Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты орнитинового цикла и биосинтеза пролина поджелудочной железы крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферменты орнитинового цикла и биосинтеза пролина поджелудочной железы крыс"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи УДК 576.85.5:577.15

нГ6 ОА

- 8 ОПТ 19ЬПэ

[■ИКОЯН АРМИНЕ АЛЕКСЕЕВНА

ФЕРМЕНТЫ ОРНИТИНОВОГО ЦИКЛА И БИОСИНТЕЗА ПРОЛИНА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС

о'З. . '^У

с^.00.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1996

^изииэиъь ^иътгльзпмазиъ могапкэзиъ ьа а^впиэзиъ ъи^ипипш-газт-ъ ьпь^иъ^ 'Л.ьзи^иъ зииишипиъ

¿ЬпшчрЬ ^ршфнОрт! ПГЭа 576.85.5:57715

ы^пзиъ ириьъь ишэиьзь

гъьэь ьшииэт/пеиизьъ аьчэь опъьгаьъизьъ зьчи^ 'ЛРШЬЪЬ ^ьъиииьъгзьзь ЗзЬРиЬЬЗЪЬРП

00.04 - ЦЬ0ишр[и5[1Ш

ЧЬОишршОш^шй ц|11ЛПф}гиСШЬр(1 pbtiGuj6nt.fi С|.[1шшЦшй ши1гфбшй|1 Ьищд15ш0 штЬйш^ипит^шй

иьиги^р

ЬРЬ^иЪ- 1996

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Ереванского государственного университета

Научный руководитель: Академик HAH РА,

профессор М.А.ДАВТЯН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Р.Г.КАМАЛЯН кандидат биологических наук Д.А.ГЕВОРКЯН

Ведущая организация: Сельскохозяйственная Академия Республики Армения, кафедра биохимии.

Защита состоится " 4 " ОКГЛfpJK199ör. в ftf00 часов на заседании специализированного Совбта 051 при Ереванском государственном университете (375049. Ереван, ул.Алека Манукяна, I, ЕрГУ, биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванского государственного университета

Автореферат разослан " 3 " 1996г.

Ученый секретарь Специализированного г __

Совета, кандидат биологических наук Qkxeu С.А.Гонян

и?(ии»лш\|рр l{iuuiuipi|bi t "ЧЬшшЬшЪ tiuiTui [ишрш^ф ^ЬЪишршЪш1{шЪ

фш^т. цлbuifi l|b\juuigf J^ui jp ujiTp^nVinLU

«UiSUHlttj WilWUT4 U <«111 Ш^ЫГМпи,

црпфЬипр

1Г.иЛичРЗиЪ

"нисэпшадъ CW>MTUMUJ\)WX ЪЬЪишршЪи^иЛ! qt»nnLpjnLVUbpti

.иштизи-ь

¡äbl^W

nnliinnp, iqpn^bunp

'МЬЪишршЪш^шЪ qfiuinLрJni^iVbpt uonL

л.и.чъчпгззи-и

*)ui?inillUj1inLßjni.lip Ii ш |шЪш I flL t

"Чш?

(375049, tpkuiti in bin )

t "J/j'kipMBkh-996?-.

ЧЬтш^шЪ ЬтГшцдириАфЪ ЦЬа 051 jiüuV™qFMui££2li lünplpqji Tuhuinni-J , TipkuiTj, U^bg Uuiljni.l{ jujüp ifmq. , X, MZ, фиЛ^пц-

и<лЬЪш{ипип|.р,|шЪ|} t ЬшЪпРшЪш^ tpU.mVi[n "ЧЬюш^шЪ £uiiTui цдириЛф

qpiuqiupiuVnLiT

UbqtTuiqjipp итшрЦшЬ t ' '¿¿_ ' '

иши"йш^1пши11ш"й ftnp'iprih qtnnuiiuAi ßUipinnLilUJp . ^ЬЪишриЛи^шЪ

qhinnLB jnLlnjbph ßbüliuibm. _ / Г"

11 1 1 Olaxe* и.илпъзиъ

0Б1ЦЛЯ ХАРАКТЕРНО ТИКЛ РАБОТЫ

Актуальность и обоснование темы. Важнейшей задачей современной биохимии является выявление механизмов регуля]тци обмена веществ. Регуляторшге механизмы, о оснопиом, пазнгпчваются на утювне..ферментов. В этом отиошении яажное значение ¡»мою? изо-ферменты. Часто пзоформк одного фермента участвует в капдиналь-но отличающихся процессах. В чясчтстя, установлено наличие двуг различных изофепментов аргиназы - уреотелкческого и неутэе-отелического, первый из которых является компонентом орнитино-вого никла мочевинообразования в печени уреотеличрских живот-ньгх, а втопой имеет широкое биологическое распространение и фуншзонирует вне орнитинового щкли, а именно: в биосинтезе пролина, глутаката и полиаминов из апгинина, лнмититюванки процесса биосинтеза гистопов (Давтян, I96L—199,4; Давтян и сотр., 1970-1992; Rsddy and Campbell, 1969; Gampor ond Mosa3 , 197^; Russell and McVicker, 1972; Yip and Knox, 1972; Kezl and Knox,

1977).

Очевидно, различные изоферменты неуреотелической аргиназы в различите организмах и органах имеют различные функции. Наиболее обоснованным является участие одного из неуреотелических изоферментов в процессе биосинтеза поолина из аигинина у аороб-ных инфузорий (Заробян и сотр., 1976), тутового шелкопряда (Агаджанян, Давтян, 1974) и других насекомых (Агаджанян, 1981; Reddy and Campbell, 1969), дождевого червя СГасспарян, 1983)» в регенерируго'ггей печени крыс (¡»лпсесян, 1989), в молочной железе лактируюдих крыс (Yip and Knox, 1972; Mesl and Knor^J1977). При этом, соответственно, указанный изоФермент аргиназы снабжен механизмом аллостерического ингибирования пролином (Агаджанян, 1987) и, в некоторых случаях (аэробные инфузории), репрессирования его синтеза (Заробян и сотр., 1976)'

Для более четкого разграничения функций изоферментов аргиназы является обоснованным дальнейшее исследование Фермента с более широким охватом различных органов и тканей. С этой кельи в данной диссертационной работе предприняты исследования по изучению изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс. Ранее (Greengard et al., 1970) было установлено лишь наличие аргиназы в зтом органе. Следует подчеекнуть, что поджелудочная железа вообще мало изучена в биохимическом отношении, в частности, от-

сутствуют данные о ферментах орнитинового цикла и пролина в этом органе.

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящего исследования являлось выявление ферментов орнитинового цикла в поджелудочной железе крыс, исследование изоферментного спектрг аргиназы и основных физико-химических параметров отдельных изс ферментов (молекулярная масса, Кт, Ш, субъединичный состав, наличие БН - групп в активном центре и др.) , а также наличия ферментов биосинтеза пролина из орнитина и их изоферментного спектра.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые предпринята попытка изучения ферментов орнитинового цикла в поджелудочной железе крыс. Впервые в этом органе обнаружены возможности биосинтеза аргинина из цитруллина и аспартата, катализируемого аргининсукцинатсинтетазой и аргининсукциназой. Таким образом, учитывая и ранее обнаруженную аргиназную активность (Сгеепеагс! et а1., 1970 , в этом органе присутствуют три из пяти ферментов орнитинового цикла. Впервые исследован изофёр-ментный спектр аргиназы поджелудочной железы крыс, обнаружены три ее изофермента. Отсутствие полного орнитинового цикла, а также свойства обнаруженных изоферментов аргиназы ( молекулярная масса, высокие значения Кт, чувствительность к тиоловнм реагентам и др.) свидетельствуют об их неуреотелическом характере.

Впервые обнаружена в поджелудочной железе орнитин - б" -трансаминаза (ОТ) и пирролин - 5 - карбоксилатредуктаза (П5КР1 катализирующие биосинтез пролина из орнитина. Учитывая неконкурентный (аллостерический) характер ингибирования двух из трех обнаруженных изоферментов аргиназы пролином с одной стороны и наличие ферментов биосинтеза пролина из орнитина с другой стороны, можно заключить, что указанные изоферменты аргиназы поджелудочной железы крыс функционируют в системе биосинтеза пролина из аргинина.

Полученные результаты могут быть учтены и использованы другими исследователями, работающими в области биосинтеза аминокислот и их роли в" злокачественном росте и регенерации поврежденных тканей.

Ащоб^ляработы. Материалы диссертации были доложены на годичных научных конференциях ЕГУ (1987 - 1969гг.) и отчетных заседаниях кафедры биохимии, а также представлены на 20-ой Биохимической Европейской конференции, Будапешт, 1990.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка использованной литературы, включающей 240 наименований. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 12 рисунков.

В обзоре литературы подробно изложены данные о ферментах орнитинового цикла и биосинтеза пролина, об их_. распрО'— странении, изоферментах, а также регуляторных свойствах у различных организмов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служили белые крысы весом 150-200г. Животных декапитировали, быстро извлекали поджелудочную железу, промывали и готовили 20% гомогенат в 0,05 М трис - нсх буфере, рН 7,4, содержащем 0,01 М кпС12 и 0,005 М аргинина. Гомогенизацию проводили в гомогенизаторе типа Поттера-Элведжема тефло-новым пестиком (5 х 30с).

Аогиназная активность. Активность фермента определяли по методу Ратнер и Паппас (Ratner and pappas, 194-9). Аргиназная активность выражалась в мкМ мочевины, удельная активность в мкМ мочевины на мг белка.

Определение мочевины. Мочевину в пробах определяли методом Арчибальда (Archibald, 1944), модифицированным "оура и Кауфманом (Moore and Kauffnan, 1970).

Определение белка. Концентрацию белка определяли по методу Лоури и сотр. (Lowry et al., 1951) и спектро*ото,''етРИ,^ски по интенсивности поглощения света при 280 нм на 0Т'-4А.

Очистку Фермента осуществляли нитеппиветеичз-тг этапами.

Термическая обработка. Термическую обработку провот'.тл при 45°С в течение 30 минут.

Высаливание сульфатом атония. Аргиназа осаждалась в пределе насыщения 20-50:4.

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Смесь активных фракций предыдущего этапа очистки наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1,6 х 18 см) насыщенной используемым буфером. Градиентную элюцию осуществляли буфером и раствором iiacl в бу-

фере: 0,25 М, 0,5 М, 0,75 М и I М. Скорость элюции - 70 мл/час объем фракций - 5 мл.

Ионообменная хроматография-на Ж--деллшоде^_Днас^щ;тивнъ фракций первого пика (4-7 фракций) и второго пика (15 - 21 фракций), полученных при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, пропускали через колонку с КМ-целлюлозой (1,6 х 12 см), насыщенно используемым буфером. Градиентную элюцию осуществляли буфером и раствором Nacl в буфере: 0,25 М, 0,5 М, 0,75 М и I М. Скорое элюции - 30 мл/час, объем фракций - 5 мл.

Определение молекулярной массы. Определение молекулярной массы проводили с использованием голубого декстрана (pharmacis высокомолекулярного вещества с молекулярной массой 2 х 10®.

Определение Km и Ki. Константу Михаэлиса (Km) для L - аргинина определяли методом Лайнуивера-Бэрка (Lineweaver and Burk, 1934-).

Константу ингибирования (Ki) для аминокислот - ингибиторе определяли графическим методом Диксона (Диксон, Уэбб, 1966).

В опытах по изучению влияния аминокислот и гуанидиновых с новакий на активность изоферментов аргиназа конечная концентрг ция их была 0,02 М.

Биосинтез цитруллина. Карбамоилфосфатсинтетазную и оршт транскарбамилазную активности определяли по Браунштейну и cotj (1956). Цитруллин определяли колориметрическим методом Арчибш да (Archibald, 1944).

Биосинтез аргинина из цитруллина. Аргининсукцинатсинтетас ную и аргининсукциназную активность определяли методом Ратнер и Паппас (Ratner and pappas, 194-9).

Определение мочевины проводили уреазным методом Зелингсо} в модификации Силаковой (1962).

Биосинтез поолина.Активность ферментов биосинтеза пролинг ОТ и П5КР выражалась в мкМ образовавшегося пролина на I г свежей ткани. Определение пролина проводилось по Блюменкрантц; (Blumenkrantz, 19SO).

Чувствительность метода составляет I мкг. В качестве ста] дарта применяли пролин в концентрации 2 мкг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Очистка аргиназы поджелудочной железы крыс

В результате экспериментов удалось разработать способ очистки аргиназы, представленный в таблице I.

Табличч I

Этапч О'кстки ирг:шази подмлудочно'! .чслпзч ::]лгс

ЭТАПЫ

Обдай; балок Общая актиглость Удолт.етл летииностъ 0,jvyot. >т [1 о''1"1','1 r11 бр.туп_' _" •'"

осадочная кость

г.мческая аботка

алнвашю суль-от.1 ai-i.ioraui -50" насицзлгл)

853,2 436 f 8

195,2 53,5

303 G 275?

2509 2500

3,5 G,3

13,3 46,7

I В nrv "

Л,Р. 05,3

13,3 'г,з

СО О Г( О С. 3

< I

! м

I ITini П пик

I пик П гсш Е! гшс

2,8 14,7

0,3 6,2

133 2340

135 40

2033

49,5 159,2

П1,4 132,3

327 9

14,1

45,5

17,5

37,С

01,Я

72, Г,

В результате представленных в таблице этапов очистки, нами выделены 3 активности аргиназы - I, II, III, отличающееся хрома-тографическим поведением, т.е. зарядом белка.

2. Определение молекулярной массы изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс

Молекулярные массы I и II активностей составляют 93320, а молекулярная масса III активности - 269153. О^об^оя полученную данные по очистке аргиназы поджелудочной железы крыс, можем заключить, что в этом органе содержится три изо|еруента аргиназы, которые отличаются по заряду, а один из них, III, отличается от двух других и по молекулярной массе. По всей видимости он является тримером, ибо его молекулярная масса почти в три раза выше таковой остальных изоГер'/ентон, янлягагу/хся мономерами.

7

CI

Ч -X

Возникает вопрос, существуют ли в действительности указа ные изоферменты в интактной клетке поджелудочной железы, или же они являются результатом диссоциации олигомерной структуры фермента на субъединицы в ходе фракционирования на ионообмен-никах и гельфильтрации. В связи с этим следует подчеркнуть, что, согласно данным литературы, некоторые хелатирующие соеди нения, в частности ЭДТА, неконкурентно ингибируют аргиназу, связывая двухвалентные катионы Мп, Со, Ni и др., поддерживющи!

олигомернуга структуру, вследствие чего фермент диссоциирует в субъединицы. Так, аргиназа из печени, почек, сердца и легкого человека (Porembska et al., 1993; Baranzyk-Kuzma et al., 1980; Dahlig et al., 1977), а также печени кролика (Velle-Bre ithburg and orth,i972) под действием ЭДТА распадается на мон меры, что сопровоздается падением активности. Подобным образо; диссоциирует на субъединицы (М.м. 34000) аргиназа многощетин-КОВЫХ червей Pista pacifica Berkly с М.м. 205000 (O'Malley an

Terwillinger, 1974-).

Согласно исследованиям-нашей-лаборатории,—олиглмерная_........

структура (М.м. 126000) аргиназы печени лягушки Rana ridibund под влиянием ЭДТА диссоциирует на димерную (М.м. 60260) и мон мерную (М.м. 35480) и одновременно инактивируется (Барсегян и др., в печати). Необходимо учесть, что удаление ионов мп под влиянием хелатирующих агентов не всегда приводит к диссоциаци фермента или падению его активности. Так, под влиянием ЭДТА а гиназн печени цыплят (Dzikowska et al., 199^), теленка (Dahli et al., 1975), быка (Harell and Solcolovski, 1972) и тонкого к шечника крысы (Hagihara and Hiros, 197*0 не распадаются, хотя активности подавляются.

В наших исследованиях гельфильтрация, очевидно, удаляет определенное количество свободного мп среды, но не связанного с ферментом,и, следовательно, распад фермента на субъединицы при гельфильтрации представляется маловероятным.

В литературе отсутствуют данные о распаде аргиназы на су< единицы под воздействием ионообменников. Установлено, что лиш при крайне низких значениях рН среды аргиназа распадается на субъединицы и инактивируется. При-рН 7,4 проявляется только К общей активности аргиназы печени быка (рН 9,5)(Sprlnp;ell,i975' Аргиназа печени человека при рН 5,0 за час теряет 78% активно* ти (Bascur et al., 1966). При рН 2,0 в течение 10 мин полност)

инактивируется аргиназа печени крыс, причем мп2+ не предотвращает процесс инактивации (нозоуаиа, 1972). При всех указанных случаях кислотной инактивации аргиназы происходит распад фермента на субъединицы: так, тетрамерная структура аргиназы печени крыс (Алчуджян, 1983) и кролика (Козоуата, 1972) распадается на димерные (М.м. 64000) и мономерные (М.м. 32000) структуры при pH 4,0 и 2,0 соответственно. Аргиназа печени лягушки Rann ridibunda (М.м. 110000 - 136000) также подвергается кислотной инактивации при pH 3,6 с распадом на субъединицы (М.м. 34910), очевидно, вследствие разрыва дисульфидных связей (Арцруни и др. в печати).

Приведенные факты говорят в пользу того, что изолированные нами I, II, III активности аргиназы поджелудочной железы крыс являются, очевидно, индивидуальными белками (изофермента-ми), а не структурами, образовавшимися при гельфильтрации-или ионообменном фракционировании фермента. Что же касается молекулярных масс обнаруженных нами изоферментов (I, II - 93320, III - 269153), то они заслуживают внимания. У большинства аргиназ различного происхождения наиболее характерным является молекулярная масса в пределах 120000 - 140000 (Давтян и др., 1981), однако имеются и значительные отклонения от этих величин. Так, Давтяном и сотр. низкомолекулярный изофермент аргиназы (М.м. 30000) обнаружен в печени крыс, а также в тканях куколки тутового шелкопряда (М.м. 60000) (Давтян и др., 1981). Изофермент аргиназы с М.м. 45000 вэделен из растворимой фракции гомогената печени головастика T?ana ridibunda (Барсегян и др., 1977а). Низкомолекулярные изоферменты аргиназы обнаружены также в молочной железе - 94000 и 42000 (Class and Knox, 1973), почках - 35000 (Асланян, 1979) и мозгу крыс - 62000 (Давтян, Бунятян, 1970)« Встречаются в природе и высокомолекулярные изоферменты аргиназы. Таковыми являются аргиназа люпина

- 500000, Bacillus lichenilormis _ 260000 (Simon and Stalón, 1976)> аэробных свободноживущих инфузорий Paramecium siultimic-ronucleatum - 160000 - 200000 (Заробян, 1976), высших грибов Neurospora crassa - 278000 (Mora et al., 1971), тутового шелкопряда - 220000 (Давтян и др., 1981), гепатопанкреаса улитки

- 244000 (Hartenstein, 1971; Reddy and. Campbell, 1969), грудной стенки речного рака - 225000, печени ящерицы и цыпленка -

220000 - 280000 (Mora et al., 1965; Porembska , 1971).

Приведенные данные литературы наглядно показывают, что об наруженные нами изоферменты аргиназы поджелудочной железы по своим молекулярным массам не являются исключением, т.к. изофег менты с аналогичными молекулярными массами встречаются и у некоторых других представителей биологического мира.

Можно допустить, что обнаруженный нами изофермент III <-■/ 270000, является тримером и состоит из трех мономеров с М.м. 90000, аналогично обнаруженным в различных организмах тример-ным формам аргиназы. Так, имеются данные о присутствии тримерг аргиназы в печени крыс (Kanyo et al., 1992), в эритроцитах человека (ikemoto et al., 1989), в Saccharomyces cerevisiae (Green et al., 1991).

3. Влияние ЭДТА на структуру и активность аргиназы поджелудочной железы крыс

В этой серии эксперимеятол.^.иаследовада влияние _ЭДТА не активность аргиназы поджелудочной железы крыс.

Согласно литературным данным аргиназы ряда организмов по; влиянием ЭДТА ингибирутотся, причем степень ингибирования зависит от концентрации ЭДТА (Барсегян и др., в печати;Porembska et al., 1993; Baranzyk-Kuzma et al., 1980; Dahlig et al., 197' Velle-Breithburg and Orth, 1972).

Ингибирующее влияние ЭДТА обусловлено тем, что реагент связывает ионы некоторых двухвалентных металлов и, в том числе, истинного активатора аргиназы Мп^+. Имеются многочисленны« данные, что ионы Мп являются необходимыми для поддержания четвертичной структуры-аргиназы. Карваял .и сотр. (Carvajal et al., 1971)» изучая влияние Мп^+ на четвертичную структуру аргиназы печени человека, обнаружили, что присутствие ионов Мп необходимо для сохранения активной конформации фермента, который имеет М.м. II8000. Инкубирование фермента с ЭДТА и последу ющий диализ приводят к образованию неактивного фермента с М.м. 30000. Теми же авторами за последние годы в исследованиях по изучению роли двухвалентных металлов в проявлении активности аргиназы печени человека было показано, что не только ионы Мп являются существенными в связывании фермента с субстратом, в этом процессе большая роль отводится и ионам Со и Ni (Carvajal et al., 1995).

Исходя из вышеизложенного, мы задались целью изучить влияние ЭДТА на активность аргиназы поджелудочной железы крыс. Так как в экспериментах по исследованию возможности распада аргиназы на субъединицы под влиянием ЭДТА необходимо было достаточно высокое количество исследуемого фермента, нами, из выделенных в процессе очистки аргиназы поджелудочной железы крыс трех изо-ферментов, использовался только II.I, который получался в достаточно большом количестве и с высокой активностью. ?Ла исследовали влияние 15-минутного инкубирования ферментного препарата в присутствии различных концентраций ЭДТЛ (1-20 мМ) при 30°С. Одновременно проверялось влияние на инактивацию предннкубиро-вания ферментного препарата с марганцем (2 мМ) в течение 15 минут при 30° (табл. 2).

Таблица 2

Влияние различных концентраций ЭДТА на активность III изофермента аргиназы поджелудочной железы крыс Активность в мк.'/! мочевины/мл п = 7

ЭДТА, мМ

' - I 5 10 20 Варианты

Без предын- g 5+g qq 5,6+0,03 5,0+0,01 4,6+0,6 3,5+0,3

кубирования ' " ' р <0,001 р< 0,001 р< 0,01 р <0,001

Предынкуби- 8,3+0,06 8,0+0,07 5,6+0,88 4,4+0,53

рование с 8,5+0,02

марганцем ~ р < 0,02 р < 0,01 р < 0,01__р_-с 0,001

Из таблицы видно, что уже при концентрации ЭДТЛ I мМ активность изофермента падает от 6,5 до 5,6, а при 20 м!Л - до 3,5. Предцн-кубирование с марганцем предотвращает ингибирование лишь при низких концентрациях ЭДТА (I - 5 мМ). При высоких концентрациях ЭДТА (10 - 20 мЮ предохраняющий эффект марганца отсутствует. Таким образом, можем заключить, что степень ингибирования фермента ЭДТА зависит от степени связывания марганца, что, в свою очередь, зависит от концентрации марганца и ЭДТЛ в среде.

Исходя из многочисленных данных о необходимости ионов марганца для поддержания четвертичной структуры аргиназы, мы допустили возможность распада фермента поджелудочной железы крыс

вследствие связывания марганца ЭДТА. С целью подтверждения этого предположения 30 мл ферментного препарата мы подвергли обработке 0,02 М ЭДТА в течение 30 мин при 30°. По истечении этого времени к препарату добавили сухого сефадекса й - 75 с учетом степени его набухания, чтобы избежать разбавления фермента при гельфильтрации и пропустили его через колонку с сефадексом С- 75 (1,8 х 75см). Гельфильтрация Ш изофермента обнаруживает один активный пик с молекулярной массой 270000, а после обработки ЭДТА, кроме I основного высокомолекулярного пика, проявляется и П - низкомолекулярный, менее выраженный пик - 93000. Следовательно, можем заключить, что ингибирование активности Ш изофермента ЭДТА связано с его частичным распадом на субъединиц с более низкой молекулярной массой.

Далее мы исследовали возможность восстановления Ферментативной активности инактивированного ЭДТА препарата добавлением марганца в количестве, эквивалентном ЭДТА - 20 мМ (табл. 3).

Реактивация ЭДТА-обработанного III изофермента аргиназы поджелудочной железы крыс ионами марганца

Активность в мкМ мочевины/мл п = 5

""^Добавки

Ое рме ЭДТА 20 мМ ЭДТА, Мп"^ 20 :

III изофермент 6,8 + 0,87 3,7 + 0,16 6,5 + 0,02

р с 0,001 р< 0,01

Из таблицы видно, что активность фермента, упавшая от инкубиров, ния с ЭДТА, полностью восстанавливается после добавления марган ца.

Таким образом, результаты исследований показали, что при реактивации восстанавливается почти 100% первоначальной активно! ти фермента. Предположение о восстановлении структуры фермента при обработке марганцем подтвердило значение М.м. 270000, полученное при гельфильтрации реактивированного фермента_на_се^ фадексе С - 200.

4. Кинетические свойства изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс

В данной серии экспериментов мы изучали константы Улхаэли-са (Km) изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс для Ь - аргинина, а также характер и константы ингибирования в присутствии лизина, пролина и ЩК.^^ленные нами изофермен-ты аргиназ_ы имеют сходные значения K,-n - I - 13 мМ, П - 18 мМ, Ш - 25 мМ, т.е., фактически, мало отличающиеся сродством к аргинину. Подобные высокие значети Кт более характерны для не-уреотелической аргиназы.

Результаты наших исследований по изучению ингибирутогдего влияния некоторых аминокислот и гуанидиновых оснований на изоферменты аргиназы поджелудочной железы крыс представлены в таблице 4. PAYK не влияет на активность выделенных изоферментов аргиназы поджелудочной железы, тогда как лизин и про-лин заметно ингибируют активность Г и П изоферментов, не влияя

Таблица 4

Кнгибирование активности изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс различными ам/.ноккс-лотала и гуанидиноташ соединениями % п => 6

Изоферменты Добавления

I

II

III

Лиз

При

ГАМК

Вал

ЛеП

Илей

Me т

21,5 ±2,02 18,2 + 1,10 г,1_+..0Д7-

21,5 + 1,51 22,5 ± 1,39 7,3 + 1,17

25.3 + 1,94 24,5 + 2,02 2,1 + 0,17

20.4 ± 0,69 23,4 + 2,30 20,8 + 0,52 5,9 + 0,84 5,3 + 0,30 3,2 + 0,34 7,5 + 0,45 6,5 + 0,31 6,1 + 0,21

14,0 + 1,67 18,7 + 2,15 0

39,0 + 2,30 15,0 + 1,24 0

О О О

Глу Гли

Гуанидиноуксус-ная кислота

Гуашданоянтарная кислота

10,6 + 0,68 8,2 + 0,60 6,6 + 0,41

5,6 + 0,32 5,0 + 0,38

О

- Т4 -

на III. Валин, лейцин, изолейцин и метионин от 18% до 25% инги-бируют активность I и II изоферментов, почти не влияя на активность III, за исключением метионина, ингибирующего его активност на 21%. Незначительное ингибирующее влияние на все три изофермен та оказывают глутаминовая кислота, глутамин, гуанидиноуксусная кислота и несколько выраженнее - гуанидиноянтарная кислота. Таким образом, изоферменты аргиназы поджелудочной железы в отношении" -ингибирующо го влияния различных аминокислот мало отличаются от аргиназ иного происхождения.

Кривые, приведенные на рис. I, 2 и рис. 3, 4 , показывают характер ингибирования I и II изоферментов ь - лизином и Ь -пролином, Ъ - лизин конкурентно, а ь - пролин - неконкурентно ингибиругт I и II изоферменты.

Неконкурентное ингибирование пролином представляет определенный интерес.Очевидно, ингибирование носит аллостерический характер, т.е. на ферменте имеется специальный центр для модулятора. Предыдущими исследованиями нашей лаборатории обосновано возможное участие"йеуреотелической аргиназы"в механизме биосинтеза пролина из аргинина и, следовательно, ретроградное ал-лостерическое ингибирование аргиназы конечным продуктом является регуляторным механизмом, выработанным в течение эволюции. Это особенно выражено в отношении аргиназы аэробных свободно-живущих инфузорий, у которых пролин не только аллостерически ингибирует аргиназу, но и репрессирует индукцию фермента, т.е. у указанных организмов аргиназа находится под двойным контролем генетическим и метаболическим Ь - пролина (Заробян и др., 1976).

Показана четкая корреляция между активностью неуреотели-ческой аргиназы, аллостерически ингибируемой пролином, и ферментов биосинтеза пролина в течение онтогенеза у тутового шелкопряда (Агаджанян, Давтян, 1974), в кишечнике дождевого червя (Гасспарян, 1983г; Давтян и др., 1982), у личинок и куколок фасолевой зерновки (Агаджанян, 1981), в молочной железе беременных и лантирующих крыс (Арутюнян, Агаджанян, 1981).

Полученные нами данные позволяют заключить, что обнаруженные нами в поджелудочной железе крыс изоферменты аргиназы, очевидно, являются нвуреотелическими, со свойственным для не-уреотелических ферментов низким сродством к субстрату, а также

Ki "1.16 • M

-25 Pao. 3

Ki~L5-W2 M

75 (тм

Ячг;;биров.зние II изэфермента аргиназы поджелудочной железы крыс А- пролином

Яий50

75 i мкН

4 - Ингибирование II изо^еруента аргиназы подхелудочной железы А - лизино!/.

- SO -25

Рйо. I - Кнгибироьание I и.заpep'.'

железы кокс L- .тээ.т/нз

Ki-t.Ob-W* M

г5 50 75i м кМ

та аргиназы подпелузочно?

7SI ПКМ

Rjc 2 " Кнгибиро?гн;:е I изо'вр^екта аргиназа1 подтелулсгаой .железы крыс L - лизкно".

Ol I

высоким молекулярным весом (III изофермента). Очевидно, обнаруженные нами I и II изоферменты аргиназы поджелудочной железы функционируют в системе биосинтеза пролина из аргинина и с этой целью они, соответственно, снабжены возможностью аллосте-рического ингибирования конечным продуктом.

5. Етияние ПХМБ на активность изоферментов аргиназы поджелудочной железы крыс

Исследование действия реагентов на различные функциональные группы позволяет выяснить наличие последних в активном центре, их участие в проявлении активности фермента. Наиболее специфическими и чувствительными реагентами на сульфгидриль-ные группы являются органические соединения ртути, в частности, парахлормеркурибензоат (ПХМБ) при воздействии которого на сульфгидрильные группы образуются меркаптиды.

Данные литературы свидетельствуют о том, что ПХМБ оказывает различное действие на аргиназы различного происхождения. Доказано, что этот реагент не действует на уреотелическую аргиназу печени крыс (Mora et al., 1966); печени человека (Carvajal et al., 1971) , тутового шелкопряда (Reddy et al., 1969), печени лягушек (Исаченков, 1967; Барсегян, Давтян, 1977), в то время как оказывает ингибирующее влияние на неуреотелическую аргиназу печени цыплят (Mora et al., 1966; Myrzinska, 1970), речного рака (nartenstair, 1971)». дождевого червя (Гасспарян и др., 1981, Давтян и др., 1982), дрожжей (Чубарян и др., 1989), люпина (Myszinska, 1970 , печени головастиков (Арцруни и др., в печати), бактерий Khodobacter capsulatus YTRY (Moreno-Vivian,1992

Результаты наших исследований, показывают, что все изученные изоферменты аргиназы поджелудочной железы крыс ингибируются ПХМБ. Особенно чувствителен к реагенту III изофешент, который ингибируется ПХМБ, начиная с концентрации 10~^М, тогда как ингибирующее влияние реагента на II изофермент проявляется с концентрации а на I изо-

фермент - При этом ПХМБ в концентрации 10 ингибирует

активность I изофермента на 25,5%, II - на 35,8%, а III - на 67,3%

Таким образом, можем заключить, что все изоферменты чувствительны к ПХМБ, следовательно, являются тиоловыми, что более характерно для аргиназ неуреотелической природы.

6. Ферменты орнитинового цикла в поджелудочной железе крыс

С целью исключения возможности участия обнаруженных изо-ферментов аргиназы поджелудочной железы крыс в механизме биосинтеза мочевины мы, в специальной серии экспериментов, исследовали активность ферментов биосинтеза цитруллина из СО^, АТФ и орнитина при участии карбадаилфосфатсинтетазы и орнитин-транскарбамилазы, а также биосинтез аргинина из цитруллина и аспартата при участии аргининсукцинатсинтетазы к аргининсук-циназы в поджелудочной железе.

Обнаружение карбамоилфосфатсинтетазы и орнитинтранскарб-амилазы в тканях различных организмов представляет особый интерес, ибо доказывает возможность вовлечения неорганических форм азота (Ш^) в анаболические процессы биосинтеза аргинина и других гуанидиновых соединений, Следует подчеркнуть, что подобная возможность, согласно литературным данным, допускается лишь в печени уреотелических животных и считается основным аргументом для доказательства уреотелизма (Давтян,—1964; Випуа-Ыап et а1., 1966).

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии биосинтеза цитруллина из-за отсутствия орнитинтранскарбамилазной или карбамоилфосфатсинтетазной или же обоих активностей в поджелудочной железе крыс, что является веским основанием для отрицания функционирования орнитинового цикла в этом органе и еще одним аргументом в пользу неуреотелической природы аргиназы поджелудочной железы крыс.

В параллельных пробах в гомогенате печени крыс обнаруживается, как и следовало ожидать, значительная активность биосинтеза цитруллина из С0£, КН^» орнитина при участии АТ5 и глу-тамата.

Аргининсукцинатсинтетазнуго и аргининсукциназную активность определяли одновременно путем инкубации гомогенатов в присутствии аспартата. штоуллина. АТФ и. аргиназы. ■ 3 течение часовой инкубации гомогената из цитруллина и аспартата синтезируется лишь 1,83 мкМ аргинина на I г свежей ткани В контрольных пробах с гомогенатами печени в идентичных условиях наблюдается значительный синтез аргинина (94 мкМ)«

Ткким образом, в поджелудочной железе крыс, по крайней мере, обнаружены 3 из 5 ферментов орнитинового цикла. Подобная

ситуация имеется и в почечной (Асланян, 1986) и мозговой (Дав-тян, 1970) ткани крыс, где, возможно, готовый цитруллин, поступающий из крови, может превратиться в аргинин и даже в мочевину. Из аргинина под влиянием трансаминаз могут образоваться различные однозамещенные гуанидиновые соединения, фосфорные производные которых-являются высокоэргическими соединениями. Очевидно, обнаруженные нами активности аргининсукцинатсинтета-зы и а.ргининсукциназы в поджелудочной железе также обеспечивают биосинтез указанных соединений из поступившего через кровь цитруллина. Что же касается изоферментов аргиназы поджелудочной железы, то они, очевидно, имеют неуреотелическую природу, что подтверждается значениями к&, молекулярных масс, к± и отсутствием в этом органе полного орнитинового цикла и, следовательно, они, возможно, участвуют в других метаболических процессах. Дня I и II изоферментов является логичным участие в биосинтезе пролина из аргинина.

С целью подтверждения этого предположения нами в новой серии экспериментов изучался биосинтез пролина из орнитина -продукта расщепления аргинина аргиназой.

7. Биосинтез пролина в поджелудочной железе крыс

Сотрудниками нашей лаборатории проведены серии экспериментов по изучению возможности биосинтеза пролина из различных предшественников в гомогенатах различных объектов: инфузорий, тутового шелкопряда, фасолевой зерновки, дождевого червя, различных органов крыс (Агаджанян и др., 1975; Агад-жанян, Давтян, 1975; Агаджанян, Арутюнян, 1979; Агаджанян, 1981; Давтян и др., 1982). Полученные данные показали, что во всех изученных объектах происходит интенсивный синтез пролина из орнитина, тогда как биосинтез пролина из других предшественников (аргинин, цитруллин, глутамат, 1Г - ацетил-глутамат) представлен не во всех объектах. Так, у инфузорий р. ии^1т±сгопис1еа1;ш1 не обнаружен биосинтез пролина из аргинина, цитруллина, глутамина, но происходит довольно интенсивный его синтез из н - ацетилглутамата (Заробян и др., 1976а). н" - ацетилглутамат является эффективным предшественником для биосинтеза пролина также у гусениц тутового шелкопряда, как в гомогенате целого тела, так и тканях и во мно-

гих органах, за исключением шелкоотделительной железы,(Агад-жанян, 1974).

Исследованиями лаборатории установлено, что предшественником для биосинтеза пролина в печени, почках, мозгу и молочной железе контрольных крыс является орнитин, а в мозгу и молочной железе беременных и лактирующих крыс, наряду с орнити-ном и цитруллин САрутюнян, 1984). В данной серии экспериментов авторами не удалось выявить превращения аргинина в пролин, т.к. опыты проводились в условиях, оптимальных для ферментов биосинтеза пролина - при рН 7,6, в отсутствие ионов Ул, что исключает активное функционирование аргиназы. Однако авторы не исключают возможность биосинтеза пролина из аргинина в ин-тактном организме, где в силу компартментализации клетки в определенных компартментах могут быть более высокие значения рН, позволяющие функционирование неуреотелической аргиназы, расщепляющей аргинин на орнитин с последующим вовлечением ор-нитина в биосинтез пролина.

Исходя из вышеизложенного, в данной серии экспериментов мы исследовали возможность биосинтеза пролина из орнитина в гомогенате, а также осадке и надосадочной жидкости гомогената поджелудочной железы крыс. Нас интересовало также какие кето-кислоты в большей степени способствуют биосинтезу пролина из орнитина в присутствии НАДН в поджелудочной железе крыс. Полученные данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о том, что выход пролина особенно высок в присутствии оС - КГ (1,92 мкМ), несколько меньше в присутствии "¡УК (1,28 мкМ) и значительно меньше в присутствии пирувата (0,55 мкМ).

Таблица 5

Биосинтез пролина в поджелудочной железе крыс в присутствии различных кетокислот п = 5

Варианты

мкМ пролина на I г ткани

1. Орн, ос - кетоглутарат

2. "Орн, пируват

3. Орн, ЩУК

1,92 + 0,33 0,55 + 0,02 1,28 + 0,06

Очевидно,с*. - кетоглутарат особенно эффективен в процессе трансаминирования орнитина, тогда как ЩУК и, особенно, пи-руват менее эффективны.

Ряд исследований нашей лаборатории посвящен изучению влияния окисленных и восстановленных нуклеотидов (НАД4-, НАДГ1", НАДН, НАДФН), а также адениловых нуклеотидов САТФ, АД5, А.\85) на биосинтез пролина у различных организмов. Давтяном и сотрудниками установлено, что эффективность НАДН в качестве кофактора П5КР в мозгу и молочной железе крыс уступает НАДЭД. Такая же закономерность обнаружена у личинок фасолевой зерновки: НАДОН, как кофактор, действует эффективнее НАДН при любых комбинациях изоферментов ОТ и П5КР (Агаджанян, 1987).

С другой стороны, некоторые исследования нашей лаборатории и других авторов свидетельствуют о сильном подавлении окисленными нуклеотидами (НАД4", НАДО4) биосинтеза пролина с участием частично очищенных ОТ и П5КР дождевого червя ( Гас-спарян, 1983), фасолевой зерновки САгаджанян, 1987), молочной железы крыс (Арутюнян, 1984), листьев сои (Miller and Stewart, 1976), хрусталика глаза крыс (Shioto et al„, 1986). Следует отметить, что на уровне гомогенатов в вышеуказанных объектах окисленные нуклеотиды не только не ингибируют, но и в значительной степени стимулируют биосинтез пролина (Гас-спарян, 1983; Арутюнян, 1984). Установлено, что в гомогенате фасолевой зерноЕки на всех стадиях ее метаморфоза (личинки, куколки, жуки), а также в мозгу крыс биосинтез пролина сильно стимулируется окисленными нуклеотидами и органическими кислотами. Причем, по активированию этого процесса органические кислоты располагаются в следующем убывающем порядке: у личинок - цитрат, изоцитрат, малат; у куколок и жуков, в мозгу крыс - изоцитрат, цитрат, малат. Примечательно, что во всех случаях стимулирование процесса органическими кислотами в 2-3 раза эффективнее в присутствии НАДФ+, нежели НАД1" (Агаджанян, 1990). Разумейся .К& уровне., очищенных препаратов отсутствуют ферменты окисления этих кислот и восстановления НАД5, что и обусловливает отсутствие стимулирующего эффекта этих кислот на биосинтез пролина в пробах с очищенными препаратами.

Изучение влияния адениловых нуклеотидов на активность ОТ и П5КР показало, что АТФ оказывает ингибирующее влияние на активность обоих ферментов в мозу крыс (Манукян, 1984), кишечнике дождевого червя (Гасспарян, 1983) и у фасолевой зерновки (Агаджанян, 1987).

С другой стороны ATS практически не влияет на НАД5 - зависимую активность П5КР в сетчатке глаза (Katsuzava, 1932). У Е. coli обнаружено подавление этой активности, но лишь при сравнительно высоких концентрациях АТ5 (Hayzer and Moses, 1978).

Учитывая вышеизложенное, в новой серии экспериментов № задались целью изучить влияние восстановленных и окисленных форм НАД и НАД5, а также адениловых нуклеотидов на биосинтез пролина в гомогенате, надосадочной жидкости и осадке гомоге-ната поджелудочной железы крыс. Полученные данные (табл. 6) свидетельствуют о том, что в исследуемой железе кофактором для П5КР является НАДФН , в присутствии которого образуется в 2 раза больше пролина (1,86 мкМ), чем в пробах с НАДН (0,80 мкМ). Из таблицы 6 видно, что биосинтез пролина в поджелудочной железе крыс осуществляется также в поисутстши окисленных нуклеотидов НАД$+ и НАД +, причем этот процесс наиболее интенсивнее на уровне гомогената: в присутствии НАД$+ в гомогенате синтезируется 0,56 мкМ пролина, надоса-дочной жидкости гомогената - 0,38 мкМ, осадке - 0,16 мкМ на I г ткани. Очевидно, на уровне гомогената происходит восстановление НАД4" и НАДФ+, которые, являясь носителями восстановительного потенциала П5КР, восстанавливают П5К в пролин.

Цитрат является наиболее эффективным активатором процесса. На уровне гомогената в поджелудочной железе крыс в присутствии НАД5+ и цитрата синтезируется 1,54 мк.\! пролина, что более чем в 3 раза превышает количество пролина, синтезируемого в контрольных пробах без цитрата (0,44 мк!Л). В осадке и над-осадочной жидкости гомогената также идет активация биосинтеза пролина в присутствии цитрата, изоцитрата и малата. Здесь наблюдается та же закономерность: в присутствии цитрата в нац-осадочной_жидкости и осадке синтезируется почти в 2 раза больше пролина, чем в контрольных пробах (0,079 мкМ вместо 0,44 и 0,32 мкМ вместо 0,16 соответственно). Цитрат, изоцитрат и ма-лат, очевидно, окисляясь, восстанавливают НДДФ+ в НЛДФН и тем

Таблица 7

Влияние окиеленннх нухлеотидов, органических кислот и АД5 на биосинтез лролина в лодкелудочной жэлезо крыс

п = 7

Сраяцки Варианты икМ пролкна на I г ткани

0,44 + 0,08

КАД$+ + изо^трат 1,10 + 0,23 р <0,02

н § НАДР'1" + палат 0,70 ± 0,07 р с0,05

ш и о НАДО* + цитрат 1,54 + 0,05 р <0,001

5 (Ч НАД5 ',+ изощтрат + Ада НАД$ + палат + № 0,89 + 0,12 0,44 + 0,21 р <0,01

НАД} + ц*трат + Д5£ 1,14 + 0,07 р< 0,001

л ч НАДО 0,41 + 0,02

о 0 1 НАДО + изоцитрат 0,74 + 0,07 р< 0,001

НАДО +. малат 0,61 + 0,03 р<0,05

§ о 3 НАДО + цитрат 0,79 + 0,11 р < 0,01

НАДО + изоцитрат + А® 0,32 + 0,03 р <0,02

я о о НЛД5 + палат + АДО 0,44 + 0,01 р <0,5

к НАДО +• цитрат + АДО 0,53 + 0,03 р <0,01

НАДО 0,16 ± 0,01

НАД? + изоцитрат 0,23 + 0,03 р ^ 0,05

НАДО + малат 0,19 + 0,01 р <0,02

о НАДО + цитрат 0,32 + 0,02 р <0,001

о о НАДО + изоцитрат + АДО 0,12 + 0,02 р<0,1

нега л. »пв П АЯ ^ П ПТ г. ПЛТ

Таблица 6

Влияние нуклеоткдов на биосинтез проякна в разных фракциях гомогеката подогелудочноЯ железы крыс п = 7

Оракцга Варианты шсМ пролета на I г ткани

НЛДН 0,80 +0,07

НАД5Н 1,86 + 0,27

в § 0) и ОД4 0,41 + 0,11

НАда+ 0,76 + 0,18

й + А1Ф 0,18 + 0,07

НЩ+ + А& 0,23 + 0,С6

НАД5+ + № + Мл" 0,03 + 0,001

1,03 + 0,11 1,27 + 0,23 0,45 + 0,078 0,48 + 0,076 0,08 + 0,01 0,12 + 0,03 0,03 + 0,002

НДЦН 0,36 + 0,03

шдан 0,36 + 0,0Э2

к НАГ 0,07 + 0,01

о § НАД5+ 0,16 + 0,03

о о нлда+ + атф 0,01 + 0,01

тт 1 < п* л л/» л лл

!* нлдн

1| нлдан

!| НАД*

!§ НДда+

; | НШ* + АТФ

нлда+ + лда

Ш 1ОД+ + Щ> + Й!**

самым стимулируют биосинтез пролина.

Возвращаясь к вопросу о влиянии адениловых нуклеотидов CAT® и АДФ) и ионов ivin на биосинтез пролина (табл. 6 ), можно сказать, что они оказывают ингибирующее влияние, особенно выраженное в пробах с АДФ и Полученные нами данные (табл. 7) относительно подавления АДФ стимулирующего влияния органических кислот на биосинтез пролина вполне объяснимы существующими данными литературы об ингибирующем влиянии АДФ на цитоплазматические НАД5 - зависимые дегидрогена-зы изоцитрата и малата (Землянухкн и др., 1987%

Следующая серия экспериментов посвящена изучению изо-ферментного спектра ферментов биосинтеза пролина в поджелудочной железы крыс. Исследованиями на^ей лаборатории выявлены два изофермента ОТ на всех стадиях метаморфоза фасолевой зерновки (Агаджанян, 1987) и в кишечнике дождевого червя (Гасспарян, 1983) и один - в молочной железе (Арутюнян, 1984) и мозгу крыс (Манукян, 1984). Обнаружены два изофермента П5КР в молочной железе (Арутюнян, I9S4) и один - в мозгу крыс (Манукян, 1984) и один у куколок и жуков фасолевой зерновки (Агаджанян, 1987), два - в кишечнике дождевого червя (Гасспарян, 1983).

В наших исследованиях изоферментный спектр ферментов биосинтеза пролина поджелудочной железы крыс изучали методом фракционирования гомогената на колонке с сефадексом G - 150. Полученные данные свидетельствуют о том, что в поджелудочной железе крыс ОТ представлен одним пиком, а П5КР - двумя, т.е. изоэнзимный спектр поджелудочной железы совпадает с таковым молочной железы крыс (Арутюнян, 1984).

В литературе имеются данные о влиянии различных эффекторов на ферменты биосинтеза пролина, в частности, тиоло-вых реагентов, ионов металлов и гидроксиламина в качестве ингибитора трансаминирования, ПХМБ в концентрации Ю"4 М ингибирует активность П5КР печени крыс и табака (Noguahi et al., 1966; Miller and Stewart, 1976), а в концентрации 2 • I0~3 М П5КР синей мухи (Yoschinaßa ot al., 1977). ПХМБ,d - аминовалерьяновая кислота, ионы двухвалентных

металлов оказывают ингибирующее действие на биосинтез пролина у фасолевой зерновки, дождевого червя и в молочной железе крыс, гидрокисламин же, ингибируя процесс в первых двух объектах, стимулирует его в молочной железе крыс (Агаджанян, 1990) Нами исследовалось влияние ПХМБ и гидроксиламина на ферменты биосинтеза пролина (табл. 8).

Таблица 8

Етаяние гидроксиламина и ПХМБ на биосттеэ пролина в поджелудочной железе крыс ОТ - 7-9 фр.;

П5КР - 9-11 фр. п ® б

Концентрации Активность пролина в мкМ на I г ткани

ингибиторов ПХМБ

Контроль 0,87 + 0,13 0,87 + 0,13

ю-2 0,15 + 0,01 р < 0,001 0,10 + 0,007 р < 0,001

ю-3 0,20 +0,02 р ^ 0,001 0,25 + 0,05 р < 0,001

0,5 . Ю-3 0,20 + 0,01 р < 0,001 0,45 + 0,09 р < 0,05

10-4 0,20 ± 0,01 р < 0,001 0,60 + 0,04 Р <0,1

0,5 • Ю-4 0,35 + 0,12 р< 0,02 0,84 + 0,03 -

Гидроксиламин подавляет активность ферментов биосинтеза пролина в концентрациях Ю-4 М и выше. Подавляющий эффект ПХМБ проявляется уже при самой низкой из использованных нами концентраций, Ю-4 М. Мигрирование ПХМБ биосинтеза пролина в поджелудочной железе крыс ыожет..£ЕИД§щельстврват^ характере П5КР, аналогично ферменту хрусталика глаза крыс (БМопо еЪ а1., 1982), кишечника дождевого червя и фасолевой зерновки (Гасспарян, 1983; Агаджанян, 1987). Ингибирующее влияние гидроксиламина, очевидно, объясняется подавлением трансаминирования орнитина, как это было установлено и в отношении ОТ из других объектов (Гасспарян, 1983; Агаджанян, 1987).

общие вывода

Исследование ферментов орнитинового цикла и биосинтеза пролина поджелудочной железы крыс и некоторых их физико-химических свойств позволяет сделать следующие выводы:

1. В поджелудочной железе крыс функционируют три фермента орнитинового цикла (аргиназа, аргининсукцинатсинтета-за и аргининсукциназа), катализирующие биосинтез мочевины

из цитруллина и аспартата. Ферментативный биосинтез карбамо-илфосфата не представлен в этом органе.

2. Выделены в очищенном виде три изофермента (I, II, iii) аргиназы поджелудочной железы крыс, отличающиеся по заряду и молекулярной массе (I, II изоферменты - низкомолекулярные 90000, III изофермент - высокомолекулярный 270000).

3. Все три изофермента имеют сходные сравнительно высокие значения Кт (13 мМ, 18 мМ, 25 мМ), т.е. низкое сродство к Ь - аргинину, характерное для аргиназ неуреотелического типа. Указанные изоферменты являются тиоловыми (активность ингибируется 10~% ПХМБ), что является характерным для не-уреотелической аргиназы.

4. Ь - лизин и ь - пролин ингибируют низкомолекулярные изоферменты (I, II) аргиназы поджелудочной железы крыс, не влияя на высокомолекулярный (III), причем ь - пролин инги-бирует I и II изоферменты неконкурентным механизмом.

5. Аргиназа поджелудочной железы крыс (III изофермент) ингибируется ЭДТА на 5<Ж. Активность полностью восстанавливается после добавления марганца. Гельфильтрация обработанного ЭДТА фермента, кроме основного пика (~270000), обнаруживает дополнительный пик активности с низкой молекулярной массой (~90000). Очевидно, в механизме ингибирования аргиназы ЭДТА существенным является распад тримера на субъединицы.

6. В экстрактах поджелудочной железы крыс обнаружены ферменты биосинтеза пролина из орнитина: орнитин - <4 -трансаминаза и пирролин - 5 - карбоксилатредуктаза, кофактором для которой является НАДФН. Цитрат является эффективным актигатором биосинтеза пролина, а АДФ и Мп^+ ингибируют его. Гидроксиламин и ПХМБ (10~^ М) также ингибируют биосинтез пролина.

7. Методом гельфильтрации экстрактов поджелудочной железы крыс выявлены два изофермента пирролин - 5 - карбокси-

латредуктазы.

8. Присутствие в поджелудочной железе крыс ферментов биосинтеза аргинина из цитруллина, ферментов биосинтеза пролила из орнитина, а также неуреотелический характер изофер-ментов аргиназы и аллостерическое ингибирование последних пролином позволяют, заключить, что. I и II изоферменты аргиназы поджелудочной железы крыс, очевидно, функционируют в механизме биосинтеза пролина из аргинина.

- СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никоян A.A., Туманян Л.Р., Чубарян C.B., Арутюнян Л.М. Очистка и некоторые свойства аргиназы поджелудочной железы крыс. Биол.ж.Армении, 1990, т.43, №2, C.III-II5.

2. Arutunian T.G., Chubarian S.V., Toumanian L.R., Arutunian J.M., Movsesian H.S., Nikoian A.A. Physico-chemical proper ties and. functions of arginase of different nature.20-th Meeting of Fed.of European Biochemical Soc.Budapest,1990.

3. Давтян M.А., Никоян A.A., Туманян Л.Р., Чубарян C.B. Влияние ЭДТА на структуру и активность аргиназы поджелудочной железы крыс. Ученые записки ЕГУ, 1995,

т. 183, J32, С .130-133

4. Никоян A.A., Туманян Л.Р., Чубарян C.B., Арутюнян Л.М., Давтян М.А. Изоэнзимы аргиназы поджелудочной железы крыс, их молекулярные массы и кинетические свойства. Биол.ж.Армении /в печати/.

urin>"ut UlWUtSíi ъпчпзиъ

Ua\ibin¡i ЬЪршшлииГприш^Ъ qbqdfi ofïjgfit-l (_t» L l{hliuiiiuh\iphq[i фЬр^ГЬЪшЪЬрр

uironouitir

\iqni jguijfili puirxbp4 uipqfi^juiquijfi fiqn$bpd"bljm\ibp , op^jfi¡3[ilj - 6* -ui^juuiiTfi^ituqui, ифргц[1Ъ - 5 - Цшррпри|1 luiinnbqnL[|iniiiqui

¿ииГш\|ш!^ш!||1д ({bluiuipfiiTfiuij Ji l(tuplinpujqni. jV |u\ir\(ip\i t" li jni ршфп-\iuit(nL|<t jujIj (|iupqun|npiTui\i i/b(uui\i[iqir^bpfi ршдш íui jmntiTp : iitupquiilnpd'ui^ |uui\jfiqiAibp[i ^шрдр, ^(иГЪш^шЪпц/, fuiuquipt^nLiT t $bpi/b\jtn|i ifujl^iupquj-i| : Ujq mbiiuil^binjig 1(шркпр \i?ui\jui!{nt pjщЪ ni.\ib^i [iqn$bpiTb^jin\ibpp : Ош|и uTfilibriLj^j 3>bptTh\!uifi ¡nqn^bpiTbWlihpp iJuiu\iuil{gnLir ЬЪ uipifuju4uu)bu ppbpi^nq mpngbulibpnuf:

Vbpl{ui ui!nb"üiu¡unijnL!i)jui\i iJhf \ibpl|ui juigi]uib ЬЪ Sbifliuqninnt.pjnt.^\ibp bbtn¡i ЬЪршитииГприш^Ъ qbqdfi jfiYi ü. 1{Ь1шш-

liPbq[i íibpiTbliin^ibpti riL unLiT^JuiujipnL p JUJ\I i}bpuipbpjuJL:

flLunttT\imu¡ipiJbl t um\ibi/iji b^PuiinnuiiTnpuuiJqbqd|i iupq[i\iiuqu) jfi n^bpiTblimuijIilj uu(bt{inpp: £u<jm^uipbpiJbL t bpbp [iqn^bpiTbVmljbp -, 2 - дшЬрин/гцЫ^т. [tup , 3 - ptupdpuiiTn [ЬЦпи ¡.шр) : jui'üuipbpijb [ t лрги. ifiVjig Ii шищшршилл^д "ТЧЬ^Ь^1!1 Ь\«иши^Ърbqр , прр ^qijnLLT

jipqfllifi\iunt.l{gfi\iu!mufilji3bp)uiquijni] Il Op\i[iP[iW-

^ 9 hk. L Ь nl PnlnP 5>bpif b\jui\ihp[i unt^ui j ne P j ni-Ър , ti\i¿u)bu Viuiül uipqji^jui-

fiq n^i bpifb\nn\ib p fi íum'^riL P jm\i\ibpp i|t|ujjni.ir b\j \ipiu\ig n¿ nLpbn-[[it| p^nijpfi ITIUU^\J:

Un\ibui|i ЬЪРшиюииГприш qbqdntiT Suijw\jujpbpi|bi b\i op\ifiBjiTj -5" npuiliuuiiTfi^juiquj II mfipn^fi^ - 5 - ({Uippnpu[i цшлп bqni.t|uiuiqui , npn\ip nm^fiqnuT bli !|b>juiuutilipbq p op\j[ip[ilj|ig:

i,ui?i||i ^ui jw\juipbp>}uib uipqtiWqu)jji jiqn5>bpiib\iui\jbp[ig bp-

,u(i bpbp|ig n¿ Ijnljl^rn. pb\jwuijfi\i ш (Д nuin bp|il.( ujpqb[ш!|пи/р iqpn-Lini| , fi^rçbu \iuj!i. op\iJip[iVihg ujpn ^¡i^i^i t{b\iuuiufi\j|i)bq|i bpiTb\«n\ibp(i ^jntPjntVp, Ljuipb^fi t bqpml^ug^/bL, np umljbui|i ЬЪршиишиГпришj¡n\j

iupqfi\iuiquj j|i [îqn^bpiTbVinVibpp qnpbnuT b\i шpqg щрп-

j[i !{b^iumu(i^ipbq[i u^upbiTnLii:

\Juiuigi|ui}> mijjui|^bpp t|ujpnq b\i uin\>ijbL b. oqinmqnpbi]b|^ ujji

«iuqnuinq\ibp[i l|nqiT[ig, npn\ip ш^шипиГ b\i miT[>\iujppni.\ihpfi ЦЬЪиши^Ъ-ф L ЪршЪд qbpfi" ¿шрпрш!| »dji ti ^Ъши^шЬ íjni.ui}ujbp\ibp[i nbqb\ib-рЪшдш^шппцГ: