Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека

Иванова, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека"

На правах рукописи

□03443804 ИВАНОВА Елена Викторовна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СРЕДНЕГО (М) ДОМЕНА ФАКТОРА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ еКН ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

1 6 ОПТ 2008

003448804

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научные руководители академик РАН, доктор биологических наук,

профессор JI. Л. Киселев

доктор химических наук В.И. Польшаков

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор O.A. Донцова

доктор биологических наук A.C. Миронов

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт

Биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А.ОвчинниковаРАН

Защита диссертации состоится 2008 г в

часов на заседании Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А. Энгельгардта РАН по адресу. 119991, Москва, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан » 0КШЛ&1Л 2008 г.

Актуальность работы

Механизм терминации трансляции, заключительной стадии биосинтеза полипептидной цепи в эукариотах, до настоящего времени остается во многом неизученным Ключевую роль в узнавании стоп-кодона в А-участке малой субчастицы рибосомы эукариот, передаче сигнала в большую субчастицу, а также последующем гидролизе сложноэфирной связи в пептидил-тРНК играет белковый фактор терминации трансляции первого класса еКР1 Ранее методом рентгеновской кристаллографии было показано, что молекула е1Ш состоит из трех доменов- И-концевого, или Ы-домена, среднего, или М-домена, и С-концевого, или С-домена Ы-домен ответственен за узнавание стоп-кодона матричной РНК С-домен взаимодействует с фактором терминации второго класса еИРЗ, за счет чего последний стимулирует активность е11Р1 М-домен содержит высококонсервативный трипептидный фрагмент ООО, необходимый для гидролиза пептидил-тРНК как в эукариотах, так и в прокариотах Результаты структурных и биохимических исследований указывают на то, что минидомен вОО располагается в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы рибосомы Абсолютная консервативность ООО-мотива в факторах терминации первого класса всех живых организмов указывает на его исключительную роль в процессе терминации трансляции

Полученная ранее структура еМЧ в кристалле имеет относительно низкое разрешение, особенно в подвижных функционально важных участках, таких, как, например, петля, содержащая трипептид ООО, или ООО-петля Несмотря на интенсивные исследования в области терминации белкового синтеза, проведенные в последнее десятилетие, многие вопросы остаются невыясненными каким образом происходит передача терминационного сигнала от малой субчастицы рибосомы к большой, как происходит гидролиз пептидил-тРНК и какую роль в нем играет М-домен еМЧ7 Для понимания механизма реакции терминации трансляции у эукариот необходимы дальнейшие углубленные исследования структуры, динамических свойств и функциональных особенностей отдельных доменов еИЛ Поэтому исследо-

вания в данном направлении представляются актуальными Для определения структуры белка в растворе в последние годы широко используется спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Методы ЯМР позволяют также определить динамические свойства белка и исследовать его взаимодействие с другими биомолекулами Для изучения функциональных особенностей еИЛ и роли его отдельных аминокислотных остатков в процессе терминации использован точечный мутагенез с последующим тестированием активности фактора

Цели и задачи исследования

Целями данной работы являются определение структуры высокого разрешения М-домена е1Ш человека в растворе, изучение его динамических свойств, связывания М-домена еИЧ с рибосомой эукариот и определение функциональной роли минидомена БвС) в механизме терминации трансляции Для достижения этих целей сформулированы следующие задачи 1) получение высокоочищенных препаратов М-домена еИР1 человека, меченных стабильными изотопами 13С и 15М, 2) получение меченого препарата мутант-ной формы М-домена еМЧ 01у183А1а, неактивного в функциональных тестах, 3) измерение и последующий анализ гетероядерных 2В и ЗО спектров ЯМР для расчета структуры М-домена и определения его динамических свойств, 4) изучение взаимодействия М-домена еМЧ с рибосомами эукариот, 5) выполнение точечных замен аминокислотных остатков в вСС)-петле М-домена еШЧ методом сайт-направленного мутагенеза, 6) выделение, очистка и исследование функциональной активности полученных мутантных форм е1У?1 человека

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые определена структура высокого разрешения в растворе М-домена еШЧ человека и изучены его динамические свойства Выявлена повышенная скорость обмена амидных протонов минидомена ввС) с водой Наиболее вероятной причиной наблюдаемых эффектов является координа-

дия молекул(ы) воды остатками Glyl83 и Glyl84 этого функционально важного участка белка Показано, что М-домен eRFl селективно связывается с большой 60S субъединицей рибосомы эукариот Найдены аминокислотные остатки М-домена, образующие интерфейс такого взаимодействия Исследован функциональный вклад каждого из инвариантных и полуконсервативных аминокислотных остатков в составе минидомена GGQ На основании полученных структурных и функциональных данных впервые предложен механизм реакции гидролиза пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре рибосомы, в котором eRFl служит непосредственным катализатором

Результаты представленной работы существенно углубляют понимание молекулярного механизма терминации белкового синтеза у эукариот, что имеет важное значение для детального изучения процесса синтеза белка в эукариотической клетке в целом Кроме того, изучение структурных и функциональных особенностей eRFl позволит в будущем разрабатывать новые методы коррекции наследственных дефектов и лечения различных заболеваний, связанных с преждевременной терминацией синтеза белка в клетке, вызванной появлением нонсенс-мутаций в кодирующей части мРНК

Апробация работы

Материалы работы были представлены на следующих международных конференциях Meeting on Translational Control (6-10 сентября, 2006, Cold Spring Harbor, США), The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, RNA-Protein Interactions (19-24 августа, 2006, Пансионат «Буран», Московская обл, Россия), Trends in Transient Interactions between Biological Macromolecules, FEBS Workshop (16-19 мая, 2007, Севилья, Испания), Protein Synthesis and Translational Control (12-16 сентября, 2007, Хайдельберг, Германия

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на /¿¿страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы ( /6<Р наименований) Диссертация содержит ¿^рисунков и ¥ таблиц

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение и очистка меченного стабильными изотопами препарата М-домена eRFl человека и его мутантной формы GIyl83AIa

Генно-инженерные конструкции на основе трансляционного вектора pET23b(+) (Novagen), кодирующие полипептидную цепь М-домена eRFl человека (со 140 по 275 аминокислоту) и его мутантной формы Glyl83Ala, в клетках Е coli получены в нашей лаборатории ранее Методом сверхэкспрессии в клетках Е coli в минимальной среде М9, содержащей сульфат аммония-1^ и глюкозу-13С, получены препараты белков, меченные указанными стабильными изотопами Методика выделения рекомбинантных белков была аналогична методике, описанной ранее для выделения целого белка eRFl (Frolova et al, 1994) Выделенные белки были дополнительно очищены с помощью ионообменной хроматографии в системе АКТА («GE Healthcare», Великобритания) с использованием колонки HiTrap SP объемом 1 мл

Клонирование и экспрессия eRFl, несущих точечные мутации в М-домене, и определение их функциональной активности

Мутантные формы eRFl получали сайт-направленным мутагенезом, который проводили с помощью ПЦР по методу "мегапраймера". В качестве матричной ДНК использовали плазмиду pERF4B, кодирующую полноразмерный ген erfl человека На первом этапе, с помощью ПЦР получали фрагмент ДНК, несущий требуемую замену с использованием соответствующего «мутагенного» праймера и одного из праймеров, комплементраного к 5'- или 3'- концу гена Полученный фрагмент очищали в легкоплавкой агарозе и использовали в следующем раунде ПЦР в качестве "мегапраймера" в паре с

одним из праймеров, комплементарным к 3'- или 5'- концу гена Достроенный таким образом фрагмент далее клонировали в заранее подготовленный вектор pERF4B. Плазмиды с нужной мутацией отбирали секвенированием, после чего трансформировали штамм Е coli BL21(DE3)pUBS520 для выделения мутантного белка Рекомбинантные белки выделяли в соответствии с описанным ранее методом (Frolova et al, 1994) RF-активность, связывание с предтерминационным комплексом и способность вызывать конформацион-ные перестройки определяли m vitro с помощью реконструированной эука-риотической системы трансляции (RETS) (Alkalaeva et al, 2006)

ЯМР спектроскопия и расчет структуры

Гетороядерные 3D спектры HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNHAHB, HBHA(CO)NH, HCCH-TOCSY, HNHB, [!H, 15N] NOESY-HSQC, ['H^C] NOESY-HSQC и 2D спектры 15N-HSQC, UC-HSQC, DQF-COSY и NOESY были измерены при 5°C и 25°C на спектрометрах ЯМР Vanan INOVA 600 и 800 MHz, а также Bruker AVANCE 600 MHz Обработка и анализ спектров выполнен с использованием программ NMRPipe, Sparky и RelaxFit Расчет структуры белка выполнен методом молекулярной динамики с наложенными экспериментальными ограничениями с использованием программ СНС, XPLOR-NIH и ARIA Анализ качества рассчитанных структур выполнен с помощью программ AQUA, PROCHEK-NMR и MolMol Анализ динамических свойств белка проведен с использованием программ TEHCOR-2 и RelaxFit Визуализация и анализ структурных данных выполнены с помощью программ Insightll (Accelrys Inc ), VMD и MolMol.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структура М-домена eRFl человека в растворе

Анализ спектров ЯМР, измеренных при температурах 278 и 298К, позволил получить 2338 ограничений на межъядерные расстояния, торсионные углы и ориентацию связей N-H Эти данные использованы для расчета семейства 25 структур ЯМР, показанных на рис 1А Из рассчитанных 25 кон-формеров определена репрезентативная структура, дающая наименьшую сумму среднеквадратичных отклонений координат тяжелых атомов полипептидной цепи (Са, С и N) при суперпозировании на нее всех остальных членов семейства Величина такого среднеквадратичного отклонения не превышала О 9 А Если исключить из анализа наименее структурированный фрагмент GGQ-петли, значение среднеквадратичных отклонений координат атомов остальной белковой цепи не превышает 0 4А, что соответствует структуре высокого разрешения Структурные данные размещены в Protein Data Bank под кодом 2HST

Топология М-домена eRFl человека представляет собой Р-ядро, формируемое пятью Р-листами (как параллельными, так и антипараллельными), окруженное четырьмя а-спиралями al-a4 (рис 1Б) Структура содержит несколько петель, самой длинной из которых является GGQ-петля

Структура М-домена eRFl человека в растворе близка к установленной ранее структуре в кристалле (Song et al, 2000), однако далеко ей не идентична (рис. 1А) Величина среднеквадратичных отклонений для атомов белковой цепи (Са, N, О и С) при суперпозиции 25 структур ЯМР на структуру в кристалле составляет 3 8±0 2А Наиболее заметны различия в ориентации GGQ-петли и ее переходе в спираль al Обнаружены также различия в геометрии участков 194-197, 213-219, 237-245 и 258-260 Все перечисленные участки, кроме 194-197, соответствуют петлям, соединяющим элементы вторичной структуры Таким образом, различия между структурой М-домена eRFl в кристалле и его структурой в растворе заключаются преимущественно в ори-

ентации петель и а-спиралей относительно (3-ядра белка Они могут быть обусловлены вероятными эффектами кристаллической упаковки, влиянием соседних С- и М-доменов на структуру М-домена в составе целого еКЛ в кристалле и/или неточностью определения координат некоторых участков белка из-за низкого разрешения кристаллической структуры вИР!

Рисунок 1. Структура М-домена еМЧ человека в растворе А. Суперпозиция семейства 25 структур ЯМР Серьм цветом показаны атомы основной белковой цепи (Са, N и С) семейства структур ЯМР Черным цветом показана структура М-домена еМЧ человека в кристалле, суперпозированная на репрезентативную структуру белка в растворе Б. Топология репрезентативной структуры М-домена еРД человека с указанием элементов его вторичной структуры

Самой неупорядоченной частью структуры М-домена еКР1 является вОС^-петля (177-187) (рис 1А) Однако, поскольку именно этот участок наиболее важен в функциональном отношении, его структура представляет особенный интерес При температуре 298К на спектрах, измеренных для М-домена еКР1, сигналы амидных протонов участка 177-187 белковой цепи отсутствовали Тем не менее их удалось детектировать и отнести в спектрах мутантной формы М-домена 01у183А1а, а также в спектрах М-домена, измеренных при температуре ниже 288К Исчезновение сигналов при 298К ука-

СС<2-пет:

зывает на наличие быстрого обмена амидных протонов с водой. Существует две вероятные причины такого быстрого обмена: (а) данный участок белковой цепи координирует одну или несколько молекул воды, ускоряет обмен амидных протонов; (б) локальная величина рН данного участка белка превышает 8, что приводит к ускоренному обмену НИ с водой за счет основного катализа.

Значительное снижение скорости обмена амидных протонов при замене 01у183А1а, не влияющей на распределение заряда в минидомене ООО и, следовательно, на значение локального рН, свидетельствует о том, что наиболее вероятной причиной быстрого обмена амидных протонов в ООО-петле является координация молекулы (или молекул) воды. Согласно данным динамических измерений (см ниже) ООО-петля претерпевает высокоамплитудные движения. Вместе с тем среди множества конформеров можно определить конформацию ООО-петли с наибольшей населенностью, т.е. наиболее энергетически выгодную (рис. 2А).

Рисунок 2. А. Расчетная наиболее энергетически выгодная структура минидомена ОвС?, соответствующая репрезентативной структуре петли 175-189. Б. Гипотетическая модель координации молекулы воды в ОйО-петле.

На этой структуре карбонильные группы 01у183 и 01у184 практически параллельны друг другу и их геометрия позволяет формировать водородные связи с координируемой молекулой воды. На рис. 2Б показана модель координации ООО-петли с молекулой воды. Такая модель не является единствен-

но возможной Амидные группы тех же аминокислотных остатков, 01у183 и 01у184 также практически параллельны друг другу и направлены в противоположную карбонильным группам сторону петли Такая геометрия позволяет формировать водородные связи с акцепторами, которыми могут быть атомы кислорода молекулы воды или, например, нуклеотидные основания тРНК

Очевидно, что экспериментально обнаружить такую молекулу воды методом ЯМР, и тем более измерить время ее жизни в координированном состоянии невозможно, ввиду быстрой динамики ООО-петли Данные экспериментов по релаксации ядер 15Ы (см ниже) позволяют предполагать, что время жизни этой координированной молекулы воды не может превышать нескольких не Вместе с тем, при связывании еЯР1 с рибосомой и формировании терминационного комплекса, подвижность белковой цепи М-домена должна снижаться и, в таком случае, время жизни молекулы воды в координированном состоянии может оказаться достаточным для ее участия в реакции гидролиза

Влияние замены С1у183А1а на структурные свойства М-домена еВД1 человека

В дополнение к определению структуры М-домена еМЧ человека дикого типа был проведен анализ структуры мутанта 01у183А1а Из функциональных исследований (Тго1оуа е! а1, 1999) известно, что замена 01у183А1а в белке еМЧ приводит к полной потере его активности Анализ спектров ЯМР мутанта 01у183А1а М-домена показал, что данная мутация не вызывает существенных изменений как в структуре М-домена в целом, так и в конфор-мации петли 177-187 химические сдвиги сигналов М-домена дикого типа и мутанта 01у183А1а не совпадают только для одного аминокислотного остатка с каждой стороны от точки замены Вместе с тем, такая замена вызывает существенное уменьшение скорости обмена амидных протонов с водой, в результате чего при температуре 298К детектируются все сигналы петли 177187, не наблюдаемые при данной температуре у М-домена еИР! дикого типа Таким образом, мутация 01у183А1а меняет лишь локальную конформацию

минидомена ввС^, что, в свою очередь, может нарушать координацию моле-кул(ы) воды.

Динамические свойства М-домена eRFl

Информация о динамических свойствах М-домена еШЛ получена в результате анализа экспериментально измеренных скоростей релаксации ядер 15М амидных групп и величин кросс-релаксации 15Ы-!Н (рис. 3).

Рисунок 3. Представление белковой цепи М-домена eRFl человека в виде трубки, ширина которой соответствует относительной амплитуде внутренних движений белковой цепи. А. Быстрые движения (от пс до не): ширина пропорциональна величине 1-S2, где S2 - параметр порядка, рассчитанный из релаксационных экспериментов. Б. Медленные (мс) кокформациокные перегруппировки: ширина цепи пропорциональна величине Rex - увеличения скорости поперечной релаксации за счет химического обмена.

Установлено, что наибольшей амплитудой движений, происходящих в шкале времени от пс до не в М-домене eRFl обладает GGQ-петля. Кроме того, в спектрах l5N-HSQC, измеренных при 278К, аминокислотные остатки Gly 181, Gly 183 и Glyl 84 наблюдаются в виде групп сигналов различной интенсивности, что свидетельствует о существовании данного фрагмента белковой цепи в виде смеси конформеров, переходящих друг в друга в шкале времени от мс и выше. Эти факты указывают на сложный характер динамики

ССС^-петли, включающей как быстрые движения белковой цепи, так и более медленные конформационные перестройки

Вторым наиболее подвижным фрагментом М-домена оказалась петчя, находящаяся на противоположном мотиву вОС! конце длинной спирали а1 Эта относительно короткая петля (позиции 215-223) претерпевает как быстрые (в шкале времени порядка 1 не), так и более медленные (миллисекунд-ные) движения

Подвижность этих двух петель может играть роль в поддержании кон-формационной пластичности белка для его эффективного связывания с рибосомой Вместе с тем, обращает на себя внимание тот факт, что петля 215-223 располагается на стыке М- и И-доменов еКР1 и с петлей ее разделяет длинная спирали а1 Это позволяет предполагать, что спираль а.1 может служить медиатором передачи терминационного сигнала от Ы-домена к функционально важной СвС^-петле посредством изменения конформации петли 215-223

2. Взаимодействие М-домена еШ?1 человека с рибосомой эукариот

В нашей лаборатории ранее было показано с помощью биохимических

тестов, что МС-домен еКР1 способен связываться с рибосомой Анализ

структуры комплексов прокариотических факторов терминации с рибосома-

ми позволяет предполагать, что М-домен еИР1 может связываться с 60Б

субъединицей рибосом эукариот Для определения интерфейса взаимодейст-

вия М-домена еМ7! человека с рибосомами эукариот был проведен монито-

ринг изменения интенсивности сигналов ЯМР аминокислотных остатков

белка в процессе титровании его рибосомами При молярных соотношениях

белка к 60Б субъединице рибосомы выше 5000 1 видимых изменений в ин-

тенсивности и ширине сигналов в спектрах 15М-Ш(ЗС не наблюдается При

последующем увеличении концентрации 60Б субъединиц интенсивность

сигналов белка уменьшается в соответствии с изменением молярного соот-

ношения белок/рибосома в растворе При молярных соотношениях белка к

рибосоме менее 3000:1 наблюдается практически полное исчезновение всех сигналов из спектров Ш(ЗС. Наиболее значимые изменения в спектрах происходят в довольно узком диапазоне соотношений белка и 60Б субъединиц рибосом от 4500:1 до 4000:1. В данном диапазоне интенсивность сигналов аминокислотных остатков белка, находящихся в непосредственном контакте с рибосомой, уменьшается наиболее быстро, что позволяет идентифицировать интерфейс контакта белок-рибосома.

С, 84 А183

Рисунок 4. Аминокислотные остатки, интенсивность которых уменьшается наиболее заметно при взаимодействии М-домена е!1Р1 человека с 60Б субъединицей рибосомы. Крупными шарами показаны атомы Са таких аминокислотных остатков. А. Белок дикого типа. Б. Мутант С183А.

Аминокислотные остатки белка, формирующие интерфейс взаимодействия с рибосомой, преимущественно расположены вдоль длинной а-спирали М-домена (рис. 4А). Кроме того, ряд аминокислотных остатков соседних к а! и расположенных на (3-листовом тяже (35 и двух коротких а-спиралях а2 и аЗ также вовлечены в формирование контакта белок-рибосома. Уменьшение интенсивности сигналов Р146, У225 и Ь226, распо-

ложенных не на поверхности белка, а в его Р-ядре, может быть обусловлено их малой подвижностью и близостью к интерфейсу взаимодействия с рибосомой

Установлено, что М-домен eRFl связывается специфически с большой 60S субъединицей рибосомы аналогичного взаимодействия с малой 40S субъединицей не обнаружено

Взаимодействие функционально неактивного мутанта G183A с 60S рибосомой оказалось, хотя и специфичным, но существенно более слабым по сравнению с белком дикого типа Кроме того, интерфейс взаимодействия не идентичен для белка дикого типа и мутанта (рис 4Б) Полученные результаты подтверждают высказанное выше предположение о функциональной роли длинной спирали al М-домена и указывают на то, что конформационная подвижность GGQ петли важна для образования плотного контакта белок-рибосома

3. Функциональная роль аминокислотных остатков минидомена GGQ

Минидомен GGQ содержит высокий процент инвариантных и полуконсервативных аминокислотных остатков (рис 5) Такая высокая консервативность может быть обусловлена в большей степени функциональной ролью этих аминокислотных остатков, чем их участием в образовании трехмерной структуры, так как обычно одиночные замены в петлевых участках белка не приводят к существенным изменениям стабильности белка и его конформации Следует отметить, что, помимо других аминокислотных остатков, минидомен GGQ содержит инвариантные His и Ser, абсолютной консервативностью которых также характеризуются некоторые классы гидролаз Анализ первичной структуры GGQ-петли позволил предположить, что eRFl непосредственно участвует в реакции гидролиза сложноэфирной связи в пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре рибосомы Для проверки этой гипотезы и установления роли отдельных аминокислотных остатков минидомена GGQ в гидролизе пептидил-тРНК нами проведен анализ

Homo sapiens (166)

Xenopus laevis (166)

Drosophila melanogaster (166)

Dictyostelium discoideum (168)

Arabidipsis thaliana (164)

Caenorhabditis elegans (174)

Saccharomyces cerevisae (163)

Podospora ansernia (161)

Schizosaccharomyces pombe (163)

Plasmodium falciparum (162)

Paramecium tetraurelia (167)

Giardia intestinalis (171)

Leishmania major (168)

Trypanosoma brucei (167)

Tetrahymena thermophila (165)

Oxytricha trifallax (171)

Stylonychia mytilus (171)

Stylonychia lemnae (171)

Euplotes aediculatus (162)

Blepharisma americanum (166)

-< RF2 Salmonella typhimurium (238

* RF2 Escherichia coli (238

RF2 Haemophilus influenzae (238

RF2 Bacillus subtilis (237

RF1 Haemophilus influenzae (222

RF1 Mycoplasma pneumoniae (222

RF Mycoplasma capricolum (223

RF1 Pseudomonas aeruginosa (223

RF2 Staphylococcus aureus (238

RF2 Rhodopirellula baltica (196

RF2 Yersinia pestis (239

RF2 Yersinia enterocolitica (238

RF2 Ehrlichia ruminantium (122

RF1 Rhodopirellula baltica (223

RFl Staphylococcus aureus (219

RFl Yersinia pestis (221

RF2 Lactobacillus delbrueckii (237

RFl Salmonella enterica (221

RF2 Rodococcus sp. (235

RFl Ehrlichia ruminantium (221

RFl Bacillus subtilis (219

RFl Mycoplasma pulmonis (22 4

RF2 Corynebacterium diphtheriae (235

RFl Tropheryma whipplei (217

RFl Mycobacterium leprae (22 6

RFl Rodococcus sp. (224

RFl Corynebacterium diphtheriae (221

RFl Clostridium perfringens (220

RFl Clostridium botulinum (219

RFl Streptococcus mutans (222

RF2 Streptococcus mutans (196

Рисунок 5. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей мини-домена ввС} эукариотических (А) и прокариотических (Б) факторов терминации трансляции первого класса. Белым на черном фоне выделены абсолютно консервативные аминокислотные остатки, черным на сером фоне выделены полуконсервативные аминокислотные остатки. Над последовательностью показаны элементы вторичной структуры. Звездочкой помечены позиции, в которые вводились замены (см. Табл.1).

мутантных форм eRFl, содержащих замены в следующих позициях Asp 175, Lys 178, Lysl79, Hisl80, Glyl81, Glyl83, Glyl84, Glnl85, Serl86 и Argl89 Полученные мутанты исследовали на их способность связываться с предтер-минационным комплексом (рге-ТС) и вызывать конформационные перестройки, а также определяли RF-активность (табл 1)

Связывание мутантных форм eRFl с предтерминационным комплексом и их способность вызывать конформационные перестройки

Способность eRFl вызывать конформационные перестройки предтер-минационного комплекса (рге-ТС) и связывание с ним без их индукции отражают два различных типа связывания фактора (i) функционально значимое связывание, в результате которого происходят конформационные изменения в рге-ТС, и при котором eRFl оказывается в функционально активном участке, и (н) связывание, которое не вызывает указанных изменений и не несет функциональной роли

В целом, замены оказывают гораздо менее значимый эффект на связывание eRFl с pre-ГС, по сравнению с их влиянием на способность вызывать конформационные перестройки (табл 1) Замены в положениях Aspl75, Glyl81 и Glnl85 не оказывают существенного влияния как на связывание, так и на конформационные перестройки рге-ТС Мутантные формы eRFl по Lys 178 и Lys 179 сохраняют способность к связыванию и индукции конфор-мационных перестроек в том случае, если происходит замена на положительно заряженные аминокислотные остатки При замене Lys 178 на Asp фактор перестает вызывать конформационные перестройки, а связывание его с рге-ТС падает примерно на 50% Значительное влияние на способность вызывать конформационные изменения рге-ТС оказывают замены в положении Argl89. При замене этого остатка на Ala или Gin способность вызывать конформационные перестройки практически исчезала, тогда как связывание указанных мутантных форм eRFl сохранялось на уровне 80% Только при замене аргинина на положительно заряженный лизин индукция конформацион-

Таблица 1. Функциональные характеристики мутантных форм eRFl человека

№ Конформационные перестройки3 Связывание6 Гидролиз пептидил-тРНК"

1 2 рге-ТС eRFl 0 100 0 100 0,0 100,0

3 D175H 74 100 86,5

4 D175S 94 95 92,8

5 D175N 100 102 99,1

6 D175R 100 85 115

7 K178R 90 105 97,3

8 К178 А 66 84 53,5

9 K178I 32 75 15,3

10 K178D 8 59 4

11 K.179R 91 104 92,9

12 К179А 20 81 17

13 К1791 32 90 7,8

14 КК/АА 10 59 10

15 HI 801 56 105 5,5

16 Н180А 51 104 5,7

17 H180R 63 103 3,0

18 Н180Е 21 79 5,0

19 Hl 80S 83 102 11,6

20 H180D 8 81 3,1

21 G181R 100 106 103,9

22 G181S 92 104 95,7

23 Gl 83 А 64 100 5,2

24 G183S 31 88 6

25 G183R 63 94 0

26 Gl 84 А 51 100 5,3

27 G184S 7 65 9,3

28 G184L 11 87 5

29 Q185G 92 104 14,5

30 Q185N 100 103 15,1

31 32 33 Q185R Q185E Q185I 99 45 100 104 99 103 15,2 8,6 3

34 S186T 37 93 9

35 S186A 57 100 27

36 S186L 61 103 3,6

37 S186H 46 101 2

38 R189A 0 83 6

39 40 R189Q R189K 0 44 82 98 1 16

Все данные представлены в %% (а) интенсивность сдвига предтерминационного ком-

плекса (pre-ТС) на +2 нуклеотида по матрице MVHL-стоп мРНК, сопровождающегося гидролизом MVHL-tPHK, в RETS, (б) интенсивность сдвига рге-ТС на +4 нуклеотида по CPV-стоп мРНК, не сопровождающегося гидролизом MVHL-tPHK, (в) высвобождение 358-меченного тетрапептида MVHL из пептидил-тРНК

ных перестроек сохранялась примерно на 50%. Возможно, инвариантные Argl89, Lys 179 и Lys 178 участвует во взаимодействии GGQ-петли с отрицательно заряженной пептидил-тРНК и/или 28S рРНК

Анализ RF-активности мутантных форм eRFl

Замены вариабельных аминокислотных остатков Glul75 и Glyl81 не влияли на RF-активность Содержащий мутации в положениях Lys 178 и Lysl79 eRFl, сохранял RF-активность тотько в случае замены на положительно заряженный аргинин Остальные мутанты по этим позициям теряли активность либо полностью, либо частично Схожие результаты получены и при замене Argl89 Мутации Argl89Ala и Argl89Gln приводили к потере как способности вызывать конформационные перестройки, так и гидролизовать пептидил-тРНК Сохраняющая положительный заряд мутация Argl89Lys также вызывала снижение активности, однако, в меньшей степени

Все исследованные замены в положении His 180 приводили к полной инактивации eRFl К потере способности eRFl вызывать гидролиз пептидил-тРНК приводили также замены в положениях Glyl83 и Glyl84, что подтверждает данные, полученные ранее Кроме вышеперечисленных остатков, для поддержания активности eRFl абсолютно необходимы Glnl85 и Serl86 Замены этих инвариантных аминокислотных остатков даже на химически близкие (Glnl85Asn, Serl86Thr) приводили к значительной потере активности Следует отметить, что замены в положениях His 180, Glyl83, Glyl84, Glnl85 и Serl86 не влияют на связывание eRFl с pre-ТС, кроме мутации Glyl84Ser, приводящей к уменьшению уровня связывания до 65% от исходного Можно предполагать, что эффект мутации Glyl84Ser связан с потерей подвижности GGQ-петли и невозможностью ее корректного позиционирования в РТС

Возможный механизм гидролиза пептидил-тРНК в пептидил-трансферазиом центре рибосомы эукариот

На основании полученной нами трехмерной структуры М-домена eRFl и функционального анализа мутантных форм eRFl можно предложить следующий вероятный механизм гидролиза пептидил-тРНК в РТС, в котором eRFl является катализатором (рис б)

На первой стадии формируется водородная связь между карбонильным атомом кислорода пептидил-тРНК и Жг-группой Gin 185 (рис 6а) Другая водородная связь формируется между ОН-группой Serl86 и N3-атомом имидазольного кольца His 180 Затем происходит атака карбонильной группы субстрата активированным серином. NH2-rpynna Glnl85 выступает в качестве электрофила и действует как активатор субстрата На следующей стадии происходит образование тетраэдрического оксианионного интермедиата (рис 66), после чего происходит нуклеофильная атака сложноэфирной связи между тРНК и пептидильным остатком, активированным атомом кислорода в тетраэдрическом интермедиате В результате образуется ацилэнзим (рис 6в), который гидролизуется молекулой воды, координируемой, вероятнее всего остатками Glyl83 и Glyl84 Координируемая двумя остатками глицина молекула воды может активироваться путем формирования водородной связи с His 180, за счет чего происходит увеличение ее нуклеофильного потенциала (рис. 6г) Активированная молекула воды атакует центральный карбонильный атом сложноэфирной связи в ацилэнзиме, в результате чего образуется второй тетраэдрический интермедиат Разрыв сложноэфирной связи приводит к высвобождению полипептида, а минидомен GGQ возвращается в свое первоначальное состояние (рис 6д и бе) Данная схема хорошо согласуется с описанными выше результатами по утрате функциональной активности му-тантными формами eRFl Единственным исключением стала мутация Serl86Ala (табл 1), которая не привела к полной потери гидролитической активности Можно предположить, что в мутанте Serl86Ala функциональную

His180)

<Gln185

(Ser186

His 180,

Gln185

Ser186

• 1RNA

His180>

Gln185 tRNA-OH

NH,

ex \ \ H¿O

,-sN H °"^<Ьег186

Gln185

His180.

Ser! 86

His180

In 185

Ser186

Gln185

Ser186

Рисунок 6. Предполагаемая схема катализа реакции гидролиза пептидил-тРНК в РТС факторе м терминации eRFl

(а) Формирование водородной связи между карбонильным атомом кислорода пептидил-тРНК и МНг-групгюй Glnl85 и между 0Н-группой Serl86 и N3 атомом Hisl80

(б) Формирование тетраэдрического интермедиата между активированным Serl 86 и пептидил тРНК и последующая нуклеофильная атака оксианионом интермедиата сложноэфироной связи между тРНК и пептидом

(в) Формирование ацил-энизимного интермедиата и высвобождение тРНК

(г) Атака молекулой воды, актививрованной His 180, карбонильной группы ацилэнзима

(д) Формирование второго тетраэдрического комплекса

(е) Разрыв сложноэфирной связи между пептидилом и Serl86 и возвраще!ше минидомена GGQ в исходное состояние

роль Serl86 берет на себя какая-либо другая химическая группа, находящаяся поблизости (например, кислород карбонильной группы основной цепи) либо дополнительная молекула воды, которая может располагаться в полости, образованной вследствие малого размера боковой цепи аланина.

На рис. 7 представлена суперпозиция полученной нами репрезентативной структуры GGQ-петли М-домена eRFl человека в растворе и кристаллической структуры петли, содержащей мотив GGQ, бактериального фактора терминации первого класса RF2, связанного с рибосомой. При отсутствии общего структурного сходства между эукариотическим и прокариотическим факторами, положения длинных а-спиралей и GGQ-петель eRFl человека и RF2 Е. coli совпадают.

Рисунок 7. Предполагаемая конформация М-домена eRFl в терминационном комплексе. А. Суперпозиция структуры М-домена eRFl человека в растворе (черный) и кристаллической структуры RF2 Е. coli (серый) в РТС бактериальной рибосомы (Petry et al., 2005). Б. Структура GGQ-петли в каталитически неактивной форме. Показаны боковые цепи аминокислотных остатков, участвующих в гидролизе пептидил-тРНК. Serl 86, Gin 185 и Argl89 обращены в сторону нуклеотида А76 пептидил-тРНК, находящейся в Р-участке. Hisl80 отдален от Serl 86. Мы предполагаем, что вслед за узнаванием стоп кодона Hisl 80 приближается к Serl86 и минидомен GGQ переходит в каталитически активную форму.

Этот факт позволяет предполагать, что конформация GGQ-петли универсальна и механизм гидролиза пептидил-тРНК может оказаться близким в разных царствах живой природы Более того, определенное сходство присутствует и в первичных структурах бактериального и эукариотического факторов терминации первого класса (рис 5)" в положении 253 прокариотического фактора терминации, соответствующем Serl86 в eRFl, находится в подавляющем большинстве случаев Ser либо His, а в положении 247, соответствующем His 180, - серии Такая инверсия аминокислотных остатков также допускает механизм, описанный на рис 6

Из рис 7А видно, что Serl86, G!nl85 и Argl89 находятся вбчизи ССА-З'-конца пептидил-тРНК Такое расположение облегчает взаимодействия, описанные на рис 6 Кроме того, Argl 89 может принимать участие в корректном позиционировании пептидил-тРНК в РТС His 180 расположен на другом конце GGQ-петли (рис 7Б) и расстояние между боковыми цепями His 180 и Serl86 велико для формирования водородной связи между ними и переноса протона Однако, изменение ориентации боковых остатков Hisl80 и Serl86 достаточно для их сближения и осуществления предложенного в данной работе механизма Такое изменение может происходить за счет высокой пластичности и подвижности GGQ-петли, а также вследствие вероятного изменения конформации GGQ-минидомена после передачи терминационного сигнала посредством длинной a-спирали Можно предполагать, что eRFl может находиться в клетке в двух различных конформациях - каталитически активной и неактивной Переход из каталитически неактивного состояния в активное может происходить после взаимодействия фактора со стоп кодоном в A-участке рибосомы Существование eRFl в двух различных состояниях предотвращает не связанный со стоп кодоном гидролиз пептидил-тРНК

выводы

1 Определена структура высокого разрешения изолированного среднего (М, middle) домена фактора терминации трансляции первого класса eRFl человека в растворе Структура депонирована в Protem DataBank под кодом 2HST Структура М-домена в растворе имеет достоверные отличия от его кристаллической структуры в полноразмерном eRFl.

2. Обнаружена высокая скорость обмена амидных протонов с водой в петле 177-187 М-домена eRFl, содержащей GGQ-мотив Мутация G183A не вызывает значительного изменения конформации белка в целом, но приводит к существенному замедлению обмена амидных протонов в минидоме-не GGQ

3 Петля 177-187 М-домена eRFl претерпевает быстрые движения в шкале времени от пс до не и медленные конформационные перегруппировки, протекающие в шкале времени от мс и выше Петля 215-223 также характеризуется как быстрыми (не), так и относительно медленными (мс) движениями.

4 Установлено, что М-домен eRFl человека специфично связывается с 60S субъединицей рибосомы эукариот. Аминокислотные остатки белка, формирующие интерфейс взаимодействия с рибосомой, расположены преимущественно вдоль длинной спирали al М-домена Два других кластера таких аминокислотных остатков располагаются в районе короткой спирали а2 (остатки 233-235) и на стыке спирали аЗ и листа р5 (остатки 250 и 251) Взаимодействие функционально неактивного мутанта G183A с 60S субчастицей рибосомы оказывается существенно более слабым по сравнению с белком дикого типа и интерфейс такого взаимодействия отличается от М-домена дикого типа

5 Аминокислотные остатки Hisl80, Glnl85 и Serl86 в составе минидомена GGQ играют существенную роль в сохранении активности eRFl человека Кроме того, подтверждены более ранние данные о критической роли остатков Glyl83 и Glyl84 в RF-активности На связывание фактора с пред-

терминационным комплексом замены в перечисленных положениях не влияют

6. Для связывания и способности с ИР! вызывать конформационные перестройки необходимо сохранение положительного заряда в положениях ЬуБ178, Ьуэ179 и Ащ189 Замены в данных положениях на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислотные остатки вызывают значительное снижение компетентного связывания и, как следствие, нарушение функциональной активности еИР1

7 Анализ полученных в работе данных позволил предложить модель механизма реакции гидролиза пеатидил-тРПК б псптидилтраисферазком центре рибосомы эукариот, в которой еИР1 функционирует как гидролаза

Список публикаций

1. Ivanova ЕV, Kolosov РМ, Birdsall В, Kisselev LL and Polshakov VI NMR assignments of the middle domain of human polypeptide release factor eRFl //Journal of Biomolecular NMR 2006 V. 36(Suppl 1) P 8

2 Ivanova E V., Kolosov P M, Birdsall В., Kelly G, Pastore A, Kisselev L L and Polshakov VI Eukaryotic class 1 translation termination factor eRFl - the NMR structure and dynamics of the middle domain mvolved m triggering nbo-some-dependent peptidyl-tRNA hydrolysis // FEBS Journal. 2007 V 274 P 4223-4237

3 Иванова E В . Алкалаева Е.З , Бирдсал Б , Колосов П М, Полынаков В И, Киселев JIJI Интерфейс взаимодействия центрального домена фактора терминации трансляции eRFl человека с рибосомой эукариот // Молекулярная биология 2008 42(6). С 1047-1057.

Подписано в печать 29 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ №850 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Елена Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая схема терминации трансляции

1.2. Факторы терминации трансляции первого класса

1.3. Факторы терминации трансляции первого класса

1.4. Декодирование стоп-кодона факторами терминации трансляции первого класса

1.5. Гидролиз пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре

1.5.1. Молекулярная анатомия пептидил-трансферазного центра

1.5.2. Роль рРНК в реакции гидролиза пептидил-тРНК

1.5.2. Роль факторов терминации трансляции первого класса в реакции гидролиза пептидил-тРНК

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды

2.1.2. Среды

2.1.3. Реактивы

2.1.4. Ферменты

2.1.5. Олигонуклеотиды

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение илазмидной ДНК из E.coli

2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК

2.2.4. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК

2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера"

2.2.7. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе

2.2.8. Сверхэкспрессия в Е. coli и выделение мутантных форм eRFl человека

2.2.9. Сверхэкспрессия в Е. coli н выделение изолированного М- домена eRFl человека и его мутантной формы Gl83А, меченных стабильными изотопами bN и ПС

2.2.10. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ

2.2.11. Измерение спектров ЯМР и их анализ

2.2.12. Расчет структуры

2.2.13. Анализ динамических свойств

2.2.14. ЯМР-титрование субчастицами рибосом

2.2.15. Определение активности eRFl

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение структуры М-домена eRF'l человека в растворе

3.1.1. Отнесение сигналов атомов основной белковой цепи и боковых цепей аминокислотных остатков М-домена

3.1.2. Определение вторичной и третичной структуры 58 М-домена eRF 1 человека

3.1.3. Анализ структуры М-домена eRF 1 человека

3.1.4. Влияние замены G183A в М-домене eRFl

3.1.5. Геометрия петли GGQ

3.1.6. Динамика основной цепи М-домена eRF

3.2. Изучение взаимодействия между М-доменом eRFl человека и рибосомами эукариот

3.2.1. Определение способности М-домена eRFl человека специфично связываться с 60S субчастицами рибосом

3.2.2. Аминокислотные остатки М-домена eRFl, формирующие интерфейс взаимодействия белка с 60S субъединицами рибосомы

3.2.3. Влияние замены Gl83А на связывание М-домена eRFl человека с 60S субчастицами рибосом

3.3. Функциональная роль аминокислотных остатков минидомена

3.3.1. Анализ первичной структуры минидомена ООС2 факторов терминации трансляции 1-го класса

3.3.2. Связывание мутантных форм еШ^ с предтерминационным комплексом и их способность вызывать конформационные перестройки

3.3.3. Анализ КБ-активности мутантных форм еШ7!

3.3.4. Возможный механизм гидролиза пептидил-тРНК в 95 пептидилтрансферазном центре рибосомы эукариот

3.4.3аключение

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека"

Механизм терминации трансляции, заключительной стадии биосинтеза полипептпдной цепи у эукариот, до настоящего времени остается во многом неизученным. Ключевую роль в узнавании стоп-кодона в А-участке малой субчастицы рибосомы эукариот, передаче сигнала в большую субчастицу, а также последующем гидролизе сложноэфирной связи в пептидил-тРНК играет белковый фактор терминации трансляции первого класса еКР1. Ранее методом рентгеновской кристаллографии было показано, что молекула еКР1 состоит из трех доменов: Ы-концевого, или Ы-домена, среднего, или М-домена, и С-концевого, или С-домена. И-домен ответственен за узнавание стоп-кодонов матричной РНК. С-домен взаимодействует с фактором терминации второго класса еИРЗ, за счет чего последний стимулирует активность еКБЧ. М-домен содержит высококонсервативный трипептидный фрагмент ОвС), необходимый для гидролиза пептидил-тРНК как в эукариотах, так и в прокариотах. Результаты структурных и биохимических исследований указывают на то, чго минидомен ввС) располагается в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы рибосомы. Абсолютная консервативность ОвС)-мотива в факторах терминации первого класса всех живых организмов указывает на его исключительную роль в процессе терминации трансляции.

Полученная ранее структура eR.Fl в кристалле имеет относительно низкое разрешение, особенно в подвижных функционально важных участках, таких, как, например, петля, содержащая трипептид ОвС), или ОСС)-петля. Несмотря на интенсивные исследования в области терминации белкового синтеза, проведенные в последнее десятилетие, многие вопросы остаются невыясненными: каким образом происходит передача терминационного сигнала от малой субчастицы рибосомы к большой, как происходит гидролиз пептидил-тРНК и какую роль в нем играет М-домен еЯР 1 ? Для понимания механизма реакции терминации трансляции у эукариот необходимы дальнейшие углубленные исследования структуры, динамических свойств и функциональных особенностей отдельных доменов еИРЬ Поэтому исследования в данном направлении представляются актуальными.

Целями данной работы являлись определение структуры высокого разрешения М-домена eR.Fl человека в растворе, изучение его динамических свойств, связывания М-домена eR.Fl с рибосомой эукариот и определение функциональной роли минидомена СС(~) в механизме терминации трансляции. Для определения структуры М-домена eR.Fl нами был выбран метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), который в последние годы широко используется для определения структуры различных белковых молекул в растворе. Методы ЯМР позволяют также определить динамические свойства белка и исследовать его взаимодействие с другими биомолекулами. В задачи работы входило: 1) получение высокоочищенных препаратов М-домена еКР1 человека, меченных стабильными изотопами 13С и 2) получение меченого препарата мутантной формы М-домена еКР1 01у183А1а, неактивного в функциональных тестах; 3) измерение и последующий анализ гетероядерных 2Б и ЗЭ спектров ЯМР для расчета структуры М-домена и определения его динамических свойств; 4) изучение взаимодействия М-домена eR.Fl с рибосомами эукариот; 5) выполнение точечных замен аминокислотных остатков в ООС)-петле М-домена еИР1 методом сайт-направленного мутагенеза; 6) выделение, очистка и исследование функциональной активности полученных мутантных форм еИР1 человека.

В данной работе впервые определена структура высокого разрешения в растворе М-домена eR.Fl человека и изучены его динамические свойства. С помощью методов ЯМР нами было исследовано взаимодействие М-домена eR.Fl с большой бОБ субъединицей рибосомы эукариот, установлена его специфичность и идентифицированы аминокислотные остатки М-домена, образующие возможный интерфейс такого взаимодействия. В работе также было проведено изучение функционального вклада каждого из инвариантных и полуконсервативных аминокислотных остатков в составе минидомена ОвС). Полученные структурные и функциональные данные позволили впервые предложить модель механизма реакции гидролиза пептидил-тРНК в пептидил-трансферазном центре рибосомы, в которой еКР1 служит непосредственным катализатором.

Результаты представленной работы существенно углубляют понимание молекулярного механизма терминации белкового синтеза трансляции у эукариот, что имеет важное значение для детального изучения процесса синтеза белка в эукариотической клетке в целом.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванова, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Определена структура высокого разрешения изолированного среднего (М, middle) домена фактора терминации трансляции первого класса eRFl человека в растворе. Структура депонирована в Protein Databank под кодом 2HST. Структура М-домена в растворе имеет достоверные отличия от его кристаллической структуры в полноразмерном eRFl.

2. Обнаружена высокая скорость обмена амидных протонов с водой в петле 177-187 М-домена eRFl, содержащей GGQ-мотив. Мутация G183A не вызывает значительного изменения коиформации белка в целом, но приводит к существенному замедлению обмена амидных протонов в минидомене GGQ.

3. Петля 177-187 М-домена eRFl претерпевает быстрые движения в шкале времени от пс до не и медленные конформационные перегруппировки, протекающие в шкале времени от мс и выше. Петля 215-223 также характеризуется как быстрыми (не), так и относительно медленными (мс) движениями.

4. Установлено, что М-домен eRFl человека специфично связывается с 60S субъединицей рибосомы эукариот. Аминокислотные остатки белка, формирующие интерфейс взаимодействия с рибосомой, расположены преимущественно вдоль длинной спирали al М-домена. Два других кластера таких аминокислотных остатков располагаются в районе короткой спирали а2 (остатки 233-235) и на стыке спирали аЗ и листа [35 (остатки 250 и 251). Взаимодействие функционально неактивного мутанта G183A с 60S субчастицей рибосомы оказывается существенно более слабым по сравнению с белком дикого типа и интерфейс такого взаимодействия отличается от М-домена дикого типа.

5. Аминокислотные остатки Hisl80, Glnl85 и Serl86 в составе минидомена GGQ играют существенную роль в сохранении активности eRFl человека. Кроме того, подтверждены более ранние данные о критической роли остатков Gly 183 и Glyl84 в RF-активности. На связывание фактора с предтерминационным комплексом замены в перечисленных положениях не влияют.

6. Для связывания и способности eRFl вызывать конформационные перестройки необходимо сохранение положительного заряда в положениях Lysl78, Lysl79 и Argl89. Замены в данных положениях на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислотные остатки вызывают значительное снижение компетентного связывания и, как следствие, нарушение функциональной активности eRFl.

7. Анализ полученных в работе данных позволил предложить модель механизма реакции гидролиза пептидил-тРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы эукариот, в которой eRF 1 функционирует как гидролаза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я испытываю глубокую благодарность и искреннюю признательность моему учителю Льву Львовичу Киселеву за постоянное внимание к работе, неоценимую помощь в планировании и подготовке экспериментов, конструктивную критику, плодотворное обсуждение полученных результатов и моральную поддержку.

Я выражаю глубокую благодарность Владимиру Ивановичу Полыпакову, за постоянное внимание к работе и интеллектуальную поддержку.

Отдельная благодарность в адрес Елены Алкалаевой и Петра Колосова1 за неоценимую помощь в проведении экспериментальной работы, конструктивную критику и плодотворное обсуждение полученных результатов.

Я благодарю Полину Крючкову и Бориса Елисеева за конструктивную критику и дружескую поддержку.

Я благодарю всех сотрудников лаборатории, словом и делом помогавших проведению работы: Фролову Людмилу Юрьевну, Зиновьеву Ольгу Леонидовну, Сенченко Веру Николаевну, Дубовую Веру Ивановну, Машкову Тамару Дмитриевну, Нину Опарину, Екатерину Анедченко, Артема Кононенко, Елену Узлову, Анну Кудрявцеву, Юрия Мазура, Алексея Дмитриева и Григория Краснова.

Я благодарю Андрея Борисовича Полтарауса, Софью Малахо и Татьяну Родионову за проведение секвенирования всех образцов ДНК.

Я благодарна Анналпзе Пасторе и за поддержку и возможность эффективно работать в Национальном институте медицинских исследований (Лондон), Берри Бирдсалл за неоценимую помощь в записи спектров ЯМР, а также всему коллективу Molecular structure division за дружественную атмосферу, внимание к моей работе и плодотворное обсуждение полученных результатов.

3.4.3аключение

Рассматривая в совокупности все полученные данные, можно придти к некоторым общим заключениям, касающимся взаимоотношений структуры и функции факторов терминации трансляции 1-го класса.

Полученная в данной работе структура высокого разрешения изолированного М-домена еЯР1 человека в растворе имеет ряд отличий от определенной ранее кристаллической структуры в составе полноразмериого еЯР1. Эти различия могут быть обусловлены как эффектами кристаллической упаковки и влияниехм на конформацию соседних доменов, так неточностью определения структуры в кристалле из-за ее недостаточного разрешения. Вне зависимости от причины такого различия, определение структуры М-домена еКР1 в растворе является важным этапом на пути к пониманию молекулярного механизма гидролиза пептидил-тРНК в рибосоме.

Обнаруженная высокая скорость обмена амидных протонов с водой в функционально важной вОС^-петле указывает на наличие координированной молекулы воды в этом участке. Конформация минидомена вОС) допускает возможность такой координации двумя глицинами мотива Свр. Замена в 183А, которая в функциональных исследованиях приводила к потере способности фактора вызывать гидролиз пептидил-тРНК, не нарушает конформацию М-домена, но приводит к значительному снижению скорости обмена амидных протонов с водой в СвС^-петле. Возможно, инактивация еКР1 при введении данной мутации объясняется именно потерей способности фактора координировать молекулу воды.

Сложное динамическое поведение СвС^-петли и находящейся на другой стороне длинной спирали а1 петли 215-223, которые претерпевают как быстрые (в пс-нс шкале времени), так и медленные (в мс шкале времени) движения, говорит об их возможном участии в передаче терминационного сигнала из А-сайта малой субчастицы в пептидилтрансферазный центр большой субчастицы рибосомы. В этом случае длинная спираль а1 играет роль медиатора, передающего сигнал с одной петли на другую.

Кроме того, аминокислотные остатки длинной спирали al, как было установлено в данной работе, формируют возможный интерфейс специфического связывания с 60S субчастицей рибосомы. Интересно, что при введении замены G183A, этот интерфейс меняется и связывание становится менее прочным.

Помимо двух глицинов в мотиве GGQ для сохранения активности eRFl необходимы входящие в состав GGQ-петли консервативные аминокислотные остатки His 180, Serl86 и Glnl85. Так как на связывание фактора с терминационным комплексом замены в перечисленных положениях не влияют, логично предположить, что функциональные группы этих аминокислотных остатков каким-то образом вовлечены в гидролиз пептидил-тРНК.

Полученные в данной работе структурные и функциональные данные позволили нам предложить модель молекулярного механизма гидролиза пептидил-тРНК в рибосоме, в которой аминокислотные остатки eRFl непосредственно вовлечены в катализ данной реакции. Безусловно, данная модель является гипотетической и для окончательного выяснения механизма гидролиза пептидил-тРНК необходимы дальнейшие исследования. Решающий прорыв в данной области буде г достигнут с получением структуры высокого разрешения комплексов эукариотических рибосом с eRFl имРНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Елена Викторовна, Москва

1. Alkalaeva, Е. Z., Pisarev, А. V., Frolova, L. Y., Kisselev, L. L., and Pestova, Т. V. (2006). In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell 125, 1 125-1 136.

2. Amort, M., Wotzel, В., Bakowska-Zywicka, K., Erlacher, M. D., Micura, R., and Polacek, N. (2007). An intact ribose moiety at A2602 of 23S rRNA is key to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis during translation termination. Nucleic Acids Res 35, 5130-5 140.

3. Arkov, A. L., and Murgola, J. (1999). Ribosomal RNAs in translation termination: facts and hypotheses. Biochemistry (Moscow) 64, 1354-1359.

4. Baleja, J. D., Marmorstein, R., Harrison, S. C., and Wagner, G. (1992). Solution Structure Of The DNA-Binding Domain Of Cd2-Gal4 From Saccharomyces-Cerevisiae. Nature 356, 450-453.

5. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. В., and Steitz, T. A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905-920.

6. Bax, A., and Grzesiek, S. (1993). Methodological Advances In Protein NMR. Acc Chem Res 26, 131-138.

7. Bertram, G., Bell, H. A., Ritchie, D. W., Fullerton, G., and Stansfield, I. (2000). Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA 6, 1236-1247.

8. Bertram, G., Bell, H.A., Ritchie, D.W., Fullerton, G. and Stansfield, I. (2000). Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop-codon recognition. RNA 6, 1236-1247.

9. Bieling, P., Beringer, M., Adio, S., and Rodnina, M. V. (2006). Peptide bond formation does not involve acid-base catalysis by ribosomal residues. Nat Struct Mol Biol 13, 423-428.

10. Birnboim, H. C. (1983). A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol 100, 243-255.

11. Bodenhausen, G., and Ruben, D. (1980). Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chem Phys Lett 69, 185189.

12. Brinkmann, U., Mattes, R. E., and Buckel, P. (1989). High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85, 109-114.

13. Brunelle, J. L., Youngman, E. M., Sharma, D., and Green, R. (2006). The interaction between C75 of tRNA and the A loop of the ribosome stimulates peptidyl transferase activity. Rna 12, 33-39.

14. Caron, F., and Meyer, E. (1985). Does Paramecium primaurelia use a different genetic code in its macronucleus? Nature 314, 185-188.

15. Caskey, C. T., Beaudet, A. L., Scolnick, E. M., and Rosman, M. (1971). Hydrolysis of IMet-tRNA by peptidyl transferase. Proc Natl Acad Sci U S A 68, 3163-3167.

16. Chapman, В., and Brown, С. (2004). Translation termination in Arabidopsis thaliana: characterisation of three versions of release factor 1. Gene 341,219-225.

17. Chavatte, L., Frolova, L., Kisselev, L., and Favre, A. (2001). The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur J Biochem 268, 2896-2904.

18. Chavatte, L., Frolova, L., Laugaa, P., Kisselev, L., and Favre, A. (2003). Stop codons and UGG promote efficient binding of the polypeptide release factor eRFl to the ribosomal A site. J Mol Biol 331, 745-758.

19. Chavatte, L., Seit-Nebi, A., Dubovaya, V., and Favre, A. (2002). The invariant uridine of stop codons contacts the conserved N1KSR loop of human eRFl in the ribosome. EMBO J 21, 5302-5311.

20. Clore, G. M., Driscoll, P. C., Wingfield, P. Т., and Gronenborn, A. M. (1990a). Analysis of the backbone dynamics of interleukin-1 beta using two-dimensional inverse detected heteronuclear 15N-1H NMR spectroscopy. Biochemistry 29, 7387-7401.

21. Connolly, M. L. (1983). Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. Science 221, 709-713.

22. Cornilescu, G., Delaglio, F., and Bax, A. (1999). Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13, 289-302.

23. Czaplinski, K., Majlesi, N., Banerjee, Т., and Peltz, S. W. (2000). Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency. RNA 6, 730-743.

24. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., and Bax, A. (1995). NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR 6, 277-293.

25. Dincbas-Renqvist, V., Engstrom, A., Mora, L., Heurgue-Hamard, V., Buckingham, R., and Ehrenberg, M. (2000). A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J 19, 6900-6907.

26. Dodson, G., and Wlodawer, A. (1998). Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem Sci 23, 347-352.

27. Dosset, P., Hus, J. C., Blackledge, M., and Marion, D. (2000). Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data. J Biomol NMR 16, 23-28.

28. Eurwilaichitr, L., Graves, F. M., Stansfield, I., and Tuite, M. F. (1999). The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 32, 485-496.

29. Feinberg, J. S., and Joseph, S. (2006). A conserved base-pair between tRNA and 23 S rRNA in the peptidyl transferase center is important for peptide release. J Mol Biol 364, 1010-1020.

30. Frcistroffer, D. V., Pavlov, M. Y., MacDougall, J., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1997). Release factor RF3 in E.coli accelerates thedissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependant manner. EMBO J 16, 4126-4133.

31. Frolova, L., Le Goff, X., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M., and Kisselev, L. (1996). Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependenl guanosine triphosphatase. RNA 2, 334341.

32. Frolova, L., Seit-Nebi, A., and Kisselev, L. (2002). Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-136.

33. Frolova, L. Y., Merkulova, T. I., and Kisselev, L. L. (2000). Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6, 381-390.

34. Gao, H., Zhou, Z., Rawat, U., Huang, C., Bouakaz, L., Wang, C., Cheng, Z., Liu, Y., Zavialov, A., Gursky, R., et al. (2007). RF3 induces ribosomal conformational changes responsible for dissociation of class I release factors. Cell 129, 929-941.

35. Frolova, L., Le Goff, X., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M., and Kisselev, L. (1996). Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2, 334341.

36. Frolova, L., Seit-Nebi, A., and Kisselev, L. (2002). Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8, 129-136.

37. Frolova, L. Y., Merkulova, T. I., and Kisselev, L. L. (2000). Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6, 381-390.

38. Gao, H., Zhou, Z., Rawat, U., Huang, C., Boualcaz, L., Wang, C., Cheng, Z., Liu, Y., Zavialov, A., Gurslcy, R., et al. (2007). RF3 induces ribosomal conformational changes responsible for dissociation of class 1 release factors. Cell 129, 929-941.

39. Goodall, J. J., Chen, G. J., and Page, M. G. (2004). Essential role of histidine 20 in the catalytic mechanism of Escherichia coli peptidyl-tRNA hydrolase. Biochemistry 43, 4583-4591.

40. Graille, M., Chaillet, M., and van Tilbeurgh, H. (2008). Structure of yeast Dom34: a protein related to translation termination factor eRFl and involved in No-Go decay. J Biol Chem 283, 7145-7154.

41. Green, R., and Noller, H. F. (1997). Ribosomes and translation. Annu Rev Biochem 66, 679-716.

42. Grentzmann, G., Brechemier-Bacy, D., Heurgue, V., Mora, L., and Buckingham, R. H. (1994). Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci "USA 91, 5848-5852.

43. Hansen, J. L., Ippolito, J. A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P. B., and Steitz, T. A. (2002a). The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol Cell 10, 117-128.

44. Iiansen, J. L., Schmeing, T. M., Moore, P. B., and Steitz, T. A. (2002b). Structural insights into peptide bond formation. Proc Natl Acad Sci USA 99, 11670-11675.

45. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, PL, Franceschi, F., and Yonath, A. (2001). High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107, 679-688.

46. Hauryliuk, V., Zavialov, A., Kisselev, L., and Ehrenberg, M. (2006). Class-1 release factor eRFl promotes GTP binding by class-2 release factor eRF3. Biochimie 8S, 747-757.

47. Heurgue-Hamard, V., Champ, S., Engstrom, A., Ehrenberg, M., and Buckingham, R. H. (2002). The hemK gene in Escherichia coli encodes the

48. N(5)-glutamine methyltransferase that modifies peptide release factors. EMBO J 21, 769-778.

49. Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten, K. (1996). VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph 14, 27-38.

50. Inagaki, Y., Blouin, C., Doolittle, W. F., and Roger, A. J. (2002). Convergence and constraint in eulcaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucl Acids Res 30, 532-544.

51. Inagaki, Y., and Doolittle, W. F. (2001). Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucl Acids Res 29, 921-927.

52. Ito, K., Ebihara, IC, Uno, M., and Nakamura, Y. (1996). Conserved motifs in prokaryotic and eulcaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. ProcNatl Acad Sci USA 93, 5443-5448.

53. Ito, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (2000). A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680-684.

54. Ivanov, V., Beniaminov, A., Mikheev, A., and Minyat, E. (2001). A mechanism for stop eodon recognition by the ribosome: a bioinformatics approach. RNA 7, 1683-1692.

55. Jeffrey, G. A. (1997). An introduction to hydrogen bonding (New York, Oxford, Oxford University Press).

56. Karimi, R., Pavlov, M. Y., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1999). Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol Cell 3, 601-609.

57. Kay, L. E., Torchia, D. A., and Bax, A. (1989). Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease. Biochemistry 28, 8972-8979.

58. Kim, D. F., and Green, R. (1999). Base-pairing between 23S rRNA and tRNA in the ribosomal A site. Mol Cell 4, 859-864.

59. Kisselev, L. (2002). Polypeptide release factors in prokaryotes and eulcaryotes: same function, different structure. Structure (Camb) 10, 8-9.

60. Kisselev, L., Ehrenberg, M., and Frolova, L. (2003). Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J 22, 175-182.

61. Kisselev, L. L., and Buckingham, R. H. (2000). Translational termination comes of age. Trends Biochem Sci 25, 561-566.

62. Klaholz, B. P., Pape, T., Zavialov, A. V., Myasnikov, A. G., Orlova, E. V., Vestergaard, B., Ehrenberg, M., and van Heel, M. (2003). Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90-94.

63. Kong, C., Ito, K., Walsh, M. A., Wada, M., Liu, Y., Kumar, S., Barford, D., Nakamura, Y., and Song, H. (2004). Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol Cell 14, 233-245.

64. Koradi, R., Billeter, M., and Wuthrich, IC. (1996). MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures. J Mol Graph 14, 5155.

65. Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D., Didichenko, S. A., Smirnov, V.

66. N., Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Novikova, O. N., Inge-Vechtomov, S. G., Neistat, M. A., and Tolstorukov, II (1990). Divergence and conservation of SUP2 (SUP35) gene of yeast Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae. Yeast 6, 461-472.

67. Laskowski, R. A., Rullmannn, J. A., MacArthur, M. W., Kaptein, R., and Thornton, J. M. (1996). AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J Biomol NMR 8, 477-486.

68. Laurberg, M., Asahara, H., Korostelev, A., Zhu, J., Trakhanov, S., and Noller, H. F. (2008). Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852-857.

69. Le Goff, X., Philippe, M., and Jean-Jean, O. (1997). Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells. Mol Cell Biol 17, 3164-3172.

70. Lekomtsev, S., Kolosov, P., Bidou, L., Frolova, L., Rousset, J. P., and Kisselev, L. (2007). Different modes of stop codon restriction by the Stylonychia and Paramecium eRFl translation termination factors. Proc Natl AcadSciUS A 104, 10824-10829.

71. Lhoest, J., and Colson, C. (1977). Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia coli. 11. A mutant lacking a new type of methylated amino acid, N5-methylglutamine, in protein L3. Mol Gen Genet 154, 175-180.

72. Liang, A., Brunen-Nieweler, C., Muramatsu, T., Kuchino, Y., Beier, H., and Heckmann, K. (2001). The ciliate Euplotes octocarinatus expresses two polypeptide release factors of the type eRFl. Gene 262, 161-168.

73. Liang, H., Cavalcanti, A. R., and Landweber, L. F. (2005). Conservation of tandem stop codons in yeasts. Genome Biol 6, R31.

74. Linge, J. P., Habcck, M., Rieping, W., and Nilges, M. (2003). ARIA: automated NOE assignment and NMR structure calculation. Bioinformatics 19, 315-316.

75. Lipari, G., and Szabo, A. (1982). Model-Free Approach To The Interpretation Of Nuclear Magnetic-Resonance Relaxation In Macromolecules. 1. Theory And Range Of Validity. J Am Chem Soc 104, 4546-4559.

76. Lozupone, C. A., Knight, R. D., and Landweber, L. F. (2001). The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol 11, 65-74.

77. Luginbuhl, P., and Wuthrich, K. (2002). Semi-classical nuclear spin relaxation theory revisited for use with biological macromolecules. Prog NMR Specroscop 40, 199-247.

78. Ma, B., and Nussinov, R. (2004). Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J Biol Chem 279, 53875-53885.

79. Mandel, M., and Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol 53, 159-162.

80. Merkulova, T. I., Frolova, L. Y., Lazar, M., Camonis, J., and Kisselev, L. L. (1999). C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett 443, 41-47.

81. Meyer, F., Schmidt, H. J., Plumper, E., Hasilik, A., Mersmann, G., Meyer, H. E., Engstrom, A., and Heckmann, K. (1991). UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocarinalus. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 3758-3761.

82. Milcuni, O., Ito, K., Moffat, J., Matsumura, K., McCaughan, K., Nobukuni, T., Tate, W., and Nakamura, Y. (1994). Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5798-5802.

83. Moffat, J. G., and Tate, W. P. (1994). A single proteolytic cleavage in release factor 2 stabilizes ribosome binding and abolishes peptidyl-tRNA hydrolysis activity. J Biol Chem 269, 18899-18903.

84. Molday, R. S., Englande.S.W., and Kallen R.G. (1972). Primary Structure Effects On Peptide Group Hydrogen-Exchange. Biochemistry 11, 150-158.

85. Mora, L., Zavialov, A., Ehrenberg, M., and Buckingham, R. H. (2003b). Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol 50, 1467-1476.

86. Mortensen, K. K., Hansen, H. F., Grentzmann, G., Buckingham, R. H., and Sperling-Petersen, H. U. (1995). Osmo-expression and fast two-step purification of Escherichia coli translation termination factor RF-3. Eur J Biochem 234, 732-736.

87. Muramatsu, T., Heckmann, K., Kitanaka, C., and Kuchino, Y. (2001). Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons. FEBS Lett 488, 105-109.

88. Nakamura, Y., and Ito, K. (1998). How protein reads the stop codon and terminates translation. Genes Cells 3, 265-278.

89. Nakamura, Y., Ito, K., and Ehrenberg, M. (2000). Mimicry grasps reality in translation termination. Cell 101, 349-352.

90. Nakamura, Y., Ito, K., and Isaksson, L. A. (1996). Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150.

91. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P. B., and Steitz, T. A. (2000a). The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289, 920-930.

92. Nissen, P., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (2000b). Macromolecular mimicry. EMBO J 19, 489-495.107.0sawa, S., and Jukes, T. H. (1995). On codon reassignment. J Mol Evol 41, 247-249.

93. Ottiger, M., Delaglio, F., and Bax, A. (1998). Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra. J Magn Reson 131, 373-378.

94. Paci, M., Pon, C., and Gualerzi, C. (1985). The interaction between initiation factor 3 and 30 S ribosomal subunits studied by high-resolution 1H NMR spectroscopy. J Biol Chem 260, 887-892.

95. Paushkin, S. V., Kushnirov, V. V., Smirnov, V. N., and Ter-Avanesyan, M. D. (1996). Propagation of the yeast prion-like psi+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. Embo J 15, 3127-3 134.

96. Peske, F., Rodnina, M. V., and Wintermeyer, W. (2005). Sequence of steps in ribosome recycling as defined by kinetic analysis. Mol Cell 18, 403-412.

97. Petry, S., Weixlbaumer, A., and Ramakrishnan, V. (2008). The termination of translation. Curr Opin Struct Biol 18, 70-77.

98. Pisarev, A. V., Hellen, C. U., and Pestova, T. V. (2007). Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell 131, 286-299.

99. Pisareva, V. P., Pisarev, A. V., Hellen, C. U., Rodnina, M. V., and Pestova, T. V. (2006). Kinetic analysis of interaction of eukaryotic release factor 3 with guanine nucleotides. J Biol Chem 281, 40224-40235.

100. Polacek, N., Gomez, M. J., Ito, K., Xiong, L., Nakamura, Y., and Mankin, A. (2003). The critical role of the universally conserved A2602 of 23S ribosomal RNA in the release of the nascent peptide during translation termination. Mol Cell 77, 103-1 12.

101. Polacek, N., and Mankin, A. S. (2005). The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit Rev Biochem Mol Biol 40, 285-311.

102. Polevoda, B., Span, L., and Sherman, F. (2006). The yeast translation release factors Mrflp and Sup45p (eRFl) are methylated, respectively, by the methyltransferases Mtqlp and Mtq2p. J Biol Chem 281, 2562-2571.

103. Polgar, L. (2005). The catalytic triad of serine peptidases. Cell Mol Life Sci 62, 2161-2172.

104. Polshakov, V. I., Frenkiel, T. A., Birdsall, B., Soteriou, A., and Feeney, J. (1995). Determination of stereospecific assignments, torsion-angle constraints, and rotamer populations in proteins using the program AngleSearch. J Magn Reson B 108, 31-43.

105. Poole, E., and Tate, W. (2000). Release factors and their role as decoding proteins: specificity and fidelity for termination of protein synthesis. Biochim Biophys Acta 1493, 1-11.

106. Preer, J. R., Jr., Preer, L. B., Rudman, B. M., and Barnett, A. J. (1985). Deviation from the universal code shown by the gene for surface protein 51A in Paramecium. Nature 314, 188-190.

107. Privalov, P. L., Jelesarov, I., Read, C. M., Dragan, A. I., and Crane-Robinson, C. (1999). The energetics of HMG box interactions with DNA: Thermodynamics of the DNA binding of the HMG box from mouse Sox-5. J Mol Biol 294, 997-1013.

108. Rawat, U., Gao, H., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2006). Interactions of the release factor RF1 with the ribosome as revealed by cryo-EM. J Mol Biol 357, 1144-1153.

109. Rawat, U. B., Zavialov, A. V., Sengupta, J., Valle, M., Grassucci, R. A., Linde, J., Vestergaard, B., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003). A cryo-electron microscopic study of ribosomc-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90.

110. Rodnina, M. V., Beringer, M., and Wintermeyer, W. (2007). How ribosomes make peptide bonds. Trends Biochem Sci 32, 20-26.

111. Ruclcert, M., and Otting, G. (2000). Alignment of biological macromolecules in novel nonionic liquid crystalline media for NMR experiments. J Am Chem Soc /22, 7793-7797.

112. Salas-Marco, J., and Bedwell, D. M. (2004). GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol Cell Biol 24, 7769-7778.

113. Salas-Marco, J., Fan-Minogue, H., Kallmeyer, A. K., Klobutcher, L. A., Farabaugh, P. J., and Bedwell, D. M. (2006). Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes. Mol Cell Biol 2d, 438-447.

114. Samaha, R. R., Green, R., and Noller, H. F. (1995). A base pair between tRNA and 23S rRNA in the peptidyl transferase centre of the ribosome. Nature 577, 309-314.

115. Sambroolc, J., Fritsch. E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual., 2 edn (N.Y., Cold Spring Harbor).

116. Sarlcar, G., and Sommer, S. S. (1990). The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8, 404-407.

117. Schmeing, T. M., Huang, K. S., Strobel, S. A., and Steitz, T. A. (2005). An induced-fit mechanism to promote peptide bond formation and exclude hydrolysis of peptidyl-tRNA. Nature 438, 520-524.

118. Schmitt, E., Mechulam, Y., Fromant, M., Plateau, P., and Blanquet, S. (1997). Crystal structure at 1.2 A resolution and active site mapping of Escherichia coli peptidyl-tRNA hydrolase. Embo J 16, 4760-4769.

119. Schmitt, E., Panvert, M., Blanquet, S., and Mechulam, Y. (1998). Crystal structure of methionyl-tRNAfMet transformylase complexed with the initiator formyl-methionyl-tRNAfMet. Embo J 17, 6819-6826.

120. Schwieters, C. D., Kuszewski, J. J., Tjandra, N., and Clore, G. M. (2003). The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package. J Magn Reson 160, 65-73.

121. Seit-Nebi, A., Frolova, L., and Kisselev, L. (2002). Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep 3, 881-886.

122. Sette, M., Spurio, R., van Tilborg, P., Gualerzi, C. O., and Boclens, R. (1999). Identification of the ribosome binding sites of translation initiation factor IF3 by multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. RNA 5, 82-92.

123. Sette, M., van Tilborg, P., Spurio, R., ICaptein, R., Paci, M., Gualerzi, C. O., and Boelens, R. (1997). The structure of the translational initiation factor IF1 from E.coli contains an oligomer-binding motif. Embo J 16, 1436-1443.

124. Shaw, J. J., and Green, R. (2007). Two distinct components of release factor function uncovered by nucleophile partitioning analysis. Mol Cell 25, 458-467.

125. Steitz, T. A. (2005). On the structural basis of peptide-bond formation and antibiotic resistance from atomic structures of the large ribosomal subunit. FEBS Lett 579, 955-958.

126. Studier, F. W., and Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-130.

127. Tate, W. P., and Brown, C. M. (1992). Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. Biochemistry 31, 2443-2450.

128. Trobro, S., and Aqvist, J. (2007). A model for how ribosomal release factors induce peptidyl-tRNA cleavage in termination of protein synthesis. Mol Cell 27, 758-766.

129. Uno, M., Ito, IC, and Nakamura, Y. (2002). Polypeptide release at sense and noncognate stop codons by localized charge-exchange alterations in translational release factors. Proc Natl Acad Sei U S A 99, 1819-1824.

130. Velichutina, I. V., Hong, J. Y„ Mesecar, A. D., Chernoff, Y. O., and Liebman, S. W. (2001). Genetic interaction between yeast Saccharomyces ccrevisiae release factors and the decoding region of 18 S rRNA. J Mol Biol 305,1X5-121.

131. Vestergaard, B., Van, L. B., Andersen, G. R., Nyborg, J., Buckingham, R. H., and Kjeldgaard, M. (2001). Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol Cell 8, 1375-1382.

132. Wang, W., Czaplinski, K., Rao, Y., and Peltz, S. W. (2001). The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBO J 20, 880-890.

133. Weinger, J. S., Parnell, K. M., Dorner, S., Green, R., and Strobel, S. A. (2004). Substrate-assisted catalysis of peptide bond formation by the ribosome. Nat Struct Mol Biol //,1101-1106.

134. Weixlbaumer, A., Petry, S., Dunham, C. M., Selmer, M., Kelley, A. C., and Ramakrishnan, V. (2007). Crystal structure of the ribosome recycling factor bound to the ribosome. Nal Struct Mol Biol 14, 733-737.

135. Wilson, D. N., Guevremont, D., and Tate, W. P. (2000). The ribosomal binding and peptidyl-tRNA hydrolysis functions of Escherichia coli release factor 2 are linked through residue 246. Rna 6, 1704-1713.

136. Youngman, E. M., Brunelle, J. L., Kochaniak, А. В., and Green, R. (2004). The active site of the ribosome is composed of two layers of conserved nucleotides with distinct roles in peptide bond formation and peptide release. Cell 117, 589-599.

137. Yusupov, M. M., Yusupova, G. Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T. N., Cate, J. H., and Noller, H. F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292, 883-896.

138. Zavialov, A. V., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (2001). A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell J07, 115-124.

139. Zavialov, A. V., Mora, L., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (2002). Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 10, 789-798.

140. Дубовая, В. И., Колосов, П. iM., Алкалаева, Е. 3., Фролова, JI. Ю., and Киселев, JL JI. (2006). Влияние изолированных доменов фактора терминации трансляции eRFl на ГТФазпую активность фактора терми нации трансляции eRF3. Мол Б иол 40, 310-316.

141. Зайцев, Е. Н., Зайцева, Е. М., Бахланова, И. В., Горелов, В. И., Кузьмин, Н. П., Крюков, В. М., and Ланцов, В. А. (1986). Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. Генетика 22, 2721-2727.

Информация о работе

Иванова, Елена Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурно-функциональный анализ среднего (М) домена фактора терминации трансляции eRF1 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы