Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные изменения в изолированных листьях при действии цитокинина

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные изменения в изолированных листьях при действии цитокинина"

} *

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

РОНЬЖИНА. Елена Степановна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ИЗОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЯХ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИТОКИНИНА

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений и К- А. Тимирязева РАН.

Научные руководители: действительный член РАН, доктс биологических наук, профессор А. Т. Мокроносов, кандидг биологических наук, старший научный сотрудник С. В. С полова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, нр< фессор О. Н. Кулаева, доктор биологических наук, профессс Ю. В. Гамалей.

Ведущее учреждение— Главный ботанический сад РАН.

Защита состоится « /¿Г» февраля 1993 г. в 10.00 ь заседании специализированного совета по присуждению уч' ной степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при И| статуте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН г адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, д. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инст1 тута физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « V »

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Л. И. Сергеева

• / V,'í ' ."-- чал .......

Обцэя харвхтерястаяа работа: Лктузяьяосгъ прсОлзыы: В настоящее время одной из основных задач, стоящих яерэд физиологией растения, является создание янтэг-радьяой концепции урожая, что предполагает достияэяио сСэлонсяро-

зяшгого фужцжшгрсашшя различных органов и ткпяеЛ в едином про-духциошгом процессе. 3 естественных услозппх сущэстзоаатзил растительного организма опрэде яяадша фглсторамн для позышокия продуктивности язляягся сптагазаичя фотосяатвгичосхой функции лтста как донора асслпшштов, процессов потребления л запасания зэщэстз в ак-цэпторшх зоотх и регуляция ингенсизносга и направленности Флоэгтло-го транспорта, олагодеря которому осущэсгвляэтся саязь «ячоду донора-,а и акцойторакя (Курсаноз, 1373; Ноаронооов, IS81, 1983).

Пока по ясно, чем определяются агтрзгярущиэ свойства тэх тли кша поя рос.гзияя, однако щхюлживеегся завкслкость Ездептортшг Функций оргатап. и ткаяэй от содоркагая эццогеших сдтогормопов тих (Г/cnt, 1939; J.stham, ШИсаз, ISS9; Куроплов, 1976; Соколова, IVCS). 1"о.гъ:::сй втеягоге на зттр-1г;;рущу;э сил}' шцзнтся»... ся&зюсзг датошяо.«», :;оторзи орпзнгярувт /ршсгорнпю яотсш ;< рпмс?:пг' в сторону оргсксп ч ri"aue.'i, оЗсгэдтих дргот ^птогормсг.йка,

Ifocr.'OTpa "'i Солыгсо количество Л^ггн'-ох-сого гпг-зрча'.а. гоа.нс*-гог в ост*ог-':о"сгтлпзч.ллнг^ л^р"с'.'-'р.. '"о.тг^жп .пг-ятюго жг.гггir-c"i~. пор "о Гч ¡'aove'-: D?r?-^''-"рчтогг сотостьт чеу^^'^тг/

njjC'ü.QCGCíí "рй'чслср'!-;! рас■■ • ^^"'ссгз

органами "i тр^гг :j;i;pro рпсгс-гпт., 'Т^'.дс-злои' 'cron; оооо:!; "ncc.X'Oi--ггппзозшг/л ,::о;:срло - ./кцелтаг;,"' • сгс;,:*\ 'Чтг.чс;:. пзродно бохгзо прсеуль .'',

УдапяоЗ .'¡бдзлыя для • t." рсяч к1;?^:-;:о .; •..гд'./.плцт^" доггощо-ачдегоотягк oraíMXiíí гххяляъгжЯ r.':r„:\ ПсдсОго ж™ на растзпшц o:i ■ .;л;?зль::со гргм агосс?;.:.: vcyriscs-влят» с:зсо оспоккуэ »'уяаггл ■ n '.чоекзиз (Sraropar^3 1 :'<•• IC57; Fovsmco л др., ISS3), ..........-ашо з яроцэсез (¡ovos:.7... -i ."cccz.:;-

ЛЯТИ 3 CP333S2IX ХПС'Т*;':-' ■.!.'' TÍ, КС! Л П ПЛТГГ-С'ПГЙ.Х, "''-""¿СП ПО

(Тиозму л ¡трл.таотсгс.'. : зхгсрлулшу^сь з пзрзлг; .'" г;

фвош* ерэд'ш;! сзл'-.: -;:.г-гзса (Darrisr, loosia, r.ot.I¿23 oí

al., 1959; Leoniitl., l'G3; ¡Суростз, ¡975; Сско.'о::-а, IC33).

Гшаил образом, деяш г40Двль содор:пг аез элзлэзтн ло~ор:?о-п;сцап-торной сиотеш: димовуа плаотишеу. з жярстзо донора асожжзлятоз, среднюю жилку и черешок в качзегзэ ш?цвотороз, фдовщ, благодаря

которой осуществляется связь между ниш. Преимущество же срезанного листа по сравнении с шпактнш состоит прежде всего в том, что он функционирует в автономном режиме и освобожден от множественного контроля со стороны целого растения и влияния систем более высоких уровней организации (Мокроносов, 1981). К тому же отделенные жстья ие снабжаются цитокшшнами из корней и потому более чувствительны к экзогенным обработкам ими (Кулаева, I9S2, 1964, 1982).

Выяснено, что аппликация экзогенного ' цитокинина, увеличивая атграгирущую способность обработанных участков отделенного листа, изменяет существующие в нем дояорно - акцепторные отношения. В 1959 году К.Мотес, .Л.Энгельбрехт и О.Н.Кулаева (Nothes et al., 1959) впервые показали, что обработка кинетином участка зрелого изолированного листа вызывает торможение базипетального оттока веществ из листовой пластинки в среднюю жилку и черешок {"эффект удерживания"',). Оказалось также, что цитокинин индуцирует приток подвижных метаболитов из других, необработанных участков ' той хе листовой пластинки ("аффект аттрагирования"). В литературе эти два одновременно осуществлякщихся процесса нередко называют "эффектом Ыотеса".

Доказано, что транспорт веществ в обработанную фитогормоном половину листовой пластинки происходит по флоэме и сопровождается их выходом в мезофилл (Niiller; Leopold, 1966; Penot, 1978; Gersani, Rende, 1982). Таким образом, локальнаяг аппликация цитокийина приво-. дат к появлению искусственного акцептора, функционирующего параллельно с естественными акцепторами - черешком и средней жилкой. С точки зрения функционального' состояния листа, цитокинин вызывает изменения, обратные происходящим в онтогенезе, поскольку закончивший рост и эхспортируищй ассимиляты лист' в результате обработки фитогормоном из донора вновь становится акцептором, а направление транспорта веществ в нем меняется на противоположное. ' •

В настоящее время активно' развиваются представления, согласно которым причиной смены функционального состояния листа в онтогенезе являются структурные и функциональные изменения транспортного пути. Одни из них предотвращают загрузку флоэмы (нарушение симпластичес-ких связей между мезофиллом и флоэмой в результате роста листа и развития мехклетников); другие способствуют ее загрузке - (формирование специализированных передаточных клеток - transfer celia - с протуберанцами оболочки у растений с закрытой флоэмой, образование • плазмодесменякх полей на .границе клеток - слутанков с. мезофиллом у

растений с открытой флоэмой) (Schmalstlg, Gelger, ' 1987; Turgeon, 1986, 1989; Гамалей, 1990). Поэтому можно было предположить, что цитокинин изменяет структуру и функционирование флоэмы, возвращая ее в состояние, свойственное молодым акцепторным листьям -

В то же время хорошо известна способность цитокининов влиять на метаболизм растительных тканей, стимулировать ростовые и биосинтетические процессы в них. Предпринятые рядом исследователей попытки разделить транспортные и метаболические ответы на фитогормоны (Osborne, I9S2; Patrick, 1974; Mulligan, Patrick, 1979; lurvey, Patrick, 1979), однако, пока не позволяют однозначно решить вопрос о том, что является непосредственной причиной регуляторного влияния цитокининов на транспорт и распределение веществ в изолированном листе: их прямое действие на структуру и функционирование флоэмы или активирующее влияние на метаболизм клеток мезофилла.

Цель н задачи работы: целью данной работы явилось выяснение природа "эффекта Мотеса"- удерживания и аттрагирования веществ участками донорного изолированного листа, обработанными цитокини-ном. Для решения данного вопроса была поставлена задача изучить три возможные причины этого эффекта:

Ьиндукция цитокинином структурных изменений элементов флоэмы,. регулирующих транспорт веществ мэвду. проводящими и фотосинтези-рувдиш клетками;

2.влияние цитогашина на процесс переноса веществ чарав мембраны в системе мезофилл - клетка-спутник - ситовидный элемент;

■ 3.актив едй цитокинином метаболизма клеток мезофилла, приводящая к потреблению веществ * и изменении градиента их концентрации в системе мезофилл - флозма.

Научная новизна робота- Впервые проведено сравнительное изучение влияния цитокишша па транспорт и распределение веществ у растений с открытым и закрыт::;-,■■ типами терминальной флоегш листа. Показана возможность з5зм9нэни? направления транспорта веществ у растений обоих типов. Виясшно, что возникновение зон импорта в донорных листьях происходит в отсутствии структурных.перестроек флоэмы и не связано с влиянием цитогашина на функционирование мембранных механизмов переноса веществ в системе мезофилл - флоэма. Показано, что причиной изменения направления транспорта на противоположное являются структурные и функциональные изменения,, происходящие в клетках мезофилла под влиянием .цитогашина:' снижение pH апопласта и индукция

роста клеток растякешем, а также активация синтеза высокополшер-ных веществ. Предполагается, что тормсжвше оттока вызвано снижением концентрации веществ е транспортном пуле клеток мезофилла. Обнаружено уменьшение -осмотического давления клеток мезофилла в местах аппликации цитокинкка к появление положительного градиента осмотического давления между дошрным к акцепторным участками листа, который является причиной индукции притока веществ.

Теоретическое и практическое вначеше. робота: Работа создает основу для решетя вопроса о механизме аттрагирущего действия ци-токкнинов, что позволяет г. помощью данных фитогормонов и веществ с ццтокишжое.ой активностью целенаправленно регулировать сложившиеся в онтогенезе донорно - аг.цепторшю отношения для увеличения хозяйственно ценной части урожая.

Апробация рсботш Результата представлены на V Моьчдународной конференции колодах ученых (Варна, 1990), II Всесоюзном съезде ЕѮР(Минск, I9S0), .Научной коифьренщш по физиологии растительной клеткк (Уфа, 1991), Кокфзрекцки молодых ученых (Киев, 1932).

Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печапшх работ.

Структуре работа: Диссертация состоит из Бвадешя, обзора литературы, описания объектов и кетодоЕ исследований » изложения результатов» их обсуждения, выводов, списка кспользовшзюй литературу I S4 каккэяоЕаянй lia русское к <=?<Упа киострашш. язаках); она излокена на 2// страницах цылисшспого текста, содораит 23 таблщн, шшострйрована 27 рисуккаш.

ОЗ'АСкте с шгода есслодоцзпкИ: Исследования проводещ на лес-тьях растений с различным ткзш терминальной флоэмы: тыквы Cucurbita papo L. (сорт Иозолээвская) с открытой- и Собов Vicia fába L, (сорт Черные русские-) с закрытой флоемой. В опытах использовала кзолироваляне листья разного возраста: ювешглышс (25% оконча-' тельного размера. - sßaK), растущие (503 SraQX), зрелый, только что закончившие рост, к старэщке лгетьп - критерием старения являлось 25Я'- кос сжк:зш59 содержания хлорофилла.

Растения Екращивали в порлитовом песке на роатюрэ Ккопа, со-дерходзм тройную дозу шгкнп к двойную калия в фшлоростатшх усло-веех фитотрона: штаксшюсть спета 90 Вт/к2 ФАР (ксеноновые ш\т ЛЧСТ-20Ш0 с водный вхракоЮ» длина светового да ¡6 часов, относительная елшшость воздуха 80%, температура +2О220С для бобов, +22+24°С для тыквы.

Постановка опытов соответствовала схеме, разработанной Мотесом и др. (liothes et al., 1959): отделенный лист помещали во влажную камеру (относительная влажность воздуха 95%) на рассеянный свет при комнатной температуре, праву» половину опрыскивали 10"4М раствором БАП (90 мкг/см2), левую - дистиллированной водой. 3 ряде опытов цитокягашом обрабатывали весь лист. Контролем служили половина листа, обработанная водой; лист, опрыснутый водой; интактный лист.

Плаирйъ листовой пластинки определяли с помощью светочувствительной бумага, измеряя площадь проекции люта на видеоплата (Reichert, Австрия). Содержание хлорофила определяли по Вернону (Vernon, I960). При. воспроизведении "эффета Мотеса" отток и приток веществ регистрировали по содержании 14С в левой, правой половинах листа и черешке со средней' жилкой. Радиоактивные соединения наносили по предложенной Мотесом и др. (Mothes et al., 1959) схеме: при изучении "эффекта удерживания"- на обработанную цитонинином половину листа, при изучении "эффекта аттрагирозания"- на обработанную водой. Время предобработки фигогормоиом для максимального развития "эффекта Мотеса" подбирали предварительно; в большинстве опытов оно было равно 48 часам. Бремя распределения14С - 24 часа. Содэр-каниа метки в тканях листа в этих и в дальнейших опытах определяли как описано йаквшгой и др. (Glaqulnta et al., 1983). Радиоактивность каздой часта выражали в процентах от суммарной радиоактивности листа. Прсниюювениа ЫС-БАЛ в Аистовую тиастшху измеряли -на .отлитых от цитошшна высечках из листьев. Содержание ьупокининов определяли методом ВЗЖХ (система приборов для ВЭЗКХ, 1KB) (Волынская и др., IS90), -Дюлогтесщро сватвность цияюхинияов - с помощью Ама-рантус - теста (Blddlngton, Thomas, 1973) после разделения пробы на 20 фракций катодом жидкостной хроматография низкого давления (коллектор фракщй "Ultropak". LKB). Фиксация материала для электронной .тисроскопт была стандартной (Гайер, 1974). Срезы получали па ультратомэ "Reichert" (1KB). Ултрстонкие срезы контрастировала насыщенным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу (Гайер, 1974) и исследовали под электронным ?япсросшгом .JE1 100В (Япония). Лсиуяошше срезы красил! смасьв из 13 раствора кокаиновой гаши зз 1% водном растворе буры я ISJ подлого раствора аоура (1:1). Просветление листьев проводил:! по Гзвдедьс (1307). Анализ .неаосярутуры, листа осуществляли по Мокропосозу и БорзэжсовоЙ (1978). Ткань листа мацерировали, под световая микроскопом проста-

тывали в камере Фукса - Розенталя число клеток, на давленных препа ратах - число хлоропластов в клетках палисады. С помощью видеоплан измеряли размер клеток, долю межклеточного пространотва в губчато мезофилле, объем хлоропластов и крахмальных зерен на срезах, р апопласпа и аютвность Н^-АНФазы тиазжиемт клеток мезофилла опрэ деляли о помощью рН-индикатора пиронкна (гидроксипирен-3-сульфоно вой кислоты), регистрируя его флуоресценцию при 405 и 470 нм (спек трофлуориметр 1С?-4, "Hitachi", Япония)... Анализ вклтения 14С продукты фсмоситеэа проводили по Дубининой и др. (1991). Оалаш ческое давление измерял! на выпаривающем осмометре ("Knauer", ФРГ) Результаты опытов обработаны статистически (Лакин, 1990).

Результаты и их обсуждение: Действие БАЛ на транспорт и распределение веществ в изолированных листьях.

Изучение распределения '^С-оахерозы при локальном нанесении hi лист цитокинина показало, что фитогормон тормозит отток вещеотв и: листовой пластинки и индуцирует приток к местам его аппликации и; необработанных участков листа и тыквы, и бобов. Локальное нанесешь цитокинина превращало участок листа из донора в акцептор, функционирующий альтернативно (у тыквы) или крмллемвнтарно (у бобов) i естественным акцепторам - черешку и средней килке (табл. I).

' таблица 1

Дейогвие БАП на.распределение ,4С-сахарозы в изолированных листьях разного возраста бобов и тыквы.

фаза радиоактивность.» разви- контроль : аттрагирование : удерживание _тия лц пп ч : лп пп ч_: лп пп_ ч

25iS„„„ шах

О БОЮ Г шах

g зрелый ы старею-

87*1,1 ЗЮ,1 10*0,2:90*3,2 2*0,1 810,2:2*0,2-88*1,3 lb 86*1,9 5i0,2 9*0,4174*2,8 14*1,4 12*1,0:4*0,2 89*1,2 7a 60*1,3 8i0,2 31*1 ,2j35tl ,7 35*2,7 30*1,&|6*0,1 87*1,0 7i 87*1,6 4t0,2 8*0,5:38*1,8 26*1,9 35tl,5;2*0,2 95*1.,3 3i

Т^шах

*БСЖ5тах

* зрелый

а стареющий

Пржы»чвии«« в чеобл. 1,3,Б принят следующие условные сокращения: ~ лп-левая половина листовой пластинки, пп-правая половин ч-черешок со средней хилкой.

84*1,9 3t0,2 13*0,4:87*1,5 3*0,3 14*0,3:4*0,3 84*0,7 13*

71*1,2 6*0,9 23*1,1:60*0,8 20*1,8 30*1,4:3*0,6 78*1,2 19*

49*1,8 6iO,2 45*1,9:21*0,8 52±2,3 27*1,7;3*0,4 90*2,0 7* 88*1,7 4t0,2 8*0,б!40*0,5 28*3,1 32*2,4|3*0,4 .95*1,9 2i

Таким образом, нами обнаружено, что "эффэкт Мотеса" существует iг листьев как с открытой (у тыквы), так и с закрытой (у бобов) терминальной флоэмой. Способность цитокининов влиять на транспорт и распределение веществ определялась Еозрастом листа: в ювенильных пкстьях "эффект Мотеса" отсутствовал, его величийа возрастала по «ieре роста листа, достигала максимума в зрелом листе и вновь уменьшалась в стареющем. На всех стадиях развития она была выше у листьев тыквы, чем бобов на соответствущих стадиях развития.

Одной из причин- различной интенсивности транспортных ответов ía цитокинин у листьев этих растений могли быть различия в проник-товении БАЛ в листовуп пластинку, однако с помощью 14С-ЕАП нами выяснено, что скорость и количество проникшего в ткани листа цитога-тана у бобов н тыквы отличаются мало (за 48 часов в лист бобов проткало 2,2 мг/г сухой массы БАЛ, в лист тыквы - 2,4 юг/г). Другой тричиной могли быть различия в гормональном балансе листьев бобов и гыквы до или после обработки БАЛ. Однако определение количэотва л 5иологическоЯ активности эндогенных цитокининов (методом ВЭЖХ в сочетании с Амараятус-тесгом) показало, что хотя качественный состав цитокининов у исследуемых видов был принципиально различен - у 5обов доминировали зеатин и его производные - рибозид зеатина и до-гидрозеатин, а у гыквы изопентениладенин и его рибозид, говорить о зущественных различиях в их количественном содеряанш в гштактных листьях вряд ли возможно. Кроме того, проникая в лист, БАЛ вызи-зал сходные у обоих видов изменения в балансе эндогенных цитоютм-юв. Через 48 часов после аппликации БАЛ в листе увеличивалось содержание свободных цитокининов и уменьшалось количество их рибози-цов. Мы полагаем, что БАП стимулирует переход физиологически ме-iee активных рибозидов, являющихся, по-видимому, транспортными формами цитокининов (Кулаэва, 1973), в физиологически более активам свободные формы и задеряяваег распад эндогенных цитокининов тутем ингабирущего действия на цитокинин - оксидазу.

Отсутствие различий в гормональном балансе листьев бобов и гыквы позволило предположить, что различия в величина "эффекта Мотеса" у этих растений определяются особенностями их катаболизма п анатомического строения.

Действие БАЛ на структуру и функционировав терминальной флоэжн листа.

При определении подходов для выяснения механизма- "эффекта Мо-

теса" мы исходили из того факта, что. цитокинин, превращая участок зрелого листа из донора в акцептор, вызывает изменения, обратные происходящим в онтогенезе. Основываясь на современных представлениях о причинах смены функционального состояния развивающегося листе в онтогенезе (Schmalstig, Geiger, 1987; Turgeon, 1986, 1989; Java-лей, 1990), мы попытались выяснить, не связано ли происходящее под влиянием ВАЛ торможение оттока у растений с закрытой флоэмой (у бобов) с исчезновением протуберанцев оболочки в клетках-спутниках, а у растений с открытой флоэмой (у тыквы) с обращением или торможением транспорта в плазмодесменных полях.

Электронно - микроскопическое научение участвующих в загрузке ассимилятов мелких жилок листа (галок двух последних порядков ветвления), проведенное через 4S часов после нанесения фитогормона, однако, показало, что ни у тшшы, ни у бобов под действием БАЛ не происходит структурных изменений клеточной стенки клэток-опутников терминальной флоэма, которые могли бы являться причиной тормохения оттока веществ.

В то асе время в клетках-спутник ах мы наблюдали явления, которые, по данным Гамалея (1990), характерны для тормокэжя оттока. У тыквы ими были появление миелдновых тел, которые образуются за счет избытка ыэмбран вндоплазматического ротикулума при нарушении осмотических градиентов в системе мезсфш! - клетка-спутник - ситовидный элемент, укрупнение каналов ендоплазматического рёгикулума, конденсация митохондрий. У бобов нами обнаружены уменьшение парциального объема протуберанцев fe увеличение парциального объема вакуоли, дэконденсация митохондрий (табл. 2).

Другой возможной причиной изменения направления транспорта на противоположное у растений с шопластной загрузкой (у бобов) могло быть влияние БАЛ на работу участвующей в загрузке активной транспортной системы, благодаря которой осуществляется перенос веществ через мембрана из мезофилла в клетки-спутники'. Для выяснения такой возмокности ш изучили влияние на транспорт и распределение вещеетв фузикокцина (4К), активирующего И^-помпу. плазмапешы и, в противоположность цитокинину, являющегося потенциальным активатором оттока (Kalek, Balter, 1978). Однако <ГК оказал качественно такое ш действие на распределение веществ, как и БАП, хотя, и более слабое, и не уменьшал удерживающий эффект цитокинина (табл. 3).

таблица 2.

Парциальный объем органелл в клетках-спутниках терминальной фловмы зрелых листьев бобов и тыгаи (%).

вариант опыта

органеллн интактный весь лист половина листа ооработана тение лист водой ■ Б0Д0Й БАП

бобы вакуоль 31,845,53. 62 ,5*6 ,49 42,1±5,43 35,4+4, 58 '

протуберанцы оболочки II, I+2,98 4 ,3±1 .73 7,541,32 , 5,2±2, II

митохондри- алышй ретикулум 15,4+2,49 12 .941 .21 14,842,04 16,412, 58

эндоплазма-тыква тичэсккй ретикулум 54,1+3,97 45 .344 .01 48,3±2,99 61,614, 25

митохондри- альный ретикулум. 12,6+2,18 12 ,0+1 ,Б0 II,9±1,83 13,141, 67

таблица 3.

Действие ФК и ВАП на распределение 1 4С-оахврози в изолированных листьях бобов разного возраста.

И,-

фаза вариант

радиоактивность.

развития опыта лп пп ч лп пп ч

растущий контроль БАП ФК. БАЛ+ФК 86*1,4 4+0,3 72+0,7 [640,9 81±1,1 941,6 • 7041,3 1941,0 10+1,2 1241,3 II+0,8 1241,1 440.4 410.6 340.5 540.7 9041,2 89+1,4 864 1,3 8842,0 741,0 640,5 ■12+1,8 741,0

зрелый контроль БАЛ ФК БАП+ФК 64±1,8 6+0,5 4841,0 2811,2 47+1,6 24+2,0 49±1,5-3111,7 30+1,4 3241,3 294 1,8 3041,2 7+0,7 6+0,8 4+0,3 4±0,5 6141,1 89+2,3 7841,3 87+2,7 32+2,7 1040,9 15+1,0 840,9

стареющий контроль БАЛ <ИС БАЛ+ФК 85+1,7 510,3 46±1,4 2341,6 61±2,6 Г4±1,8 50г2,0 2541,4 10+0,8 3141,7 264 1,9 25±2,I 5+0,4 440,6 440,5 6+0,3 85+1,5 88+1,9 84+2,0 86+1,4 1040,6 9+0,7 П±1,0 9+0,5

В растущих, импортирующих ассимиляты листьях разгрузка веществ осуществляется только из незрелых ситовидных элементов, и фронт разгрузки движется вдоль прокамбиального тяна вместе с процессом дифференциации флоэмы - по листу прокатывается "бегущая волна разгрузки флоэмы" (Гамалей, 1990). В сеязи с этим мы попытались выяс-•нить, не является ли причиной индукции притока в обработанную БАП

половину листа формирование терминале» более высоких порядков с незрелыми ситовидными элементами, способными к разгрузке. Для этого проведено изучение жилкования на просветленных листьях через 2 и 7 суток пооле аппликации цитокинина. Однако структура проводящей системы под влиянием БАЛ не менялась ни у тыквы, ни у бобов ни на одной стадии развития листа. Оставались постоянными количество свобод- ных окончаний на ареолу и средняя площадь одной ареолы (например, у зрелых листьев тыквы она была равна 0,1 мм2 во всех вариантах опыта, у зрелых листьев бобов - 0,4, мм2).

Для изучения природа разгрузки ассимилятов при "аффекте Моте-оа" мы ингибировали в листьях бобов К*-АТФазу плазмалеммы с помощьв ванадата, эритрозина и ЛЕС. Однако ингибиторы на уменьшали величину "эффекта аттрагирования". . . •

Таким образом, наш исследования позволили заключить, что причиной формирования под влиянием цитокинина зон импорта в уже выполняющих донорную функцию листьях не являвтся структурные перестройки клеточной стенки клеток-спутнков терминальной флоэмы или изменение функционирования мембранных механизмов переноса веществ в системе мезофилл - флоэма,•хотя структура клеток-спутников меняется вслед за изменением направления транспортных потоков в листе.-

Альтернативной возможной причиной изменения направления транспорта могли быть процессы, происходящие в клетках мезофилла.

Действия БАЛ ш структуру и яетОолиэя лезофшиа.

При изучении влияния цитокинина на мезофилл у обоих видов обнаружено, что. уке через три часа после локальной обработки листа БАП в местах его аппликации происходит снижение осмотического давления. В результате этого мевд доноршм и акцепторным участками листа появляется положительный градиент осмотического давления, который сохраняется на протяжении всего опыта (рис. I). В соответствии с гипотезой Ышха (Münch, 1930), он, по-видимому, и является движущей силой направленного транспорта веществ при "эффекте Моте-са". Отсутствие влияния ингибиторов на аттрагирувдие свойства обработанных цитокииином тканей также указывает на то, что разгрузка в данном случае не связана с затратой энергии и идет по градиенту осмотического давления. Аналогичным образом разгрукакгся ассимиляты в акцепторных тканях - растущих и запасающих органах, в частности, в молодом листе (Shmalstlg, Gelger, 1985, 1987; Ding et al., 1988; Turgeon, 1989; Гамалей, 1990).

<

г4

* э*о

\

ЗОО

200

1

|

% /оо

I.

х<

ЧЬ

\

I

у

¿4

0 /

БАЛ

46

И /

/

ь

/ /

/ /

? / ?

к

-р2-

л, г

¿лги/эе+сш^иг; Фаза раЗ^ИтпиЛ лиггупех

Рио. Т. " Дейотвие БАЛ на осмотическое давление изолированных листьев тыквы,-

1-временная зависимость (1

2-через 48 часов после обработки (I1%). 0-интактный лист, Ё -весь лист-БАЛ, Щ-весь лист-вода, □ -половина листа-вода, Д-половина листа-БАП.

Дальнейшие эксперименты были направлены на выяснение причин снижения осмотического давления в клетках мезофилла под влиянием БАЛ. Мы предположили, что этот эффект мог быть следствием потребления веществ на ростовые и морфообразовательные процессы, которые стимулирует цитокинин (Кулаева, 1973). .

Подтверждением этого предположения явилась обнаруженная нами индукция цитокининам роста клеток растяжением в закончивших poor листьях (табл. 4). Изучение структуры листа показало, что у тыквы через 48 часов под влиянием БАЛ объем клеток палисадного мезофилла увеличился с 5,3 тыс. мкм3 до 6,7 тыс. мкм3, а у бобов с 47,9 тыс. мкм3 до 53,9 тыс. мкм3. По-видимому, это произошло в результате активации фитогормоном протонной помпы и стимуляции выброса протонов из клетки. В пользу этого предположения говорит тот факт, что в обработанной БАЛ половине листа ш наблюдали спонтанное изменение флуоресценции при 470 им инфильтрированного в лист pH - индикатора пиронина, свидетельствующее о снижении pH апопласта. Наши данные согласуются со сделанными ранее выводами Mappe и др. (Marre et al., 1974) об активации цитокинином протонной помпы в семядолях редиса.

Снижение pH апопласта должно приводить к активации гидролаз и

таблица 4.

Действие БАЛ на структурно-морфологические характеристики зрелых изолированных листьев тыкеы (¿-достоверность различий).

показатель

единица измерения

вариант вода (контроль!"

опыта ~БШГ

ТогштГ

площадь половины листа

толщина листа

объем палисадных клеток

площадь межклетников в ■ I см губчатого мезофилла

число клеток

палио едшх+губч атых

см

% от исходной

MíCM

тыс.мкм3 мм2

палисадных губчатых

число хлоропластов объем хлоропластов

тис./см2 гас./О,5 листа

тыс./см^ тыс./О,5 листа

тас./сьг гас./О,5 листа

ИТ

мкм;

,з

30,2±1,57 100+0,1

II8,0i3,96

5,3±0,0,03

16,01

220±18,9 6644 51 1545 169 5099

31±5,8

28,4±1,78

32,0+1,44 * 105+1,2

121,1+5,55 А

■ 6,7+0,04

*

20,34

265+20,4 8480 66 2120 199 6360

37+8,2

30,4±2,44

разрыхлении клеточной стенки, а происходящее вследствие этого уменьшение ее противодавления способствовать усиленному поступлению воды в клетки мэзофшга. Это, вероятно, является не только причиной роста растякешем клеток мезофилла, но и снижения их осмотического давления.

Для проварки этой возможности мы провели опыты с ФК и ИУК, стимулирующими внСрос протонов из клеток и визващими их рост растяжением. Оказалось, что и ИУК, и ФК, подобно БА11, влияют на транспорт и распределение веществ в листе (табл. 3, 5). Это также служит подтверждением возможности того, что аттрагирующая способность тканей листа связана с описанным выше процессом.

таблица 5.

Действие ЮТ и БАБ на аттрагирующую способность зрелых изолированных листьев бобов и тыквы.

вариант опыта

тыква ООСЫ

радиоактивность, ч

лп 1Ш ч лп Ш1 ч

53* I »4 411,3 43*1 ,2 . 66+2,6 5+0,8 29+2 ,7

ЗЫ .2 29+I,7 40*1 ,7 49*1,3 24+1,4 27 + 2 ,4

2211 ,0 49+1,9 29*1 ,6 3611,5 32+1,5 32+1 ,6

3512 ,0 31¿2,2 331:2 .4 49+1,8 25+1,3 26+1 ,3

23+1 ,7 47*1,5 30±1 3 46+I,7 34+1,0 30*2

34+1 ,3 2041,4 46*1 ,9 57+1,4 16+1,2 27+1 ,9

контроль БАЛ (48 часов) ИУК (48 часов) ИУК (24. часа)+ БАЛ (24 часа) БАЛ (24 часан ига (24 часа) БАП+,

ИУК

"(48 чаоов

Другой возмояясЯ причиной снижения осмотического давления могло быть включение относительно низкомолекулярных веществ в осмотически менее активные полимерные соединения. Кроме того, метаболиза-ция ' притекающих в обработанную БАЛ половину листа веществ должна поддерживать созданный градиент осмотического давления на постоянном уровне, что ш и нвблвдали в наших опытах (рис. I).

Для проверки такой возможности мы изучили напровлекность кета-. Солизма клеток мезофилла путем радиохимического анализа состава 14С-продуктов фотосинтеза. Для этого листья вкагонировали в атмосфере С02 в течение 16 минут, пооле чего одну группу листьев сразу. использовали для анализа, а другую помещали во влажную камеру на рассеянный свет еще на 45 кинут. В результате этих исследований выяснено, что у обоих растений БАЛ усиливает синтез высокополимерных соединений - крахмала, вещёств клеточных стенок и С.елков, снижая

таблица 6

Действие БАЛ на состав 1АС-продуктов фотосинтеза зрелых изолированных листьев бобов и тыквы.

время радиоактивность, Я

растение вариант вклю-опыта чения (мин) СПИрТОЕОДО" расгворимая осадок крахмал остаток

бобы вода БАП 15 15 96,3+0,30 95,4+0,42 3,7+0,30 4,6±0,42 0,6±0,05 0,9+0,07 2,9+0,18 3,5+0,23

вода БАП 15+45 15+45 94,3+0,55 85,4±0,93 5,7+0,55 14,6+0,93 2,0+0,11 4,4+0,10 3,7+0,31 10,2+0,56

тыква вода БАП 15 15 90,4±0,62 89,0±0,76 9,6+0,62 11,0+0,76 0,4+0,05 1,1±0,0Э 9,2+0,78 9,9+0,76

вода БАП 15+45 15+45 87,9+0,94 82,8±0,9Э 12,1+0,94 17,2+0,99 2,3±0,15 3,9+0,12 9,8+0,85 13,3+0,92

включение метки в спиртоводорастворимую фракцию (табл. 6).

Об увеличении количества крахмала под действием БАЛ говорят не только данные по включению метки, но и полученные наш данные электронно-микроскопических исследований. Так, за 48 часов содержание крахмала в хлоропластах губчатого мезофилла увеличилось с 1,3 мкм3/хлоропласт в зрелом интактном листе тыквы до 5,9 мкм3/хло-ропласт в обработанной БАП половине листа; у зрелых листьев бобов эти величины составляли соответственно 0,7 мкм3 и 7,1 мкм3. Хлоропласт в обработанной водой половине листа через 48 часов были полностью лишены крахмала.

- Полученные результаты дают основание утверждать, что причиной направленного транспорта веществ в обработанную БАП половину листа при "аффекте Мотеса" является структурные и функциональные изменения, происходящие в клетках мезофилла - рост клеток растяжением и синтез полимерных веществ. Интенсивность и соотношение этих процессов и определяют величину создаваемого градиента осмотического давления и аттрагирующую активность обработанных цитокинином тканей листа. Усиление синтеза макромолекул, по-видимому, можно рассматривать и как фактор, снижающий концентрацию транспортных форм углерода в клетках мезофилла и являющийся причиной удерживающего эффекта фигогормона. Такое представление хорошо объясняет видовуй специфику и возрастные особенности транспортных ответов на цитокинин.

У бобов рост клеток растяжением был меньше, чем у тыквы, однако больше изменения обнаружены наш в синтезе крахмала. В юве-

О

нильных листьях увеличение площади листовой пластинки было вызвано активацией делений клеток мезофилла под действием БАЛ (у тыквы количество клеток в I см2 площади листа в обработанной БАЛ половине увеличилось с 702 тыс. до 846 тыс., а их ширина.уменьшилась с 10,5 ?жм до 8,3 мкм), накопление крахмала в пластидах было очень незначительно. Таким образом, ни одного из факторов, способных привести к снижении осмотического давления, в листьях этого возраста на обнаружено, о чем, по-видимому, и связано отсутствие аттрагирующего эффекта у них. Не происходит и усиления синтеза полимерных веществ, приводящего к тормокению оттока. У зрелых листьев отмечен и значительный рост клеток растяжением, сопровождающийся образованием необходимых для его осуществления полимерных соединений, и синтез крахмала, благодаря чему наблюдается высокая аттрагирукщая и удерживающая способность обработанных цитокинином тканей. В стареющих листьях ростовая реакция на цитокинин отсутствовала, но увеличилось содержание крахмала (в интактных листьях тыквы объем крахмальных зерен был равен 2,0 мкм3/хлоропласт, в обработанной БАЛ половине листа - 7,3 мкм3/хлоропласт).

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что механизм аттрагирующего действия цитокининов при "эффекте Моте-са" состоит в снижении осмотического давления и создании его положительного градиента между донорным и акцепторным участками листа. Это способствует пассивной разгрузке концов ситовидных элементов и вызывает передвижение веществ к местам аппликации цитокинина. Происходящее под влиянием фитогормона. усиление синтеза полимерных соединений может быть, по нашему мнению, также причиной удержива-щего действия цитокинина, поскольку уменьшает концентрацию подвижных метаболитов в транспортном пуле клеток, что приводит к торможению оттока веществ из листовой пластинки.

Выводы:

1. Разработана и описана модель для изучения действия цитокининов на транспортные процессы в листьях на уровне флоэмы и мезо-. филла. Проведено сравнительное изучение транспорта и распределения веществ в изолированных листьях тыквы с открытой относительно мезофилла, терминальной флоемой и бобов с закрытой флоэмой.

2. Экзогенный цитокинин тормозит базипетальшй отток веществ из листовой пластинки и индуцирует их приток из необработанных частей той же листовой пластинки у растений как с открытым, так и с

закрытым типом терминальной флоэмы.

3. а) Торможение оттока веществ в обработанном цитокшпагок участке листа не связано с качественными изменениями структуры клеточных стенок клеток - спутников терминальной флоэмы (протуберанцев оболочки у бобов и плазмодесменвдх полей у тнквы), однако этот процесс сопровождается рядом изменений в ¡метках - спутниках: -появлением миелиновых тел, укрупнением каналов ендоплазнаткчеслого рети-кулума, конденсацией митохондрий у тыквы, уменьшенною парциального объема протуберанцев оболочки, увеличением парциального обх-о.ма вакуоли, декондексацией митохондрий у бобов;

б) торможение отток;-« в местах аппликации цитошазша кг схетано с изменением функционирования мембранных мзхшазшз 'яэрзсэса сздеотс, поскольку фузшсокцяи - активатор апошюстнчэскоГ. - облада-

ет удерживающим действием и кэ уменьшает удериайящки э.а^-экт гшо-кшша;

4. а) Индукция "цятокшшном притока взщасп нройсходагс в ог-оутствш образования новых праводяшдх аяом-эктоь к созшпшо-вэния "бегущей волш разгрузи! флоэмы";

б) разгрузка веществ в обработанном цитокшишом участию лисус происходит баз участия системы активного переноса !ьпзогп из фяовмх шзофшш, та1: как ингибиторы 1Г'-лТФаж шшдоос..? &с влзог величину "еффэкта аттрагироваи^'-'.

Б. Шшшю щягашшш» к» •«-лнепор? аовшвввтх с листо оиред'.~ ляется действии оихокдош- г;е клатхги шзофшшаг

а)' тормошше оттока связана со енпждагом кюцртрацнв трашгартш: форы ■ углэрода в вдтошшУ'..е ;аогок кезофшша к продотерещеншы о-з попадания в транспортное рчеяо вследствие сшиега полккерннх вз-■щэстб;

б) аддукция цэтокшашом арзгокь веществ к местам его шюшкшшт происходит в результате сшшшя осмотического дамошя 'в клзтках мэзофгхлла этих гол к создания подояетельного градаепта осшхичоско-го давления ывкду доноршш п акцвпторнш участками люта. Причина» снюкенпя осмотического давления- является происходящие, под действием цитокшаша уменьшение рН алопласта и индукция роста клэток растякэ-гсениам, а таккэ активация синтеза Бысояоцолиморшх веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ronjina Е. S. The Effect of ВАР and IAA the Distribution of HC-sucrose in Detached Leaves//Vth International Youth Symposium on Plant Metabolism Reputation: Abstracts. — Bulgaria, Varna, 1990.—P. 75.

2. P о н ь ж и н а Е. С. Действие экзогенного БАП на содержание эндогенных цитокининов в изолированных листьях//Тез. докл. научн. конф. — Уфа, 199). —С. 34.

3. Роньжина Е. С. Изменение баланса цитокининов и абсцизовой кислоты в онтогенезе листа//Тез. докл. научн. конф.—Уфа, 1991.—

4. Роньжина Е. С. Влияние цитокининов на транспорт 14С-сахаро-зы в изолированных листьях тыквы//Тез. докл. II Всесоюзн. съезда ВОФР.-М., 1992.-С. 184.

5. Роньжина Е. С. Природа индуцированных цитокинином ростовых процессов во взрослых изолированных листьях // Тез. докл. конф. молодых ученых. — Киев, 1992. — С. 38.

С. 35.

Объем11 п. л.

Тираж 100

Заказ 2308.

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44