Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ"

ч /

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ, БИОХИМИИ и ПИТАНИЯ

сельскохозяйственных животных

На правах рукописи Генинг Татьяна Петровна

*УДК 612-1+619:615+636.087.5

эритроциты млекопитающих в направленном транспорте биологически активных веществ

03 00.13 — физиология человека и животных 16.00.04 — ветеринарная фармакология и токсикология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Боровск — 1992

Работа выполнена на кафедре физиологии сельскохозянстве ных животных и фармакологии Ульяновского сельскохозянстве ного института и на кафедре нормальной физиологии Семипал •гинского государственного медицинского института.

Официальные оппоненты: — доктор биологических наук

профессор А. А. Алиев доктор биологических наук профессор И. В. Сидоров доктор биологических наук профессор В. Б. Акопян

Ведущее учреждение: — Санкт-Петербургский ветеринарнь

институт

Защита состоится « » ______ 1992 го;

в ______ часов на заседании специализированного сове'

Д.020.17.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животш (249010 Калужская обл., г. "Боровск, ВНИИФБиП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзн го научно-исследовательского института физиологии, биохимии питания сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан « »___ 1991

Ученый секретарь Специализированного совета -#&ндадат биологических наук В. Н- Булачев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание нетоксичных и биодеграднруемых. систем адресной доставки химиопрепар?тов в очаг поражения по-' зволит избежать аллергизацин организма, контролировать кинетику освобождения лекарственного вещества, значительно снизить дозы лекарственных препаргг.ов, исключить контакт тканей,-кроме тканей органа-мишени, с активной формой лекарственного1 вещества, а также предоставить возможность конрастирования в диагностических целях паренхиматозных органов (печени и селезенки) п в профилактических целях — создавать активный местны-'! иммунитет. В настоящее время для этих целен в эксперименте п в единичных случаях в клинике используют иммобилизованные лекарственные препараты, липосомы, магнитные микросферы, на-нсчастицы к микрокапсулы из найлона. Однако, надежды на скорое получение с помощью искусственно созданных носителей эффективного средства доставки лекарственных препаратов при системном введении в организм пока не оправдались. Кроме частных причин имеются общие препятствия, связанные со стабильностью и фармакокинетикой таких носителей в организме. Много сообщений об их дестабилизации и лизисе под действием компонентов крови. Кроме того, даже «пустые» искусственные носители и, в частности, липосомы вызывают реакции при введении в организм: повышение уровня глюкозы в крови и мозге, нарушение свертыва ;мости крови, уменьшение содержания пролактпна в сыворотке.

В то время как наблюдения при длительном введении эритроци-гарных носителей показатели отсутствуе каких бы то ни было по-эочных эффектов. Таким образом системы доставки, в которых используют собственные клетки организма, в частности, эритроциты, будут более выгодны с точки зрения их совместимости.

Эрнтроцитарные контейнеры можно использовать в двух целях: 1ля создания депо лекарств вне клетки н для доставки лекарств в слетки органа-мишени. И если в первом случае, видимо, следует гепользовать эрнтроцитарные контейнеры с максимально сохра-генньшн размерами, формой, поверхностным антигенным соста-юм, реологическими характеристиками исходных эритроцитов, •о во втором случае следует искать такие способы обработки эри-роцитов и включения в них переносимых веществ, которые повышали бы тропность получаемых носителей к органу-мишени.

Эрнтроцитарные контейнеры без искусственных векторов в за-исимости от способа включения в них транспортируемого веще-тва имеют различную выживаемость в кровеносном русле. Одна-

з

ко, тот факт, что большая часть их, введенная в организм, захватывается печенью, привел к тому, что среди специалистов и в широких научных кругах возникло пессимистическое настроение по во просу применимости эритроцнтарных носителей в биологии, ветеринарии и медицине. Такой пессимизм на данном этапе, возможно; и оправдан, если иметь в виду доставку заключенных в эритроциты веществ к отдельным тканям. Однако знание механизмов взаимодействия эритроцнтарных носителей с клетками и ряд методических приемов позволит успешно применить эритроцитарные носители в ряде областей ветеринарии и медицины и, в первук очередь, в гепатологии.

Однако отсутствие фундаментальных работ по включению е эритроцитарные носители различных классов лекарств, по изучению фармакокинстики таких лекарств, а также исследований пс токсичности и иьшуногенности самих эритроцнтарных носителе! привело, с одной стороны, к неоправданным надеждам бысгрогс использования эритроцнтарных носителей для направленного тран спорта лекарств к органам и тканям, а с другой — к недостаточ ному пониманию возможностей их использования в ветеринарной медицинской и зоотехнической практике.

Таким образом, учитывая в первую очередь, огромное практи ческое значение данного направления в трансфузиологической био технологии в связи со все возрастающими потребностями в кон струировании новых лекарственных форм, а также актуальное^ изучения фундаментальных механизмов эритродиэреза быт сформулированы цель и задачи исследования.

Цель и задачи исследования- Целью диссертационного иссле дования являлось изучение возможности использования гомоло гичных эритроцитов млекопитающих, не снабженных дополнитель ным искусственным вектором, в направленном транспорте лекар ств-

Для реализации поставленной цели необходимо было решит следующие задачи: 1. Разработать условия получения эритроцг тарных носителей для различных классов лекарств; 2. Разрабс тать тест-систему для оценки функционального состояния эритрс -нптов: 3 Изучить токсичность и иммуногсыность эритроцитарны носителей при длительном введении их в организм; 4. Изучит фармакокинетику лекарств, вводимых в организм, в эритроцита}: ных носителях; 5. Показать преимущества использования эритрс

.итарных носителей в направленном транспорте различных класов лекарств: антибиотиков, рентгепконтрастных веществ, вакцин, ормонов.

Научная новизна. Работа представляет собой первое комплексное исследование эритроцитов, как системы для направленного ранспорта лекарств. На основе выполненных биохимических, ги-тологических, морфологических, электрофизиологических и им-[унологических клинических и экспериментальных исследований проведенного на их основе анализа получена система данных, озволяющих говорить о создании новой системы для направлен-ого транспорта лекарств в клетках крови. Разработаны способы ключения в эритроциты млекопитающих антибиотиков, рентген-онтрастных веществ, микробных клеток и гормонов. Разработала тест-система для оценки функционального состояния эритро-;итов. Установлено, что длительное введение эритроцнтариых но-ителеи в организм не вызывает никаких отрицательных побоч-ых эффектов. Впервые изучена фармакокинстика лекарства, вво-.имого в организм в эритроцнтариых носителях без дополнитель-ого вектора. Предпринята попытка расширить представления о5 эволюционносложившихся функциям эритроцитов млекопитаю-цих.

Теоретическое и практическое значение. В работе представле-ta система новых данных о физиологии эритроцитов млекопитающих, о зависимости функциональных систем безъядерных эрн-роцитов от состояния макрооргапизма, о поведении in vivo эрн-роцитов, прошедших процедуру осмотического гемолиза, которые асшпрягот и углубляют существующие в физиологии системы ровн представления о функциях эритроцитов. На основании био-имических и иммунологических исследований впервые устаноп-ено отсутствие токсичности и иммуногсниости эритроцитов, про-1едших процедуру осмотического гемолиза, что является вкладом экспериментальную и клиническую гематологию. Разработан-ые режимы обратимых изменений проницаемости эритроцитарной 1ембраны под действием диффузионного потенциала представляют интерес для мембранологпи, где эритроцит традиционно ис-ользуется в качестве модели мембраны.

Установлена возможность стимуляции лактации крупного ро-атого скота микроколичествами экзогенного соматотропиого горюна, доставленного непосредственно в печень, что позволяет точннть механизм действия этого гормона и расширить существующие представления о функциях печени.

Разработанный способ идентификации безъядерных эритрощ тов (А- с- 1300558 и А. с. 1471107) используется в гематологии урологии, способ включения шигелл в эритроциты (А. с. 1517172 используется для получения иммунных сывороток, способы лече «ия и контрастирования печени и желчевыводящих путей (А. < 1641350) и заявка № 4603154/14 (068925), положительное реше •ние от 19. 12. 90 г.) используются в гепатологии, способ стимула дни лактации у крупного рогатого скота (заявка № 4910515/1 (13766), положительное решение от 23. 09. 91 г.) используется молочном животноводстве для корректирования лактационно кривой, при восстановлении продуктивности после переболевани маститом, после технологического и температурного стресса, дл стимуляции лактогенеза у нераздоившихся коров. Результаты дис сертационного исследования, касающиеся оценки функционально то состояния эритроцитов, могут быть использованы в экспери ментальных и клиникодиагностических лабораториях. Результа ты диссертационного исследования по фармакокинетике антибис тика, вводимого в организм в эритроцитарных носителях, могу быть рекомендованы в качестве информационной основы для раз работки схем антибиотикотерапии при различных патологиях.

Внедрение. Результаты исследований, защищенные авторски МИ свидетельствами на изобретение и опубликованные в ряде ста хей, используются с целью диагностики, лечения и профилактик: «а клинических кафедрах Алма-Атинского и Семипалатинскоп государственных медцинских институтов, в Ульяновском сельско хозяйственном и Омском ветеринарном институтах, в хозяйства: Ульяновской области, в центральной городской больнице, детско! инфекционной больнице, облонкодиспансере, областной клиничес кой. больнице г. Семипалатинска, в НИИ эпидемиологии, микро биологии и инфекционных болезней (г. Алма-Ата).

Апробация работы. Результаты исследований н основные мате риалы диссертации были представлены и обсуждены на 1-01* съезде физиологов Казахстана (Алма-Ата, 1988), на XV Всесоюз ном съезде физиологов (Ленинград, 1985), на Всесоюзной науч но-техническоп конференции по проблемам создания лекарствен пых форм с заданными биофармацевтическими свойствами (Харь ков, 1989), на симпозиуме «Обмен при зимней спячке и естествен лом сне» (Махачкала, 1985), на заседаниях школы-семинара пс современным проблемам биохимии (Новосибирск, 1989), на засе даниц кафедры нормальной физиологии Центрального ордена Ле

нша Института усовершенствования врачей» а также па итоговых ручных конференциях Семипалатинского государственного меди-динского института и Ульяновского сельскохозяйственного ннстн-гута (ЩЗО—1991 гг.)

Публикации- Основные результаты диссертационного исследования изложены в монографии и 16 опубликованных работах-

На защиту выносятся:

- положение об отсутствии токсичности и иммупогепности эрит-юцитарных носителей, полученных из гомологичных эритроцитов ютодами гипоосмогического лизиса;

- положение об изменении фармакоккнетикн антибиотика при ведении его в организм в эритроцитарных носителях по сравнение с традиционными способами введения;

- тест-система для оценки функционального состояния эритроци-ов;

- способ включения в эритроциты млекопитающих цельных мик-обных клеток;

- способ идентификации безъядерных эритроцитов методами лю-инисцентной микроскопии;

- способ включения в эритроциты млекопитающих антибиотиков;

- способ включения в эритроциты млекопитающих рентгенкон-эастных веществ;

- способ включения в эритроциты крупного рогатого скота со-атогропиого гормона;

- способ лечения гнойно-воспалительных заболеваний печени и елчепыводящнх путей;

- способ получения иммунной сыворотки;

■ способ контрастирования печени и желчевыводящих путей;

■ способ стимуляции лактации крупного рогатого скота;

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации нз-•жено на 397 страницах машинописного текста, включающего еденис, 5 глав, заключение, выводы и список использованной ли-рагуры. Диссертация иллюстрирована 37 рисунками и 60 таб-щами. Список использованной литературы составляет 493 рады, из которых 316 на иностранных языках.

Глава I. Функциональные системы эритроцита в

кровеносном русле

Зрелые эритроциты млекопитающих представляют клетки ли-«^основных субклеточных структур: ядра, митохондрий J, ■ 1Ф в них Образуется исключительно глнколнтнчсс-

кнм путем.

Гликолититеская цепь оснащена большим количеством пото-п прямых и Обратных связен, авторегулирующих ко цеГтраш, Too

WТТт ПР0ДУКТ0В ..11СГШ в "У"™ Р^ветвленпй &Г"каждый из контуров прямой и обратной связи не функцпонпп-4 а«

Г При °бра3°М «-Действует с^^сеГ "Сальны

mil. llpn этом изменение активности одного энзима нопи кпг шло, приводит к изменению активности другиГфсрмеЙоГвЖ' ствие взаимодействия контуров регуляции. ФЧ^ентоь вслед

SSSZSJSX

ГЖЙГМ -ивно- сразу

и 2 3ЛПФГ 1С"абжаст эритроцит энергией, активным водородом

Jrii, ? ' ОТ анаэР°бн"» способ превращения глюкозы тесн, связан с функционированием гемоглобина. ^нжозы тесгг

Важную роль при защите эритроцита от перекненого опгг-гг

ГстГовленЕо ГГ ГЛуГа™°»а- Д™ и о д д ер ж а^п I я последнего восстановленной форме особое значение имеет аэпобный пп.п,

тельный способ превращения глюкозы _ ^нтшофосфат ый , п-

Его доля в общем обмене глюкозы в эрит^То^Х,^

роцн™ГЯ Пэ?оеппалЩиТЫ ГСМ0гл0б1»1а ФУикшгя глутатноиа в эр,г роцитах - эго поддержание нормальной эластичности клето^нс

ог.«"ю0суще,ствляст детоксикации г

«1 шшеншо ко многим ксенобиотикам (СйазБеис! 1974) V,-, вень восстановлрцного глутатптп « -.,■.. . .? Ур

1.ш1и1ишии .Ы)Ытшш-в эритроците зависит от ск

Таким образом, для синтеза глутатпона необходима энергия, аккумулируемая в АТФ, которая образуется в процессе гликолиза, для нормального протекания которого необходим восстановленный глутатиоп-

Восстановленный глутатиоп играет также существенную роль в стабилизации мембранной структуры оболочки эритроцита- Показана зависимость обменной диффузии иона натрия через эрпт-роцитарную мембрану от SH-групп (Motáis, Sola, 1973)-Нарушение синтеза глутатнона, увеличение его распада, так же, как и нарушение систем регулирования его уровня приводят к гемолизу (Lo, Marti, Kltzig, 1971).

Глава 2. Тест-система для оценки функционального состояния эритроцитов.

Исходя из взаимосвязи метаболических цепей в эритроците, обеспечивающих его структуру и функции в кровеносном русле, па основании анализа многочисленных публикаций в отечественной литературе и за рубежом, посвященных различным способам исследования функционального состояния эритроцитов и на. основании собственных данных по изучению состояния эритроцитов в норме и при различной патологии у человека и животных нами отобраны показатели, адекватно отражающие функциональное состояние эритроцитов во всех рассмотренных случаях. В качестве таких показателей с учетом простоты и доступности методов их определения, мы предлагаем определение активности ферментов:

1. Na+, К+ — АТФ-азы. Это актпвиотранспортная система в эритроците, локализованная в цитоплазматической мембране. Осуществляет энергетическое обеспечение активного обмена через мембрану ионов К-Ь и M ' a. АТФ-азы связаны с гликолизом, со спектром и жидкостпостыо мембранных липндов эритроцита. Нами установлено изменение активности фермента в эритроцитах млекопитающих при гипотермии, на фоне беременности, эндогенной интоксикации, в популяциях эритроцитов разного возраста, на фоне иммуностимуляцпн, а также в эритроцитах, прошедших процедуру включения биологически активных веществ, а также в эритроцнтарных контейнерах, полученных из эритроцитов млекопитающих.

2. Глутатиоиредуктаза (КФ 1,66.4.2.). Место фермента в обменных процессах эритроцита хорошо видно из схемы основных метаболических путей в клетке. Это фермент антиокислителыюй защиты, при недостаточности которого уменьшается продолжн-

тельность жизни эритроцитов. Нами установлено изменение активности фермента в эритроцитах млекопитающих, детей и половозрелых особен, при различных физиологических состояниях, при выраженной эндогенной интоксикации организма различной этиологии, £ также в эрнтроцигарных контейнерах, полученных из эритроцитов млекопитающих.

3- Суперокеиддисмутаза (супероксид-оксидорсдуктаза КФ М5.1.1.). Фермент обезвреживает одну из форм активного кислорода — супороксидные анион-радикалы (02), которые, могут принимать у-частно в окислительном повреждении эритроцитов, превращая их в менее реакционноспособные молекулы Н202 и три-плетпого кислорода. Как следствие генерации 02 рассматриваются перокендация лнпидов мемораны эритроцитов, появление те-л:ц Геинца п гемолиз. Нами установлено изменение активности фермента по мере старения эритроцита, при пневмонии, осложненных формах острых хирургических заболеваний органов брюшной п;:лости, а также в зритроцитарных контейнерах, полученных из эритроцитов млекопитающих разными способами.

Для оценки функционального состояния эритроцитов предлагается также определять интенсивность гликолиза в клетке по количеству лактата в кулътур'альной среде. По мнению ряда авторов, высокие концентрации лактата являются не только физиологическим сигналом кислородной недостаточности, но и непосредственно стабилизатором, способствующим сохранению нормального катиоипого состава клетки (речь идет о лактате крови). Механизм этого воздействия может быть связан с угнетением гликолиза избытком лактата н КАД-Н (Иаророг!, 1978), приводящим к ун сличению входа глюкозофосфата в пеитозный цикл, в реакциях которого образуется НАДФ-Н, используемый через глутатионредуктазную систему для восстановления тиоловых групп мембраны и внутриклеточных фрагментов, в том числе и N3+, К.4-— АТФ-азы. Сдвиг кривой диссоциации окенгемоглобпна вправо под влиянием лактата, видимо, за счет накопления в эритроцитах 2,3 — ДФГ (ВеиНег, 1978) может положительно сказг'ъся па газообмене. Таким образом, количество лактата в культуральной среде эритроцитов, взятых из кровеносного русла и инкубированных в среде непродолжительное время, с одной стороны, будет отражать сбалаЕ1снрованность вышеперечисл_ец1ши-{тредессов гг

JШШieт-G-дfyf:wr==^тíГбyдeт лактат только эритроцитов в отличие от лактата крови. Разработанный нами способ прост и дает воспро-извидпмые результаты (Гешшг Т. П. с соавт., 1.987)-

Нами установлено, что предлагаемый тест адекватно оценивает состояние эритроцитов после хранения в консервантах, в условиях температурного стресса, при патологии системы дыхания и системы кровн, при гипоксии и гипотермии, при лейкозе и на фоне беременности, состояние эритроцитов разного возраста и полученных из них эрлтроцитарных контейнеров.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет оценивать функциональное состояние эритроцитов и, следовательно, может быть использована при прогнозировании выживаемости последних в кровеносном русле.

Для оценки различных способов получения эрнтроцитарных носителей, а также формы и размеров последних после включения в них лекарств были необходимы способы, позволяющие наблюдать эритроциты млекопитающих в световом микроскопе. Однако, согласно данным литературы, эритроцнтарные контейнеры не

могут быть наблюдаемы в световом микроскопе. Выявить тени эритроцитов позволяет только фазовоконтрастный метод (Ра-1ек, ОИигсЬ, Ракьапэ, 1980), который предполагает использование

малодоступной и жестко фиксирующей чегырехокисн осьмня. Использование люминисцентной микроскопии считалось невозможным потому, что самостоятельной люминисценцией в форме кратковременного красного свечения обладают только отдельные эритроциты (Закржевский Е., Васильева Л., 1963). Интенсивность свечения первичной флуоресценции эритроцитов крайне мала. Витально флюорохромированные эритроциты не флюоресцируют вследствие того, что гемоглобин гасит свечение (НаШг^ег, 1959).

Нами разработан способ, позволяющий получить длительно и стабильно флюоресцирующие эритроциты и их тени (Ас. № 1305558).

Метод апробирован при обследовании контрольной группы здоровых доноров, больных с различными формами анемии. Исследовали также эритроциты трупной крови, свежие эритроциты крыс

и тени эритроцитов, полученные методом гнпоос.мотичеекого шока. Метод позволяет выявить не только форму и размеры, но и характер стечения эритроцитов и эритроцнтарных контейнеров. Све-ченне сохраняется более трех месяцев. Предлагаемым способом

выявляются все разновидности теней эритроцитов.

И

Глава 3. Методы получения и биокинетика эритроцитарных носителей

3.1. Методы получения эритроцитарных носителей.

Инкапсуляция биологически активных соединений позволит защитить вводимое in vivo вещество от разрушения в кровеносном русле, позволит исключить контакт с иммунной системой и контролировать кинетику высвобождения активного начала.

Преимущества инкапсулированных лекарств наиболее ярко проявляются при создании систем направленного их транспорта. При этом системы доставки, в которых используются собственные клетки организма, наиболее выгодны с точки зрения биологической совместимости- Эритроцитарная оболочка нивелирует до биологической совместимости побочные эффекты, присущие лекарственным препаратам, обеспечивает депонирующий эффект их действия. предохраняет активное начало введенных препаратов от инактивирующего действия биологических секретов.

Включение в эритроциты биологически активных веществ может быть осуществлено различными способами.

Метод гипоосмотического лизиса при получении эритроцитар ных контейнеров используется в четырех модификациях.

1. Эритроциты суспендируют в гипотоническом растворе или в воде при объемном соотношении клетки: лизирующий раствор 1:3 или 1:4. При таком соотношении клетка теряет в процессе лизиса 60^-70% своего содержимого (Вакег, Gíllis, 1969)- Последующее восстановление проницаемости эритроцитарной мембраны происходит при восстановлении тоничности среды до физиологической добавлением 9°/о-го раствора NaCl. Если соотношение клетки. визирующий раствор будет больше указанного, в ходе гемолиза теряется почти все содержимое клетки, остаются так называемые «белые тени» эритроцитарных мембран, которые быстро уничтожаются in vivo фагоцитирующими клетками.

2. Лизис с предварительным набуханием. Rechtsteiner (1975) суспендировал эритроциты- в слабо гипотоническом растворе, который еще не вызывал гемолиз. Затем клетки отделяли от раствора и вызывали полный гемолиз их

-CXRa-ввдьь-В шли1Ше-с)т предыдущего процесс гемолиза происходил быстро. При этом в клетках сохраняется больЬая часть молекул' АТФ и цитоплазматические ферменты- Такие клетки лучше выживают in vivo (Humpreys, Ihler 1980) .

о СЬ-ь*

.............Jïfffl- -

' > ч' * . ' ' чi '

•• . ., К,- '<*////." i

- - ' ^.í^íav.

1-Л, V//••■■ /.y,./, .

----Ci * •

^ ______J x ■

"Ce К

'..ü ci

■0) о ■•t

, ÍC

S s

íi о и ¡3

ö s?

10 ж

.s s

•il . -О, !

= "0 (I 45

«

Ч

■s- « У

«i « - ) »

3. Лизис при диализе. Упакованные при центрифугировании эритроциты помещают в диализный мешок и лнзируют в ходе диализа против гипотонического раствора. Так как большие молекулы не проникают через диализный мешок, потеря ферментов

минимальная (Dale et al 1977; De Loach et al, 1979).

4. Осмотический лизис в нзо'тонпческом растворе. (Billahetal, 1976) показали, что эритроциты, содержащие этиленгликоль, который включается в клетки диффузно, могут быть лизированы и целостность мембран их может быть восстановлена в изотоническом растворе при смешивании со средой, свободной от этиленгли-коля.

Ряд биологически активных соединений может быть включен в эритроциты при индукции эндоцитоза.

Кратковременное повышение проницаемости клеточной мембраны эритроцитов возможно при помещении клеток в электрическое поле высокого напряжения (Kinosita, Tsohg, Pilwat, Viem<en 1980). При этом большие поры образуются при повышении интенсивности поля, при увеличении продолжительности импульса либо при уменьшении ионной силы раствора (Zimmermann, Pihvat, Riernan 1975).

Поры открываются при низких температурах и закрываются в условиях инкубации при 37°С. В соответствующей среде перфорация клеток ндет без гемолиза, позволяя готовить эритроцитар-ные контейнеры, длительно живущие in vivo.

Нами отработаны режимы включения различных биологически активных соединений в эритроциты млекопитающих методом ги-поосмотического лизиса и при помещении клеток в электрическое поле. Для включения во внешнем электрическом поле нами было разработано специальное устройство (информационный листок № 15-87, 1986 г. Семипалатинский ЦНТИ).

В таблице 1 приведены оптимальные условия для включения в эритроцитарные контейнеры ряда биологически активных соединений и цельных микробных клеток.

3.2. Устойчивость эритроцитарных носителей.

Требования к устойчивости эритроцитарных носителей на вытекание включенного в них препарата in vivo будут, видимо, различными в зависимости от конечной цели, с которой эти носители

"ч>"' Таблица 1

Оптимальные условия включения биологически активных веществ и цельных микробных клеток в контейнеры из эритроцитоз млекопитающих методом гипотонического лизиса

^ с

сп ;

- •■мл л жзкец а я»

У слов и я в к л ю че н ия

Вк.иоч.

соотно'пс-р-р препа- ипс ярпг: ; оухшшя I .чпчир. I (% N--^1) I рисгвор

0:101 ПО!ЦеП. ьрн ¡р.:

р-р БКЛЮЧ.

сэ а»-а

П •

г. и ¿-2

Время инкуб, при 37СС

М1К1.

Крысы

Ц

Человек Крысы Овцы гг

еитамн-Ш

страцнк-тна дрохл.

3. Человек Окситет

Крысы Овцы

4. Человек Г Крысы Овцы

5. Человек А

Крысы Овцы

6. Коровы

7. Поросята

рапикл. Нидрохл. "умОокицин

орфоцик-

1Ш1

1251-СТГ

25-1 прогестерон Нигеллы

8. Человек

9. Кролик Б]руцеллы Человек

0,65 1:1 1:10 60 мг/мл 3 0,014 60

0,65 1:5 1:2 25 мкг/мл 1 0,014 120

0,00 1:10 1:2 —»— 3 0,020 90

—. 1:7 1:2 —»—. 4 0,030 60

0,05 1:5 1:2 —»— 1 0,014 120

0,60 1:10 1:2 —»—. 3 0,020 90

— ):/ 1:2 —»— 4 0,030 60

0,65 1:5 1:2 —»— 1 0,014 120

0,60 1:10 1:2 —»— 3 0,020 90

— 1:7 1:2 —»— 4 0,030 60

0,65 1:5 1:2 —»— 1 0,014 120

0,60 1:10 1:2 —»— 3 0,020 90

— 1:7 1:2 25 мкг/мл 4 0,030 60

0,75 1:10 1:2 2,5 мкг/мл 1-7-3 0 360

— 1:2 1:2,5 1 мкМОль/л 3 0,014 30

_ 1:10 1:10 2 млрд/мл 40 0,014 120

— 1:10 1:10 1 млрд/мл 20 0,030 120

— 1:10 1:10 —»— 20 0,030 120

2

используются. В любом случае они должны быть устойчивы в кровотоке в течение отрезка времени, равного или большего времени кругооборота крови.

На основании литературных данных можно заключить, что устойчивость эритроцитарных контейнеров к вытеканию включенного в них препарата зависит как от способа включения, так и от способа включения, так и от свойств самого препарата.

Нами была изучена устойчивость эритроцитарных носителей к вытеканию ряда биологически активных соединений и потере цельных микробных клеток- Результаты представлены в таблице 2.

Относительно количества препарата, включаемого внутрь эрн-гроцитарных носителей, данные литературы немногочисленны. Так Lynch с соавт. (1980) указывают, что при гипоосмотическом лизисе приблизительно 1/3 от общего объема клеток может быть заменена раствором включаемого вещества. Sprangel с соавт. (1980) показали, что количество включаемого препарата значительно варьирует в зависимости от видовой принадлежности эритроцитов.

Мы определили процент включения вышеперечисленных биологически активных соединений и цельных микробных клеток в эритроциты человека, крысы, мыши, овцы, кролика, поросенка ц коровы. Было, установлено, что водорастворимые антибиотики включаются в эритроциты млекопитающих приблизительно в равном количестве. В этих же пределах (1СН-20°/о) варьирует и включение гормонов — прогестерона и соматотропного гормона- Это может быть связано с одинаковым механизмом инкапсуляции в клетке водорастворимых соединений с небольшим молекулярным весом,- Включение их происходит в результате обменной диффузии через образующиеся в клеточной мембране поры.

В значительно больших количествах (27-^30%) включается в эритроциты млекопитающих цельные микробные клетки. Возможно, что в данном случае помимо диффузии имеет место эндоцнтоз замкнутыми тенями эритроцитов. Однако, это предположение не имеет пока доказательств.

При сравнении количеств препарата, включаемого в эритроциты млекопитающих методом гипотонического лизиса и во внешнем электрическом поле следует отметить, что в последнем случае, при нспользованных нами режимах включения водорастворимые антибиотики включались в значительно меньших количествах;

Таблица 2

Количество включаемого вещества, определяемое в надоеадочной жидкости при тировании раствором Хенкса и сывороткой крови клеток-Контейнеров из эритроцитов млекопитающих

л-л

1

2 с?

со

2

м 3

о о.

15 мнну

Раствор Хенкса 30 мину

45 мину

2

о

<о

Сыворотка

15 минут 30 минут

6

Тетрацикл.1 гидрохлория (мкг/мл)

2. Окситетрац! гидрохлорид| {мкг/мл)

0,040±0,006 0,015±0,0060,010+0,004 0

0,030+0,010 0,010 + 0,004 0 0

0,060+0,017 0,040 + 0,0123,010+0,005 0

0 0

0 О

0,050 + 0,021 0,020+0,0050,010±0,004 0

Человека п= 15 Крысы п = 20 Овцы п= 10

Человека 0,030 ±0,009 0,010±0,003 п= 15

0,010 + 0,003 0,007±0,002

Крысы

II=20

Овцы п= 10

3. Румбоцнн (Человека (мкг/мл) | п=15

Крысы п = 20 Овцы п= 10

4. Морфоцйклт! Человека 0,015±0,005 0,005+0,002 (мкг/мл) | п=15

Крысы 0,010 ±0,004 Следы

0,510+0,019 0,120 + 0,055 0,470 + 0,120 О 0,600 + 0,211 0,140±0,062

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0,020 + 0,002 0,010±0,00! 0,25 ±0,007 0,040±0,012 0,015 + 0,008 0,55 + 0,023 0,040 + 0,018 0,030+0,012 0,070±0,014 0,010 + 0,004 0,010±0,006

45 мин

й о

9 10 11

Следы 0 0

Следы 0 0

Следы 0 0

0,020 ±0,004 Следы 0

Следы 0 О

0,020 + 0,003 Следы 0

0 0 0

0 0 0

0,010 + 0,002 0 О

Следы 0 0

Следы 0 0

Таблица 2 (продолжение)

10

«-■гужгггзгх:

п = 20 Обцы и = 10

5. Геита мицин Крысы (мкг/мл) н = 20

Б. 1251-СТГ Коровы п = 25

0,030+0,010 Следы

В. Шигсллы

Человека и = 20

1,5±0,32

7. 12:31-н рогрес Поросята 2,6±0,01 (ерин (нмоль/л) и = 8

0,3 ±0,08 1.1 ±0,13 о

0 О 0,010±0,016

— 115,6 ±36,2

0 0 2,0 ±0,76

0 0 1,9 ±0,27

0 0

0.010 ±0,004 0

14,8± 1,13 Следы 0

0,7+0,040 0

0,5 ±0,0(5 0

О О

7

8

О

О

Примечание: п — количество проб

эритроцитов от разных доноров;

цельные микробные клетки включались в единичных случаях, а изотопсодержащне гормоны после помещения в электрическое поле с напряжением 940 В не проявляли специфической активности.

3.3. Органоспецифичность клеточных носителей

Органоспецифичность эритроцитарных носителей, не несущих соответствующих антител к органу-мишени, будет определяться в первую очередь, способностью эритроцитов фиксироваться эрит-рофагоцнтирующими клетками, в основном, в печени и селезенке.

Попытки использовать эрптроцитарные носители, коныогиро-ванные с антителами к органу-мишени, в частности, с антителами к коллагену, увенчались успехом в опытах SamoKhin с соавт. (1983). Однако, следует ожидать значительной аллергизации организма чужеродным белком антител. Кроме того, покрытые антителами эритроциты имеют укороченное время циркуляции in vivo. При очень высокой концентрации антител на поверхности эритро-цитоз деструкция клеток может происходить при комплементин-дуцпрозапиом гемолизе внутри сосудов.

Эритроциты, поврежденные при обработке глутаровым альдегидом, сульфгидрцальными агентами и антителами, нейрамини-дазон, а также после длительной циркуляции в кровеносном русле, выводятся путем фагоцитоза в селезенке и печени (Beutler et al, 1977; De Loach et al, 1977; Gregoriadis et al, 1974). При этом эрптроцитарные носители с минимальным уровнем повреждения выводятся большей частью селезенкой, которая удаляет минимально поврежденные эритроциты. Эритроцптарные носители со значительной степенью повреждения выводятся преимущественно печенью. Эритроциты, поврежденные при термической обработке, на 30% фиксировались синусоидальными клетками печени (Вillali et al, 1976).

Нами было изучено распределение in vivo эритроцитарных контейнеров, полученных из эритроцитов мыши. Эксперимент выполнен на мышах линии RalB/c. Эритроциты и эритроцптарные носители метили 51Сг и вводили мыши в хвостовую вену-

Животные, которым вводили интактные меченные эритроциты — Серия 1.

Для оценки роли поверхностного слоя -мембраны эрптргцшхоа-

меченные 51 Сг, дополнительно обрабатывали таншшом в разведении 1:10000 и также вводили в хвостовую вену — Серия II.

Эрнтроцитарные контейнеры получали двумя способами:

а) методом гипотонического лизиса при диализе (Серия III) к

б) методом гипотонического лизиса с пренабуханием (Серия IV).

Для изучения распределения in vivo эритроцитариых контейнеров, покрытых неспецифическими антителами, на поверхность контейнеров, меченных 51Сг, «пришивали» с использованием овп-динбиотиновой сшивки у — глобулин кроличий. — Серия V.

Животных всех серий забивали декапитациеп через 40 минут, 16 часов, 2-е, 3-е, 6-ть и 8-мь суток после введения эритроцитариых контейнеров, у ■— активность по каналу 51Сг просчитывали в сердце, легких, печени, селезенке, почках и цельной крови на у —счетчике фирмы LK.B (Швеция). Было установлено, что распределение радиоактивности в серии 1 соответствует степени кровоснабжения органов, а высокий процент метки в кровеносном русле при одновременном низком содержании ее в почках свидетельствует о том, что метка с эритроцитов не смывается.

Анализ данных серии II показывает, что такие клетки уже через Í0 минут после введения их количество в крови составило ются печенью. В дальнейшем эта цифра только возрастает, и через 9 суток после введения она составляет уже 91,64%. Из кровеносного русла такие эритроциты исчезают стремительно. Через 30 минут после введения их количество в крови • составило 0,21/), а к 9-ым суткам после введения эта цифра уменьшилась до 0,03%. Таким образом, обработка эритроцитов мыши танни-ном ргзко увеличивает их тропность к печени. Этот вывод подтверждается данными по удельной активности органов. В печени она на всех сроках после введения, начиная с суток, была максимальной по сравнению с другими органами н тканями.

В 'серии III мышам вводили клетки-контейнеры, полученные из меченных 51Сг-эритроцитов методом гипотонического лизиса при диализе- Установлено, что такие контейнеры в основном (до вв,56So) фиксируются клетками печени н сс^ргниготся гам до 8-ми суток после введения. Следует также отмстить высокую удельную радиоактивность в ткани селезенки, что может позволить использовать и этот орган в качестве мишени при направленном транспорте биологически активных соединений в эритроцитариых контейнерах этого типа.

В серии IV животным вводили клетки-контейнеры, полученные из эритроцитов, меченных 51Сг, методом гипотонического лизиса с пренабуханием. В данных этой серии обращает на себя внима-

пп'е достаточно высокий процент радиоактивности, обнаруживаемый в крови на протяжении всего периода наблюдения, то есть с 40 минут до 8-ми суток после введения. Этот факт, видимо, согласуется с данными литературы о лучшем функциональном состоянии таких клеток-контейнеров, что позволяет им дольше оставаться в кровеносном русле. .Обращая внимание на этот факт, мы полагаем, что это позволит в дальнейшем использовать эритроцнтар-ные контейнеры, полученные методом гипотонического лизиса с пренабуханием, для пролонгирования эффекта препаратов непосредственно в кровеносном русле.

Основная же масса введенной радиоактивности по каналу 51Сг обнаруживалась в печени. При этом процент ее в печени в первые три дня после'введения составил в среднем 81,43+0,098% и уменьшился в 8-му дню после введения до 48,64%, в основном, за счет увеличения процента метки в крови (25,85%). Такое перераспределение радиоактивной метки, как мы полагаем, явилось результатом концентрирования в кровеносном русле фракции устойчивых клеток-контейнеров, не подвергающихся элиминации по механизмам, работающим для поврежденных клеток-

В серии V мышам вводили эритроциты, меченные 51Сг, с фиксированными на них антителами. Обращает на себя внимание факт быстрой элиминации таких клеток из кровеносного русла: через четверо суток после введения радиоактивность во всех исследуемых органах и тканях была на уровне фона. При этом максимум введенной радиоактивности обнаруживался в печени и селезенке через сутки после введения эритроцитов. Уровень радиоактивности в крови за этот период уменьЬился с 58,18% (через 30 минут после введения) до 6,58 проц. В дальнейшем изменение процента от общей введенной радиоактивности в этих тканях носило волнообразный характер. Обращает на себя внимание также факт высокой удельной радиоактивности но каналу 5|Сг в ткани легких.

Таким образом, эритроциты, покрытые неспецифическнмн антителами, достаточно быстро выводятся из кровеносного русла. При этом они фиксируются тканью печени, селезенки и легких

3.4. Фармакокинегнка биопрепаратов, включенных

в эритроцнтарные носителя^—---

представляет возможности сопоставить фармакокинетику биопрепаратов, вводимых в организм в эритроцитарных носителях с таковой при традиционных способах введения, а, следовательно, и продемонстрировать достоинст-20

ва и недостатки такого направленного транспорта биологически активных соединений.

Изучение фармакокинетики биологически активных соединений Есегда преследует две цели: возможно более полное значение их терапевтических возможностей и опасности побочного действия. При этом биопрепарат подвергается изменениям, сущность которых определяется физиологическими процессами. Действие лекарственных препаратов, вводимых в организм традиционными способами, осуществляется за небольшим исключением, вневаскуляр-но. Однако, кинетика содержания в тканях — наименее изученная из фармакокинетических характеристик- Это объясняется методическими трудностями и трудоемкостью исследований такого рода

В доступной литературе мы не обнаружили данных о фарма-.кокинетических исследованиях препаратов, вводимых в организм .в системах направленного транспорта вообще, и в эрптроцнтар-:Ных носителях, в частности. В то же время практическое приложение результатов фармакокинетических исследований весьма обширно.

Нами в эксперименте изучена фармакокинетика представителей двух классов веществ, вводимых в организм млекопитающего в эрнтроцигарных носителях — это соединения белковой природы .и синтетические препараты, обладающие антимикробным действием и не метаболизирующиеся в организме. R качестве представителя группы белков использовали бычий сывороточный альбумин Эксперимент проведен на белых мышах линии BAIB/C- Альбумин метили 1251. Меченный альбумин включали в эритроциты мышей .двумя способами, а) Методом лизиса при диализе — серия VI. б) Методом гипотонического лизиса с пренабуханием — серия VII. Контрольной группе животных вводили внутривенно раствор 1251-альбумин на физиологическом растворе (БСА).

Распределение изотопмеченного БСА при внутривенном его введении соответствует обычному распределению чужеродного белка в организме при данном способе введения. При анализе распределения меченного БСА, вводимого в организм в эрнтроцитар-ных контейнерах (рис. 1—4) отмечается следующее. Через 40 минут после введения (серия VI) большая часть введенного БСА обнаруживается в печени (54,5%) и в следующие б дней эта цифра мало изменяется. Количество препарата в легких достигает максимума на-второй-день после введения (16,45%) и уменьшается к ■8-му дню после введения до фоновых величин. Количество препарата в почках возрастает с 7,38% через 40 минут после введейия до 16,13% — на 6-ые сутки после введения- Обращает на себя вни-

мание высокая удельная активность по каналу 1251 в ткани легких. Через 16 часов и на 2-ые сутки после введения она превышала таковую в ткани печени и селезенки.

Таким образом, внутривенное введение белкового препарата, предварительно включенного в клетки-контейнеры из гомологичных эритроцитов, изменяет его фармакокинетику по сравнению с обычным внутривенным введением. Препарат, введенный в контейнерах, полученных методом гипотонического лизиса при диализе, фиксируется, в основном, в печени. При згом максимальная удельная активность по каналу 1251 на I г ткани через 16 часов ц двое суток после введения обнаруживается в ткани легких-

Сравнение фармакокинетики БСА, вводимого в организм в эритроцитарных носителях, полученных двумя модификациями метода гипотонического лизиса (при диализе и с пренабуханкем) показало отсутствие выраженных и достоверных различий в распределении радиоактивности в органах и тканях по каналам 1251.

Использование носителей для транспорта биологически активных соединений в области-мишени признано перспективным методом улучшения селективности лекарств. В группе синтетических антибиотиков гентамицин привлек нас своей выраженной нефро-тропностыо. Изменение кинетики такого препарата при направленном его транспорте по сравнению с традиционными способами введения было бы более наглядным. В то же время широкий, спектр антимикробного действия этого препарата делает желательной его доставку к таким органам и тканям, где при традиционных способах введения не удается достичь терапевтической концентрации на достаточный срок. Кроме того, фармакокинетика гентаын-цина достаточно изучена практически при всех способах введения: его в организм, включая лимфотропный.

В работе использован гентамицин в форме субстанции активностью 62,6 мкг/мл производства ПО «Мосмедпрепараты» им. А, Я. Карпова. Исследования проводили в опытах на белых беспородных крысах массой 200 г- Препарат вводили однократно и внутривенно в форме субстанции и в эритроцитарных контейнерах в дозе 3,3 мл/кг (эквивалента суточной дозе человека в пересчете на единицу поверхности тела).

Концентрацию гентамицина в сыворотке крови определяли с ПОМОЩЬЮ системы лекарстдринпгп мшишушнц — Т».п' («ДццпП,,. США). Ткани предварительно гомогенизировали в присутствии 10% раствора тритона Х-100. Анализ проводили в надосадочной жидкости.

Включение гентамицпна в эритроциты проводили методом гипотонического шока с пренабуханием- После внутривенного введения активность гентампцнна определяли в тканях через 30 минут, час,три и 24 часа.

Таблица 3

Концентрация гентамицииа в тканях при внутривенном введении его в эритроцитариых носителях

i Коиценграция гснтамнцина, мкг, мл

Ткйнь Серия 30 мин. ! час 3 часа 1 24 часа f п

1 п = 6 1 п = 6 п = 8 1 п = 8 i

печень контр. 0,75+0,03 0,72+0,05 0,72 ±0,02 о ™ i .и ^-------- j 1,20+0,09

опыт 5,83±0,97 2,14+0,73 1,42+0,64 1,94 ±0,27

контр. 1,35±0,19 3,69 ±0,12 8,76+0,21 7,6о±0,30

ihhvi они г 38,41 + 1,20 13,07 + 1,80 6,45 ±0,93 16,23+1,40

конгр. 1,41 + 0,42 0.87+0,19 1,41 + 0,37 1,32 ±0,36

легкие опыт 15,72+3,20 1,44 ±0,96* 0,79+0,34* 0,76 + 0,42*

контр. 0,81+0,08 1,08+0,13 1,56 ±0,16 1,53+0,13

селе ен. опыт 29,46± 1,30 30,30+2,40 17,18+1,50 44,40 + 3,80

контр. 0,80±0,11 0.45 ±009 0,99+0,04 1,26+0,17

мыпда опыт 78,49 + 11,20 1,29+0,98* 0,59 ±0,42" 1,23+0,64*

конгр. 5,28+0,93 2,14±0,6 7 0,54 ±0,31 0,90+0,05

кро:ь опыт 3,75+0,36 2,69+ 0,92* 2,03+1,10 0,68+0,13 s

контр. 6,34+0,71 1,91±0 IS 0,!0±0,09 0,15 ±0,02

плаг.ча опыт 0,05+0,13 1,46±0,04* 0,09+0,02s 0,05 ±0,02*

Примените: Зве-дочкон отмечены данные, недостоверно отличающиеся

от контроля.

Таким образом, распределение гентамицпна по тканям, а также длительность удерживания препарата последними при введении его в эритроцитарных контейнера:; достсисрко и существенно отличается от таковых при обычном внутривенном «т-сдсшш.

Фармакокинетику характеризовали параметрами, не зависимыми от структуры модели: период полувыведения (T 1/2), площадь под фармококинетнческой кривой (ЛИС), среднее время удержания (MPT) и стационарный объем распределения (Vss), которые рассчитывали по известным формулам (Жердев В. П., Пиотровский В. К., Борпсснко С. А., 1987).

Сравнительный анализ фармакокинетических параметров гентамицина при введении его в организм в эрптроцитарных контейнерах доказывает, что такой способ введения значительно увеличивает период полувыведения антибиотика из организма, его ..среднее время удержания и стационарный объем распределения.

/Тля пищики степени бнодоступно^и антибиотика при различных способах введения были вычислены отношения АИС при введении гентамицина в эрптроцитарных носителях и внутривенном введении для различных органов (Фирсов А. А-, Пиотровский В. К., 198*3).

Таблица 4

Абсолютная степень биодоступностн гентамицина для различных органов при введении его в организм в эрптроцитарных носителях (в%). п = 6

Серия | легкие | мышца | печень |селезенка | почки | Эритроцнтарные

носители «А» 88 96 308 2743 167

Эритроцнтарные

носители «Б» 85 98 179 1954 157

Примечание: А — эритроциты, обработанные тапнином;

Б — эритроциты без обработки тапнином;

Таким образом, при введении антибиотика в эрптроцитарных носителях резко возрастает абсолютная степень его биодоступностн для тканей органов-мишеней: печени и селезенки-

Работами А. А. Фирсова (1987, 1988) установлена закономерность, имеющая достаточно универсальный характер. Речь идет о целесообразности сопоставления антимикробного эффекта антибиотика с площадью под фармакокннетнческой кривой. При этом выраженность антимикробного эффекта определяется величиной АИС. Анализируя с этой точки зрения полученные данные можно прогнозировать значительно более выраженный антимикробный эффект р тканях печени, почек и селезенки при введении антибиотика в эритроцит арных носителя? го сравнению с внутривенным его введением.

Таким образом, изучение биокинетики эрптроцитарных нпсптс-—яен и фармакикннегики Оиологпческих активных соединений, вводимых в организм в этих носителях, позволяет сделать следующие выводы.

1. Обработка клеток-контейнеров ташпшом сокращает время! их циркуляции в крови и резко повышает их тропиость к ткани печени.

2. Эрнтроцнтарные носители, полученные методом гипотонического лизиса, при внутривенном введении па .80—88% фиксируются клетками печени;

3- Включение биологически активных соединений в эритроци-тарные носители вызывает изменение их фармакокинетпки (увеличение иерида полувыведения и среднего времени удержания препарата);

4. При введении антибиотика в эритроцптарных контейнерах: резко возрастает абсолютная степень его биодоступности для тканей органов-мишеней и есть основания ожидать более выраженного антимикробного эффекта в этих тканях;

Глава 4. Токсичность и иммуногенпость эритроцптарных

носителей

Одним из основных требований при создании систем направленной доставки лекарств является отсутствие токсичности и аллер-генности последних. Теоретически токсические эффекты могут вызываться содержащимися в носителе активными веществами, сп-нергпческнм действием носителя и его содержимого и, наконец,, самими эритроцитарнымн носителями. Что касается токсичности, связанной с активным веществом, включенным в носитель, то ввиду универсальности эритроцптарных носителей для медицинских, и ветеринарных целей ее следует рассматривать в связи с конкретной ситуацией. Предполагать токсичность самих эритроцптарных носителей, полученных из ауто-, или гомологичных эритроцитов идентичной с реципиентом группы, можно только па основании работ, авторы которых исследовали острые нефропатии. возникшие па почве впутрнсосудистого гемолиза (Амбуржс с соавт. 1965; Н. Маждраков, Л. Попова, 1980). При этом пе дифференцируется какие продукты гемолиза: эритроциты или освобождающийся гемоглобин оказывают прямое вредящее влияние на почки.

В работе представлены результаты определения токсичности: эритроцптарных носителей в остром и хроническом эксперименте-па собаках. Опытным животным в течение месяца через каждые 72 часа вводили внутривенно 50%-ную суспензию эритроцптарных носителей в физиологическом растворе в дозе 100 мкл носителей на I кг веса тела животного. Животным контрольной группы в те же сроки вводили физиологический раствор. Эрнтроцнтарные но-

-сители получали методом гипотонического шока в стерильных условиях. В ходе опыта в сыворотке крови определяли общий белок, гмочевину, креатшшн, холестерин и концентрацию ионов N3+, К+, билирубин, активность аланинаминотрансферазы, щелочной фос--фатазы, исевдохолинэстеразы, проводили тимоловую и сулемовую пробу по унифицированным методикам. Через 15 дней после псс -прдцей инъекции и сыворотке крови животных определяли наличие антител к эрнтроцитариым носителям в реакции агглютинации при 4,20 и 37°С, наличие неполных антител в реакции Кумбса и наличие гемолизинов. Реограмму почек регистрировали при внутреннем наложении электродов. После этого производили правостороннюю нефректомию. Кусочки почки для гистологического исследования фиксировали в 10%-ном формалине, готовили парафиновые блоки с последующим приготовлением гистологических срезов. Срезы окрашивали гематосилин-эозином. Одновременно проводили частичную гепатектомию большой доли печени. Биохимически в ткани печени и почек определяли активность цито-хромоксндазы, сукцинатдегидрогеназы, • К+, N3+ — АТФ-азы, АТФ-АМФ-дезамииазы.

Установлено, что экскреторная функция почек и печени при длительном введении эритроцитарных носителей была не нарушена. Характерные для нефротического синдрома гипопротеинемия и гнперхолестеринемия не имели места. Сохранялись на одном уровне в ходе эксперимента концентрация крёатинина, мочевины в сыворотке крови, характеризующие функциональное состояние клубочкового отдела нефрона. Выделение элёктролитов почками также сохранялось неизменным.

Ведущим патогенетическим механизмом почечной недостаточности, вызванной гемолизом, является ишемия почек. Нами были исследованы ферменты группы энергетического и пуринового обменов, которые изменяются на ранних сроках ишемии. Уровень активности в подопытной группе животных после длительного введения эритроцитарных носителей не отличался от контрольных величин-

При исследовании гистологических препаратов почек собак патологические изменения не обнаружены.

Изучение реакции нммуиой системы организма показало отсутствие в крови подопытных животных антител к вводимым эрит-

роцитарным носителям.___________

-т^согрБтага-почек подопытных животных не отличалась от таковой у животных контрольной группы. При частоте пульса 230— 250 в минуту интервал от зубца 0) до начала анакроты составил

2й

б среднем 0,06 с, а время катакротнческого спуска — около 0,1 с.

Таким образом, длительное введение эритроцитарных носителей крупным лабораторным животным не вызывает изменения функционального состояния печени и почек, морфологической структуры почечной ткани, не приводит к изменению почечной гемодинамики, уровню энергетического и пуринового обменов в почках, а также не стимулирует образования антител.

Глава 5- Эритроциты в направленном транспорте биологически активных соединений

5.1. Эритроциты в направленном транспорте антибиотиков.

Направленный транспорт антибиотиков использовали для ле-*ения воспалительных и гнойных заболеваний печени и желчных 1утей. Доставка аминогликозидов в печень в контейнерах из гомо-тогичных эритроцитов осуществлена в эксперименте на собаках. 1 которых был смоделирован гнойно-воспалительный процесс в. 1ечени и желчном пузыре, и у людей с диагнозом «острый холецистит и холецистопанкреатит».

В ходе эксперимента установлено, что на высоте модели ост->ого гнойно-воспалительного поражения печени и желчного пузы->я отмечается ускоренное СОЭ, увеличение общего количества [ейкоцитов при одновременном увеличении процентного содержали в них нейтрофилов и падении лимфоцитов, некоторое уменьшение количества эритроцитов и гемоглобина. Из биохимических оказателей в сыворотке крови достоверно возрастает содержание бщего билирубина, активность аланинаминотрансферазы, щелоч-ой фосфатазы и незначительно уменьшается активность псевдо-олинэстеразы. Все указанные изменения показателей крови сви-етельствуют в пользу обширного гнойно-воспалительного пораже-ия паренхимы печени и желчного пузыря с элементами некроза, 'то подтверждается также результатами гистологических исследо-аний ткани печени и желчного пузыря, полученных от животных, абитых па высоте модели.

В процессе лечения животным опытной группы вводили внут-ивенно канамицин, предварительно включенный в гомологичные оитроциты, в дозе 0,08 Г на I кг живого веса (доза канамицнна эи парэнтеральном его введении). Всего 5 инъекций. Большее 1сло инъекций было бы нецелесообразным, так как уже через 5> гьекцнй антибиотика в эритроцитарных контейнерах у животах наблюдалась клиническая картина выздоровления. Жиеот-

тным контрольной группы вводили раздельно пустые эритроцитар-шые контейнеры и канамицин- в той же дозировке внутривенно.

Через 6 суток лечения у животных опытной группы СОЭ' снизилась практически до нормальных величин. У животных контрольной группы СОЭ оставалась увеличенной. Количество лейкоцитов _у животных опытней группы тяюке оказалось в пределах физиологической нормы, в то время как у животных контрольной груп-лы количество лейкоцитов значительно превышало нормальный уровень, а анализ лейкоцитарной формулы у них показал повышенный уровень нейтрофилов и пониженный уровень лимфоцитов.

При исследовании препаратов печени животных контрольной после начала лечения обращает на себя внимание повышенный уровень аланинаминотрансферазы, общего билирубина и щелочной фосфатазы и пониженный уровень ацетйлхолинэстеразы у животных контрольной группы- У животных опытной группы все изученные показатели в этот период статистически достоверно не отличались от таковых у здоровых животных.

При исследовании препаратов печени животных контрольной группы можно отметить сохранившуюся жировую и зернистую .дистрофию, частичную деструкцию гепатоцитов, набухание клеток Купфера, расширенные синусоидальные капилляры. При- анализе препаратов желчного- пузыря животных этой же группы следует отметить сохраняющуюся клеточную' инфильтрацию собственно!" лластинки слизистой, отек.

На препаратах печени животных опытной группы особых патологических отклонений не налюдается. Сохранялась незначительная мелкая зернистость в' цитоила!зме. Структура печеночны: .долек сохранена.

При осуществлении направленного транспорта аминогликозн ..дов в аутологичных эритроцитах больных приступ острого холецн •стопанкреатита'был купирован за 4'дня, удалось избежать экстрен лой операции. При традиционных методах лечения приступ' ост рого холецистопанкреатита удается купировать через 7—10 днсИ ■Осложнений при применении направленного транспорта антиби'С гиков в аутологичные эритроциты не выявлено.

Таким образом, направленный транспорт антибиотиков в пе ■чень в контейнерах из гомологичных эритроцитов приводит к бс .лее быстрому и эффективному купированию гнойно-воспалител! пых процессов по сравнению с традиционными сдеее&ашь-ваед< иия антибиотиков;

На способ лечения гнойно-воспалительных заболеваний печешг путем направленного транспорта антибиотиков в эритроцитарных носителях получено авторское свидетельство № 1641350 от 15 декабря 1990 года.

5.2. Эритроциты в направленном транспорте рентген контрастных веществ.

Проведенные исследования направленного транспорта рент-генконтрастных веществ (верографина и билигноста) в эритроцитарных носителях в эксперименте на лабораторных животных и в клинике показали возможность контрастирования указанным способом печени и желчевыводящих путей. При этом значительно снижается системная токсичность рентген контрастного препарата, поскольку исключается его контакт со всеми органами и тканями, кроме органа-мишени; сокращается доза рентгенконтрастного препарата в 3—4 раза; появляется возможность использовать для контрастирования печени верографнн вместо высокотоксичного торотраста.

Способ оформлен заявкой на изобретение во ВНИИГПЭ (заявка № 4693154/14 068925). Положительное решение по заявке принято 19112.1990 г.).

5.3. Эритроциты в направленном транспорте соматотропного

гормона

Большое количество литературных данных доказывает положительное влияние экзогенного самототропного гомона (СТГ) на молочную продуктивность крупного рогатого скота.

СТГ принимает участие в регуляции многих видов обмена веществ, усиливает гуморальный и клеточный иммунные ответы, однако, особенный интерес с точки зрения конечной цели наших исследований представляет механизм влияния СТГ на клетки эпителия молочной железы крупного рогатого скота. В результате прямого -ли, косвенного-ли влияння гормона, но клетки эти должны значительно усилить молокосинтезирующую активность для то-

чтобы обеспечить возрастающую секрецию лактозы, молочного эелка и молочного жира-

Повышенный молочный синтез под действием введения СТГ коровам связан, возможно, с изменением активности ключевых ферментов, которое ведет к повышению интенсивности деятельности отдельных молокообразующих клеток. Нельзя не учитывать и юзможности' увеличения количества этих клеток. Кроме того, нормальное снижение биохимической активности, которое наступает-

29

в ходе лактации, могло восстанавливаться с применением СТГ (Bauman, 1987). В целом литературные данные о механизме действия СТГ позволяют заключить следующее. 1. Одним из органов-мишеней СТГ является печень; 2. Действие СТГ на организм опосредуется соматомединами, синтез которых может осуществляться также в печени; 3. Для насыщения соматотропинчувствительных рецепторов печени достаточно количесша гормона, соизмеримого с его концентрацией в крови. Таким образом, направленный транспорт экзогенного СТГ непосредственно в печень в условиях, исключающих его взаимодействие с другими органами и тканями, позволил бы с одной стороны, уточнить существующие представления о механизме действия гормона, с другой — на несколько порядков снизить дозу экзогенного гормона при сохранении эффекта усиления лактации. Последнее имеет особенное значение с точки зрения экологической чистоты получаемого таким образом молока-и сокращения расхода остродефицитного и дорогостоящего препарата.

В качестве биодеградируемых носителей для направленного транспорта экзогенного СТГ в печень использовали аутологнчные эритроциты. Препарат включали внутрь эритроцитов методом гипоосмотического лизиса по Вакег (1969) и Rechtsteine (1975) в нашей модификации.

Опыт выполнен на коровах черно-пестрой породы с продутив-ностью 4000—5000 кг молока за лактацию. Животные были разделены на три серии. В серию I были подобраны животные с 40то по 50-ый день лактации. В серии II были животные, лактнрующие в связи с поздним эффективным осеменением свыше 300-т дней.

В серию III были подобраны животные, переболевшие маститом и в связи с этим резко снизившие молочную продуктивность.

Подопытные животные всех серий получали одну инъекцию рекомбинантного бычьего еоматотропного гориона (СТГ) фириы «Монсанто», предварительно включенного в гомологичные эритроциты в дозе 100-М50 иг. Животным контрольной группы каждой серии вводили однократно внутривенно СТГ, растворенный в физиологическом растворе в дозе 100 мг (контроль I) и стерильный физиологический раствор (контроль 2). У всех животных исследовали венозную кровь, в которой определяли общий белок, холестерин, кетоновые тела, креатинин, мочевину, сахар, кальций, фосфор, ак]нвггог№-т^нгея^нипп ло-1жърюп1п, череч гутки, трое и пять

суток после инъекции. Не установлено статистически достовер ных различий перечисленных показателей до и после инъекции j

животных опытных и контрольных групп всех серий. На протяже-шп опыта во всех сериях вели ежедневный учет индивидуальной полочной продуктивности.

В результате эксперимента установлено, что в серии I у живог-1ых контрольной группы (контроль 2) продуктивность за б суток ?озросла в среднем на 5,4% за счет естественного раздоя. В груп-1е животных, получивших внутривенно чистый СТГ (контроль 1), 1родуктивность в среднем возросла на 6,20%. У подопытных жн-¡отных увеличение продуктивности на 6-ьгс сутки после введения ■ормона в эритроцнтарных контейнерах составило в среднем 3,24%. При этом в подопытной группе не выявлены животные, у соторых отсутствовала бы реакция на введение гормона-

У животных серии II в целом по группе в подготовительный [ериод отмечено падение молочной продуктивности в среднем на 1,5%; связанное с угасанием лактационной функции в последней ретн лактации. В обеих контрольных группах это падение продук-нвносги сохранялось в ходе эксперимента. Только у 6-ти из 8-ми швотных, получивших чистый СТГ внутривенно (контроль I), наблюдалось кратковременное, в течение суток, повышение продук-нвности от 2-х до 16-ти %.

В подопытной группе животных этой серии, получивших инъек-,шо СТГ в дозе 100 нг, предварительно включенного в контейне-ы из гомологичных эритроцитов, позышеиие продуктивности име-(О место у всех животных и в среднем по группе составило 17,78%. 'силенпе лактационной функции начиналось в первые сутки после ведения гормона в носителях и у 5-ти животных из 8-ми сохраня-ось в течение 5-ти суток после введения. Затем продуктивность нижалась до исходного уровня-

Таким образом, ведение экзогенного СТГ коровам в период гасания лактационной функции вызывает кратковременное ее силенпе. Использование эритроцнтарных носителей для достижс-ня эффекта, трехкратно превышающего таковой при веедошш чи-гого гормона, позволяет снизить количество гормона

103 раз по сравнению с количеством, вводимым просто ьнугри-2ИИО.

У животных серии III в результате перепесенного мастита проективность упала на 45—60%. Восстановление продуктивности э исходного (до болезни) уровня при отсутствии стимуляции проводит в течение 10-^- 15-ти дн,ей. У животных же подопытной груп-л этой серии отмечено стойкое повышение продуктивности, сос-¡вившее через 6 суток после введения СТГ в носителях в среднем

по группе 28,81%. Восстановление лактационной функции начиналось в первые сутки после введения гормона. Продуктивность при этом увеличивалась до 97% от исходного уровня. В последующем: этот уровень продуктивности сохранялся. Лактационная кривая, ¿¡скаженная в результате заболевания, восстанавливалась.

Л л я ппрнк'п пгтияння введенного экзогенного СТГ на лам анионную кривую в целом был проведен анализ продуктивности и состава молока за лактацию у коров, получавших гормон в различных дозах н при различных способах введения. Установлено, что одноразовое введение экзогенного СТГ в дозе 50—100 мг внутривенно, в дозе 100—150 нг внутривенно в эритроцнтарных контейнерах и в дозе 500 мг подкожно в пролонгированной форме не приводит к нарушению лактационной функции в течение лактации-

Таким образом, результаты проведенных исследовании дают основания утверждать следующее.

1. Однократные инъекции экзогенного СТГ в вышеперечисленных дозах и способах введения не вызывают патологических изменений физиологического статуса лактирующих коров и их лактационной функции на протяжении всего периода лактации.

2- Использование экзогенного СТГ в виде разовой инъекции позволяет сократить сроки восстанонвления молочной продуктив' лости у коров после перенесенного мастита до 1—2-х суток, вое станавлнвать лактационную кривую в последней трети лактации стимулировать усиление лактационной функции у коров с удлиненным сервис-периодом и повысить их продуктивность на 22— 40%.

3. Направленный транспорт экзогенного СТГ в эрптроцнтар пых носителях позволяет в 10® раз уменьшить дозу гормона npi сохранении эффекта стимуляции лактации. (ВНИИГПЭ 30.07.91 г принято решение о соответствии данного способа стимуляции лак тации — заявка № 4910515/15 (013766) требованиям иатеитоспо собности и о выдаче на указанный способ патента).

5.4. Эритроциты в направленном транспорте вакцин.

Существует ряд наблюдений, полученных в эксперименталь пых исследованиях и в клинической практике о том, что клеточ ный или гуморальный иммунитет может развиваться изолирован но, один из них может играть преимущественную роль в элнмииа ции тех пли иных антигенов- Так клеточный и гуморальный пмм) —imiei трапп ведущую роль в сопротивляемости разным ипфе!-дням: например, клеточный при бруцеллезе, лепре, а гуморал! лый при дифтерии, гангрене.

Создавая системы направленного транспорта мы ставили целыег-доставить вакцину непосредственно к тем иммупокомпетептньш клеткам, которые ответственны за создание иммунитета при данной инфекции. Это, с одной стороны, повысит эффект вакцинации,, а с другой — позволит исключить потерн вакцины и, вероятно, удлинит срок ее действия.

5.4.1- Направленный транспорт бруцеллезной вакцины.

Выбирая бруцеллезную вакцину для направленного транспорта в эрнтроцигариых носителях мы исходили из того, что бруцел-лы принадлежат к внутриклеточным паразитам, размножающимся и длительно живущим внутри клеток ретикулоэндотелиальнон. системы. Из внутренних органов при бруцеллезе чаще всего изменения происходят в печени и селезенке. Поскольку бруцеллы паразитируют внутрнклеточно, механизм их разрушения в тех случаях, когда оно имеет место, вероятно, заключается в ннгпби-ции внутриклеточного роста путем создания неблагоприятных условии внутри клетки (Е1Ьег£, 1973). А иммунологического усиления фагоцитоза, в свою очередь, можно достигнуть с помощью антител (Н. Вершнлова с соавт. 1974). Таким образом, антитела при: бруцеллезе в отличие от лепры, вероятно обладают защитным действием, каким-то образом (прямо или опосредованно через макрофаги) угнетая размножение бруцелл. Вакцины при бруцеллезе используют как в профилактических, так и в лечебных целях.

Нами разработан способ включения бруцелл в эритроциты человека и кролика. В ходе исследовании создана методика получения парафиновых срезов эритроцитов, используя которую мы подсчитывали число микробных клеток внутри срезаВ работе установлено, что у кроликов, вакцинированных с использованием метода направленного транспорта, то есть бруцел-лами, включенными в гомологичные эритроциты, антитела образуются в более ранние сроки и более длительно сохраняются в сыворотке в высоком титре, что позволит использовать этих животных для получения противобруцеллезнон сыворотки в течение длительного промежутка времени (от 2-х педель до 3—4-х месяцев)

Таким образом, направленный транспорт бруцеллезной вакцины с использованием аутологичиых эритроцитов более эффективен по сравнению с традиционными способами введения вакцины..

.0.4.2- Получение эритроцитарных носителей с дизентерийной |

вакциной.

Существование местного и общего иммунитета при дизентерийной инфекции и принципиальная возможность создания эффективной специфической защиты с помощью живых дизентерийных вакцин не вызывает сомнрння (Сергеев, Елкина, Солодовников и .др. 1974). Местный иммунитет, формирующийся лнмфоидпым аппаратом и слизистой оболочкой кишечника, более напряжен и длителен, хотя и менее специфичен, чем общий. Как местный тканевой, так н общий иммунитет имеет важное значение в резистентности организма к дизентерийной инфекции. Однако, по мнению •большинства исследователей, ведущая роль в постинфекционном ¡иммунитете принадлежит защитным факторам слизистой оболочки, являющейся не только входными воротами инфекции, но и местом формирования основного иммунологического барьера.

Таким образом, данные о внутриклеточном паразитизме дизентерийных бактерий и выводы о первостепенном значении местных механизмов иммунитета указывают на то, что для эффективной вакцинации необходима доставка вакцинных штаммов к эпители-тальным клеткам и макрофагам толстой кишки. При этом вакци-иа должна быть защищена в кровеносном русле от бактерицидного действия крови.

Нами разработан способ включения шигелл в эритроциты млекопитающих (А. с. 1517172. Приоритет от 1- 06. 1987 г.)- Получены эритроцитарные носители с шигеллами. При помещении на поверхность таких носителей вектора к тканям толстой кишки они доставят вакцину непосредственно к месту создания местного иммунитета.

ВЫВОДЫ

1. Длительное внутривенное введение в организм систем направленного транспорта биологически активных соединений, полученных из гомологичных эритроцитов, не вызывает изменения функционального состояния печени и почек, морфологической структуры почечной ткани, не приводит к изгененпю почечной гемодинамики, уровню энергетического и т рипового обменов в почках, а также не стимулирует образования антител.

:2. При использовании методов гип00см0ти4есуг|г0 гтнчнгп -

■з-реднш млекопитающих могут быть включены антибиотики, рент-генконтрастные вещества, соматотропиый гормон, цельные микробные клетки. 31

З.Эритроцитарные контейнеры, покрытые неспецифическимн антителами. имеют малое время циркуляции in vivo. Основная их масса фиксируется печенью в первые сорок минут после введения в кровеносное русло и обнаруживается там даже через трое суток после введения.

4. Методом люминисцентной микроскопии можно выявить форму, размеры, характер свечения эритроцитов млекопитающих и полученных из них методом гипоосмотического лизиса эритроцитарных носителей.

5. Тест-система, включающая определение К+, Na-АТФ-азы, су-пероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, уровня лактата в куль-туральной среде и кислотную резистентность эритроцитов, адекватно отражает функциональное состояние эритроцитов млекопитающих.

6. Эритроцитарные носители с производными тетрациклина, рубомн-цина и гентамицином устойчивы при титровании сывороткой крови не менее 30—60-ти минут.

7. Включение гентамицина в эритроцитарные контейнеры вызывает изменение его фармакокинетики (увеличение периода полувыведения и среднего времени удержания препарата).

8. При введении гентамицина в эритроцитарных носителях резко возрастает абсолютная степень его биодоступности для тканей органов-мишеней, на основании чего можно прогнозировать более выраженный антимикробный эффект в этих тканях.

9. Направленный транспорт аминогликозидов в печень в контейнерах из аутологичных эритроцитов приводит к более быстрому и эффективному излечению гнойно-воспалительных процессов в печени по сравнению с внутривенным введением антибиотика.

10. Использование направленного транспорта рентгенконтрастного • вещества в эритроцитарных носителях в печень позволяет а) значительно снизить системную токсичность рентгенконтрастного препарата, поскольку исключается его контакт со всеми органами и тканями, кроме органа-мишени; б) сократить дозу ренгенкоптраст-ного препарата в 3—4 раза; в) использовать для контрастирования печени верографин вместо высокотокснчного торограста.

11. Направленный транспорт в эритроцитарных носителях реком-бинантпого бычьего соматогропного гормона в печень коров в количествах 100—150 нг не вызывает патологических изменений функционального состояния печени и приводит к усилению лактации и повышению продуктивности от 3-х до 31%.

12. Направленный транспорт бруцеллезной вакцины с использованием аутологичных эритроцитов более эффективен по сравнению с традиционными способами введения вакцин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Генинг Т. Т., Елисеева А. П., Потатуркина-Нестерова Н- И. ' О'возможности использования замкнутых теней аутологичных эритроцитов для направленного транспорта антибиотиков, //ж- Антибиотики и мед.'биотехнология, 1985, № 2, с. 33—35. '

2. Генинг Т. П., Хлебутина Т. А. К вопросу о механизмах эри-гроцитоза при гипотермии. //В кн-: Обмен при зимней спячке и

•стественном сне. Махачкала, 1985, с. 41.

3. Керхер М. Э- Генинг Т. П., Иванов В. В. Люминисцентная .микроскопия эритроцитов и их теней, //ж. Лабораторное дело, 1986, с. 264—265.

4. Генинг Т П., Шевченко Т. Ф., Керхер М. Э. Использование гомологичных эритроцитов в направленном транспорте лекарственных средств. //Тезисы XV съезда Всесоюзного физиологического общества. Ленинград, 1987, т. 2- стр. 428.

5. Генинг Т. П., Елисеева А. П., Гансфельд Т. Н. Воздействие продуктов высокого внутрисосудистого гемолиза аутологичных -эритроцитов на организм животных. //Деп. ж- Гематология ц трансфузиология, № 2861—В 87.

6. А. И. Куссельман, Т. П. Геиинг, А. Г. Вермова. Метод оцен-тш функционального состояния эритроцитов, //ж. Здравоохранение Казахстана,, 1987, № 12, с. 45—47.

7- А. И. Куссельман, Т. П. Генинг, А. Г. Вермова. Гликолити-ческая активность клеток крови при пневмонии у детей раннего возраста. //Деп. ж. Педиатрия. № Д—15002.

8. Генинг Т. П. Тест-система для оценки функционального состояния эритроцитов. //В кн.: 1-ый съезд физиологов Казахстана, Алма-Ата, 1988, с. 69.

9. Генинг Т. П., Колкер И- И., Жумадилов Ж- Ш. Использование форменных элементов крови для направленного транспорта -хнмиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения. //ж. Антибиотики и химиотерапия, 1988, № 11, с. 867—871

10. Жумаднлов Ж- Ш., Генннг Т. П., Вермова А. Г. Дезгшток-сикационная система форменных элементов крови у больных с осложненными формами острых хирургических заболевании органов брюшной полости. //В кп-: Современные методы детокснкации в неотложной хир. и осложненной травме. Алма-Ата, 1938, с. 25— 26.

11. Генинг Т. П. Лекарственные формы на основе гомологичных эритроцитов. //В кн.: Актуальные проблемы создания лек. формы с заданными биофармацевтическими свойствами. Харьков, 19,89, с. 110.

12. Генннг Т- П., Шевченко Т. Ф. Включение в эритроциты цель-пых микробных клеток, //ж. Микробиология, эпидемиология и иммунология, 1989, № 11, с. 118—119.

13- Керхер М. Э., Генннг Т. П., Иванов В. В. Способ окраски эритроцитов для люминисцентной микроскопии. //А. с. № 130055814. Керхер М. Э., Генинг Т. П., Иванов В. В. Способ исследования организованного осадка мочи. //А. с. 1471107.

15. Генинг Т- П., Шевченко Т. Ф. Способ включения шнгеля в эритроциты. //А. с. 1517172.

16. Генинг Т. П., Жумаднлов Ж. Ш., Мусинов Д. Р. Способ лечения гнойно-воспалительных заболеваний печени и желчных путей. //А. с. 164135017. Генинг Т. П. Тест-система для оценки функционального состояния эритроцитов. Ульяновск, 1991, 69, е., илл.