Структурные и функциональные особенности аргиназы печени лягушек RANA RIDIBUNDA в течении онтогенетического развития

Арцуни, Наталья Альфредовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные и функциональные особенности аргиназы печени лягушек RANA RIDIBUNDA в течении онтогенетического развития
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные особенности аргиназы печени лягушек RANA RIDIBUNDA в течении онтогенетического развития"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи УДК 576.85.5:577.15

АРЦРУНИ НАТАЛЬЯ АЛЬФРЕДОВНА

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АРГИНАЗЫ ПЕЧЕНИ ЛЯГУШЕК RANA RIDIBUNDA В ТЕЧЕНИЕ ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ

Q.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1997

<UDUUSU"br> AlTbPUTlbSnMíHmij 1|РШ1НЭ-Зиъ ЬЧ<1-МПМЕЬ31ГЪ Шиигигпма-зпкь ЬРЬЧЧЪЬ ilbSUWrb <UUTILUUPU"b

áhmuqpli (ipiuilniüpnil flhSa 576.85.5: 577.15

UPÜPÍlFbb "bUSULBU ЩЪРЬаГ»

RANA RIDIBUNDA Ч-ílPSh LaUPI-h UP<1-КЫШГ1 li LUl-flh34UÜ.fiU3 Kb

b<-L а>пкьчзмгии. ип-иъэъи^иБ^пмэ-зпьъъьре u"b<usuuu."b aupq-usuin, сгьошшпнг

Q-.00.04 - LfbQuuiplitiluu

i-ih(¡uuipiuüiul|tuü ti]imnipjniQGbp]i"phljüiu&nili q)iimul|iuQ шиифйшСф hiujgihuü luwbüiutununipjuiG

ubauuq.hr

bPbM.U"b- 1997

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факульте Ереванского государственного университета

Научные руководители: Академик HAH РА, профессо

Давтян М.

Кандидат биологических на;

Барсегян Э.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессс

Априкян Г.

Кандидат биологических на;

Алчуджян Н.'

Ведущая организация: Сельскохозяйственная Академия Республш

Армения, кафедра биохимии.

Защита состоится 1997г. в /^ часов на заседай*

специализированного Совета 051 при Ереванском государственно универагтете (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна 1, ЕрГУ, биологически факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванско) государственного университета

..f..

Автореферат разослан " Г " 1997г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук ^ С.А. Гонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и обоснование темы. Существенную роль в регуляции обмена веществ играют изоферменты, участвующие в различных биохимических процессах. В этом отношении большой интерес представляет выдвинутая Давтяном концепция о существовании в природе уреотелических и неу-реотелических изоэнзимов аргиназы с различными метаболическими функциями (Давтян, 1968, 1970; Давтян и др., 1970). Не вызывает сомнения то, что в течение онтогенетического развития организмов в процессе клеточной и тканевой дифференцировки с одной стороны постепенно реализуется генетическая информация в виде индукции биосинтеза различных белков, в том числе изоэнзимов, а с другой - непрерывно репрессируется биосинтез других.

Предыдущие исследования нашей лаборатории установили, что в ходе онтогенетического развития амфибий в период метаморфоза в печени индуцируется уреотелическая аргиназа, которая, функционируя совместно с четырьмя известными ферментами биосинтеза аргинина обуславливает формирование орнитинового цикла мочевинообразования. Таким образом, переход амфибий при метаморфозе от аммонотелизма к уреотелизму происходит, главным образом, за счет индукции нового изоэнзима аргиназы - уреотелического. Примечательно, что до метаморфоза в печени амфибий содержатся все 5 ферментов орнитинового цикла, но они не функционируют как единое целое, так как аргиназа является неуреотелической. Следовательно, является ошибочным мнение ряда авторов относительно решающей роли модификации существующей до метаморфоза аргиназы, а не de novo биосинтеза уреотелической аргиназы, в формировании уреотелиз-ма у амфибий (Mora е. а., 1965, 1966; Palacios е. а., 1969; Исаченков, Нестайко, 1971).

С целью подтверждения решающей роли индукции уреотелической аргиназы в механизме становления уреотелизма необходимы дополнительные углубленные исследования аргиназ до и после метаморфоза амфибий.

Существенным является выяснение структурных особенностей аргиназ до и после метаморфоза. В этом плане ценную информацию дает изучение процесса инактивирования аргиназы под влиянием кислой среды или хела-тирующих агентов (ЭДТА), когда фермент распадается на субъединицы, а также процесс реактивирования фермента при рН 9,5 в присутствии высоких концентраций Мгг', когда субъединицы реассоциируются в олигомер-ную структуру. Изучение механизмов указанных процессов инактивации и реактивации аргиназы включают вопросы участия ионов Мп2+ и функциональных групп (SH- и др.) в формировании олигомерной структуры и обеспечении активности фермента. Перед нами была поставлена задача выяснить особенности инактивирования и реактивирования аргиназы печени лягушек, а также провести сравнительное исследование этих процессов до и после метаморфоза лягушек. Мы преследовали цель новыми аргументами подтвердить наличие существенных различий между аргиназами печени до

и после метаморфоза лягушек, указывающие на различную их генетическую детерминированность и следовательно решающую роль индукции пру метаморфозе новой аргиназы.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является сравнительное изучение следующих вопросов изоэнзимов аргиназы печени лягушек Rana ridibunda до и после метаморфоза:

1. процесс инактивации под действием ЭДТА.

2. процесс инактивации под действием рН 3,6.

3. процессы реактивации предварительно инактивированных изоэнзимов.

4. диссоциация изоэнзимов на субъединицы при инактивации и реассоциа-ция последних в олигомерную структуру при реактивации.

5. роль ионов Mn2+, SH- и других групп в процессах инактивации и реактивации изоэнзимов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые аргиназе печени амфибий подвергнута углубленному изучению, в частности, выявлены особенности процесса инактивирования фермента при кислом рН и воздействии ЭДТА, а также реактивирования фермента при рН 9,5 в присутствии ионов марганца.

Впервые доказано, что механизмы инактивирования фермента различными способами различны и образующиеся при этом субъединицы значи тельно отличаются, особенно по роли SH-групп в проявлении их каталити ческой активности. Механизмы реактивации предварительно инактивиро ванной различными способами аргиназы также существенно различны и i результате образуются принципиально новые олигомерные структуры, от личающиеся от нативного олигомера.

Полученные результаты представляют определенный, на наш взгляд энзимологический интерес. До сих пор судили о процессах инактивации \ реактивации лишь по показателям активности фермента. Между тем, иссле дуя роли рН, температуры, ионов Мп2+, влияния тиоловых реагентов, моле кулярные веса субъединиц и олигомеров при инактивации различными спо собами и последующей реактивации аргиназы можно получить более углуб ленную информацию о структуре фермента.

Очевидно, примененные нами указанные подходы при изучении арги назы могут быть полезными при исследовании других ферментов.

Изучая процессы инактивации и реактивации аргиназы, а также значе ние ионов Мп2+ и SH-групп в этих процессах, удалось раскрыть существую щие различия между изоэнзимами аргиназы печени лягушек до и после ме таморфоза, которые неоспоримо доказывают их различную генетическук детерминированность. Очевидно, количественное соотношение изоэнзимо! меняется в течение онтогенеза механизмами индукции и репресии, в част ности, при метаморфозе индуцируется качественно новая аргиназа - урео телическая, играющая решающую роль в формировании уреотелизма.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на отчетных заседаниях кафедры биохимии.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, и списка использованной литературы, включающей 293 наименования. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 15 таблиц и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служили лягушки Rana ridibunda (лягушка озерная) весом 150-180 г. Гомогенизацию проводили в стеклянном гомогенизаторе типа Поттер-Эльведжема со стеклянным пестиком при температуре+4°С. В экспериментах использовали 2, 5% гомогенаты печени на дистиллированной воде или на 0,005 М трис-HCl буфере (pH 7.4) в зависимости от условий опыта.

Классификацию этапов развития головастиков проводили по Терентъе-ву (Терентьев, 1950). Классификация основана на на внешних морфологических характеристиках головастиков. Первые 19 стадий развития - эмбриональные. Номер стадии 30 соответствует началу истинного метаморфоза.

Апгиназнпя активность. Аргиназную активность определяли методом Ратнер (Ratner, Pappas, 1960) с небольшими изменениями путем инкубирования 1 мл ферментного препарата при 37°С в течение 60 мин. в 0,05М глициновом буфере (pH 9,5) в присутствии L-аргинина (50 мкмоль) и МпС12 [5 мкмоль). Далее определяли образовавшуюся при расщеплении субстрата мочевину методом Арчибальда (Archibald, 1956) в модификации Мооре и Кауфмана (Moore, Kaufman, 1970). Активность фермента выражали в мкмо-лях образовавшейся мочевины на 1г свежей ткани, в 1 мл экстракта фермента или на 1 г белка.

Определение мочевины. В пробирку со шлифованной пробкой наливали 1 мл ферментного препарата, 2,5 мл кислотной смеси (1 часта концентрированной Н3Р04 и 3 части концентрированной H2S04 в присутствии солей FeCl3, MnS04) и 0,25 мл 3% раствора диацетилмонооксима. Пробирки встряхивали, затем их содержимое кипятили в течение 45 мин. Далее охлажденные пробы калориметрировали на СФ-4А при длине волны 478 ммк против контроля на реактивы.

Определение белка проводили по методу Гровса и Девиса (Peterson, 1983), а также при 280 нм.

Гель-фильтрация экстрактов печени, полученных после 30 минутного центрифугирования при 2500Ö g проводилась на колонке с сефадексом G-150 (Sephadex G-150, "Pharmacia", Швеция). На колонку (1,5x63) наносили 2,5-3 мл экстракта гомогената. Уравновешивание и элюция 0,005 М трис-HCl буфером, pH 7,4. Скорость элюции 8 мл/час.

Ионообменная хроматография экстрактов печени проводилась на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (колонка 1,5x20см). Уравновешивание 0,005 М трис-HCl буфером, pH 7,4. Элюция градиентная растворами KCl в этом же буфере при постоянном повышении молярности от 0 до 0.35 М. Скорость

элюции 24 мл/час.

Определение молекулярной массы Молекулярная масса определялась методом гельфильтрации (Sephadex G-200, "Pharmacia", Швеция). Размеры колонки 1,5x40 см, объем элюции 5 мл.

Для определения значения Vc (свободный объем колонки) использовали 0,2 М раствор голубого декстрана (Blue dextran 2000, "Pharmacia", м.м. 2x10 дальтон). В качестве белков маркеров использовались уреаза из соевых бобов (м.м. 480000), дрожжевая алкогольдегидрогеназа (м.м. 150000), гемоглобин крови лошади (67000) и пепсин (м.м. 35000).

Величину Km по отношению к L-аргинину определяли графическим методом по Лайнуиверу-Бэрку (по Диксону). L-аргинин применяли в концентрациях 30, 60, 120, 300, 600 мкмоль на пробу.

Инактивацию аргиназы проводили в 0,05 М глицин-HCl буфере рН 3,6, а также при действии ЭДТА в конечной концентрации 5х10'2М.

Реактивацию предварительно инактивированной аргиназы проводили после нейтрализации инкубационной среды 0.05 М глицин-NaOH буфером рН 9,5 при температуре 37°С с добавлением ионов Мп2+ (25 мкмоль на 1 мл пробы).

При исследовании влияния различных концентраций ПХМБ на активность аргиназы печени головастиков были использованы концентрации 1, 3, 5 мкмоль ПХМБ на пробу. Фермент предварительно выдерживался в течение 1 часа с ПХМБ (в вышеуказанных концентрациях) при комнатной температуре и рН 9,5. Затем ПХМБ добавлялся и в инкубационные пробы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Инактивация при рН 3,6 пли возасйствии ЭДТА и реактивация ' аргиназы печени лягушки Лапа ridibunda

1.1. Влияние ЭДТА и рН 3,6 на активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda

В первой серии экспериментов определялось время инактивирования экстракта аргиназы печени лягушек Rana ridibunda при рН 3,6 и действии ЭДТА. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Инактивирование аргиназы печени лягушек Rana ridibunda

Способ инактивации Активность аргиназы, мкмоль/г

исходная активность через 2 часа через 22 часа % инактивации

рН 3,6 30000±223,6 19200+446 4734±165,6 85

ЭДТА(рН 7,4) 29600±440,4 2140±155,8 - 92.8

Почти полное инактивирование экстракта аргиназы печени при рН 3,6 наблюдалось к 22 часу инкубации (на 85%), при действии же ЭДТА в конечной концентрации 5 х 10"2 М (рН 7,4) - через 2 часа (на 92.8%).

Такая быстрая инактивация фермента в присутствии ЭДТА свидетельствует, вероятно, об относительно непрочной связи Мп24 с субъединицами аргиназы и о легкой диссоциации этих ионов при их поверхностном расположении на аргиназе.

С целью выяснения роли ионов Мп2+ в процессе инактивации проводилась предварительная предынкубация проб с Мп2 + . Как показали результаты исследования (таблица 2), в случае кислотной инактивации присутствие ионов марганца не предотвращает инактивацию фермента.

Таблица 2.

Роль ионов Мп2+ в процессе ииактивирования аргиназы печени лягушки Rana ridibunda при рН 3,6 и действии ЭДТА

Проба Активность аргиназы, мкмоль/г

исходная активность через 2 часа через 22 часа %ингиби-рования

рН 3,6 30000±223.6 192001446 47341165,6 85

Предынкубация с Мп Ю'(рН 3,6) 30000+223,6 106801544 4760+374 85

ЭДТА (рН 7,4) 290001451.7 2140±155,8 - 92,6

Предынкубация с Мп Ю'(ЭДТА) 29600±440,45 162801382,4 - 45

В варианте же с ЭДТА наблюдается иная картина. Как показали результаты исследований, представленные в таблице 3, предынкубация с марганцем предотвращала инактивацию на 55%.

Предотвращение инактивации фермента ЭДТА при предынкубации с Мп2+ на 55% вероятно связано с тем, что в аргиназе печени лягушек Rana ridibunda, как было показано ранее методом ЭПР, обнаруживаются 2 типа ионов марганца, отличающихся по белковому окружению в молекуле фермента, причем число участков одного типа ионов марганца примерно вдвое больше участков связывания другого типа ионов (Барсегян и др.,1979).

Очевидно, в наших экспериментах при предынкубации с марганцем последний прочно связывается с определенными участками апофермента и не отщепляется под влиянием ЭДТА поддерживая активную конформацию фермента.

В следующих сериях экспериментов нами определялись оптимальные условия процессов обратимой инактивации.

1.2. Влияние рН среды на процесс инактивации аргиназы печени лягушек Rana ridibunda под действием ЭДТА

Для изучения зависимости действия ЭДТА на аргиназу от рН среды мы проводили инактивацию фермента ЭДТА при 4-х разных значениях рН среды (7,4; 8,6; 9,0; 9,5). Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Анализ полученных данных показывает, что рН среды в пределах 7,49,5 не влияет на процесс инактивации аргиназы под действием ЭДТА, так как при всех испытанных значениях рН аргиназа печени лягушки Rana ridibunda инактивировалась практически в одинаковой мере (91-94%). Даль-

нейшие эксперименты по инактивации аргиназы при действии ЭДТА нам! были проведены при рН7,4.

Таблица Í

Влияние рН среды на процесс инактивации аргиназы печени лягушки Rana ridibunda под действием ЭДТА

Активность аргиназы, мкмоль/г

рН среды

7,4 8,6 9,0 9,5

Исходная активность 293801180 29460+337 30080±384,7 30200+141.4

Инактивир. Аргиназа 2056± 144,6 26511321 18051243.2 19201263

% инактивации 93 91 94 94

1.3. Изучение влияния температуры на процесс инактивации аргиназы печени лягушки Rana ridibunda

Далее эксперименты по изучению инактивации аргиназы печени мы проводили при двух температурных режимах (0° и 20°). Эксперименты ставились при рН 3,6 (0,05 глицин-HCl буфер) и при действии ЭДТА. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние температуры на процесс инактивации аргиназы печени лягушки Rana ridibunda

Активность аргиназы, мкмоль/г

рН 3,6 ЭДТА

0й 20" 0" 20"

0 мом 32800±386 328001386 308901620 308901620

2 ч. 227001931 227001931 30000+540 27801242

22 ч. 3608±546 36081546 278001732 0

% инактив. 89 89 10 91

Как видно из данных таблицы кислотная инактивация не подвергается воздействию температурного фактора, тогда как инактивация ЭДТА проявляет выраженую температурную зависимость. При 20°С фермент резко инактивируется (на 91%) через 2ч., а при 0° через тот же промежуток времени инактивирования практически не было. Даже через 22 ч. при 0° активность сохраняется на высоком уровне (на 90%). Тормозящий эффект низких температур в процессе инактивирования аргиназы под действием ЭДТА был также отмечен Дейлиг и сотр., изучавшими инактивацию аргиназы легких здорового человека ( ИаЬНд е. а., 1975).

Исходя из полученных нами данных дальнейшие эксперименты по инактивации фермента проводили при комнатной температуре (20-24° С).

1.4. Инактивация препаратов аргиназы различной степени очистки при рН 3,6 и действии ЭДТА Следующая серия экспериментов предпринята с целью изучения процесса инактивации аргиназы в зависимости от степени очистки фермента.

Инактивации подвергали экстракты, полученные центрифугированием гомогеиатов печени лягушек Rana ridibunda при 25000 g, частично очищенные препараты аргиназы печени лягушек Rana ridibunda, полученные путем пропускания экстрактов печени через колонку только с сефадексом G-75, или G-150 с последующим разделением на ДЭАЭ целлюлозе. Следует подчеркнуть, что при хроматографии экстракта печени лягушек на ДЭАЭ целлюлозе проявляются 3 пика аргиназиой активности (рис. 1).

Рис. I. Фракционирование аргиназы печени лягушек Rana ridibunda на колонке с ДЭЛЭ целлюлозой.

Для сравнения был использован и продажный высокоочищенный препарат аргиназы из печени крупного рогатого скота (Олайнского завода хим-реактивов, активность не менее 20 ФЕ мг). Относительно аргиназы печени быка известно, что она полностью инактивируется при рН ниже 4, а ЭДТА инактивирует эту аргиназу не вызывая диссоциации на субъединицы (Rossi е. а., 1983). Результаты исследований представлены в таблицах 5 и 6.

Данные таблицы показывают, что если через 2 часа кислотного воздействия в экстрактах инактивация аргиназы незначительна (всего 24%), то в частично (сефадекс G-75) и более очищенных (G-150, ДЭАЭ-целлюлоза и продажный) препаратах происходит значительная инактивация. Все 3 субфракции аргиназы, полученные на ДЭАЭ-целлюлозе, инактивировались через 2 ч инкубации на 84,5; 89,8 и 80% соответственно (Табл.5).

Что касается аргиназы экстракта печени лягушки, то только к 22 часу инкубации активность фермента подавлялась на 85%. По всей видимости, в гомогенате печени лягушки имеется фактор, стабилизирующий фермент против кислотной инактивации. Очевидно при очистке этот фактор исчезает и фермент становится уязвимым в отношении воздействия низких значений рН. Природа его пока неизвестна, либо он связан непосредственно с ферментом, либо находится в среде. Можно предположить, что этот фактор

по крайней мере прикрывает дисульфидные связи от влияния низких рН среды.

Таблица 5

Инактивация препаратов аргиназы различной степени очистки при рН 3,6.

время Экстракт мкмоль/г ткани Частично оч. преп, 0-1Ь, мкмоль/г ткани Частично очищенный препарат, С-150, ДЭАЭ-целлюлоза, мкмоль/г белка Высокоочищ. препарат из печени круп. рог. скота, мкмоль/1000мл

Исх.а кт 30993±252 300001224 149+7.9 393±26.6 261±25.2 7920160

30' - - 89.518.6 162.2±Ю .2 137±17.2 -

1ч - - 48.2±3.7 95±12.8 101±5 -

2ч 23400±П4 2 4560±1021 13±1.8 40±9 51.7±3.6 60±4

22ч 4734+675 - - - - -

X ииак. 85 85 84.5 89.8 80 100

Результаты исследований с ЭДТА показали, что аргиназа печени лягушек как в экстрактах, так и частично очищенная значительно (на 90-91%) инактивируется через 20 минут (Табл. 6). Дальнейшая экспозиция практически не отражалась на степени инактивирования.

Таблица 6

Инактивация препаратов аргиназы различной степени очистки при действии ЭДТА

Время Экстракт, мкмоль/г ткани Частично очищен, препарат, С-75, мкмоль/г ткани Частично очищенный препарат, в-150, ДЭАЭ-целлюлоза, мкмоль/г белка Высокоочищ. препарат из печени круп, рог. скота, мкмоль/1000 мл

Исх.акт 284161624 300001224 133114.3 423124.4 269118.6 7960178

Г - - 16.713.6 18.315.4 29.714.6 -

20' 29181417 26151516 - - - 45801180

30' - - 16.613.2 17.713.2 27.213.6 -

40' - - - - 41521160

60' - - 15.612.2 17.612.7 26.514.2 17601134

80' - - - - - 1206172

120' 1960+342 17701256 14.212.1 16.312.2 26.514.2 1128156

% инак. 93 94 88 96 90.1 86

Что касается процесса инактивации аргиназы из печени крупного рогатого скота, то фермент в тот же период времени (20') инактивируется всего на 42% и достигает 86% инактивации только после 2-часовой инкубации.

Это, по-видимому связано со степенью экранированности ионов Мп2< в молекуле фермента, поскольку, как ранее было обнаружено, в аргиназе печени быка 2 атома Мп24 слабо связаны с ферментом, третий - сравнительно сильнее, а четвертый связан так прочно, что не удаляется даже при диализе против 1-10-о-фенантролина (Ganadu е. а.,1984).

Быстрая инактивация аргиназы печени лягушек в присутствии ЭДТА в наших экспериментах свидетельствует, вероятно, об относительно непрочной связи Мп2^ с субъединицами аргиназы и о легкой диссоциации этих ионов при их поверхностном расположении на ферменте, тем более, что ранее было заключено о присутствии 2 типов двухвалентного Мп2+ в печени лягушек Rana ridibunda, которые ассоциируются на поверхности, но отличаются по белковому окружению в молекуле фермента (Барсегян и др., 1979).

1.5. Реактивация предварительно инактнвированной ЭДТА или при рН 3,6 аргиназы печени лягушки Rana ridibunda

Имеются литературные данные относительно возможности реактивации аргиназ из некоторых объектов после инактивирования ЭДТА и при низких рН.

В данной серии экспериментов мы задались целью выяснить возможность реактивации аргиназы печени лягушек Rana ridibunda, предварительно инактнвированной ЭДТА и при рН 3,6.

Таблица 7

Реактивирование аргиназы печени лягушек предварительно инактивироваимой при рН 3,6 и ЭДТА

Аргиназа экстракта печеп.и Активность аргиназы, мкмоль/г

инактивация при рН 3,6 % инакт. инактивация ЭДТА % инакт.

Исходная 32127±846 100 29600±440 100

Инактнвнрованная 4800 ±320 13 2140±56 6.4

Ренатурир. без Ми'* 94841132 28 10952±1342 37

Ренатуриров. с Мп2* 24800Q±1026 70.6 21600±812 72

Как видно из таблицы 7, кислотная инактивация и инактивация под воздействием ЭДТА обратимы. И в том, и в другом случае происходило восстановление активности фермента, однако по-разному в зависимости от наличия в инкубационной среде ионов Мп2+.

В обоих случаях реактивация фермента без добавления ионов Мп2+ протекала менее интенсивно (всего на 28 и 37%), чем в присутствии этих ионов, где реактивация достигла 70,6 и 72%, соответственно.

1.6. Фракционирование аргиназы печени лягушки Rana ridibunda после ее инактивации при рН 3,6 и реактивации

В данной серии экспериментов мы задались целью выяснить возможность распада аргиназы печени лягушек Rana ridibunda на субъединицы при ее инактивации.

Результаты предыдущих исследований нашей лаборатории показали, что м.в. аргиназы печени лягушки Rana ridibunda (экстракт) колеблется в пределах 123000-131800 (Барсегян и др., 1977).

Результаты наших исследований показывают, что после кислотной инактивации аргиназы метедом гель-фильтрации выявляеся один пик активности фермента, м.в. которого равен 34910 (рис. 2). Сопоставляя значения молекулярных масс исходной и инактивированной аргиназ печени лягушек, мы можем говорить о тетрамерной структуре аргиназы печени лягушек Rana ridibunda.

5 ^— Пепсин

Ии а ктш ви р о» аня а я кргввш

^Гемоглобин

Алкогольдегыдрогеназа

ч^Уревэа

4.5

1 од м.м.

Рис.2. Фракционирование аргиназы печени лягушек Rana ridibunda после инактивации при рН 3,6.

Гемоглобин

Алю

Реактманроааяяас аргиназа

4.5

5.5

íog м.м.

мл

Яис.З. Фракционирование реактивировшшой после кислотной инактивации аргиназы печени лягушек Rana ridibunda.

Реактивация аргиназы печени приводила к восстановлению общей активности фермента до 75%. М.в. реактивированного фермента, определенный нами, был равен 316000 (рис. 3).

Таким образом, ассоциация субъединиц аргиназы в буфере при заданных условиях приводила к образованию октамера аргиназы. По-видимому, разрыв дисульфидных связей под воздействием низких рН, приводящий к молекулярной деградации аргиназы изменяет конформацию фермента и отражается на процесе формирования его олигомера.

Рис. 4. Кривая Лайнуивера-Берка для чнактивированной и реактивированной арпшаз.

Таким образом, при реактивации аргиназы, очевидно, образуется качественно новое олигомерное состояние фермента, которое должно обладать другими кинетическими и регуляторными характеристиками. Были определены значения Кгп по отношению к Ь-аргинину инактивированной и реактивированной аргиназы графическим методом Лайнуивера-Бэрка (Диксон, Уэбб, 1966). Ь-аргинин применяли в коццентреациях 30, 60, 120, 300, 600 мкмоль на пробу. Результаты исследований показали, что если значение Кт по отношению к Ь-аргинину для аргиназы печени лягушек было равно 30 мМ (Барсегян и др., 1977), то значение Кш, полученное для инактивиро-ванного фермента стало равным 151 мМ, т. е. сродство мономера аргиназы по отношению к субстрату в сравнении с таковым олигомера ниже в 5 раз. После реактивации аргиназы величина Кш стала равна 53 мМ (рис.4), сродство реактивированного фермента по отношению к субстрату возросло в 2,8 раза, однако значение величины Кш не достигло исходного значения.

Таким образом, анализ результатов исследований показал, что при реактивации инактивированной при рН 3,6 аргиназы печени лягушек Rana ridibunda происходит образование олигомерной структуры, не идентичной нативному ферменту.

1.7. Фракционирование аргиназы печени лягушки Rana ridibunda после инактивации под действием ЭДТА и последующей реактивации

Данная серия экспериментов была проведена с целью выявления возможного расщепления олигомерной структуры аргиназы печени лягушки Rana ridibunda после инактивации под действием ЭДТА, а также возможного реассоциирования субъединиц в олигомерную структуру при реактивации фермента.

Результаты исследований представлены на рисунках 5 и б. Как видно из рисунка 5, при действии ЭДТА на аргиназу печени лягушки Rana ridibunda методом гельфильтрации выявляются 3 фракции аргиназы (Al, All, Allí) с соответствующими молекулярными массами 127900, 63035 и 34956. При этом следует подчеркнуть, что фракционирование аргиназы, не обработанной ЭДТА приводит к появлению лишь первой фракции с молекулярной массой 123000-131800 (Барсегян и др., 1977).

Из литературы известен случай, при котором обработка ЭДТА наиболее активных изоферментов аргиназы печени и почек крысы приводила к образованию фракций фермента с м.в. 120000, 60000 и 30000 (Baranczyk-Kuzma, 1976).

Анализ полученных нами данных (рис.5) показывает, что при обработке аргиназы печени лягушек ЭДТА происходит диссоциация фермента на субъедшшцы с м.в. 63035 и 34956.

Аргин«зд11! Тепскн

Аргиназа]!

Геноглобнк

ьр г ин аза I

лкоголадсгидрогаяаза

Уреаза

4.5

5.5

log м.м-

Рис. 5. Фракционирование аргиназы печени лягушек Rana ridibunda после инактивации под действием ЭДТА.

То обстоятельство, что в наших экспериментах обнаруживается определенное количество недиссоциированного фермента (1 фракция, м.в. 127900), очевидно является следствием неполного воздействия ЭДТА (в силу его низкой концентрации) или реассоциации фермента в колонке при гельфильт-рации (вследствие разбавления концентрации ЭДТА). Нельзя было исключить также и наличие изоэнизма, не инактивируемого ЭДТА,С целью выяснения этого вопроса было исследовано действие ЭДТА на 3 субфракции, полученные ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (рис.1).

Оказалось, что ЭДТА ингибировал аргиназную активность во всех трех субфракциях, причем ннгибирование обнаруживалось уже в первые минуты эксперимента и в процентном отношении почти не изменялось в течение 2 часов (Табл. 8).

Таблица 8

Действие ЭДТЛ на аргиназную активность п 3 субфракциях, полученных ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе

Активность аргиназы, мкмоль/г белка

время 1 2 3

исх.акт. 133+14.3 423+24.4 269+18.6

Г 16.7+3.6 18.3±5.4 29.7±4.6

30 16.6+3.2 17.7+3.2 27.2±3.6

60 15.6+2.2 17.6±2.7 26.7+4.2

120 14.2±2.1 16.3+2.2 26.5+4.2

% инакт. 88 96 90.1

Таким образом, наличие изоэнзима, не инактивируемого ЭДТА, было исключено.

Аргипв ЭА II I

епски

АргннаяаП

Гемоглобин

Реактиянрованная аргиназе Алкогольдегидрогеназ

log м. м.

Рис.6. Фракционирование реактивированной аргиназы печени лягушек Rana ridibunría после инактивации под действием ЭДТЛ.

мл

<■5

5.5

В последующей серии экспериментов мы проводили реактивацию инактивированиой ЭДТА аргиназы при рН 9,5 и температуре 37°С с добавлением ионов Мп3+ (25 мкмоль на 1 мл пробы), экспозиция 22 часа.

Реактивированный фермент пропускался через колонку с сефадексом G-200 (рис.6). Результаты исследований показали, что реактивированный фермент в большинстве случаев имел м.в. 126000. Однако наряду с фракцией 126000, выявлялись также димер и мономер с м.в. 60260 и 35480 соответственно. В связи с этим следует упомянуть, что при реактивации восстанавливается лишь 72% первоначальной активности фермента. Очевидно, что оставшиеся 28% активности - результат неполной реассоциации.

Таким образом, в процессе реактивации аргиназы печени лягушек Rana ridibunda, предварительно инактивированиой ЭДТА при рН 7,4, в большинстве случаев происходила ассоциация субъединиц в тетрамерный оли-гомер. Эти данные вызывают определенный интерес в сравнении с результатами изучения процесса обратимой инактивации при низких рН (3,6), где предполагается иной механизм распада фермента на субъединицы за счет разрыва дисульфидных связей нативного фермента. Реактивация фермента в случае кислотной инактивации приводила к ассоциации субъединиц в ок-тамерный олигомер взамен нативного тетрамера .

Опыты по реактивации фермента при двух способах инактивирования - дополнительный аргумент, свидетельствующий о различных механизмах процесса обратимой инактивации.

1.8. Изучение процесса инактивации аргиназы печени головастиков Rana ridibunda при низких рН и действии ЭДТА

В данной серии экспериментов предварительно изучался изоэнзимный спектр аргиназы печени головастиков ( на разных стадиях развития) и взрослых лягушек. Как видно из приведенных кривых гель-фильтрации (рис. 7, 8) экстракта печени до метаморфоза обнаруживаются 2 пика арги-назной активности, первый (1) изоэнзим из которых фильтруется вместе с высокомолекулярной фракцией белков и обладает высокой ферментативной активностью, а второй (11) изоэнзим фильтруется вместе с низкомолекулярными белками и обладает меньшей активностью. После метаморфоза (рис. 9) в экстрактах печени лягушек обнаруживается резко выраженный один пик ферменативной активности, фильтрующийся с высокомолекулярными белками. Можем сказать, что при метаморфозе происходит резкая индукция одного изофермента (1) и репрессия другого (И).

Таким образом, нами были воспроизведены данные нашей лаборатории относительно изменения изоэнзимного спектра аргиназ печени лягушек в ходе онтогенетического развития (Барсегян и др., 1977). При этом было выяснено, что по ряду физико-химических показателей (Km, молекулярный вес, К1) они значительно различаются. Даже 1 изоэнзим до и после метаморфоза несколько отличаются по значениям Km. Это могло быть результатом гетерогенности 1 изоэнзима, что и было подтверждено в экспериментах по

V (мл)

Рис.7. Гель-фильтрация аргиназы печени головастиков Нала ridibunda (стадия 27-28).

V {мл)

Рис.8. Гель-фильтрация аргиназы печени головастиков Rana ridibunda (стадия 28-29)

дальнейшему фракционированию этого изоэнзима на колонках с ДЭАЭ целлюлозой. Действительно 1 изоэнзим ионообменной хроматографией разделялся на 3 субфракции (1А, 1В, 1С), соотношение активностей которых в ходе развития меняется. При метаморфозе наблюдается индукция особенно 1С и 1В, тогда как 1А не меняется. На основании этих результатов было

заключено, что в механизме формирования уреотелизма при метаморфозе существенное значение имеет индукция 1С и 1В. Очевидно они и являются уреотелическими изоэнэимами, тем более по Кт, К) и м.в. они соответствуют уреотелическим аргиназам различного происхождения.

Рис.0. Гель-фильтрация аргиназы лечена лягушек Rana ridibunda.

Как видно из таблицы 9 аргиназа гомогенатов печени головастиков стадий 27-28 и 28-29 постепенно йнахтивируется в течение б часов. После частичной очистки (гель-фильтрация, G-150) препаратов на тех же стадиях развития время инактивации сокращается до 3 часов.

Таблица 9.

Инактивация аргиназы печени головастиков Rana ridibunda при рН 3,6 на разных стадиях развития.

Активность аргиназы, мкмоль/г белка ш

Время (ч| Экстракт Аргиназа 1

ст.27-28 ст.28-29 ст.27-28 ст.28-29

Исходакт. 53.414.2 68+12.1 82.116.4 170+32

30' 43.7±3.2 60±3.1 50+3.5 44+9.6

I 38±2.8 54+2.4 4112.4 15.813.4

2 27.6+2.5 37±6.3 3712.3 10.212.7

3 16.7±2.4 21±5.6 1811.7 7.311.8

6 9±2.2 1313.2 - -

Наши исследования на взрослых лягушках (параграф 1.4) показали, что через 2 часа воздействия рН 3,6 аргиназа экстракта печени инактивируется всего на 24%, тогда как аргиназа экстракта печени головастиков на стадии 27-28 ингибируется на 48%, а на стадии 28-29 ингибируется на 45%, т. е. по мере приближения к метаморфозу аргиназная активность экстракта печени головастиков по исследованному показателю приближается к активности экстракта печени взрослых лягушек. Это, очевидно, является следствием указанных изменений изоэнзимного спектра аргиназ печени лягушек в течение онтогенеза. Это подтверждается и результатами соответствующих исследований 1 изоэнзима аргиназы, полученного гель-фильтрацией экстракта печени головастиков. На стадии 27-28 1 изоэнзим при 2-часовом кислотном воздействии (рН 3,6) ингибируется на 55%, на стадии 28-29 - на 94%, т. е. почти столько, сколько у взрослых лягушек (параграф 1.4). Таким образом, в ходе развития лягушек меняется степень кислотной инактивации 1 изоэнзима аргиназы печени, что, вероятнее всего, является изменением количественного соотношения субфракций 1 изоэнзима (1А, 1В, 1С). Оценивая полученные данные по изучению кислотной инактивации изоферментов аргиназы можем утверждать, что они подтверждают заключение об индукции при метаморфозе амфибий определенных изоэнзимов, имеющих характерное поведение при кислотной инактивации.

Как уже отметили (параграф 1.4), аргиназа экстракта печени лягушек, как и частично очищенная аргиназа (1 изоэнзим, полученный гельфильтра-цией и его субфракции 1А, 1В, 1С, полученные ионообменной хроматографией на ДЭАЭ целлюлозе) значительно инактивируются сразу после добавления ЭДТА.

Таблица 10.

Инактивация аргиназы печени, головастиков Rana ridibunda под действием ЭДТА на разных стадиях развития

Активность а ргиназы, мкмоль/г белка

Время Экст ракт Аргиназа 1 Аргиназа 11

ст. 27 ст. 28-29 ст. 27 ст.28-29 ст. 27 ст.28-29

Исх.акт 43.7±2.8 68112.1 61.4±5.6 170±32 16.6±1.2 13.510.98

1" 0.72±0.05 1.72±0.42 3.3±0.4 б,8±1.4 16.6+1.2 13.5Ю.98

30' 0.44+0.03 1.6М.2 4±0.6 б.8±1.4 0 0

60' 0.43+0.03 1.7+0.18 3.02±0.18 6.811.4 0 0

120' 0.44+0.03 1.6+0.2 2.87±0.12 б.8±1.4 0 0

Данные по влиянию ЭДТА на активность аргиназы печени головастиков (табл.10) четко показывают, что ЭДТА сразу ингибирует аргиназную активность экстрактов, а также 1 изоэнзима, полученного гельфильтрацией экстрактов печени на различных стадиях развития. Таким образом, 1 изоэн-зимы по ингибированию ЭДТА до и после метаморфоза проявляют одинаковый характер. Что же касается 11 изоэнзима аргиназы, обнаруживаемого при гельфильтрации экстракта печени только до метаморфоза, который репрессируется при метаморфозе и, очевидно, является неуреотелическим,

не ингибируется в первые минуты действия ЭДТА, что обычно обусловленс наличием в молекуле фермента более прочно связанных с белком ионо£ Мп2 + .

Таким образом, полученные данные являются дополнительным доказательством присутствия в печени лягушек различных изоэнзимов аргиназы (обладающих разными структурными особенностями), количественное соотношение которых меняется в ходе онтогенеза механизмами индукции v. репрессии.

II. Роль функциональных SH-групп в проявлении активности аргиназы н поддержании натив нон конформацин фермента

Природу функциональных групп активных центров и участие их i сохранении специфической конформации ферментов можно выяснить действуя на них различными реагентами. Достаточно специфическими и чувствительными реагентами на сульфгидрильные группы являются органические соединения ртути, в частности р-хлормеркурийбензоат.

11.1. Сравнительное изучение действия ПХМБ на активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda в онтогенезе

Мы проводили изучение влияния различных концентраций ПХМБ не активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda в онтогенезе. Были использованы концентрации 1, 3, 5 мкмоль ПХМБ на пробу. Результаты исследований представлены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11

Изучение влияния разных концентраций ПХМБ на активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda (мкмоль/r ткани)

Концентрация ПХМБ Активность, мкмоль/г

Контроль 27113+742

1 мкмоль 271131742

3 мкмоль 271061736

5 мкмоль 27133+742

Выяснилось, что ПХМБ при всех испытанных концентрациях не действовал на активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda (Табл. И), ка» и на фермент печени лягушек Rana terrestris (Исаченков, Нестайко, 1971) печени крыс (Mora е. а., 1966), печени человека (Carvajal е. а., 1978, 1982), не содержащих ответственных за активность SH-rpynn.

Нами также было изучено влияние разных концентраций ПХМБ на активность аргиназы печени головастиков на разных стадиях развития. Результаты этой серии представлены в таблице 12.

Исследования показали, что ПХМБ при всех испытанных концентрациях действовал на активность аргиназы печени головастиков Ranc ridibunda. Аналогичное влияние ПХМБ было обнаружено на аргиназе печени головастиков Rana terrestris (Исаченков, Нестайко, 1971). Чувствительными к ПХМБ являются аргиназы из почек лягушек Rana pipiens и Ram

catesbeiana (Carlisky, Sadnik, 1972), печени цыплят (Mora e. a., 1966), дрожжей (Туманян и др., 1983), бактерий Rhodobacter capsulatus EIFI (Moreno-Vivian e. a., 1992). Все три изоформы аргиназы поджелудочной железы являются тиоловыми (Никоян и др., 1980). Аргиназа из печени Xenopus laevis ингибировалась ПХМБ в концентрации 5 мкмоль всего на 10% (Peiser, Balinsky, 1982). Можно заключить, что в большинстве случаев уреотеличес-кие аргиназы не чувствительны к ПХМБ, а неуреотелические являются тиоловыми ферментами.

Таблица 12.

Изучение действия разных концентраций ПХМВ на активность аргиназы печени головастиков Rana ridibunda (мкмоль/г ткани).

Активность аргиназы, мкмоль/r ткани

Стадия Стадия Стадия Стадия Стадия

21-24 25-27 28 29 30

2300 4050 5125 8800 7205

Исходная 2448 4060 5170 8965 9625 .

активность 3227 4593 5812 9200 10750

в 3258 6000 7450 9850 11200

гомогена- 3900 6520 7650 9900 11467

тах 8050

8500

Mini 30261293 50441512 68221535 93431226 10529178 6

911 4039 3229 8592 5562

1042 1360 1129 7991 8417

1 мкмоль 1425 2171 2235 4460 9990

1414 1348 4681 8776 9715

ПХМБ 1774 2596 5299 ' 5056 10500

4217 11977

5051

М±т 13131153 2302+496 36911546 69751919 93601894

244 2655 2707 3493 3362

738 627 988 1690 6565

3 мкмоль 336 1003 1428 2960 5892

659 735 3279 7784 6720

ПХМБ 1132 1227 4953 4262 6355

2795

4032

М±т 6221158 12491366 28831523 403811026 60861592

120 1440 810 1854 1861

470 588 950 1637 3165

5 мкмоль 220 660 1050 1896 3620

343 624 2880 4680 6600

ПХМБ В64 1770 2760 2990 5205

1914 5430

2700

М1т 403.41129 10161246 1866+350 26111568 43131709

Более выраженное действие ПХМБ в наших экспериментах нами обнаружено в вариантах с использованием ПХМБ в концентрации 5 мкмоль. На начальных стадиях развития головастиков ПХМБ в концентрации 5 мкмоль резко подавляет активность фермента от 3026,6 до 403,4 мкмоль/г. Этот факт свидетельствует о наличии свободных SH-групп в аргиназе печени головастиков на этой стадии.

По,мере приближения к стадии истинного метаморфоза ингибирующее действие ПХМБ падало. Так, если на стадии 25-27 активность фермента падала в 5 раз, то на стадии 30 уже в 2,4 раза.

Так как в процессе развития лягушек Rana ridibunda изоферментный состав аргиназы печени подвергается существенным изменениям, очевидно, по мере приближения к стадии истинного метаморфоза происходит постепенная репрессия изоферментов, чувствительных к ПХМБ, и индукция уреотелической изоформы аргиназы нетиоловой природы.

Результаты этой серии являются еще одним доказательством того, что после метаморфоза аргиназы печени лягушек Rana ridibunda существенно отличаются от аргиназ преметаморфотического периода развития.

11.2.Роль функциональных SH-групп в процессе обратимой инактивации > аргиназы печени лягушки Rana ridibunda

В этой серии экспериментов было изучено влияние ПХМБ на активность инактивированной и восстановленной аргиназы, как при кислотной инактивации, так и при действии ЭДТА. Результаты исследований представлены в таблице 13. Нами было показано (параграф 1.1), что под влиянием рН 3,6 активность аргиназы печени лягушек ингибируется на 85% через 22 часа, т. е. остается 10-15% остаточной активности. Очевидно, этой активностью обладают субъединицы, образующиеся при диссоциации фермента при рН 3,6. '

Таблица 13.

Влияние ПХМБ на активность аргиназы печени лягушек Rana ridibunda в процессе обратимой инактивации (рН 3,6 и ЭДТА).

Способ Активность аргиназы, мкмоль/г ткани

инактиви Аргиназа -ПХМБ + ПХМБ

рования

Исходная 27300±742 273001742

рН 3,6 Инактивированиая 2184±124 10561113

Реактивированная 204751812 204001849 .

Исходная 296001440.45 296001440.45

ЭДТА Инактивированиая 48601320 63201350

Реактивированная 216901768 103451932

Данные таблицы показывают, что остаточная активность инактивированной при рН 3,6 аргиназы гомогената печени лягушки под влиянием ПХМБ подавляется в 2 раза. Это, очевидно, связяно с наличием в субъединицах аргиназы функционально активных 5Н-групп.

И по литературным источникам известно, что наибольшее число SH-групп обнаруживается в опытах по модификации аргиназы в растворах с низким значением рН. Видимо распад аргиназы на субъединицы в кислой среде сопровождается высвобождением реактивных SH-групп, что доказано и методом кругового дихроизма на аргиназе печени крыс (Hosojama, 1982).

Учитывая то обстоятельство, что после кислотной инактивации аргиназа печени лягушек Rana ridibunda (м.в. 110000-136000) расщеплялась на субъединицы с м.в. 34910, можно допустить, что наличие реактивных SH-групп в молекуле инактивированного при рН 3,6 фермента, возможно, результат разрыва дисульфидных мостиков нативной аргиназы.

Инактивированная же вторым способом (действием ЭДТА) аргиназа печени лягушек не обнаруживала активных SH-групп. В этом варианте наблюдалось даже некоторое активирование фермента в присутствии ПХМБ (4860 мкмоль-6320 мкмоль). В этом отношении инактивированная ЭДТА аргиназа печени лягушки проявляет свойства фермента мозга, почек, печени кур (Давтян и др., 1981), молочной железы крыс (Агаджанян, Арутюнян, 1983), аргиназы из тканей многощетинковых червей (O'Malley, Terwilliger, 1974), активируемых ПХМБ. Имеется ряд работ, указывающих на значение SH-групп фермента в связывании ионов Мп!<. Так, диализ аргиназы почек лягушек Rana pipiens и Rana catesbeiana вызывает ингибирование на 79,8 и 81,8%, а в присутствии 2-МЭ процент ингибирования составляет всего 58,2 и 11%, соответственно, т. е. он оказывает защитное действие (Carlisky, Sadnik, 1972). Показано, что и в аргиназе молочной железы крыс SH-группы обнаруживаются (по реакции с йодацетамндом) только после диализа фермента (Fuentes е. а., 1994). Очевидно ионы марганца связываются с SH -группами в активном центре и, следовательно, SH-группы проявляются (реагируют с ПХМБ или иодацетамидом) после их обнажения, т. е. удаления ионов Мп2+ (диализом или ЭДТА). Тем более, что ионы металлов легко образуют хелатные структуры с цистеином и гистядином, обуславливая образование комплекса металл-белок (Малер, Кордес,1970).

Наблюдаемая разница в чувствительности к ПХМБ при двух различных формах инактивации может свидетельствовать о различных механизмах инактивации. Очевидно при этом ферменты распадаются на разные субъединицы вследствие разрыва различных связей в олигомерной структуре белка под влиянием разных способов инактивации.

Реактивированная при рН 9,5 и добавлении ионов Мп2+ аргиназа печени лягушки, инактивированная под действием рН 3,6, как мы уже указали, образует октамер. Изучение влияния ПХМБ на октамерную структуру восстановленного фермента показало (табл.13), что после восстановления активности не обнаруживалось влияния специфического реагента, т. е. в реактивированной аргиназе отсутствовали SH-группы, ответственные за проявление активности.

Несколько неожиданными были результаты взаимодействия ПХМБ на реактивированную добавлением ионов Мп2+ аргиназу, предварительно инактивированную ЭДТА. Здесь активность фермента значительно падала,

тогда как фермент в исходном экстракте не ингибировался ПХМБ. Очевидно реактивированная аргиназа по структурным особенностям отличается от нативной, хотя они, как было показано (параграф 1.7), по м.в. не отличаются.

Таким образом, при реактивировании предварительно инактивирован-ных двумя способами аргиназ печени лягушек образуются различные оли-гомерные структуры, которые не идентичны исходному ферменту. То есть различны не только механизмы этих двух способов инактивации, но и механизмы реактивации. При оценке влияния ПХМБ следует также учесть, что ПХМБ может и неспецифически взаимодействовать с ферментом, поскольку известны случаи, когда ПХМБ вызывает инактивацию не в результате модификации SH-групп, а за счет нарушения нативной конформации фермента при взаимодействии с другими функциональными группами (Garland е. а., 1976). Показано, что ПХМБ в некоторых случаях подавляет активность ферментов, вообще не содержащих сульфидных групп, что также объясняется неспецифическим взаимодействием реагента с белком (Greenblatt, Sarkissian, 1974). Не исключается, что инактивированная ЭДТА аргиназа становится уязвимой в отношении неспецифического влияния ПХМБ.

11.3. Роль функциональных SH-групп в процессе обратимой реактивации аргиназы печени лягушки Rana ridibunda Далее нами изучено влияние ПХМБ на сам процесс ренатурации при двух способах инактивации (рН 3,6 и ЭДТА). Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14

Влияние ПХМБ на процесс ренатурации аргиназы печени лягушки Rana ridibunda, инактивированной при рН 3,6 и действием ЭДТА.

Способ инакти-вирова-ния Исходная аргиназа Инактин. аргиназа Ренатура-ция -ПХМБ Ренатурация + ПХМБ % ингибиро-вания ренатурации

рН 3,6 27700±486 4220±370 219001876 26401118 88

ЭДТА 29600±440 21401155.8 214001842 3840+168 87.2

Результаты исследований показали, что присутствие ПХМБ предотвращало процесс ренатурации в обоих вариантах. Очевидно, "ПХМБ, блокируя SH-группы предотвращает образование олигомерной структуры. И другими авторами было показано предотвращение процесса реактивации аргиназы печени лягушек Rana terrestris ПХМБ, предварительно инактивированной при рН 4,0 (Исаченков, Нестайко, 1971).

По мнению большинства исследователей в активации аргиназы ионами двухвалентных металлов лимитирующую роль играет конформационный пе реход. Предполагают, что ионы Мп2+ связываются с аргиназой в своеобраз-

ной складке белковой молекулы (НибЬ-КоПэ е. а., 1971).

По-видимому, в процессе реактивации инактивированной двумя способами аргиназы ПХМБ своим специфическим и, возможно, неспецифическим действием препятствует связыванию Мп2+ с белком, и тем самым предотвращаются конформационные изменения, приводящие к образованию олигомерной структуры и активированию фермента.

В заключении говорится, что при вызванной различными способами (ЭДТА и рН 3,6) инактивации аргиназы печени лягушек фермент диссоциирует на различные субъединицы, а при их реассоциации образуются различные олигомеры, отличающиеся по структуре от нативного фермента.

Таким образом, в процессах диссоциации и ассоциации, а также инактивации и реактивации фермента существенную роль играют рН среды, ионы Мп2+ и модификация БН-групп ферментного белка. Примечательно, что согласно результатам наших данных имеются широкие возможности рекомбинации субъединиц в различные олигомерные структуры.

Проведенные нами исследования по углубленному изучению процессов инактивации и реактивации различными способами раскрыли интересные стороны субъединичной структуры нативной и реактивированной аргиназы печени лягушки. Наши иследовання позволяют заключить, что аргиназа печени лягушек обладает структурными и, следовательно, функциональными особенностями, отличающими ее от аргиназ печени организмов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

Наши данные не оставляют сомнения в том, что в течение онтогенетического развития лягушек в печени индукцией и репрессией меняются изоэнзимы аргиназы, которые сильно отличаются по механизмам инактивации и реактивации, а также роли в этих процессах ионов Мп2+ и функционально активных групп. Резко индуцируемый при метаморфозе изоэнзим аргиназы, который по указанным показателям отличается от других изоэн-зимов печени, проявляемых в течение онтогенеза лягушек, и по своим кинетическим свойствам (Кт, И, молекулярный вес) соответствует уреотели-ческой аргиназе печени уреотелических организмов, очевидно, играет решающую роль в формировании орнитинового цикла и становлении уреоте-лизма при метаморфозе амфибий.

Таким образом, не модификация аргиназы, имеющейся до метаморфоза в печени, а индукция уреотелической аргиназы является ключевой в механизме формирования уреотелизма при метаморфозе, что является подтверждением концепции Давтяна.

Параллельно нам проведенные в других лабораториях исследования подтверждают наличие различных изоэнзимов аргиназы, индуцируемых и репрессируемых в течение онтогенеза в печени и в других органах амфибий (Хи е. а., 1993).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Аршназна экстракта печени лягушек Rana ridibunda инактивируется на 85% в течение 22 часов при рН 3,6 и на 90% - через 20 минут под действием ЭДТА.

2. Изоэнзимы аргиназы печени лягушек Rana ridibunda уже через 2 часа при рН 3,6 инактивируются более чем на 80%, а под действием ЭДТА инги-бируются почти на 90% уже в первые минуты эксперимента.

3. Инактивация аргиназы, вызванная как кислотным влиянием, так и действием ЭДТА сопровождается распадом фермента на субъединицы с м.в. около 35000. Очевидно, нативный фермент является тетрамером с м.в. 125000-130000. Некоторая остаточная активность, сохраняющаяся после обоих способов инактивации, вероятнее всего является активностью субъединиц.

4. Предварительно инактивированные аргиназы печени лягушек Rana ridibunda реактивируются при рН 9,5 в присутствии ионов марганца. Реактивирование аргиназы после кислотной инактивации приводит к образованию октамерного олигомера, а реактивирование аргиназы, предварительно инактивированной под действием ЭДТА - к тетрамерному олигомеру.

5. Образующиеся при реактивации олигомерные структуры значительно отличаются от нативного тетрамера также по значениям Кш для аргинина, чувствительностью к тиоловым реагентам (ПХМБ).

6. Реактивированная аргназа, предварительно инактивированная ЭДТА, в отличие: от исходной, становится чувствительной к ПХМБ, а реактивированная аргиназа, предварительно инактивированная при рН 3,6, не чувствительна к ПХМБ.

7. Образующиеся при кислотной инактивации аргийазы субъединицы чувствительны к ПХМБ, а субъединицы, образующиеся при инактивации ЭДТА, не ингибируются ПХМБ и даже несколько активируются. Таким образом, механизмы инактивации различными способами аргиназы и ее реактивации принципиально различны.

8. По особенностям инактивации и реактивации аргиназа печени лягушек Rana ridibumda отличается от аргиназы печени крупного рогатого скота и других аргиназ, что обусловлено ее структурными особенностями, в частности, белковым окружением ионов марганца и их связью с функционально активными группами (SH-группы, имидазольные остатки и др.) фермента.

9. Проявляемые в течение онтогенетического развития лягушек в печени различные изоэнзимы значительно отличаются по особенностям инактивации, а также чувствительностью к ПХМБ. Аргиназа экстракта печени головастиков ингибируется ПХМБ, а после метаморфоза аргиназа является не-чеувствителыюй к этому реагенту. Изоэнзим 1 аргиназы печени головастиков инактивируется ЭДТА в первые же минуты эксперимента, в то врема как изоэнзим 11, элиминируемый при метаморфозе, ингибируется ЭДТА при

более продолжительном действии реагента. Индуцируемый после метаморфоза изоэнзим ингибируется сразу же после добавления ЭДТА. Указанные различия являются аргументами в пользу различной генетической детерминированности изоэнзимов, количественное соотношение которых меняется в течение онтогенеза механизмами индукции и репрессии.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арцруни Н. А., Барсегян Э. X., Давтян М. А. Роль функциональных SH-групп в проявлении активности аргиназы печени головастиков Rana ridibunda // Биолог, журн. Армении. - 1997. - т. SO, N 1-2, с.

2. Арцруни Н. А., Барсегян Э. X., Давтян М. А. Инактивация препаратов аргиназы различной степени очистки // Биолог, журн. Армении. - 1996. - т. 49, N 3-4. - с. 156.

3. Барсегян Э. X., Арцруни Н. А., Давтян М. А. Роль функциональных SH-групп в процессе обратимой инактивации аргиназы печени лягушек Rana ridibunda // Уч. зап. ЕГУ. - 1995. - N 2. - с. 75-78.

4. Барсегян Э.Х., Арцруни H.A., Давтян М.А. Фракционирование аргиназы печени лягушек Rana ridibunda после инактивации под действием ЭДТА и последующей реактивации. - Биолог, журн. Армении (в печати).

5. Арцруни H.A., Барсегян Э.Х., Давтян М.А. Некоторые свойства аргиназы печени головастиков Rana ridibunda.- Биолог, журн. Армении, (в печати).

11РГ>РПКЫ> "OUSULnU UUl.Pb'lh

«Rana ridibunda цприф L^Plf1 uipq{i(iuu|fi Ipunnigiluiópujjfili Ь tynialjyjinüiuL umiuüáüuihuiinlinipjniüühpp шйЬштшЦшй quipqiuydiuü püpiuypniií»

шгфпфио-ЬР

<UiGl;llli|Ulj|lG puilll.p UI|1C|)1ÜU1(| . |lüiul|lil]ll|uu|lllü . 1lliUll|lll|H|UH|IIUÍ:

Uui[j(iui|uuunipjuiG dLy niurmííiuiu¡ipi|mü Uü Rana ridibunda qnpm)i Uuipi]|i u!pq|ifiuiq¡; l;ummgi)uií>piuj{iü Ь -1>niGligJinÜmi uimiiüáliuihuiwl¡mpjmüGlipp йЬшшйпр-V'iq.liíj ui.Miiiy Ь htiinn: vbinuiqnim|uió t uipq|ifiuiq|i ]iGuil|uiln]iugmiip ppni pH-|i L t'lSlL-U uiqqUjmpjuiG йиррп: nuiguiliuijuitliuü t. ífUpiSUGm|i uipnhniCip Mipuiü|imi¡npüLp]i |iGmqui|iijuigúuiü ЬрЦш ¿UUpJi iqujjduiGGlipniiS: íimjg L inpi|uió, np Uplpu i¡: L j;iniií Ц liGui4ui|ii|ujgnii5|i qujpáU[]i t: í'üi] iipimS piuguihuijuiiliud L, np ¡iüuú¡m|r.¡un|liiuü U nliuil)uilu]uiqdu]ü iSL]uuiG|iqi5GLpp, [íG^iqUu GuiL |tGml(ui]ii|mgúuiG uiiiuiüuit-i uirmiyiuigiuó tilipuii5|iUii|npGtipG ni iiUuil|in|»i|uK)t]ujd ."JibpiíLüinGtipp l.uiiqliu шшррЬрфпй lili )iüiuljui]iijujc)duiG uiuippbp UqiuüiuljGlipli цЪщршй:

¡ImUluujuHumpjiuG ú'Ly hliuiuiqnimjujó I. üujU iupq|lüuiq)l |iqn,t>UplíLtiuiшjti uiqUlpnpp цпртЦф шйЬштшЦшй qiupquigiSuiQ pGpusgpmiS: hpuil|iuGuigi]iud I. l¡qn.1>L>]>dUGuiüLiptt hiuiíLiSujinuiljiuG niuntdGiuulipnipjniGp iíbinunlnp4>nq]ig umuiy li lil.uni: íinijq I. uipijuió, np uiGhujuiujliuiC qiupquigiiuiü pGpuigpnid ijuqiqniü' huijuiGiuptq^imS Lü ui|iq|iliuiq|i uiuippbp |iqn^bpiitiUuiübp. npnüq|ig 2-p nbiqpUu|iuij|i bü blipuqilplnid d]i(i¿b úbuiiuünp.lmqp Ipijü úliuiiuünp.1)iiq]i püpuigpmii. |iulj tíjniu 3 liqn.^bpdbUiJiGbpItg 2-p |iüi)iuí{q|iuij|i l.ü Lüpujpl|i]inii rfl>uiuirfnp.t>nqjtg hbuin:

bqil1>bpi¡büinGbp]i Ф'"' p|nl|Uij]iü iiLuiqbGuiGUpli uiqqbgilipjuiü luumiitiuiulipmüp, |iG}iqbu üuib puiguihuijmijuiü Gpuilig liuuiuil) muippbpnipjntGüLpii |iüuil¡m|ii|uigüuiü U nbuil|ui|ii|uigiiuiG qnp£>pGpuigniii (фМшффтй bü. np liqn.1>bpüb(iu>Gbpp m liU (i uiuippbp qbübin|il)ui^uiG i|buibpi51iGiugnii5 b Gpuiüg ршйш1)ш1)шй huipuipbpnipjinGGbpp фпфп|ифт5 bü oliuinqbübqli püpiugpniiS ]i(iqnil|3|iujj¡i b nUiqpbufiujjli iSbjuuiGliqiSGbpni|:

< -заказ io¿ c_Тираж 50

Подразделение оперативной полиграфии ЕГУ Ереван, Ал. Манукяна, 1

Информация о работе

Арцуни, Наталья Альфредовна
кандидата биологических наук
Ереван, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы