемых РНК. Экспрессия другого фермента - NpGUTl, локализующегося в КС и участвующего также в биогенезе пектина, не оказывала влияния на накопление ЗФБ (рис. 2 В). С другой стороны, транспортный белок ВТМ, который, как известно, взаимодействует с ПМЭ, снимает эффект ингибирования репродукции ВТМ (рис. 2 В), Это указывает на важную роль транспортного белка в преодолении хозяйской устойчивости, вызванной ПМЭ.

ПМЭ подавляет накопление вирусных РНК и стимулирует образование siRNA.

Нозерн-блот анализ вирусных РНК при совместной агроинфильтрации крВТМ:ЗФБ и ПМЭ показал значительное подавление накопления вирусных РНК (рис. 4А). Обратный эффект наблюдался при подавлении синтеза ПМЭ введением в клетки асПМЭ. Подобное действие оказывал также ген-супрессор умолкания генов Р19 ВККТ (рис. 4А, дорожка 4). Низкий уровень накопления геномной РНК крВТМ в векторном контроле, по-видимому, связан с отсутствием БО. Введение в геном крВТМ гена БО резко усиливало накопление геномной РНК. Способность ПМЭ вызывать деградацию вирусной РНК, по-видимому, связано с механизмом умолкания генов (gene silencing). Для проверки этого предположения мы выделили препарат коротких РНК и провели гибридизацию зондом к негативной цепи мРНК ЗФБ. Ко-экспрессия крВТМ-ЗФБ и ПМЭ приводит к резкому увеличению количества 21-нт siRNA (рис. 4Б, дорожка 3). Таким образом, экспрессия ПМЭ вызывает умолкание РНК, сопровождаемое разрушением РНК крВТМ и накоплением 21-нт siRNA.

А.

/М* У

крВТМ-ЗОВ 1 2 » 4 в

S.*//

г«номнм f НК«Ф ? ^ ;

lliil

£ :4

25 ZI

19 w+

pPHK i

64- j. , !. я v; .i ■ .ч Î f-,' ' -s

РНК ЗФБ

Ло* S S -'-WÎ :

Pi « P) H) <S)

pPHK ^

Рис. 4. Подавление репликации крВТМ-ЗФБ ПМЭ связано с накоплением вирус-специфичных siRNA длиной 21 нт.

(А) Нозерн блот на вирусные РНК, которые синтезирующихся при репликации кр&ТМ-ЗФБ.

Инфильтрировали листочки N.benthamfana смесями агробактерий: (1) крВТМ-ЗФБ + асПМЭ, (2) крВТМ-ЗФБ + ПМЭ, (3) крВТМ-ЗФБ + pBIN19, (4) крВТМ-ЗФБ 4- р19, (5) pB!N19. Положение субгеномных вирусных РНК показано слева стрелками. После переноса РНК мембрану окрашивали метиленовой синькой, чтобы показать равные количества наносимой в слоты геля РНК.

(Б) Анализ накопления вирусоспецифических siRNA после агроинфильтрации смесями агробактерий, содержащих (1) pBIN19, (2) крВТМ-ЗФБ + pBIN19, (3) крВТМ-ЗФБ + ПМЭ, (4) крВТМ-ЗФБ + асПМЭ и (5) крВТМ-ЗФБ + ПМЭ-БЭА. РНК контроля нанесения окрашивали атидием бромида.

ПМЭ не оказывает влияния на репродукцию ХВК, если активен вирусный ген-супрессор умолкання генов, 25К ТБГ1.

Для выяснения влияет ли экспрессия ПМЭ на репликацию других вирусов, мы использовали вирусный вектор на основе ХВК, экпрессирующий ЗФБ. В предварительных экспериментах было показано, что ни ПМЭ, ни ПМЭ-БЭА или асПМЭ не оказывали значимого влияния на экспрессию ЗФБ. Геном ХВК содержит тройной блок перекрывающихся генов, ТБГ (ТГБ1-25К, ТГБ2-12К и

ТГБЗ-8К), которые вместе с геном БО необходимы для вирусного транспорта. ТГБ1 25К является многофункциональным белком, который помимо своей транспортной функции, является также супрессором сайленсинга. Мы предположили, что ПМЭ и 25К нивелируют друг друга, и сайленсинг, вызванный ПМЭ, снимается 25К. Для проверки этого предположения были созданы два вирусных вектора. В один вектор была введена мутация, приводящая к сбою рамки трансляции в 25К (ХВК-ЗФБ-25Ксрт), в другом векторе был удален весь ТГБ и БО (ХВК-ЗФБ-ДТБГ-ДБО). Показано, что репликация векторов без 25К стала чувствительна к экспрессии ПМЭ. Происходило подавление их репликации в присутствие ПМЭ и усиление при добавления асПМЭ и ПМЭ-БЭА. Мы заключили, что ТГБ1 25К ХВК снимает сайленсинг, вызываемый ПМЭ.

ПМЭ вызывает сайленсинг РНК трансгенного ЗФБ.

Чтобы ответить на вопрос, вызывает ли ПМЭ сайленсинг только при репликации описанных ранее вирусов или происходит деградация трансгенных транскриптов, мы провели серию экспериментов по изучению влияния ПМЭ на экспрессию моноцистронного трансгенного ЗФБ. Атробактерии, содержащие экспрессионную кассету с ЗФБ, смешивали в соотношении 1:1 с агробактериями, содержащими ПМЭ, инфильтрировали листья N.benthamiana и оценивали накопление РНК и флуоресценцию ЗФБ. На рис. 5А видно, что ПМЭ подавляет накопление ЗФБ (А). Уровень накопления ЗФБ падает примерно в б раз (Б), в то время как асПМЭ и ПМЭ-БЭА его резко увеличивает. Это хорошо коррелирует с уровнем накопления РНК (рис. 5В). Одновременно с подавлением аккумуляции мРНК ЗФБ, ПМЭ увеличивает продукцию специфических siRNA (рис. 5Г). Таким образом, ПМЭ вызывает не только ВИУГ, но и ТИУГ. ПМЭ вызывает накопление ядерного белка DCL1 в цитоплазме.

Развитие ВИУГ и ТИУГ зависит от активности ядерных факторов и их экспорта из ядра в цитоплазму. Так, недавно было показано, что белок р19 ВККТ,

который является наиболее полно изученным супрессором сайленсинга, взаимодействует с факторами экспорта РНК из ядра в цитоплазму АЬУ.

А.

Б.

в.

<ъ

рРНК

Г.

_ ж4

■> х^ Л

рРНК

Рис. 5. ПМЭ усиливает сайленсинг трансгенных РНК.

(A) Фото листа бентамианы,

агроинъецированного конструкцией) экспрессирующей ЗФБ, совместно с В1п19 (слева) или ПМЭ (справа). (Б) Тестирование уровня экспрессии ЗФБ в присутствии В!п19 (пустой вектор) (1), ПМЭ (2), а с ПМЭ (3) или ПМЭ-БЭА (4).

(B) Нозерн блот ЗФБ мРНК, выделенной из листьев М.Ьел*Лат/ала, инфильтрированных агробактериями, содержащих (1) ЗФБ + рВ1[М19, (2) ЗФБ + ПМЭ, (3) ЗФБ + асПМЭ и (4) ЗФБ+ ПМЭ-БЭА РНК была выделена через три дня после агроинфильтрации. ' Внизу представлен контроль нанесения. (Г) Нозерн блот Стрелкой обозначено ■ положение 21 рибонуклеотидного маркера подвижности.

Некоторые из ключевых клеточных белков, принимающих участие в развитии сайленсинга, обнаружены в ядре, DCL1 имеет сигнал ядерной локализации (NLS) и принимает участие в процессинге (разрезании) микроРНК (miRNA), DCL2 образует вирусоспецифичные siRNA, DCL3 образует siRNA, ответственные за модификацию хроматина. В ВИУГ и ТИУГ участвуют также белки другого класса, такие как HEN1 и AG04, которые также обнаруживаются в ядре. В этой работе мы использовали два слитых с ЗФБ дайсера DCL1 и DCL2 A.thaliana. Цель эксперимента - выяснить, не изменяется ли локализация DCL1-ЗФБ и БСЬ2-ЗФБ при суперэкспрессии ПМЭ. На рис. б А и В видно, что после агроинфильтрации кДНК DCLl-ЗФБ флуоресценция обнаруживалась только в ядре. В противоположность DCLl-ЗФБ, ОСЬ2-ЗФБ давал флуоресценцию как в ядре, так и в цитоплазме (рис. 6 С и D), и экспрессия ПМЭ не меняла его локализацию (рис. 6 G и Н). Однако DCLl-ЗФБ вел себя иначе. В присутствии ПМЭ его флуоресценция обнаруживалась только в цитоплазме; в ядре флуоресценции не наблюдалось (рис. 6 Е и F). Мутанты ПМЭ, такие как асПМЭ (рис. б I и J), ПМЭ-БЭА (рис. б К и L) и А2-ПМЭ (рис. 6М и N), не изменяли ядерную локализацию DCLl-ЗФБ. Таким образом, накопление DCL1 в цитоплазме может быть ключевым моментом в понимании механизма сайленсинга, вызываемого ПМЭ.

ПМЭ стимулирует процессинг miRNA.

Для выяснения, влияет ли перемещение DCL1 из ядра в цитоплазму на процессинг miRNA, предшественник miR171 из A.thaliana (pBlCmiR 171 ргес) экспрессировали в листьях N.benthamiana. Только небольшое количество процессированной эндогенной miR171 можно было обнаружить в незаражениых листьях (рис. 7). После инфильтрации агробактерий, содержащих, pBICmiR171prec, количество регистрируемой miR171 сильно возрастало. ПМЭ увеличивает накопление miR171, тогда как ферментативно неактивный ПМЭ-БЭА

такого эффекта не производит. Мы заключили, что ПМЭ стимулирует накопление не только в^ЫА, но и пиПЫА.

ОСИ оФБ

ОСП:ЗФБ+ЛМЭ

ССЖ1:ЗОЬ +асПМЭ

■ш

оа.р зов

' • ^.

ОСи 1 ;ЗФБ +А2-ПМГ)

Рис. 6. Накопление ядерного 0С1.1 в цитоплазме клетки связано с ферментативной активностью белка ПМЭ.

Снимки сделаны на лазерном конфокальном микроскопе с фильтрами для ЗФБ (А,С,Е,6,1,К,М) и в фазовом контрасте (В,0,Р,НД1-,М). На снимках видно, что флуоресценция ограничена эпидермальными клеточными стенками. Длина линейки равна 20 мкм.

(А и В) При инъекции 0С1_1-ЗФБ флуоресценция видна только в ядре.

(С и Р) 0С1_2-ЗФБ: флуоресценция наблюдается как в ядре, так и в цитоплазме.

(Е и Г) показывает, что в присутствии ПМЭ РСИ-ЗФБ перемещается в цитоплазму.

(6 и Н) 0С1_2-ЗФБ с ПМЭ не меняет своей локализации в клетке.

(1-1Ч) Влияние ПМЭ на локализацию ОСН-ЗФБ +ПМЭ ОС 1.1+ асПМЭ

РСШ-ЗФБ + ПМЭмут(К,Ц, ОСИ +А2-ПМ (М.Ы).

А.

тИ71пред + + + —

ПМЭ + - — —

ПМЭ-БЭА — + — —

рВ!Ж9 — — + —

— 21 т

Рис. 7. ПМЭ стимулирует процессинг т!РНК.

ПМЭ активирует расщепление п^МАргес. В листья N. Ьел№ат/апа вводили агробактерии, содержащие т!ЗД71ргес с ПМЭ или его мутантами, и проводили Нозерн блот-анализ 1шР171 через два дня после агроинъекции.

т[ГМ71ргес как субстрат ОСЫ снимает ингибирующий эффект ПМЭ в

репродукции вируса.

На рис. 8 показано, что совместная инъекция тШ.171ртес и крВТМ-ЗФБ

снимает ингибирующий эффект ПМЭ. Мы предположили, что участие ОСЫ в

ВИУГ вызывает конкуренцию между репродукцией ВТМ и процессингом пиЛЫА.

В соответствии с этим предположением совместная экспрессия 1тШ71ргес и

крВТМ-ЗФБ приводила к повышению накопления вирусной РНК (рис. 8). Кроме

того показана взаимосвязь между биогенезом гшЮ^А и репродукцией ВТМ, где оба процесса, по-видимому, конкурируют за ОСЫ. Действительно, инъекция гтШ71ргес и крВТМ-ЗФБ приводила к резкому увеличению накопления ЗФБ (рис. 9А) и вирусной РНК (рис. 9Б).

Мы заключили, что конкуренция между ппЯ171ргес и крВТМ-ЗФБ за ОСИ приводит к суперпродукции вирусной РНК.

тШ171ргес - - + +

ПМЭ - + - +

крВТМ:ЗФБ + + + +

РВШ19 + + -

ЗФБ МРНК

Рис. 8. Субстрат ОС1.1 снимает ингибирующий эффект ПМЭ на репродукцию вируса. На рисунке показано накопление РНК ЗФБ в присутствии: 1-рВ1М19; 2-ПМЭ+рВ1Ы19; 3-т1К17'ргес+рВ1М19; 4-т1М71ргес+рВ1М19+ПМЭ

Листья N. ЪешЬатхапа инфильтрировали агро бактерия ми, содержащими 1шК171ргсс и ПМЭ и/или крВТМ:ЗФБ. Через два дня делали Нозерн блот на ЗФБ мРНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Известно, что ПМЭ участвует в биогенезе КС, развитии корневой системы, стебля, роста пыльцевой трубки и созревании плодов. Однако, в последнее время становится все более очевидным, что роль ПМЭ в жизни растения этим не ограничивается. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ табака способна взаимодействовать с ТБ ВТМ. Полагают, что ПМЭ КС может выполнять

функцию клеточного рецехггора ТБ и взаимодействие ПМЭ с ТБ требуется для эффективного вирусного транспорта.

ПМЭ синтезируется в клетках всех высших растений. Важно знать особенности структуры гена ПМЭ, и недавно была сделана попытка систематизировать наши представления об этом. ПМЭ как семейство генов разделили на 8 групп, кладов. Табачная ПМЭ, выделенная и секвенированная в нашей работе, попадает в группу Plant 1, к которой относятся ПМЭ с .длинной лидерной областью (255 аминокислот) и пятью консервативными сигнатурными доменами зрелого фермента. В нашей работе впервые изучена транзиентная (временная) экспрессия полноразмерного гена ПМЭ в растительной клетке. Показано, что ген экзогенной ПМЭ хорошо экспрессируется и увеличивает уровень ферментативной активности ПМЭ КС, в то время как асПМЭ резко

А. Б.

Рис. 9. Конкуренция между miR171prec и крВТМ:ЗФБ за DCL1

Листья А/. Ьеп№ат1апа инфильтрировали агробактериями, содержащими пгпК171ргес и/или крВТМ:ЗФБ; через 3 дня после агроинъекции листья фотографировали (А) и выделяли РНК, которую гибридизовали зондом, специфичным к ЗФБ мРНК (Б).

блокирует эндогенную ПМЭ (рис. 1). Проведенный мутационный анализ впервые экспериментально подтвердил ранее предполагавшуюся модель активного центра ПМЭ.

Тестирование биологической активности гена ПМЭ и его дериватов было только прелюдией к решению основной задачи данного исследования -выявлению роли ПМЭ в развитии вирусной инфекции. Известно, что растение на проникновение чужеродного генетического материала реагирует развитием механизма умолкания РНК, Более того, растения были первым биологическим объектом, где это явление было показано в 1990 году. Сейчас известно, по крайней мере, три уровня умолкания РНК: ВИУГ, ТИУГ и умолкание эндогенной РНК с помощью пп1ША. События, сопровождающие агроинфекцию растений вирусным вектором (метод, использованный в данной работе), являются примером первого уровня умолкания РНК, сопровождающегося разрушением вирусной РНК и накоплением $1|ША. Наши эксперименты показывают, что этот процесс резко усиливается при введении в клетки экзогенной ПМЭ. Четко определена обратная зависимость между уровнем ферментативной активности ПМЭ и способностью клеток репродуцировать вирус. Разрушение вирусной РНК сопровождается одновременным накоплением 5|1ША (отличительная черта умолкания РНК), ПМЭ индуцирует не только ВИУГ, но и ТИУГ, что может указывать на общие механизмы этих процессов.

Механизм участия ПМЭ в развитии умолкания РНК не ясен. Наши эксперименты с использованием конфокальной микроскопии и пи11171ргес указывают на участие цитоплазматической БСЫ в разрушении вирусной РНК. Недавно были получены результаты, подтверждающие наши данные и свидетельствующие об участии БСЫ в репликации вирусной РНК и

конкуренции этого процесса с биогенезом пиНКА.

выводы.

1. Проведено выделение кДНК гена ПМЭ табака, определены структурные элементы, ответственные за активность ПМЭ.

2. Для изучения роли ПМЭ в репродукции вирусов разработан метод транзиентной (временной) репродукции ВТМ и ХВК при агроинфекции листьев Л//со^апа benthamiana, позволяющий изучать уровень репродукции вирусов по способности накапливать в клетках зеленый флуоресцентный белок ЗФБ.

3. Показано, что только секретируемый и ферментативно-активный ПМЭ подавляет репродукцию ВТМ. Этот процесс сопровождается интенсивным разрушением вирусной РНК с одновременным накоплением коротких интерферирующих РНК фКМА).

4. ПМЭ подавляет репродукцию ХВК, когда его белок 25 ТБГ1, ответственный за подавление умолкания РНК, инактивирован,

5. Установлено, что действие ПМЭ не ограничено подавлением ВИУГ, но распространяется и на ТИУГ, вызывая интенсивное разрушение трансгенной мРНК с одновременным накоплением $¡14^.

6. Показано, что ПМЭ вызывает активацию ядерного фермента дайсера

ответственного за образование коротких клеточных днРНК (пгпЯМА). ПМЭ вызывает накопление ядерного РС1_1 в цитоплазме клеток.

7. Показано, что ПМЭ стимулирует процессинг пгнКМА.

8. РНК-предшественник гшЯМА как субстрат РСШ снимает ингибирующий эффект ПМЭ в репродукции вируса.

9. Показана взаимосвязь между биогенезом тИЗЫА и репродукцией ВТМ; оба процесса, по-видимому, конкурируют за ОСИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Dorokhov, Y.L., Skurat, E.V., Frolova, O.Y., Gasanova, T.V., Ivanov, P.A., Ravin N.V., Skryabin K.G., MSkinen, K., Klimyuk V., Gleba Y.Y. and Atabekov, J.G. (2006). Role of the leader sequences in tobacco pectin methylesterase secretion. FEBS Letters 580, 3329-3334.

2. Dorokhov, Y.LM Frolova, O.Y., Skurat, E.V., Ivanov, P.A. Gasanova, T.V., Sheveleva P.A., Ravin N.V., MSkinen, K., Klimyuk V., Skryabin K.G., Gleba Y.Y. and Atabekov, J.G. (2006). A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase: the enhancer of RNA silencing. FEBS Letters 580, 3872-3878

3. Дорохов Ю.Л., Скурат E.B., Фролова О.Ю., Гасанова Т.В., Смирнов А. А., Зверева С.Д., Иванов П.А., Равин Н.В., Замчук Л.А., Атабеков И.Г. (2004). Обратная зависимость между экспрессией гена пектинметилэстеразы и эффективностью репродукции тобамовируса в растениях Nicotiana benthamiana. ДАН 394, №2, 269-271.

4. Тюлькина Л. Г., Скурат Е. В., Зверева А, С., Дорохов Ю. Л,, Атабеков И. Г., (2006). Транспортный бепок стимулирует репродукцию вируса табачной мозаики в инфицированных клетках. ДАН 409, 253-258.

Тезисы докладов:

1. Dorokhov Y., Skurat E.t Ravin N., Frolova O,, Zvereva S., Ivanov P., Makinen K., Klimyuk V. and Atabekov J. Study of possible role of tobacco pectin methylesterase in cell-to-cell movement of tobacco mosaic virus. The XII International Congress of Virology, July 27-August 1, 2002.

2. Yuri L. Dorokhov , Peter A. Ivanov, Eugene V. Skurat , Olga Yu. Frolova, Nikolay V. Ravin, Svetlana D. Zvereva, Tanja Gasanova, Kristiina Makinen, Victor Klimyuk, Yuri Yu. Gleba and Joseph G. Atabekov (2003). Pectin

methylesterase as a putative movement protein receptor exerts negative effect on tobacco mosaic virus multiplication and movement. Abstracts of 7th International Congress of Plant Molecular Biology, Barcelona, June 23-28. S25-5, p.360.

3. ЮЛ.Дорохов, Е.В.Скурат, О.Ю.Фролова, ПАИванов, Н.В.Равин, Т.В.Гасанова, С.Д.Зверева, К.М.Мякинен, В.И.Климюк, КХ.Скрябин, Ю.Ю.Глеба, И.Г.Атабеков (2003). Синтез пектинметилэстеразы интерферирует с транспортом и репликацией вируса табачной мозаики. II Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 10-14 ноября. Стр.169-170.

Патенты:

1. Skurat Е. (2004). Method of protein production In plants. Patent number: MXPA04001871.

2. Dorokhov, Y., Skurat, E., Klimyuk, V., Gleba, Y. (2005). Method of protein production in plants. Patent number: US20050015830.

принято к исполнению 24/10/2006 Исполнено 25/10/2006

Заказ N° 805 Тираж: ЮОэкз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www, autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скурат, Евгений Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II. 1. Пектинметилэстераза растений.

II. 1.1. Клеточная стенка растений.

II. 1.2. Биохимические процессы клеточной стенки, с участием пектина.

II. 1.3. Роль пектинметилэстераз в биогенезе клеточной стенки.

II. 1.4 Классификация Пектинметилэстераз.

IIЛ .5. Трехмерная реконструкция ферментативной части ПМЭ.

II.1.6. Взаимодействие ПМЭ с транспортным белком вируса табачной мозаики.

II.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ У РАСТЕНИЙ.

И.2.1. Короткие двухнитевые РНК (siPHK, miPHK, ta-siPHK) - основные участники УГ.

11.2.2. Цитоплазматическое умолкание РНК.

11.2.3. Умолкание эндогенной мРНК с помощью miPHK.

11.2.4. Метилирование ДНК и подавление транскрипции.

11.2.5. Дайсеры.

11.2.6 Аргонавты и индуцируемый РНК комплекс УГ.

11.2.7 РНК-зависимая РНК-полимераза.

11.2.8 Системное УГ.

11.2.9 РНК-зависимое метилирование ДНК и участие РНК-полимеразы.

11.2.10 Вирусные супрессоры УГ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

IV. 1 Выделение кДНК гена ПМЭ из табака (N.tabacum) и его экспрессия в экспериментах по агроинфильтрации листьев бентамианы (N. benthamiana).

IV.2. Подавление репродукции ВТМ-ЗФБ при совместной агроинфильтрации с кДНК ПМЭ.

IV.3 Подавление ПМЭ накопления вирусных РНК и стимулирование образования siPHK.

IV.4 ПМЭ не оказывает влияния на репродукцию ХВК, если активен вирусный ген-супрессор умолкания генов, 25К ТБГ1.

IV.5 ПМЭ усиливает умолкание РНК трансгенного ЗФБ.

IV.6 ПМЭ вызывает накопление ядерного белка DCL1 в цитоплазме.

IV.7 Стимулирование процессинга miPHK при экспрессии ПМЭ.

IV.8 Подавление ингибирующего эффекта ПМЭ предшественником. miR171 в накоплении вирусных РНК.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов"

Умолкание генов (gene silencing), посттранскрипционное умолкание генов или РНК интерференция (PHKi) - все эти термины обозначают механизм регуляции активности генов, заключающийся в нуклеотид-специфическом контроле активности мРНК, включающем в себя вирус-индуцируемое умолкание генов (ВИУГ) и трансген-индуцируемое умолкание генов (ТИУГ). ВИУГ и ТИУГ имеют общие черты для всех эукариот. Молекулярный механизм умолкания генов включает: (а) нарезание двухнитевой РНК на короткие (21-25 нт) интерферирующие РНК (siPHK); (б) включение одной из нитей siPHK в так называемый РНК-индуцируемый комплекс умолкания (ИРКУГ), где происходит взаимодействие с мРНК-мишенью, приводящее к ее деградации или ингибированию трансляции. Сейчас известно, по крайней мере, три уровня умолкания РНК: ВИУГ, ТИУГ и умолкание эндогенной РНК с помощью так называемых микро-РНК (miPHK), которые структурно не отличаются от siPHK. Во всех этих процессах ключевую роль играют два белка: (а) фермент, относящийся к семейству РНКаз III, получивший название дайсера (DCR) и (б) белок ARGONAUTE, способный разрушать мРНК-мишень в ИРКУГ. В растениях дайсеры получили название DCR-like (DCL). Эти ферменты могут быть разделены на 4 типа: (a) DCL1, участвующий в биогенезе miPHK; (б) DCL2, образующий siPHK из вирусных днРНК; (в) DCL3, образующий эндогенные siPHK, ответственные за модификацию хроматина; (г) DCL4, ответственный за образование ta-siPHK.

Поиск и идентификация клеточных белков, участвующих в ВИУГ и ТИУГ, расширяет наше представление об этом важном общебиологическом явлении. Одним из таких белков является пектинметилэстераза (ПМЭ). Этот фермент катализирует деэстерификацию пектина и участвует в биогенезе клеточной стенки (КС), развитии корневой системы, стебля, росте пыльцевой трубки и созревании плодов. Однако в последнее время становится все более 7 очевидным, что роль ПМЭ в жизни растений этим не ограничивается. Ранее в нашей лаборатории было показано, что ПМЭ табака способна взаимодействовать с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ). Полагают, что ПМЭ клеточной стенки может выполнять функцию клеточного рецептора транспортного белка и взаимодействие ПМЭ с транспортным белком необходимо для эффективного вирусного транспорта.

В данной работе нами выделена полная кДНК гена ПМЭ табака и исследована роль ПМЭ в вирус-индуцируемом и транс-индуцируемом умолкании генов.

II. Обзор литературы

II.1. Пектинметилэстераза растений.

11.1.1. Клеточная стенка растений

Клеточная стенка является важнейшим компонентом растительной клетки. Она образует внешний скелет клетки, определяет её форму, обеспечивает адгезию соседних KneTOK(Iwai et al., 2002); (Pane and Geitmann, 2005). Клеточная стенка играет важную роль в проведении межклеточного сигнала, участвует в дифференцировке и определяет направление роста клетки (Carpita and Gibeaut, 1993). Растения должны защищать себя не только от поедания животными и насекомыми, которых можно отпугнуть шипами, стрекательными клетками, алкалоидами или горьким вкусом, но и от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. Если у животных хорошо развита иммунная система, в виде макрофагов, лейкоцитов или антител, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений нет системы циркуляции и каждая отдельная клетка должна автономно содержать весь набор защитных механизмов. Растения являются неподвижными организмами, поэтому клеточная стенка, является самым главным элементом защиты против внешних воздействий.

Клетки растений ограничены клеточной мембраной, за которой следует первичная клеточная стенка, толщиной около 1 мкм, затем между ними начинает формироваться вторичная клеточная стенка более толстая и жесткая, которая начинает образовываться после того, как клетка в основном перестала расти и выполняет опорную функцию (Varner and Lin, 1989). Жесткость клеточной стенке придают целлюлозные кристаллические фибриллы уложенные в несколько параллельных слоев, соединяясь между собой гемицеллюлозными цепочками, образуя целлюлозный каркас (Engelsen et al., 1996). Схематичное строение клеточной стенки представлено на рис.(1). взаимное расположение основных компонентов: целлюлозные микрофибриллы, связанные с гемицеллюлозой (ксилоглюканами); пектины различных классов, образующие пектиновый гелеобразный матрикс; структурные белки придают дополнительную жесткость целлюлозному KapKacy(Marga et al., 2005). Метелки на схеме изображают сложные, разветвленные цепи пектиновых молекул, которые могут исполнять роль рецепторов. Точками обозначены ионы Са2+, которые связывают параллельные линейные участки пектиновых цепей, уплотняя гель (Taiz Zeiger 3d ch. 15 р.4).

Соединение между фибриллами не жесткое и целлюлозные фибриллы могут скользить друг относительно друга при растяжении стенки (Brummell and Harpster, 2001). Целлюлозная сеть находится в геле, образованным высокогидратированным олигосахаридным матриксом, состоящим в основном из пектина, который препятствует слипанию целлюлозных фибрилл (Thakur, Singh, and Handa, 1997). Пектиновый гель регулирует также проницаемость клеточной стенки (Dourado et al., 2004; Nergard et al., 2005).

Структурные белки необходимы для дополнительной жесткости целлюлозного каркаса (Roberts et al., 1985). Известно, что, несмотря на свою жесткость, клеточная стенка обладает достаточной пористостью. Размер пор составляет 4 нм, и через нее могут проходить различные молекулы и белки с молекулярной массой до 60 кДа (Anisimov, Sorokina, and Dautova, 1998).

Первичная клеточная стенка состоит на 25% (от сухого веса стенки) целлюлозы, 25% гем и целлюлозы, 35% пектина (с вариациями +/- 10%) и содержи] от i до 8% структурных белков (Keller and Lamb, 1989). Содержание воды в ней составляет 78-80% (Fry, 1994). Во вторичной клеточной стенке содержание целлюлозы несколько выше, чем в первичной. На рис. (2) показано распределение целлюлозы и пектина на периферии клеток арабидопсиса A. thaliana.

Целлюлоза Пектин

Рис. 2. Распределение пектина и целлюлозы в клеточных стенках арабидопсиса. 1-вторичная стенка клеток паренхимы арабидопсиса обработанная красителем Calcofluor, который окрашивает целлюлозу во вторичной КС, 2-тот же препарат, обработанный антителами к гомогалакторонану (J1M5), конъюгированных с флюоресцентным красителем. (Centre for Plant Science, University of Leeds Paul Knox Cell Wall Lab).

11.1.2. Биохимические процессы клеточной стенки, с участием пектина.

Пектином называют гетерологичную группу полимеров, которые состоят из кислых Сахаров, таких как галактуроновая кислота и нейтральных Сахаров: рамнозы, галактозы и арабинозы. На рис. (3) изображена химическая формула пектина, который имеет линейные участки, состоящие из остатков полигалактуроновых кислот, связанных а-1—>4 связью, и разветвленные области, в которых к основной полигалактороновой цепи присоединены боковые цепи, состоящие из самых разных Сахаров. Основными сахарами боковых цепей явлются арабинаны и арабипогалактаны, которые имеют общее название рамнозил. R

Остатки дигалактуроновой кислоты

Рис. 3. Структура пектина. Линейные участки цепи состоят из 70-100 остатков галактуроновой кислоты, соединенных а-1—>4 связью. Линейные участки прерываются боковыми цепями, состоящими преимущественно из остатков рамнозила-R (Round et al., 2001).

Пектины наиболее растворимый компонент клеточной стенки и легко вымываются горячей водой или хелатирующими реагентами, связывающими ионы кальция. Некоторые пектины имеют относительно простую линейную структуру, такие как гомогалактуронан с редкими боковыми цепями, состоящими из остатков рамнозила (Bailey, Chesson, and Monro, 1978). Наиболее распространенным среди пектинов являются рамногалактуропапы I

RGI) с длинной главной цепью, состоящей из дисахарида рамнозы и галактуроновой кислоты и многочисленных боковых цепей из арабинанов, галактанов, арабиногалактанов и галактуронанов (McNeil et al., 1984). В молекуле (RGI) ветвистые участки перемежаются с длинными линейными участками, состоящими из гомогалактуронанов (Limberg et al., 2000). Самый сложный класс пектинов RGII состоит, по меньшей мере, из 10 различных Сахаров и имеет очень разветвленную структуру, отличную от RGI. В виду своей сложности и непохожести на другие пектины, RGII вероятно выполняет какие-то сигнальные функции.

Пектин образует гидратированный гель по механизму электростатического взаимодействия анионов карбоксильных групп галактуронанов с катионами Са2+, кроме того, молекулы пектина могут быть связаны ковалентно (Bednarska, Lenartowska, and Niekras, 2005) (рис. 4).

Рис. 4. Образование ионной связи между карбоксильными группами галактуроновых остатков в параллельных пектиновых цепях с участием катионов

Са (Taiz Zeiger 3d ch.15 p. 12)

Во время биосинтеза в аппарате Гольджи пектины частично эстерифицируются метальными, ацетильными и другими группами, при этом происходит маскирование отрицательного заряда карбоксильной группы

0 0=С 7- o-f^Ю 0"= с о-@"°

Метальная группа галактуроновой кислоты, что препятствует гелеобразованию пектина через ионы кальция (MacDougall et al., 2001) рис.(5).

Рис. 5. Секреция пектиновых Сахаров. Электронная микрофотография аппарата Гольджи из Micrasterias. Препарат был обработан антителами Jim 7, конъюгированных с золотом, которые реагируют только с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000).

Эстерифицированный пектин секретируется в клеточную стенку по актиновым микрофиламентам. Такой пектин считается химически инертным и не может вступать в метаболические реакции в клеточной стенке (MacKinnon et al., 2002; Wakabayashi, Hoson, and Huber, 2003) (рис.6).

Рис. 6. Локализация эстерифицированного пектина. Электронная микрофотография первичной клеточной стенки Micrasterias (PW). Препарат был обработан антителами Jim7, конъюгированных с золотом, которые связываются с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). На фотографии видно, что после секреции эстерифицированный пектин равномерно распределен по первичной клеточной стенке.

После попадания в клеточную стенку пектин может деметилироваться. Этот процесс проиллюстрирован на рис. (7). I

Н * i

Рис. 7. Распределение деэстерифинированного пектина. На фотографии препарата первичной клеточной стенки Micrasterias (PW) видно, что пектин деметилируется на самой границе стенки (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). Препарат был обработан антителами Jim5, которые узнают только деметилированный пектин.

11.1.3. Роль пектинметилэстераз в биогенезе клеточной стенки.

Деэстерификация пектина происходит с помощью фермента клеточной стенки пектинметилэстеразы (ПМЭ) (ЕС 3.1.1.11), который катализирует реакцию отщепления метальной группы из гомогалактуронового эфира (рис. 8).

Рис. 8. Реакция деэстерификации дигалактуроновых сложных эфиров, катализируемая пектинметилэстеразой (McFeeters and Armstrong, 1984; Micheli, 2001).

Ферменты ПМЭ могут проводить деэстерификацию пектина в местах, распределенных случайным образом, что в большей степени характерно для фитопатогенов (Shevchik and Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2003). При этом образуется протонный дрейф, приводящий к понижению рН вблизи клеточной стенки, что вызывает активацию полигалактуронидаз, как клеточных, так и фитопатогенов, которые деградируют пектиновые цепи

Arancibia and Motsenbocker, 2006). После действия полигалактуронидаз, пектиновый гель становится более жидким, а клеточная стенка более проницаемой (Dobies, Kozak, and Jurga, 2004). После действия полигалактуронидаз образуются короткие 15-членные олигосахариды, которые активируют защитные механизмы клетки (Walker-Simmons et al., 1984).

Клеточные ПМЭ могут работать и линейным образом, отщепляя метальные группы последовательно (рис. 9). В этом случае параллельные пектиновые цепи сшиваются друг с другом через ионы Са2+, происходит загустение пектинового геля и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Marudova, MacDougall, and Ring, 2004).

Таким образом, пектипметилэстераза является важнейшим ферментом клеточной стенки, действие которого может локально регулировать жесткость клеточной стенки, позволяя ей растягиваться в нужном направлении и регулировать проницаемость (Baskin, 2005) (Bosch, Cheung, and Hepler, 2005). В зависимости от состояния клеточной стенки ПМЭ может деэстерифицировать пектин случайным образом (рис.9а), и деметилированные галактуроновые кислоты становятся мишенью для эндополигалактуроназ. Вследствие этого происходит разрыв пектиновых цепей и клеточная стенка размягчается (Wakabayashi, Hoson, and Huber, 2003). При блочном деметилировании (рис.9б) происходят сшивки пектиновых цепей через ион Са2+ и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Micheli, 2001).

Секреция ПреПроПМЭ и пектина в клеточную стенку

Случайная деэстерификация а) X О

Последова тельн ая деэстерификация б)

Саг+ пг т w t

Сз2+ ооос н н пг

Са2+Са2+Са2+Саг+ т т

Са2+Сэ2+Са2+Са2+Са2+Саг+

Размягчение клеточной стенки

Уплотнение клеточной стенки

Метилированный остаток галактуроновой кислоты Деэстерифицированный остаток галактуроновой кислоты П Г-п опи га ла югу ронида за

Рис. 9. Две модели действия нектинметилэстераз (Capel et al., 2005).

Кроме того, работа чужеродных ПМЭ фитопатогенов (грибов и бактерий), с помощью которых они стремятся проникнуть сквозь клеточную стенку, приводит к индукции различных защитных реакций клетки (McGurl, Pearce, and Ryan, 1994; Oelofse and Dubery, 1996): образование перекиси водорода (Mellersh et al., 2002; Troshina et al., 2006; Wojtaszek, 1997), индукция фитоалексинов, активация SIPK киназ, секреция каллозы в места проникновения гаусторий гриба (de Torres et al., 2006; Moscatiello et al., 2006; Ndimba et al., 2003; Truman, de Zabala, and Grant, 2006), а также к возникновению такого явления, как умолкание генов в ответ на экспрессию чужеродной РНК вирусов, которые проникают через поврежденную клеточную стенку.

11.1.4 Классификация Пектинметилэстераз.

В пыльцевых трубках табака было найдено 7 изоформ ПМЭ, отличающихся по подвижности в электроизофокусирующем геле с изоэлектрическими точками от 5.5 до 7.8 (Li et al 02). Считается, что случайную деэстерификацию катализируют кислые ПМЭ, а линейную щелочные изоформы. Активность ПМЭ увеличивается в присутствии дивалентных катионов и в еще большей степени в присутствии тривалентных катионов (Nari, Noat, and Ricard, 1991; Yoo et al., 2003).

После секвенирования генома арабидопсиса было обнаружено, 67 генов, которые содержат последовательности, характерные для ПМЭ (Theologis et al., 2000). Матричные РНК этих генов кодируют ПМЭ в форме предшественника ПМЭ Препропмэ. Аминокислотная последовательность Пре-участка содержит сигнальный пептид, который требуется для встраивания в эндоплазматический ретикулум. Сигнальный пептид имеет вначале положительно заряженные аминокислоты, затем трансмембранный домен и отрицательно заряженную аминокислотную последовательность. Такое строение характерно для белков со встраиванием в мембраны по второму типу, при котором N-конец полипептида находится в цитоплазме, а С-конец оказывается в люмене эндоплазматического ретикулума. Наличие у белка KDEL последовательности позволяет предположить, что далее ПМЭ идет в аппарат Гольджи, где происходит окончательное созревание белка. При секреции ПМЭ в клеточную стенку происходит отщепление ПреПро-области и в апопласте ПреПроПМЭ не обнаруживают.

При анализе последовательностей генов ПМЭ из арабидопсиса выяснилось, что их можно разделить па два класса (Gaffe, Tiznado, and Handa, 1997). Гены первого класса содержат только два-три интропа и имеют длинную про- область. Гены второго класса имеют пять-шесть интронов и имеют короткую про- область или не содержат её вовсе. ПМЭ второго класса имеют структуру, похожую на структуру ПМЭ фитопатогеиов (Christgau et al., 1996; Draborg et al., 1995) и участвуют в размягчении клеточной стенки (Duvetter et al., 2006). Выдвигаются различные гипотезы, зачем нужна про-область ПМЭ. Согласно компьютерному анализу третичная структура про-области похожа на ингибитор иивертаз (Rausch and Greiner, 2004). Таким образом, ПМЭ секретируется в клеточную стенку в неактивном состоянии, т.к. ферментативная часть связана со своим же ингибитором в соотношении 1:1 (Di Matteo et al., 2005). Пектины секретируются в клеточную стенку по тому же секреторному пути, что и ПМЭ, поэтому Про- область, являясь ингибитором, предотвращает преждевременную деэстерификацию Сахаров (Camardella et al., 2000). ПМЭ фитопатогеиов не имеют про- областей, т.к. они не секретируют пектины (Khanh et al., 1991). Другая гипотеза предполагает, что про- область может служить шапероном для правильной укладки ферментативной части. В наших экспериментах ПМЭ с делениями в про- области не обладали ферментативной активностью, поэтому можно предположить, что существуют различные способы сборки ПМЭ фитопатогеиов и ПМЭ растений.

11.1.5. Трехмерная реконструкция ферментативной части ПМЭ.

Ферментативная часть ПМЭ имеет размер 33-35 кДа и представляет собой бочкообразную глобулу, сложенную из 29 р-слобв, на С-конце имеются 3 fit-спирали, Такая структура характерна для бактериальных и растительных ферментов, гидролизующих пектины: пектин лиаз, пектат лиаз, полигалактуроназ и рамногалактуроназ (Ding et al., 2002). Вдоль молекулы фермента проходит желобок, образованный Р-слоями. Он является местом связывания субстрата - полигалактуроновой цепи рис. (10). В средней части желобка расположены остатки ароматических аминокислот, которые связывают карбогидраты: Phe84, Туг139, Phel60, Tyr222, Trp227, Phe250 и

Рис. 10.Трехмерная модель зрелой части ПМЭ моркови (Daucus at rota полученная на основе кристаллограммы.

В узкой части субстрат-связывающего желобка, находится активный центр фермента. В него входят две карбогидрат-связываюгцие аминокислоты Asp 136 и Asp 157 и пять аминокислот активного центра: Gin 113, Gin 135, Phe 160, Arg 225 и Trp 227, которые осуществляют реакцию деметилирование (рис. 11).

Тгр252.

Рис. 11. Реконструкция активного центра ПМЭ, взаимодействующего с метилированной галактуроновой кислотой (Johansson et al., 2002).

11.1.6. Взаимодействие ПМЭ с транспортным белком вируса табачной мозаики.

Во время вирусной инфекции вирусы растений в своей транспортной форме переходят из клетки в клетку через особые межклеточные контакты -плазмодемы, пока они не достигают сосудистой системы. Считается, что движение вирусов по сосудам, которое называется дальним транспортом, осуществляется пассивным способом (Leisner and Howell, 1993) вместе с током клеточных Сахаров, которые синтезируются в процессе фотосинтеза. В противоположность дальнему транспорту, межклеточный (ближний) транспорт осуществляется активно. Вирус, попадая в клетку, взаимодействует с клеточными белками плазмодесм (Carrington et al., 1996). Это взаимодействие осуществляется транспортными вирусными белками. Вирус табачной мозаики табака (ВТМ) имеет один транспортный белок (ТБ), в отличие от, например, Х-вируса картофеля, которому для межклеточного транспорта необходимо четыре белка (Howard et al., 2004; Schepetilnikov et al., 2005; Tamai and Meshi, 2001). Транспортный белок ВТМ наиболее детально изучен в настоящее время. Было показано, что ТБ локализуется в плазмодемах (Atkins et al., 1991; Ding et al., 1992) и увеличивает их пропускную способность. Кроме этого, ТБ ВТМ способен кооперативно связываться с однонитевыми нуклеотидными цепочками (Citovsky et al., 1990; Citovsky et al., 1992; Kiselyova et al., 2001) и взаимодействовать с элементами клеточного цитоскелета. Исходя из этих данных считается, что ТБ переносит вирусную РНК из зон репликации в соседние клетки, используя клеточный цитоскелет и увеличивая просвет каналов плазмозмодесм (Citovsky and Zambryski, 1993; Ghoshroy et al., 1997). Из работ (Dorokhov et al., 1999) и (Chen et al, 2000) известно, что, помимо взаимодествия с белками цитоскелета (Heinlein et al., 1995; McLean, Zupan, and Zambryski, 1995) транспортный белок ВТМ взаимодествует белком клеточной стенки - пектинметилэстеразой (рис.12). Транспортный белок ВТМ также связывается с ПМЭ и в дрожжевой двугибридной системе, причем связываются только функционально-активные по транспорту мутанты ТБ (Chen et al., 2000).

BSA > ззк ■»

14.4K

Рис. 12. Элюция фракции белков из клеточных стенок с ТБ-аффинной колонки. На фотографии ПААГ геля, окрашенного Кумасси, изображена 1М NaCl. На третьей дорожке видна двойная зона, которая соответствует молекулярной массе ЗЗкДа. Белки из двойной зоны были выделены и секвенированы. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов из этих зон показало, что они имеют гомологию с аминокислотной последовательностью ПМЭ (Dorokhov et al., 1999).

Рис. 13. Электронная микрофотография среза клеточной стенки, который был обработан антителами к ПМЭ, конъюгированных с золотом. Детекция ПМЭ в клеточной стенке мезофильных клеток табака. V-вакуоль, PD-плазмодемата, CW-клеточная стенка, CHL-хлоропласт, N-ядро, С-цитоплазма (Chen et al., 2000).

На рис. 13 хорошо заметна повышенная концентрация ПМЭ в районе плазмодесмы, где локализуется и ТБ ВТМ она выше, чем в окружающей ее клеточной стенке

11.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ У РАСТЕНИЙ

В последние несколько лет в научной литературе (и обществе) широко обсуждается явление, получившее название умолкание (gene silencing) генов (УГ), которое является нуклеотид-специфическим механизмом регуляции транскриптома эукариот. Интерес общества к УГ, в частности, выражается также и в том, что Нобелевская премия по медицине за 2006 год была присуждена Эндрю Файр (Andrew Z. Fire) и Крэйг Меллоу (Craig С. Mello) за открытие РНК-интерференции у нематоды (Caenorhabditis elegans).

Однако все началось гораздо раньше. Давид Болкомб вспомнил (Baulcombe, 2004), что в 1928 году уже описывались растения табака, инфицированных вирусом кольцевой пятнистости табака, у которых верхние неинокулированные листья не содержали вируса и были устойчивы к заражению. Это типичное проявление умолкания генов.

В последующие годы многие фитовирусологи наблюдали подобные проявления вирусной инфекции. Все они подробно описаны в монографии Мэтыоза, настольной книги вирусологов. Однако систематическое изучение УГ началось тогда, когда стал популярным метод получения трансгенных растений. Тогда же исследователи столкнулись с неожиданным и неприятным явлением. У некоторых линий растений, в геном которых были встроены чужеродные или гомологичные гены, не удавалось обнаружить мРНК этих генов. В 1990 году в лаборатории Йоргенесена (Napoli, Lemieux, and Jorgensen, 1990) было показано, что если в растение встроен ген, например эндогенной нитритредуктазы (Nia), т.е. как бы увеличена доза гена, то вместо ожидаемого увеличения уровня транскрипции, количество мРНК Nia в клетке падало в 50 раз по сравнению с нетрапсгениым контролем (Vaucheret et al., 1997; Vaucheret et al., 1995). Тогда же были введены термины косупрессия и УГ. Другой важный факт был обнаружен, когда стали реализовывать идеи Санфорда и Джонсона, предложивших в 1985 году получать устойчивые к вирусу растения, вводя в его геном фрагменты вирусного генома. В 1992 году в лаборатории Дагерти было показано, что введение в геном табака нетранслируемого фрагмента потивируса приводило к антивирусной устойчивости, сопровождающейся разрушением вирусной РНК (Lindbo and Dougherty, 1992). Через несколько лет в лаборатории Давида Болкомба было сделано важное открытие: при УГ разрушение РНК приводит к накоплению специфических коротких (21-25 нт) двухнитевых РНК (днРНК, short/small interfering РНК, siPHK)(Baulcombe, 1996). С этой работы и началось систематическое изучение УГ растений. Явление УГ включает в себя разнообразные механизмы контроля транскриптома хозяина и патогена, выражающееся в подавлении транскрипции, снижении стабильности мРНК и в ингибировании ее трансляции (Brodersen and Voinnet, 2006). Для всех этих процессов характерно: (а) образование днРНК или мРНК со «шпилечными» структурами (Engdahl, Hjalt, and Wagner, 1997), (б) специфическое нарезание длинных днРНК или мРНК со «шпилечными» структурами на короткие днРНК с помощью дайсера (Finnegan, Margis, and Waterhouse, 2003), и (в) разрушение или ипгибировапие трансляции мРНК-или вирусной РНК-мишени в специфических РНП-комплексах, «индуцируемых РНК комплексах УГ» (ИРКУГ) (Табл. 2).

В этой части обзора будут рассмотрены основные механизмы УГ, а также клеточные (Табл. 2) и вирусные факторы (Табл. 5), участвующие в этих процессах.

Табл. 2. Клеточные факторы умолкания генов.

Белок Домены и мотивы Биохимическая активность Метаболическая цепь

AG01 AG04 DCL1 DCL2 DCL3 DCL4 HEN1 PAZ, PIWI PAZ, PIWI РНКаза III, днРНК-связывание, хеликаза cDEAD- боксом, PAZ, DUF283 РНКаза III, днРНК- связывание, PAZ РНКаза III, днРНК-связывание, PAZ РНКаза III хеликаза днРНК- связывание PAZ Связывание днРНК, связывание S-аденозила Разрезание мРНК в месте комплементарного взаимодействия мРНК и siPHK/ miPHK в ИРКУГ Синтез miPHK Синтез 21-нт siPHK Синтез 24-нт siPHK Синтез 21-нт siPHK РНК- метилтрансфераза miPHK, S-PTGS, ta-siPHK, хроматин* хроматин miPHK, nat-siPHK вирусная днРНК, nat-siPHK хроматин ta-siPHK IR-PTGS S-PTGS на всех уровнях УГ

HST Связывание гомолог miPHK

HASTY) RanGTP экспортина 5 животных

HYL1 Связывание miPHK днРНК Связывание днРНК

МЕТ1 Цитозин-ДНК- Цитозин-ДНК- хроматин метилтрансфераза метилтрансфераза

NRPDla РНК-полимераза РНК-полимераза хроматин nat-siPHK

NRPDlb РНК-полимераза РНК-полимераза хроматин

NRPD2 РНК-полимераза РНК-полимераза хроматин

RDR6 RdRP RdRP S-PTGS транзитивность,

SGS3 Функция Coiled- ta-siPHK, coil, nat-siPHK, связывание S-PTGS

ИОНОВ Ztl

11.2.1. Короткие двухнитевые РНК (siPHK, miPHK, ta-siPHK) - основные участники УГ.

Известно, по крайней мере, три механизма УГ в растении: (а) цитоплазматическое умолкание РНК, сопровождающееся образованием siPHK; (б) умолкание эндогенной мРНК с помощью специфических коротких двухпитевых микроРНК (miPHK) и (в) метилирование ДНК и подавление транскрипции.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Скурат, Евгений Владимирович

VI. выводы.

1. Проведено выделение полноразмерной кДНК гена ПМЭ табака, определены структурные элементы, ответственные за функциональную активность ПМЭ.

2. Для изучения роли ПМЭ в репродукции вирусов разработан метод транзиентной (временной) репродукции ВТМ и ХВК при агроинфекции листьев Nicotiana benthamiana, позволяющий изучать уровень репродукции вирусов по способности накапливать в клетках зеленый флуоресцентный белок ЗФБ.

3. Показано, что только секретируемая и ферментативно-активная ПМЭ подавляет репродукцию ВТМ. Этот процесс сопровождается интенсивным разрушением вирусной РНК с одновременным накоплением коротких интерферирующих РНК (siPHK).

4. ПМЭ подавляет репродукцию ХВК, когда его белок 25 кДа ТБГ1, ответственный за подавление умолкания РНК, инактивирован.

6. Показано, что ПМЭ вызывает активацию ядерного фермента дайсера DCL1, ответственного за образование коротких клеточных днРНК (miPHK). ПМЭ вызывает накопление ядерного DCL1 в цитоплазме клеток.

7. Показано, что ПМЭ стимулирует процессинг miPHK.

8. РНК-предшественник miPHK как субстрат DCL1, снимает ингибирующий эффект ПМЭ в репродукции вируса.

9. Показана взаимосвязь между биогенезом miPHK и репродукцией ВТМ: оба процесса, по-видимому, конкурируют за DCL1.

Благодарности

С большим удовольствием приношу искренюю благодарность за постоянную помощь, поддержку и внимание к моей работе Иосифу Григорьевичу Атабекову. Я глубоко признателен своему научному руководителю Юрию Леонидовичу Дорохову за бесценную помощь и неустанную поддержку, оказанную мне в течение многолетней работы. Свою признательность я выражаю всем коллегам, с которыми я работал в течение многих лет: Ольге Фроловой и Тане Гасановой за непосредственное участие и помощь в проведении многих экспериментов; Петру Иванову и Максиму Скулачеву за участие в обсуждении результатов и их интерпретации; Виктору Константиновичу Новикову за оказанные мне консультации в процессе работы; Лидии Германовне Тюлькиной за доброжелательное отношение к моей работе; Виктору Равину за ценные советы по использованию фаговой библиотеки, а также Виктору Климуку (ФРГ) за помощь в работе. Благодарен всем сотрудникам кафедры вирусологии за помощь и доброжелательное отношение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скурат, Евгений Владимирович, Москва

1. Allen, Е., Xie, Z., Gustafson, А. М., and Carrington, J. С. (2005).microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121(2), 207-21.

2. Anisimov, A. V., Sorokina, N. Y., and Dautova, N. R. (1998). Water diffusion in biological porous systems: a NMR approach. Magn Reson Imaging 16(5-6), 565-8.

3. Arancibia, R. A., and Motsenbocker, С. E. (2006). Pectin methylesterase activity in vivo differs from activity in vitro and enhances polygalacturonase-mediated pectin degradation in tabasco pepper. J Plant Physiol 163(5), 488-96.

4. Atkins, D., Hull, R., Wells, В., Roberts, K., Moore, P., and Beachy, R. N. (1991). The tobacco mosaic virus 30K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. J Gen Virol 72 ( Pt 1), 209-11.

5. Bailey, R. W., Chesson, A., and Monro, J. (1978). Plant cell wall fractionation and structural analysis. Am J Clin Nutr 31(10 Suppl), S77-S81.

6. Baskin, Т. I. (2005). Anisotropic expansion of the plant cell wall. Annu Rev Cell Dev Biol 21,203-22.

7. Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431(7006), 356-63.

8. Baulcombe, D. C. (1996). RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants. Plant Mol Biol 32(1-2), 79-88.

9. Baulcombe, D. C., Chapman, S., and Santa Cruz, S. (1995). Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J 7(6), 1045-53.

10. Baumberger, N., and Baulcombe, D. C. (2005). Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Sheer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 102(33), 11928-33.

11. Bayne, E. H., Rakitina, D. V., Morozov, S. Y., and Baulcombe, D. C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression ofRNA silencing. Plant J 44(3), 471-82.

12. Bednarska, E., Lenartowska, M., and Niekras, L. (2005). Localization of pectins and Ca2+ ions in unpollinated and pollinated wet (Petunia hybrida Hort.) and dry (Haemanthus albiflos L.) stigma. Folia Histochem Cytobiol 43(4), 249-59.

13. Belostotsky, D. (2004). mRNA turnover meets RNA interference. Mo I Cell 16(4), 498-500.

14. Berna, A., Gafny, R., Wolf, S., Lucas, W. J., Holt, C. A., and Beachy, R. N. (1991). The TMV movement protein: role of the C-terminal 73 amino acids in subcellular localization and function. Virology 182(2), 682-9.

15. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409(6818), 363-6.

16. Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12(22), 8711-21.

17. Bollman, К. M., Aukerman, M. J., Park, M. Y., Hunter, C., Berardini, T. Z., and Poethig, R. S. (2003). HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase change and morphogenesis. Development 130(8), 1493-504.

18. Borsani, O., Zhu, J., Verslues, P. E., Sunkar, R., and Zhu, J. K. (2005). Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123(7), 1279-91.

19. Bosch, M., Cheung, A. Y., and Hepler, P. K. (2005). Pectin methylesterase, a regulator of pollen tube growth. Plant Physiol 138(3), 1334-46.

20. Bouche, N., Lauressergues, D., Gasciolli, V., and Vaucheret, H. (2006). An antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. Embo J 25(14), 3347-56.

21. Bowman, J. L. (2004). Class III HD-Zip gene regulation, the golden fleece of ARGONAUTE activity? Bioessays 26(9), 938-42.

22. Brodersen, P., and Voinnet, O. (2006). The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet 22(5), 268-80.

23. Brummell, D. A., and Harpster, M. H. (2001). Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants. Plant Mol Biol 47(1-2), 311-40.

24. Canizares, M. C., Taylor, К. M., and Lomonossoff, G. P. (2004). Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic virus are required for suppression of silencing. J Gen Virol 85(Pt 11), 34315.

25. Capel, F., Nicolai, Т., Durand, D., Boulenguer, P., and Langendorff, V. (2005). Influence of chain length and polymer concentration on the gelation of (amidated) low-methoxyl pectin induced by calcium. Biomacromolecules 6(6), 2954-60.

26. Cardon, G. H., Hohmann, S., Nettesheim, K., Saedler, H., and Huijser, P. (1997). Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3: a novel gene involved in the floral transition. Plant J \ 2(2), 367-77.

27. Carpita, N. C., and Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J 3(1), 1-30.

28. Carrington, J. С., Kasschau, К. D., Mahajan, S. K., and Schaad, M. C. (1996). Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell 8(10), 1669-1681.

29. Chan, S. W., Zilberman, D., Xie, Z., Johansen, L. K., Carrington, J. C., and Jacobsen, S. E. (2004). RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303(5662), 1336.

30. Chapman, S., Kavanagh, Т., and Baulcombe, D. (1992). Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J 2(4), 549-57.

31. Chen, J., Li, W. X., Xie, D., Peng, J. R., and Ding, S. W. (2004). Viral virulence protein suppresses RNA silencing-mediated defense but upregulates the role of microrna in host gene expression. Plant Cell 16(5), 1302-13.

32. Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A. K., and Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. Embo с/19(5), 913-20.

33. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., and Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell 60(4), 637-47.

34. Citovsky, V., Wong, M. L., Shaw, A. L., Prasad, В. V., and Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virusmovement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell 4(4), 397-411.

35. Citovsky, V., and Zambryski, P. (1993). Transport of nucleic acids through membrane channels: snaking through small holes. Annu Rev Microbiol 47, 167-97.

36. Cohen, Y., Gisel, A., and Zambryski, P. C. (2000). Cell-to-cell and systemic movement of recombinant green fluorescent protein-tagged turnip crinkle viruses. Virology 273(2), 258-66.

37. Cohen, Y., Qu, F., Gisel, A., Morris, T. J., and Zambryski, P. C. (2000). Nuclear localization of turnip crinkle virus movement protein p8. Virology 273(2), 276-85.

38. Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line. Genes Dev 14(13), 1578-83.

39. Di Matteo, A., Giovane, A., Raiola, A., Camardella, L., Bonivento, D., De Lorenzo, G., Cervone, F., Bellincampi, D., and Tsernoglou, D. (2005).

40. Structural basis for the interaction between pectin methyl esterase and a specific inhibitor protein. Plant Cell 17(3), 849-58.

41. Ding, В., Haudenshield, J. S., Hull, R. J., Wolf, S., Beachy, R. N., and Lucas, W. J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell 4(8), 915-28.

42. Ding, J. L., Hsu, J. S., Wang, M. M., and Tzen, J. T. (2002). Purification and glycosylation analysis of an acidic pectin methylesterase in jelly fig (Ficus awkeotsang) achenes. JAgric Food Chem 50(10), 2920-5.

43. Dlakic, M. (2006). DUF283 domain of Dicer proteins has a double-stranded RNA-binding fold. Bioinformatics.

44. Dobies, M., Kozak, M., and Jurga, S. (2004). Studies of gelation process investigated by fast field cycling relaxometry and dynamical rheology: the case of aqueous low methoxyl pectin solution. Solid State Nucl Magn Reson 25(1-3), 188-93.

45. Dorokhov, Y. L., Skulachev, M. V., Ivanov, P. A., Zvereva, S. D., Tjulkina, L. G., Merits, A., Gleba, Y. Y., Hohn, Т., and Atabekov, J. G. (2002).

46. Polypurine (A)-rich sequences promote cross-kingdom conservation of internal ribosome entry. Proc Natl Acad Sci USA 99(8), 5301-6.

47. Draborg, H., Kauppinen, S., Dalboge, H., and Christgau, S. (1995). Molecular cloning and expression in S. cerevisiae of two exochitinases from Trichoderma harzianum. Biochem Mol Biol Int 36(4), 781-91.

48. Dunoyer, P., Himber, C., and Voinnet, O. (2005). DICER-LIKE 4 is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal. Nat Genet 37(12), 1356-60.

49. Dunoyer, P., and Voinnet, 0. (2005). The complex interplay between plant viruses and host RNA-silencing pathways. Curr Opin Plant Biol 8(4), 41523.

50. Duvetter, Т., Fraeye, I., Sila, D. N., Verlent, I., Smout, C., Hendrickx, M., and Van Loey, A. (2006). Mode of de-esterification of alkaline and acidic pectin methyl esterases at different pH conditions. J Agric Food Chem 54(20), 7825-31.

51. Ebhardt, H. A., Thi, E. P., Wang, M. В., and Unrau, P. J. (2005). Extensive 3' modification of plant small RNAs is modulated by helper component-proteinase expression. Proc Natl Acad Sci USA 102(38), 13398-403.

52. Engdahl, H. M., Hjalt, T. A., and Wagner, E. G. (1997). A two unit antisense RNA cassette test system for silencing of target genes. Nucleic Acids Res 25(16), 3218-27.

53. Engelsen, S. В., Cros, S., Mackie, W., and Perez, S. (1996). A molecular builder for carbohydrates: application to polysaccharides and complex carbohydrates. Biopolymers 39(3), 417-33.

54. Epel, B. L., Padgett, H. S., Heinlein, M., and Beachy, R. N. (1996). Plant virus movement protein dynamics probed with a GFP-protein fusion. Gene 173(1 Spec No), 75-9.

55. Fagard, M., and Vaucheret, H. (2000). (TRANS)GENE SILENCING IN PLANTS: How Many Mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51,167-194.

56. Finnegan, E. J., Margis, R., and Waterhouse, P. M. (2003). Posttranscriptional gene silencing is not compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE 1) mutant, a homolog of Dicer-1 from Drosophila. Curr Biol 13(3), 236-40.

57. Frenkel, C., Peters, J. S., Tieman, D. M., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1998). Pectin methylesterase regulates methanol and ethanol accumulation in ripening tomato (Lycopersicon esculentum) fruit. J Biol Chem 273(8), 4293-5.

58. Fridborg, I., Grainger, J., Page, A., Coleman, M., Findlay, K., and Angell, S. (2003). TIP, a novel host factor linking callose degradation with the cell-to-cell movement of Potato virus X. Mol Plant Microbe Interact 16(2), 132-40.

59. Fry, S. C. (1994). Plant cell expansion. Unzipped by expansins. Curr Biol 4(9), 815-7.

60. Gaffe, J., Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Pectin Methylesterase Isoforms in Tomato (Lycopersicon esculentum) Tissues (Effects of Expression of a Pectin Methylesterase Antisense Gene). Plant Physiol 105(1), 199-203.

61. Gaffe, J., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1997). Characterization and functional expression of a ubiquitously expressed tomato pectin methylesterase. Plant Physiol 114(4), 1547-56.

62. Gafny, R., Lapidot, M., Berna, A., Holt, C. A., Deom, С. M., and Beachy, R. N. (1992). Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology 187(2), 499-507.

63. Gao, M. J., Parkin, I., Lydiate, D., and Hannoufa, A. (2004). An auxin-responsive SCARECROW-like transcriptional activator interacts with histone deacetylase. Plant Mol Biol 55(3), 417-31.

64. Gasciolli, V., Mallory, A. C., Bartel, D. P., and Vaucheret, H. (2005). Partially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs. Curr Biol 15(16), 1494-500.

65. Gatfield, D., and Izaurralde, E. (2002). REFl/Aly and the additional exon junction complex proteins are dispensable for nuclear mRNA export. J Cell Biol 159(4), 579-88.

66. Gazzani, S., Lawrenson, Т., Woodward, C., Headon, D., and Sablowski, R. (2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis. Science 306(5698), 1046-8.

67. Ghoshroy, S., Lartey, R., Sheng, J., and Citovsky, V. (1997). Transport of Proteins and Nucleic Acids through Plasmodesmata. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 27-50.

68. Gleba, Y., Klimyuk, V., and Marillonnet, S. (2005). Magnifection-a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23(17-18), 2042-8.

69. Gleba, Y., Marillonnet, S., and Klimyuk, V. (2004). Engineering viral expression vectors for plants: the 'full virus' and the 'deconstructed virus' strategies. Curr Opin Plant Biol 7(2), 182-8.

70. Goelet, P., Lomonossoff, G. P., Butler, P. J., Akam, M. E., Gait, M. J., and Kam, J. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 79(19), 5818-22.

71. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, С. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287(5462), 2494-7.

72. Guo, H. S., Fei, J. F., Xie, Q., and Chua, N. H. (2003). A chemical-regulated inducible RNAi system in plants. Plant J 34(3), 383-92.

73. Hartmann, E., Rapoport, T. A., and Lodish, H. F. (1989). Predicting the orientation of eukaryotic membrane-spanning proteins. Proc Natl Acad Sci USA 86(15), 5786-90.

74. Hartmann, E., Wiedmann, M., and Rapoport, T. A. (1989). A membrane component of the endoplasmic reticulum that may be essential for protein translocation. Embo J 8(8), 2225-9.

75. Heinlein, M., Epel, В. L., Padgett, H. S., and Beachy, R. N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science 270(5244), 1983-5.

76. Henderson, I. R., Zhang, X., Lu, C., Johnson, L., Meyers, В. C., Green, P. J., and Jacobsen, S. E. (2006). Dissecting Arabidopsis thaliana DICER function in small RNA processing, gene silencing and DNA methylation patterning. Nat Genet 38(6), 721-5.

77. Himber, C., Dunoyer, P., Moissiard, G., Ritzenthaler, C., and Voinnet, 0. (2003). Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. EmboJ 22(17), 4523-33.

78. Ho, Т., Pallett, D., Rusholme, R., Dalmay, Т., and Wang, H. (2006). A simplified method for cloning of short interfering RNAs from Brassica juncea infected with Turnip mosaic potyvirus and Turnip crinkle carmovirus. J Virol Methods 136(1-2), 217-23.

79. Huettel, В., Kanno, Т., Daxinger, L., Aufsatz, W., Matzke, A. J., and Matzke, M. (2006). Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis. EmboJ 25(12), 2828-36.

80. Iwai, H., Masaoka, N., Ishii, Т., and Satoh, S. (2002). A pectin glucuronyltransferase gene is essential for intercellular attachment in the plant meristem. Proc Natl Acad Sci USA 99(25), 16319-24.

81. Janowski, B. A., Huffman, К. E., Schwartz, J. C., Ram, R., Nordsell, R., Shames, D. S., Minna, J. D., and Corey, D. R. (2006). Involvement of AGOl and AG02 in mammalian transcriptional silencing. Nat Struct Mol Biol 13(9), 787-92.

82. Johansson, K., El-Ahmad, M., Friemann, R., Jornvall, H., Markovic, O., and Eklund, H. (2002). Crystal structure of plant pectin methylesterase. FEBS Lett 514(2-3), 243-9.

83. Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas, A., Jr., Zhu, J. K., Staskawicz, B. J., and Jin, H. (2006). A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc Natl Acad Sci USA.

84. Kavi, H. H., Fernandez, H. R., Xie, W., and Birchler, J. A. (2005). RNA silencing in Drosophila. FEBS Lett 579(26), 5940-9.

85. Keller, В., and Lamb, C. J. (1989). Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Dev 3(10), 1639-46.

86. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans. Nature 404(6775), 296-8.

87. Khanh, N. Q., Ruttkowski, E., Leidinger, K., Albrecht, H., and Gottschalk, M. (1991). Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene 106(1), 71-7.

88. Kim, J., and Kim, H. Y. (2006). Molecular characterization of a bHLH transcription factor involved in Arabidopsis abscisic acid-mediated response. Biochim Biophys Acta 1759(3-4), 191-4.

89. Kim, J. H., Choi, D., and Kende, H. (2003). The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis. Plant J 36(1), 94-104.

90. Kraft, E., Stone, S. L., Ma, L., Su, N., Gao, Y., Lau, O. S., Deng, X. W., and Callis, J. (2005). Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis. Plant Physiol 139(4), 1597-611.

91. Krishnamurthy, K., Heppler, M., Mitra, R., Blancaflor, E., Payton, M., Nelson, R. S., and Verchot-Lubicz, J. (2003). The Potato virus X TGBp3 protein associates with the ER network for virus cell-to-cell movement. Virology 309(1), 135-51.

92. Kubota, K., Tsuda, S., Tamai, A., and Meshi, T. (2003). Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing. J Virol 77(20), 11016-26.

93. Kurihara, Y., Takashi, Y., and Watanabe, Y. (2006). The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. Rna 12(2), 206-12.

94. Kurihara, Y., and Watanabe, Y. (2004). Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions. Proc Natl Acad Sci USA 101(34), 12753-8.

95. Kwong, R. W., Bui, A. Q., Lee, H., Kwong, L. W., Fischer, R. L., Goldberg, R. В., and Harada, J. J. (2003). LEAFY COTYLEDON 1-LIKE defines a class of regulators essential for embryo development. Plant Cell 15(1), 5-18.

96. Lartey, R., Ghoshroy, S., Ho, J., and Citovsky, V. (1997). Movement and subcellular localization of a tobamovirus in Arabidopsis. Plant J 12(3), 537-45.

97. Lartey, R. Т., Lane, L. C., and Melcher, U. (1994). Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch Virol 138(3-4), 287-98.

98. Lartey, R. Т., Voss, Т. C., and Melcher, U. (1995). Completion of a cDNA sequence from a tobamovirus pathogenic to crucifers. Gene 166(2), 331-2.

99. Lazo, G. R., Stein, P. A., and Ludwig, R. A. (1991). A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology (N Y) 9(10), 963-7.

100. Lecellier, С. H., Dunoyer, P., Arar, K., Lehmann-Che, J., Eyquem, S., Himber, C., Saib, A., and Voinnet, 0. (2005). A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 308(5721), 557-60.

101. Leisner, S. M., and Howell, S. H. (1993). Long-distance movement of viruses in plants. Trends Microbiol 1(8), 314-7.

102. Li, J., Yang, Z., Yu, В., Liu, J., and Chen, X. (2005). Methylation protects miRNAs and siRNAs from a З'-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr Biol 15(16), 1501-7.

103. Lindbo, J. A., and Dougherty, W. G. (1992). Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189(2), 725-33.

104. Lingel, A., Simon, В., Izaurralde, E., and Sattler, M. (2003). Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature 426(6965), 465-9.

105. Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X., and Ding, S. W. (2000). Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. Embo J 19(7), 1672-80.

106. Luo, M. L., Zhou, Z., Magni, K., Christoforides, C., Rappsilber, J., Mann, M., and Reed, R. (2001). Pre-mRNA splicing and mRNA export linked by direct interactions between UAP56 and Aly. Nature 413(6856), 644-7.

107. Lutz-Meindl, U., and Brosch-Salomon, S. (2000). Cell wall secretion in the green alga micrasterias. JMicrosc 198(Pt 3), 208-17.

108. MacDougall, A. J., Rigby, N. M., Ryden, P., Tibbits, C. W., and Ring, S. G. (2001). Swelling behavior of the tomato cell wall network. Biomacromolecules 2(2), 450-5.

109. MacKinnon, I. M., Jardine, W. G., O'Kennedy, N., Renard, С. M., and Jarvis, M. C. (2002). Pectic methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. JAgric Food Chem 50(2), 342-6.

110. Macrae, I. J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A. N., Cande, W. Z., Adams, P. D., and Doudna, J. A. (2006). Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311(5758), 195-8.

111. Makeyev, E. V., and Bamford, D. H. (2001). Primer-independent RNA sequencing with bacteriophage phi6 RNA polymerase and chain terminators. Rna 7(5), 774-81.

112. Makeyev, E. V., and Grimes, J. M. (2004). RNA-dependent RNA polymerases of dsRNA bacteriophages. Virus Res 101(1), 45-55.

113. Mallory, А. С., Bartel, D. P., and Bartel, B. (2005). MicroRNA-directed regulation of Arabidopsis AUXIN RESPONSE FACTOR17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes. Plant Cell 17(5), 1360-75.

114. Mallory, A. C., and Vaucheret, H. (2004). MicroRNAs: something important between the genes. Curr Opin Plant Biol 7(2), 120-5.

115. Marga, F., Grandbois, M., Cosgrove, D. J., and Baskin, Т. I. (2005). Cell wall extension results in the coordinate separation of parallel microfibrils: evidence from scanning electron microscopy and atomic force microscopy. Plant J 43(2), 181-90.

116. Margis, R., Fusaro, A. F., Smith, N. A., Curtin, S. J., Watson, J. M., Finnegan, E. J., and Waterhouse, P. M. (2006). The evolution and diversification of Dicers in plants. FEBS Lett 580(10), 2442-50.

117. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2005). Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat Biotechnol 23(6), 718-23.

118. Markovic, O., and Janecek, S. (2004). Pectin methylesterases: sequence-structural features and phylogenetic relationships. Carbohydr Res 339(13), 2281-95.

119. Martin, C., and Paz-Ares, J. (1997). MYB transcription factors in plants. Trends Genet 13(2), 67-73.

120. Marudova, M., MacDougall, A. J., and Ring, S. G. (2004). Pectin-chitosan interactions and gel formation. Carbohydr Res 339(11), 1933-9.

121. McFeeters, R. F., and Armstrong, S. A. (1984). Measurement of pectin methylation in plant cell walls. Anal Biochem 139(1), 212-7.

122. McGurl, В., Pearce, G., and Ryan, C. A. (1994). Polypeptide signalling for plant defence genes. Biochem Soc Symp 60,149-54.

123. McLean, В. G., Zupan, J., and Zambryski, P. C. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cells. Plant Cell 7(12), 2101-14.

124. McNeil, M., Darvill, A. G., Fry, S. C., and Albersheim, P. (1984). Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu Rev Biochem 53, 625-63.

125. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15(2), 185-97.

126. Meister, G., Landthaler, M., Peters, L., Chen, P. Y., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2005). Identification of novel argonaute-associated proteins. Curr Biol 15(23), 2149-55.

127. Mellersh, D. G., Foulds, I. V., Higgins, V. J., and Heath, M. C. (2002). H202 plays different roles in determining penetration failure in three diverse plant-fungal interactions. Plant J 29(3), 257-68.

128. Micheli, F. (2001). Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important roles in plant physiology. Trends Plant Sci 6(9), 414-9.

129. Mis, J., Ner, S. S., and Grigliatti, T. A. (2006). Identification of three histone methyltransferases in Drosophila: dG9a is a suppressor of PEV and is required for gene silencing. Mol Genet Genomics 275(6), 513-26.

130. Molnar, A., Csorba, Т., Lakatos, L., Varallyay, E., Lacomme, C., and Burgyan, J. (2005). Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly structured single-stranded viral RNAs. J Virol 79(12), 7812-8.

131. Moscatiello, R., Mariani, P., Sanders, D., and Maathuis, F. J. (2006). Transcriptional analysis of calcium-dependent and calcium-independent signalling pathways induced by oligogalacturonides. J Exp Bot 57(11), 2847-65.

132. Nakayashiki, H. (2005). RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett 579(26), 5950-7.

133. Napoli, С., Lemieux, С., and Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2(4), 279-289.

134. Nari, J., Noat, G., and Ricard, J. (1991). Pectin methylesterase, metal ions and plant cell-wall extension. Hydrolysis of pectin by plant cell-wall pectin methylesterase. Biochem J 279 ( Pt 2), 343-50.

135. Ndimba, В. K., Chivasa, S., Hamilton, J. M., Simon, W. J., and Slabas, A. R. (2003). Proteomic analysis of changes in the extracellular matrix of Arabidopsis cell suspension cultures induced by fungal elicitors. Proteomics 3(6), 1047-59.

136. Nemhauser, J. L., and Chory, J. (2005). A new FronTIR in targeted protein degradation and plant development. Cell 121(7), 970-2.

137. Oelofse, D., and Dubery, I. A. (1996). Induction of defence responses in cultured tobacco cells by elicitors from Phytophthora nicotianae. Int J Biochem Cell Biol 28(3), 295-301.

138. Padgett, H. S., Epel, B. L., Kahn, T. W., Heinlein, M., Watanabe, Y., and Beachy, R. N. (1996). Distribution of tobamovirus movement protein in infected cells and implications for cell-to-cell spread of infection. Plant J 10(6), 1079-88.

139. Papp, I., Mette, M. F., Aufsatz, W., Daxinger, L., Schauer, S. E., Ray,

140. A., van der Winden, J., Matzke, M., and Matzke, A. J. (2003). Evidence for nuclear processing of plant micro RNA and short interfering RNA precursors. Plant Physiol 132(3), 1382-90.

141. Parre, E., and Geitmann, A. (2005). Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta 220(4), 582-92.

142. Pfeffer, S., Dunoyer, P., Heim, F., Richards, К. E., Jonard, G., and Ziegler-Graff, V. (2002). P0 of beet Western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing. J Virol 76(13), 6815-24.

143. Phartiyal, P., Kim, W. S., Cahoon, R. E., Jez, J. M., and Krishnan, H.

144. B. (2006). Soybean ATP sulfurylase, a homodimeric enzyme involved in sulfur assimilation, is abundantly expressed in roots and induced by cold treatment. Arch Biochem Biophys 450(1), 20-9.

145. Pillai, R. S., Artus, C. G., and Filipowicz, W. (2004). Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. Rna 10(10), 1518-25.

146. Pirrotta, V., and Gross, D. S. (2005). Epigenetic silencing mechanisms in budding yeast and fruit fly: different paths, same destinations. Mol Cell 18(4), 395-8.

147. Preall, J. В., and Sontheimer, E. J. (2005). RNAi: RISC gets loaded. Cell 123(4), 543-5.

148. Qiu, W., Park, J. W., and Scholthof, H. B. (2002). Tombusvirus PI 9-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact 15(3), 269-80.

149. Qu, F., and Morris, T. J. (2005). Suppressors of RNA silencing encoded by plant viruses and their role in viral infections. FEBS Lett 579(26), 5958-64.

150. Rausch, Т., and Greiner, S. (2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochim Biophys Acta 1696(2), 253-61.

151. Reddy, M. S., Dinkins, R. D., and Collins, G. B. (2003). Gene silencing in transgenic soybean plants transformed via particle bombardment. Plant Cell Rep 21(7), 676-83.

152. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12(4), 340-9.

153. Roberts, K., Grief, C., Hills, G. J., and Shaw, P. J. (1985). Cell wall glycoproteins: structure and function. J Cell Sci Suppl 2, 105-27.

154. Roth, В. M., Pruss, G. J., and Vance, V. B. (2004). Plant viral suppressors of RNA silencing. Virus Res 102(1), 97-108.

155. Round, A. N., Rigby, N. M., MacDougall, A. J., Ring, S. G., and Morris, V. J. (2001). Investigating the nature of branching in pectin by atomic force microscopy and carbohydrate analysis. Carbohydr Res 331(3), 337-42.

156. Sarmiento, C., Gomez, E., Meier, M., Kavanagh, T. A., and Truve, E. (2006). Cocksfoot mottle virus PI suppresses RNA silencing in Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum. Virus Res.

157. Schauer, S. E., Jacobsen, S. E., Meinke, D. W., and Ray, A. (2002). DICER-LIKE1: blind men and elephants in Arabidopsis development. Trends Plant Sci 7(11), 487-91.

158. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993a). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties. J Biol Chem 268(16), 11851-7.

159. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993b). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. J Biol Chem 268(16), 11858-67.

160. Schiebel, W., Pelissier, Т., Riedel, L., Thalmeir, S., Schiebel, R., Kempe, D., Lottspeich, F., Sanger, H. L., and Wassenegger, M. (1998). Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10(12), 2087-101.

161. Shevchik, V. E., and Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (2003). PaeX, a second pectin acetylesterase of Erwinia chrysanthemi 3937. J Bacteriol 185(10), 3091-100.

162. Shivprasad, S., Pogue, G. P., Lewandowski, D. J., Hidalgo, J., Donson, J., Grill, L. K., and Dawson, W. O. (1999). Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. Virology 255(2), 312-23.

163. Simon-Mateo, C., and Garcia, J. A. (2006). MicroRNA-guided processing impairs Plum pox virus replication, but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism. J Virol 80(5), 2429-36.

164. Sleat, D. E., Gallie, D. R., Jefferson, R. A., Bevan, M. W., Turner, P. C., and Wilson, Т. M. (1987). Characterisation of the 5'-leader sequence oftobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. Gene 60(2-3), 217-25.

165. Steele, N. M., McCann, M. C., and Roberts, K. (1997). Pectin Modification in Cell Walls of Ripening Tomatoes Occurs in Distinct Domains. Plant Physiol 114(1), 373-381.

166. Stephenson, M. В., and Hawes, M. C. (1994). Correlation of Pectin Methylesterase Activity in Root Caps of Pea with Root Border Cell Separation. Plant Physiol 106(2), 739-745.

167. Takeda, A., Sugiyama, K., Nagano, H., Mori, M., Kaido, M., Mise, K., Tsuda, S., and Okuno, T. (2002). Identification of a novel RNA silencing suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Lett 532(1-2), 75-9.

168. Takeda, A., Tsukuda, M., Mizumoto, H., Okamoto, K., Kaido, M., Mise, K., and Okuno, T. (2005). A plant RNA virus suppresses RNA silencing through viral RNA replication. EmboJ24(\l), 3147-57.

169. Tamai, A., and Meshi, T. (2001). Cell-to-cell movement of Potato virus X: the role of pl2 and p8 encoded by the second and third open reading frames of the triple gene block. Mol Plant Microbe Interact 14(10), 1158-67.

170. Thakur, B. R., Singh, R. K., and Handa, A. K. (1997). Chemistry and uses of pectin--a review. Crit Rev Food Sci Nutr 37(1), 47-73.

171. Thomas, C. L., Leh, V., Lederer, C., and Maule, A. J. (2003). Turnipcrinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana. Virology 306(1), 33-41.

172. Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Reduction in Pectin Methylesterase Activity Modifies Tissue Integrity and Cation Levels in Ripening Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Fruits. Plant Physiol 106(2), 429-436.

173. Tieman, D. M., Harriman, R. W., Ramamohan, G., and Handa, A. K. (1992). An Antisense Pectin Methylesterase Gene Alters Pectin Chemistry and Soluble Solids in Tomato Fruit. Plant Cell 4(6), 667-679.

174. Timmermans, M. C., Maliga, P., Vieira, J., and Messing, J. (1990). The pFF plasmids: cassettes utilising CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. JBiotechnol 14(3-4), 333-44.

175. Truman, W., de Zabala, M. Т., and Grant, M. (2006). Type III effectors orchestrate a complex interplay between transcriptional networks to modify basal defence responses during pathogenesis and resistance. Plant J 46(1), 14-33.

176. Tyulkina, L. G., Skurat, E. V., Zvereva, A. S., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2006). Movement protein stimulates tobacco mosaic virus reproduction in infected cells. Dokl Biochem Biophys 409,253-6.

177. Ueki, S., and Citovsky, V. (2002). The systemic movement of a tobamovirus is inhibited by a cadmium-ion-induced glycine-rich protein. Nat Cell Biol 4(7), 478-86.

178. Ueki, S., and Citovsky, V. (2005). Identification of an interactor of cadmium ion-induced glycine-rich protein involved in regulation of callose levels in plant vasculature. Proc Natl Acad Sci USA 102(34), 12089-94.

179. Uhrig, J. F., Canto, Т., Marshall, D., and MacFarlane, S. A. (2004). Relocalization of nuclear ALY proteins to the cytoplasm by the tomato bushy stunt virus P19 pathogenicity protein. Plant Physiol 135(4), 2411-23.

180. Vaistij, F. E., Jones, L., and Baulcombe, D. C. (2002). Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell 14(4), 857-67.

181. Varner, J. E., and Lin, L. S. (1989). Plant cell wall architecture. Cell 56(2), 231-9.

182. Vaucheret, H., Mallory, A. C., and Bartel, D. P. (2006). AGOl homeostasis entails coexpression of MIR 168 and AGOl and preferential stabilization of miR168 by AGOl. Mol Cell 22(1), 129-36.

183. Vaucheret, H., Palauqui, J. С., Elmayan, Т., and Moffatt, B. (1995). Molecular and genetic analysis of nitrite reductase co-suppression in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet 248(3), 311-7.

184. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P., and Bartel, D. P. (2004). The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev 18(10), 1187-97.

185. Vazquez, F., Vaucheret, H., Rajagopalan, R., Lepers, C., Gasciolli, V., Mallory, A. C., Hilbert, J. L., Bartel, D. P., and Crete, P. (2004). Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol Cell 16(1), 69-79.

186. Voinnet, O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17(8), 449-59.

187. Voinnet, O. (2005a). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nat Rev Genet 6(3), 206-20.

188. Voinnet, O. (2005b). Non-cell autonomous RNA silencing. FEBS Lett 579(26), 5858-71.

189. Waring, D. A., and Kenyon, C. (1990). Selective silencing of cell communication influences anteroposterior pattern formation in C. elegans. Cell 60(1), 123-31.

190. Wassenegger, M., and Pelissier, Т. (1998). A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol 37(2), 349-62.

191. Wojtaszek, P. (1997). Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem J 322 ( Pt 3), 681-92.

192. Wright, S. I., and Gaut, B. S. (2005). Molecular population genetics and the search for adaptive evolution in plants. Mol Biol Evol 22(3), 506-19.

193. Wu, G., Kaper, J. M., and Jaspars, E. M. (1991). Replication of cucumber mosaic virus satellite RNA in vitro by an RNA-dependent RNA polymerase from virus-infected tobacco. FEBS Lett 292(1-2), 213-6.

194. Xie, Z., Allen, E., Fahlgren, N., Calamar, A., Givan, S. A., and Carrington, J. C. (2005a). Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiol 138(4), 2145-54.

195. Xie, Z., Allen, E., Wilken, A., and Carrington, J. C. (2005b). DICERLIKE 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 102(36), 12984-9.

196. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2(5), El 04.

197. Xie, Z., Kasschau, K. D., and Carrington, J. C. (2003). Negative feedback regulation of Dicer-Likel in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Curr Biol 13(9), 784-9.

198. Yamazaki, H., Tasaka, M., and Shikanai, T. (2004). PPR motifs of the nucleus-encoded factor, PGR3, function in the selective and distinct steps of chloroplast gene expression in Arabidopsis. Plant J 38(1), 152-63.

199. Yan, K. S., Yan, S., Farooq, A., Han, A., Zeng, L., and Zhou, M. M. (2003). Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature 426(6965), 468-74.

200. Ye, К., and Patel, D. J. (2005). RNA silencing suppressor p21 of Beet yellows virus forms an RNA binding octameric ring structure. Structure 13(9), 1375-84.

201. Yoo, S. H., Fishman, M. L., Savary, B. J., and Hotchkiss, А. Т., Jr. (2003). Monovalent salt-induced gelation of enzymatically deesterified pectin. J Agric Food Chem 51(25), 7410-7.

202. Yu, В., Chapman, E. J., Yang, Z., Carrington, J. C., and Chen, X. (2006). Transgenically expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in Arabidopsis. FEBSLett 580(13), 3117-20.

203. Zandueta-Criado, A., and Bock, R. (2004). Surprising features of plastid ndhD transcripts: addition of non-encoded nucleotides and polysome association of mRNAs with an unedited start codon. Nucleic Acids Res 32(2), 542-50.

204. Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299(5607), 716-9.

205. Zvereva, S. D., Ivanov, P. A., Skulachev, M. V., Klyushin, A. G., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2004). Evidence for contribution of an internal ribosome entry site to intercellular transport of a tobamovirus. J Gen Virol 85(Pt 6), 1739-44.

Информация о работе

Скурат, Евгений Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно