Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные исследования IgG1 человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования IgG1 человека"
Направахрукописи
ВОЛЫНСКАЯ АЛЛА МАРКОВНА
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА: ВЫЯВЛЕНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ СВОБОДНЫХ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА
Специальность: 03.00.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2004
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М М. Шемякина и ЮА. Овчинникова Российской академии наук
Научный руководитель: кандидат химических наук
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
доктор химических наук, профессор
Ведущая организация:
Гевондян Наталия Мушековна
Арион Виталий Яковлевич
Румш Лев Давыдович
Институт биохимии им. АН.Баха РАН
Защита диссертации состоится «оЦ^^^^Й^^ 2004 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при ГУ «НИИ физико-химической медицины МЗ РФ» по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «НИИ физико-химической медицины МЗ РФ»
Автореферат разослан
М»
2004 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук
Мурина Марина Алексеевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Антитела являются мощным фактором приобретенного иммунитета, обеспечивающего устойчивость организма к вирусам, бактериям, токсинам и другим патогенам. Именно они в первую очередь взаимодействуют с поступающими в организм этиотропными агентами и вовлекают в иммунный ответ молекулярные и клеточные механизмы защиты, которые без участия антител лишены возможности селективно действовать на патогены.
На основании многочисленных исследований с применением методов физико-химического, белкового и иммунохимического анализов установлено, что молекула IgGl состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, включающих 12 доменов, сходных по способу укладки полипептидной цепи и наличию одной дисульфидной связи в гидрофобном ядре каждого домена. Четыре полипептидные цепи сложены таким образом, что в результате образуется три большие субструктуры - две идентичные Fab области, содержащие антигенсвязывающий центр, и Fc область, осуществляющая зффекторные функции. В состав Fab фрагмента входит вся легкая цепь и N концевая половина тяжелой цепи, в состав Fc фрагмента - С-концевые половины двух тяжелых цепей. Fab фрагменты соединены с Fc фрагментом константным участком тяжелой цепи, именуемым шарнирным регионом (Burton, 1985; Padlan, 1994).
Несмотря на большой объем накопленных данных по структуре и функциям антител, до настоящего времени остается невыясненным, почему при высокой секреции специфических антител в процессе иммунного ответа последние часто не оказывают протективный эффект. Неизвестно также, за счет каких молекулярных механизмов обеспечивается динамичность молекулы IgG, необходимая для поливалентного связывания с антигеном и осуществления аллостерических структурных изменений, происходящих во второй фазе реакции антиген-антитело (Harris et al., 1999). Предполагается, что сегментарная гибкость и передача сигналов от центров связывания с антигеном Fab области к эффекторным доменам Fc области в основном осуществляется шарнирным участком антитела (Nezlin, 1990; Roux, 1999). Отличительной особенностью этой области является высокая обогащенность остатками пролина и цистеина, которые с одной стороны придают структуре гибкость, а с другой - стабильность за счет межцепочечных дисульфидных связей (Padlan, 1996; Coloma et al., 1997). Таким образом, сложилось представление, что остатки цистеина в молекуле IgG выполняют исключительно каркасную функцию, обеспечивая целостность четвертичной структуры молекулы.
В то же время в литературе стали появляться единичные сообщения об обнаружении свободных SH-групп в препаратах IgG (Гевондян и
1986-
БИБЛИОТЕКЛ С.Петербург л, /
О» Ш^и.xJj
1997; Lyons, 1990, Zhang, Czupryn, 2002, Saphire et al., 2002). Несмотря на то, что работы по определению SH-групп носят фрагментарный характер и феномен их появления не объясняется или интерпретируется как результат разрыва лабильной межцепочечной дисульфидной связи (Schauenstein et al., 1996; Saphire et al., 2002), эти данные заслуживают внимания, поскольку поднимают вопрос о возможном существовании, наряду с ковалентно связанными, свободных остатков цистеина, потенциально способных, в силу своей реактивности, участвовать в процессе функционирования антител.
Отсутствие единой точки зрения относительно наличия в IgG свободных остатков цистеина, а также то, что в моноклональных, миеломных и генноинженерных антителах свободные остатки цистеина не обнаруживаются или выявляются в следовых количествах (Lyons, 1990, Zhang, Czupryn, 2002), тогда как в некоторых препаратах IgG, выделенных из сывороток крови, определяется от 0.3 до 1.5 SH-групп и наблюдается уменьшение их числа при патологии (Гевондян и др. 2003; Schauenstein et al., 1986), делает актуальным проведение исследований по выяснению наличия или отсутствия свободных остатков цистеина в IgG в норме и патологии.
Целью работы являлось: выяснение истинного количества свободных остатков цистеина в IgGl человека в норме, определение их локализации в полипептидных цепях и роли в функционировании антител.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Выделить из сыворотки крови гомогенный препарат IgGl с сохранением нативной четвертичной структуры.
. 2. Разработать способ глубокой денатурации белка для тестирования всех имеющихся SH-групп IgGl с дифференциацией их по степени доступности к тиоловым реагентам.
3. Для идентификации местоположения свободных остатков цистеина в полипептидной цепи белка разработать оптимальные условия химической модификации SH-групп с учетом степени сродства к тиоловым реагентам в отсутствии восстановителя и способ контроля эффективности алкилирования молекулы IgGl.
4. Разработать алгоритм поиска меченых остатков цистеина, выделить индивидуальные пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, и провести анализ их аминокислотной последовательности.
5. Исследовать влияние химической модификации IgGl по остаткам цистеина на функциональную активность антител.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что наряду с четырнадцатью дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободные остатка цистеина. Определено, что только один из них является легкодоступным и
реакциошюспособным, а остальные три - в различной степени маскированы и выявляются на разных стадиях денатурации белка. Показано, что свободные остатки цистеина расположены в двух L цепях в положении 214 и двух Н цепях в положении 220. Это свидетельствует об отсутствии ковалентной связи между Н и L цепями в Fab фрагменте молекулы. Установлено, что реакционноспособный остаток цистеина расположен в Н цепи и необходим для функционирования антител; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалетному связыванию с эпитопами антигена. Полученные данные о наличии четырех свободных остатков цистеина открывают принципиально новые возможности для тестирования конформационных и функциональных состояний молекулы при действии различных физических, химических и биологических факторов.
Практическая ценность работы. Результаты исследования были использованы при разработке эталона конформационного состояния молекулы IgGl в норме, применяемого в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител по функциональной активности; для экспресс-диагностики доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности у больных с аллергическими, атопическими и инфекционными заболеваниями; оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии; а также при разработке оптимальных параметров и режимов воздействия фотоматричных терапевтических систем на биообъект.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Beyond the genonx Understanding and exploiting molecules and cells in the 3rf Millennium (Birmingham, 2000); International Symposium on Biomedical Optics (San Jose, 2000); V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова "Биоорганика-2000" (Москва, 2000); Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 2001); ХШ международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» (Сочи, 2002); международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004). По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, состоитиз введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего наименований. Диссертация
содержит рисунков и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 ВЫДЕЛЕНИЕ IgGl
Для понимания внутримолекулярных механизмов функционирования IgGl необходима информация о четвертичной структуре нативной молекулы В связи с этим, в отличие от подавляющего числа исследований, проводящихся на миеломных, моноклональных или генноинженерных антителах, в настоящей работе изучались поликлональные иммуноглобулины, выделенные непосредственно из крови здоровых доноров Подбор доноров осуществлялся на основании клинического и иммунологического обследования пациентов, проведенного на базе лаборатории клинической иммунологии НИИ физико-химической медицины МЗ РФ и клинической больницы № 7 г Москвы В качестве источника иммуноглобулинов использовалась плазма крови, полученная путем плазмафереза, а также сыворотки крови
На этапе выделения IgGl основной задачей являлось получение гомогенного препарата с сохранением нативной четвертичной структуры С этой целью из широкого спектра методов были выбраны наиболее щадящие, использование которых не приводит к конформационным изменениям белка Для выделения иммуноглобулинов была подобрана двухступенчатая схема высаливания белка насыщенным раствором сульфата аммония при рН 7 2, что позволило получить фракцию, обогащенную по IgG (рис 1) В результате последующей очистки иммуноглобулинов методом ионообменной хроматографии и гельфильтрации был получен электрофоретически чистый гомогенный препарат (рис 1)
Рис 1. SDS-электрофорез в 7% полиакриламидном геле фракций, полученных в процессе выделения IgGl A - стандарты молекулярных масс, В - сыворотка крови донора, С -фракция сыворотки крови после первой ступени высаливания, D -фракция сыворотки крови после второй ступени высаливания, Е - препарат IgGl после ионообменной
хроматографии на DEAE-сефарозе и гельфильтрации на сефадексе G-200
Принадлежность полученных иммуноглобулинов к G-классу (изотипу G1) была установлена методом радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони Дополнительное подтверждение принадлежности выделенных антител к подклассу IgGl было получено в результате анализа N-концевой аминокислотной Последовательности Fab и Fc фрагментов молекулы после ограниченного трипсинолиза и разделения продуктов гидролиза
иммуноглобулина (табл. 1). Анализ N-концевой последовательности Fab фрагмента показал одновременное присутствие в выделенном препарате IgGl как X, так и к легких цепей (табл.1). О функциональной активности выделенных IgGl свидетельствовало специфическое связывание антител с антигенами грам-положительных бактерий в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Таблица 1. Результаты определения N-концевой аминикислотной последовательности Fab и Fc фрагментов IgGl
Анализируемый фрагмент Аминокислотная последовательность Координаты аминокислотной последовательности в соответствии в первичной структурой белка
Fab-фрагмент DIVLTQSPSSLS QSVLTQPPSASGT EVQLVQSGGGW 1-12, к-цепь
1-13, Агцепь
1-12, Н-цепь
Fc-фрагмент THTC/2PPC/2PAPEL 223-234, Н-цепь
Идентификация была проведена на основании сравнения результатов секвенирования с известной структурой IgGl.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА СВОБОДНЫХ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В МОЛЕКУЛЕ IgGl ЧЕЛОВЕКА
Тиоловые группы являются сильными нуклеофилами, их реакционная способность варьирует в широких пределах и определяется многими факторами - влиянием функциональных групп окружающих аминокислот, укладкой полипептидных цепей в молекуле, пространственным расположением в белковой глобуле (Petersen et. ai, 1999; Raso et al, 2001). Если определение реакционноспособных SH-групп, расположенных на поверхности молекулы, не вызывает затруднений, то выявление остатков цистеина, находящихся в гидрофобных кластерах возможно лишь после глубокой денатурации или гидролиза белка при условии, что используемые тиоловые реагенты обладают не только высокой селективностью к SH-группам, но и способны проникать вглубь молекулы (Scott-Ennis, Nohmann, 1985; Gevondyan et al., 1989).
Ввиду отсутствия единой точки зрения относительно существования свободных остатков цистеина в IgGl, молекулу исследовали как в нативном, так и в денатурированном состоянии. Учитывая, что в IgGl имеется много дисульфидных связей, а также то, что молекула устойчива к денатурирующим воздействиям (Троицкий и др, 1984; Attanasio et al.,1994), необходимо было подобрать не только условия максимальной денатурации белка с сохранением дисульфидных связей, но и реагенты, способные селективно взаимодействовать с SH группами, расположенными как в гидрофильных, так
и гидрофобных кластерах молекулы. С этой целью для тестирования SH-rpynn были использованы три типа специфических реакций: меркаптидирование (нитратом серебра или двухлористой ртутью), тиол-дисульфидный обмен (реактив Эллмана) и алкилирование (иодуксусной кислотой, 4-винилпиридином, N-дансилазиридином (ДАЗ) или 4-аминосульфонил-7-фтор-2,1,3-бензоксадиазолом (АБД-Ф)).
Определение числа легкодоступных SH-rpynn с использованием различных тиоловых реагентов.
Для определения количества легкодоступных реакционноспособных SH-групп IgGl инкубировали в аммоний-бикарбонатном буфере, рН 7.2, не содержащем денатурирующих агентов, в течение 5 минут при 37°С (условия А), после чего подвергали тестированию. Из анализа полученных данных (табл. 2, условия А) следует, что в одной и той же партии нативного белка в зависимости от природы тиолового реагента определяется от 0.3 до 1.1 свободных остатков цистеина, что в среднем составляет 0.70+0.12 моль реакционноспособных SH-групп моль/моль белка. Минимальное количество остатков цистеина определялось при использовании иодуксусной кислоты и реактива Эллмана, а максимальное - при амперометрическом титровании белка нитратом серебра или двухлористой ртутью (табл. 2.2, условия А), что может объясняться различиями в реакционной способности и заряде тиоловых реагентов (Каламкаров и др., 1980; Tremblay et al, 2001; Britto et al., 2002). Таким образом, результаты эксперимента показывают, что в IgGl здоровых доноров присутствует одна реакционноспособная SH-rpyima.
Определение числа замаскированных остатков цистеина в IgGl человека. Согласно данным первичной структуры (Edelman et al., 1969), молекула IgGl содержит четное число остатков цистеина, вовлеченных в образование 16 дисульфидных связей, таким образом, обнаружение одной реакционноспособной SH-группы позволило предположить наличие еще как минимум одного (или более) маскированного остатка цистеина, недоступного для тиоловых реагентов в нативных условиях. Для выяснения взаимосвязи между степенью разрушения третичной и вторичной структуры и демаскированием SH-групп была проведена серия экспериментов с использованием различных режимов денатурации IgGl и способов тестирования SH-rpynn.
Предварительные исследования, показали, что применение мочевины или гуанидинхлорида вызывает ограниченную деструкцию молекулы, недостаточную для выявления глубоко маскированных остатков цистеина. В связи с этим, для денатурации белка было использовано сочетание мочевины с SDS. Однако оказалось, что в результате инкубации IgGl (10 минут) в присутствии 8М мочевины и 2% SDS (рис. 2, условия В10)
Таблица 2. Доступность SH-групп IgGl для тиоловых реагентов в зависимости от условий
денатурации и способа тестирования
Тиоловые реагенты, Условия предвари- БН-группы (моль/моль бежа) Условия проведения
используемые для определения БН-групп тельной инкубации Легкодоступные (модифицированные) Маскированные (немодифици-рованные)ь модификации остатков цистеина
А8КОз или НёС12 А В С 1.1±0.03 2.8±0.04 4.0±0.03 - инкубация при комнатной температуре
А В 0.8±0.04 1.8±0.06 3.1±0.03 2.3±0.0б дважды добавляли 40-кратный избыток реагента, 2 часа, комн. темп. (Г)
С 3.3±0.05 0.5±0.03
4-витшшридин С 3.9±0.02 0 трижды добавляли 40-кратный избыток реагента, 6 часов, комн. темп, ЮМ мочевины (П)
АБД-Ф А В С 0.8±0.03 1.7±0.06 3.2±0.04 3.0*0.03 2.4±0.0б 1.0±0.03 дважды добавляли реагент до концентрации 4мМ, 2 часа, коми. темп.
ДАЗ А В С 0.9±0.03 1.8±0.05 3.0±0.04 3.0±0.03 2.4±0.04 1.3±0.03 дваящы добавляли 40-кратный избыток реагента, 2 часа, комн. темп.
реактив Эллмана А В С 0.3±0.02 1.5±0.04 2.8±0.07 . 40-хратный избыток реагента, 30 мин, комн. темп
йодуксусная кислота А В С 0.3±0.03 1.1±0.04 2.2±0.05 3.5±0.03 3.0±0.05 1.7±0.05 80-ти кратный избыток реагента, 30 минут, комнатная температура
* был предварительно инкубирован в 0.1М аммоний-бикарбонатном буфере, рН 7.2, содержащем 2мМ ЭДТА: А - без денатурирующих реагентов в течение 5 минут при 37°С; В - в присутствии 8 М мочевины и 2% SDS в течение 120 минут при комн. темп.; С - в присутствии 8 М мочевины и 2% SDS в течение 120 минут при комн. темп., концентрация мочевины в инкубационной среде повышалась ступенчато путем добавления порций мочевины, соответствующих двум молям с интервалом в 30 минут. ь Количество немодифицированных SH-групп оценивали методом амперометрического титрования алкилированного IgGl в условиях С. р<0.05
методом амперометрического титрования определяется не более 1.76±0.1 SH-групп моль/моль белка. Полное демаскирование SH-групп не достигается даже при увеличении времени взаимодействия белка с денатурирующими агентами. После 120-ти минутной инкубации белка в той же среде (рис. 2, условия В) количество легкодоступных SH-групп
возрастало всего до 2.8±0.04. И только при ступенчатом повышении концентрации мочевины (рис. 2, табл. 2, условия С) происходила достаточно глубокая денатурация белка с высвобождением четырех SH-групп, которые с высокой воспроизводимостью определялись методом амперометрического титрования, но лишь частично выявлялись при применении других методов тестирования. Так, с помощью алкилирующих и дисульфидсодержащих реагентов в условиях С определялось не более 2.2-3.3 SH-групп, и только в случае шести часовой инкубации с 4-винилпиридином при дополнительном введении мочевины (до ЮМ) удалось модифицировать 3.9±0.02 остатка цистеина (табл.
Рис 2. Количество легкодоступных и маскированных SH-групп, выявляемых методом амперометрического титрования в зависимости от условий денатурации белка. Условия инкубации А, В, С см. в подписи к таблице 2; Вю - 10 мин инкубация в условиях В; D - инкубация в присутствии 8 М мочевины и 4% SDS в течение 120 минут при комн. темп., концентрация мочевины в инкубационной среде повышалась ступенчато путем добавления порций мочевины, соответствующих □ легкодоступные SH-групяы Шмаоюрованные SH-группы двум молям с интервалом в 30 минут
Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что основная причина, по которой многим авторам не удалось обнаружить маскированные остатки цистеина, связана с устойчивостью макромолекулы к денатурирующим воздействиям и возможным участием SH-групп во внутримолекулярных нековалентных взаимодействиях (Pal, Chakrabarti, 1998; Raso et al, 2001).
Таким образом, полученные результаты показывают, что успех определения маскированных остатков цистеина зависит как от кинетики внутримолекулярных изменений, происходящих в процессе денатурации бежа, так и от способа тестирования SH-групп. Наиболее полное определение количества свободных остатков цистеина в IgGl возможно только методом амперометрического титрования. Это может быть объяснено тем, что ионы тяжелых металлов способны проникать в стерически малодоступные для других тиоловых реагентов участки молекулы и, в силу высокого сродства к атомам серы, вытеснять цистеины из внутримолекулярных нековалентных взаимодействий. К преимуществам данного способа тестирования, наряду с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, можно отнести возможность определения SH-rpynn непосредственно в растворе белка в присутствии денатурирующих реагентов. Такой
подход, несвязанный с многоступенчатым процессом алкилирования IgGl, последующим обессоливавшем и определением степени алкилирования (спектрофотометрически или на основе результатов аминокислотного анализа), позволяет избежать потерь и погрешностей, возможных на каждом из этих этапов, а также значительно сокращает время и трудоемкость исследований.
Для полного выявления всех имеющихся остатков цистеина в IgGl (в том числе и глубокомаскированных) были использованы жесткие условия денатурации (8 М мочевины и 4% SDS - условия D, рис. 2), подобранные ранее при изучении Na, К-АТФазы (Gevondyan et/ al., 1989). В результате такой обработки методом амперометрического титрования обнаруживалось как и в предыдущем случае (условия С) 4.0+0.03 SH-группы. Дальнейшее увеличение концентрации мочевины до 12М не привело к появлению дополнительных SH-групп. Из этого следует, что в молекуле IgGl были выявлены все имеющиеся свободные остатки цистеина и что в примененных денатурирующих условиях в отсутствии восстановителя дисульфидные связи не разрывались. По окончании меркаптидирования всех SH-групп (в условиях D), в той же пробе велось определение числа остатков цистеина, замкнутых в дисульфидные связи. Амперометрическое титрование SH-групп, высвободившихся в результате разрушения дисульфидных связей методом сульфитолиза, позволило выявить дополнительно 28+0.03 SH-групп. При тестировании аналогичного препарата IgGl (в условиях С или D), обработанного сульфитом натрия непосредственно перед титрованием, определяется 32+0.05 SH-группы, что соответствует данным первичной структуры белка.
Таким образом, в IgGl здоровых доноров определено 14 S-S связей (а не 16, как предполагалось ранее) и четыре SH-группы, три из которых в различной степени маскированы и обнаруживаются в результате ступенчатой денатурации белка. Тот факт, что из четырех SH-групп только одна доступна для тиоловых реагентов в отсутствии детергентов, свидетельствует об асимметрии IgGl и согласуется с результатами ретгеноструктурных исследований молекулы (Saphire et al., 2002).
3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЧЕТЫРЕХ СВОБОДНЫХ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В МОЛЕКУЛЕ IgGl
Полученные данные о наличии в IgGl четырех свободных остатков цистеина, обладающих различной реакционной способностью, вызвали необходимость определения их местоположения в полипептидной цепи. К числу прямых методов идентификации свободных остатков цистеина в белках относится их модификация специфическими реагентами (Darby, Creighton, 1997). Принимая во внимание, что первичная структура белка известна, локализация свободных остатков цистеина в молекуле IgGl возможна путем идентификации аминокислотной последовательности пептидных фрагментов,
содержащих предварительно модифицированные остатки цистеина. В ходе проводимого эксперимента модифицирующие реагенты выбирались таким образом, чтобы производные незамкнутых в дисульфидные связи остатков цистеина оставались стабильными в условиях кислотного и ферментативного гидролиза, могли быть обнаружены при аминокислотном анализе и N-концевом секвенировании в виде отдельного пика, а продукты дансилирования были бы видны на двумерной хроматографии. Учитывая сложную р-складчатую структуру IgG (рис. 3), а также маскированный характер свободных остатков цистеина, важной характеристикой алкилирующего реагента являлась высокая специфичность к SH-группам и возможность его использования в денатурирующих условиях.
Процесс поиска четырех SH-групп в крупной мультидоменной молекуле IgGl, содержащей 32 остатка цистеина, проходил в две стадии: 1) локализация свободных остатков цистеина в Fab и/или Fc фрагменте; 2) определение местоположения меченых остатков цистеина в полипептидных цепях иммуноглобулина.
Рис. 3. Схематическое изображение IgGl человека (Clark, 2004).
Поиск свободных остатков цистеина в Fab и Fc фрагментах IgGl.
Определение свободных остатков цистеина проводили методом амперометрического титрования Fab и Fc фрагментов, полученных в результате разделения продуктов ограниченного трипсинолиза свежевыделенного IgGl. В результате титрования установлено, что свободные остатки цистеина находятся только в Fab фрагменте молекулы.
Необходимость исключения тиол-дисульфидного обмена, возможно протекающего в процессе гидролиза IgGl и разделения продуктов щепления, обусловила проведение эксперимента по алкилированию SH-групп целой молекулы иммуноглобулина с
Fat
репсая (L) цепь ■тяжелая (Н) цепь
последующей оценкой распределения метки между Fab и Fc фрагментами, полученными в результате трипсинолиза белка Степень модификации белка определялась спектрофотометрически, а также по разности числа SH-групп в IgGl до и после алкшгарования, выявляемых методом амперометрического титрования нитратом серебра или хлоридом ртути В результате денатурации белка (в условиях С) и последующего алкилирования N-дансилазиридином (условия реакции см табл 1), было модифицировано 3 0 остатка цистеина (моль/моль белка) Разделение продуктов ограниченного трипсинолиза методами гельфильтрации и ионообменной хроматографии позволило получить электрофоретически чистые Fab и Fc фрагменты (рис 5 а) Анализ распределения флуоресценции при хроматографии на DEAE-сефарозе свидетельствовал о том, что основная часть метки сосредоточена в первом пике (рис 4), который по данным электрофореза содержал Fab фрагмент (рис 5) Контрольное титрование Fc-фрагмента показало отсутствие свободных остатков цистеина как в нативных, так и в денатурирующих условиях, в то время как в Fab фрагменте, при тестировании в денатурирующей среде (условия С), обнаруживалась одна глубоко замаскированная SH-группа
Лгво
1И>
n^mcojmJJ!®»
-10 »СЛ.«
¡Fib
А
Fc
ь
» ю я 150 мин
кДа
94666245 0- ' 310-
а)
Рис 4. Разделение Fab и Fc фрагментов IgGl, алкилированно-го N-дансилазиридином методом
ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе Пунктирная линия отображает градиент концентраций аммоний-бикарбонатного буфера, рН 8 0, вертикальные линии - величину флуоресценции в условных единицах
Рис 5. SDS-электрофорез в 10% полиакриламидном геле продуктов ограниченного
триптического гидролиза IgGl, модифицированного ДАЗ а) белковые полосы окрашены кумасси G-250, б) гель в ультрафиолетовом свете А -триптический гидролизат, В -фракция I (Fab фрагмент), С -фракция II (Fc фрагмент) после ионообменной хроматографии
Таким образом, результаты проведенного эксперимента согласуются с данными предыдущего опыта по титрованию Fab и Fc фрагментов и позволяют сделать вывод о том, что все SH-группы IgGl расположены в Fab-фрагменте молекулы.
Определение местоположения четырех свободных остатков цистеина в Fab фрагменте IgGl.
Анализ С-кощееой последовательности Fab фрагмента. Исходя из структуры Fab фрагмента молекулы IgGl можно было ожидать, что наличие четырех свободных остатков цистеина скорее обусловлено отсутствием межцепочечных дисульфиддых связей, чем внутридоменных, - крайне консервативных, формирующихся в процессе синтеза цепей, а не во время посттрансляционной модификации белка (Goto, Hamaguchi, 1982; Kikuchi et al, 1986). Учитывая, что остатки цистеина, которые, как считается, образуют дисульфидную связь между Н и L цепями, расположены вблизи сайта щепления IgGl на Fab и Fc фрагменты (рис 3), для выяснения их состояния было проведено определение С-концевой аминокислотной последовательности Fab фрагмента, полученного в результате трипсинолиза предварительно алкилированного IgGl.
В качестве алкилирующего агента на данном этапе исследования был выбран 4-винилпиридин, что обусловлено результатами предыдущих исследований, показавших максимальную модификацию свободных остатков цистеина в присутствии высоких концентраций денатурирующего реагента (табл. 2, модификация II) и возможность контроля за полнотой алкилирования непосредственно в процессе реакции с помощью метода амперометрического титрования Кроме того, с помощью 4-винилпиридина в полипептидную цепь вводится полярная группировка, повышающая растворимость белка, а ДНС-производное 5-(4-пиридилэтил)цистеина однозначно детектируется на тонкослойной хроматографии С-концевого секвенирования Подобранные условия реакции позволили получить препарат иммуноглобулина со степенью модификации цистеинов 3.9 моль/моль белка.
В результате ограниченного трипсинолиза меченого IgGl и последующих хроматографии на сефадексе G-200 и DEAE-сефарозе, электрофоретически чистые Fab и Fc фрагменты были перенесены на PVDF-мембрану. После этого одна часть Fab-фрагмента была подвергнута действию карбоксипептидаз, а другая - N-концевому секвенированию по методу Эдмана.
Анализ С-концевых аминокислот Fab-фрагмента был проведен с использованием комбинации карбоксипептидаз А, В и Y в две стадии при рН 8 5 и рН 7.0. Необходимость снижения значений рН на второй стадии обусловлена тем, что в С-концевой области обеих цепей находятся остатки дикарбоновых кислот, скорость отщепления которых
увеличивается при понижении рН В результате двумерных хроматографии на силикагельных пластинках в гидролизате были детектированы дансилъные производные аминокислот, соответствующих С-концевым областям Н и L цепей Fab фрагмента (табл. 3). Присутствие в гидролизате производного S-(4-пиридилэтил)цистеина при полном отсутствии дансильных производных цистина позволяет заключить, что мечеными, а следовательно не замкнутыми в дисульфидные связи, могут являться Cys-214 X-цепи и Cys-214 к-цепи. Присутствие в полученном Fab фрагменте двух типов легких цепей (X и к) было также подтверждено результатами анализа его N-концевой аминокислотной последовательности
Таблица 3. Аминокислотная последовательность С-концевой области Fab фрагмента.
Тип полипептидной цепи Аминокислотная последовательность С-концевой области Fab фрагмента IgGl
Н-цепь 2l2DKRVEPKSCD&lJj224
^цепь 203EGSTVEKTyAMB£'S213
к-цепь 203 L S S Р V Т К S FNICfilC2W
Серым цветом обозначены аминокислоты, полученные в результате С-концевого аминокислотного анализа, подчеркиванием - аминокислоты, обнаруженные в гидролизате первой стадии реакции.
С целью выявления возможной модификации цистеинов среднего шарнирного региона, дополнительно был проведен анализ аминокислотной последовательности N-концевой области Fc-фрагмента Отсутствие меченых остатков цистеина в положении 226 и 229 согласуется с данными предыдущих опытов и свидетельствует о наличии в среднем шарнирном регионе дисульфидной связи.
Анализ С-концевой последовательности Fab-фрагмента и N-концевой последовательности Fc-фрагмента показал, что расщепление алкилированного иммуноглобулина произошло неспецифично, то есть не после Lys-222 тяжелой цепи, а на две аминокислоты ближе к С-концу молекулы - между аминокислотными остатками His-
222 Lys-Thr-His-Thr-Cys/2-Pro-Pro-Cys/2-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu 234
Изменение места расщепления IgGl может быть следствием структурной трансформации средней шарнирной области молекулы, вызванной включением в белок полярной группировки 4-винилгшридина.
Выделение цистеинсодержащих пептидов из триптического гидролизата Fab фрагмента На основании результатов С-концевого секвенирования не удалось сделать
однозначный вывод о состоянии остатка Cys-220 Н-цепи в силу его удаленности от места расщепления и отсутствия в полипептидной цепи специфических аминокислот, отличных от аминокислот С-концевой области Я, и к цепей. В связи с этим возникла необходимость использования альтернативного подхода для оценки состояния как Cys-220 тяжелой цепи, так и других восьми цистеинов Fab-фрагмента. С этой целью был проведен эксперимент по локализации свободных остатков цистеина IgGl путем модификации тиоловых групп молекулы флуоресцентным реагентом ДАЗ (в условиях С) с последующим разделением белка на Fab и Fc фрагменты и выделением меченых пептидов Fab фрагмента. Поскольку аминокислотные последовательности константных областей молекул IgG имеют до 95% гомологии (Ellison, Hood; 1984), определив последовательность модифицированного по остатку цистеина пептида, с высокой долей вероятности можно предположить его место в белке.
Очередной задачей стало расщепление модифицированного по остаткам цистеина Fab-фрагмента на небольшие пептиды для последующего разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и выявления меченых фракций. Для глубокого расщепления Fab фрагмента оказалось недостаточно денатурировать белок перед началом реакции, необходимо было также увеличить соотношение ферментхубстрат до 1:20. Ступенчатый трипсинолиз в течение четырех часов привел практически к полному расщеплению иммуноглобулина на небольшие фрагменты.
Разделение супернатанта триптического гидролизата проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, что позволило получить фракцию I, обладающую выраженной флуоресценцией (рис. 6 а). В результате серии последовательных рехроматографий фракции I были получены гомогенные пептиды
1, обладающие флуоресценцией (рис. 6 г, д, е), которые впоследствии подвергались секвенированию (табл. 4).
Таблица 4. Аминокислотная последовательность пептидов Fab-фрагмента ДАЗ-IgGl, содержащих флуоресцентную метку.
Пептид Аминокислотная последовательность* Координаты аминокислотной последовательности в соответствш с первичной структурой белка
1-1-1-1 SFNRGE6 208-214 к-цепи
1-1-1-2 TVAPTE&S 208-215 Х-цепи
1-2-1 SCDK 219-222 Н-цепи
1-3-1 VEPKSßDK 215-222 Н-цепи
"серым цветом обозначены флуоресцентно-меченые остатки цистеина
Рис. 6 Разделение продуктов триптического гидролиза Fab фрагмента (модифицированы 3 SH-группы моль/моль белка) методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (4.6*250 мм) в градиенте концентраций ацетонитрила, скорость элюции 0.5 мл/мин: а) и б) аммоний-бикарбонатный буфер, рН 8.0, Nucleosil Си (7мкм); в) 0.1% ТФУ, рН 2.1, Nucleosil С)8 (7мкм); г) 0.1% ТФУ, рН 2.1, Nucleosil Си (5мкм); д) и е) 0.1% ТФУ, рН 2.1, Nucleosil Сц (7мкм). Пунктирной линией показано изменение содержания ацетонитрила, в процентах. Вертикальные линии отображают величину флуоресценции соответствующих фракций, в условных единицах.
Выявление модифицированных остатков цистеина в положении 220 Н-цепи, 214 X-цепи и 214 к-цепи позволяет заключить, что в препарате IgGl, выделенном из сыворотки здорового донора без восстановителя, отсутствуют дисульфидные связи между легкими и тяжелыми цепями. Эти данные согласуются с результатами С-концевого секвенирования Fab фрагмента.
Выделение цистеинсодержащих пептидов ш трипттеского гидропизата апкилированного IgGl. В отличие от предыдущего эксперимента, данный этап работы заключался в анализе флуоресцентно меченых пептидов, полученных в результате исчерпывающего алкилирования и последующего гидролиза целой молекулы IgGl. Проведение такого эксперимента было обусловлено необходимостью исключить присутствие свободных остатков цистеина в среднем шарнирном регионе и в Fc области в целом.
С целью максимальной модификации всех SH-гругш решено было изменить схему реакции алкилирования IgGl N-дансилазиридином, использованную ранее, которая позволяла пометить лишь три из четырех остатков цистеина (табл. 2, инкубация бежа в условиях С) трехкратно добавляя N-дансилазиридия и увеличив время реакции с двух до шести часов. Такой подход позволил модифицировать N-дансилазиридином 3.5 SH-групп моль/моль белка.
Расщепление модифицированного иммуноглобулина на пептиды проводилось по схеме, разработанной для трипсинолиза Fab-фрагмента. Продукты триптического гидролиза разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате первичного деления были получены фракции II и Ш с выраженной флуоресценцией, элюирующиеся при 35% и 40% ацетонитрила, соответственно (рис. 7 а). Флуоресценция других фракций не превышала уровня фона.
В результате серии последовательных хроматографии фракции II были получены флуоресцентные фрагменты и дипептид II-2-2-2 (рис. 7 в, г, д).
Определение аминокислотной последовательности фракции II-2-2-2 показало, что она состоит из двух фрагментов тяжелой цепи, по-видимому, соединенных внутридоменной дисульфидной связью. Флуоресценция фракции П-2-2-2 вероятно связана с присутствием в фрагменте модифицированного цистеина в положении 220. Тот факт, что разделения фрагментов тяжелой (II-2-2-2) и легкой (II-2-2-1) цепей удалось добиться только в результате серии последовательных рехроматографий в кислых условиях, подтверждает литературные данные о высокой ассоциации Н и L цепей за счет нековалентных взаимодействий.
Повторная хроматография фракции III из первичного деления на той же колонке при рН 2.1 привела к получению двух гомогенных флуоресцентных фрагментов III-1 и Ш-2 (рис. 7 е).
Рис. 7. Разделение продуктов триптического гидролиза ДАЗ-IgGl (модифицировано 3.5 SH-групп, моль/моль белка) методом ВЭЖХ в градиенте концентраций ацетонитрила, скорость элюции 0.5 мл/мин: а) и б) аммоний-бикарбонатный буфер, рН 8.0, колонка 4.6*250 мм, №ю1еоя1 С^ (7мкм); в), г) 0.1% ТФУ, рН 2.1, колонка 4.6*250 мм, №ю1еоя1 С]8 (7мкм); д) 0.1 % ТФУ, рН 2.1, колонка 4 *250 мм, №ю1еоя1 Св (7мкм); е) 0.1 % ТФУ, рН 2.1, колонка 4.6*250 мм, Nucleosil С18 (7мкм). Пунктирной линией показано изменение содержания ацетонитрила, в процентах. Вертикальные линии отображают величину флуоресценции соответствующих фракций, в условных единицах.
Таблица 5. Аминокислотная последовательность пептидов ДАЗ-IgGl, содержащих флуоресцентную метку.
Пептид Аминокислотная последовательность' Координаты аминокислотной последовательности в соответствии с первичной структурой белка
ii-2-1 sfnrgel 208-214 к-цепи
ii-2-2-1 tvapteüs 208-215 Х-цепи
п-2-2-2 stsggtaalgc/2lvk yic/2nvnhkpsntkvdkrvepksBdk 134-147 и 198-222 Н-цепи
п-1-1 skdk 219-222 Н-цепи
ш-1 vepksSdk 215-222 Н-цепи
п1-2 vepksIdktht 215-225 Н-цепи
'серым цветом обозначены флуоресцентно-меченые остатки цистеина
Анализ первичной структуры выделенных пептидов (табл. 5) показал, что все они принадлежат к Fab области и содержат ДАЗ-производные Cys-220 тяжелой цепи и Cys-214 легких каппа и лямбда цепей. Эти данные подтверждают результаты исследования пептидов Fab-области, свидетельствуя о наличии в положении 220 Н-цепи и 214 L-цепи свободных остатков цистеина. Таким образом, можно утверждать, что между Н и L цепями отсутствует дисульфидная связь.
Имеющиеся в литературе данные о том, что ассоциация тяжелой и легкой цепей может осуществляться за счет междоменных нековалентных взаимодействий (Padlan et al., 1986; Ramon et al., 2002), а также что дисульфидная связь между Н и L цепями IgG не является необходимым условием для поддержания четвертичной структуры молекулы (Rowe, 1976; Michaelsen et al., 1988) и выполнения ею эффекторных функций (Rinfret et al., 1985; Michaelsen et al., 1994) подтверждают полученные нами результаты.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЖ СВОБОДНЫХ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В IgGl Согласно результатам, полученным нами в процессе выявления свободных остатков цистеина, в IgGl, выделенных из сыворотки крови здоровых доноров, присутствеют одна легкодоступная SH-rpynna и три маскированных, в то время как в IgGl больных людей такой SH-грутшы обнаружить не удалось (Гевондян и др., 2003). Для выяснения функциональной значимости остатков цистеина был проведен сравнительный анализ агглютинирующей способности IgGl здоровых доноров до и после алкилирования легкодоступного остатка цистеина. С этой целью был использован метод пассивной гемагтлютинации сенсибилизированных антигеном эритроцитов, позволяющий определять способность антител к поливалентному связыванию с эпигонами антигена.
На данном этапе работы для алкилирования IgGl был выбран N-дансилазиридин, поскольку методом кругового дихроизма показано, что модификация N-дансилазиридином
IgG кролика не сопровождается заметными изменениями во вторичной структуре белка и незначительно сказывается на его антигексвязывающих свойствах (Шкулева и др., 1990). Модификацию белка проводили в отсутствии детергента в течение одного или двух часов, что позволило получить IgGl со степенью модификации 0.5 и 0.9 SH-групп моль/моль белка, соответственно.
Исследования показали, что нативные IgGl, так же как и сыворотка, из которой они выделялись, обладали практически одинаковой агглютинирующей способностью, их титры составляли от 1:64 до 1:128 в зависимости от антигена. В то же время, модификация 0.5 (моль/моль белка) остатков цистеина в IgGl привела к снижению титров агглютинации, а 0.9 - к практически полной потере способности антител агглютинировать сенсибилизированные специфическим антигеном эритроциты (табл. 6).
Исходя из полученных данных, можно заключить, что независимо от специфичности антител, модификация свободных остатков цистеина IgGl приводит к потере способности антител к поливалентному связыванию с антигеном, что является важным этапом в реализации протективной активности IgGl.
Таблица 6. Определение титров нормальных антител к антигенам грам-положительных бактерий в препаратах IgGl, нативных и алкилированных ДАЗ
Исследуемый материал Титр нормальных антител к антигенам грам-положительных бактерий, 1ой
X У г
Сыворотка 6 б 7
1861 6 б 7
ДАЗ-^01 (модифицировано 0.5 БН-групп) 4 4 5
ДАЗ-^в! (модифицировано 0.9 ЭИ-групп) 1 1 1
5 ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕАКЦИОННОСПОСОБНОГО ОСТАТКА ЦИСТЕИНА В МОЛЕКУЛЕ ИММУНОГЛОБУЛИНА
Поскольку блокирование легкодоступного остатка цистеина ведет к потере агглютинирующей способности антител, информация о его местоположении представляется исключительно важной с функциональной точки зрения.
В ходе настоящего исследования показано, что четыре тиоловые группы IgGl принадлежат Cys-220 двух Н-цепей и Cys-214 двух L цепей молекулы. Таким образом, для локализации одной легкодоступной ЗН-группы достаточно определить в какой из цепей -легкой или тяжелой - она находится. Для определения местоположения реакционноактивной ЗН-группы IgGl было проведено ограниченное алкилировапие одного остатка цистеина М-дансилазиридином с последующим анализом распределения
флуоресценции между легкой и тяжелой цепями и выделением меченого пептида при помощи ВЭЖХ
Оценка распределения флуоресцентных производных цистеина между цепями IgGl. Алкилирование ^О проводили в отсутствии детергентов (в условиях А), что привело к модификации 0 9 8И-групп, моль/моль белка Таким образом, был получен препарат с меченой реакционноспособной 8И-грушюй и тремя маскированными остатками цистеина, выявляемыми в денатурирующих условиях
Разделение алкилированного ^01 на легкие и тяжелые цепи проводилось при помощи электрофореза по Леммли в денатурирующих условиях, необходимых для
разрушения нековалентных связей между цепями Учитывая, что в присутствии
Рис. 8. 8Э8-электрофорез в 10% полиакриламидном геле ^01, нативного и алкилированного N дансилазиридином а) белковые полосы окрашены кумасси 0-250, б) гель в ультрафиолетовом свете А - молекулярные стандарты, В - ^01, алкилирован-ный ^дансилазиридином, С -Ig01, алкилированый ^дансилазиридином, Э - нативный ^01 А, В - в присутствии р-меркапто-этанола, С, Э - в отсутствии р-меркаптоэтанола
маскированные 8И-группы становятся реакционноспособными, а белок - склонным к агрегации (Ба^ег е1 а1, 1988, Maningeг е1 а1, 1996, Бгоёу, 1997), для предотвращения этого процесса в образец был добавлен 1% р-меркаптоэтанола. Анализ распределения флуоресценции (рис 8) показал, что 8И-группа, модифицированная ^дансилазиридином, находится в тяжелой цепи молекулы ^01
Выделение флуоресцентных пептидов Fab-фрагмента. Для проверки результатов проведенного эксперимента альтернативным методом определяли аминокислотную последовательность пептида, содержащего флуоресцентно-меченый остаток цистеина
Трипсинолиз ДАЗ-^01 с одной модифицированной 8И-грушюй проходил значительно медленнее, чем после исчерпывающего алкилирования Так, 90% расщепления удалось добиться только через 20 часов, вместо 3 часов в предыдущих экспериментах По-видимому, такая разница в поведении иммуноглобулина объясняется гидрофобностью белка и отсутствием на данном этапе предварительной инкубации в присутствии детергентов Выделение РаЬ-фрагмента и расщепление его на пептиды проводились в условиях, аналогичных описанным ранее
Рис. 9. Разделение продуктов триптического гидролиза Fab фрагмента (модифицирована 1 SH-группа моль/моль белка) методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (4.6*250 мм), с носителем Nucleosil Си (7мкм) в градиенте концентраций ацетонитрила, скорость элюции 0.5 мл/мин а) и б) аммоний-бикарбонатный буфер, рН 8.0; в), г) 0.1% ТФУ, рН 2.1. Пунктирной линией показано изменение содержания ацетонитрила, в процентах. Вертикальными линиями показана величина флуоресценции соответствующих фракций, в условных единицах.
Разделение продуктов триптического гидролиза Fab-фрагмента проводили методом ВЭЖХ. В результате хроматографии была получена флуоресцентная фракция IV (рис. 9). Последовательные хроматографии выделенной фракции при рН 8.0 и рН 2.1 привели к получению гомогенных флуоресцентных пептидов IV-1-1 и ]У-2-1.
Данные о первичной структуре выделенных пептидов суммированы в таблице 7. Таблица 7. Аминокислотная последовательность пептидов БаЪ-фрагмента ДАЗ-IgGl, содержащих флуоресцентную метку.
Пептид Аминокислотная последовательность * Координаты аминокислотной последовательности в соответствии с первичной структурой белка
IV-1-1 S^DK 219-222 Н-пепи
IV-2-I VEPKSCDK 215-222 Н-цепи
'серым цветом обозначены флуоресиеигвд-меченые остатки цистеина
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что реакционяоспособный остаток цистеина молекулы IgGl расположен в тяжелой цепи в положении 220 и согласуются с данными, полученными при анализе распределения флуоресцентной метки между Н и L цепями методом электрофореза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Суммируя результаты исследования, можно заключить, что сам факт обнаружения свободных остатков цистеина в IgGl человека меняет представление о молекулярной организации иммуноглобулинов Gl-класса и позволяет отнести их к группе белков, имеющих как дисульфидные связи, так и свободные SH-группы, необходимые для функционирования молекулы.
Повышенная устойчивость IgG к денатурирующим воздействиям и ограниченная доступность SH-групп для тиоловых реагентов, свидетельствующие о гидрофобности шарнирного участка, затрудняют выявление глубокомаскированных остатков цистеина, это способствует формированию ложного представления о том, что все остатки цистеина находятся в дисульфидных связях и выполняют исключительно каркасную функцию.
Наличие четырех свободных остатков цистеина в верхнем шарнирном регионе IgGl, по-видимому, предопределяет динамичность молекулы и способность антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена. Отсутствие дисульфидной связи между Н и L цепями позволяет объяснить аллостерические изменения и согласуется с имеющимися литературными данными об удлинении L цепи, сдвиге и повышении гибкости Н цепи, изменении угла между доменами и конформационных перестройках в шарнирном участке молекулы (Cooper et al., 1993; Wilson, Stainfield, 1994; Pikuleva et al., 1990; Sortiffer, 1998), которые происходят в IgG при реакции антиген-антитело.
Выявление реакционноспособной SH-группы в Н цепи молекулы (в функционально значимом верхнем шарнирном регионе) позволяет выдвинуть гипотезу о возможном
участии этого остатка цистеина в передаче сигнала от активного центра к эффекторным доменам.
Обнаружение свободных остатков цистеина в IgGl открывает новые перспективы в изучении конформационных изменений в молекуле, происходящих во второй фазе реакции антиген-антитело и определяющих протективную активность антител.
ВЫВОДЫ
1. Впервые установлено, что наряду с 14 дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободные остатка цистеина. Из них только один остаток цистеина является легкодоступным и реакционноспособным, а остальные три - в различной степени маскированы, что свидетельствует об асимметрии молекулы
2. Показано, что определение маскированных остатков цистеина зависит как от кинетики внутримолекулярных изменений, происходящих в процессе денатурации белка, так и от способа тестирования SH-групп Наиболее чувствительным методом выявления маскированных остатков цистеина является амперометрическое титрование нитратом серебра или хлоридом ртути
3. С помощью различных способов тестирования продуктов ограниченного протеолиза IgGl, алкилированного в нативных и денатурирующих условиях установлено, что все свободные остатки цистеина расположены в Fab области молекулы.
4. Из триптического гидролизата IgGl, алкилированного N-дансилазиридином, методом ВЭЖХ выделены пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, определена их аминокислотная последовательность и установлена локализация четырех свободных остатков цистеина: двух в L цепях (в положении 214) и двух Н цепях (в положении 220) Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ковалентной связи между легкой и тяжелой цепями молекулы.
5. Установлено, что легкодоступный остаток цистеина расположен в тяжелой цепи IgGl и необходим для функционирования молекулы; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалетному связыванию с эпитопами антигена.
6. На основании оценки реакционной способности остатков цистеина разработан эталон конформационного состояния молекулы IgGl в норме, используемый в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител по функциональной активности; экспресс-диагностики доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности (при аллергическом, атопическом и инфекционном синдромах); оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии.
Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:
1. Гевондян Н.М., Гевондян B.C., Трофимова И.Б., Мишурис Л.А., Волынская А.М., Щукина И.В., Гевондян М.В. Авидитет антител G класса в патогенезе атонического дерматита. Аллергология, №3,2003, с 17-23
2. Гевондян Н.М., Гевондян B.C., Трофимова И.Б., Лебедев В.В., Мишурис Л.А., Волынская AM., Щукина И.В., Гевондян М.В. Повышение авидитета антител G класса -альтернативный путь лечения больных атоническим дерматитом. Аллергология, №4, 2003, с 27-35
3. Гевондян B.C., Ермилов СА, Гевондян Н.М., Волынская A.M., Жаров В.П. Изучение влияния низкоинтенсивного оптического излучения на гуморальный иммунитет. Биомедицинская радиоэлектроника, 1999, №5, с. 32-35.
4. Zharov V.P., Gevondyan V.S., Gevondyan N.M., Eraiilov SA., Volynskaya A.M. Light activation of immune system. Part I. Influence on G-Class antibodies. Progress in Biomedical Optics and Imaging. Laser - Tissue Interaction XI: Photochemical, Photothermal, and Photomechanical, USA, 2000, V.I, N 8, p527-536.
5. Volinskaya A.M., Gevondyan V.S., Gevondyan N.M. Structure-Function Organization of G-Class: High Avid and Low Avid Antibodies. 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology Beyond the genom: Understanding and exploiting molequles and cells in the 3rd Millennium, 2000, Birmingham UK p.53
6. Волынская А.М., Гевондян B.C., Гевондян Н.М. Свободные остатки цистеина в IgGl человека и их участие в функционировании антител. Тезисы докладов VII чтений, посвященных памяти академика ЮАОвчинникова. Москва, 2004, с.67.
7. Волынская А.М., Гевондян Н.М., Дидковский НА., Малашенкова И.К., Гевондян B.C. Новые доказательства предопределяющей роли В-системы иммунитета в патогенезе хламидийной респираторной инфекции. Труды IV Международной конференции и дискуссионного научного клуба:" Новые информационные технологии в медицине и экологии". Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 1998, с.212-213.
8. Гевондян Н.М., Волынская А.М., Гевондян B.C. Антитела G класса и вторичные иммунодефициты. Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова "Биоорганика-2000" с.44.
9. Гевондян B.C., Гевондян Н.М., Музыка И.С., Волынская А.М., Ермилов С.А. Жаров В.П. Повышение протективной активности антител G класса с помощью низкоинтенсивного оптического излучения. Труды V Международной конференции и дискуссионного научного клуба: "Новые информационные технологии в медицине и экологии". Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 1999, с. 121-123.
10. Гевондян Н.М., Гевондян B.C., Жаров В.П., Трофимова И.Б., Дидковский Н.А., Малашенкова И.К., Мишурис Л.А., Волынская А.М., Ермилов С.А., Касатова Т.Е. Тест-система для экспресс-диагностшси вторичных иммунодефицитов. Альтернативные пути иммунокоррекции, способы и аппаратура. Тезисы Биотехнология -99, Пущино, 1999, с.33-34.
11. Zharov V.P., Gevondyan V.S., Gevondyan N.M., Volynskaia A.M., Ermilov SA. Liaght activation of the immune system. BIOS 2000. International Symposium on Biomedical Optics. 22-28 January 2000. San Jose, California USA, 3914-60
12. Гевондян B.C., Трофимова И.Б., Жаров В.П., Щукина И.В., Волынская А.М., Гевондян Н.М. Иммунокоррегируюшее действие низкоинтенсивного оптического излучения - альтернативный путь лечения атонического дерматита. Труды конференции. ГХ Международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2001 г., с. 101-103
13. Жаров В.П., Меняев ЮА, Гевондян B.C., Гевондян Н.М., Волынская А.М. Изучение влияние низкоинтенсивного излучения и ультразвука на иммунологические показатели. Тезисы докладов ХШ международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» г. Сочи, 2002 г., с.181
Заказ № 474 Тираж: 100 экз.,
0 0 0 «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru
№23 8 4 0
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волынская, Алла Марковна
ВВЕДЕНИЕ.
1. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G-КЛАССА И
ИХ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ (обзор литературы).
1.1. Структура иммуноглобулинов G-класса.
1.1.1. Fab фрагмент.
1.1.2. Fc фрагмент.
1.1.3. Шарнирный регион.
1.1.4. Пространственная структура.
1.1.5. Подклассы IgG человека.
1.2. Эффекторные функции иммуноглобулинов.
1.2.1. Активация системы комплемента.
1.2.2. Индукция опсонизации.
1.2.3. Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента.
1.3. Механизмы функционирования иммуноглобулинов.
1.3.1. Модель изменения конформации.
1.3.2. Аллостерическая модель.
1.4. Свободные остатки цистеина и их возможное участие в функционировании антител.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение IgGl.
2.2.2. Анализ белковых и пептидных фракций.
2.2.2.1. Определение концентрации белка.
2.2.2.2. Гель-электрофорез.
2.2.2.3. Электроблотгинг.
2.2.2.4. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов.
2.2.2.5. Определение агглютинирующей способности.
2.2.2.6. Аминокислотный анализ.
2.2.2.7. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности.
2.2.2.8. Определение N-концевого аминокислотного остатка.
2.2.3. Методы определения SH-групп и дисульфидных связей.
2.2.3.1. Предварительная подготовка белка.
2.2.3.2. Меркаптидирование.
2.2.3.3. Алкилирование.
2.2.3.4. Тиол-дисульфидный обмен.
2.2.4. Получение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулина G1.
2.2.5. Определение С-концевой аминокислотной последовательности алкилированного Fab фрагмента.
2.2.6. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата.
Fab фрагмента IgGl.
2.2.7. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата IgGl.
2.2.8. Определение агглютинирующей способности модифицированного IgGl.
2.2.9. Определение местоположения легкодоступного остатка цистеина.
2.2.10. Методы статистической обработки данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Получение гомогенного препарата IgGl человека.
3.2. Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека.
3.2.1. Легкодоступные остатки цистеина.
3.2.2. Маскированные остатки цистеина.
3.3. Локализация четырех свободных остатков цистеина в IgGl.
3.3.1. Поиск свободных остатков цистеина в Fab и Fc фрагментах.
3.3.2. Анализ С-концевой последовательности Fab фрагмента.
3.3.3. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов Fab фрагмента IgGl.
3.3.4. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl.
3.4. Определение значимости легкодоступного остатка цистеина для функционирования IgGl.
3.5. Локализация легкодоступного остатка цистеина в IgGl.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные исследования IgG1 человека"
Антитела являются мощным фактором приобретенного иммунитета, обеспечивающего устойчивость организма к вирусам, бактериям, токсинам и другим патогенам. Именно они в первую очередь взаимодействуют с поступающими в организм этиотропными агентами и вовлекают в иммунный ответ молекулярные и клеточные механизмы защиты, которые без участия антител лишены возможности селективно действовать на патогены.
На основании многочисленных исследований с применением методов физико-химического, белкового и иммунохимического анализов установлено, что молекула IgG состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, включающих 12 доменов, сходных по способу укладки полипептидной цепи и наличию одной дисульфидной связи в гидрофобном ядре каждого домена. Четыре полипептидные цепи сложены таким образом, что в результате образуются три большие субструктуры - две идентичные Fab области, содержащие антигенсвязывающий центр, и Fc область, осуществляющая эффекторные функции. В состав Fab фрагмента входит вся легкая цепь и N-концевая половина тяжелой цепи, в состав Fc фрагмента — С-концевые половины двух тяжелых цепей. Fab фрагменты соединены с Fc фрагментом константными участками тяжелых цепей, именуемыми шарнирным регионом [1,2].
Несмотря на большой объем накопленных данных по структуре и функциям антител, до настоящего времени остается невыясненным, почему при высокой секреции специфических антител в процессе иммунного ответа последние часто не оказывают протективный эффект. Неизвестно также, за счет каких молекулярных механизмов обеспечивается динамичность молекулы IgG, необходимая для поливалентного связывания с антигеном и осуществления аллостерических структурных изменений, происходящих во второй фазе реакции антиген-антитело [3]. Предполагается, что сегментная гибкость и передача сигналов от центров связывания с антигеном Fab области к эффекторным доменам Fc области в основном осуществляется шарнирным участком антитела [4, 5]. Отличительной особенностью этой области является высокая обогащенность остатками пролина и цистеина, которые с одной стороны придают структуре гибкость, а с другой - стабильность за счет межцепочечных дисульфидных связей [6, 7]. Таким образом, сложилось представление, что остатки цистеина в молекуле IgG выполняют исключительно каркасную функцию, обеспечивая целостность четвертичной структуры молекулы.
В то же время в литературе стали появляться единичные сообщения об обнаружении свободных SH-групп в препаратах IgG [8 - 13]. Несмотря на то, что работы по определению SH-групп носят фрагментарный характер, и феномен их появления не объясняется совсем или же интерпретируется как результат разрыва лабильной межцепочечной дисульфидной связи [13, 14], эти данные заслуживают внимания, поскольку поднимают вопрос о возможном существовании, наряду с ковалентно связанными, свободных остатков цистеина, потенциально способных, в силу своей реактивности, участвовать в процессе функционирования антител.
Отсутствие единой точки зрения относительно наличия в IgG свободных остатков цистеина, а также то, что в моноклональных, миеломных и генноинженерных антителах свободные остатки цистеина не обнаруживаются или выявляются в следовых количествах [11, 12], тогда как в некоторых препаратах IgG, выделенных из сывороток крови, определяется от 0.3 до 1.5 SH-групп и наблюдается уменьшение их числа при патологии [15- 17], делает актуальным проведение исследований по выяснению наличия или отсутствия свободных остатков цистеина в IgG в норме и при патологии.
Целью работы явилось выяснение истинного числа свободных остатков цистеина в IgGl человека в норме, определение их локализации в полипептидных цепях и роли в функционировании антител.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- выделить из сыворотки крови гомогенный препарат IgGl с сохранением нативной четвертичной структуры;
- разработать способ глубокой денатурации белка для тестирования всех имеющихся SH-групп IgGl с дифференциацией их по степени доступности к тиоловым реагентам;
- для идентификации местоположения свободных остатков цистеина в полипептидной цепи белка разработать оптимальные условия химической модификации SH-групп с учетом степени сродства к тиоловым реагентам в отсутствие восстановителя и способ контроля эффективности алкилирования молекулы IgGl;
- разработать алгоритм поиска меченых остатков цистеина, выделить индивидуальные пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, и провести анализ их аминокислотной последовательности;
- исследовать влияние химической модификации IgGl по остаткам цистеина на функциональную активность антител.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что наряду с четырнадцатью дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободных остатка цистеина. Определено, что только один из них является легкодоступным и реакционноспособным, а остальные три - в различной степени маскированы и выявляются на разных стадиях денатурации белка. Показано, что свободные остатки цистеина расположены в двух L цепях в положении 214 и двух Н цепях в положении 220. Это свидетельствует об отсутствии ковалентной связи между Н и L цепями в Fab фрагменте молекулы. Установлено, что реакционноспособный остаток цистеина расположен в Н цепи и необходим для функционирования антител; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена.
Полученные данные о наличии четырех свободных остатков цистеина открывают принципиально новые возможности для тестирования конформационных и функциональных состояний молекулы при действии различных физических, химических и биологических факторов.
Практическая значимость работы. Результаты исследования были использованы при разработке эталона конформационного состояния молекулы IgGl в норме, применяемого в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител по функциональной активности, экспресс-диагностики доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности у больных с аллергическими, атопическими и инфекционными заболеваниями, оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии; а также при разработке оптимальных параметров и режимов воздействия фотоматричных терапевтических систем на биообъект. Практическая ценность работы подтверждена актами внедрения (см. приложения).
Основные результаты работы были представлены на 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology «Beyond the genom: Understanding and exploiting molecules and cells in the 3 rd Millennium» (Birmingham, 2000); International Symposium on Biomedical Optics (San Jose, 2000); V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика-2000» (Москва, 2000); Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1998, 1999, 2001); XIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» (Сочи, 2002); Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004).
По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волынская, Алла Марковна
выводы
1. Впервые установлено, что наряду с 14 дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободных остатка цистеина. Из них только один остаток цистеина является легкодоступным и реакционноспособным, а остальные три - в различной степени маскированы, что свидетельствует об асимметрии молекулы.
2. Показано, что определение маскированных остатков цистеина зависит как от кинетики внутримолекулярных изменений, происходящих в процессе денатурации белка, так и от способа тестирования SH-групп. Наиболее чувствительным методом выявления маскированных остатков цистеина является амперометрическое титрование нитратом серебра или хлоридом ртути.
3. С помощью различных способов тестирования продуктов ограниченного протеолиза IgGl, алкилированного в денатурирующих условиях, установлено, что все свободные остатки цистеина расположены в Fab области молекулы.
4. Из триптического гидролизата IgGl, алкилированного N-дансилазиридином, методом ВЭЖХ выделены пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, определена их аминокислотная последовательность и установлена локализация четырех свободных остатков цистеина: в двух L цепях (в положении 214) и в двух Н цепях (в положении 220). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ковалентной связи между легкой и тяжелой цепями молекулы.
5. Установлено, что легкодоступный остаток цистеина расположен в тяжелой цепи IgGl и необходим для функционирования молекулы; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена.
6. Данные о реакционной способности остатков цистеина легли в основу создания эталона конформационного состояния молекулы IgGl в норме, используемого в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител* по функциональной активности; экспресс-диагностики
103 доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности (при аллергическом, атопическом и инфекционном синдромах); оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обобщая результаты исследования, можно заключить, что сам факт обнаружения свободных остатков цистеина в IgGl человека в норме меняет представление о молекулярной организации иммуноглобулинов G1-класса и позволяет отнести их к группе белков, имеющих как дисульфидные связи, так и SH-группы, необходимые для функционирования молекулы.
Повышенная устойчивость IgG к денатурирующим воздействиям и ограниченная доступность SH-групп для тиоловых реагентов, свидетельствующие о гидрофобности шарнирного участка, затрудняют выявление глубокомаскированных остатков цистеина. Это способствовало формированию ложного представления о том, что все остатки цистеина находятся в дисульфидных связях и выполняют исключительно каркасную функцию.
Наличие четырех свободных остатков цистеина в верхнем шарнирном регионе IgGl, по-видимому, предопределяет динамичность молекулы и способность антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена. Отсутствие дисульфидной связи между Н и L цепями позволяет объяснить аллостерические изменения и согласуется с имеющимися литературными данными об удлинении L цепи, сдвиге и повышении гибкости Н цепи, изменении угла между доменами и конформационных перестройках в шарнирном участке молекулы, которые происходят в IgG при реакции антиген-антитело [144, 145, 147].
Выявление реакционноспособной SH-группы в функционально значимом верхнем шарнирном регионе IgGl человека в норме позволяет выдвинуть гипотезу о возможном участии этого остатка цистеина в передаче сигнала от активного центра к эффекторным доменам.
Обнаружение свободных остатков цистеина в IgGl открывает новые перспективы в изучении конформационных изменений, происходящих в молекуле во второй фазе реакции антиген-антитело и определяющих протективную активность антител.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волынская, Алла Марковна, Москва
1. Burton D.R. Immunoglobulin G: functional sites // Mol. Immunol. 1985. -Vol. 22.-P. 161-206.
2. Padlan E.A. Anatomy of the antibody molecule // Mol. Immunol. 1994. -Vol. 31, №3.-P. 169-217.
3. Harris L.J., Larson S.B., McPherson A. Comparison of intact antibody structures and the implications for effector function // Adv. Immunol. 1999. -Vol. 12.- P. 191-208.
4. Nezlin R. Internal movements in immunoglobulin molecules // Adv. Immunol. 1990. - Vol. 48. - P. 1-40.
5. Roux K.H. Immunoglobulin structure and function as revealed by electron microscopy // Int. Arch. Allergy. Immunol. 1999. - Vol. 120, №2. - P. 8599.
6. Padlan E.A. X-ray crystallography of antibodies // Advan. Protein. Chem. -1996.-Vol. 49.-P. 57-133.
7. Coloma J.H., Trinh K.R., Wins L.A., Morrison S.L. The hihge as a spaser contributes to covalent assembly and required for function of IgG // J. Immunol. 1997. - Vol. 158 . - P. 733-740.
8. Гевондян B.C., Ермилов C.A., Гевондян H.M., Волынская A.M., Жаров В.П. Изучение влияния низкоинтенсивного оптического излучения на гуморальный иммунитет // Биомедицинская радиоэлектроника. 1999. -№5. - С. 32-35.
9. Lyons A., King D.S., Owens J. Site-specific attachment to recombinant antibodies via introduced surface cystein residues // Protein Engineering. -1990. Vol. 3, №8. - P. 703-708.
10. Zang W., Czupryn MJ. Free sulfhydryl in recombinanat monoclonal antibodies // Biotechnol. Prog. 2002. - Vol. 18. - P. 509-513.
11. Saphire E.O., Stanfield R.L., Crispin M.D.M., Parren P.W., Rudd P.M., Dwek R.A., Burton D.R., Wilson I.A. Contrasting IgG structures reveal extreme asymmetry and flexibility // J. Mol. Biol. 2002. - Vol. 319. - P. 9-18.
12. Schauenstein E., Dachs F., Reiter M., Gombotz H., List W. Labile disulfide bonds and free thiol groups in human IgG. I. Assignment to IgGl and IgG2 subclasses // Int. Archs. Allergy. Appl. Immun. 1986. - Vol. 80. - P. 174179.
13. Гевондян H.M., Гевондян B.C., Трофимова И.Б., Мишурис JI.A., Волынская A.M., Щукина И.В., Гевондян М.В. Авидитет антител G класса в патогенезе атопического дерматита // Аллергология. 2003. -№3. - Р. 17-23.
14. Radaev S., Motyka S., Fridman W.H., Sautes-Fridman C., Sun P.D. Structure of a human type III Fcgamma receptor in complex with Fc // J. Biol. Chem. -2001. Vol. 276, №19. - P. 16469-77.
15. Guddat L.W., Herron J.N., Edmundson A.B. Three-dimensional structure of a human immunoglobulin with a hinge deletion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90, № 9. - P. 4271-4275.
16. Sarma R., Laudin A.G. The three-dimensional structure of a human IgGl immunoglobulin at 4 A resolution: a computer fit of various structural domains on the electron density map // J. Appl. Crystallog. 1982. - Vol. 15. -P. 476-481.
17. Harris L.J., Larson S.B., Skaletsky E., McPherson A. Comparison of the conformations of two intact monoclonal antibodies with hinges // Immunol. Rev.- 1998.-Vol. 163.-P. 35-43.
18. Harris L.J., Skaletsky E., McPherson A. Crystallographic structure of an intact IgGl monoclonal antibody // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 275, №5. - P. 861-72.
19. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochem. J. 1959. - Vol. 73. - P. 119-126.
20. Edelman G.M. Poulik M.D. Studies on structural units of the gammaglobulins//J. Exp. Med.-1961.-Vol. 113.-P. 861-884.
21. Fleischman J.B., Pain R.H., Porter R.R. Reduction of gamma-globulins // Arch. Biochem. Biophys. 1962. - Vol. 1. - P. 174-80.
22. Edelman G.M., Gaily J.A. A Model for the 7S antibody molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1964. Vol. 51. - 846-853.
23. Marler E., Nelson C.A. Tanford C. The polypeptide chains of rabbit gammaglobulin and its papain-cleaved fragments // Biochemistry. 1964. - Vol. 170.-P. 279-284.31. http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html
24. Poljak R.J., Amzel L.M., Avey H.P., Chen R.P., Saul F. Three-dimensional structure of the Fab' fragment of a human immunoglobulin at 2,8-A resolution //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1973. Vol. 70, №12. - P. 3305-3310.
25. Poljak R.J., Amzel L.M., Avey H.P., Веска L.N., Nisonoff A. Structure of Fab' New at 6 A resolution // Nature. 1972. - Vol. 235. - P. 137-140.
26. Michaelsen Т.Е. Alteration of the conformation of human IgG subclasses by reduction of the hinge S-S bonds // Mol. Immunol. 1988. - Vol. 25, № 7. -P. 639-646.
27. Saul F.A., Poljak R.J. Crystal structure of human immunoglobulin fragment Fab New refined at 2.0 A resolution // Proteins: Struct. Funct. Genet. 1992. -Vol. 14.-P. 363-371.
28. He X.M., Rueker F., Casale E., Carter D.C. Structure of human monoclonal antibody Fab fragment against gp41 of human immunodeficiency virus type 1 //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. - Vol. 89. - P. 7154-7158.
29. Larson S., Day J., Greenwood A., Skaletsky E., McPherson A. Characterization of crystals of an intact monoclonal antibody for canine lymphoma // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 222. - P. 17-19.
30. Harris L. J., Larson S. В., Hasel K. W., Day J., Greenwood A., McPherson A. The three-dimensional structure of an intact monoclonal anti-body for canine lymphoma // Nature. 1995. - Vol. 360. - P. 369-372.
31. Worn A., Pluckthun A. An intrinsically stable antibody scFv fragment can tolerate the loss of both disulfide bonds and fold correctly // FEBS Lett. -1998. Vol. 427. - P. 357-361.
32. Padlan E.A., Silverton E.W., sheriffs., Cohen G.H., Smith-Gill S.L., Davies D.R. Structure of an antibody-antigen complex: crystal structure of the HyHEL-10 Fab-lysozyme complex // PNAS. 1989. - Vol. 86. - P. 59385942.
33. Garcia K.C., Ronco P.M., Verroust P.J., Brunger A.T., Amzel L.M. Three-dimensional structure of an angiotensin II-Fab complex at 3 A: hormone recognition by an anti-idiotypic antibody // Science. 1992 . - Vol. 257, № 5069.-P. 502-507.
34. Colman P.M. Structure of antibody-antigen complexes: implications for immune recognition // Adv. Immunol. 1988. - Vol. 43. - P. 99-132.
35. Bhat T.N., Bentley G.A., Fischmann Т.О., Boulot G., Poljak R.J. Small rearrangements in structures of Fv and Fab fragments of antibody D1.3 on antigen binding // Nature. 1990. - Vol. 347. - P. 483-485.
36. Rini J.M., Schulze-Gahmen U., Wilson I.A. Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition // Science. 1992. - Vol. 255.-P. 959-965.
37. Schulze-Gahmen U., Rini J.M., Wilson I.A. Detailed analysis of the free and bound conformations of an antibody. X-ray structures of Fab 17/9 and three different Fab-peptide complexes // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 234, №4. - P. 1098-1118.
38. Thies M.J.W., Talamo F., Mayer M., Bell S., Ruoppolo M., MarinoG., Buchner J. Folding and Oxidation of the Antibody Domain CH3 // J. Mol. Biol. 2002. - Vol. 319. - P. 1267-1277.
39. Seegan G.W., Smith C.A., Schumaker V.N. Changes in quaternary structure of IgG upon reduction of the interheavy-chain disulfide bond // Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 1979. - Vol. 76. - P. 907-911.
40. Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment В of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9 and 2.8 A resolution // Biochemistry. 1981. - Vol. 20. - P. 2361-2370.
41. Burmeister W.P., Huber A.H., Bjorkman P J. Crystal structure of the complex of rat neonatal Fc receptor with Fc // Nature. 1994. - Vol. 372. - P. 379383.
42. Tischenko V.M., Abramov V.M., Zav'yalov V.P. Investigation of the cooperative structure of Fc fragments from myeloma immunoglobulin G // Biochemistry. 1998 . - Vol. 37, №16. - P. 5576-5581.
43. Sondermann P., Huber R., Oosthuizen V., Jacob U. The 3.2-A crystal structure of the human IgGl Fc fragment-FcgRIII complex // Nature. 2000. -Vol. 406.-P. 267-273.
44. DeLano W.L., Ultsch M.H., de Vos A.M., Wells J. A. Convergent solutions to binding at a protein-protein interface // Science. 2000. - Vol. 287. - P. 1279-1283.
45. Brekke O.H., Michaelsen Т.Е., Sandlie I. The structural requirements for complement activation by IgG: does it hinge on the hinge? // Immunol. Today. 1995. - Vol. 16. - P. 85-90.
46. Ito W., Arata Y. Proton nuclear magnetic resonance study on the dynamics of the conformation of the hinge segment of human G1 immunoglobulin // Biochemistry. 1985. - Vol. 24, №23. - P. 6467-6474.
47. Marquart M., Deisenhofer J., Huber R., Palm W. Crystallographic refinement and atomic models of the intact immunoglobulin molecule Kol and its antigen-binding fragment at 3.0 A and 1.0 A resolution // J. Mol. Biol. -1980.-Vol. 141, №4.-P. 369-391.
48. Kim H., Matsunaga C., Yoshino A., Kato K., Arata Y. Dynamical structure of the hinge region of immunoglobulin G as studied by 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 236, № 1. - P. 300309.
49. Terry W.D., Matthews B.W., Davies D.R. Crystallographic studies of a human immunoglobulin //Nature. 1968. - Vol. 220. - P. 239-241.
50. Edmundson A.B., Wood M.K., Schiffer M., Hardman K.D., Ainsworth C.F., Ely K., Deutsch H.F. A crystallographic investigation of a human IgG immunoglobulin // J. Biol. Chem. 1970. - Vol. 245. - P. 2763-2764.
51. Huber R., Deisenhofer J., Colman P.M., Matsushima M., Palm W. Crystallographic structure studies of an IgG molecule and an Fc fragment // Nature. 1976. - Vol. 264. - P. 415-420.
52. Harris L.J., Skaletsky E., McPherson A. Crystallization of intact monoclonal antibodies // Proteins: Struct. Funct. Genet. 1995. - Vol. 23. - P. 285-289.
53. Kuznetsov Y.G., Day J., Newman R., McPherson A. Chimeric human-simian anti-CD4 anti-bodies form crystalline high symmetry particles // J. Struct. Biol. 2000.- Vol. 131.- P. 108-115.
54. Rajan S.S., Ely K.R., Abola E.E., Wood M.K., Colman P.M., Athay R.J., Edmundson A.B. Three-dimensional structure of the Meg IgGl immunoglobulin//Mol. Immunol. 1983.- Vol.20. - P. 787-799.
55. Colman P.M., Deisenhofer J., Huber R., Palm W. Structure of the human antibody molecule Kol (immunoglobulin Gl): an electron density map at 5 A resolution // J. Mol. Biol. 1976. - Vol. 100. - P. 257-278.
56. Valentine R.C., Green N.M. Electron microscopy of an antibody-hapten complex//J. Mol.Biol. 1967.- Vol.27. - P. 615-617.
57. Schur PH. IgG subclasses—a review // Ann. Allergy. 1987. - Vol. 58, № 2.- P. 89-96.
58. French M., Harrison G. Serum IgG subclass concentrations in healthy adults: a study using monoclonal antisera // Clin Exp Immunol. 1984. Vol. 56. -P. 473-475.
59. French M. Serum IgG subclasses in normal adults // Monogr. Allergy. -1986.- Vol. 19.- P. 100-107.
60. Furukawa K., Kobata A. IgG galactosylation its biological significance and pathology // Mol Immunol. - 1991. - Vol. 28, № 12. - P. 1333-1340.
61. Ellison J., Hood L. Linkage and sequence homology of two human immunoglobulin gamma heavy chain constant region genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982. Vol. 79. - P. 1984-1988.
62. Michaelsen Т.Е., Frangione В., Franklin E.C. Primary structure of the "hinge" region of human IgG3. Probable quadruplication of a 15-amino acid residue basic unit // J. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252. - P. 883-889.
63. Huck S., Fort P., Crawford D.H., Lefranc M.P., Lefranc G. Sequence of a human immunoglobulin gamma 3 heavy chain constant region gene: comparison with the other human С gamma genes // Nucleic. Acids. Res. -1986.- Vol. 14.- P. 1779-1789.
64. Michaelsen Т.Е., Naess L.M., Aase A. Human IgG3 is decreased and IgGl, IgG2 and IgG4 are unchanged in molecular size by mild reduction and reoxidation without any major change in effector functions // Mol. Immunol.- 1993.-Vol. 30, № 1. P. 35-45.
65. Gregory L., Davis K.G., Sheth В., Boyd J., Jefferis R., Nave C., Burton D.R. The solution conformations of the subclasses of human IgG deduced fromsedimentation and small angle X-ray scattering studies // Mol. Immunol. -1987.-Vol. 24.-821-829.
66. Hamilton R.G. The human IgG subclasses // Booklet Calbiochem-Novabiochem Corporation. 2001. - 66 p.
67. Natvig J.B., Kunkel H.G. Human immunoglobulin: classes, subclasses, genetic variants and idiotypes // Adv. Immun. 1973. - Vol. 16. - P. 1-59.
68. Stanworth D.R., Turner M.W. Immunochemical analysis of human and rabbit immunoglobulins and their subunits // In Handbook of experimental immunology in four volumes, ed. by Weir D.M. Blackweel scien. pub. Oxford. 1986.
69. Kishore U., Kojouharova M.S., Reid K.B. Recent progress in the understanding of the structure-function relationships of the globular head regions of Clq // Immunobiology. 2002. - Vol. 205. - P. 355-364.
70. Hughes-Jones N.C. Functional affinity constants of the reaction between 1251-labelled Clq and Clq binders and their use in the measurement of plasma С1 q concentrations//Immunology. 1977.- Vol.32. - P. 191-198.
71. Hughes-Jones N.C., Gardner B. Reaction between the isolated globular sub-units of the complement component Clq and IgG-complexes // Mol. Immunol. 1979. - Vol. 16. - P. 697-701.
72. Wright J.K., Tschopp J., Jaton J.C., Engel J. Dimeric, trimeric and tetrameric complexes of immunoglobulin G fix complement // Biochem. J. 1980. -Vol. 187.- P. 775-780.
73. Painter R.H., Foster D.B., Gardner В., Hughes-Jones N.C. Functional affinity constants of subfragments of immunoglobulin G for Clq // Mol. Immunol. -1982.- Vol. 19.- P. 127-131.
74. Schumaker V.N., Calcott M.A., Spiegelberg H.L., Muller-Eberhard H.J. Ultracentrifuge studies of the binding of IgG of different subclasses to the Clq subunit of the first component of complement // Biochemistry. 1976. -Vol. 15.- P. 5175-5181.
75. Hulett M.D., Hogarth P.M. Molecular basis of Fc receptor function // Adv. Immunol.- 1994.- Vol.57. P. 1-127.97. van Dijlc M.A., van de Winkel J.G. Human antibodies as next generation therapeutics //Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. - Vol. 5. - P. 368- 374.
76. Ravetch J.V., Bolland S. IgG Fc receptors // Annu. Rev. Immunol. 2001. -Vol. 19.- P. 275-290.
77. Ravetch J.V., Anderson C.L. FcR family: proteins, transcripts, and genes // In: Fc receptors and the action of antibodies. Ed. by Metzger H. 1990. - Am. Soc. Microbiol, Washington DC. - 211 p.
78. Jefferis R., Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for Fc-R: current models // Immunol. Lett. 2002. - Vol. 82. - P. 57- 65.
79. Utsumi S., Okada M., Udaka K., Amano T Preparation and biologic characterization of fragments containing dimeric and monomeric С gamma 2 domain of rabbit IgG // Mol. Immunol. 1985. - Vol. 22. - P. 811-819.
80. Sensel M.G., Kane L.M., Morrison S.L. Amino acid differences in the N-terminus of C(H)2 influence the relative abilities of IgG2 and IgG3 to activate complement//Mol. Immunol. 1997.- Vol.34. - P. 1019-1029.
81. Duncan A.R., Winter G. The binding site for CIq on IgG // Nature. 1988. -Vol.332. - P. 738-40.
82. Hezareh M., Hessell A J., Jensen R.C., van de Winkel J.G., Parren P.W.J Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1 // Virol. 2001. -Vol.75. - P. 12161-12168.
83. Thommesen J.E., Michaelsen Т.Е., Loset G.A., Sandlie I., Brekke O.H. Lysine 322 in the human IgG3 C(H)2 domain is crucial for antibody dependent complement activation // Mol. Immunol. 2000. - Vol. 37. - P. 995-1004.
84. Tao M.H., Smith R.I., Morrison S.L. Structural features of human immunoglobulin G that determine isotype-specific differences in complement activation//J. Exp. Med. 1993.- Vol.178. - P. 661-667.
85. Xu Y., Oomen R., Klein M.H. Residue at position 331 in the IgGl and IgG4 CH2 domains contributes to their differential ability to bind and activate complement // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 3469-3474.
86. Canfield S.M., Morrison S.L. The binding affinity of human IgG for its high affinity Fc receptor is determined by multiple amino acids in the CH2 domain and is modulated by the hinge region // J. Exp. Med. 1991. - Vol. 173. -P. 1483-1491.
87. Jefferis R., Lund J., Pound J.D. IgG-Fc-mediated effector functions: molecular definition of interaction sites for effector ligands and the role of glycosylation // Immunol. Rev. 1998. - Vol. 163. - P. 59-76.
88. Lund J., Tanaka Т., Takahashi N., Sarmay G., Arata Y., Jefferis R. A protein structural change in aglycosylated IgG3 correlates with loss of huFc gamma R1 and huFc gamma Rill binding and/or activation // Mol. Immunol. -1990.- Vol.27. P. 1145-1153.
89. Lund J., Pound J.D., Jones P.T., Duncan A.R., Bentley Т., Goodall M., Levine B.A., Jefferis R., Winter G. Multiple binding sites on the CH2 domain of IgG for mouse Fc gamma R11 // Mol. Immunol. 1992. - Vol. 29. - P. 53-59.
90. Burton D.R., Woof J.M. Human antibody effector function // Adv. Immunol. 1992.- Vol.51. - P. 1-84.
91. Diamond В., Boccumini L., Birshtein В. K. Site of binding of IgG2b and IgG2a by mouse macrophage Fc receptors by using cyanogen bromide fragments // J. Immunol. 1985. - Vol. 134. - P. 1080-1083.
92. Gergely J., Sarmay G. The two binding-site models of human IgG binding Fey receptors // FASEB J. 1990. - Vol. 4. - P. 3275-3283.
93. Dwek R.A., Lellouch A.C., Wormald M.R. Glycobiology: 'the function of sugar in the IgG molecule' // J. Anat. 1995. - Vol. 187, Pt 2. - P. 279-292.
94. Tao M.H., Morrison S.L. Studies of aglycosylated chimeric mouse-human IgG. Role of carbohydrate in the structure and effector functions mediated by the human IgG constant region // J. Immunol. 1989. - Vol. 143. - P. 2595-2601.
95. Ghirlando R., Lund J., Goodall M., Jefferis R. Glycosylation of human IgG-Fc: influences on structure revealed by differential scanning micro-calorimetry//Immunol. Lett. 1999.- Vol.68. - P. 47-52.
96. Woof J.M., Nik Jaafar M.I., Jefferis R., Burton D.R. The monocyte binding domain(s) on human immunoglobulin G // Mol. Immunol. 1984. - Vol. 21,- P. 523-527.
97. Walker M.R., Lund J., Thompson K.M. Aglycosylation of human IgGl and IgG3 monoclonal antibodies can eliminate recognition by human cells expressing Fc gamma RI and/or Fc gamma RII receptors // Biochem. J. -1989.- Vol.259. P. 347-353.
98. Takahashi N., Ishii I., Ishihara H., Mori M., Tejima S., Jefferis R., Endo S., Arata Y. Comparative structural study of the N-linked oligosaccharides of human normal and pathological immunoglobulin G // Biochemistry. 1987.- Vol. 26.- P. 1137-1144.
99. Dangl J.L., Wensel T.G., Morrison S.L., Stryer L., Herzenberg L.A., Oi V.T. Segmental flexibility and complement fixation of genetically engineered chimeric human, rabbit and mouse antibodies // EMBO J. 1988. - Vol. 7.- P. 1989-1994.
100. Roux K.H., Strelets L., Michaelsen Т.Е. Flexibility of human IgG subclasses //J. Immunol. 1997,- Vol. 159.- P. 3372-3382.
101. Tan L.K., Shopes R.J., Oi V.T., Morrison S.L. Influence of the hinge region on complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1990 . Vol. 87.- P. 162-166.
102. Brekke O.H., Michaelsen Т.Е., Sandin R., Sandlie I. Activation of complement by an IgG molecule without a genetic hinge // Nature. 1993. -Vol. 363. - P. 628-630.
103. Rinfret A., Home C., Dorrington K.J., Klein M. Noncovalent association of heavy and light chains of human immunoglobulins. IV. The roles of the CHI and CL domains in idiotypic expression // J. Immunol. 1985. - Vol. 135. -№4.- P. 2574-2581.
104. Hamel P.A., Klein M.H., Smith-Gill S.J., Dorrington K.J. Relative noncovalent association constant between immunoglobulin H and L chains is unrelated to their expression or antigen-binding activity // J. Immunol. -1987. Vol. 139. - P. 3012-3020.
105. Bindon C.I., Hale G., Waldmann H Complement activation by immunoglobulin does not depend solely on Clq binding // Eur. J. Immunol. -1990.- Vol.20. P. 277-281.
106. Junghans R.P. Cruel antibody fictions! Cellular antigen enumeration by 'saturation' binding // Immunol. Today. 1999. - Vol. 20. - P. 401-406.
107. Schifferi J.A., Ng Y.C., Peters D.K. The role of complement and its receptors in the elimination of immune complexes // N. Engl. J. Med. 1986. - Vol. 315.-P. 488-495.
108. Wilson I.A., Stainfield R.L. Antibody-antigen interactions: new structures and new conformational changes // Current Opinion in Structural Biology. -1994,- Vol.4. P. 857-867.
109. Sotriffer C.A., Rode B.M., Varga J.M., Liedl K.R. Elbow flexibility and ligand-induced domain rearrangements in antibody Fab NC6.8: large effects of a small hapten // Biophysical J. 2000. - Vol. 79. - P. 614-628.
110. Guddat L. W., Shan L., Anchin J.M., Linthicum D.S., Edmundson A.B. Local and transmitted conformational changes on complexation of an anti-sweetener Fab // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 236. - P. 247-274.
111. Kodandapani R., Veerapandian L., Ni C.Z., Chiou C.K., Whittal R.M., Kunicki T.J., Ely K.R. Conformational change in an anti-integrin antibody: structure of OPG2 Fab bound to a beta 3 peptide // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1998.- Vol.251. P. 61-66.
112. Lesk A.M., Chothia C. Elbow motion in the immunoglobulins involves a molecular ball-and-socket joint//Nature.- 1988.- Vol.335. P. 188-190.
113. Landolfi N.F., Thakur A.B., Fu H., Vasquez M., Queen C., Tsurushita N. The integrity of the ball-and-socket joint between V and С domains is essential for complete activity of a humanized antibody // J. Immunol. -2001.- Vol. 166,- P. 1748-1754.
114. Пикулева И.А., Турко И.В., Адамович Т.Б., Чащин B.JI. Химическая модификация иммуноглобулинов G кролика N-дансилазиридином иисследование свойств модифицированных антител // Биохимия. 1990.- т.55, № 12.- С. 2200-2210.
115. Oda М., Kozono Н., Morii Н., Т. Azuma Evidence of allosteric conformational changes in the antibody constant region upon antigen binding //International Immunology. 2003.- Vol. 15.- P. 417-426.
116. Stanfield R.L., Takimoto-Kamimura M., Rini J.M., Profy A.T., Wilson I.A. Major antigen-induced domain rearrangements in an antibody // Structure. -1993.-Vol. 1.- P. 83-93.
117. Nair D.T., Singh K., Siddiqui Z., Nayak B.P., Rao K.V.S., Salunke D.M. Epitope recognition by diverse antibodies suggests conformational convergence in an antibody response // The Journal of Immunology. 2002.- Vol. 168.- P. 2371-2382.
118. Smith T.J., Chase E.S., Schmidt T.J., Olson N.H., Baker T.S. Neutralizing antibody to human rhino virus 14 penetrates the receptor-binding canyon // Nature. 1996. - Vol. 383. - P. 350-354.
119. Schneider W.P., Wensel T.G., Stryer L., Oi T.V. Genetically engineered immunoglobulins reveal structural features controlling segmental flexibility // PNAS. 1988.- Vol.85. - P. 2509-2513.
120. Montan R.F., Morrison S.L. Influence of the isotype of the light chain on the properties of IgG 1 // The Journal of Immunology. 2002. - Vol. 168. - P. 224-231.
121. Pritsch O., Hudry-Clergeon G., Buckle M., Petillot Y., Bouvet J.P., Gagnon J., Dighiero G. Can immunoglobulin CH 1 constant region domain modulate antigen binding affinity of antibodies? // J. Clin. Invest. 1996. - Vol. 98. -P. 2235-2243.
122. Edmundson A.B., Ely K.R., Abola E.E. Conformational flexibility in immunoglobulins // Contemp. Top Mol. Immunol. 1978. - Vol. 7. - P. 95-118.
123. Novotny J., Bruccoleri R., Newell J., Murphy D., Haber E,. Karplus M. Molecular anatomy of the antibody binding site // J. Biol. Chem. 1983. -Vol.258. - P. 14433-14437.
124. Chintalacharuvu K.R., Morrison S.L. Residues critical for H-L disulfide bond formation in human IgAl and IgA2 // J. Immunol. 1996. - Vol. 157. - P.3443-3449,
125. Schauenstein E., Lahousen M., Reiter M. Labile disulfide bonds and free thiol groups in human IgGl. IV. Use of the "2 S" value for postoperative monitoring of gyneacological malignant tumors // Wien. Klin. Wochenschr. -1989.- Vol. 101.- P. 117-119.
126. Yoo E.M., Wims L.A., Chan L.A., Morrison S.L. Human IgG2 can form covalent dimers // J. Immunol. 2003. - Vol. 170. - P. 3134-3138.
127. Mohammad S.F., SharmaN., Woodward S.C. Disulfide linking of albumin to the hinge region of immunoglobulin G in normal human serum // Biochemica et Biophysica Acta. 1983. - Vol. 794. - P. 47-51.
128. Kostyushov V.V. Thiol-selective mechanism of HIV antigen conjugation with serum IgM, IgG, and IgA // Bull. Exp. Biol. Med. 2000. - Vol. 130. - P. 1147-1149.
129. Grabar P., Robert B. Determination of thiol-protein groups in immunochemical reactions // Ann. Inst. Pasteur 1957. -Vol. 92. - P. 56-61.
130. Markus G., Grossberg A.L., Pressman D. The disulfide bonds of rabbit gama-globulin and its fragments // Arch. Biochem. Biophys. 1962. - Vol. 96. -P. 63-69.
131. Azuma Т., Isobe Т., Hamaguchi К. Kinetics of recombination of heavy and light chains of a human IgGl myeloma protein // J. Biochem. 1975. - Vol. 77. - P. 473-479.
132. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.
133. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 263275.
134. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriofage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
135. Ouchterlony O. Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis // in Handbook of experimental immunology. Blackwell Scientific Publications. Oxford and Edinburg. 1967.
136. Gupta R.K., Sharma S.B., Ahuja S., Saxena S.N. Indirect (passive) haemagglutination test for assay of antigen and antibody (a review) // Acta Microbiol. Hung. 1991. - Vol. 38. - P. 81-90.
137. Bruton C.J., Hartley B.S. Chemical studies on methionyl-tRNA synthetase from Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1970. - Vol. 52. - P. 165-178.
138. Benesch R.E., Larde H.A., Benesch R. The sulfhydryl groups of cristaline proteins // J. Biol. Chem. 1955. - Vol. 215. - P. 665-660.
139. Gevondyan N.M., Gevondyan V.S., Gavrilyeva E.E., Modyanov N.N. Analysis of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in Na+,K+-ATPase // FEBSLett.- 1989.- Vol.255. P. 265-268.
140. Gevondyan N.M., Gevondyan V.S., Modyanov N.N. Analysis of disulfide bonds in the Na+,K+-ATFase a-subunit // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. -Vol. 29.-P. 327-337.
141. Carter J.R. Amperometric titration of disulfide and sulfhydryl in proteins in 8 m urea//J. Biol. Chem. 1959.- Vol.234. - P. 1705-1710.
142. Sturgill T.W., Baskin G.S., Taylor R.P. Bovine serum albumin as a catalyst. VI. Specificity of several nucleophilic groups in the protein for N-dansylaziridine // Biochem. et biophys. acta. 1977. - Vol. 485. - P. 236241.
143. Gevondyan N.M., Gevondyan V.S., Modyanov N.N. Location of disulfide bonds in the Na+, K(+)-ATPase alpha subunit // Biochem. Mol. Biol. Int. -1993.- Vol.30. P. 347-355.
144. Toyo'oka Т., Imai K. Isolation and characterization of cysteine-containing regions of proteins using 4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2,l,3-benzoxadiazole and high-performance liquid chromatography//Anal. Chem. 1985.- Vol. 57.- P. 1931-1937.
145. Gething M.J.H., Davidson B.E. Chorismate mutase/prephenate dehydratase from Escherichia coli K12. Modification with 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) // Eur. J. Biochem. 1977. - Vol. 78. - P. 103-110.
146. Belenky B.G., Nesterov V.V., Gankina E.S., Smirnov M.M. A dynamic theory of thin layer chromatography // J Chromatogr. 1967. - Vol. 31. -P. 369-374.
147. Vermeer A.W., Norde W., van Amerongen A. The unfolding/denaturation of immunogammaglobulin of isotype 2b and its F(ab) and F(c) fragments // Biophys. J. 2000.- Vol. 79.- P. 2150-2154.
148. Attanasio R., Stunz G.W., Kennedy R.C. Folding patterns of immunoglobulin molecules identified by urea gradient electrophoresis // J. Biol. Chem.- 1994.- Vol.269. P. 1834-1838.
149. Троицкий Г.В., Тэтии С.Ю., Ефетов K.A. Влияние дегидратации на междоменные взаимодействия в иммуноглобулине G и его фрагментах // Биофизика. 1984. - т.29, №4. - С. 578-582.
150. Tischenko V.M., Zav'yalov V.P. Long-term metastable conformation of human Fcgamma subunit // Immunol. Lett. 2002. - Vol. 84. - P. 241-245
151. Pezolet M., Pigeon-Gosselin M., Coulombe L. Laser raman investigation of the conformation of human immunoglobulin G // Biochim. Biophys. Acta-1976. Vol. 453. - P. 502-512.
152. Welfle K., Misselwitz R., Hausdorf G., Hohne W., Welfle H. Conformation, pH-induced conformational changes, and thermal unfolding of anti-p24
153. HIV-1) monoclonal antibody CB4-1 and its Fab and Fc fragments I I Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1431.-P. 120-131.
154. Taschner N., Muller S.A., Alumella V.R., Goldie K.N., Drake A.F., Aebi U„ Arvinte T. Modulation of antigenicity related to changes in antibody flexibility upon lyophilization // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 310. - P. 169179.
155. Phillips A.P., Martin K.L., Horton W.H.J. The choice of methods for immunoglobulin IgG purification: yield and purity of antibody activity // Immunol. Methods. 1984. - Vol. 74. - P. 385-393.
156. Брок Й. Иммунохимия // Иммунологические методы / под ред. Фриммеля Г., пер. с нем. Тарасова А.П.,-М.: Медицина, 1987. 472 с.
157. Goto Y., Ichimura N., Hamaguchi К. Effects of ammonium sulfate on the unfolding and refolding of the variable and constant fragments of an immunoglobulin light chain // Biochemistry. 1988 . - Vol. 27. - P. 16701677.
158. Kent U.M. Purification of antibodies using ammonium sulfate fractionation or gel filtration // Methods. Mol. Biol. 1999. - Vol. 115. - P. 11-18.
159. Steinbuch M. Protein Fractionation by ammonium sulphate, rivanol and caprylic acid precipitation // in Methods of plasma protein fractionation, ed. by J.M. Curling, Academic Press. 1980. - P. 34-56.
160. Page M., Thorpe R. IgG purification // Methods. Mol. Biol. 1998. - Vol. 80. - P. 95-111.
161. Qi Y., Yan Z., Huang J. Chromatography on DEAE ion-exchange and Protein G affinity columns in tandem for the separation and purification of proteins // Biochem. Biophys. Methods. 2001. - Vol. 49. - P. 263-273.
162. Oxelius V-A. Preparation of IgG Subclass Allotypes from Polyclonal IgG // Scand. J. Immunol. 1999. - Vol. 49. - P. 395-398.
163. Darbre A. (ed.) Practical Protein Chemistry: A Handbook. Wiley-Interscience, Chichester, Great Britain. - 1986.
164. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М., Наука. - 1977.
165. Petersen M.T., Jonson P.H., Petersen S.B. Amino acid neighbours and detailed conformational analysis of cysteines in proteins // Protein. Eng. -1999.- Vol. 12,- P. 535-548.
166. Heyduk Т., Moniewska A., Kochman M. The reactivity and function of cysteine residues in rabbit liver aldolase В // Biochim. Biophys. Acta. -1986. Vol. 874. - P. 337-346.
167. Scott-Ennis R.J. and Noltmann E.A. Differential response of cysteine residues in pig muscle phosphoglucose isomerase to seven sulfhydryl-modifying reagents // Arch. Biochem. Biophys. 1985. - Vol. 239. - P. 1-11.
168. Raso S.W., Clark P.L., Haase-Pettingell C., King J., Thomas G. J. Jr. Distinct cysteine sulfhydryl environments detected by analysis of Raman S-hh markers of Cys~>Ser mutant proteins // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 307. -P. 899-911.
169. Britto P.J., Knipling L., Wolff J. The local electrostatic environment determines cysteine reactivity of tubulin // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277.- P. 2918-2927.
170. Исследование сульфгидрильных групп родопсина в фоторецепторной мембране / Каламкаров Г.Р., Скокан JI.E., Островский М.А. // Биофизика. 1980. - т. 26. - С. 634-639.
171. Edelman G.M., Cunningham В.А., Gall W.E., Gottlieb P.D., Rutishauser U., Waxdal M.J. The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - Vol. 63. - P. 78-85.
172. Pal D., Chakrabarti P.J. Different types of interactions involving cysteine sulfhydryl group in proteins // Biomol. Struct. Dyn. 1998. - Vol. 15. - P. 1059-1072.
173. Nemani R., Lee E.Y. Reactivity of sulfhydryl groups of the catalytic subunits of rabbit skeletal muscle protein phosphatases 1 and 2A // Arch. Biochem. Biophys. 1993.- Vol.300. - P. 24-29.
174. Darby N., Creighton Т.Е. Probing protein folding and stability using disulfide bonds // Mol. biotechnology. 1997. - Vol. 7. - P. 57-77.
175. Scouten W.H., Lubcher R., Baughman W. N-dansylaziridine: a new fluorescent modification for cysteine thiols // Biochem. et Biophys. Acta. -1974. Vol. 336. - P. 421-426.
176. Мельникова Я.И., Одинцов С.Г., Кравчук З.И., Марцев С.П. Антигенсвязывающая активность моноклональных антител после инкубации с органическими растворителями // Биохимия. 2000. - т. 65, №11.- С. 1488-1499.
177. Goto Y., Hamaguchi К. Unfolding and refolding of the reduced constant fragment of the immunoglobulin light chain. Kinetic role of the intrachain disulfide bond // J. Mol. Biol. 1982. - Vol. 156. - P. 911-926.
178. Kikuchi H., Goto Y., Hamaguchi K. Reduction of the buried intrachain disulfide bond of the constant fragment of the immunoglobulin light chain: global unfolding under physiological conditions // Biochemistry. 1986. -Vol.25. - P. 2009-2013.
179. Ellison J.W., Berson В .J., Hood L.E. The nucleotide sequence of a human immunoglobulin С gammal gene // Nucleic Acids Res. 1982. - Vol. 10. -P. 4071-4079.
180. Pikuleva I.A., Turko I.V., Adamovich T.B., Chashchin V.L. Chemical modification of rabbit IgG with N-dansylaziridine. Investigation of the properties of dansylated antibodies // Mol. Immunol. 1991. - Vol. 28. - P. 311-318.
181. O'Donnell I .J., Frangione В., Perter R.R. The disulphide bonds of the heavy chain of rabbit immunoglobulin G // Biochem. J. 1970. - Vol. 116. - P. 261-268.
182. Padlan E.A., Cohen G.H., Davies D.R. Antibody Fab assembly: the interface residues between CHI and CL // Mol. Immunol. 1986. - Vol. 23. - P. 951960.
183. Rowe E.S. Dissociation and denaturation equilibria and kinetics of a homogeneous human immunoglobulin Fab fragment // Biochemistry. 1976. -Vol. 15.-P. 905-916.
184. Zimmerman В., Grey H.M. Noncovalent interactions between immunoglobulin polypeptide chains. Stability to dissociation by denaturants // Biochemistry. 1972. - Vol. 11. - P. 78-84.
185. Azuma Т., Hamaguchi К. Kinetics and equilibrium studies on autologous and heterologous recombinations of heavy and light chains of myeloma proteins // J. Biochem. (Tokyo). 1975. - Vol. 78. - 341-347.
186. Bigelow C.C., Smith B.R., Dorrington K.J. Equilibrium and kinetic aspects of subunit association in immunoglobulin G // Biochemistry. 1974. - Vol. 13.-P. 4602-4608.
187. Sears D.W., Kazin A.K., Mohrere J., Friedman F., Beychok S Acquisition of the covalent quaternary structure of an immunoglobulin G molecule. Reoxidative assembly in vitro // Biochemistry. 1977. - Vol. 16. - P. 20162020.
188. Palm G.J., Billy E., Filipowicz W., Wlodawer A. Crystal structure of RNA 3'-terminal phosphate cyclase, a ubiquitous enzyme with unusual topology // Structure. Fold. Des. 2000. - Vol. 8. - P. 13-23.
189. Phan J., Zdanov A., Evdokimov A.G., Tropea J.E., Peters H.K. 3rd, Kapust R.B., Li M., Wlodawer A., Waugh D.S. Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 50564-50572.
190. Luks C., Connell G.E. Aggregation of an immunoglobulin fragment by sulfhydryl oxidation // Can. J. Biochem. 1968. - Vol. 46. - P. 961-964.
191. Fasler S., Skvaril F., Lutz H.U. Electrophoretic properties of human IgG and its subclasses on sodium dodecyl-sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblots // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 174. - P. 593-600.
192. Brody T. Multistep denaturation and hierarchy of disulfide bond cleavage of a monoclonal antibody // Anal. Biochem. 1997. - Vol. 247. - P. 247-256.
-
Волынская, Алла Марковна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Сравнительные исследования структуры иммуноглобулинов класса G животных различных видов (свиньи, мыши, кролика) методами микрокалориметрии и дифференциальной спектрофотометрии
- Иммуногенетика липопротеина низкой плотности у американской норки
- Некоторые аспекты механизма иммунитета при экспериментальном эхинококкозе овец и пути его коррекции
- Низкомолекулярный белок клеточной стенки стрептококка группы А, не обладающей типовой специфичностью: выделение, иммунологические свойства, использование в иммунодиагностике
- Моноклональные антитела к миоглобину человека
