Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биофизических основ взаимодействия эритроцитов человека с антибиотиками различных классов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование биофизических основ взаимодействия эритроцитов человека с антибиотиками различных классов"

На правах рукописи

Баева Елена Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОФИЗИЧЕСКИХ ОСНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ

КЛАССОВ

Специальность 03.01.02. — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

25 ИЮЛ 2013

Воронеж - 2013

005531694

005531694

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования <<Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: Артюхов Валерий Григорьевич

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Попова Татьяна Николаевна,

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет, заведующий кафедрой медицинской биохимии и микробиологии

Попова Ирина Евгеньевна,

кандидат биологических наук, доцент, Воронежский государственный институт физической культуры, кафедра медико-биологических дисциплин

Ведущая организация: Российский национальный

исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится 12.09.2013 в 13.30 на заседании диссертационного совета Д 212.038.03. при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 09.08.2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Грабович

доктор биологических наук ^^ ' Маргарита Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Инфекционные процессы представляют одну из самых сложных проблем современной медицины. Возникновение инфекции - комплексный процесс, в котором взаимодействуют агрессивные факторы микроба и защитные - макроорганизма. Роль антибиотика в этой системе также многогранна: она, с одной стороны, направлена на ликвидацию патогена, с другой - на продукцию факторов воспаления - высвобождение эндо- и экзотоксинов, утяжеляющих течение процесса. Стратегия современной антибиотикотерапии, в связи с этим, направлена на быстрое антимикробное воздействие, патогенетическую и иммуногенную коррекцию для ликвидации очага и последствий его агрессии (С.М. Навашин, 1998).

Проблема возрастающей антибиотикорезистентности носит глобальный характер и диктует необходимость рационализации использования антибактериальных средств (В.К. Таточенко, 2002). В настоящее время исследователями активно обсуждаются возможные механизмы взаимодействия клеток макроорганизма с антибиотиками различных классов. Это обусловлено тем, что многолетние исследования в области антибиотикотерапии указывают на проявление антибиотиками как лечебного, так и побочного действия (И.М. Станковская, 1991; Л.С. Страчунский, 2002, Т. Krakauer, 2003; D.L. Brown et al., 2004; S.L. Segelnick et al., 2010; Е.Б. Гршценко, 2011; M.A. Рябова, 2012). Отечественными и зарубежными учеными показано, что физико-химия взаимодействия антибиотиков с клетками микро- и макроорганизмов сложна и не ограничивается прямым антимикробным действием препаратов. Имеются данные о влиянии антибиотиков на фагоцитарную активность макрофагов (Л.С. Страчунский и др., 2002), агрегационные свойства тромбоцитов (Е. Hackl, 2006, 2012), структурно-функциональные свойства эритроцитов (И.В. Калашникова, 2008; Е.В. Хакл и др., 2008; О.В. Золотухин, 2009; G. Kapur et al., 2006).

Выявлено, что величина эффекта антибактериального препарата находится в прямой зависимости с его концентрацией в месте действия, в котором должно быть равновесие с молекулами этого препарата в крови (A.B. Соколов, 2002). Это означает, что оптимальному терапевтическому эффекту должна соответствовать некая средняя концентрация препарата в крови пациента, в пределах которой существует достаточно высокая вероятность получения положительных и низкая вероятность появления нежелательных побочных и токсических эффектов (A.B. Соколов, 2002). Более того, исследование действия субингибиторных концентраций некоторых антибиотиков (к примеру, тетрациклинов) указывает на возможность получения противовоспалительного эффекта без антимикробного (J.B. Bikowski, 2003, 2005).

Учитывая важность структурной целостности клеток, остаются дискуссионными вопросы молекулярно-клеточных механизмов

взаимодействия антибиотиков с отдельными системами макроорганизма, знание которых позволит более точно оценить степень их влияния с целью прогнозирования и минимизации нежелательных реакций.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось исследование биофизических основ взаимодействия эритроцитов с антибиотиками различных классов.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование уровня распространенности и чувствительности прокариотических организмов на примере семейства Mycoplasmataceae к антимикробным препаратам различных классов. Обоснование широкого использования данных препаратов.

2. Изучение структурно-функциональных свойств эритроцитов под действием антибиотиков, применяемых для лечения микоплазменной инфекции.

3. Исследование морфофункционального состояния эритроцитов донорской крови и динамики изменения поверхностной архитектоники клеток в присутствии антибиотиков различных классов.

4. Изучение структурно-функциональных свойств гемоглобина, выделенного из эритроцитов донорской крови после предварительной инкубации с антибиотиками.

5. Разработка обобщённой схемы процессов, протекающих в эритроцитах при воздействии антибиотиков различных классов.

Научная новизна. Исследована степень распространённости микоплазменной инфекции, вызванной mycoplasma hominis, ureaplasma urealyticum среди населения г. Воронеж за 2009-2010 гг. Проведена оценка чувствительности изучаемых штаммов к антибактериальным препаратам различных классов, обусловленная специфичным механизмом их действия на клетки микроорганизмов. Установлено, что урогенитальные микоплазмы наиболее чувствительны к фторхинолонам, доксициклину, джозамицину; наиболее резистентны к азитромицину и рокситромицину. Проведен анализ изменения структурных свойств эритроцитов, модифицированных антибиотиками, применяемыми для лечения микоплазменной инфекции (азитромицин, кларитромицин, рокситромицин, джозамицин, клиндамицин, доксициклин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин). Выявлен дозозависимый эффект взаимодействия антибиотиков с мембранами эритроцитов, определяемый временем взаимодействия с модификатором. Показана химическая модификация белковых компонентов мембран эритроцитов. Выявлено, что исследуемые антибиотики вызывают гетерогенные изменения в популяции эритроцитов. Накопление структурных дефектов мембраны зависит от времени взаимодействия с антибиотиками. Установлено, что по общепринятым критериям оценки терапевтического действия доксициклин вызывает, в том числе и токсический эффект, приводя к изменениям более 50% клеток. Показано, что изучаемые препараты, проникая в эритроцитарные клетки, химически модифицируют молекулы

гемоглобина, приводя к денатурации его макромолекул. Выявлены типы взаимодействия ионогенных групп гемоглобина с функциональными группами антибиотиков. Описаны реакции возможных типов комплексирования между ними:

1) нь02-с00н + 0н-аб-+ нь-0-с(0)-аб

2) ню2-№12 + о = с-аб-*нь-к = с-аб + н2о

3) ню2-№1+о = с-аб-+нъ-м-сон-аб

4) НЬ02-N11 + ОН- АБ—>НЬ-М-С-АБ + Н20

5) НЬ02 - 1ЯН + ОС = АБ —* НЬ - N - СОН - АБ

Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о механизме повреждения мембран и макромолекул соматических клеток организма при модификации антибиотиками различной природы. Знания в этой области дадут возможность спрогнозировать фармакологический эффект препарата, повысить качество проводимой терапии и разработать эффективную схему лечения пациентов с минимальным риском побочных эффектов. Установленный эффект химической модификации компонентов эритроцитарных мембран особенно важно учитывать при развитии воспалительных процессов различной этиологии, вызывающих ускоренное «старение» эритроцитов (их апоптоз), а, следовательно, и смещение их чувствительности к действию анализируемых антибиотиков. Выявленные особенности взаимодействия антибиотиков с эритроцитарными клетками указывают на необходимость строгого соблюдения режима дозирования, контроля морфологической картины эритрона и, по-видимому, пересмотра назначаемой дозы антибиотика, так как оптимальная доза должна нести

максимально благоприятный эффект.

Материалы диссертационной работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2008, 2010), Международной интернет -конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012), Международной конференции молодых ученых (Пущино, 2012), Международной научно-методической школе-конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013), II Всероссийской научно-практическои конференции с международным участием «Медико-биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа жизни» (Воронеж, 2013), II Международной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2013).

Публикации. По теме диссертации имеется 13 публикаций: 6 статей и 7 тезисов, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК РФ».

На защиту выносятся следующие положения:

1. Изученные антибиотики (азитромицин, рокситромицин, кларитромицин, джозамицин, клиндамицин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин), за исключением доксициклина, являются слабыми гемолитическими агентами.

2. Степень изменения гемолитической активности эритроцитов определяется химической природой модификатора, его концентрацией и временем взаимодействия с клеткой.

3. Исследованные антибиотики индуцируют гетерогенные изменения поверхностной архитектоники клеток в популяции эритроцитов. Доксициклин в концентрации 7,8*10"5 моль/л вызывает, в том числе, и токсический эффект.

4. Исследованные антибиотики, проникая в эритроциты, вызывают изменение соотношения основных лигандных форм гемоглобина, в том числе, снижение/блокирование метгемоглобинообразования в клетке.

5. Степень активности антибиотиков в отношении ионогенных групп гемоглобина определяется их концентрацией и химической природой модификатора.

6. Предложена схема событий, отражающих возможные механизмы изменения структурных свойств эритроцитов и гемоглобина при воздействии антибиотиков различных классов.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 184 страницах машинописного текста, состоит из «Введения», 9 глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 319 источников. Иллюстрационный материал включает 56 рисунков и 9 таблиц. В «Приложении» содержатся 8 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структура и физико-химические свойства антибиотиков различных классов

В главе изложены современные представления о классификации антибиотиков различных классов, рассмотрены их основные физико-химические свойства, а также механизмы поступления и действия антибиотиков на клетки про- и эукариотических организмов.

Глава 2. Морфология и функции эритроцитов человека

В главе представлен обзор основных работ, посвященных анализу особенностей морфологии эритроцитарных клеток человека и их составных компонентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

Объектами исследования послужили эритроциты и гемоглобин, полученные из крови доноров обоих полов. Оценку чувствительности прокариотических организмов к антибактериальным препаратам различных классов проводили на примере семейства Mycoplasmataceae.

Среднее содержание эритроцитов донорской крови определяли с помощью автоматического гематологического анализатора Drew Scientific ЕХ2280 (Великобритания). Суспензии эритроцитов получали из крови доноров путем центрифугирования в физиологическом растворе NaCl (0,9%) при 1500 об/мин в течение 10 мин. В качестве антикоагулянта использовали небольшое количество ЭДТА.

Кинетику осмотического гемолиза эритроцитов изучали при двух концентрациях NaCl: 0,85% и 0,55%. Гемолиз эритроцитов проводили в термостатируемых кюветах с наружными размерами 20 х 40 х 10 мм и рабочим объёмом 5 мл. Изучение кислотной резистентности эритроцитов проводили методом регистрации интегральных эритрограмм, используя 0.1н соляную кислоту.

В качестве модифицирующих агентов мы использовали антибиотики в форме порошка, навеску которых растворяли в заданном объеме изотонического раствора хлорида натрия: азитромицин (Сумамед, Хорватия)

- 1,34*10"" моль/л, 1,34*10'5 моль/л, рокситромицин (Roxithromycin, Sigma-Aldrich) - 7,2* 10"5 моль/л, 7,2*10'6 моль/л, кларитромицин - 1,33*10"4 моль/л, 1,33*10"5 моль/л (Клацид, Abbott S.p.A); джозамицин - 1,21* 10'4 моль/л, 1,21*10'5 моль/л (Josamycin, Sigma-Aldrich); доксициклин - 7,8*10"5 моль/л, 7,8*10"6 моль/л (Doxycycline hyclate, Sigma-Aldrich); клиндамицин - 1,4*10"4 моль/л, 1,4*10'5 моль/л (Clindamycin, Sigma-Aldrich); ципрофлоксацин -1,21 *10"4 моль/л, 1,21 *10"5 моль/л (Ciprofloxacin, Sigma-Aldrich), офлоксацин

- 1,1*10"4 моль/л, 1,1*10"5 моль/л (Ofloxacin, Sigma-Aldrich), спарфлоксацин -1,02*10"4 моль/л, 1,02*10"5 моль/л (Sparfloxacin, Sigma-Aldrich).

Поверхностную архитектонику эритроцитов (ПАЭ) крови доноров изучали на сканирующем электронном микроскопе JSM - 6380 LU (Япония) при ускоряющем напряжении 20-25 кВ. Предварительно инкубированные с антибиотиками эритроциты фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида («Reanal», Венгрия) при температуре 4°С в течение 1 ч. Производили обезвоживание клеток центрифугированием в серии водных

растворов этанола восходящей концентрации и далее - ацетоном. Приготовленную суспензию наносили на алюминиевые подложки и высушивали в термостате при 37 °С. Для обеспечения электропроводности объектов их напыляли тонкой плёнкой золота. Структурно-функциональную характеристику мембран эритроцитов оценивали по классификации Г.И. Козинец (1977), характер изменения ПАЭ оценивали по расчетным индексам (В.Н. Кидалов, К.К. Зайцева, 1986; С.Б. Назаров, 1995).

Оксигемоглобин (НЬОг) в концентрациях СИЬо2=0,3' 10~5 моль/л и

С„ьо2=5-1(Г5 моль/л выделяли с использованием метода (D. Drabkin, 1946;

JI.A. Блюменфельд, 1957).

Электронные спектры поглощения гембелка регистрировали на UV/VIS спектрофотометре Shimadzu UV-2401PC (Shimadzu, Япония). В экспериментах использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Обработку данных проводили с использованием компьютерных программ UVProbe 2.21 (Shimadzu, Япония) и Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft, США).

О наличии в растворе той или иной лигандной формы Hb судили по изменению спектров поглощения. Для вычисления процентного содержания окси-, дезокси- и метгемоглобина использовалась эмпирическая система уравнений (Л.К. Стусь, Е.Д. Розанова, 1992; А. Zwart et al., 1981).

Протолитометрическое титрование растворов оксигемоглобина осуществляли на иономере И-130. Предварительное закисление раствора гембелка с концентрацией порядка 10"5 моль/л проводили до значения рН=3,0 с помощью 0,1н раствора соляной кислоты в количестве не более 0,5 мл.

Термостатирование контрольных и исследуемых растворов оксигемоглобина осуществляли на водяной бане типа LW-2 при 55 °С в течение 30 мин. Подвергнутые воздействию температуры образцы охлаждали до комнатной температуры (230 С). Измерение светопропускания растворов контрольных и модифицированных антибиотиками образцов с последующим перерасчётом в величины светопоглощения (в данном случае рассеяния света) проводили с помощью фотоколориметра концентрационного КФК-3 при длине волны 490 нм: т = (1-Т>100%, где Т-коэффициент светопропускания раствора гемоглобина.

Для изучения степени распространенности урогенитальных микоплазм культуральным методом и ПЦР использовали диагностические наборы «ДНК-Технология» (ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ и ГНЦ

Института физики высоких энергий). Определение чувствительности mycoplasma hominis и ureaplasma urealyticum к антимикробным препаратам проводили с использованием тест - системы «МИКОПЛАЗМА / УРЕАПЛАЗМА — АЧ» (Санкт-Петербург).

Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли с помощью прикладных программ «Statistica 6.О.». Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента при 5% уровне значимости.

Глава 4. Проблема распространенности и неадекватной антибпотикотерапнн микоплазмозов Результаты обследования 3000 пациентов на наличие инфекций, передаваемых половым путем, методом ПЦР представлены на рис. 1, из которого следует, что наиболее частыми возбудителями являются ureaplasma

Рис. 1. Распространённость ИППП, % Обозначения: ИППП - инфекции, передаваемые половым путём; m gen — mycoplasma genitalium; chlam -Chlamidia trachomatis; m hom -mycoplasma hominis; u ure - ureaplasma urealyticum

По мнению ряда авторов, трудность диагностики микоплазменных инфекций, распространенность микоплазмозов и неадекватность проводимой терапии привели к преобладанию этих инфекций над «классическими» венерическими заболеваниями. С помощью культурального метода проведен количественный анализ содержания u. urealyticum и m. hominis отделяемого урогенитального тракта 134 пациентов (75 m. hominis и 59 u. urealyticum) с определением чувствительности указанных возбудителей к антибиотикам. Наиболее активными антибиотиками, подавляющими рост микоплазм, являются макролиды, тетрациклины и новые фторхинолоны. Однако использование антимикробных препаратов создает селективное давление, способствующее отбору и выживанию резистентных штаммов. Данные, полученные в нашей лаборатории, представлены на рис. 2, из которого следует, что в отношении штаммов m. hominis и u. urealyticum высокую активность ■ проявляли фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин), джозамицин, доксициклин. Однако штаммы m. hominis сохраняли активность к клиндамицину, а штаммы u. urealyticum - к

urealyticum и mycoplasma hominis.

иппп 2,8

кларитромицину. Отмечена низкая чувствительность изучаемых микроорганизмов к азитромицину и рокситромицину.

l %

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 п п. I 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 :П,П ,_i_C—1 ■

AM РМ км ДМ КЦ ДЦ ЦФ ОФ СФ AM PM км ДМ КЦ ДЦ ЦФ ОФ СФ

1 2 Рис. 2. Уровень чувствительности mycoplasma hominis (1) и Ureaplasma urealyticum (2) к антимикробным препаратам, %

Обозначения: AM - азитромицин, РМ - рокситромицин, КМ -кларитромицин, ДМ - джозамицин, КЦ - клиндамицин, ДЦ - доксициклин, ЦФ - ципрофлоксацин, ОФ - офлоксацин, СФ - спарфлоксацин

Глава 5. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных антибиотиками различных классов

Методом регистрации интегральных эритрограмм выявлено дозозависимое изменение гемолитической активности эритроцитов под действием изучаемых модификаторов (рис. 3,4).

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что антибиотики (AM, ДМ, ОФ, СФ) постепенно проникают в эритроцитарные клетки, индуцируя в них накопление скрытых дефектов (рис. 3). РМ, КМ, КЦ вызывают зависимое от времени усиление гемолитической активности низкостойких эритроцитов, что находит отражение в увеличении параметра G = до 5%. Максимальный гемолитический эффект индуцируется ЦФ и ДЦ после их предварительной инкубации с эритроцитами (t=30 мин), приводя к гемолизу 9 и 73% клеток соответственно.

При изучении гемолитической активности эритроцитов в изоосмотической среде под действием антибиотиков в меньшей концентрации установлено, что все модификаторы, за исключением ДЦ (Озо=9о/0)) индуцируют сферуляцию (AM, ДМ, ОФ, СФ; либо

гемолиз (РМ, КМ, КЦ, ЦФ; G~4%) клеток при длительном взаимодействии с ними (рис. 4).

є, % 80 -

70І

60

50

40

ЗО

20

км

№

-ТЕ^-

ДЦ

кц

ЦФ

1 X ' "і/"' ОФ

СФ

О 0,9 % N301 Н 0,9 % N8« (инкуб. ЗО мин)

Рис. 3. Значения степени гемолиза (в) эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами

Обозначения: АМ - азитромицин (1,34* 10"4 моль/л), РМ -рокситромицин (7,2*10~5 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33*10"4моль/л), ДМ - джозамицин (1,21 * 10"4моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8*10"5 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*10~+моль/л), ЦФ - ципрофлоксацин (1,21*10~4 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1*10"4моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10"4 моль/л)

є, % 12

і

і

км

ДЦ

ЦФ

00,9% N801 □ 0,9% N»01 (инкуб. 30 мин)

Рис. 4. Значения степени гемолиза (в) эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами

Обозначения: АМ - азитромицин (1,34*10"5 моль/л), РМ -рокситромицин (7,2* 1СГ6 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33*Ю"3 моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10° моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8*10"6 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*10° моль/л), ЦФ - ципрофлоксацин (1,21*10"5 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1*10° моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10"5 моль/л)

При 0,55%-ном содержании хлорида натрия в инкубационной среде все антибиотики, за исключением ДЦ, вызывали незначительное повышение

ГеМОЛИТИЧеСКОЙ аКТИВНОСТИ КЛеТОК, ИНДуЦИруЯ увеличение ВеЛИЧЙНЫ в] 20 ~

2-4% (АМ, КМ, Щ, ЦФ, ОФ), до 8% (АМ), 6% (КМ), 4% (ДМ, КЦ), 11% (ЦФ), 8% (ОФ), 2,5% (СФ) за время 1:иикуб=30 мин, т.е. С=/(г). Активное связывание ДЦ с мембранами эритроцитов указывает на низкий уровень барьера стерических ограничений для их взаимодействия (рис. 5).

80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10

Ш 0,55 % КаОІ 0 0,55 % ]\"аС1 (инкуб. 30 мин)

Рис. 5. Значение степени гемолиза (О) эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами

Обозначения те же, что и к рис. 6: АМ — азитромицин (1,34*1(Г4 моль/л), РМ - рокситромицин (7,2*10° моль/л), КМ — кларитромицин (1,33*10"4моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10"4моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8* 10"5 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*10"4моль/л), ЦФ -ципрофлоксацин (1,21 *10"4 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1*10"4моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10"4 моль/л)

Выявленное в опыте снижение осмотической резистентности эритроцитов предполагает повреждение липостроматинового и спектрин-актинового комплексов, локализованных на цитоплазматической поверхности мембраны. Из данных вытекает, что величина энергетического барьера липидного бислоя для изучаемых антибиотиков определяется молекулярным составом эритроцитарной мембраны, определяя постепенное встраивание модификаторов в мембраны средне- и высокостойких субпопуляций эритроцитов. Полученные данные позволили заключить, что взаимодействие молекул антибиотиков с компонентами эритроцитарного цитоскелета, по-видимому, индуцирует изменение заряда макромолекул, что способствует модификации поверхности контактных взаимодействий спектрин-актинового и липостроматинового комплексов. В результате

подобных конформационных перестроек происходит ослабление и последующий распад спектрин-актиновой сети, т.е. гемолиз эритроцитов.

Установлена зависимость скорости гемолитического процесса от концентрации модифицирующего агента: при сКаС1=0.55% (а для ЦФ, ДЦ и при сКаС1=0.9%) (3=^с). Полученные данные указывают на проникновение в эритроцит антибиотиков по пассивному механизму (рис. 6).

Рис. 6. Значение степени гемолиза (О) эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами. Обозначения: АМ - (1,34*10"5 моль/л), РМ - (7,2*10"6 моль/л), КМ -(1,33*10"5 моль/л), ДМ -(1,21*1моль/л), ДЦ - (7,8*10"6 моль/л), КЦ ~(1,4*1(Г5 моль/л), ЦФ -(1,21*10"5 моль/л), ОФ -(1,1 * 10"5 моль/л), СФ -(1,02* 10"5 моль/л)

Глава 6. Кислотная резистентность эритроцитов, модифицированных антибиотиками различных классов

При изучении влияния антибиотиков в терапевтической концентрации на величину кислотной резистентности и динамику распада эритроцитов выявлено зависимое от времени снижение длительности латентной фазы гемолиза при добавлении к суспензии эритроцитов ДЦ, АМ, ЦФ (примерно на 100 с) и КМ (на 10 с) относительно контроля (рис. 7,а). При непосредственном взаимодействии с эритроцитами КЦ и ОФ вызывали сокращение длительности латентной фазы (на 20 с), а РМ и СФ -повышение данного параметра относительно контроля на 15 и 60 с при длительном (1=60 мин) взаимодействии с клетками (рис. 7,а).

По степени химической активности, реализуемой в снижении кислотной резистентности эритроцитов, ДЦ и АМ характеризуются как реагенты с наиболее выраженными свойствами гемолитика, вызывающими соответственно повышение параметра АКтах до 0,4 и 0,8 отн.ед. ЦФ, ОФ и СФ повышали степень структурной модификации эритроцитов, снижая

величину ДКтах относительно контроля (рис. 7,6). На фоне снижения параметра ЛКтах (~ -0,3 отн.ед.) для СФ регистрируется максимальное приращение длительности гш (=80 с), а для ЦФ (-0,6 отн.ед.) - наибольшее снижение величины г1а1 (=105 с) относительно контроля. ЦФ и СФ подавляли развитие гемолитического процесса, что отражено в снижении значения АОтах на 70 и 55% соответственно (рис. 7,в).

Д1Ы, С ДК„„, отн.ед.

Рис. 7. Значение основных параметров кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных антибиотиками

Обозначения: а - б - ДКтах, в - ЛОтах; 1 - без инкубации, 2 -инкубация 60 мин; АМ - азитромицин (1,34*10"4 моль/л), РМ -рокситромицин (7,2*10"5 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33*10~4моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10'4моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8* 10"5 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4* 10"4моль/л), ЦФ - ципрофлоксацин (1,21 *10"4 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1* 10"4моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10"4 моль/л)

На фоне снижения длительности латентного периода гемолиза (в среднем на 80 с) антибиотики в меньшей концентрации способствовали снижению структурной однородности эритроцитов, что проявлялось в повышении параметра Ктах на ~ 0,35 отн.ед. в сравнении с контролем (рис. 8, а, б). При оценке качественного состава молодой популяции эритроцитов по

величине Стах можно констатировать, что изменения, протекающие в молодых высокостойких эритроцитах, слабо коррелируют с концентрацией модификатора в инкубационной среде (рис. 8,в).

Рис. 7. Значение основных параметров кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных антибиотиками

1 - без инкубации, 2 - инкубация 60 мин; (АМ - азитромицин 1,34*10"5 моль/л, РМ - рокситромицин 7,2*10"6 моль/л, КМ - кларитромицин 1,33*10"5 моль/л, ДМ - джозамицин 1,21 *10"5 моль/л, ДЦ - доксициклин 7,8* 10"6 моль/л, КЦ - клиндамицин 1,4*10"5 моль/л, ЦФ - ципрофлоксацин 1,21 *10"5 моль/л, ОФ - офлоксацин 1,1*10"5 моль/л, СФ - спарфлоксацин 1,02*10"5 моль/л)

Таким образом, изученные нами антибиотики изменяют структурную дифференцировку эритроцитов, преимущественно воздействуя на низкостойкие субпопуляции клеток, вызывая глубокие конформационные перестройки в белково-липидных комплексах мембраны в предгемолитической фазе (1лат.).

Глава 7. Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов, модифицированных антибиотиками различных классов По-видимому, в основе изменения осмотической резистентности клеток лежит нарушение морфофункционального состояния эритроцитов при

их модификации изучаемыми антибиотиками. Исследование рельефа поверхности эритроцитов, модифицированных антибиотиками, методом сканирующей электронной микроскопии показало дозозависимое снижение количества двояковогнутых дискоцитов (в среднем на 3-5%) и увеличение доли необратимо деформированных эритроцитов относительно контроля (табл. 1,2).

Таблица 1

Цитоархитектоника эритроцитов крови доноров, модифицированных антибиотиками в терапевтической концентрации (р<0,05)

Показатели Контроль АМ РМ КМ ДМ ДЦ КЦ ЦФ ОФ СФ

Д,% 91,4 76,7 87,0 79,7 82,7 28,7 87,0 85,0 85,0 89,7

ОД, % 6,0 1,3 1,7 1,0 7,0 3,19 1,0 5,3 5,0 1,3

НД, % 2,6 22,0 11,3 19,3 10,3 68,1 12,0 9,7 10,0 9,0

ИТ 0,09 0,3 0,15 0,26 0,21 2,48 0,15 0,18 0,18 0,15

йот 0,07 0,02 0,02 0,01 0,08 0,11 0,01 0,06 0,06 0,01

инот 0,03 0,29 0,13 0,24 0,13 2,37 0,14 0,11 0,12 0,1

Обозначения те же, что и к табл.2: Д - количество дискоцитов (%), ОД/НД -количество обратимо/необратимо деформированных клеток (%), ИТ - индекс трансформации, ИОТ/ИНОТ - индексы обратимой/необратимой трансформации; АМ - азитромицин (1,34*10"4 моль/л), РМ - рокситромицин (7,2*10"5 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33*10"4 моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10"4 моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8*10"5 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*10"4 моль/л), ЦФ - ципрофлоксацин (1,21*10"4 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1*10"4 моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10'4 моль/л)

Таблица 2

Цитоархитектоника эритроцитов крови доноров, модифицированных антибиотиками в концентрации, на порядок ниже терапевтической (р<0,05)

Показатели Контроль АМ РМ км дм ДЦ КЦ ЦФ ОФ СФ

Д,% 91,4 82,7 88,7 89,0 89,0 42,3 89,0 89,6 88,3 91,0

ОД, % 6,0 2,67 2,0 2,0 3,67 5,04 2,33 1,7 3,0 1,33

НД, % 2,6 14,7 9,3 9,0 7,3 52,6 8,7 6,0 8,7 7,7

ИТ 0,09 0,21 0,13 0,12 0,12 1,36 0,12 0,086 0,13 0,1

йот 0,07 0,03 0,02 0,02 0,04 0,13 0,03 0,05 0,04 0,01

инот 0,03 0,18 0,11 0,1 0,08 1,48 од 0,07 0,1 0,08

Обозначения: АМ - (1,34*10"5 моль/л), РМ - (7,2* 10"6 моль/л), КМ -(1,33*10"5 моль/л), ДМ - (1,21*10~5 моль/л), ДЦ - (7,8*10"6 моль/л), КЦ -(1,4*10"5 моль/л), ЦФ - (1,21* 10"5 моль/л), ОФ - (1,1*10"5 моль/л), СФ -(1,02*10"5 моль/л)

Особенности изменения морфологической картины эритрона под действием антибиотиков проанализированы нами при исследовании поверхностной архитектоники эритроцитов на примере ДЦ (рис. 9).

5 мин 10 мин 15 мин

20 мин 30 мин 60 мин

Рис. 9. Динамика изменения поверхностной архитектоники эритроцитов, модифицированных ДЦ в концентрации 7,8* 10° моль/л

Выявлено, что с увеличением времени взаимодействия антибиотика с эритроцитами дискоциты с обычной округлой зоной пеллора сменяются клетками с продолговатыми условно-полиморфными стомами (УПС) и УПС отросчато-звездчатой формы. По-видимому, ДЦ в концентрации 7,8* 103 моль/л индуцирует ускоренное «старение» эритроцитов, приводя к функциональной недостаточности клеток.

Глава 8. Физико-химические свойства нативного и модифицированного антибиотиками различных классов оксигемо1 лобина человека

Методом абсорбционной спектрофотометрии нами исследовано влияние антибиотиков на структурное состояние внутриэритроцитарного гемоглобина человека. Выявлено, что антибиотики ЦФ, ОФ, СФ и КМ обладают сходным по направленности действия на оксигемоглобин эффектом изменения основных спектральных максимумов, характерных для гема (Х= 542, 576, 342 нм) и глобина (1= 272 нм). Выявлено, что ЦФ, ОФ, СФ, КМ индуцируют частичный отрыв лиганда (02) от молекулы НЬ02, что можно представить в следующем виде: [АБ] + [НЮ2] -> [АБ-НЬ02] [АБ-НЬ], где АБ - молекула антибиотика. Результаты исследования электронных спектров поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного спарфлоксацином (СФ), представлены на рис. 10.

X, нм

Рис. 10. Электронные спектры поглощения растворов оксигемоглобина человека, модифицированного СФ. Обозначения: 1 - контроль; 2 - НЮ2+СФ (1,02*10"4 моль/л); 3 -НЮ2+СФ (1,02*10"5 моль/л)

Индуцированное антибиотиками класса макролиды (АМ, РМ, КМ, ДМ) и ДЦ изменение спектральных свойств оксигемоглобина обусловлено суммарным эффектом структурных модификаций гема и глобина. Показано преимущественное воздействие КЦ на гемовую составляющую белка.

Установлено, что исследованные антибиотики способствуют изменению содержания основных лигандных форм гемоглобина, приводя к снижению метгемоглобинообразования в клетке (табл. 3).

Таблица 3

Соотношение основных лигандных форм гемоглобина в растворе

Антибиотик [нь02]*ю'3 [нь]*10"3 [мшъ]*10"3

к (нъ02) 2,885 (82,1%) 0,535 (15,2%) 0,095 (2,7%)

ню2+цф* 2,805 (74,1%) 0,899 (23,8%) 0,081 (2,1%)

нъ02+цф 2,805 (74,1%) 0,899 (23,8%) 0,081 (2,1%)

ню2+оф* 3,03 (76,9%) 0,862 (21,9%) 0,048 (1,2%)

ньо2+оф 2,635 (70,2%) 1,059 (28,2%) 0,061 (1,6%)

ню2+сф* 2,62 (70,1%) 1,026 (27,4%) 0,094 (2,5%)

нь02+сф 2,62 (70,1%) 1,026 (27,4%) 0,094 (2,5%)

ньо2+кц* 3,27 (78,9 %) 0,858 (20,7 %) 0,018 (0,4 %)

нъо2+кц 3,02 (78,2 %) 0,838 (21,7 %) 0,002 (0,05%)

нъо2+дц* 3,115 (73,5 %) 1,051 (24,8 %) 0,071 (1,7%)

ньо2+дц 3,25 (78,1 %) 0,816(19,6%) 0,094 (2,2 %)

нъо2+ам* 2,635 (70,2 %) 1,059 (28,2 %) 0,061 (1,6 %)

ньо2+ам 2,755 (76,6 %) 0,785 (21,8 %) 0,055 (1,5 %)

нъо2+рм* 2,425 (67,1 %) 1,129 (31,2%) 0,061 (1,7%)

нъ02+рм 2,795 (75,4 %) 0,875 (23,6 %) 0,035 (0,9 %)

нъо2+км* 2,65 (70,3 %) 1,092 (29,0 %) 0,028 (0,7 %)

ньо2+км 3,03 (76,9 %) 0,862 (21,9 %) 0,048 (1,2 %)

ню2+дм* 2,895 (70,9 %) 1,103 (27,0%) 0,087 (2,1 %)

ню2+дм 2,975 (78,0 %) 0,739 (19,4 %) 0,078 (2,0 %)

Обозначения: К - контроль, * - меньшая концентрация антибиотика, р < 0,05

Глава 9. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия антибиотиков различных классов с оксигемоглобином человека

Выявлено, что инкубирование растворов НЮ2, модифицированного изучаемыми антибиотиками, приводит к дозозависимому снижению термоустойчивости его водных растворов относительно контроля (рис. 12).

дт, %

ам рм км дм кц дц цф оф сф

Рис. 12. Комбинированное влияние антибиотиков и температуры на интенсивность светорассеяния в растворах оксигемоглобина

Обозначения: 1 - концентрация, на порядок ниже терапевтической; 2 -терапевтическая концентрация АБП соответственно: АМ - азитромицин (1,34* 10"5 моль/л, 1,34* 10"4 моль/л), РМ - рокситромицин (7,2*10"6 моль/л, 7,2* 10"5 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33* 10"5 моль/л,1,33*10~4 моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10"5 моль/л, 1,21*10"4 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*10"5 моль/л, 1,4*10"4 моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8*10~6 моль/л, 7,8*10° моль/л), ЦФ - ципрофлоксацин (1,21*10"5 моль/л, 1,21*10"4 моль/л), ОФ -офлоксацин (1,1*10"5 моль/л, 1,1*10"4 моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02*10° моль/л, 1,02*10-4 моль/л)

Методом протолитометрического титрования показано, что все исследованные нами соединения в разной степени блокируют карбоксильные группы, изменяя тем самым поверхностный заряд белка. Связываясь частично или полностью с имидазольными и сульфгидрильными группами, антибиотики вызывают изменения буферных и конформационных свойств

белковой глобулы. В опытах показано, что ковалентное связывание изучаемых антибиотиков ионогенными группами оксигемоглобина приводит к изменению поверхностного заряда макромолекулы и ослаблению внутримолекулярных связей, вызывая перераспределение электронной плотности белка (рис. 13).

др, мкл 1000

500

-500 -1000 -1500

33 АМ ШЗРМ 0КМ ЕЗДМ окц ОДЦ ИЦФ ПОФ ЕЭСФ

Рис. 13. Зависимость изменения относительной буферной ёмкости водных растворов оксигемоглобина (АР), модифицированных антибиотиками, от величины рН. Обозначения: АМ - азитромицин (1,34*10" 4 моль/л), РМ - рокситромицин (7,2*10"5 моль/л), КМ - кларитромицин (1,33* 10"4моль/л), ДМ - джозамицин (1,21*10"4моль/л), ДЦ - доксициклин (7,8*10"5 моль/л), КЦ - клиндамицин (1,4*юЛголь/л), ЦФ -ципрофлоксацин (1,21 *10~4 моль/л), ОФ - офлоксацин (1,1*10"4моль/л), СФ - спарфлоксацин (1,02* 10"4 моль/л)

Учитывая высказанные нами соображения, взаимодействие функциональных групп антибиотиков с ионогенными группами НЬ02 можно представить следующим образом:

1) НЮ2 - СООН + ОН - АБ —> НЬ-0-С(0)-АБ

2) ньо2-ын2 + о = с-аб-*нь-м = с-аб + н2о

3) НЮ2 - ЫН + 0 = С- АБ->НЬ-М - СОН - АБ

4) НЮ2-ИН + ОН-АБ-*НЬ-М-С-АБ + Н20

5) НЬ02— ИН + ОС = АБ —> НЬ - N - СОН — АБ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

SM- 3-5

V

На основании анализа результатов собственных исследований по изучению влияния антибиотиков различных классов на структурно-функциональное состояние эритроцитарных клеток, а также их вклада в нарушение организации мембранных компонентов и внутриклеточного

гемоглобина и данных литературы нами составлена обобщенная схема формирования структурных изменений клеточных структур под воздействием антибиотиков (рис. 14).

Рис. 14. Обобщённая схема изменения главных компонентов в мембранах эритроцитов под воздействием антимикробных препаратов

ВЫВОДЫ

1. Урогенитальные микоплазмы наиболее чувствительны к следующим антибиотикам, используемым для лечения:

а) ш. hominis - спарфлоксацин, офлоксацин, джозамицин, ципрофлоксацин, клиндамицин;

б) u. urealyticum - спарфлоксацин, доксициклин, джозамицин, офлоксацин, кларитромицин.

Наиболее низкая чувствительность mycoplasma hominis, ureaplasma urealyticum - к азитромицину и рокситромицину.

2. Установлено, что изученные антибиотики (азитромицин, рокситромицин, кларитромицин, джозамицин, клиндамицин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин), за исключением доксициклина, являются слабыми гемолитическими агентами. Характер изменения осмотической резистентности эритроцитов определяется химической природой действующего модификатора, его концентрацией и временем взаимодействия с клеткой.

3. Установлено, что изученные антибиотики химически модифицируют белки эритроцитарной мембраны, что приводит к изменению её проницаемости.

4. Обнаружено, что исследованные антибиотики вызывают гетерогенные изменения поверхностной архитектоники в популяции эритроцитов, приводя к повышению их структурной однородности. Определено соотношение обратимо- и необратимо модифицированных форм клеток под действием антибиотиков.

5. Доксициклин в концентрациях 7,8* 10'5 моль/л, 7,8* 10"6 моль/л индуцирует необратимые изменения морфофункционального состояния более 50% эритроцитов и вызывает, в том числе, токсический эффект.

6. Изученные антибиотики вызывают изменение конформационных свойств гемоглобина за счет модификации гемового и глобинового компонентов белковой макромолекулы.

7. Взаимодействуя с молекулой гемоглобина, исследованные антибиотики вызывают изменение соотношения его основных лигандных форм, в том числе, снижение/блокирование метгемоглобинообразования в клетке.

8. Степень активности антибиотиков в отношении ионогенных групп белка определяется их концентрацией и химической природой модификатора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Херувимова (Баева) Е.С. Изучение уровня чувствительности урогенитальных микоплазм к действию антибактериальных препаратов различной природы / Е.С. Херувимова, В.Г. Артюхов, С.Г. Резван // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2010. - № 2. - С. 115-119.

2. Баева Е.С. Исследование осмотической и кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами различных классов / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Медицина в XXI веке: традиции и перспективы. Сборник трудов международной интернет-конференции, Казань, 12-15 марта 2012 г. - Казань: изд-во «Альянс», 2012.-320 с.

3. Баева Е.С. Изменение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при модификации антибиотиками различной природы / Е.С. Баева, С.Г. Резван, В.Г. Артюхов // IV съезд биофизиков России. Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток». Материалы докладов. - Нижний Новгород, 2012. -С. 32.

4. Баева Е.С. Сканирующая электронная микроскопия эритроцитов, модифицированных антибактериальными препаратами различных классов / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Актуальные вопросы современной науки. Материалы II Международной научной конференции, 31 августа 2012 г. -Санкт-Петербург. - Петрозаводск: ПетроПресс, 2012. - 100 с. - В надзаг.: Науч.-изд. центр «Открытие».

5. Баева Е.С. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия антибиотиков с гемоглобином / Е.С. Баева // Экспериментальная и теоретическая биофизика. Сборник трудов международной конференции молодых ученых. Секция «Биофизика клетки и внутриклеточная сигнализация». - Пущино, 22-24 октября 2012 г. - С. 32-34.

6. Баева Е.С. Влияние антибиотиков класса макролиды на структурное состояние гемоглобина человека / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Медико-биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа жизни : сборник научных статей II Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием. Том 1 / [под. ред. Г. В. Бугаева, И. Е. Поповой].

- Воронеж : Издательско-полиграфический центр «Научная книга», 2013. -461 с.

7. Баева Е.С. Влияние доксициклина на структурно-функциональное состояние гемоглобина человека / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы : материалы Международной научно-методической конференции. - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронеж, гос. ун-та.-2013.-С. 29-31.

8. Баева Е.С. Влияние антибиотиков класса фторхинолоны на структурное состояние гемоглобина человека / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - Москва, 2013. - № 7. - С. 44-47.

9. Баева Е.С. Влияние клиндамицина на структурно-функциональное состояние гемоглобина человека / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы : материалы Международной научно-методической конференции. - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронеж, гос. ун-та. - 2013. - С. 32-34.

10. Баева Е.С. Изучение механизмов взаимодействия антибиотиков различных классов с гемоглобином / Е.С. Баева, С.Г. Резван, В.Г. Артюхов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2012. - № 2. - С. 119-124.

11. Баева Е.С. Влияние кларитромицина на структурное состояние гемоглобина человека / Е.С. Баева, В.Г. Артюхов // Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы. Сборник трудов международной интернет-конференции. - Казань: изд-во «Альянс», 2013. - С. 26-28.

Статьи № 1, 8, 10 опубликованы в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Подписано в печать 05.07.2012. Формат 60 х 84 1/16 . Бумага офисная. Усл. печ. л. 1,4 Тираж 100 экз. Заказ №1851

Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГБУ «РЭА» Минэнерго России 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баева, Елена Сергеевна, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Баева Елена Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОФИЗИЧЕСКИХ ОСНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ

КЛАССОВ

Специальность 03.01.02. - Биофизика

N. со

Диссертация на соискание ученой степени О со кандидата биологических наук

со £

со 8

СГ>

О о

СМ

12 см

^ Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Г. Артюхов

Воронеж 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И ТЕРМИНОВ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 Глава 1. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

АНТИБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ 12

1.1. Классификация антибактериальных веществ 12

1.1.1. р-лактамные антибиотики 15

1.1.2. Аминогликозиды 16

1.1.3. Хинолоны/Фторхинолоны 16

1.1.4. Макролиды 21

1.1.5. Тетрациклины 26

1.1.6. Линкозамиды 28

1.1.7. Гликопептиды 29

1.1.8. Оксазолидиноны, полимиксины, сульфамиды и ко-тримаксозол 29

1.1.9. Нитроимидазолы 29

1.1.10. Нитрофураны 3 0

1.2. Поступление антибиотиков в клетки про- и эукариот 30

1.3. Действие антибиотиков на клетки про- и эукариот 31 Глава 2. Морфология и функции эритроцитов человека 35

2.1. Морфология эритроцитов 35

2.1.1. Молекулярная структура мембраны эритроцита 37

2.1.2. Цитоскелет эритроцита 39

2.1.3. Липидный состав мембраны эритроцита 43

2.2. Проницаемость эритроцитов для молекул 44

2.3. Гемолиз эритроцитов 47

2.4. Физико-химические и функциональные свойства гемоглобина 50

2.5. Трансформация эритроцитов 54

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 60

Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 60

3.1. Получение суспензий эритроцитов 60

3.2. Подсчет количества эритроцитов крови 61

3.3. Модификация эритроцитов АБП различных классов 62

3.4. Получение растворов оксигемоглобина человека 62

3.5. Автоматический метод регистрации осмотических и кислотных эритрограмм 63

3.6. Метод сканирующей электронной микроскопии 65

3.7. Метод протолитометрического титрования 66

3.8. Методика исследования тепловой денатурации оксигемоглобина 67

3.9. Регистрация спектральных характеристик 68 ЗЛО. Определение соотношения основных лигандных форм в нативном

и модифицированных образцах гемоглобина 68

3.11. Изучение степени распространенности урогенитальных микоплазм 69

3.12. Изучение уровня чувствительности урогенитальных микоплазм к действию АМП различных классов 70

3.13. Статистическая обработка экспериментальных данных 70 Глава 4. ПРОБЛЕМА РАСПРОСТРАНЕННОСТИ И НЕАДЕКВАТНОЙ АНТИБИОТИКОТЕР АПИИ МИКОПЛАЗМОЗОВ 71

4.1. Изучение степени распространенности урогенитальных микоплазм 71

4.2. Изучение уровня чувствительности урогенитальных микоплазм к действию АБП различной природы 73 Глава 5. ОСМОТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ 76

5.1. Исследование гемолитической активности эритроцитов в изоосмотической среде в присутствии антибиотиков различных классов 77

5.2. Исследование гемолитической активности эритроцитов в гипоосмотической среде в присутствии антибиотиков различных классов 80

Глава 6. КИСЛОТНАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ 86

6.1. Исследование кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных АБП в терапевтической концентрации 86

6.2. Исследование кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных АБП в меньшей концентрации 92 Глава 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ АРХИТЕКТОНИКИ ЭРИТРОЦИТОВ (ПАЭ), МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ 96

7.1. Изучение цитоархитектоники эритроцитов,

модифицированных АБП 96

7.2. Изучение динамики изменения поверхностной архитектоники эритроцитов, модифицированных доксициклином 101

7.3. Исследование влияния антибиотиков на структурное состояние эритроцитов 103 Глава 8. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И МОДИФИЦИРОВАННОГО АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА 106

8.1. Спектральные характеристики водных растворов оксигемоглобина

при модификации антибиотиками класса макролиды 106

8.1.1. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного азитромицином 107

8.1.2. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного рокситромицином 109

8.1.3. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного кларитромицином 110

8.1.4. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного джозамицином 111

8.2. Спектральные характеристики водных растворов оксигемоглобина

при модификации антибиотиками класса фторхинолоны 113

8.2.1. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного ципрофлоксацином 114

8.2.2. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного офлоксацином 115

8.2.3. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного спарфлоксацином 117

8.3. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного клиндамицином 118

8.4. Электронные спектры поглощения водных растворов оксигемоглобина, модифицированного доксициклином 120

8.5. Сравнительный анализ влияния АБП различных классов на конформационное состояние оксигемоглобина человека 122 Глава 9. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ С ОКСИГЕМОГЛОБИНОМ ЧЕЛОВЕКА 127

9.1. Комбинированное влияние антибиотиков различных классов и температуры на интенсивность светорассеяния водных растворов оксигемоглобина 127

9.2. Протолитометрическое титрование растворов оксигемоглобина, модифицированных АБП различных классов 129

9.3. Сравнительный анализ влияния АБП различных классов на структурно-функциональные свойства оксигемоглобина 133 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 138 ВЫВОДЫ 144 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 146 ПРИЛОЖЕНИЕ 181

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ И ТЕРМИНОВ

АБ - антибиотик;

АБП - антибактериальный препарат; АМП - антимикробный препарат; АХЭ - ацетилхолинэстераза; Г-З-ФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; ДАК - дегидроаскорбиновая кислота; ИЛ-1 - интерлейкин I;

ШИШ - инфекции, передаваемые половым путем; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; МПК - минимальная подавляющая концентрация; СМ - сфингомиелин;

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия;

УПС - условно-полиморфные стомы;

ФЛ - фосфолипиды;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ФС - фосфатидилсерин;

ФХ - фосфатидилхолин;

ФЭ - фосфатидилэтаноламин;

ХЛ - холестерин;

ADP - аденозиндифосфат;

АТР - аденозинтрифосфат;

с-АМР - цикло-аденозинмонофосфат;

НЬ - дезоксигемоглобин;

НЬОг - оксигемоглобин;

His - гистидин;

MtHb - метгемоглобин;

NADP - никотинамиддинуклеотидфосфат;

NADPH - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Инфекционные процессы представляют одну из самых сложных проблем современной медицины. Возникновение инфекции - комплексный процесс, в котором взаимодействуют агрессивные факторы микроба и защитные — макроорганизма. Роль антибиотика в этой системе также многогранна: она, с одной стороны, направлена на ликвидацию патогена, с другой - на продукцию факторов воспаления - высвобождение эндо- и экзотоксинов, утяжеляющих течение процесса. Стратегия современной антибиотикотерапии, в связи с этим, направлена на быстрое антимикробное воздействие, патогенетическую и иммуногенную коррекцию для ликвидации очага и последствий его агрессии [117].

Проблема возрастающей антибиотикорезистентности носит глобальный характер и диктует необходимость рационализации использования антибактериальных средств [176]. В настоящее время исследователями активно обсуждаются возможные механизмы взаимодействия клеток макроорганизма с антибиотиками различных классов. Это обусловлено тем, что многолетние исследования в области антибиотикотерапии указывают на проявление антибиотиками как лечебного, так и побочного действия [39, 149, 171, 172, 220, 262, 301]. Отечественными и зарубежными учеными показано, что физико-химия взаимодействия антибиотиков с клетками микро- и макроорганизмов сложна и не ограничивается прямым антимикробным действием препаратов. Имеются данные о влиянии антибиотиков на фагоцитарную активность макрофагов [172], агрегационные свойства тромбоцитов [241, 242], структурно-функциональные свойства эритроцитов [51,56, 188, 254].

Выявлено, что величина эффекта антибактериального препарата находится в прямой зависимости с его концентрацией в месте действия, в котором должно быть равновесие с молекулами этого препарата в крови [165]. Это означает, что оптимальному терапевтическому эффекту должна

соответствовать некая средняя концентрация препарата в крови пациента, в пределах которой существует достаточно высокая вероятность получения положительных и низкая вероятность появления нежелательных побочных и токсических эффектов [165]. Более того, исследование действия субингибиторных концентраций некоторых антибиотиков (к примеру, тетрациклинов) указывает на возможность получения противовоспалительного эффекта без антимикробного [215, 216].

Учитывая важность структурной целостности клеток, остаются дискуссионными вопросы молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия антибиотиков с отдельными системами макроорганизма, знание которых позволит более точно оценить степень их влияния с целью прогнозирования и минимизации нежелательных реакций.

Цель и задачи диссертационной работы. Основной целью данной работы явилось исследование биофизических основ взаимодействия эритроцитов с антибиотиками различных классов. Задачи работы предусматривали:

1. Исследование уровня распространенности и чувствительности прокариотических организмов на примере семейства Мусор1азта1асеае к антимикробным препаратам различных классов. Обоснование широкого использования данных препаратов.

2. Изучение структурно-функциональных свойств эритроцитов под действием антибиотиков, применяемых для лечения микоплазменной инфекции.

3. Исследование морфофункционального состояния эритроцитов донорской крови и динамики изменения поверхностной архитектоники клеток в присутствии АМП различных классов.

4. Изучение структурно-функциональных свойств гемоглобина, выделенного из эритроцитов донорской крови после предварительной инкубации с АМП.

5. Разработка обобщённой схемы процессов, протекающих в эритроцитах при воздействии АМП различных классов.

( !

Научная новизна. Исследована степень распространённости микоплазменной инфекции, вызванной mycoplasma hominis, ureaplasma urealyticum среди населения г. Воронеж за 2009-2010 гг. Проведена оценка чувствительности изучаемых штаммов к антибактериальным препаратам различных классов, обусловленная специфичным механизмом их действия на клетки микроорганизмов. Установлено, что урогенитальные микоплазмы наиболее чувствительны к фторхинолонам, доксициклину, джозамицину; наиболее резистентны к азитромицину и рокситромицину. Впервые проведен анализ изменения структурных свойств эритроцитов, модифицированных антибиотиками, применяемыми для лечения микоплазменной инфекции (азитромицин, кларитромицин, рокситромицин, джозамицин, клиндамицин, доксициклин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин). Выявлен дозозависимый эффект взаимодействия антибиотиков с мембранами эритроцитов, определяемый временем взаимодействия с модификатором. Показана химическая модификация белковых компонентов мембран эритроцитов. Выявлено, что исследуемые антибиотики вызывают гетерогенные изменения в популяции эритроцитов. Накопление структурных дефектов мембраны зависит от времени взаимодействия с антибиотиками. Установлено, что по общепринятым критериям оценки терапевтического действия доксициклин вызывает, в том числе и токсический эффект, приводя к изменениям более 50% клеток. Показано, что изучаемые препараты, проникая в эритроцитарные клетки, химически модифицируют молекулы гемоглобина, приводя к денатурации его макромолекул. Выявлены типы взаимодействия ионогенных групп гемоглобина с функциональными группами антибиотиков. Описаны реакции возможных типов комплексирования между ними:

1) НЬ02-С00Н + 0Н-АБ-> НЬ-0-С(0)-АБ

2) Hb02-NH2 + 0 = C-AB-+Hb-N = C-AE + H20

3) НЬ02 - NH + О = С - АБ —» Hb - N - СОН - АБ

4) НЮ2 - NH + ОН - АБ —> Hb - N - С - АБ + Н20

5) НЬ02 -1ЧН + ОС = АБ —> НЬ - N - СОН - АБ

Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о механизме повреждения мембран и макромолекул соматических клеток организма при модификации антибиотиками различной природы. Знания в этой области дадут возможность спрогнозировать фармакологический эффект препарата, повысить качество проводимой терапии и разработать эффективную схему лечения пациентов с минимальным риском побочных эффектов. Установленный эффект химической модификации компонентов эритроцитарных мембран особенно важно учитывать при развитии воспалительных процессов различной этиологии, вызывающих ускоренное «старение» эритроцитов (их апоптоз), а, следовательно, и смещение их чувствительности к действию анализируемых антибиотиков. Выявленные особенности взаимодействия АМП с эритроцитарными клетками указывают на необходимость строгого соблюдения режима дозирования, контроля морфологической картины эритрона и, по-видимому, пересмотра назначаемой дозы антибиотика, так как оптимальная доза должна нести максимально благоприятный эффект.

Материалы диссертационной работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2008, 2010), Международной интернет -конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012), Международной конференции молодых ученых (Пущино, 2012), Международной научно-методической школе-конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические и

педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа жизни» (Воронеж, 2013), II Международной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей и 7 тезисов. На защиту выносятся следующие положения:

1. Изученные антибиотики (азитромицин, рокситромицин, кларитромицин, джозамицин, клиндамицин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин), за исключением доксициклина, являются слабыми гемолитическими агентами.

2. Степень изменения гемолитической активности эритроцитов определяется химической природой модификатора, его концентрацией и временем взаимодействия с клеткой.

3. Исследованные антибиотики индуцируют гетерогенные изменения поверхностной архитектоники клеток в популяции эритроцитов. Доксициклин в концентрации 7,8* 10"5 моль/л вызывает, в том числе, и токсический эффект.

4. Исследованные антибиотики, проникая в эритроциты, вызывают изменение соотношения основных лигандных форм гемоглобина, в том числе, снижение/блокирование метгемоглобинообразования в клетке.

5. Степень активности антибиотиков в отношении ионогенных групп гемоглобина определяется их концентрацией и химической природой модификатора.

6. Предложена схема событий, отражающих возможные механизмы изменения структурных свойств эритроцитов и гемоглобина при воздействии АМП различных классов.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 184 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (9 глав), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 56 рисунков и 9 таблиц. В «Приложении» содержится 8 рисунков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

1.1. Классификация антибактериальных веществ

Антиинфекционные химиопрепараты представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Так, только в России в настоящее время используется 30 различных групп антибиотиков, а общее число АМП (без учета дженериков) приближается к 200 [172]. Использование антибиотиков широко распространено как в промышленно-развитых, так и развивающихся странах мира [194, 282]. Многие данные указывают на то, что противомикробные средства часто используются ненадлежащим образом. Согласно современному определению, антибиотики

- конечные продукты обмена веществ организмов, накапливающиеся внутри клетки или выделяющиеся в окружающую среду, обладающие высокой физиоло