Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. ВА ЭНГЕЛЬГАРДТА
На правах рукописи
ТУНИЦКАЯ Вера Леонидовна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-ПОЛИМЕР АЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т7
03.00.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 2004
Работа выполнена в лаборатории энзимологии транскрипции Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Научный консультант: Член-корреспондент РАН,
доктор химических наук, профессор Кочетков С.Н.
Официальные оппоненты: Академик РАН,
доктор химических наук, профессор Богданов А.А. доктор биологических наук Куханова М.К. доктор химических наук, профессор Варламов В.П.
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
Защита диссертации состоится «15» апреля 2004 г. в час.
на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной
биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991. Москва, ул. Вавилова, д.32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Автореферат разослан « 15 » марта 2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
А.М.Крицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Бактериофаг Т7 является наиболее изученным среди фагов, поражающих бактериальные клетки Е.еоН. Ключевым ферментом жизнедеятельности бактериофага является ДНК-зависимая РНК полимераза (Т7РНКП), которая ответственна за транскрипцию генов, кодирующих белки, определяющие созревание и упаковку фаговых частиц.
Т7РНКП была впервые выделена в 1969 г. из клеток Е.еоН, инфицированных бактериофагом Т7. В настоящее время источником выделения рекомбинантного фермента являются штаммы Е.еой, несущие плазмидные конструкции, экспрессирующие ген Т7РНКП (ген 1 бактериофага Т7). Первичная структура Т7РНКП была определена в 80-е годы. Фермент состоит из 883 аминокислотных остатков (98092 Да) и представляет собой односубъединичный белок, способный осуществлять полный цикл транскрипции без участия каких-либо дополнительных белковых факторов. Это делает данный фермент наиболее удобной моделью для изучения молекулярных механизмов транскрипции. Новая информация о закономерностях процесса транскрипции может быть использована при изучении других ферментов, в том числе вирусных РНК-полимераз, что имеет большое значение для поиска способов борьбы с вирусными инфекциями.
Помимо этого, вследствие доступности Т7РНКП, ее высокой транскрипционной активности и строгой специфичности к промотору, этот фермент широко используется в молекулярной биологии для синтеза заданных последовательностей РНК. Изучение закономерностей функционирования Т7РНКП, наряду с исследованием мутантных форм фермента, может привести к получению белков с измененными свойствами, являющихся более эффективными и многофункциональными молекулярно-биологическими инструментами, нежели природная Т7РНКП. В связи с этим детальное структурно-функциональное исследование Т7РНКП, в частности, установление роли отдельных аминокислотных остатков и локализация контактов между компонентами полимеразной реакции в процессе транскрипции, является актуальной научной проблемой.
Цель и задачи исследования: Целью данной работы являлось всестороннее изучение молекулярного механизма действия и роли отдельных структурных элементов Т7РНКП на различных стадиях процесса транскрипции. Для этого были применены такие методические подходы, как аффинная модификация фермента аналогами нуклеотидного субстрата и модифицированными промоторами, а также изучение широкого набора мутантных форм Т7РНКП. Конкретными задачами исследования являлись:
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Петербург Л /л 1 • 09 ИМ '
- установление роли отдельных аминокислотных остатков фермента в механизме транскрипции на различных стадиях ферментативной реакции;
- установление контактов между компонентами транскрипционного комплекса, включая и такие, которые вследствие короткого времени существования не могут быть зафиксированы при рентгеноструктурных исследованиях;
- исследование мутантных форм фермента, для которых продемонстрированы новые функции, не свойственные природной Т7РНКП. Изучение возможности их дальнейшего практического использования.
Научная новизна работы. Был впервые сформулирован ряд закономерностей функционирования Т7РНКП. Так, представления о роли ^концевого домена фермента ранее ограничивались лишь связыванием РНК-продукта, и лишь значительно позже было установлено его участие в ферментативном акте на стадии элонгации и терминации синтеза. В нашей работе впервые была продемонстрирована роль этого домена в связывании с промотором, а также его влияние на общую пространственную структуру фермента, прослеживающееся не только на стадии элонгации, но и на более ранних этапах синтеза РНК
Впервые локализован высококонсервативный участок в структуре Т7РНКП (остатки 555575), названный нами «мотивом D», участвующий в связывании со специфическим промотором и важный для ферментативной активности. Этот участок не принадлежит к ранее установленным высококонсервативным мотивам А, В и С, и другими исследователями не рассматривался.
При изучении консервативного мотива В, характерного для всех РНК-полимераз и лишь некоторых ДНК-полимераз, получена новая информация, позволившая локализовать в этом мотиве два фрагмента с различными функциями - ^концевой, определяющий общую пространственную структуру активного центра, и С-концевой, содержащий группу аминокислотных остатков, непосредственно участвующих в катализе. Показана пространственная сближенность и возможность взаимодействия между важнейшим для активности аминокислотным остатком Тугб39 и кодирующей цепью Т7-промотора в районе инициации синтеза РНК.
Впервые охарактеризованы мутантные формы фермента, обладающие новыми свойствами, в частности, мутант, способный утилизировать дезоксинуклеозидтрифосфаты и удлинять ДНК-праймер, включая в него рибонуклеотидные звенья, а также мутант, лишенный способности к синтезу удлиненных транскриптов, присущей Т7РНКП дикого типа.
Практическая ценность работы Разработанные методические подходы, а также полученная новая информация о механизме транскрипции, могут быть использованы при изучении других
нуклеотид-полимеризующих ферментов, в том числе вирусных РНК-полимсраз. Созданы мутантные формы фермента, позволяющие расширить возможности его использования в качестве инструмента в молекулярно-биологических исследованиях. Так, мутант Туг639РИе;8ег641Аа, способный эффективно включать в цепь РНК дезоксирибонуклеотидные звенья, был использован сотрудниками нашей лаборатории (Оиёта е! а1, 1997) при получении «смешанных» ДНК/РНК матриц, которые, в свою очередь, применялись для исследования механизма действия обратной транскриптазы ВИЧ. Другими исследователями (АрИа8ЙЬеу е! а1, 1997) с помощью созданнного нами мутанта был получен ряд модифицированных тРНК, использовавшихся при изучении механизма действия тРНК-синтетаз, а также общих механизмов синтеза белка. Мутант А172-3, лишенный способности синтезировать побочные продукты при использовании матриц с 3'-выступающим концом, оказался предпочтительным для синтеза заданных последовательностей РНК, поскольку позволял получить более чистые препараты и повысить их выход. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), на 19 Конференции ФЕБО (Рим, 1989), 20 Конференции ФЕБО (Дублин, 1990), Симпозиуме «Молекулярные механизмы транскрипции» (Кейстон, 1992), 22 Конгрессе ФЕБО (Стокгольм, 1993), 16 Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, 1994), Совещании по молекулярной генетике бактерий и фагов (Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1995), 13 Международном круглом столе «Нуклеотиды и нуклеозиды и их применение в биологии» (Монпелье, 1998), Международном симпозиуме «Биокатализ-98» (Пущино, 1998), 26 Конференции ФЕБО (Ницца, 1999), 4 Международной Энгельгардтовской конференции (Москва - Санкт-Петербург, 1999). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 печатных работы. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 223 наименования. Диссертация содержит рисунков и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Аминокислотная последовательность Т7РПКП имеет высокую степень гомологии с родственными ферментами. При системном сопоставлении первичных структур односубъединичных ДНК- и РНК-полимераз (Бе1агие е! а1, 1990) было установлено наличие трех консервативных мотивов, общих для этих ферментов - А, В и С (рис1). Мотивы А и С имеются во всех без исключения ДНК- и РНК-полимеразах, в них содержатся инвариантные остатки
аспарагиновой кислоты. Мотив В характерен лишь для некоторых ДНК-полимераз, но для всех без исключения РНК-полимераз, и содержит инвариантные остатки лизина, тирозина и глицина (для Т7РНКП - Lys631, Тугб39 и Gly640). Данные по ограниченному протеолизу Т7РНКП позволили постулировать доменную структуру фермента; он легко подвергается специфическому расщеплению на большой С-концевой и малый N-концевой домены. Характерным свойством Т7РНКП является синтез большого количества коротких (т.н. абортивных) транскриптов, с последующей диссоциацией реакционного комплекса и реинициацией транскрипции. Способность к синтезу абортивных транскриптов сохраняется у изолированного С-концевого домена, что позволило заключить, что в нем расположен активный центр фермента (Dceda & Richardson, 1987). Т7РНКП проявляет строгую специфичность к консенсусной последовательности фагового промотора. Фермент также может использовать в качестве матрицы одноцепочечный полинуклеотид d(Qn; при этом синтезируются narm(G) последовательности. Первые данные по рентгеноструктурному анализу Т7РНКП (Sousa et al, 1993) позволили установить ряд общих закономерностей пространственной структуры фермента. Было обнаружено определенное сходство в строении Т7РНКП и ряда односубъединичных ДНК полимераз, таких как ДНК-полимераза I E.coh (фрагмент Кленова) и обратная транскриптаза ВИЧ (HIV I) (Steitz, 1999). Все они оказались организованными по модульному принципу, причем различные функциональные активности этих ферментов были сосредоточены в специфических белковых доменах. Пространственные структуры полимеризующих доменов этих односубъединичных полимераз по форме напоминают правую руку, в связи с чем соответствующие субдомены получили наименования "palm", "thumb" и "fingers" («ладонь», «большой палец» и «пальцы»). При этом консервативные структурные мотивы А и С пространственно сближены и располагаются в «ладони», а мотив В - в «пальцах». Субдомены образуют глубокую полость, допускающую размещение в ней почти двух полных витков двуспиральной молекулы ДНК (рис.1). Пространственная локализация N-концевого домена Т7РНКП в этой работе не была установлена, возможно, вследствие его подвижности.
В то же время, даже после появления первых рентгеноструктурных данных, вопрос о механизме функционирования фермента и значении отдельных аминокислотных остатков и консервативных мотивов в целом, оставался открытым.
и
1. Нуклеотидные ингибиторы Т7РНКП. Аффинная модификация.
Мы начали исследования с тех экспериментов, которые традиционно предшествуют рентгенострукгурному и мутационному анализу белков, а именно со скрининга потенциальных ингибиторов Т7РНКП и поиска реагентов для аффинной модификации. Для детального исследования роли рибозного фрагмента молекулы субстрата был исследован ряд аналогов UTP (рис. 2А), содержащих дополнительные метальные группы в положениях 2', 3' И 5' молекулы нуклеотида (соединения любезно предоставлены д.х.н. С.Н. Михайловым, ИМБ РАН).
но он
Ura Hi*»
А.
1 S'eMo-UTP 2 SlMt-UTF
"ТлГ
HOOH HOOH
5 7M»4JTP
4 ЗММЛР
? % °
P. _p_o_p_o_|_on
CH OH OH
100 80 to
40-
n-
9
1«-
¡2 m CD -UTP
контроль 51We-UTP
УаМв-ИТР TMe-VTP
ft 5 4 .1 2 1
B.
1
w w <m
iSi* 1 *
Рис.2. А: Формулы исследованных аналогов OTP;
Б: Относительная активность Т7РНКП
в присутствии аналогов UTP. В: Транскрипция in vitro в присутствии аналогов UTP: 1:+UTP (контроль); 2:-UTP (отрицательный контроль); 3: +5'aMeUTP; 4: +5'tMeUTP; 5:+2'MeUTP; 6: +3'MeUTP.
б
Было установлено, что введение метальных заместителей в 5*-положение рибозного кольца не приводит к полной потере субстратных свойств соединения, хотя имеется определенная зависимость эффективности включения от пространственного расположения метильной группы. Так, 5'-алло-ИЗОМер (5'аМеЦТР) обеспечивал активность фермента, равную 15% от контрольной, а для талло-изомера (5'1МеиТР)включение составляло 7% (рис.2Б). В обоих случаях совместное присутствие в реакционной смеси аналога и природного субстрата приводило не только к полному восстановлению активности, но даже к некоторому ее превышению, близкому к аддитивности (110 и 103% соответственно). ЗМеШТР не являлся субстратом для Т7РНКП, однако добавление природного иТР полностью восстанавливало активность фермента, что указывает на отсутствие связывания аналога в активном центре фермента. В то же время не только
утрачивал субстратные свойства, но и эффективно ингибировал включение природного иТР (рис. 2Б). Из рис.2В видно, что З'МеШР не включается в РНК-продукт, в то время как 2'МеИТР после однократного включения обеспечивает полную терминацию синтеза. Таким образом, введение заместителей в 2'(3') положения, при сохранении общей конфигурации гидроксильных групп, тем не менее приводит к невозможности утилизации З'МеШР ферментом, а в случае 2'МеШР - к высокоэффективной терминации.
Данные соединения и их дезокси-аналоги были ранее исследованы как субстраты некоторых других ДНК- и РНК-полимераз (Савочкина и др.;1989, М1кЬаНоу е! а1, 1991). Сравнение результатов этих исследований с нашими данными позволяет подтвердить заключение, сделанное при сопоставлении структур целого ряда односубъединичных ДНК- и РНК-полимераз: Т7РНКП имеет общие структурные черты (и, видимо, некоторые особенности механизма действия) в большей степени с односубъединичными полимеризующими ферментами, даже с ДНК-полимеразами, нежели с РНК-полимеразами мультисубъединичной структуры. В первом случае общие закономерности утилизации метальных производных были аналогичны нашим результатам, а для РНК-полимеразы Е.соН результаты оказались противоположными: 3'МеИТР являлся терминатором синтеза, а 2'МеИТР не узнавался ферментом. Проведенные конформационные расчеты показали, что для 3'МеиТР взаиморасположение нуклеинового основания и метильного заместителя приводит к возникновению стерически «запрещенной» конформации аналога, которая «разрешена» в случае природного ИТР и 2'-замещенного производного. Поскольку З'МеШР не узнается ферментом, вероятно, что конформация приходящего нуклеотидного субстрата в процессе ферментативного акта лежит в «запрещенной»
области. Терминирующие свойства 2'MeUTP с наибольшей вероятностью объясняются тем, что для данного аналога характерна преобладающая М- конформация рибозного цикла, сопряженная с изменением расположения З'-ОН группы и отдалением ее от места формирования следующей межнуклеотидной связи.
Поскольку инициирующим нуклеозидтрифосфатом для Т7РНКП является исключительно GTP, и активный центр фермента окончательно формируется лишь в присутствии последнего (Basu & Maitгa, 1986), нами далее был протестирован ряд модифицированных производных GTP, что позволяло составить представление о важности отдельных фрагментов молекулы инициирующего субстрата (соединения предоставлены [Ю.В.Хроповим,} МГУ). Некоторые из ню содержали реакционноспособные группировки, и могли являться потенциальными аффинными модификаторами фермента (рис.3)
"А
ОН ОН
Рис.3. Общие формулы исследованных аналогов СТР. Радикалы Л и К| - см. в табл.1 и 2.
Среди исследованного ряда производных GTP были обнаружены как обратимые конкурентные ингибиторы, которые были охарактеризованы соответствующими константами ингибирования К, (табл.1), так и соединения, ковалентно связывающиеся с ферментом (табл. 2). Для последних определялись величины констант связывания (К) и констант скорости ковалентной модификации (к) в соответствии с уравнением (1):
Е +1 Е*1 —» Е-1 (1)
Таблица 1. Аналоги СТР - обратимые конкурентные ингибиторы Т7РНКП.
№ 11(1*1) КьмМ
I и = -Р-0-Р-СН2-СН2-Пг >2
II -Р-0-Р-0-Р-СН2-СН2-Вг 0,9
III -Р-О-Р-О-Р-СН2-С1 1,6
IV -Р-0-С(0)-Мез 2,0
V "зС Сн3 -Р-О-Р-О-Р-О- ( N- Н3С сн3 >2
VI -С(0)-РЬ-802Р-Л< 0,4
VII К1= я /=\
-Ю 0.9
У
VIII т „_„■ Н3с сн3 >2
Таблица 2. Аналоги вТР, необратимо связывающиеся с Т7РНК11.
№ к Кт,мМ кз, мин"1
IX -Р-СН2 -СНг-Вг 0,4 0,17
X -С(0)-РЬ-802Р-л 1,0 0,12
XI -С(0)-Р11-СН2-Вг 1,4 0,20
XII -С(0)-РЬ- ЭСЪР-и (основание Аёе) 2,5 0,12
Обсуждая результаты, представленные в табл. 1 и 2, можно отметить следующие закономерности:
1. Сродство аналога к нуклеотид-связывающему центру определяется преимущественно «нуклеозидным» фрагментом молекулы, а длина полифосфатной цепочки не имеет существенного значения для связывания. Так, наиболее сильный ингибитор (VI) вообще не содержит трифосфатного фрагмента.
2. Большинство исследованных аналогов GTP содержат два типа реакциошюспособных групп: галоидалкильную или сульфонилфторидную. Среди необратимых ингибиторов Т7РНКП представлены соединения обоих типов. При этом для соединений необратимого действия
характерны близкие расстояния от 5'- углеродного атома гуанозина до нуклеофильного центра атакующей группировки (6,5-8,5 А с учетом средних длин связей). Соединения с большими или меньшими расстояниями необратимо с ферментом не связываются, даже обладая очень похожим строением (ср. например, соединения с разным числом фосфатных групп в молекуле,
или отличающиеся положением сульфонилфторидной группировки в заместителе).
Во всех случаях ковалентной модификации Т7РНКП наблюдался эффект защиты субстратами, причем в максимальной степени - при одновременном использовании матрицы и GTP, что свидетельствовало о специфичности посадки ингибитора в районе активного центра фермента. Сульфонилбензоильное производное аденозина (Р8ВЛ) имело несколько более высокую константу ингибирования, чем 5'-я-фторсульфонилбензоил-гуанозин (FSBG), при равной константе скорости модификации, что указывало на вероятное взаимодействие этих соединений с одной и той же аминокислотой фермента. Поэтому для детального исследования аффинной модификации Т7РНКП мы выбрали аденозиновое производное, как наиболее часто использующееся и легко доступное (в том числе, в виде соединения).
Данные табл.3 демонстрируют, что модифицированный фермент (Еи) утрачивает связывание со специфическим промотором и нуклеотидным субстратом (GTP), сохраняя при этол сродство к достаточно протяженным фрагментам неспецифической ДНК.
Таблица 3. Связывание матрицы и GTP с нативной (Е) и модифицированной (Ет) Т7РНКП.
Фермент Связывание с ДНК, К, х 10" М Связывание GTP, отн.ед.
pGEM-2 Короткий промотор ДНК без промотора -pGEM-2 +pGEM-2
Е 5,7 + 0,7 2,8 ±0,4 16,0 ±3,0 100 370
Еш 16,4 ±1,5 - 19,0 ±5,0 1,02 14,6
С целью установления аминокислотного остатка, подвергавшегося модификации, мы использовали радиоактивно меченый [14C]-FSBA, полученный нами в соответствии с описанной методикой (Wyatt& Colman, 1977). Включение [14С]-метки в белок коррелировало с падением активности фермента и составляло 0,95 моль/моль белка. При ограниченном гидролизе модифицированной Т7РНКП трипсином было показано, что изотоп включался в N-концевой домен. При этом специфический сайт ограниченного протеолиза смещался в сторону «цептра» белка (рис.4). Это позволяет предполагать, что модифицируемая аминокислота находится в N-концевой области, причем вероятнее всего в районе междоменной перемычки.
Исчерпывающий трипсинолиз Е„ и последующее фракционирование гидролизата с помощью ВЭЖХ позволило выделить гомогенный [иС]-меченый пептид, первичная структура которого (А5п-Уа1-О1и-О1и-О1п-Ьеи-А5п-Хаа-Аг£, где Хаа -модифицированный аминокислотный остаток) однозначно соответствует последовательности пептида 165-173 в структуре Т7РНКП, причем модифицированной аминокислотой является остаток Ьуз-172. Отметим, что связь между остатками Ьу8172-А^173 преимущественно подвергается расщеплению при междоменном протеолизе Т7РНКП.
Этот результат оказался несколько неожиданным, поскольку было известно, что активный центр фермента расположен в С-концевом домене. Наши данные позволили впервые предположить функциональное взаимодействие доменов и пространственную сближенность активного центра Т7РНКП и междоменной перемычки. Для подтверждения этой гипотезы мы использовали тот факт, что сульфониламидная связь, образовавшаяся при взаимодействии Р8БА с е-аминогруппой лизина, достаточно прочна, в то время как сложноэфирная связь между 5'-гидроксилом рибозы и карбоксильной группой заместителя лабильна, особенно при щелочных значениях рН. При диализе модифицированного фермента при рН 9 мы регистрировали уменьшение включения метки в белок, что связано с гидролизом сложноэфирной связи и высвобождением [,4С]-аденозина. При этом ковалентно связанная сульфонилбекзоильная группировка должна была остаться присоединенной к остатку Ьув172 (рис.5).
Оказалось, что обработанный таким образом фермент частично восстанавливает активность. При этом Кп,011' «восстановленного» фермента становится равной константе для нативного белка, что указывает на освобождение места связывания нуклеотидного субстрата. Синтез абортивных транскриптов восстанавливался в большей степени, чем полноразмерных, что позволило нам заключить, что роль ^концевого домена и/или междоменной перемычки более существенна для стадии элонгации и синтеза длинных транскршггов.
2. Роль ^концевого домена и междоменной перемычки
Полученные нами результаты, свидетельствующие об участии ^концевого домена во взаимодействии с матрицей, были подтверждены исследованием ограниченного трипсинолиза Т7РНКП в присутствии субстратов реакции (табл.4).
Таблица 4. Ограниченный трипсилолиз Т7РНКП в присутствии компонентов РНК-полимеразной реакции и после модификации Р8БЛ
Состав смеси Полипептидные фрагменты, % Т|я, мин
98К 80К 70К 20К др.
Т7РНКП 12,7 57,3 20,9 3,3 15,8 8,0
Т7РНКП+СТР 12,0 22,4 20,7 12,0 34,3 8,0
Т7РНКП + Д1ПС 22,7 51,5 - 9,1 16,7 19,0
Т7РНКП + РНК 21,8 47,3 10,9 3,6 16,4 17,0
Т7РНКП + рОЕМ-2 26,7 35,7 - 37,7 - 20,0
Т7РНКП + РБВА (Е„) 48,7 12,5 30,8 - 8,0 24,0
Время реакции - 30 мин. Т\п - время полужизни Т7РНКП.
Присутствие GTP мало влияет на скорость протеолиза междоменной перемычки и на расположение сайта расщепления. Наличие же в реакционной смеси промотор-содержащей плазмиды pGEM-2, а также РНК или неспецифической ДНК, заметно снижало скорость трипсинолиза фермента. Во всех случаях N-концевой фрагмент в полиакриламидном геле практически не регистрировался, что связано с его быстрой деградацией после отщепления. Однако присутствие pGEM-2 полностью предотвращало вторичную деградацию N-концевого домена, что свидетельствует о том, что этот домен остается связанным с промотор-содержащей ДНК и защищенным от протеолиза.
Для дальнейшего изучения роли этого участка фермента в нашей лаборатории (к.б.н. В.О. Речинский и к.б.н. Д.Л.Ляхов) были получены три мутантных формы Т7РНКП с заменами в области междоменной перемычки а также мутант, содержащий
делецию двух соседних остатков Lys 172 и Arg173 (Д172-3). Все полученные мутанты оказались способными к синтезу полноразмерных РНК-копий (рис.6).
Отличительной чертой транскриптов, полученных при использовании матрицы с 3'-выступающим концом (как использованная нами плазмида pGEM2, линеаризованная при расщеплении рестриктазой является появление аномальных продуктов с длиной,
12 3 4
1
Рис.6. Транскрипция in vitro Т7РНКП и ее мутантными формами. Матрица - pGEM-2 (Sphï). 1-Т7РНКП;
2 - Lysl72Leu;
3 - Lysl72Gly; 4-Д172-3.
превышающей транскрибируемую часть матрицы. Существуют два объяснения этой аномальной активности: предполагающее «поворот» фермента и считывание противоположной цепи ДНК ^сЬепЪогп & М1егепёогГ, 1985), или продолжение синтеза в режиме удлинения РНК-праймера (Са2епауе & иЫепЪеск, 1994; №сЬеуа & Вегеа1-Негтап2, 2003). В нашем случае эти продукты присутствуют в транскриптах, синтезируемых как ферментом дикого типа, так и мутантами Ьуз1721.еи иЬу8172С1у. В то же время при использовании мутанта Д172-3 таких продуктов не образуется. Можно предположить, что делеция двух остатков междоменной перемычки приводит к существенным изменениям в структуре ^конщевого домена и/или взаиморасположении доменов, которые лишают фермент возможности «разворачиваться» на выступающем З'-конце матрицы. Это свойство мутанта Д172-3 является весьма полезным в плане его практического использования для получения РНК заданной структуры без образования побочных продуктов.
Для подробной характеристики полученных мутантных форм фермента (и других планируемых мутантов), было важно определить отдельно параметры инициации и элонгации синтеза РНК, поскольку влияние аминокислотных замен на эти стадии процесса транскрипции могло оказаться различным. Мы предложили принципиально новый подход к оценке параметров стадий инициации и элонгации синтеза, основанный на кинетическом анализе реакции.
С одной стороны, время синтеза одной полной копии матрицы определенной длины может быть выражено, как
где - среднее время элементарного акта элонгации (включения одного нуклеотида в растущую цепь РНК); N - число нуклеотидов в транскрибируемой части матрицы; сложный параметр, включающий временные характеристики стадий, отличных от элонгации - связывания субстратов, инициации и терминации транскрипции.
С другой стороны, т может быть рассчитано по результатам эксперимента как
где t - время протекания реакции; [М] И [С] - концентрации матрицы и нуклеотидного субстрата, соответственно; АО - общая радиоактивность в пробе, срт; А - включение радиоактивности в продукт, срт; ф -«коэффициент гетерогенности матрицы». При длине матрицы более 150 п.о. можно считать, что все четыре нуклеотида встречаются в транскрипте с одинаковой частотой. В случае матриц меньшей длины необходимо учитывать их состав, так как
для большинства матриц, применяющихся для определения активности Т7РНКП, в районе начала синтеза транскрипт обогащен пуриновыми нуклеотидами, особенно гуаниловыми. Отсюда при N>150 п.о. ф = 4; а при N<150 п.о. ф<4 и рассчитывается для каждой конкретной матрицы.
Используя набор линейных матриц различной длины, можно экспериментально определить значения г для Т7РНКП и мутантных форм. Далее из графика зависимости т =/(№) определяется ^ как тангенс утла наклона (и обратная величина V - скорость элонгации), и обобщенный параметр - как отрезок, отсекаемый прямой на оси Г(рис.7).
Рис.7. Определение скорости
элонгации и параметра tx
для Т7РНКП и ее мутантных форм
(см. текст):
1 - Т7РНКП дикого типа;
2 -Г-увШЬеи;
3-Д172-3;
4-1^172С1у.
0 800 1000 1600 2000 2500 3000
N. нукл
Таблица 5. Свойства мутантных форм Т7РНКП с заменами в междоменной перемычке.
Фермент Активное ть,% V, нукл7сек. и, сек. Связ. с промотором К^хЮ-'М Активность на неканонических матрицах,%
Т7РНКП 100 97 3+2 2.2 (<1С)„-100 ДНК<1 а(1С)„-13 (Ш)п-<1
ЬуБ172Ьеи 120 106 3±1 5,0 ас)„- юо ДНК- 13 <1(1С)„-52 (гЩ,- 13
ЬувШау 80 27 22+4 2,6 <1С)„- 50 ДНК< 1 аас)„-1-4 (ги)п-<1
Д172-3 110 125 2+1 10,0 ёС)п- 100 ДНК- 7 <1(1С)„-44 (гЦ)„- 8
Константы Михазлиса для гМТР у мутантов совпадают с параметрами для фермента дикого типа.
X, сек
Исследование специфичности мутантов в отношении матриц различного типа показали, что два из трех полученных ферментов - Lysl72LeU И Д172-3, приобрели повышенную способность к синтезу полирибонуклеотидов на беспромоторных матрицах, как двухспиральных, так и одноцепочечных, причем эта способность коррелирует с некоторым ослаблением фермент-промоторного взаимодействия (табл.5).
Еще одно свидетельство участия N-концевого домена в связывании с промотором было получено при изучении взаимодействия фермента с синтетическими олигонуклеотидами, соответствующими консенсусной последовательности промотора и содержащими химически активированные межнуклеотидные фосфатные группы. Олигонуклеотид, содержащий такой активированный фосфат в положении (-14) промотора, образовывал ковалентную связь с остатком Lys98 белка (Филиппова и др., 2002). На основании этих данных нами была проведена замена Lys98 на остатки Arg и Ala. Мутант Lys98Arg, содержащий близкородственную замену, частично сохранял ферментативную активность (до 15% от контрольной), причем в большей степени - в синтезе коротких транскриптов (~30% от контрольной). При этом константа диссоциации фермент-промоторного комплекса у него резко возрастала (>10-6 М). Замена Lys98Ala приводила к полной потере ферментативной активности и связывания мутанта с промотором. Поскольку такое связывание, а также способность к синтезу абортивных транскриптов, сохраняется у С-концевого домена Т7РНКП даже при отсутствии N-концевого, можно заключить, что мутация Lys98Ala не только нарушает взаимодействие с промотором данного остатка, но и изменяет пространственную структуру всего домена (или его части) таким образом, что последний препятствует функционированию С-концевого домена.
Участие N-концевого домена в связывании Т7РНКП с промотором на протяжении нескольких лет было предметом дискуссии. Предполагалось, что этот домен образует центр неспецифического связывания полинуклеотидов, служащий для стабилизации растущей РНК-цепи, при отсутствии непосредственного взаимодействия с промотором. Однако полученные нами результаты указывают на то, что роль N-концевого домена и междоменной перемычки не исчерпывается связыванием РНК-продукта; помимо этого имеет место его взаимодействие с промотором, а также участие в формировании структуры С-концевого домена. Недавно опубликованные данные по РСА элонгационного комплекса Т7РНКП (Tahirov et al, 2002) полностью подтвердили наши выводы.
3. Роль аминокислотной последовательности 563-571 в Т7РНКП.
Для дальнейшего поиска функционально важных аминокислотных остатков Т7РНКП, в нашей лаборатории (к.б.н. В.О.Речинский, н.с. Д.А.Костюк) была создана генетическая система «случайного мутагенеза» Т7РНКП, позволяющая получать точечные мутанты, заведомо лишенные ферментативной активности in vivo на консенсусном промоторе. Полученные таким образом мутантные формы Т7РНКП приведены в табл.6.
Таблица 6. Мутантные формы Т7РНКП, полученные в результате случайного мутагенеза.
Положение Число Нуклеотидпая Аминокислотная
мутации Клонов замена замена
563 2 ССТ-»АСТ Pio->Thr
1 CCT-^GCT Pro-» Ala
571 1 TACТСС Туг-» Ser
636 1 ACG-»CCG Thr-»Pro
639 3 TAC-»GAC Tyr->Asp
646 1 TTC-^TGC Phe-»Cys
Несколько полученных мутантных форм фермента оказались «вырожденными» либо полностью (одна и та же замена в одном положении), либо частично (разные замены в одном и том же положении). Характерно, что все замены были локализованы в двух достаточно коротких фрагментах белковой молекулы, один из которых совпадает с консервативным мотивом В, а другой находится вблизи от мотива А, но непосредственно в него не входит. Тем не менее, при анализе структур родственных ферментов мы обнаружили значительную гомологию первичных последовательностей в этом районе, причем мутировавшие остатки были инвариантными. Мы назвали этот участок «мотивом Б». Для выяснения роли мотива Б были исследованы как мутантные формы фермента, найденные методом случайного мутагенеза, так и еще ряд специально полученных мутантов в этом участке (рис.8). Свойства полученных мутантов приведены в табл.7.
Т7/ГЗ ССИАУ1ЧЫ,Р8ЕТУд01¥С1УА
К11 СС11АУМ,ЬР80ТУ<2П1УК1УА
вРб САКАУЗЧЬКР80АРд01У(}АУА
УШ САТрУГЧЬУРвВКРдоХУАНУА
Рис.8. Аминокислотная последовательность 555-575 в Т7РНКП (мотив И) и соответствующие участки в родственных РНК-полимеразах. Совпадающие аминокислоты выделены жирным шрифтом, родственные — подчеркнуты. Курсивом обозначены исследованные
Таблица 7. Свойства мутантных форм Т7РНКП, содержащих точечные замены
Мутанты Рго563А1а, Рго5631Ъг и Tyr571Ser были получены в результате случайного мутагенеза в условиях, предполагающих отсутствие ферментативной активности in vivo. При тестировании in vitro у обоих мутантов с заменами в положении 563 обнаруживалась незначительная активность на Т7 промоторе, однако эта активность была нестабильной и быстро падала при хранении препаратов. Мутант Tyr571Ser был изначально полностью неактивен в промотор-содержащей системе, однако замена того же остатка на родственный Phe не приводила к столь критическим последствиям (лишь двукратное падение активности). В то же время ферменты с любыми заменами в положениях 563 и 571 проявляли высокую и стабильную активность на матрице (dC)n в отсутствие специфического промотора. Отсюда следует, что данные остатки существенны именно для взаимодействия Т7РНКП с Т7 промотором. Замены в положении 564 и 568 оказалась не столь существенными, хотя активность последнего мутанта
была заметно снижена, преимущественно за счет ухудшения связывания с промотором и инициации синтеза. Обе замены в положении 569, как Asp->Asn, сопряженная с уничтожением заряда карбоксильной группы, так и замена па нейтральную аминокислоту Ala, приводили к полной потере активности, причем как на промотор-содержащей матрице, так и на Связывание с промотором у этих мутантов было значительно снижено. Константы Михаэлиса для NTP (измеренные для активных мутантов), практически не отличались от значений, полученных для фермента дикого типа, что указывает на отсутствие взаимодействия этой области белка с нуклеозидтрифосфатами.
По данным РСА, для исследованного нами фрагмента молекулы Т7РНКП (остатки 555575) взаимодействие с промотором не зафиксировано. Поскольку мы наблюдали явную и однозначно интерпретируемую потерю связывания с промотором обоих мутантов по положению 569, а также мутанта Tyr571Ser, мы провели более тщательный анализ имевшихся рентгеноструктурных данных. Это позволило выявить возможное образование остатками Asp569 и Туг571 водородных связей, способствующих стабилизации реакционного комплекса (рис.9) Разрушение этих связей в результате мутагенеза приводит к дестабилизации локальной структуры и к утрате ферментативной активности.
Рис.9. Пространственная структура участка (555-575) Т7РНКП (мотив Ю).
Таким образом, нами впервые обнаружен участок в структуре Т7РНКП (мотив D), не принадлежащий к известным консервативным мотивам, но имеющий высокую степень гомологии с родственными односубъединичными полимеразами, и принимающий непосредственное участие во взаимодействии Т7РНКП со специфическим промотором.
4. Исследование консервативного мотива В.
К моменту начала нашей работы каких-либо систематических исследований функциональной роли этого мотива проведено не было. Основанием для изучения мотива В послужили данные по аффинной модификации остатка Ьув631 о-формил-фепиловым эфиром ОМР (Максимова и др., 1989), а также тот факт, что значительное число мутаций, полученных при «случайном» мутагенезе, оказались принадлежащими именно этому мотиву. Для выявления функциональной роли этих и других аминокислотных остатков, составляющих мотив В, был получен и охарактеризован набор направленных мутантов, содержащих различные точечные замены в этой области (рис.10 и табл. 8).
Т7/ГЗ УТгаутемуМПДУСЖЕРОР РНК-полимеразы К11 УТЙКУТЮ^УМТЬАУСБКЕБЬУ
ДНК-полимеразы КР Е(5Ш18АКА1 N РСТ, ГУвМБ АРвЬ Тач ЬМШ1ААКГ1N РОУЬУСМБ АНЫ-
УТЛвУТКЗЙУМТЪАУСвКЕГСР
Рис. 10. А - Аминокислотные последовательности мотива В в односубъединичных РНК- и ДНК-
полимеразах. Инвариантные остатки выделены жирным шрифтом; остатки, идентичные в РНК-полимеразах, но отличные от ДНК-полимераз подчеркнуты.
Б • Исследованные аминокислотные замены в мотиве В. Курсивом обозначены результаты
Как показывают данные табл. 8, свойства мутантов Т7РНКП, содержащих точечные замены в К- и С- концевых фрагментах мотива В, несколько различаются. Так, для мутаций в N концевой части (остатки 627-635) характерна значительно сниженная активность, причем это снижение в большей степени зависит от самого факта замены определенной аминокислоты, нежели от характера этой замены. Для данной группы мутантов было показано сохранение связывания с промотором, а также незначительные изменения что указывало на то, что
взаимодействие с компонентами транскрипционного комплекса непосредственно не
затрагивается. При измерении параметров инициации и элонгации для некоторых мутантов, сохранявших частичную активность, было установлено, что уровень активности хорошо коррелирует с изменением скорости элонгации синтеза, в то время как временные затраты на другие стадии транскрипционного цикла были одинаковы у исследованных мутантов и Т7РНКП дикого типа. Таким образом, мутации в этой части мотива В приводят к снижению или потере активности за счет нарушения процесса элонгации синтеза РНК.
Таблица 8. Свойства мутантных форм Т7РНКП, содержащих точечные замены в мотиве В.
Активность, % Связ.с промотором КЛ**, М Кгамтр, мкМ
Станд. («V СТР АТР СТР ЦТР
Т7РНКП 100 100 2,2x10-' 160 40 60 38
А^627йп"' 15(37°) 20(42°) 7(37°) 16(42°) - 200 75 60 60
Ьу8б31А^"" 25(30°) 5(37°) 2.5x10'7 170 140 60 149
Ьуз631Ьеи'" 2-5 5,6x10"' 200 138 76 154
Ьу8бЗЮ1у"" 2 0,4x10-' 170 48 80 39
А^63201у 75 0,5x10"' 80 - - -
8егбЗЗА1а <1 1,8x10-7 - - - -
8ег633А1а, Ме1б35Пе <1 3,3x10"° - - - -
МеЙЗбТуг'" 5-10 - - - - - -
ТЬгбЗбРго <1 <1 2,0x10"' Нелинейная зависимость
Тугб39РЬе 120 100 0,5x10"' 400 100 150 100
ТугбЗЭЬув 20 50 0,8x10"' 176 135 130 30
ТугбЗЭАэр <1 5 2,5x10"' - - - -
ТугбЗЭАвп 3 40 10x10"' 190 155 80 30
8ег641А1а <1 <1 - - - - -
Тугб39РЬе,8ег64 1А1а 120 100 0,9x10"' 180 50 80 40
РЬеб46Су5 2-5 40 нелинейная зависимость
'Активность на (<1С)п приведена, когда она заметно отличается от стандартной.
"Для неактивных мутантов связывание с промотором определялось по константе ингибирования мутантом связывания фермента дикого типа.
•"Мутанты, нестабильные при хранении.
Кроме того, характерным свойством мутантов данной группы была их невысокая стабильность: активность падала в течение нескольких дней после выделения фермента. В большинстве случаев (за исключением мутанта Aгg627GIn) эта нестабильность не сопровождалась протеолитической деградацией белка. Исследование температурной зависимости
реакции транскрипции, а также анализ КД спектров в области 200-250 нм, позволили заключить, что для мутаций в N- концевой части мотива В характерны аномальные температурные параметры реакции и структурные изменения. Arg627Gln оказался более термостабильным, чем Т7РНКП дикого типа: температурный оптимум ферментативной реакции для этого мутанта повышался до 420С. Напротив, температурный оптимум ферментативной активности для мутантов по положению 631 (Lys631Arg и Lys631Gly), был снижен до 25-30°С, при практически полной потере активности при 40°С. Анализ спектров КД для мутанта Lys631Arg позволил рассчитать уменьшение а-спиральности до 26% (фермент дикого типа - 48%) и увеличение содержания суммарной p-структурыуже при 15°С. Аналогичнвыйререход наблюдается для нативной Т7РНКП только при 50°С.
Иные закономерности обнаружились при исследовании мутантов, содержащих замены в С-концевой части мотива В. Для мутаций в положении 639 была характерна зависимость активности фермента не от самого факта, а от характера аминокислотной замены: мутант Тугб39РЬе полностью сохранял ферментативную активность, замена Tyr639Lys приводила к ее заметному снижению, а замены в том же положении на Asp и Asa - к полной потере активности на Т7-промоторе. В то же время способность к синтезу поли(С) на матрице (dC)n у этих мутантов в значительной степени сохранялась. Однако параметры связывания с промотором в этом ряду мутантов не изменялись. Более подробное исследование самого низкоактивного мутанта этого ряда - Tyr639Asp, привело к заключению, что в этом случае нарушенным звеном является взаимодействие с NTP (табл 9).
Таблица 9. Относительное связывание GTP и АТР ферментом дикого типа и мутантом Tyr639Asp*.
NTP Т7РНКП Tyr639Asp
-Рг + Рг -Рг + Рг
GTP 1 2,3 3.57 3,55
АТР 0,017 0,11 1,19 1,42
•Связывание G1P нативной Т7РНКП принято за условную единицу.
Во-первых, сродство фермента к инициирующему GTP в случае мутанта несколько повышено и перестает зависеть от наличия промотора в реакционной смеси; во-вторых, если фермент дикого типа не проявляет заметного сродства к АТР, то мутант фактически не различает эти нуклеотиды и связывает их с близкой эффективностью. Аналогичное повышенное сродство к АТР обнаружилось у Tyr639Asn, но отсутствовало у Tyr639Lys и у Туг639РЬе. Эти данные позволяют сделать вывод, что ароматическое кольцо Туг или Phe принимает участие в
правильной ориентации NTP при элонгации РНК-цепи. Замена Tyr->Lys загрудняет эту ориентацию, а введение карбоксильной (Asp) или карбоксамидной (Asn) групп нарушает адекватное расположение пуклеозидтрифосфата, что приводит к тому, что при необходимости утилизации всех четырех NTP невозможен отбор комплементарного основания. Поскольку эффективность синтеза на гомогенной матрице для мутантов этого ряда также снижена, возможно, что нарушаются и параметры утилизации GTP. Мутанты Tyr639Asp и Tyr639Asn оказались равно неактивными в промотор-зависимом синтезе, но при замене
активность на гомоматрице (dC)n существенно увеличилась. Можно полагать, что отрицательный заряд карбоксильной группы особенно неблагоприятно сказывается на правильной ориентации GTP. Заметим, что во фрагменте КленоваДНК-полимеразы 1£л>Л'остаток Туг766, гомоло/ячный Туг639 в Т7РНКП, расположен в сайте связывания dNTP и, вероятно, принимает у-ысгие во взаимодействии с последним (Yadav et al, 1992). Исследование других мутаций в С-концевой области мотива В показали, что в случае замены ТЬтбЗбРгО нарушенным звеном также оказывается связывание нуклеотидЕого субстрата, а замена Thr646Cys приводит к аномально высокому сродству фермента к промотору и к неправильному расположению последнего, вследствие чего промотор препятствует связыванию GTP.
Агй632
Рис. 11 ■ Пространственная структура мотива В Т7РНКП.
По данным РСА, мотив В расположен в субдомене «пальцы», сближен с мотивами Л и С, и, по-видимому, вместе с ними образует активный центр фермента. Основная часть этого фрагмента молекулы представляет собой а-спираль; при этом в соответствии с ходом спирали боковые радикалы четырех аминокислотных остатков Аг»627, Ьуз631, Ме1635 и Туг 639 -направлены в полость связывания субстратов реакции. Два из этих остатков - Lys631 и Туг639, являются инвариантными, а А^627 присутствует у большей части ферментов. Дополненная нами модель, построенная на основании этих РСА данЕЫХ, показывает, что остатки ТЬгбЗб, 8ег641 и РЬе646 пространственно сближены, и в случае замены ароматического кольца РЬе646 на серосодержащий остаток цистеина, локализация последнего допускает изменение взаиморасположения трех перечисленных аминокислот, сопряженное со значительным нарушением параметров активного центра (рис.11).
Таким образом, высококонсервативный мотив В в структуре Т7РНКП может быть подразделен на две функционально различающиеся области. Мутации в М-концевой части этого мотива (остатки 627-635), не влияют непосредственно на связывание ни с промотором, ни с нуклеотидными субстратами. При этом мутантные белки, как правило, характеризуются значительной нестабильностью и структурными изменениями, приводящими или к протеолитической лабильности (в случае замены А^627С1п), или к постгрансляционным перестройкам пространственной структуры. Последние проявляются как в изменении физико-химических характеристик (спектры КД и температурные аномалии активности), так и в быстрой инактивации при хранении. Можно полагать, что эта часть мотива В определяет пространственное расположение компонентов транскрипционного комплекса в ходе ферментативного акта. В то же время С-концевая часть мотива В (остатки 636-646) представляет собой собственно активный центр фермента (или его важную часть), где происходит инициация синтеза. Особо следует отметить роль остатка Туг639, вовлеченного в ферментативный акт непосредственно на стадии узнавания комплементарного нуклеотида и, возможно, формирования фосфодиэфирной связи.
5. Свойства «двойного» мутанта Тугб39РЬе,8егб41Л1а. Утилизация дезоксинуклеозидтрифосфатов и удлинение праймера.
При рассмотрении последовательности мотива В нами было замечено различие в первичных структурах этого участка у ДНК- и РНК-полимераз (рис.ЮА): у последних имеет место регулярная повторяемость гидроксилсодержащих аминокислотных остатков (положения 626,628,630, 633,636,639 и 641). При этом замены гидроксилсодержащих аминокислот в положениях
633,636 и 641, в отличие от положения 639, приводили к полной потере ферментативной активности. В то же время мы обнаружили, что одновременное удаление гидроксильных групп в положениях 639 и 641 («двойной» мутант Tyr639Phe,Sei641Ala) полностью восстанавливало активность фермента (см. табл.8). С другой стороны, как было упомянуто выше, аналогичный Туг639 остаток в структуре фрагмента Кленова (Туг766) непосредственно вовлечен в процесс дискриминации рибо- и дезоксирибонуклеотидов (Yadav et al, 1992).
Предположив, что замена Ser641 Ala сопряжена с невозможностью утилизации нуклеотидных субстратов именно из-за нарушения взаимодействия с рибозными остатками, и обнаружив, что уничтожение соседней гидроксильной группы восстанавливает такое взаимодействие, мы допустили, что этот «двойной» мутантный фермент может характеризоваться изменением специфичности в отношении рибо- и дезоксирибо- субстратов.
При детальном исследовании свойств мутанта Tyr639Phe мы обнаружили, что, при сохранении РНК-полимеразной активности, он в очень незначительной степени проявляет способность использовать в качестве субстратов дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (за исключением инициирующего dGTP). В то же время у «двойного» мутанта, помимо полного восстановления ферментативной активности, проявилась аномальная способность к утилизации dNTP, которая многократно превышала наблюдаемую при одиночной замене Tyr639Phe.
Мы подробно исследовали этот мутант с целью выяснения деталей его двойственной специфичности. Включение dNTP в полинуклеотидный продукт анализировалось как на уровне коротких (5-12 нуклеотидов) транскриптов, что могло служить моделью инициирующей стадии, так и при образовании достаточно протяженных полимеров. В качестве матриц мы использовали серию линеаризованных плазмид, отличавшихся последовательностью нуклеотидов в инициирующей части (табл.10).
Таблица 10. Плазмиды, использованные для тестирования включения в цепь РНК дезоксирибонуклеотидных звеньев мутантом Tyr639Phe,Ser641 Ala.
№ Плазмида/эпдонуклеаза рестрикции Последовательность РНК-транскрипта (с П03.+1) Длина транскрипта нукл.
I. pPV19/A2>aI GGGAAGCUUGCAUGC 109
II. pPV18 / HindOl GGGAAUUCGAGCUCG 134
m. pGEM-2 / BamHl GGGAGACCGGAAGCU 42
IV. pBSKSII / EcoRV GGGCGAAUUGCAGCU 73
V. pLys,3 / EcoW. GCCCGGAUAGCUCAG 86
VI. pTZR7G / PvuII GGGGGGGAUCCACUA 131
Эффективность синтеза смешанных полимеров падает по мере увеличения числа dNTP, замещающих rNTP. Наиболее «легко проходимыми» оказываются пиримидииовые нуклеотиды, причем dCTP лучше, чем dlTP, затем следует dATP и, наконец, dGTP. Утилизация dATP в положении 4 имеет место для трех плазмид (I, II и Ш, табл. 10); однако в случаях I и II требуется два включения dATP подряд. В результате включение dATP в этих случаях заметно меньше, чем для матрицы III, где dATP в 4-ое положение включается однократно. Включение dCTP, в целом достаточно эффективное, практически не происходит на матрице V, где требуется синтез «тройки» ССС в положениях 2-4. Включение dTTP оказывается максимальным для случая III, где данный нуклеотид впервые встречается только в положении 15. Таким образом, наиболее критичной для включения в продукт dNMP является инициирующая стадия: именно введение дезоксирибо-аналогов GTP и АТР, составляющих первые 5-6 звеньев транскрипта (большую часть инициирующего участка), является наименее эффективным. Сопоставляя эффективность включения dNMP со структурой транскрибируемой последовательности, можно видеть, что она тем выше, чем дальше от старта транскрипции впервые встречается заменяемый нуклеотид, и понижается в случае включения dNMP два и более раз подряд.
С целью обеспечить возможность более эффективного включения в транскрипт всех dNTP, за исключением инициирующего GTP, в нашей лаборатории (н.с. Д.А.Костюк) была сконструирована плазмида pTZR7G (матрица VI, табл. 10), в которой первые 7 нуклеотидов считываемой части представляли собой ^^-последовательность. При этом все остальные нуклеотиды оказывались фактически за пределами области инициации, наиболее чувствительной к замене rNTP-»dNTP. Данная конструкция явилась весьма перспективной для получения
смешанных полимеров: на ней с достаточной эффективностью синтезировались транскрипты 3dNTP/гGTP. В дальнейшем эта плазмида была использована в нашей и других лабораториях для получения смешанных полимеров различного состава.
При синтезе на различных матрицах были в целом выше, чем
Максимальное увеличение константы Михаэлиса (практически на порядок) наблюдалось для инициирующего dGTP и для dATP, что согласуется с фактом зависимости эффективности утилизации dNTP от расстояния места включения от начала транскрипции. Измерение величины <1СТР
с использованием плазмид серии рК, в которых положение первого остатка СТР в
лет?
транскрипте изменялось от позиции 7 до 19, показало монотонное падение значения Кт и приближение к величине Кщ1*^ по мере удаления позиции первого включения dCMP от участка инициации (рис.13).
250
£ 2С0
ь
Ч
X 150
100
50
\«рКЗ
№4.99*29
рК4
рКбЧ к*стг>
10
12 14 1С 1»
N
го гг г*
Рис 13. Зависимость от расстояния первого включаемого остатка ¿СТР от точки инициации транскрипции. N - порядковый номер первого включения.
В синтезе коротких транскриптов, при общем сохранении сформулированных выше закономерностей, точность транскрипции, во всяком случае на инициирующей стадии, у двойного мутанта была несколько снижена: при использовании впервые
включающегося в транскрипт в положении (+4), и немеченных рибо- или дезоксирибоGTP, составляющих инициаторную последовательность транскрипта GGG, мы наблюдали появление [НР]-меченых ди- и тринуклеотидов, причем частота ошибок была большей при использовании dGTP. Однако при добавлении [у-ИР]-АТР и dGTP меченого продукта зарегистрировать не удалось. Следовательно, гАТР не способен служить инициирующим нуклеотидом, и замена А имеет место лишь во второй или в третьей позициях транскрипта. Из этого опыта также следует
возможность инициации синтеза ёОТР, хотя и с невысокой эффективностью. Поскольку получение длинных транскриптов при наличии в реакционной смеси только трех из четырех КТР остается невозможным, ошибочное включение, по всей вероятности, проявляется в основном на стадии абортивной транскрипции - там, где имеются наибольшие затруднения при включении дезоксирибо-звеньев.
При исследовании синтеза коротких (5 нукл.) транскриптов Т7РНКП дикого типа и «двойным» мутантом мы использовали синтетические промотор-содержащие дуплексы. При этом было замечено, что наряду с ожидаемыми три, тетра- или пентамерами в случае транскрипции «двойным» мутантом в реакционной смеси обнаруживался в незначительном количестве радиоактивно-меченый продукт большей длины (около 20 нуклеотидов). Наиболее вероятным представлялось предположение, что наряду со способностью к утилизации дезоксирибо-нуклеотидов, данная мутаптная форма фермента приобретает и другое свойство, а именно возможность удлинения праймера, что в определенной степени сближает мутант с ДНК-полимеразами.
Для проверки этого предположения были использованы праймер-матричные конструкции, приведенные в табл. 11. Во всех трех системах мы наблюдали удлинение праймера (рис 14), причем олигонуклеотид, соответствующий последовательности Т7 промотора, удлинялся "двойным" мутантом более эффективно, чем праймер в неспецифическом дуплексе р8"№Т/Х17, то есть специфичность мутантного фермента в отношении нуклеотидной последовательности сохранялась.
Таблица 11. Праймер-матричные системы, использовавшиеся при исследовании реакции удлинения праймера «двойным» мутантом.
С22/1Ч17 кодирующая цепь Т7 промотора + 5 нуклеотидов считываемой части АТТАТССГСАСТСАТАТССТСА ТАЛТАСвАСТСАСТАТА некодирующая цепь промотора
рТ2УМ7 одноцепочечная циклическая форма плазмиды рТ2.18К рТ218К—АТТАТССТСАСТСАТАТСССТТ—рТ218К 5'- ТААТАССАСТСАСТАТА- некодирующая цепь промотора
Р8\УТ/Х17 одноцепочечная плазмида рБШТ (не содержащая Т7-промотора') р$\УТ—СПСТАСТСТТСТОАССАСТТТЛОА—р8\У"Г) 5'- СССАТСАСААСАСТССТ комплементарный олигонуклеотид
Даже в случае "бесконечной" (циклической) матрицы, удлинение праймера ограничивается 7- 8 нуклеотидами. Последний факт логично объясняется, исходя из данных РСА (ТаЫю й а1, 2002): по достижении длины транскрипта 7-8 оснований происходит конформационный переход фермента из стадии инициации синтеза РНК в стадию элонгации, сопряженный с фиксацией 5'-конца растущей РНК-цепи ИаМ-концевом домене фермента. В случае функционирования фермента в режиме удлинения праймера, свободный 5'-конец РНК-продукта как таковой отсутствует. Поэтому фиксация такого продукта в сайте, предназначенном для связывания одноцепочечной РНК, и последующие перегруппировки с переходом к стабильному элонгационному комплексу, едва ли представляются возможными. Вследствие этого реакция не достигает стадии элонгации, и удлинение праймера не превышает длины абортивных транскриптов.
Таким образом, двойная аминокислотная замена Туг639РЬе,8ег641А1а, соответствующая удалению двух близко расположенных гидроксильных групп в районе активного центра -фермента, привела к появлению у фермента новых свойств, связанных с нарушением дискриминации между рибо- и дезоксирибонуклеотидами, и, как следствие, к способности использовать ёМТР. Одновременно эта мутация сопровождалась возникновением возможности функционирования фермента в режиме удлинения праймера с образованием «химерных» олигонуклеотидов, состоящих из дезоксирибо- и рибо- последовательностей. Эта реакция
протекает эффективнее, когда структура праймера совпадает с консенсусной последовательностью Т7 промотора; при этом достраиваемый фрагмент не может превышать длины абортивного транскрипта.
6. Взаимодействие Т7РНКП с модифицированными промоторами.
Исследование аминокислотных мутаций в мотиве В позволило заключить, что, хотя большинство из них не затрагивает непосредственно механизма взаимодействия фермента с промотором, в то же время С-концевая часть мотива непосредственно участвует в каталитическом акте на стадии связывания инициирующего нуклеозидтрифосфата, и, следовательно, должна располагаться вблизи инициирующего домена промотора. Поэтому некоторые аминокислотные остатки, расположенные вблизи мотива В, могут участвовать во взаимодействии фермента с промотором. Для поиска таких остатков мы использовали метод аффинной модификации, причем реакционноспособные группировки находились в составе модифицированных промоторов (рис.15).
-15
3' -АТТАТССТОА&ТСАТАТССТСА-5' 5'-ТААТАСС1(*ТСАСТАТА®5АСТ-3'
Ш (X
Рис. 15. Структура модифицированных промоторов, использованных дм изучения фермент-промоторных взаимодействий.
В качестве модифицированных звеньев были использованы два типа соединений. Первый тип был представлен остатками
содержащими цис-гликольные группировки, которые окисляются периодатом натрия до диальдегидных производных, способных образовывать основания Шиффа с близко расположенными аминогруппами лизина. Восстановление борогидридом натрия и последующий анализ полученного ковалентного фермент-промоторного комплекса позволяет локализовать белок-нуклеиновые контакты, имеющие место при специфическом взаимодействии фермента с промотором.
Другой разновидностью модификации промотора было введение в определенные положения ДНК остатков 6-тиогуанозина (бО). В этом случае образования ковалентных сшивок можно было ожидать после УФ-облучения фермент-промоторного комплекса.
Первой стадией исследования было установление способности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих модифицированные звенья, служить промоторами в РНК-полимеразной реакции, катализируемой Т7РНКП (табл. 12).
Таблица 12. Активность Т7РНКП на модифицированных промоторах.
Промотор Модифицир. остаток Активность, %
Без активации После активации
С0ЛЧ22 — 100 -
С0ЛЧ18 — 100 —
С(-11)ЛШ сп» 100 95
С(-11)/М8 С"0 100 100
С(-10)Ш2' -рпо 39,9 16,1
С(-9)Ш2 ев 25,1 18,5
С(-12)/Ш2 ев 25,9 23,5
С(+1)ЛЧ22 С"0 <1 —
С(+1)/М8 сп0 синтез динуклеотида —
С(+2)ЛЧ22 сп0 <1 —
С(+2У1Ч18 С"0 <1 -
С0ЛЧ22(+и) ев 56,7 —
С0ЛЧ22(+2) БО 100 —
С0ЛЧ22(+5) 100 83,5
Обозначения: С-кодируюшая цепь, № некодирующая цепь. СО - ^модифицированная кодирующая цепь, содержащая последовательность промотора (17 нукпеотидов) и 5 оснований в считываемой части. N18 -некодирующая цепь промотора + одно основание считываемой части; N22 - то же + 5 оснований в считываемой части. В скобках указаны положения модификаций. Под активацией в случае заместителей с цис-гликольной группировкой подразумевается периодатное окисление, а для б-тиойТР-про изводи ых — УФ облучение.
Модификации в постпромоторной части некодирующей цепи - sG(+2) и ТлЪ(+5) не влияли на активность фермента. Введение двух модифицированных остатков sG, причем одного из них в положение (+1), несколько снижало активность. Включение СпЬв положение (-11) кодирующей цепи не отражались на эффективности использования промотора, тогда как аналогичная замена на Г* в положении (-10), приводила к заметному снижению ферментативной активности. Еще более существенно сказывались на активности замены на sG в положениях (-9) и (-12). Можно сделать вывод, что положение (-10) более существенно для полноценной функции промотора, чем (-11). Модификации в положениях (-9) и (-12) имели другую природу: значительное снижение активности фермента на sG-содержащих промоторах может объясняться тем, что модифицированное нуклеиновое основание участвует в уотсон-криковском взаимодействии и влияет на общую укладку дуплекса.
Наличие модифицированной группировки С"1" в положении (+2) кодирующей цепи приводило к полной потере активности независимо от характера используемой матрицы. При использовании двухцепочечных дуплексов с той же модификацией в положении (+1) кодирующей цепи (C(+l)/N22) синтез продукта также отсутствовал, однако при наличии одноцепочечного участка матрицы (C(+l)/N18) наблюдался синтез исключительно [ИР]-динуклеотидов. Поскольку в качестве меченого рибонуклеозидтрифосфата в опыте использовался [а-32Р]-АТР, занимающий в синтезируемом транскрипте положение (+3), вероятно, что синтез в данном случае начинается с позиции (+2), поскольку дополнительный остаток рибозы в положении (+1) препятствует инициации. Следует отметить, что инициация с позиции (+2) была ранее продемонстрирована для одного из консенсусных промоторов Т7РНКП, у которого в положении (+1) нематричной цепи находится аденозин (Jia et al, 1997).
Непродуктивные дуплексы с модификациями в положениях (+1) и (+2) эффективно ингибировали транскрипцию, конкурируя с матрицами «дикого типа», что указывало на сохранение сродства к ферменту. Однако ковалентного связывания ни одного из модифицированных промоторов с ферментом дикого типа не наблюдалось. Имеются данные (Martin et al, 1987), подтвержденные позже результатами РСА (Cheetham et al, 1999), что в облаеть (-9Н-12) с Т7РНКП контактирует преимущественно некодирующая цепь промотора. Этим, вероятно, может объясняться отсутствие ковалентных взаимодействий в случае модификаций в положениях (-9) - (-12) кодирующей цепи. Однако существование контактов фермента с кодирующей цепью промотора в области инициации синтеза (в положениях (+1) и (+2)) мы полагали весьма вероятным. Поскольку альдегидные группы, генерируемые в результате окисления являются специфичными реагентами для остатков лизина, отсутствие
последнего вблизи модифицированных положений дуплекса при его фиксации в активном центре исключает возможные ковалентные взаимодействия. Полагая, что модифицированные группировки локализованные в начале считываемой части матрицы, должны располагаться вблизи сайта инициации транскрипции, то есть, по нашим данным, в районе С-конца мотива В, мы проверили возможность ковалентного взаимодействия с этими дуплексами мутанта Tyr639Lys, у которого в указанном районе появляется остаток лизина Поскольку этот мутант сохраняет частичную ферментативную активность и полноценное связывание с промотором, можно было ожидать, что его взаимодействие с промотор-содержащим дуплексом аналогично взаимодействию нативной Т7РНКП.
Действительно, [^РЗ-меченыедуплексы с модификацией в положении (+2) образовывали ковалентный комплекс с мутантным белком (рис. 16), в то время как для промоторов с модификациями (-11), (-10) и (+1) такого связывания не регистрировалось. Поскольку нельзя исключить, что мутация в данном положении привела к изменению обшей или локальной структуры белка, вследствие чего в пределах досягаемости реакционноспособной группы оказался иной остаток лизина, мы использовали в качестве контроля другие мутанты с заменами в том же положении, сохранявшие ферментативную активность: Tyr639Phe, Tyr639Asn и «двойной мутант» Tyr639Phe;Ser641 Ala. Ни один из них не образовывал ковалентной связи с данным олигонуклеотидным дуплексом. Таким образом, можно полагать, что мутации в положении 639 не приводят к серьезным изменениям структуры белка, и образование ковалентной связи происходит специфично.
1 2 3 4 а; в 7 в в
, V 't-'r^ - START
, 17RNAP
Рис. 16 Ковалентное связывание модифицированных олигонуклеотидов мутантом Туг639Ьуз
1 - Т7РНКП дикого типа, дуплекс С(+2)/ГО2,2 - Мутант ТугбЗ^ув, дуплекс С(+1)ЛЧ22; 3 -ТугбЗЭЬув, С(+1)М8; 4 - Тугб39Ьу$, С(+2)ЛЧ22; 5 -ТугбЗЭЬув, С(+2)/М8, 6 - то же, что 4, + 4ОТР (400мкМ), 7 - то же, что 5 + 4ОТР (400мкМ), 8 -Тугб39А$п, С(+2)/№2:9-Туг639РЬе, С(+2)Ж22.
Заметим, что при очень небольшом расстоянии между положениями (+1) и (+2) олигонуклеотида, ковалентное взаимодействие регистрируется только в случае модификации в
(+2)-положении. Этот факт нашел свое объяснение при мппенироиани^ посалки
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ
модифицированных промоторов в активном центре фермента, проведенном нами на основе данных PC А (рис.17).
Рис 17. Модель, иллюстрирующая расположение инициирующей области промотора в активном
Из рис. 17 видно, что дополнительный остаток рибозы в положении (+1) «смотрит в сторону» от аминокислотной последовательности фермента, тогда как аналогичный остаток в положении (+2) действительно сближен с положением 639 белка.
Таким образом, наши исследования подтвердили пространственную сближенность активного центра фермента и кодирующей цепи промотора в области инициации транскрипции. Несколько позже это было независимо подтверждено другими авторами (Place et al, 1999).
7. Фотоаффинная модификация Т7РНКП.
В целях определения дальнейшей стратегии идентификации функционально важных аминокислотных остатков Т7РНКП мы исследовали несколько производных нуклеотидов, содержащих фотоактивируемые группировки, с точки зрения перспектив их использования как аффинных модификаторов фермента (рис.18).
5-[3-{£>(4-азидо-23,5,6,-тетрафторбензамидо)пропенил-1 ]-1ЛР (Ю-ТРВР-ЦТР)
4-тиоиТР (4-8ЦТР) б-тиоСТР (б-вйТР)
Рис. 18. Формулы соединений, тестированных в качестве возможных аффинных модификаторов Т7РНКП.
Прежде всего нами были изучены субстратные свойства соединений в отношении Т7РНКП как при синтезе полноразмерных транскриптов, так и при однократном включении аналога (табл.13).
Таблица 13. Субстратные свойства аналогов нуклеотидов, содержащих фотоактивируемые группировки.
Соединение Полноразмерные транскрипты Односубстратная реакция
К„, мкМ У^, % К„,шМ
итр 28 + 3,4 100 229+12 100
4-б1ГГР 3,7+1,5 11,5 12 + 2,2 10,5
N3- ТРВР -ЦТР 9,9 + 1,3 6,1 108 + 35 100
б-вйТР — <1 — 2,2
б-вйТР + вМР - <1 - 15
Аналог инициирующего нуклеозидтрифосфата - 6-sGTP, оказался практически неактивным в РНК-полимеразной реакции. В то же время производные UTP, содержащие
различные типы модифицирующих группировок, 4-SUTP ЭД-ТРЙР-ЦТР, были способны заменять природный ШТР даже в синтезе длинных транскриптов. При этом величины Ужх для 4^ЦТР были одинаковы как при синтезе длинных транскриптов, так и при однократном включении нуклеотида. В то же время для Ыз-ТТВР-иТР включение одной молекулы в растущую цепь РНК происходило со стопроцентной эффективностью, хотя У//юх в синтезе длинных транскриптов составляло всего 6%. В случае 4^ШТР модифицированная группа должна участвовать в уотсон-криковском взаимодействии, тогда как для заместитель не
принимает участия в таком контакте. Можно предположить, что для 4^ШТР искажение геометрии при спаривании с комплементарным основанием приводит к затруднению образования фосфодиэфирной связи перед модифицированным остатком. В случае же Ыз-ТРВР-ЦТР, объемный заместитель на длинной "ножке" препятствует связыванию следующего МТР и формированию связи после модифицированного звена.
При использовании в качестве матрицы плазмиды рТ218Я (первое включение ШТР в положении (+6) транскрипта), УФ-облучение реакционной смеси при использовании 4^ШТР и
не приводило к включению радиоактивной метки (<х-[32Р]АТР) в фермент. Однако на плазмиде рТ2Я7С (первое включение Ш в положении +9) в случае Мз-ТГВР-иТР мы наблюдали эффективное мечение фермента, причем этот процесс развивался во времени до 30 минут (рис.19)
старт
I
Т7РНКП
0 10 20 30 мин
Рис 19. Фотоаффинная модификация Т7РНКП девяти членным РНК-продуктом,
содержащим N3- ТТВР -ЦМР в положении (+9). Меченый нуклеотид- [а-32Р]АТР.
Столь длительное развитие реакции фотомодификации объясняет, почему ковалентное включение наблюдается лишь на одной из двух использованных матриц: в случае рТ218Я длина
полученного продукта (6 нукл.) лежит в области абортивной транскрипции, то есть происходит его быстрая диссоциация и реинициация синтеза. Девятичленный продукт, получающийся при использовании рТ270 (и, фактически, набор более длинных продуктов, обусловленный известным явлением «соскальзывания» по матрице) соответствует яроцессивной конформации фермента. В этом случае остановленный тройной комплекс имеет достаточно длительное время жизни, и медленно (до 30 минут) протекающая реакция фотомодификации успевает осуществиться.
После исчерпывающего гидролиза трипсином модифицированного комплекса и последующей очистки целевого пептида мы получили индивидуальный «нуклеотидопептид». С помощью аминокислотного секвенирования удалось установить, что объектом модификации является последовательность Туг802-ЬуБ826, принадлежащая к консервативному мотиву С в структуре Т7РНКП. Наиболее вероятными мишенями модификации в составе этого пептида являются остатки Шб811 и А^812. Отметим, что А^812 является инвариантным в структуре всех односубъединичных ДНК- и РНК-полимераз, и принимает непосредственное участие в ферментативной реакции (ОБишьЭау1Б й а1, 1992).
Рис.20. Моделирование связывания РНК-транскрипта, содержащего остаток Мз-ТТВР-11ТР в активном центре Т7РНКП.
Компьютерное моделирование, основанное на данных РСА, подтвердило, что данные остатки отстоят от 3'-конца РНК продукта на расстояние 10А, которое в точности соответствует длине спейсера между нуклеотидной и фотоактивируемой частями молекулы модификатора (рис.20). Таким образом, нами было показано, что З'-концевой остаток синтезируемой РНК-цепи сближен с функционально важными аминокислотными остатками в составе мотива С в структур Т7РНКП.
выводы
1. С помощью аффинной модификации Т7РНКП 5'-л-фторсульфонилбензоил-аденозином (FSBA) было впервые показано, что на определенных стадиях транскрипционного цикла N-концевой домен фермента пространственно сближен с С-концевым доменом и принимает участие как во взаимодействии с промотором, так и в стабилизации структуры С-концевого домена. Продемонстрировано, что ДНК и РНК защищают междоменную перемычку от протеолиза. При этом ДНК, содержащая Т7 промотор, обеспечивает сохранение междоменных взаимодействий и стабилизацию N-концевого домена после протеолиза.
2. Получен ряд мутантных форм Т7РНКП, содержащих аминокислотные замены или делецию в междоменной перемычке. Показано, что такие мутации приводят к ослаблению связывания фермента с промотором и повышают способность к утилизации как двухспиральных, так и одноцепочечных неспецифических матриц.
3. Установлено, что делеция двух остатков междоменной перемычки (Lys 172 и Arg 173) приводит к утрате ферментом способности к синтезу характерных удлиненных транскриптов. Данное свойство мутанта обеспечивает его преимущества перед Т7РНКП дикого типа при использовании в качестве инструмента для синтеза заданных последовательностей РНК.
4. Обнаружен неизвестный ранее высококонсервативный мотив D в структуре Т7РНКП (остатки 555-575), важный для активности фермента и участвующий в связывании с промотором.
5. Выявлена функциональная неоднородность консервативного мотива В: установлено, что N-концевая часть этого мотива (остатки 627-635) определяет пространственное расположение компонентов транскрипционного комплекса в ходе ферментативного акта, в то время как С-концевая часть мотива В (остатки 636-646) представляет собой собственно активный центр фермента, где происходит инициация синтеза и образование межнуклеотидных связей.
6. Обнаружено, что «двойная» мутация Tyr639Phe, Ser641Ala приводит к возникновению новых свойств фермента:
(а) Данный мутант приобретает способность к утилизации дезоксинуклеозид-трифосфатов. Эффективность использования dNTP мутантом тем выше, чем дальше от старта транскрипции впервые встречается заменяемый нуклеотид. По достижении
длины транскриптов 20 и более нуклеотидов включение в синтезируемый продукт рибо-и дезоксирибонуклеотидных звеньев становится близким по величине.
(б) «Двойная» мутация приводит также к возможности функционирования фермента в режиме удлинения праймера, свойственном ДНК-полимеразам. Однако при этом фермент не переходит в процессивную конформацию и достраиваемый фрагмент не превышает длины абортивных транскриптов (7-8 нукл.).
7. С помощью аффинной модификации с использованием модифицированного промотора впервые показан контакт между положением (+2) кодирующей цепи промотора и активным центром фермента, в частности остатком Туг639.
8. Исследована возможность фотоаффинной модификации Т7РНКП реагентами различной природы. Показано ковалентное взаимодействие между остатком 5-[3-(Е)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)пропенил-1]ШМР в составе РНК-продукта с пептидом 802-826 в структуре Т7РНКП, входящим в консервативный мотив С. Наиболее вероятными мишенями модификации являются остатки His811 или Азр812.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. ВЛ.Туницкая, А.А.Мишин, В.В.Тюркин, ДЛЛяхов, В.О. РечинскиЙ, С.Н.Кочетков. Аффинная модификация ДНК-зависимоЙ РНК-полимеразы фагаТ7 5'-п-фторсульфонилбеюоиладенозином. Молекулярная биология, 1988, т. 22, № 6, с.1642-1649.
2. ВЛ.Туницкая, С.В.Лучин, Л.В.Мемелова, ДЛЛяхов, В.О.Речинский, С.Н.Кочетков. Аффинная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы фагаТ7 5'-п-фторсульфонилбензоиладенозином: влияние модификации на взаимодействие с субстратами. Молекулярная биология, 1989, т. 23, № 5, с. 1273-1278.
3. А.Х.Акбаров, ВЛ.Туницкая, Л.А.Баранова, Ю.В.Хропов, М.М.Красильникова, С.Н.Хочегков.
Исследование нуклеозидтрифосфат связывающего центра ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 с помощью аналогов ОТР. Биохимия, 1990, т.55, № 5, с. 829-835.
4. ДЛ.Ляхов, Х.Ильгенфриц, В.О.Речинский, ВЛ.Туницкая, Б.К.Чернов, С.Н.Кочетков. Изменение специфичности РНК- полимеразы фага Т7 в результате олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Докл. АН СССР, 1991, т. 317, № 4, с. 1005 -1008.
5. ДЛЛяхов, Х.Ильгенфриц, Б.КЛернов, С.М.Драган, В.О.Речинский, Д.КЛохолок, ВЛ.Туннцкая, СН. Кочетков. Сайт-специфический мутагенез остатка 1^-172 РНК-полимеразы фага Т7: характеризация транскрипционных свойств мутантных белков. Молекулярная биология, 1992, т. 26, № 5, с.1022-1035.
6. Ю.В-Хропов, АЛ.Мишин, ВЛ.Туницкая, С.Н.Кочетков. Исследование ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 с помощью аналогов ОТР. Аффинная модификация флуоресцентными метками и исследование взаимодействия с матрицей. Биохимия, 1993, т. 58, №1, с. 44-51.
7. ВЛ.Туницкая, Н.П.Бажулина, СМ.Драган, Н.В.Кузнецова, ДЛЛяхов, В.О.Речипский, Ю.В.Морозов, С.Н.Кочетков. Исследования форм РНК-полимеразы бактериофага Т7, содержащих точечные замены в области функционально важных аминокислотных остатков. Молекулярная биология, 1993, т. 27, № 1, с. 92-103.
8. ВЛ.Туницкая, С.М.Драган, Д.А.Костюк, ДЛЛяхов, Л.В.Мемелова, В.О.Речинский, С.Н.Кочетков. Функциональные исследования мутантных форм РНК-полимеразы бактериофага Т7, содержащих точечные замены в мотиве В активного центра фермента. Биохимия, 1994, т.59, № 4, с. 494 -502.
9. Д.А.Костюк, С.М.Драган, В.О.Речинский, В.Л.Туиицкая, Б.К.Чернов, С.Н.Кочетков. Мутантная форма РНК-полимеразы бактериофага Т7, способная катализировать синтез РНК и ДНК. Докл. РАН, 1995, т. 346 № 6, с. 824-827.
10. В.Л.Туницкая, Л.В.Мемелова, Д.А.Костюк, С.О.Гудима, С.Н.Кочетков. Исследование закономерностей утилизации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов мутантными формами РНК-полимеразы бактериофага Т7. Молекулярная биология, 1997, т. 31, № 2, с. 365-370.
11. Е.Е.Русакова, А.П.Янкин, Л.В.Мемелова, ВЛ.Туницкая, С.Н.Кочетков. Олигонуклеотид-направленный мутагенез Т7РНК-полимеразы бактериофага Т7: влияние замещения остатков Met635 и Ser633 на функционирование фермента. Молекулярная биология, 1999, т. 33, № 4, с. 598-602.
12. Е.Е.Русакова, ВЛ.Туницкая, С.Н.Кочетков. РНК-полимераза бактериофага Т7. Молекулярная биология, 1999, т. 33 № 3, с. 353-367.
13. ВЛ.Туницкая, С.В.Кочеткова, Е.С.Годовикова, С.Н.Кочетков. Взаимодействие РНК-полимеразы бактериофага Т7 с аффинными модификаторами - аналогами нуклеозидтрифосфатов. Молекулярная биология, 2000, т. 34 № 1, с. 60-66.
14. Филиппова С.Е., Ивановская М.Г., Романова Е.А., Туницкая В.Л., Кочетков С.Н. Тестирование точечных контактов в структуре промоторного комплекса РНКП бактериофага Т7 с помощью фосфат-активированных производных нуклеотидов. Молекулярная биология, 2002,т.36,№4, с. 543-550.
15. ВЛ.Туницкая, С.Н.Кочетков. Структурно-функциональный анализ РНК-полимеразы бактериофага Т7. Биохимия, 2002, т. 67, № 10, с.1360-1373.
16. V.L.Tunitskaya, A.Kh.Akbarov, S.N.Kochetkov. T7RNA polymerase: use of limited proteolysis for the study of enzyme interaction with substrates and inhibitors. Biochemistry International, 1990, v. 20, №6, p. 1033-1040.
17. V.L.Tunitskaya, A.Kh.Akbarov, S.VXuchin, L.V.Memelova, V.O.Rechinsky, S.N.Kochetkov. Inactivation of bacteriophage T7 DNA-dependent RNA polymerase by 5'-p-fluorosulfonylbenzoyladenosine. Identifcation of the modification site and the effect of the modification on the enzyme action. Eur. J. Biochem., 1990, v. 191, №1, p. 99-103.
18. T.G.Maksimova, A.A.Mustayev, E.F.Zaychikov, D.L.Lyakhov, V.L.Tunitskaya, A.Kh.Akbarov, S.VXuchin, V.O.Rechinsky, BXChernov, S.N.Kochetkov. Lys-631 residue in the active site ofthe bacteriophage T7 RNA polymerase: affinity labeling and site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem., 1991, v. 195 №3, p. 841-847.
19. D.L.Lyakhov, V.O.Rcchinsky, V.L.Tunitskaya, BXChemov, S.N.Kochetkov. Site-directed mutagenesis ofbacteriophage T7 DNA- dependent RNA polymerase. Cell Biochem., 1992, Suppl. 16E, p. 166 (Keystone Symposia "Fundamental Mechamisms ofTranscription")
20. V.O.Rechinsky, D.A.Kostyuk, V.L.Tunitskaya, S.N.Kochetkov. On the functional role ofthe Tyr-639 residue ofbacteriophage T7 RNA polymerase. FEBS Letters, 1992, v. 306, №2-3, p. 129-132.
21. V.O.Rechinsky, V.L.Tunitskaya, S.M.Dragan, D.A.Kostyuk, S.N.Kochetkov. Tyr-571 is involved in the 17 RNA polymerase binding to its promoter. FEBS Letters, 1993, v. 320, № 1, p. 9-12.
22. V.O.Rechinsky, D.AKostyuk, V.L.Tunitskaya, D.LLyakhov, L.VMemelova, S.N.Kochetkov. Bacteriophage T7 RNA polymerase: application of site-specific mutagenesis to the mechanism studies. Modem Enzymology. Problems and Trends. Nova Science Publ. Lac, New-York, 1994, p. 277-292.
23. V.O.Rechinsky, B.K.Chemov, S.M.Dragan, D.A.Kostyuk, V.L.Tunitskaya, S.N.Kochetkov. Targeted mutagenesis identifies Asp-569 as a catalytically critical residue in T7 RNA polymerase. Mol. Gen. Genet. 1995, v. 247, p. 110-113.
24. DA.Kostyuk, S.M.Dragan, D.L.Lyakhov, V.O.Rechinsky, V.L.Tunitskaya, BXChernov S.N.Kochetkov. Mutants ofT7 RNA polymerase that are able to synthesize both RNA and DNA. FEBS Letters, 1995, v. 369, № 1, p. 165-168.
25. DA.Kostyuk, D.L.Lyakhov, LV.Memelova, V.O.Rechinsky, V.L.Tunitskaya, S.N.Kochetkov. Studies of the mechanism of bacteriophage T7 RNA polymerase by affinity modification and site-directed mutagenesis. Chemical modification of enzymes (B.LKurganov, NXNagradova, O.I.Lavrik, Eds) Nova Science Publ. Inc., New-York, 1996, p. 347-387.
26. V.L.Tunitskaya,E.E.Rusakova, N.Sh.Padyukova, B.S.Ermolinsky, AJ*\Chernyi, Yu.P.Lysov, S.N.Mikhailov, S.N.Kochetkov. Substrate properties of C'-methyl UTP derivatives T7 RNA polymerase reactions. Evidence for N-type NTP conformation. FEBS Letters, 1997, v. 400, №3, p. 263-266.
27. E-E-Rusakova, V.L.Tunitskaya, L.V.Memelova, S.V.Kochetkova, DA.Kostyuk, S.N.Kochetkov. Mutant T7 RNA polymerase is capable of catalyzing DNA primer extension reaction. FEBS Letters., 1998, v. 423 №2, p. 189-192.
28. S.O.Gudima, D.A-Kostyuk, O.LGrishchenko, L.V.Memelova, V.L.Tunitskaya, S.N.Kochetkov. Synthesis ofmixed ribo/deoxyribonucleo-tidcs by mutant T7 RNA polymerase. FEBS Letters. 1998, v. 439, №4, p. 302-306.
29. S.N.Kochetkov, E.E.Rusakova, V.L.Tunitskaya. Recent studies of 17 RNA polymerase mechanism. FEBS Letters, 1998, v. 440, № 3, p. 264-267.
30. E.V.Efimtseva, L.S.Viktorova, A.A.Rodionov, B.S.Ermolinsky,, M.V.Fomitcheva, V.L.Tunitskaya, S.N.Mikhailov, M.Oivanen, A.VanAerscot, P.Herdewijn. Disaccharide nucleosides and their enzymatic and chemical incorporation into oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 1998, v. 17, №9-11, p. 1681-1684.
31. V.L.Tunitskaya, EJE.Rusakova, L.V.Memelova, S.N.Kochetkov, A.Van Aerschot, P.Herdewijn, E.V.Efimtseva, B.S.Ermolinsky, S.N.Mikhailov. Mapping ofT7 RNA polymerase active site with novel reagents oligonucleotides with reactive dialdehyde groups. FEBS Letters, 1999, v. 442, № 1, p. 20-24.
32. S.O.Gudima, D.A.Kostyuk, V.L.Tunitskaya, S .NJCochetkov. Synthesis ofmixed ribo/deoxyribo-polynucleotides by mutant RNA polymerase. Nucleosides and Nucleotides 1999, v.18, № 6-7, p. 1239-1240.
33. E.E.Rusakova, V.L.Tunitskaya, L.V.Memelova, B.S.Ermoh'nsky, S.N.Kochetkov, S.N.Mikhailov. Lx)calyzation ofthe Initiation site in T7 RNA Polymerase by Affinity Labeling. Nucleosides and Nucleotides 1999, v. 18, №6-7, p. 1359-1360.
Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 10.02.-2004 г. Формах 60x90 1/16. Усл.печл. 2,75. Тираж 100 экз. Заказ 162. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В Ломоносова.
»5- 67 2 1
Содержание диссертации, доктора химических наук, Туницкая, Вера Леонидовна
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ •
1.1. Физико-химические свойства Т7РНКП, первичная и пространственная структура фермента.
1.2. Транскрипционный цикл Т7РНКП.
1.2.1. Взаимодействие с промотором.
1.2.2. Связывание NTP и инициация транскрипции.
1.2.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК.
1.2.4. Неспецифические проявления активности Т7РНКП. Беспромоторные системы.
1.2.5. Терминация транскрипции.
1.3. Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных аминокислотных остатков.
1.2.5. Химическая модификация и ингибиторный анализ.
1.2.6. Аффинная модификация.
1.2.7. Исследование мутантных форм Т7РНКП.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы, буферные растворы, плазмиды и ферментные препараты.
2.2. Методики, использованные в работе.
23. Расчет кинетических параметров реакций.
2.4. Конформациоиные расчеты и построение пространственных моделей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Аналоги нуклеотидов - субстраты и ингибиторы Т7РНКП.
3.2. Необратимые ингибиторы Т7РНКП. Аффинная модификация фермента.
3.3. Роль N-концевого домена и междоменной перемычки.
3.3.1.Изучение ограниченного протеолиза Т7РНКП.
3.3.2. Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки.
3.3.3. Мутации по остатку Lys-98.
3.4. Роль аминокислотной последовательности 563-571 в Т7РНКП.
3.5. Исследование консервативного мотива В.
3.5.1.Общая характеристика мотива В.
3.5.2. Обоснование выбора вариантов аминокислотных замен.
3.5.3. Мутации в N-концевой части мотива В.
3.5.4. Мутации в С-концевой части мотива В.
3.6. Уникальные свойства мутанта Tyr639Phe. «Двойной» и «тройной» мутанты.
3.6.1 .Утилизация дезоксирибонуклеотидов мутантной формой Т7РНКП.
3.6.2. Ошибки при транскрипции, свойственные «двойному» и «тройному» мутантам.
3.6.3. Функционирование «двойного» мутанта Т7РНКП в режиме удлинения праймера.
3.7. Взаимодействие Т7РНКП с модифицированными промоторами.
3.8. Фотоаффинная модификация Т7РНКП. 5-[3-(£)-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)пропенил-1]-иТР (N3-TFBP-UTP).
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7"
Бактериофаг Т7 является одним из наиболее изученных среди фагов, поражающих клетки E.coli. Ключевым ферментом жизнедеятельности бактериофага является ДНК-зависимая РНК-полимераза (Т7РНКП), которая ответственна за транскрипцию генов, кодирующих белки, определяющие созревание и упаковку фаговых частиц. Т7РНКП была впервые выделена в 1969 г. из клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т7. В настоящее время источником выделения рекомбинантного фермента являются штаммы E.coli, несущие плазмидные конструкции, экспрессирующие ген 1 бактериофага Т7.
Т7РНКП состоит из 883 аминокислотных остатков (98092 Да) и представляет собой односубъединичный белок, способный осуществлять полный цикл транскрипции без участия каких-либо дополнительных белковых факторов. Это делает данный фермент наиболее удобной моделью для изучения молекулярных механизмов транскрипции. Новая информация о закономерностях процесса транскрипции может быть использована при изучении других ферментов, в том числе вирусных РНК-полимераз, что имеет большое значение для поиска способов борьбы с вирусными инфекциями.
Помимо этого, вследствие доступности Т7РНКП, ее высокой транскрипционной активности и строгой специфичности к промотору, этот фермент широко используется в молекулярной биологии для синтеза заданных последовательностей РНК. Изучение закономерностей функционирования Т7РНКП, наряду с исследованием мутантных форм фермента, может привести к получению белков с измененными свойствами, являющихся более эффективными и многофункциональными молекулярно-биологическими инструментами, нежели природная Т7РНКП. В связи с этим детальное структурно-функциональное исследование Т7РНКП, в частности, установление роли отдельных аминокислотных остатков и локализация контактов между компонентами полимеразной реакции в процессе транскрипции, является актуальной научной задачей.
Целью настоящей работы являлось изучение молекулярного механизма действия и роли отдельных структурных элементов Т7РНКП на различных стадиях процесса транскрипции, в частности, установление функции отдельных аминокислотных остатков фермента в на различных стадиях ферментативной реакции, выявление контактов между компонентами транскрипционного комплекса, включая и такие, которые вследствие короткого времени существования не могут быть зафиксированы при рентгеноструктурных исследованиях. Кроме того, изучение мутантных форм Т7РНКП, обладающих новыми свойствами, может расширить возможность применения этого фермента в молекулярно-биологической практике.
Т7РНКП изучается в лаборатории энзимологии транскрипции ИМБ РАН с 1987 года. В начале нашей работы информация о функциональной топографии и механизме действия Т7РНКП была весьма ограниченной. Однако, поскольку данный фермент является перспективным объектом как с позиции исследования молекулярных основ механизма транскрипции, так и с точки зрения практического использования, в последние десятилетия этот белок был предметом пристального внимания целого ряда зарубежных лабораторий. За прошедшие годы с начала нашей работы в научной литературе появились сотни публикаций, касающихся исследований Т7РНКП, основные из них подробно рассмотрены в обзоре литературы. Вследствие этого наше исследование оказалось закономерно «встроенным» в общий поток работ по этому актуальному направлению.
Такая ситуация имела как свои достоинства, так и недостатки. С одной стороны, полученные нами результаты в ряде случаев были приоритетными и через некоторое время подтверждались независимыми исследованиями других лабораторий. Кроме того, появление в 1993 году первых данных, а в 1999-2002 году - полного цикла рентгеноструктурных исследований Т7РНКП, позволило нам соотнести результаты нашей работы с информацией, полученной принципиально иным методом, и тем самым получить дополнительные подтверждения обоснованности наших положений и выводов. С другой стороны, находясь в состоянии жесткой конкуренции с зарубежными лабораториями, в большинстве случаев лучше материально оснащенными, в некоторых случаях мы не смогли обеспечить приоритетность наших результатов — аналогичные независимо полученные данные оказывались опубликованными одновременно или чуть раньше наших.
Однако в целом нам удалось сохранить положение одной из лидирующих групп, разрабатывающих данную научную проблему. Значительная часть результатов, представленных в данной работе, в настоящее время сохраняют свою новизну и оригинальность, признанную нашими зарубежными коллегами и конкурентами.
В процессе всестороннего исследования Т7РНКП с использованием преимущественно методов аффинной модификации и исследования мутантных форм фермента, нам удалось установить ряд новых деталей механизма функционирования фермента, а также выявить неизвестные ранее контакты между отдельными аминокислотными остатками Т7РНКП и определенными положениями промотора и/или нуклеотидных субстратов. Были также исследованы впервые полученные мутантные формы фермента, обладающие новыми свойствами, не присущими Т7РНКП дикого типа.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Туницкая, Вера Леонидовна
233 ВЫВОДЫ
1. С помощью аффинной модификации Т7РНКП 5'-л-фторсульфонилбензоил-аденозином (ФСБА) было впервые показано, что на определенных стадиях транскрипционного цикла N-концевой домен фермента пространственно сближен с С-концевым доменом и принимает участие как во взаимодействии с промотором, так и в стабилизации структуры С-концевого домена. Продемонстрировано, что ДНК и РНК защищают междоменную перемычку от протеолиза. При этом ДНК, содержащая Т7 промотор, обеспечивает сохранение междоменных взаимодействий и стабилизацию N-концевого домена после протеолиза.
2. Получен ряд мутантных форм Т7РНКП, содержащих аминокислотные замены или делецию в междоменной перемычке. Показано, что такие мутации приводят к ослаблению связывания фермента с промотором и повышают способность к утилизации как двухспиральных, так и одноцепочечных неспецифических матриц.
3. Установлено, что делеция двух остатков междоменной перемычки (Lysl72 и Argl73) приводит к утрате ферментом способности к синтезу характерных удлиненных транскриптов. Данное свойство мутанта обеспечивает его преимущества перед Т7РНКП дикого типа при использовании в качестве инструмента для синтеза заданных последовательностей РНК.
4. Обнаружен неизвестный ранее высококонсервативный мотив D в структуре Т7РНКП (остатки 555-575), важный для активности фермента и участвующий в связывании с промотором.
5. Выявлена функциональная неоднородность консервативного мотива В: установлено, что N-концевая часть этого мотива (остатки 627-635) определяет пространственное расположение компонентов транскрипционного комплекса в ходе ферментативного акта, в то время как С-концевая часть мотива В (остатки 636-646) представляет собой собственно активный центр фермента, где происходит инициация синтеза и образование межнуклеотидных связей.
6. Обнаружено, что «двойная» мутация Tyr639Phe,Ser641Ala приводит к возникновению новых свойств фермента: а) Данный мутант приобретает способность к утилизации дезоксирибонуклеозид-трифосфатов. Эффективность использования dNTP мутантом тем выше, чем дальше от старта транскрипции впервые встречается заменяемый нуклеотид. По достижении длины транскриптов 20 и более нуклеотидов включение в синтезируемый продукт рибо- и дезоксирибонуклеотидных звеньев становится близким по величине. б) «Двойная» мутация приводит также к возможности функционирования фермента в режиме удлинения праймера, свойственном ДНК-полимеразам. Однако при этом фермент не переходит в процессивную конформацию, и достраиваемый фрагмент не превышает длины абортивных транскриптов (7-8 нукл.).
7. С помощью аффинной модификации с использованием модифицированного промотора впервые показан контакт между положением (+2) кодирующей цепи промотора и активным центром фермента, в частности остатком Туг639.
235 *
8. Исследована возможность фотоаффинной модификации Т7РНКП реагентами различной природы. Показано ковалентное взаимодействие между остатком 5-[3-(£^-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)пропенил-1]ЦМР (N3-TFBP-UTP) в составе РНК-продукта с пептидом 802-826 в структуре Т7РНКП, входящим в консервативный мотив С. Наиболее вероятными мишенями модификации являются остатки His811 или Asp812.
БЛАГОДАРНОСТИ
Приношу глубокую благодарность любимому шефу и научному консультанту Сергею Николаевичу Кочеткову. Искренне благодарю Владимира Олеговича Речинского и Дмитрия Алексеевича Костюка за обеспечение генноинженерных основ для выполнения представленной работы и помощь в экспериментах. Благодарю всех настоящих и бывших сотрудников лаборатории энзимологии транскрипции ИМБ РАН, и в первую очередь Дмитрия Львовича Ляхова, Екатерину Евгеньевну Русакову и Людмилу Васильевну Мемелову.
Я глубоко признательна также сотрудникам других лабораторий ИМБ, любезно предоставившим мне необходимые препараты и оказывавшим помощь на различных этапах исследования: Сергею Николаевичу Михайлову, Борису Сергеевичу Ермолинскому, Юрию Самойловичу Скоблову, Светлане Владиславовне Кочетковой, Елене Анатольевне Широковой, Виктору Васильевичу Петухову.
Благодарю Татьяну Владимировну Овчинникову, Цезия Алексеевича Егорова и Александра Мусолямова (ИБХ РАН) за проведение аминокислотного секвенирования пептидов.
Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Туницкая, Вера Леонидовна, Москва
1. Studier F.W. Bacteriophage T7. Science, 1972, v. 176, p. 367-376.
2. Studier F.W., Dunn J.J. Organization and expression of bacteriophage T7 DNA. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1983, v. 47, p. 999 -1007.
3. Chamberlin M., McGrath J., Waskell L. New RNA polymerase from Escherichia coli infected with bacteriophage T7. Nature, 1970, v. 228, p. 227-231.
4. Davanloo P., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Studier F.W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 2035-2039.
5. Речинский В.О., Драган С.М., Костток Д.А., Ляхов Д.Л., Кочетков С.Н. Генетическая система отбора точечных мутантов РНК-полимеразы бактериофага Т7. Мол. биол., 1991, т. 25, с. 1588-1593.
6. Grachev М.А., Pletnev A.G. The nucleotide sequence of gene 1 of T7 phage DNA which codes for the phage-specific DNA-dependent RNA-polymerase. FEBS Lett., 1981, v. 127, p. 53-56.
7. Moffatt B.A., Dunn J.J., Studier F.W. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1984, v. 173, p. 265-269.
8. Niles E., Conlon S., Summers W. Purification and physical characterization of T7 RNA polymerase from T7-infected Escherichia coli. Biochemistry, 1974, v. 13, p. 3904-3911.
9. Oakley J.L., Pascale J.A., Coleman J.E. T7 RNA polymerase: conformation, functional groups, and promoter binding. Biochemistry, 1975, v. 14, p. 4684-4691.
10. Gunderson S.I., Chapman K.A., Burgess R.R. Interaction of T7 RNA polymerase with T7 late promoters measured by footprinting with methidiumpropyl-EDTA-iron(II). Biochemistry, 1987, v. 26, p. 1539-1546.
11. Ikeda R.A., Richardson C.C. Enzymatic properties of a proteolytically nicked RNA.polymerase of bacteriophage T7. J. Biol. Chem., 1987, v.262, p.3790-3799.
12. Muller D.K., Martin C.T., Coleman J.E. T7 RNA polymerase interacts with its promoter from one side of DNA helix. Biochemistry, 1989, v. 28, p. 3306-3313.
13. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interaction of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,v. 83, p. 3614-3618.
14. Chamberlin M., Ring J. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. I. General properties of the enzymatic reaction and the template specificity of the enzyme. J. Biol. Chem., 1973, v. 248, p. 2235-2244.
15. McAllister W.T., Carter A.D., Regulation of promoter selection by the bacteriophage T7 RNA polymerase in vitro. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8 p. 4821-4837.
16. Coleman J. The role of Zn(II) in transcription by T7 RNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. Com., 1974, v. 60, p. 641-648.
17. King G.C., Martin C.T. Pham T.T., Coleman J.E. Transcription by T7 RNA polymerase is not zinc-dependent and is abolished on amidomethylation of cystein-347. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 36-40.
18. McGraw N.J., Bailey J.N., Cleaves G.R., Dembinsky D.R., Gocke C.R., Collifee L.K., Mac Wright R.C., McAllister W.T. Sequence and analysis of the gene for bacteriophage T3 RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1985, v. 13, p. 6753-6766.
19. Dietz A., Weisser H.J., Kossel H., Hausmann R. The gene for Klebsiella bacteriophage KI 1
20. DNA polymerase: sequence and comparision with the homologous gene of phages T7, T3 and SP6. Mol. Gen. Genet., 1990, v. 221, p. 283-286.
21. Kotani H., Ishizaki Y., Hiraoka N., Obayashi A. Nucleotide sequence and expression of the cloned gene of bacteriophage SP6 RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, p. 26532664.
22. Masters B.S., Stohl L.L., Clayton D.A. Yeast mitochondrial RNA polymerase is homologous to those encoded by bacteriophage T3 and T7. Cell, 1987, v. 51, p.89-99.
23. Delarue M., Poch 0., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng., 1990, v. 3, p. 461-467.
24. Sousa R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at З.ЗА resolution. Nature, 1993, v.364, p. 593-599.
25. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependent DNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, v.3, p.31-38.
26. Osumi-Davis P.A., de Aguillera M.C., Woody R.W., Woody A.-Y.M. Asp537, Asp 812 are essential and Lys631, His811 are catalytically significant in bacteriophage T7 RNA polymerase activity. J. Mol. Biol., 1992, v.226, p.37-45.
27. Mookhtiar K.A., Peluso P.S., Muller D.K., Dunn J.J., Coleman J.E. Processivity of T7 RNA polymerase requires the C-terminal Phe882-Ala883- COO" or "foot". Biochemistry, 1991, v. 30, p. 6305-6313.
28. Steitz T.A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, p. 17395-17398.
29. Tabor S., Richardson C.C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, p. 1074-1078.
30. Grodberg J., Dunn JJ. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification. J. Bacterid., 1988, v. 170, p.1245-1253.
31. Muller D.K., Martin C.T., Coleman J.E. Processivity of proteolitically modified forms of T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 5763-5771.
32. Cheetham G.M., Jeruzalmi D., Steitz T.A. Structural basis for initiation of trans-cription from an RNA polymerase-promoter complex. Nature, 1999, v. 399, p. 80-83.
33. Yin Y.W., Steitz T.A. Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase. Science, 2002, v.298, p. 1387-1395.
34. Tahirov Т.Н., Temiakov D., Anikin M., Patlan V., McAllister W.T., Vassylyev D.G., Yokoyama S. Structure of T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9A resolution. Nature, 2002, v. 420, p. 43-50.
35. Jeruzalmi D., Steitz T.A. Structure of T7 RNA polymerase complexed to the transcryptional inhibitor T7 lysozime. EMBO J, 1998, v. 17 p. 4101-4113.
36. Zhang X, Studier F. W. Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNA polymerase by T7 lysozyme. J.Mol. Biol., 1997, v. 269, p. 10-27.
37. Sousa R., Patra D., Lafer E.M., Model for the mechanism of bacteriophage T7 RNAP transcryption initiation and termination. J.Mol. Biol., 1992, v. 224, p. 319-334.
38. Пожитков A.E., Лаврик И.Н., Сергеев M.M., Кочетков С.Н. Кинетический анализ реакции, катализируемой РНК полимеразой бактериофага Т7. Мол. биол., 1998, т. 32, с. 93-97.
39. Jia Y., Patel S.S. Kinetic mechanism of transcription initiation by bacteriophage T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1997, v.36, p. 4223-4232.
40. Chamberlin M. Bacterial DNA-dependent RNA polymerases. The Enzymes, 1982, v. XV, p. 61-86.
41. Straney D.C., Crothers D.M. Intermediates in transcription initiation from the E.coli lacUV5 promoter. Cell, 1985, v. 43, p. 449-459.
42. Buc H., McClure W. Kinetic of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lacUV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 2712-2722.
43. Golomb M., Chamberlin M. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. IV. Resolution of the major in vitro transcripts by gel electroforesis. J. Biol. Chem., 1974, v. 249, p. 2858-2863.
44. Dunn J. J., Studier F.W. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and locations of T7 genetic elements. J. Mol. Biol., 1983 v. 166 p. 477-535.
45. Studier F.W., Rosenberg A.H. Genetic and physical mapping of the late region of bacteriophage T7 DNA by use of cloned fragments of T7 DNA. J.Mol. Biol., 1981, v. 153, p. 503-525.
46. Chapman K.A., Wells R.D. Bacteriophage T7 late promoters: construction and in vitro transcription properties of deletion mutants. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, p. 6331-6340.
47. McAllister W.T., Barrett C. Hybridization mapping of restriction fragments from the early region of bacteriophage T7 DNA. Virology, 1977, v. 82, p. 275-287.
48. Максимова Т.Г., Мустаев А.А., Зайчиков Е.Ф., Баранова JI.B., Кумарев В.П., Лухтанов Е.А. Локализация остатка лизина в области связывания инициирующего субстрата РНК-полимеразы бактериофага Т7. Биоорг. химия, 1989, т. 15, с. 18-23.
49. Baklanov М.М., Golikova L.N., Malygin E.G. Effect on DNA transcription of nucleotide sequences upstream to T7 promoter. Nucl. Acids Res., 1996, v. 24 p. 3659-3660.
50. Martin C.T., Coleman J.E. Kinetic analysis of T7 RNA polymerase promoter inter-actions with small synthetic promoters. Biochemistry, 1987, v. 26, p. 2690-2696.
51. Osterman H.L., Coleman J.E. T7 ribonucleic acid polymerase promoter interactions. Biochemistry, 1981, v. 20, p. 4884-4892.
52. Chapman K.A., Gunderson S.T., Anello M., Wells R.D., Burgess R.R. Bacteriophage T7 late promoters with point mutations: quantitative footprinting and in vivo expression. Nucl. Acids Res., 1988, v. 16, p. 4511^4524.
53. Place C. Oddos J., Buc H., McAllister W.T., Buckle M. Studies of contacts between T7 RNA polymerase and its promoter reveal features in common with multisubunit RNA polymerases. Biochemistry, 1999, v. 38, p. 4948-4957.
54. Li Т., Но H.H., Maslak M., Schick C., Martin C.T. Major groove recognition elements in the middle of the T7 RNA polymerase promoter. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 3722-3727.
55. Jorgensen E.D., Durbin R.K., Risman S.S., McAllister W.T. Specific contacts between the bacteriophage ТЗ, T7 and SP6 RNA polymerases and their promoters. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 645-651.
56. Sastry S., Ross B.M. Probing the interaction of T7 RNA polymerase with promoter. Biochemistry, 1999 v. 38, p. 4972-4981.
57. Stahl S.J., Chamberlin M.J. Transcription of T7 DNA containing modified nucleotides by bacteriophage T7 specific RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, p. 4951-4959,
58. Ikeda R.A., Ligman C.M., Warshamana S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucl. Acids Res, 1992, v. 20, p. 2517-2524.
59. Schneider T.D., Stormo G.D. Excess information at bacteriophage T7 genomic promoters detected by a random cloning technique. Nucl. Acids Res., 1989 v. 17 p. 659-674.
60. Schick C., Martin C.T. Tests of a model of specific contacts in T7 RNA polymerase-promoter interaction. Biochemistry, 1995, v. 34, p. 666-672.
61. Chapman K.A., Burgess R.R. Construction of bacteriophage T7 late promoters with point mutations and characterization by in vitro transcription properties. Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, p. 5413-5432.
62. Oakley J.L., Strothkamp R.E., Sarris A.H., Coleman J.E. T7 RNA polymerase: promoter structure and polymerase binding. Biochemistry, 1979, v. 18, p. 528-537.
63. Strothkamp R.E., Oakley J.L., Coleman J.E. Promoter melting by T7 ribonucleic acid polymerase as detected by single-stranded endonuclease digestion. Biochemistry, 1980, v. 19, p. 1074-1080.
64. Ujvari A., Martin C.T. Identification of minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter. J. Mol. Biol., 1997, v. 273, p. 775-781.
65. Ujvari A., Martin C.T. Thermodinamic and kinetic measurements of promoter binding by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 14574-14582.
66. Sastry S.S., Ross B.M. A direct real-time spectroscopic investigation of the mechanism of open complex formation by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 1571515725.
67. Maslak M., Martin C.T. Kinetic analysis of T7 RNA polymerase transcription initiation from promoters containing single-stranded regions. Biochemistry, 1993, v. 32, p. 4281-4285.
68. Kukarin A., Rong M., McAllister W.T. Exposure of T7 RNA polymerase to the isolatedbinding region of the promoter allows transcription from a single-stranded template. J. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 2419-2424.
69. Dunn J.J., Bautz F.A., Bautz E.K.F. Different template specificities of phage T3 and T7 RNA polymerases. Nat. New Biol., 1971 v. 230 p. 94-96.
70. Beck P.J., Gonzalez S., Ward C.L., Molineux I.J. Sequence of bacteriophage T3 DNA from gene 2.5 through gene 9. J. Mol. Biol., 1989, v. 210, p. 687-701.
71. Beier H., Hausmann R. ТЗ T7 phage crosses leading to recombinant RNA polymerases. Nature, 1974, v. 251, p. 538-539.
72. Ryan Т., McConnel D.J. Physical mapping of hybrid bacteriophage T7/T3 RNA polymerase genes. Virology, 1982, v. 43, p. 844-858.
73. Raskin C.A., Diaz G.A., McAllister W.T. T7 RNA polymerase mutants with alteres promoter specificities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 3147-3151.
74. McAllister W.T. Structure and function of the bacteriophage T7 RNA polymerase. Cell Mol. Biol. Res., 1993. v. 39, p. 385-391.
75. Joho K.E., Gross L.B., McGraw N.J., Raskin C., McAllister W.T. Identification of a region of the bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases that determines promoter specificity.
76. J. Mol. Biol., 1990, v. 215, p. 31-39.
77. Rong M., He В., McAllister W.T., Durbin R.K. Promoter specificity determinants of T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 515-519.
78. Martin C.T., Coleman J.E. T7 RNA polymerase does not interact with the 5'-phosphate of the initiating nucleotide. Biochemistry, 1989, v. 28, p. 2760-2762.
79. Basu S., Maitra U. Specific binding of monomelic bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases to their respective cognate promoters requires the initiating ribonucleoside triphosphate (GTP). J. Mol. Biol., 1986, v. 190, p.425-437.
80. Axelrod V.D., Kramer F.R. Transcription from bacteriophage T7 and SP6 RNA polymerase promoters in the presence of З'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate chain terminators. Biochemistry, 1985, v. 24, p. 5716-5723.
81. Logsdon N., Lee C.G.L., Harper J.W. Selective 5'-modification of T7 RNA polymerase transcripts. Analyt. Biochem., 1992, v. 205, p. 36-41.
82. Brieba L.G., Padilla R., Sousa R. Role of T7 RNA polymerase His 784 in start site and initial transcription. Biochemistry, 2002, v.41, p. 5144-5149.
83. Kuzmine I., Gottlieb P. A., Martin C.T. Binding of the priming nucleotide in the initiation of transcription by T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 2003, v. 278, p. 2819-2823.
84. Weston B.F., Kuzmine I., Martin C.T. Positioning of the start site in the initiation of transcription by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1997, v. 272, p. 21-30.
85. Stano M.M., Levin M.K., Patel S.S. The +2 NTP binding drives open complex formation in T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 2002, v. 227, p. 37292-37300.
86. Martin C.T., Muller D.K., Coleman J.E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 3966-3974.
87. Grachev M.A., Zaichikov E.F. Initiation by Escherichia coli RNA-polymerase: transformation of abortive to productive complex. FEBS Lett., 1980, v. 115, p. 23-26.
88. Straney D.C., Clothers D.M. A stressed intermediate in the formation of stable initiated RNA chains at the Escherichia coli lac\JV5 promoter. J. Mol. Biol., 1987, v. 193, p, 267-278.
89. Ackerman S., Bunick D., Zandomeni R., Weinman R. RNA polymerase III transcription complex generated in vitro. Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, p. 6041-6064.
90. Yamakawa M., Furuichi Y., Nakashima K., LaFiandra A.J., Shatkun A.J. Excess synthesis of viral mRNA 5'-terminal oligonucleotides by reovirus transcriptase. J. Biol. Chem., 1981,v. 256, p. 6507-6514.
91. Ling M.-L., Risman S.S., Klement J.F., McGraw N., McAllister W.T. Abortive initiation by bacteriophage T3 and T7 polymerases under conditions of limiting substrate. Nucl. Acids Res., 1989, v. 17, p. 1605-1618.
92. Diaz G.A., Rong M., McAllister W.T., Durbin R.K. The stability of abortively cycling T7 RNA polymerase complex depends upon template conformation. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 10837-10843.
93. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberger T. Cristall structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2A resolution. Nature 1998, v. 391, p. 251-258.
94. Nath S.T., Lee M.-S., Romano L.J. Effect of carcinogenic adducts on transcription by T7 RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, p. 4257-4272.
95. White R.J., Phillips D.R. Sequence-dependent termination of bacteriophage T7 RNA transcription in vitro by DNA-binding drugs. Biochemistry, 1988, v.28, p. 4277-4283.
96. Sastry S.S., Hearst J.E. Studies on the interaction of T7 RNA polymerase with a DNA template containing a site-specifically placed psoralen cross-link. I. Characterization of elongation complexes. J. Mol. Biol., 1991, v. 221, p. 1091-1110.
97. Pavco P. A., Steege D.A. Characterization of elongating T7 and SP6 RNA polymerase and their response to a readblock generated by a site-specific DNA binding protein. Nucl. Acids Res., 1991, v. 19, p. 4639-4646.
98. Patra D., Lafer E.M., Sousa R. Isolation and characterization of mutant bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1992, v. 224, p. 307-318.
99. Brieba L.G., Sousa R. T7 promoter release mediated by DNA scrunching. EMBO J., 2001, v. 20, p. 6826-6835.
100. Ma K., Temiakov D., Jiang M., Anikin M., McAllister W.T. Major conformational changes occur during the transition from an initiation complex to an elongation complex by T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 2002, v. 277, p. 43206-43215.
101. Karamychev V.N., Panyutin I.G., Neumann R.D., Zhurkin V.B. DNA and RNA folds in transcription complex as evidenced by iodine-125 radioprobing. J. Biomolecular Struct, and Dynamics, Conv. 11, 2000, v. 1, p. 155-167.
102. Masukata H., Tomisava J. A mechanism of formation of persistent hybrid between elongation RNA and template DNA. Cell, 1990, v. 62, p. 331-338.
103. Baker T. A., Kornberg A. Transcriptional activation of initiation of replication from the E.coli chromosome at origin: an RNA-DNA hybrid near ori C. Cell, 1988, v. 55, p. 113-123.
104. Krasilnikova M.M., Samadashwily G.M., Krasilnikov A.S., Mirkin S.M. Transcription through a simple DNA repeat blocks replication elongation. EMBO J.,1998, v. 17, p. 5095-6002.
105. Daube S.S., von Hippel P.H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science, 1992, v. 258, p. 1320-1324.
106. Daube S.S., von Hippel P.H. RNA displacement pathways during transcription from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Biochemistry 1994, v. 33, p. 340-347.
107. Sastry S.S., Hoffman P.L. The influence of RNA and DNA template structures during transcription elongation by RNA polymerases. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995,v. 211, p. 106-114.
108. Temiakov D., Anikin M., McAllister W.T. Characterization of T7 RNA polymerase transcription complexes assembled on nucleic acid scaffolds. J. Biol. Chem., 2002, v.277, p. 47035-47043.
109. Mentesana P.E., Chin-Bow S.T., Sousa R., McAllister W.T. Characterization of halted T7 RNA polymerase elongation complexes reveals multiple factors that contribute to stability. J. Mol. Biol., 2000, v. 302, p. 1049-62.
110. Biebricher C.K., Luce R. Template-free generation of RNA species that replicate with bacteriophage T7 RNA pjlymerase. EMBO J., 1996, v. 15, p. 3458-3465.
111. Cazenave C., Uhlenbeck O.C. RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v.91, p. 6972-6976.
112. Schenborn E.T., Mierendorf R.C., Jr. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucl.Acids Res., 1985, v. 13, p. 6223-6236.
113. Nacheva G.A., Berzal-Hermanz A. Preventing non-desired RNA-primed RNA extension catalyzed by T7 RNA polymerase. Eur. J. Biochem., 2003, v. 270, p. 1458-1465.
114. Sastry S.S., Ross B.M. Nuclease activity of T7 RNA polymerase and the heterogeneity of transcription elongation complex. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 8644-8652.
115. Dunn J.J., Studier F.W. The transcription termination site at the end of the early region of bacteriophage T7. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, p. 2119-2132.
116. McAllister W.T., McCarron R.J. Hybridization of the in vitro products of bacteriophage T7 RNA polymerase to restriction fragments of T7 DNA. Virology, 1977, v. 82, p.288-298.
117. Christiansen J. The 9S RNA precursor of Escherichia coli 5S RNA has three structural domains: implications for processing. Nucl. Acids Res., 1988, v. 16, p. 7457-7476.
118. Young R.A. Transcription termination in the Escherichia coli ribosomal RNA operon rrnC. J. Biol. Chem., 1979, v. 254, p. 12725-12731.
119. Jeng S.-T., Gardner J. F., Gumport R.I. Transcription termination by bacteriophage T7 RNA polymerase at rho-independent terminators. J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 3823-3830.
120. McAllister W.T., Morris C., Rosenberg A.H., Studier F.W. Utilization of bacteriophage T7 late promoters in recombinant plasmids during infection. J. Mol. Biol. 1981, v. 153,p. 527-544.
121. Jeng S.-T., Gardner J.F., Gumport R.I. Transcription termination in vitro by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 19306-19312.
122. Macdonald L.E., Zhou Y., McAllister W.T. Termination and slippage by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1993, v. 232, p. 1030-1047.
123. Macdonald L.E., Durbin R.K., Dunn J.J., McAllister W.T. Characterization of two types of termination signal for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1994, v. 238,p. 145-158.
124. Hartvig L., Christiansen J. Intrinsic termination of T7 RNA polymerase mediated by either RNA or DNA. EMBO J., 1996, v. 15, p. 4767-4774.
125. Arndt K.M., Chamberlin M.J. RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase: factors affecting the stability of elongating ternary complex. J. Mol. Biol., 1990,v. 213, p. 79-108.
126. Mead D.A., Skorupa E.S., Kemper B. Single-stranded DNA "blue" promoter plasmids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering. Protein Engineering, 1986, v. 1, p. 67-74.
127. Lyakhov D.L., He В., Zhang X., Studier F.W., Dunn J.J., McAllister W.T. Mutant T7 RNA polymerases with altered termination properties. J. Mol. Biol., 1997, v. 269, p. 28-40.
128. He В., Kukarin A., Temyakov D., Chin-Bow S.T., Lyakhov D.L., Rong M., Durbin R.K., McAllister W.T. Characterization of an unusial, sequence-specific termination signal for T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 18802-18811.
129. Lyakhov D.L., He В., Zhang X., Studier F.W., Dunn J.J., McAllister W.T. Pausing and termination by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol., 1998, v. 280, p. 201-213.
130. Zang X., Studier F.W. Isolation of transcriptionally active mutants of T7 RNA polymerase that do not support phage grouth. J. Mol. Biol. 1995, v. 250, p. 156-168.
131. Axelrod V.D., Kramer F.R. Transcription from bacteriophage T7 and SP6 RNA polymerase promoters in the presence of 3'-desoxyribonucleotide 5'-phosphate chain terminators. Biochemistry 1985, v. 24, p. 5716-5723.
132. Anderson R.A., Nakashima Y., Coleman J.E. Chemical modification of functional residues of fd gene 5 DNA-binding protein. Biochemistry, 1975, v. 14, p. 907-917.
133. Краевский А.А. Молекулярные основы поиска препаратов для лечения СПИДа. Достижения и вероятные перспективы. Мол. биол., 1999, т. 33, с. 343-352.
134. Wilmanske D., Czyz М., Studzian R., Piestrzeniewicz M.K., Gniazdovski M. Effect of anticancer drugs on transcription in vitro. Z. Naturforsch, 2001, v. 56, p. 886-891.
135. Андреева О.И., Ефимцева E.B., Падюкова Н.Ш., Кочетков С.Н., Михайлов С.Н., Диксон Г.Б.Ф., Карпейский М.Я. Взаимодействие обратной транскриптазы ВИЧ-1 и
136. РНК-полимеразы бактериофага Т7 с фосфоиатными аналогами NTP и неорганического пирофосфата. Мол. биол., 2001, т. 35, с. 844-856.
137. Colman R. F. Affinity labelling of purine nucleotide sites in proteins. Ann.Rev. Biochem., 1983, v. 52, p. 67-91.
138. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: общие вопросы и исследование транскрипции. Успехи химии, 1997, т. 66, с. 401-413.
139. Коршун А.В., Берлин Ю.В. Введение нерадиоактивных репортерных групп всинтетические олигонуклеотиды и их детекция. Биоорг. химия, 1994, т. 20, с. 565-616.
140. Грачев М.А., Лухтанов Е.А., Мустаев А.А. Высокоселективное аффинное мечение промотора в комплексе с РНК-полимеразой E.coli алкилирующими производными инициирующих субстратов. Биоорг. химия, 1987, т. 13, с. 565-567.
141. Грачев М.А.Б Зайчиков Е.Ф., Лухтанов Е.А., Максимова Т.Г., Мустаев А.А. t Высокоселективное аффинное мечение ДНК-зависимой РНК-полимеразыбактериофага Т7. Биоорг. химия, 1987, т. 13, с. 568-570.
142. Kumar S. А., Моопеу С., Krakow J.S. Template restricted inactivation of RNA polymerase from azotobacter vinelandii with 5'-/?-fluorosulfonylbenzoyl adenosine. Fed. Proc., 1977, v. 36, p. 882.
143. Pandey V.N., Modak MJ. Affinity labelling of Escherichia coli DNA polymerase I by 5'-fluorosulphonyladenosine. J. Biol. Chem., 1988, v. 263, p. 6068-6073.
144. Schaffner A.R., Jorgensen E.D., McAllister W.T., Hartmann G.R. Specific labeling of the active site of T7 RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, p. 8773-8781
145. Grachev M.A., Hartmann G.R., Maximova T.G., Mustaev A.A., Schaffner A.R., Sieber H„ Zaichikov E.F. Highly selective affinity labelling of RNA polymerase В (II) fromwheat germ. FEBS Lett., 1986, v. 200, p. 287-290.
146. Grachev M.A., Kolocheva T.I., Lukhtanov E.A., Mustaev A.A. Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. Highly selective affinity labelling by analogues of initiating substrates. Eur. J. Biochem., 1987, v. 163, p. 113-121.
147. Riva M., Schaffher A.R., Sentenac A., Hartmann G.R., Mustaev A.A., Zaichikov E.F., Grachev M.A. Active sites labelling of the RNA polymerase А, В and С from yeast. J. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 14377-14380.
148. Knoll D.A., Woody R. W., Woody A.-Y.M. Mapping of the active site of T7 RNA polymerase with 8-azidoATP. Biochim. Biophys. Acta, 1992, v. 112, p. 252-260.
149. Гриценко O.M., Громова E.C. Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислотыи их компоненты: синтез, свойства, аффинная модификация белков. Успехи химии, 1999, т. 68, с. 267-278.
150. Ефимцева Е.В., Михайлов С.Н. Дисахаридные нуклеозиды и олигонуклеотиды наjих основе: новые инструменты исследования ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Биохимия, 2002, т. 67, с. 1374-1384.
151. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffmity labelling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes. FEBS Lett., 1998, v. 433, p. 9-14.
152. Hanna MM. Photoaffinity cross-linking methods for studying RNA-protein interactions. Meth. Enzymol., 1989, v. 180, p. 383-409.
153. Schuster G.B., Platz M.S. Photochemistry of phenyl azide. Adv. Photochem., 1992, v. 17, p. 69-122.
154. Кнорре Д.Г., Алексеев П.В., Биченкова E.B., Коваль В.В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т.С. Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами. Биоорг. химия, 1998, т. 24, с. 663-669.
155. Borukhov S., Lee J., Goldfarb A. Mapping of a contact for RNA 3' terminus in the largest subunit of RNA polymerase. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 23932-23935.
156. Freund E., McGuire P.M. Identification of a nucleoside triphosphate binding site on calf thymus RNA polymerase II. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 276-284.
157. Rush J., Konigsberg W.H. Photoaffinity labeling of the Klenow fragment with 8-azido-dATP. J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 4821-4827.
158. Knorre D.G. Structural tools for the analysis of protein-nucleic acid complexes. Lilley D.M.J., Heumann H., Suck D., eds. Basel, Boston, Berlin: Birkhauser Verlag, 1992,p. 185-1931
159. Годовикова T.C., Березовский M.B., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификацияаминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе. Биоорг. химия, 1995, т. 21, с. 858-867.
160. Dissinger S., Hanna М.М. Active site labeling of Escherichia coli transcription elongation complexes with 5-((4-azidophenacyl)thio)uridine 5'-triphosphate. J. Biol. Chem., 1990,v. 265, p. 7662-7668.
161. Hanna M.M., Zhang Y., Reidling J.C., Thomas M.J., Jou J. Synthesis and characterization of a new photocrosslinking CTP analog and its use in photoaffinity labeling E.coli and T7 RNA polymerases. Nucl. Acids Res., 1993, v. 21, p. 2073-2079.
162. Лебедева H.A., Колпащиков Д.М., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов. Биохимия, 2002, т. 67, с. 973-981.
163. Lebedeva N.A., Kolpashchikov D.M., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. A binary system of photoreagents for high-efficiency labeling of DNA polymerases. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, v. 287, p. 530-535.
164. Лебедева H.A., Колпащиков Д.М., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Новая бинарная система для сенсибилизации фотоаффинного мечения ДНК-полимераз в ядерных экстрактах. Биохимия, 2003, т. 68, с. 476-481.
165. Tanner N.K., Hanna М.М., Abelson J. Binding interaction between yeast tRNA ligase and a precursor transfer ribinucleic acid containing two photoreactive uridine analogues. Biochemistry, 1988, v. 27, p. 8852-8861.
166. Rechinsky V.O., Kostyuk D.A., Lyakhov D.L., Chernov B.K., Kochetkov S.N. Random mutagenesis of the gene for bacteriopgage T7 RNA polymerase. Mol. Gen. Genet., 1993, v. 238, p. 455-458.
167. Gross L., Chen W.J., McAllister W.T. Characterization of bacteriophage T7 RNA polymerase by linker insertion mutagenesis. J. Mol. Biol., 1992, v. 228, p. 488-505.
168. Chen W.J., Gross L.G., Joho K.J., McAllister W.T. A modified kanamicyn-resistance cassete to facilitate two-codon insertion mutagenesis. Gene, 1992, v. 111, p. 143-144.
169. McAllister W.T., Carter A.D. Regulation of promoter selection by the bacteriophage T7 RNA polymerase in vitro. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, p. 4821-4837.
170. Ikeda R.A., Chang L.L., Warshamana G.S. Selection and characterization of a mutant T7 RNA polymerase that recognizes an expanded range of T7 promoter-like sequences. Biochemistry, 1993, v. 32, p. 9115-9124.
171. He В., Rong M., Durbin R.K., McAllister W.T. A mutant T7 RNA polymerase that is defective in RNA binding and blocked in the early stages of transcription. J. Mol. Biol., 1997, v. 265, p. 275-288.
172. McAllister W.T., Raskin C.A., The phage RNA polymerases are related to DNA. polymerases and reverse transcriptases. Mol. Microbiol., 1993, v. 10, p. 1-6.
173. Zhang X., Studier F.W. Isolation of transcriptionally active mutants of T7 RNA polymerase that do not support phage growth. J. Mol. Biol., 1995, v. 250, p. 156-168.
174. Osumi-Davis P.A., Sreerama N., Volkin D.B., Middaugh C.R., Woody R.W., Woody A-Y. M. Bacteriophage T7 RNA polymerase and its active site mutants. Kinetic, spectroscopic and calorimetric characterization. J. Mol. Biol., 1994, v. 237, p. 5-19.'
175. Bonner G., Patra D., Lafer E.M., Sousa R. Mutations in T7 RNA polymerase that support the proposal for a common polymerase active site structure. EMBO J., 1992, v. 11, p. 37673775.
176. Bonner G., Lafer E.M., Sousa R. Characterization of a set of T7 RNA polymerase active site mutants. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p.25120-25128.
177. Bonner G., Lafer E.M., Sousa R. The thumb subdomain of T7 RNA polymerase functions to stabilize the ternary complex during processive transcription. J. Biol. Chem., 1994,v. 269, p. 25129-25136.
178. Izawa M., Sasaki N., Watahiki M., Ohara E., Yoneda Y., Muramatsu M., Okazaki Y., Hayashizaki Y. Recognition sites of З'-OH group by T7 RNA polymerase and its application to transcriptional sequencing. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 14242-14246.
179. Lopez P.J., Guillerez J., Sousa R., Dreyfus M. The low processiviry of T7 RNA polymerase over the initially transcribed sequence can limit productive initiation in vivo. J. Mol. Biol., 1997, v. 269, p. 41-51.
180. Wyatt J.R., Walker J.T. Deoxynucleotide-containing oligoribonucleotide duplexes: stability and susceptibility to RNase V and RNase H. Nucl. Acids Res., 1989, v. 17, p. 78337842.
181. Conrad F., Hanne A., Gaur R.K., Krupp G. Enzymatic synthesis of 2'-modified nucleic acids: identification of important phosphate and ribose moieties in RNase P substrates. Nucl. Acids Res., 1995, v. 23, p. 1845-1853.
182. Huang Y., Eckstein F., Padilla R., Sousa R. Mechanism of ribose 2'-group discrimination by an RNA polymerase. Biochemistry, 1997, v. 36, p. 8231-8242.
183. Padilla R., Sousa R. Efficient synthesis of nucleic acids heavily modified with noncanonical ribose 2'-groups using a mutant T7 RNA polymerase (RNAP). Nucl. Acids Res.,1999, v. 27, p. 1561-1563.
184. Brieba L.G.„Sousa R. Roles of histidine 784 and tyrosine 639 in ribose discrimination by
185. T7 RNA polymerase. Biochemistry, 2000, v. 39, p. 919-923.
186. Padilla R., Sousa R. A Y639/H784 T7 RNA polymerase double mutant displays superior properties for synthesizing RNAs with non-canonical NTP's. Nucl. Acids Res., 2002, v. 30,1. No. 24 el38.
187. Promega protocol and application guide. 2nd edition, Madison: Promega Corp. 1991.
188. Похолок Д.К. Взаимодействие обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее мутантных форм с субстратами и ингибиторами. Кандидатская диссертация, ИМБ РАН, Москва, 1995.
189. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984, 480 с.
190. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v. 227, p. 680-685.
191. Wyatt J.L., Colman R.F. Affinity labeling of rabbit muscle piruvate kinase by 5'-p-fluorosulfonylbenzoyladenosine. Biochemistry, 1977, v. 16, p. 1333-1342.202., Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, с. 388-390.
192. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Изд. МГУ, 1976, с. 80.
193. Kitz R., Wilson J.E. Esters of methanesulfonic acid as irreversible inhibitors ofiacetylcholinesterase. J. Biol. Chem., 1962, v. 237, p. 3245-3252.
194. Scrutton M.S., Utter M.F Pyruvate carboxylase. V. Interaction of the enzyme with adenosine triphosphate. J. Biol. Chem., 1965, v.240, p. 3714-3723.
195. Klotz J.M., Hunston D.L. Properties of graphical representations of multiple classes of binding sites. Biochemistry, 1971, v. 10, p. 3065-3069.
196. Zhurkin V.B., Lysov Yu.P. Florentiev V.L., Ivanov V.I. Torsional flexibility of B-DNA as revealed by conformational analysis. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, p. 1811-1830.
197. Arnott S., Hukins D.W.L. Optimised parameters for A-DNA and B-DNA. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1972, v. 47, p. 1504-1509.
198. Гордон А., Форд P. Спутник химика. M.: Мир, 1976, с. 127-131.
199. Protasevich I.I., Memelova L.V., Kochetkov S.N., Makarov A.A. The studies of cooperative regions in N7 RNA polymerase. FEBS Lett., 1994, v. 349, p. 429-432.
200. Болотина И.А., Лугаускас В.Ю. Определение вторичной структуры белков изVспектров кругового дихроизма. Мол. биол., 1985, т. 19, с. 1409-1421.
201. V бактериофага Т7 с помощью фосфат-активированных производных нуклеотидов. Мол. биол., 2002, т. 36, с. 543-550.
202. Tabor S., Richardson С.С. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxy-ribonucleotides. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1995, v. 92, p. 6339-6343.
203. Chung Y.L. Structure and function of nucleic acids and Proteins. Wu F.Y.H., Wu C.W., eds. N.-Y. Raven Press, 1990, p. 55-59.
204. Gudima S.O., Kazantseva E.G., Kostyuk D.A., Shchaveleva I.L., Grishchenko O.I.,I
205. Memelova L.V., Kochetkov S.N. Deoxyribonucleotide-containing RNAs: a novel class of templates for HIV-1 reverse transcriptase. Nucl. Acids Res., 1997, v. 25, p. 4614-4618.
206. Middel|,W.R., Babasick D.M., Haugen D.A. Photochemistry of 4-thiouridineV
-
Туницкая, Вера Леонидовна
-
доктора химических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.03
- Транскрипционные стратегии phiEco32-подобных бактериофагов
- Изучение эволюционно-вариабельных участков β '-субъединиц бактериальных РНК-полимераз
- Функциональные свойства мотива В РНК-полимеразы бактериофага Т 7
- РНК-полимераза бактерий: иммунология и молекулярная генетика
- Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli
