Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные изменения мембран стафилококов у заязку зi стiйкостю до антибиотиков

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные изменения мембран стафилококов у заязку зi стiйкостю до антибиотиков"

.АКАДЕМ Ш НАУК УНРЛШ ШСТИТУТ 'ШРОБЮЛОГН ТА В1РУСОЛОГП 1м. Д.К.ЗАБШОТНОГО

На правах ругспиеу УДК 579.222.6 : 579.861.2:615.33

ОРЯБ1НСЬКА Лариоа Боряо1вна

СТРУКТУРН0-ФУНКЦ10НАЛШ ЗМ1НИ:МЕМБРАН СТАФ1ЛОКОКШ У ЗВ'ЯЗКУ 31 СТ1ЙК1СГО ДО АНТИБЮТИК1В

I

03.00.07 - м1кроб1одог1я

Автореферат

даоертацН на здобуття яаукового отупеня кандидата 61олог1чнйх наук

КлГа - 1994

Робота виконана на кафздр! м!нроб1олог!Г Дц1пропетровоького державного ун1вероитету.

НауковиЯ яер!вник: аяадем!к АН ВШ УкраГяи, профеоор В1нн!ков Альберт 1вановЕЧ.

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б!олог1чних наук Соколов 1ван ГеоугМовпч,

иандлдат б1олог)чних наук Назаренко Волс^.ыир 1иановкч.

. Пров1дна уотанова: 1нотн-ут еп1де(Лолог!1 1 1нфекц1йних ззхворввань Громашевоъкого.

Захист в!дбудеться "</& " _ 1994 р.

б_годин ла зас1доян1 спец1эл1зовано1 вчено! рада

ДО 16.06.01 при 1нотитут1 н!кроб1ологП ! в1русолог1! !м. Заоо-лотяого АН УкраГни за едреоога:

252627, ГСП, Ки!в-143, вул. Заболотного, 26.

3 дисергац!си можяа ознзйоыигись у б!бл!стец1 1нстагуту м1кроб!ологИ I в1руоо!.ог1! 1м. Д.К.Забологкого АН Укра!ни.

Автореферат роз1сланий

. Вчений оекретар впец!ал1зовано! вчено! ради кандидат с>1олог!чних наук

* Бур1лз Лариса Михайл1вна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Ак?уплг.п!сть робота. Ноконтрольоваис ьлкористаиня пптиб1отп-к1и у медицин 1 та ветер!нарН привело до полей t шэпдкого розвовоюд-еоння от fЛиих до лих ы!крооргеш!зм!в, серед яких особлоу трупу • складами стэ.фiлококи.

Пла<ш<чн!оть Mateóostsu? стаф!яокок!я дозвояяз !м приетооува-гиоя та вироблятт", заообц захясггу одночасно до я1яькох антп01отпк1в, а так os антисептик!в га дз:Г!лф!куючпх 1?зсоб1в ( Lyon, ßlnirray , 1981). Не прявводить до знякенгя ефектпЕяоот! л!куваяяя багатвох захзсрвзань, що дозволяй розглядатп е,т!йк!сть до знти6(отйк!в m одяу з актуальних ьроблем сучаоно! м1дро01олоо11 та кл!и!чно! медицина.

Гп-меяо, що виннкнення ctíékoc'pI до ;:!к!в у ы1кроорган!зм1л Tinao ,,'з;язане з! зм1нама !х обм1ну речовня. Неэважаачи на то, що в достатня ь*лы;!оть публ!кад1й а д!eï яроблеми, ряд пптань, особливо в гаяуз! молекулярпих механ!з[д1в píIííkoqtI, латаагатьоя до к!ндя . не з'ясованиг.ш.

Для 80-90-х peni в вдаствва л!дсплзяз увага до деядпх яових ас---пект!в антвбкгикорезистенгноот! э позпц!! впзпаняя рол! дооперазда-яих азаелод!й во1х захноних онотем в одя'.й кл!тс1! (Навас.п, 1990). В зв'яэяу з цим сл!д було чекати, со зпачна частика б!ох1.ч1чпг.х про-део1в, цо супрсводхсують антиб!оиикор5з:1стентв1оть, будв зсоередазиа в мзкбран!, з якою, як в'.домо, пов'язано багато вакливкх для яиття функц!й ял!ган м!нрооргая1з.>Ли.

Остаян!и часом мембрану розгяядавдь ! яч иайзожлгш 1шу "м!взнь" дíï аитибактер^дьних спслук, так як окр!м вращения кондратно-функ-ц!опально! оданнц!, аптиб1отпки вкявляють р1зно1.1зн1тиий в пли у на оак-тер!альну кл!тину.

За в!дсутн!стю сиотешшх дапнх про роль мем0рани,ят{ одного з фактор!в, що обумовлшть антпб1отиксрезйстентн!ст1>, вшзчешш прег!,с— oíb, що прот!кають в н!Я при формуванн! захпених ыехан!гм!в та врлй~ в ont акткбактер!альЕ'.их ополук межуть мати велика заачзшш для псиу-к1в рац1ональнах метода боротьби з антиб1стикост1йкини штачанц oía-ф1локон1в.

Мета^дзно!. уоботи. If и ходячи з вашеяиялздеиого, г.'етса неса'о до-сложения стало пор!пияльне вкычешш мембранного апапзту кл!тил ста-ф!лс-кокк!в за ьабуття Тми ctIükóctI до зити61отия!е. р.;^я!ьон1я поставлено! ;.:ети .егшглла роз;''язанкя таких задач:

- розроб'ги нов! ефсктивч! ывтодл деа1итегргщ1! ял!тин стафзде-

коку та Евд1лення внутр!зньокл!тишшх структур в нативному стая!;

- вивчити ссоблйвост) функцtонувзння мембранозв'язаних ферментов лаидюгу переносу електрон!з те трансформацИ енерг11 в кл!тина.:

■чутлавого та отШких до антиб!огик1в штам1в стаф!лококу;

- визначити особливоот! х1шчяого складу мембран стяф! лскоку у зв'язку з! CTÜiKlcra до внтиб1огик1в;

- провести пор!вняльне дссл!дяення впливу пен!цил!ну, тетрацик-я1ну, еритром1цину та хлорамфен1колу fia фуиш1онугания ыембрснозв'я-ааянх фернеят!в систелш енергозабезпечення кл!тин стаф!лококу.

Паукова новизна. Представлен! прям! екопериментальн! докази участ! мембранних структур у фсрмуванн1 ыехан!зм1в аятиб1откяореэис-теятяоот!.

Вяеряо показано, то здобуття стГйкост! до ц!лого ряду антиб!о-тик1в у отаф!локок!в пов'язёно з! зм1нами фупвд!онування фермгят1в дихального ланцлгу, х\и\чпото сх{ладу та пронинливост! цитоплазма,, • ¡гЫ иемйрат. BKasanf зм!ни залезали в!д природа генетичних детерм!-наат, кодуотих стШисть до антпб1отик!в.

Виявлено в плав аптиб!отш;!в, що лрягя1чують синтез б1лку та компонент !в ял1ишяс? otJpkk, на проявддив!сть мембран та функц!оау-вання ряду камбраиозв'язаиих. фермент 1в.

Розроблано ефевтизпий катод дез!нтеграц!1 кл!тия стаф5дояоку з вянориотаиЕям ферментного препарату ш'таыу Actinomjces récifensis. vor. lyticus 2435 та запропонован! схеми одержання кл!тшших ст1-нок та цятоплазиатичних ьеыбран кл1тин стаф!яококу.

Практичкп значим1пть робэтп. Дан!, одержан! в робот!, дозеояя-ють оц!шш! роль ыеыбрани як об'екту д11 аятйб1стак1в i як структура, з як он пов'язайо ряд ланцюг:1г кахан!зыу ctîôkcot! до антйб!оа'щ(!в. Це треба враховувати при розребц! ыетод!в рац!онально1 антиб!отико-терапН та пошуков! йових х!м1отерапевтичних препарат!в, об'ектии д!Г яких ыожуть бути чембранн! структура.

РозроблениЙ метод дез1нтеграц!1 кл!ти5 з використанням ферментного препарату птам. Act. reciloaclr, ver.ljticuc • 2435 пррадтмий для одержання 1нпшх вяутр!шньскл.1иш1тх утзорряь, вклзчаючи генетич-ний патер(ал кл!ткн (Бабанко, Оряб!ноька, 1990), шо uose знайти строке використаяня при вкачена! <НологИ стаф!локок!в та îx генетики.

Препарат кл1тиннйх ст!нок та цитоплазматичних мембран вид!лея! фериентаийним методом, м о-суть бути викоркстан! для шп. чення !х структурно! оргаяЛзацП та хШчиого складу,'а такos бути ыоделлю при вивчеян! механ!з.уу д!1 ряду аятяб!отак1в та фермент!в.

На захнот вияооягзоя основа! положения дасертац1йво! робота:

- розробка метод1в вид!лення субкл!тикг:лх структур з викорио-танням ферментного препарату штаму Act. reoifenai3 var. lyticua

24s5;

- зм1на активноот! пов'яззних з мембранами фермент!в снсргоза-безпечення ил!тин стафхлококу за набуття от1йнсот1 до антаб1отик!в;

- паявн!сть зм!н цитохрсмного складу та зм!ни к1нетнчних влао-гивосгей тер:,)}пально! сяопдазп та АТФ-г!дролаза в мембранах ",т!йких штш.'Лв;

- генетиздо детерм!новая! зм1н^ у б!лковому та д(п!дноыу ак/га-д1 мембран кл!тин стеф1локоя!э; ,

- д!я пзн!дил!пу, теграиаял1ну, хяорамфен!колу та ерктром!цпяу на мембранний апарпт клСтин стаф!локок!в.

л1тсобац!я робота. Матерtaли даоертацШяоГ роботи прэдотзэяялд-ся на п!дсумкових иаукозих'копфзреяц!ях Ди1лр<л1е?ровоь8ого дергявно- «. го ун1верситету, на УП з'1зд1 Укра1поького м!кроб!олог!чного тоза-риства (Черн!вц!, 1989), па копференц!ях "Рогуляц1я м!кро<5иого нота- ' бол!зму" (Пущино, 1939), "Молод! вченt - б1отехяологИ" (Моокза, 1989), "Проблем« хЬЛотерап!! базтер!альяо! IкфекцII" (Москва, 19ЭГ), на М (парадному коягрео! fifoxfnfnfB (ГзраГль, IS9I), па 21 з'Гзд! febs (1рланд!я, 1992), на У1 з'?зд! Укра!ноькогЬ б!ох!м!чного тоза-рпства (Ки!в, 1992), на Нейстояеьяому симпоз!ум! з молекуяярно! та кл1ткпно! б1ояог11 (США, 1992), а иное на УШ з• IздI Унра1 ноького м!кроб!олог!чного товариства (Одеоа, 1993).

Публ1кац!Г. Результата доал1дагань опубл Ьсован! в 14 роботах, 5 рсб!т подан! до друку.

Структура та обояг дасертац!Йно? робота. Дисертоц1я викладенц на гоо стор!гшах друкарського тексту ! складзатьоя з ватупу, огляду л!тературн (2 роэд!ла), екоперимеятально! чаотвин (5 розд1л!в>, заключения та bbchoekIb, Дисертвц1я ¡люстроаака 25 таблицами та 27 ма-~ люнками. Список викориотано! я"!теротури н!о?ить 285 ддерея в1тчйз-няних та !ноземних автор1в.

НАТЕРШИ ТА ЖГОДИ ДОСЛЮТННЯ

Об'ектом досл!гжень Зуло вияориотаио Btr.puyloco^cuo оцгеии 209, а також ряд штам1в ста?илокгч$в Гз музео культур [[¡U eu'senlc-логН iu. Н.В.ГамалеГ АМН Pcclf, з «Iдомов молекулярко-б!олог!чиоэ характеристике». Штам 8325-4 був бйх1дн;:ы для отриыання лвтопааа трансдуктпнт1в, шо неауть плаэм!дя та фаги. Оирешувания ил!тии с?а41~ док оку проводили на KU при температур f i;7° С протягай 18 годая (до

а!ндя логарифм1чно! фазл росту).

При вивченя! впливу антаб1отяк1в на фермента еноргозабезпечен-ня кл!тип воли вносились в живильне сзредовище в суббаятер!остатмч них тнцентрац1ях, що складають для тетрацикл!ну 0.CS мкг/мл, хло-рамфеп1колу - 1,94 мкг/мл, еритром!цину та пен!цил!ну - 0,03 та 0,075 мкг/мл в!дпов!дно.

Бивчення процеогв обм!ну проводили на Франц1ях мембранних везикул, одержаних при улыразвуков!й дез!нтеграцН га ферментативному г1дрол1з1. Ферментативная л!зпс здН'снювали з вияориставням препарату штаму Act. reciteosis vas. lyfcicus 2435 ври t° 37° С. Ульггч-звукову дез1итеграц!ю проводили на диспергатор! УЗДН в1тчизняного внрсбнпцтва та un -II виробництва Полыц!. Обробка ультразвуком проводилась протягом 15 хеилия, з !нтервалсм 30 сек. £<ракц!ю мембранних везикул одержували за допомогою дпферевц!йного центрифугування озвучено! суспензН при 22000 е протягом 60 хв. для ооадження незруГхи ланях к л 1 тин та великих кл!тянних фрагмент^, та е^и 144000 g протягом 70 хв. для ооадження мембран.

Швидк1сть поглинання кисни мембранами бактер!й назначали на по-лярограф! LP -7 (ЧеЮ-Словаччина) за допомогою заирнтого платинового електроду Кларка. Константа гальмувакня назначали в координатах Диксона ( Vinogradov et al. , 1980). . •

Активность мембра.чозв'язаних дег'1дрогеназ впзначали за в!днов-ленням 2,6-дихлорфенол1ндофенолу на Speoord uv vis (Шмеччина) при 660 нм (Островсьяий та 1нш1, 1968).

ДиферонЩйн! спектрк поглинання цитохрои!в реестрували на спектрофотометр! "вос»ап DO -8" (США). Цлгохродга в !дяовлгазали дат!о- ' hItom натр!ю. СО-спектри запьсуаали п1сля пропускания СО протягом 30 сек через розчпн цитохромп, в!дневлеяих диакон!том натр!я> Шсея-кова, Мохова, 1964). '

К!траредуктазну чктилн1сгь оц!нювали за накопиченням н1трят-!он!в в культуральн!й р!дин! за методом Бурлакевег (1972).

Активн1сть ыембганэзв'язано! АТФази визпачали за прирос-"ом ис-орг-ч!чного фосфору при г!дрол!з! АТФ (Сямакояа та !нш!, 1968).

Б!лок, у фракц!ях мембран визначалм за методом Jloypl ( Lowry , 1951) та Groen-serg (Ï982).

Розд1лспня 61лк!в мембран кл!тин стаф!лококу проводила методом електрофорезу в псл1акрилам1дному reni в прасутност! дсдецилсульфату , натр!ю за методом 7вЪвр та Osbora (1969)'в модиф!кац!Г о> farral (1975).

Обчнсленкя воказш1к!з под!баост! б!лнових спскгр!г проводила

за методом sneath (IS63). Коеф!ц!8Нти под!бкост! представляли у вигляд.1 ояметрично* в!днооно д!агокая! нагрнц!, яку п!дкавала.нук. -ричксму анал(су методом одинарного зв'язку (Малашенко та írrjí, 198О).

1кфрачервон! спектра сухих пл!бок мембран гя!далп ко лрилад! Spccord 75 IR • В!днссеняя смуг поглипаин" проводили sa Балами (1963). Розрахунон проводила за сптачной гуотияся смур поглаваяня сигнал!^ Ам1д-1 (КОО см"1), сяладноеф1ряого зв'язку у фоефол!п!дах (1740 cm_í) i али1льнах ланцюг!в зпрнах кислот (2S29 см-1) (Остров-оький, 1973). Якстракц!ю л!п1д!в зд!йсяввалп за методом Polch,lasa (1957). Денслгометрувапня нейтралах л!п!д!в проводили на лазерному денситометр! KB ulteescan XL (США).

Виявлоння фосфат:.!îcTHiiX л5л!д!в зд!йснзвали методом Васьксгоь-иого та Коетедьяого (гл. Katea , 1972). К1льк1ониЙ bmIot фосфолИН-д!в у зразяах впзпачали за методом aoriacii та D&utichs (1983).

Проянклаэ1оть мембран кл!тин визначаля за виходом низьяомолеяу-лярних сполук, Hid мають максимум поглипэяпя при 260 ras.

Стстистлчну обробяу результат1в njсводили за методом Сепетл!е-зо (1'ЬвЗ ).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ÍX ОБГСВОРЕШЯ I. Одержяння мембран кл i тип стаф!лояояу з .впнорвомпвям ферментного препарату штгму Act. rooifoiwls vop. lyticue

Методичн! труднещ! одеряашш чпотого препарату мембран, пов'я-зан! з особливостяки будови кя!тинноГ ст!яки стаф!кококу, потробу-ють пояуку пових 33C06ÍB дез1нтеграцП кя!тия, як! доьвояяпть збз-регти ц!л!стн!сть та висоянй р!вень fx фдрментатавио! активное?!,

В робот! приведен! дан! про п!дб!р ептишльних умов л(зиоу кл!-тин стаф!локску фермэнтяим препаратом штаму Act. recifonaie vor, lytíous 2435 та факторах, що п!двидувть адтявн!оть цього процзоу. Проведено пор!вкяльнэ вивчения ефеятивиоог! дез!нтегрэц!! оуо-пенз!Г кл!тин стаф!лскоку ультразвуком, л1зоцимсм та прегяратом ита-ыу 2435. Показано, що уяьтпазвукова обребка забезпечувола руйнуванья близько 68$ кл f тин, л!зсцем л яощентрзцП 100 im г/мл при 3-гогияз1а дН л!зував не б!льше як IG» ил!тня. Вигористання ферментного препарату штаму 24Б5 прстягом дього пер!оду п. шодило до практично талого руйнувакня кл!тян стафЬчоиоку, Гояередяя ойробия нл!тич прогя-гон 5-15 хв. розчинами NaOff (0,05-0,5 H) або iracTeï.ha-JIOÏ '0,010,1 М) та SDü (0,01-0,02 1Í) сприяяо и1двиясинв fx чутлилост! до ферментативного г1дрол!зу в 2,0-4,7 рази тл дояволи/ сяорствтз ">5а л!зису з 3-х родин дт 5-Г5 при теипеозтур! його пу.саедеиья f.fi'с

I до 90 хв. при температур! 37° С.

На оояов1 них досл!джень розройлен! метода вид!лення фракц!й цитоплазматичнгх мембран, що включапть попередню обробку кл1тия, ферментативной г!дрол!з та диференц1йне центрифугування (мал. I). РозроблениЙ метод ферментативно! дез1нтеграц1! кл!тия стасМлококу на данному етап1 досл1дження иоже використоьуватись також для отрп-мання фракцН кл1тинних ст!нок. Вих1д кл1тияних ст1нок при п!д1бра-шзх нами умовах склав Цитоплазматичн1 мембрани збер!гали актив-н!оть ыеыбранозв'язаних фермеят!в та висояий р!веяь вы!сту цитохро-м1в (табл. I).

Мал. I. Схема вид!леяня мембран та кл1тинних ст!нок 1з ил!тин стсф1лококу з використаняям препарату штама 2435

Таблиц* I

Питона актива1сть систем еяергстичного метабол1зму та в?л!сту цитох|->м1з в препаратах аекбраа з. аогеиз

пгана'209 Р

Метод НАДН- Дег!дрогеяазяв АТФ«, аза Цы шможь/ ;охро!ла,' мг б!дку

руйну-ваяня окои^ налаг|®^"| НАДО

каза* и 1 « 0

Ультразвук Фарнент-нии препарат 300,0 +92,4 220, С +33,6 2Э.4 12,2 160,8 +6,4 +2,3 +41,4 ~6Д 12,0 131,1 +1,2 +2,5 +36,1 1,8 +0,2 ~3,24 +0,4 0,46 +0,09 0,53 +0,11 0,17 +0,04 "Ь ,20 +0,03 0,20 +0,06 ~0,26 +0,04

ь "?<ол!в оуботрату за хз. па кг б!лку; И ,.--шол1в Р1 на яг б'.ляу з* годмяу.

Одержан! дан! ев!дчать про перспектива изть зипориотання л!зо- ^ ензимпого прзларзту атаму 2455 для дез!втеграц!1 йл1тйи стаф!локску та вид!лення сускл!тийних структур, Ми гадаемо, шо рсзроблев1 .метсу дз можуть буга з уситхом вняоркстан1 для одерзакяя ведомостей про суЗм1кросксп!чи! зн!кн бзктер!алы;пх отруктур, «гЛ пдЛйсггаятвоя п!д д!еР протим!кробнпх сполук,а'таяож з результат! формувапяя вахпонпх до рих нехан1зм!в.

2. Активн1отг> неыбрзнозв'язапнх фернепг1л опергозабезлочоння ка!тин стаф!лояоку у зп'язку з1 от1Як1ота до зн1иб10тйя!в

Виходячи з постаЕлепо? перед няни задзч! внпгпсгшя рол! мембранного апарату отаф!локок1в в процзо! розвчтну антиб1отидоот1йгоот!, була проведена сц!нка систем еиергзгп«иого метабол!зыу за 1твпаав-я!стга гавидкост! окисления р!зпиг субстрат!в в мембранах чугливих -.я от4йких до антиб1откк1в штам1в стаф!локся1в.

Ми намагал-»оь з'ясувата, чи. е взавмопп'ласу м!з активн!от» да-тальчих фермент 1в з5 ст!йк1отл> до антиб1отяк1в та природой ге«»тяч№?. детерн!кант.

В робот! показано, ко !птродукц!я I. .азм!д рвз.".атентяоот1 в аут-лввий до анткб!итик!т; атам стаф1чококу 3325-4 забезпсчуваяа Б-31яыгвн-ея на Ю4-30СЙ вшидкост! окисления оубстраг!в 1Ш'Л, ыа.тзту, оукцяяв-ту, 1втеясиф1яац1ю ыехан1зи.я вЬчиовленнк я1трат1в г 1,11-1.40 1 зниженгя активном! деяках дзг(дрогеназ ЧШ (табл. 2). Мсяливо, сэ

Табллця 2

Пита-« яктибп1сть систем ензргетичаого метабол!эму та вм!сту цитохром'ш в * препарата:-; мембран чутливого та от!йлих до аятиб!от1ш1в штаа1в В. аигеав

Штаы Сг1й-к!сть до акта <5(о~ ти»1в Окспдазл, пмсл1н Си, за на Дег1даогеназз, нмол1в субстрату за хз па мг б!яку Цптохрсми, нмол5в на мг б!лку

НАДН .палат су^ця-нат НАДН палат сукщ наг в а 0

1 8325-4 . -НЪТ-3 То Н1Я-3(52А)Тс МЬС-З Со ИЬС-3(52А)Сп Его 994 ' Еп Его 994(52А)ЕВ Ер -ь Ей,Те,Рв

Ш) В-

РОТ 101 "Рп

ггТС.Р^

III ,5+9 253,4+30 245,0+10 334,2+22

149,7+10 «

167,3+20

152,е+п 160,5+16

2Э.8+? 27,5+2 55,6+6 38,0+2 63,8+7 40,с72 58,3+3 41,3+3

40,5+2 35 ,0+2

31,6+1 31,8+1

2С8,8+15 200,1+13 181,5+24 134,1+28 140,4+21 160,3+11 164,8+29 145,6+41

25,4+7 8,3+2 14 12,4+4 20,1+5 4,011

15,7+2 8,9+1 19,1+5 18,1+4 6,7+1

4,2+1 8,8+2 3.9+1 6,3+1 5,1+1

1,33+0,2

0,93+0,03

0,87+0,06

1,07+0,09

0,86+0.09

0,32+0,06

0,26+0,09

0,67+0,10

0,88+0,2

0,341.0,06

0,15+0,04

0,23+0.07

0,15+0,03

0,1бГ0,04

0,10г0,02

о.зг+о.ое

0,439+0.06 0,435+0,04 0,399+0,04 0,489+0,08 0,399+0,05 0,362+0,02 0,344Г0,03 0,507+0,07

34,0+2 - 134,5+12 19,6+3 5,1+1 40,0+2 28,8+1 84,4+12 23,5+5 10,3+2

0,62+0,12 0,17+0.03 0,344+0,03 1,10+0,2 0,33+0,08 0,435+0,05

Тс - тетрациклин, Сэ - хлорамфеи!кол, Е-,

еритро.лцик.

- пен1шл!н.

виязлея! sai 1 ни аптивност! дихальяях систем маягь б1олог1чяа*1 ~;Лст з точки зору забезяечення функц!ояування кл1тин в nprcvraocT! виооких концентрац1Й антяб!отш;!в. „

Проведений я!петлчш!й анал!з впллву д!ан!ду кэл1э яа аяпзвн i сть НАДН-оксидазяо! система мембран дозволив виявятя зм1ни на р!вн! тзр-гНналыю! оксидази зэ набуттям ctÍííkoctI стаф!локаду до антяб!отпк!в. Змеиионня констант гальму^ання активное?! ояио'яеиня НАДН в 1,4-2,4 рази мембранами отШшх датам Ib можна поясяити я1двйл.оняям у яих коя-центранП в!дновлеяо? форми цитохромоксида 'Я, яка зв'язуе !яг!б!тор ( Kauiraan , Golder . 1974).

Для он i нки рол! *ií3ffi!x компонент^ електроптрзнспортаоГ оястекя як склздсвоГ чзстинп механ!зму с!йкост! до антиб(стпн!в було проведено пор!иняльне вивчепня-як!сного складу та к!льк!аного вм!оту ця-тохром!в в препаратах мембран, чутливпх та ст№<их итом1а.

?еестрац1я дафзренц1йних (в1дновлених дит!оя1тоы протл екпе.та-ного поа!трям) спектр!в погляпання cniiy дозволила зяязитч а мембра-—х aolx доол!дг5уваяах птам!в цитохроми а 1 в. Диферевц1Ян! опеятри кс.чплексу з СО виявияи прясутн!сть питохрому о. 1ятродукц!я геветач-них детерм!яаят в 'хл1тищ. чутлпвого шгаму забезпечувага ■ зсуз диферзяц!йних максимума поглинання для питохром!з в 5 о та прПЕода-ла до зниження питомого вм!оту цитохро.м!в a i в (табл. 2). -3i.il.чп опеятральних характеристик мембран св1дчзть про наявя1оть ял Soso !н-еих дятохромлях компонентов або про зм1нн у сп!зв!диоиеня1 цитохро.м-них компонент^, шо 1скують р мембранах батьк!воького штаму.

В1до;.ю, до в результат! фугащ! свувэння дихального ландягу у кл!типх утвериэтьсп АТФ то !ка1 макроерг!чн! сполуки.-З метой оц!н-кн !нтенсЕв;юст! синтезу Л7Ф неж була назначена АТО-фссфог!дролазна актавн!сть мембран стэф'iokokíb у зв'язку з! ctíü'.íctej до анткб!сти-к!з. •

Проведен! дссл!даення покезали, то мембрана втаф1локок1в нега-' лежне в!д штамово? налемост! маля АТФазну активн!сть, оптималья! умови д1Г яко? проявлялись при pH 6,5 ! температур! 45° С. Однсва-лентн'! патгони к1" ia IIa4- не отшулювала аятяэя1о!№ ферменту, яя це було показано для кд!пщ 1штах м!кроорган!зм!в ( киЪак, Yotis , I9SI). Аналогично впливали ¡они Ca24. Разом з тин, i они М , внесен1 в се-редовиЕ-э для 5якубац!г в кощеятрадН 4 Ш, викликалт» 3,1-1?,8-крзтну агаиу.тац!ю АТФазяоГ активном1!. ЕфеитМд* копна сп!вв!дяести з Яого здзтя!стэ утворгаатя хелатниЗ комплекс з АТФ, ккий с 1станнвм. оуб-. стратой для баятер1алытх АТФаз ( ota , Horishita , IS56).

Зв'язана з кеыбранои АТФаза ус!х досл!дкуваних штам!в проявляла чутлив1сть до инг1б!тор!в ЫаР, аз!ду нагр!в 1 ЫЛ^-дицикло-гекс1лкарбоди1м!ду (ДЦКД), що е опециф!чш'м 1нг!б!тором протонних Ах'Фаз.

Незваяшотя на под!бн!сть у в!дношенн! ряду к!нетичних параметра АТФазно! реакцП, мамбраии чутливого штаму. в!др!знялись в!д мембран от!йках до-актиб!отик!в кл!тин стаф!лококу. 1нтенсиф!кац!я швидкоот! г!дрол!эу АТФ мембранами ст!Еккх кл!тин у 1,3-2,5 рази, а так'ож зб1льиення чугливост! ферменту до ДЩ<Д у 1,04-2,25 рази могли св!дчити про б!льиу 1нтеноизн!сть енергетичного м.зтабол1зму у зв'яг-ку з. виникненням ст1йкоот1 до онта61отшив.

Приведен! Дйн1 св!дчать про.те, ас набуття кя1тинрда стШкост! до антиб!отик!в внасл!док 1нтродукц1Г плазму резкетентноот! пов'я-зане з! зм!ною комплексу функц!оналыц1Х властивостей, що сг4впряке-я1 з процесами еяергозабезпечення кл!тин. Характер цих зм1н визнэ-чався природою геаетичних детерм!нант. Показано, що. штами стаф!локо-к!в, л!зоген! за фагом 52А, в1др!знялиоя в!д !х пяазы!дяих ,гтр!ант!в. 1ранодзкц1я фагу 52А забезпечув'ала знпешшя р!вню активност! ЯАДН-оксидазно! сиатеки, к!траредуктази та АТФаг.и, ко могло ов!дчигй про вплйв цього ганетачного фактору на ызтабол!чя! процееа кл!гшш.

3. Особлавост! складу мембран чутлавого та сг!йкех до 'антиб1отик!в птшЛв стаф!докск1в .

Ака.ч!з ллреляц!! и!п атупекем. зм!н функц!онування зз'язаних з мембранами фермент!в та природою резистонтност! дозволив долустити, ио меябранн! структура, вгягнен! в систему реал!зац!1 гепетичяоГ !н-формацИ, що ы!статься в гечах антиб!отикорезистеитноати.

■ У зв'язку з циы, пров!дним напрямком подальших досл!дкень стало пор!вняльне вивчення х!м!чного складу мембран чутливого та ст1йких до антиб!отик!в штам!в стаф!локок!в.

Проведен! дос.л!дкення показали, что б!лки мембран ус!х досл!д-Еуваних итагЛв при електрофорез! з додецилсульфатоы натр!ю розпод!-лялиоь на фракцИ з ыолекулярНЕьа ыаевми в!д 10 до 170 КД, що в!дпо-в!дае л1тературним даним для мембрзвних б!лк!в 1нших шта»Лв стаф!ло-кок!в (Григорьева, Лукоянова, 1981). Набуття ст!Йкост! супроводаува-дооь зб!льценняа б1лков'.;х фракц!й в1д 26 до ЬЬ коипоионт!в. 1ндив1-луьльа!от' б1лхових спектр1в мембран п1дтвердкувала наявн1сть нових б!лк!в, пов'язг.пнх з гезл!зац!е:о резистентном! чи втратов здатнос-«I г».,;1л1н спите зу ряду б!лк!в, як! с у <5атьк!воького штела.

Серед доол1джених культур б!лыпою под!бноотп'б1лкових спектр!в хар-ктерчзувались штами, як! несли плазм!ди ст!йкост; до аНлЯб!оти-к1в та 1х трансдуктанти по фагу 12А.

Денситометрування електрофореграм б!лк1в та рпзразпван! показ-ники под!бност1 дозволили нам провести групування досл1дяених культур зр отупенем под!бност! !х б!лкозих спектр!п J одержан! резуль-тати подати у вигляд1 стсвпчато! д!аграми, розрах'овачо! за методом одинарного эв'язку (мал. 2). На д!аграм! ломана л!н!я, ио повднуа досл1джен! штами, являв собою найкоротший зв'язок м!ж ними при яай-алшнх яоеФ!ц1вятах под!бност!.

Мал. 2. Д1аграма, то в!,;ображаа под!бн!ить б!лксзих спектр1в р!зш1х штам!в'стаф!лскоя!в: I - Его 994, 2 -.Его 994 (52А), 3 - N10-3, 4 _ N10-3.(52Л), 5 - ПЫ-3 (52А); 6- ИЬТ-З, 7 - ЕрЬ , 8 - Ер£ (52АХ 9 - РШЯ01, 10 - 8325-4

Вивчення л!п!дного складу мембран дозволяло виявяти особливоот! л!по^енезу кл!тчч стай!лококу у зв'язку з! ат!йк!стю до антиб!отин1в. Прове, ,ея! досл!дженяя показали прису?н)ста у мембранах ус!х досл!д-ч куванкх штам!в стеф!локок1в двсх ялао1э ополук - нейтральних л!п!д!в та фосфол!п1д!з. ФрэдцШгай енлзд ягйтралышх л!п!д'1э був лредотав-лоний моно— ! дпгл1цегт1Дами, фракц!ею в!лытх жирних кислот, тригя!-церидами, такоя виявлея> каротино!дя". та дв! не!дектиф!коЕая! фрак-г». ' '

Показана законом !рн!оть зб!льшення в мембранах ст1йких штагЛв _

фракцИ; тригл!церид!в та каротиноГдних п1гыант!в (табл. 3), що, ыож-яиво, шло великий б!олог!чний зм!ст. Виявлене перевахання тригл!це-рид!в могло св!дчити про зб1яьшення чаотк" нейтральних л!п!д!в, як! лежать в основ! обы!ну фссфол!п!д!в, а також викснугочих роль запас-них енаргетичних речовин. Зб!лыпення вм!сту каротино!днх п!гыент1в ыокиа розглядатга як нопряме п!дтвердкення збагачеипя мембран мено-х!нонама, ягл за данями нашшопй, White (1970) виявлялись у фрак-ц!ях 1;арот.1Яо1дних п1гаент!в.

Таблиця 3

Вы1от окремих фракц!й л!п!д!в та каротино1хлих п!гмент1в . в мембранах чутливого та ст!йких до антиб!отил1в штам!в стаф!локок!в (дан! приведен! в % по в!дношенню до штаыу

8325-4)

Штам От!йк!сть до анти-OtOTHKIB Тригл!-церида Кароти-ногдн! п!гмеяти Кард!о-л!и 1н Фосфй- тидна кислота

8325-4 чутливий • 100 100 100 100

Nl.T-3 • То 128,8. 119,8 119,0 169,6

■ NLT-3 (52Л) Тс 101,8 101Д 113,0 321,7

Его 994 . Ей 172,1 172,5 130,0 ISO ,6

Его 994 (52А) . •. ; Ей 135,1 139,6 121,0 304,0

Ept " •Еа.Тс.Рп 127,9 127,5 ■117,1 143,5'

iipt (52А) Еп,То,Рп 105,4 123,1 115,1 252,0

РцВ 101 Рп 149,5 169,2 120,0 152,0

Nrf-3 , Сш ' 133,3 202,0 - -

NxC-3 (52А) Са 115,3 103,3 - -

не ввзначалд.

Вавчення окладу фосфол1п1д!в дозволило встаяовити, що за складом основнюг фракц!й фоспол!п!д!в резистентн! кл!тини, як1 м!стяли плазм(ди от!йкост1,,-не в1др1знялись в.1д чутливого до антиб!отик1в штаыу стаф!локок!в t включали кард!ол!п1н, фосфатидалгл1дермн, фос-фптидилатаноламtн, фосфатидну кислоту та не!д?нтиф!ковапий фоофол!-п1дУ|.' Л1 эген!зац!я плазм!дких щтаы!в фагом 52А кор^лювала э включениям до складу ы8ыбр,эвих л1п!д!в не1дентиф!ко|-аного фосфол!п!;у У2 I одночаоно» втратог здатаоот1 до синтез? фосфол!п!да yj (мал. 3).

•Роззиток,ст!Г*(оот1 до антиб!отик1в супроводжувався перерозпод!-лом окреми£ фракцЩ фос:]ол!п!д1в у б!к зб!льшзння вм!сту кард!ол1,п!-

ну та фос^атидно! кислота (табл. 3). Не впяличено", ио перерозпод!л у г-;лад! $осфол1п!д!в ноже ойуловлпвагпоя епоокоп мсгябол!ч-:ов ал-тивп1стю них сполук та !х можлирзмя взаемоперетвореннлчи.

Нал. 3. Фосфол1п1ди мембран кл1ткн стаа.1локок!в: I - кард!ол!п!н, 2 - фосфатидплгл1церин, 3 - фосфатидплетанолам!н, 4 - фоофатидна «колота, 5 - не1дентиф1кованн? фссфол!п1д У-г, 6 - не1де.чтпф1коваяпЙ фосфол!п!д ?2

4нал!з.уюча л!тературн! дан! (Белоуссва? 1980), ми припустили, що розвиток ст1йдост! го анта"б!от;:к1в (.,лке супроводжуватись (нтенси-ф!кац1ею метаболНких плях1в, як! в!длоз!дають эа б! синтез л1п!д!в. Анал!з 1Ч-спектр!в покгзав зростання ,в!дношення л!п'дп до б1ляа у кл!ти"ах ст!йких до антиб!отик!в штам!в у 1,12-1,72 рази, що п!д-твердндо наше припуаешш.

Б1дпов1дно до одержашзх нами даких детально було припусалти, що зм!нп в л склад! мог от б сприяти вяншшепка ст!йкост!

кл!тлн стаф!лококу до висеяих кояцоятрацШ антаб'отичних речовин вяасл.док зм!ни фунлц!онально1 либ!льност! мепбраи.

Проведен! досл!дження показали, що '!нтенслф!яац1я лЫдоутво-' рання та перерозпод!л у б!лково-л!п!дному комплекс! приводили до п!двишення фувкц!овально! лаб!льност! мембран ст!йких кл!тия, про що св!дчнло зб!лыоення !х нл1нанно1 проникност1 у 1,4-3,0 рази для продукт !в пуклеотидно! природа п!д вп'ливом екстремальних температур та р!зпих зйачень рН оередовища.

Таким чином, ввявлен! нами особливост! метабол!зму кл!тин ста-ф!лококу дозволяють правустати, що один з ие:ган1зм1в антиб!отикаре-зистентноот! обумовлекий модиф!кац!ею лЫдного та б!лкового складу мембран, що вказус на значн! перебудови мембранного апарату кл1тин отаф!лококу при реал1зацН ыехан!зм1в ст1йкост! до антиб1отак1в.

4. Деяк1 аспект?» механ!зму дЛ ряду аитистаф1лококовах ?нтиб1отик1в

Враховуючи вакливу роль мембрана в ж!ттед!яльност! кл!тини, ми припустили, що вона ыояе бути залучена 1 в систему дН ряду антибак-тер1альних сполучень, первинний механ!зм яких, як вваилось, не за'язаний з мемб^анотропними ефектами.

В таблиц! 4 приведен! дан!, як! виазують на зм!ни в к!льк!сяому вм!ст! цитохром1в та у функц!онуванн1 деяких пов'язаних з мембранами фермент!в при внесепн! пен1цил!ку, тетрацикл!ну, хлорамфен!колу та еритром!цину в середовище вироцування вих!дного штаму стаф!локок!в л суббактер!остати>/них кояцентрац!ях. Вказан! зм!ни, вирог!дно, сл!д в1днеоти до порушедая бЮсинтетичних процес!в в метаболизм! деяких меыбранних б!лк!в.

Таблиця 4

Питома активн1сть систен енергетичного метабол!зму та вм1сту цитохром!в в препаратах мембран s. aureus итама 8325-4, вирощених в присутност! аатиб!отик!в (дан! приведен! в % по в!дношеннэ до вих!дного штаму)'

t АитисНо-тик Копцен-трац!я анти-б1отика НАДН-оксн-даза Дег!дрогенази' Цитохроми АТФаза

НАДН суки? нат малат в 0

— ( 100 100 100 100 100 100 100 100

Пен кил tH 0,0075 68,3 43,8 100 172,4 71,5 50,8 62,3 68,6

' Еритром!ция 0,03 ' 84,6 85,6 41,5 11,0 62,2 23,8 24,6 90,7

Тетрацакл!н 0,06 • 39,6 51,9 92,7. 38,2 131,7 130,2 54,1 70,6

Хлорамфен1-кол 1,94 84,9 55,6 184,1 176,0 134,1 79,4 86,9 .29,7

Порял s тм внеоеуня антиб!отия1в в реакцН:ну оистему, яка м1с-тать мембрани кл!тин, що вирсоли у ¿(дсутност! антиб1отик1в, також доявояилс виявити пригн!чення активностей фермент!в ЩДН-оксидази 1 АТФйзл на 55- Очевидно, що одержана!} ефект не був пов'язочиГ: э ъапрс^ю огп.тезу фермент!в, а мав характер швидко! реакц!! на вве-

дений в систему антиб!отик.

Ми припустили, що ц1 змIни можуть бути обумовлен! поругенням конформац!йного стану мембран пру адсорбцП на н1Й антиб1отяч1гах речовин. Але зм!на прошшност! кл1тич для низьдомоленул^фних сполук нуклеотидно! природи в!дм(чена т!лыш для тетрагон; л! ну та хлорамфе-н!нолу. В1дсутн1сть деструктивних зм!н мембран п1д д)ею пен1дил!ну та еритром!цину могла вкг?,увати на р(знидк) у ступёля зв'язуваняя fx з логерхневимн структурам!! та св!дчитп про 1нлг1 мехон!зми пронякяен-ня до м1кробно! кл!тмни. •

Разом з тим, вирощуиания кл1тин стаф!лох;ску в присутност! суб-бактер1остатичних ксщ,знтрац!й yclx досл1дгених антпб1отлк!з приводило до поруиень мембран, як! пр^являлися у р!Jй зм'.н! проникноо-т( кл!тин п(д д!ек> екстремальних температур. Характер порушзяь мембран у цьому внпадку не буг 1дентичгаш порушенчю мембран при д1! внтибtотик 1в, внесених до середовшца для культурування кл!тин 'in vitro • Можлпво, за!на структурно-фуищ!опального стану.мембрпн с насл!дком виливу суббактер!остзтичних концентркд1й гнтиб jothiUb на метабол!чн! пронеси кл!ткн.

Проведен! дойл!джеппя молуть сг!дчкти про те, шо мембрана вклю-""•на в опстему первшшого механизму д!1 досл1джежх аятиб1отик!в, шо несбх!дно враховуватп при Ix рекомендацН в кл!п!д!.

висновки

1. Розроблзл! метод я г!д!лення препарат 1в нд!тшших с?1нод та функц!опально активнпх Фраки1й цитоплязматичних мембран стаф!локок1з, як! включать пспередко обрсбку кл!тин 0,1 М розчином пиотдГпу-HG.I , наступай" Г1Дрол!з з вжоргстй.чням ферментного препарату штгму Aot. roeifonsis var. lyticus 2435 1 диференп!йнв центржТугування.

2. ?еал!зац!я мехагг!зм!в антиб/отикорезлетентно^т' супроводжу-налась знвжзякяы пвидассг1 дег!друэання субстратЬ ЦТК, зб!льшеяяям • оксидазних i н!тратредуктазно! активностей та п!даишенням чутливос-т! НАДН-оксидазно! системн до !нг!б!тора KCN, шо вказувало н; зм1-на в •eHcpreTHuw.i? "ртябол1зм! ттам1в g. aureus . як1 м!стять плэз-м!ди ст!йксстi до пен!цилЬ:у, те?рацикл!ну, хлорамфен!колу ! еритро-MtoiHj. . .

3. В дахальному ланцюгу вс!х досл)дженнх штам!з s. ai-reus вияв-лено цитохроми а, в 1 п. Набуття ст!йкост! супроводжувалось зиияен-ням литомсго ам|сту цитохром!в a fв та зм!нси спектральних характеристик дитохром!в в ! о. .

4. Встановлено,-ио АТФаза вс!х Д0СЛЙ!ГЭМ1в .S. aureus е* -

Ме-золедаиы форматор, чутливии до tHriök'opis NaT, азиду натр!п га ШКД, з оптимумом д'Л при pH 6,5 та температур! 45° С. Бобуття от1£кост$ до антиб$оиж1в приводило до и1даиаання АТФ-г tspo.uasisof аклшюст! ыеыбрашшх ирзпарат!в в 1,3-2,5 рази та пропорц1окаяьно~ го зб1льше'ш1Я чутливост! фермента до Uiriötiopa ЛЦКД.

5. 1итродукц1я плазм1д резистентност! ! генома фагу 52А в кл1-тини чутливого штаму s. aureus забсзпочувала зм!ну б!лкового про-ф$ла мембран, .и 1дащечкя в 1,12-1,72 рази в1дносноГ частки меибр&н-'них л!п1д1в та перерозпод!л !х вы1сту в 6ik збйшиання кард1ол!п 1ну, фоофатидно! кислота, тркгд1церид1в та Kapowoixiujc пигмент 1в.

6. Ст1йкость до антиб iothkib щтам1в з. üutousиорелюваяя з1 Diiiüoio осыотично! отаб!льноот1 мембран, на що вказувало п1двиаення в 1,4-3,0 рази ix проникливост! для назькомолекулярних спояук нук-леотидно! природа п!д д1его р1зних температур та значень pH серздо-вища.

7. Показана, що суббактер1сстатичн1 концентрэцИ пея1цйл1ну, тетрациил1ну. хлораифен1нолу та еритрогЛцину впливають на актг>вн1сть 5аркент1в електронтрапспортвого ланцюга t АТФазк, а також на меыбрад-ну прошшлив 1сть, що ов1дчить про залучення мембраннпх структур чут-ливого штаму стаф1локок'в до система дИ вказаних антиб1отик1в.

ПРАЦ1, 0ЩИПК0ВАН1 ЗА ТЕМОЮ ДНСЕРТАЦП

1. Бабекко Ю.С., Орябаяокая Л.Б. ферцентннй лизис клеток стафилококка и получение клеточных станок // Антибиотики и химиотерапия, -I9P1. - Т. ХХХШ, й 2. - С. III-II5.

2. Орябияская Л.Б., Вишшков А.II, Активность фермента энергетического.обмена в клетках стафилококков, чувствительных и устойчивых к антибиотикам // В сб.: Всесошзн. конф. "Регуляция микробного метаболизма",' Пущино. Тез. докл. - 1989. - С. 13?.

3.. Орябинокая Гаврилюк В.Г., Вишшков А.И. АТФазная активность

■ .' ога^плококков в связи с устойчивостью к антибиотика«/ // В сб.: УП съезд Л.Ю; Тез.. докл., Черновцы. - 1989.

4. Орябинокая Л.Б., БабенкоЮ.С., Винников А.И. Изучечне возможности использования нового препарата литических фетшентов в аналитических целях // В сб.: Рг:есоюз::. конф. "Регуляция микробного метаболизм". Тез. докл. Пущино. - 1989. - С. 56.

5. Кукушкиь- Н.В., Чсрригор Н.П., Котелегоц Л.М., Орябинокая Л.Б. Применение лне-оэкзимного комплекса 24PL для разрушения бактериаль-шх г четок // Сб. тез. докл. Всесоюз!;. кенф. '-Молода? учеше -биотехнологии",-Москва. - I9f,'£. - С. 4-5.

6. Орябиясчая Л.Б., Бябенло Ю.С., Виннинов Л.И. Использоваяпо ферментного препарата штамма Act; recifonsis vet. lj-Sicue 2435 для выделения мембраншх препаратов из клеток стафилококка

// Антибиотики и химиотерапия. - 1990. -Т. 35, А? 6. - С. 18-21.

7. Бабенко Ю.С., Орябяноная Л.Б. Применение лизоэнзшяого препарата Act. recifenoia var. lyticus 24S5 для выделения ДНК ИЗ клеток стафилококка // Антибиотики л хшиотерайия. - 1990, № 3. - С. 17-20.

8. Орябинсяяя Л.Б., Голодок Л.Ь., Ванников А.И. Активность ме.мс-браносвязанных ферментов стафилококков, содертадих плаз»,гада устойчивости к ряду антибиотиков // Тез. Всесоюзн. конф. "Проблемы химиотерапия бактериально? инфекций", Москва. - 1991. -

С. 480-481.

9. Орябинсяая Л.Б,, Впнников А.И., Голодок Л.П. Особенпооти энергетического обмена стафилококков, содержащих плазмида устойчивости к ряду антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия. -1992. - Т. 37, й 10. - С. 34-37.

10. Голодок Д.П., BIhhIkob A.I., Орябхнська Л.Б. 5м1на структурно-$ункц1ональних параметра мембранних компонент1в чутлизих 1 ст!йких до,антиб!отик!в ста^!локок1в // Урр. б!ох!м. з'Гзд, Ки?в, Видавнвдтво УСТА. - 1992. -^Ч. I. - С. 68.

11. ОрябКчоька Л.Б., Голодок Л.Г., BIhhIkob A.I. Деяк! властивост! ■мембранозп'язано! АТ^ази .чутливих ! от!Ских до антпб1отг.к1в шта-м1в стаф!локока // Укр. 6foxlM. з'Гзд, Кп!в, Бидавництво УСТА. -1992. - Ч. 3. - С. 84.

12. Vr'anikov-A.I., Orysbinslcaya L.B., Golodelt Ь.В. Characteristic-features of energy Motaboliaa in Staphylococci containing р1аз-aids of resistance .,0 золэ anfcibio'tics. Israel. 1991

13. VinniJcov- Goledok L.P., Cryobinskaya L.B., Oberevach ttlv. The merabroneeonnoctert Ш?аее of antibiotics i?eaistanoe staphylococcal strains // 21st FEB3 Mooting« August 9-14-.- Ireland, Bublin 2.-'1992

OryabinaJcuy Ь.В., Vinnikov Л.Х.,Ruban O.V. Gsnstio deterninants of the aeabrane-bound АТРаяо of Staphylococci // Koystcno Sya-posia on Moloculer and Cellular Biology.- J. of Cellular bioc-

14.