Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы"

На правах рукописи

Зоров Савва Дмитриевич

Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва-2005

Работа выполнена в отделе биоэнергетики института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории К. Северинова института им. Ваксмана, университета Ратгсрс, США (Waksman Institute, Rutgers University, USA)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Д.Б. Зоров

кандидат биологических наук, К. Северинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.А. Валуева

кандидат биологических наук, A.B. Кульбачннский

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученых степеней кандидатов наук в Институте Биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т., 33, корп. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке Биологической Литературы по адресу; 119071 Москва, Ленинский пр-т., 33, корп. 1

Автореферат разослан «/£» 2005 года

Защита состоится « ' ' » IAUHJ- 2005 года

года в / часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

г 2 У/зу

Актуальность проблемы. ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП) осуществляют процесс транскрипции, т.е. создание РНК-копии генов для последующей трансляции. Выделяют три стадии транскрипционного цикла* инициацию, элонгацию и терминацию, при этом непосредственно реакция полимеризации происходит на стадии элонгации. Ключевым этапом процесса элонгации является образование фосфодиэфирной связи между входящим субстратом (нуклеозидгрифосфатом) и 3'-концевым нуклеотидом цепи РНК в активном центре РНКП Несмотря на множество биохимических и структурных данных, механизм функционирования активного центра РНКП в целом остается не полностью изученным.

Недавно была предложена модель, в соответствии с которой реакция образования фосфодиэфирной связи в активном центре РНКП, равно как и другие виды активностей, такие как расщепление РНК и пирофосфоролиз, происходит при участии двух ионов магния, находящихся в активном центре РНКП (Бовипоу л а1,2003). Однако необходима дальнейшая работа по проверке и совершенствованию этой модели.

Кроме того, не изучены процессы в активном центре, предшествующие образованию фосфодиэфирной связи, и в этом направлении остается огромное поле для деятельности.

Понимание всех этих этапов в работе РНКП необходимо для выяснения механизма функционирования активного центра РНКП в целом.

Помимо чисто научного смысла, понимание функционирования активного центра РНКП несет в себе и практический интерес, особенно в случае бактериальной РНКП, поскольку его можно применить в разработке новых антибиотиков. Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение структурно-функциональной организации активного центра бактериальной РНКП. В задачи данного исследования входило:

1. Изучить механизм ингибирования РНКП антибиотиком стрепголидигином, действующим на уровне активного центра.

2. На основе структурных и биохимических данных по ингибированию РНКП сгрептолидигином предложить общую схему функционирования активного центра РНКП.

3. Произвести проверку универсальной модели механизма катализа в активном центре РНКП с участием двух ионов двухвалентных металлов.

Научная новизна. В работе исследован механизм действия антибиотика стрептолидигина на бактериальную РНКП. Несмотря на то, что этот антибиотик известен уже очень давно (51<1<)Ыко1 й а1,1969), до настоящего времени исследования механизма его действия детально не проводились. При этом известно, что ингибирование РНКП стрептолидигином связано с его взаимодействием с активным центром РНКП (Беуеппоу е1 а1., 1995), поэтому исследование механизма ингибирования РНКП стрептолидигином представляло существенный интерес в понимании функционирования активного центра РНКП.

В настоящей работе впервые, с помощью структурных данных и биохимических исследований был детально изучен механизм действия стрептолидигина. Было показано, что стрептолидигин ингибирует РНКП по необычному механизму, когда РНКП, связанная со стрептолидигином, остается активной, но скорость реакций, осуществляемых РНКП, сильно снижена Это первый пример описанного ингибитора РНКП, действующего таким образом, а не полностью инактивирующего РНКП при связывании с ней.

Кроме того, с помощью стрептолидигина впервые было получено свидетельство существования стадии рабочего цикла процесса элонгации, предшествующей синтезу фосфодиэфирной связи.

На основе результатов данной работы была предложена новая модель функционирования активного центра РНКП, в соответствии с которой нуклеотид связывается с ДНК, а потом переносится из так называемого "прединсерционного" в "инсерционный" сайт, где происходит синтез фосфодиэфирной связи.

При помощи мутагенеза была подтверждена недавно предложенная модель двуметаллического катализа образования фосфодиэфирной связи в активном центре. В этой модели два иона магния координированы в активном центре тремя консервативными остатками аспарагиновой кислоты. Показано, что каждый из трех остатков аспарагиновой кислоты участвует в акте катализа, а также впервые продемонстрировано, что нуклеиновые кислоты играют значительную роль в связывании М^2* в активном центре.

Практическое значение работы. Понимание каталитического механизма бактериальной РНКП расширяет горизонты для различных стратегий антибактериальной защиты. В частности, изучение действия стрептолидигина представляет большой интерес, так как этот антибиотик или его производные в

» >*« ! * ?

«о , *

перспективе могут найти применение в клинической практике вообще и в борьбе с устойчивыми штаммами бактерий в частности

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им.А Н.Белозерского (Москва, 2005). Отдельные аспекты работы представлены на: 12th Biannual Meeting on Post-Initiation Activities of RNA Polymerases Mountain Lake, VA, USA November, 4-7, 2004 и Russian Bioenergetics. From Moleculls to Cells. Moscow February, 21-23 2005. Публикации. Основные положения диссертации изложены в 4 печатных работах. Структур« и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 142 страницах машинописного текста и содержит 38 рисунков Библиография включает в себя 142 названия РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Работа состоит из двух частей Первая часть посвящена изучению механизма действия ингибитора РНКП стрептолидигина и процессам, происходящим в активном центре, предшествующим синтезу фосфодиэфирной связи Вторая часть посвящена собственно механизму образования фосфодиэфирной связи в активном центре РНКП. 1. Изучение механизма действия стрептолидигина.

Одной из основных мишеней действия антибиотиков в бактериальной клетке является РНКП. Ингибирование РНКП антибиотиками связано с блокированием каких-либо важных стадий функционирования РНКП, что делает эти вещества мощным инструментом в исследовании механизма транскрипции. Антибиотик стрептолидигин (рис 1) ингибирует многие активности РНКП, такие как синтез РНК,

пирофосфоролиз, внутреннее

расщепление (Siddhikol et al., 1969, McClure, 1980). Несмотря на то, что стрептолидигин изучается уже около

Рис.1. Структурная формул«

стрептолидигина.

40 лет, механизм его действия остается малоизученным. Мутации устойчивости к стрептолидигину находятся вблизи активного центра РНКП (Heister et al., 1993; Severinov et al., 1995; Yang et al., 1995), таким образом, исследование механизма ингибирования РНКП стрептолидигином

з

может приблизить нас к пониманию функционирования активного центра РНКП. Так как наша работа посвящена исследованию активного центра РНКП, представляло большой интерес изучение механизма действия этого антибиотика

Исследования механизма действия стрептолидигина проводили на РНКП термофильного микроорганизма Thermus aquaticus Выбор объекта обусловлен двумя причинами. Во-первых, нами было показано, что эффект стрептолидигина гораздо сильнее выражен на РНКП Thermus aquaticus, нежели на РНКП E.coli. Во-вторых, в сотрудничестве с лабораторией Д Васильева нами была получена кристаллическая структура комплекса РНКП близкородственного организма Thermus thermophilus со связанным с ней стреггголидигином, что давало возможность интерпретировать полученные результаты в терминах трехмерной структуры РНКП.

Для исследования механизма действия стрептолидигина был использован искусственный элонгационный комплекс, собранный на нуклеиново-кислотном остове (скаффолде), состоящем из 13-нуклеотидной РНК и 42-нуклеотидных матричной и нематричной цепей ДНК (рис 2) Последовательность ДНК этого элонгационного комплекса соответствует последовательности AI промотора бактериофага Т7 с -15 по +27 положения относительно точки старта транскрипции Все эксперименты проводили при 40°С. При добавлении к элонгационному комплексу нуклеозидтрифосфата, комплементарного следующему положению матричной цепи, происходит удлинение РНК на один нуклеотид Измеренная нами кажущаяся константа скорости (К,^) элонгации при добавлении СТР в насыщающей концентрации составляет 3000 мин"'.

TACGAGAGGGACA

J I

5'-AGGATACTTAGAGCC CGGCGAATAGCGAT-3'

3'-TCCTATGAAT2JCGG£[GCTCTCCCTGT GCCGCTTATCGSJA-51

i м м i i i м i 5'-AUCGAGAGGGACA-3" RNA" t13

Рнс.2. Схема искусственного транскрипционного комплекса (скаффолда).

Вследствие высокой скорости реакции эти измерения проводили на быстром смесителе методом быстроостановленной реакции В присутствии стрептолидигина эта реакция значительно замедлялась (рис 3) и ее измерения проводили вручную.

При попытке установить константу ингибирования стрептолидигииом нами было замечено, что при небольших концентрациях стрептолидигина часть элонгационных комплексов остается активной, обладая той же скоростью элонгации, что и в отсутствие ингибитора (рис.4). Эта часть элонгационных комплексов

Время 0 5 «ос 10 мсек 20 мсек 50 мсек 100 мсек 250 мсек 500 мсек 3 сек 0 10 сек 1 мин 5 мин 10 мин 30 мин

|Стп], у/МП 0 100

Мм*-»

13 мр—* цйРММНМм

Рис.3. Ингнбирование стрептолидигииом (Стл) одиотяговой элонгации Представлена кинетика присоединения СТР (1 шМ) в отсутствие и в присутствии Стл (без Стл измерение проводилось на быстром смесителе методом быстроостановленной реакции, со стрептолкдигином - вручную) Продукты реакций разделялись в денатурирующем ПААГ. показан радиоавтограф геля.

составляла так называемую быструю фракцию. Оставшаяся часть элонгационных комплексов (медленная фракция) обладала очень низкой скоростью присоединения юо _ нуклеотида (0,27мин"'), в 11000 раз

ниже скорости быстрой фракции.

Рис.4. Разделение элонгационных комплексов на фракции ■ присутствии стрептолидигина (Стл). Приведены кинетики одношаговой элонгации в присутствии 1мМ СТР при разных концентрациях Стл; Ромбы - без Стл, прямоугольники - Стл 5 мкг/кл, треугольники Стл 100мкг/мл; фигурными скобками показана доля быстрой фракции для каждого из трех случаев.

Количество быстрой фракции напрямую зависело от концентрации стрептолидигина в реакции. Это позволило предположить, что медленную фракцию составляют элонгационные комплексы, связанные со стрептолидигииом, тогда как быстрая фракция соответствует элонгационным комплексам, свободным от стрептолидигина Тот факт, что элонгационные комплексы медленной фракции все же обладали активностью, можно было объяснить двумя причинами: (1) В медленной фракции стрептолидигин находится в равновесии с элонгационным комплексом, полностью инактивируя его при связывании с ним При диссоциации же

Время, мин

стрептолидигина активность элонгационного комплекса возвращается в исходное состояние (2) Стрептолидигин, связываясь с элонгационным комплексом, приводит не к полной инактивации, а к сильному замедлению активности РНКП

Если верно первое предположение, то увеличение концентрации стрептолидигина в реакции должно приводить к уменьшению скорости медленной фракции Однако нами было показано, что скорость медленной фракции не зависит от концентрации антибиотика в реакции, что свидетельствует в пользу предположения, что стрептолидигин замедляет активность РНКП

Данное предположение нам также удалось подтвердить с помощью использования ионов марганца в качестве каталитического металла РНКП Оказалось, что ионы марганца сильно увеличивают скорость медленной фракции элонгационных комплексов, при этом практически не влияя на быструю фракцию. Присутствие 5 мМ Мл2+ по сравнению с 10 мМ активировало медленную фракцию в 13 раз (рис 5,

табл 1) При проведении реакции в отсутствие стрептолидигина, наличие 5 мМ Мл2+ не оказывало активирующего действия, напротив, даже приводило к слабому ингибированию (в 2 раза) (табл. 1).

Время, мин

Рнс.5. Графики кинетнк элонгации ■ присутствии 100мкг/мл стрептолидигина ■ присутствии ионов магния или марганца. Треугольники - в присутствии ЮмМ М^*; ромбы - в присутствии 5ыМ Мп2*.

Так как этот эффект может объясняться тем, что присутствие ионов марганца может влиять на связывание стрептолидигина, мы измерили концентрации полуннгибирования в присутствии ионов магния и марганца. Концентрации полуингибирования стрептолидигином были рассчитаны по измеренной зависимости количества быстрой фракции от концентрации стрептолидигина, и соответствовали его концентрации, при которой доля быстрой фракции составляет 50%. Эти значения оказались равными в присутствии Мп2+ и Mg2+ и составляли 8,3 мкг/мл стрептолидигина

Таким образом, полученные данные подтверждают то, что быстрая фракция элонгационных комплексов соответствует РНКП, не связанной со стрептолидигином, и свидетельствуют в пользу того, что РНКП, связанная со стрептолидигином, активна, хотя ее скорость элонгации сильно замедлена

Еще одно доказательство было получено при использовании медленно расщепляемого аналога СТР цитидии-5'-0-(1-тиотрифосфата) (тиоСТР) в качестве субстрата (Роквку « а!., 1992; КашЫк е1 а!., 1996). Оказалось, что включение этого модифицированного нукпеозидтрифосфата РНК-полимеразой происходит в 1250 раз медленнее по сравнению с нормальным нуклеозидтрифосфатом. С другой стороны,

Тябл 1. Влияние ионов металлов н субстратов ня скорости одиошаговой элонгации А_

Субстрат Стл кл,, мин"'

Мп-1*

СТР - ЗООО 1500

тиоСТР - 2,4 12

СТР + 0,27 3,6

тиоСТР + 0,012 0,72

Б Кратность

Ми" Мп'*

(СТР - стл):(тиоСТР - стл) 1250 125

(СТР + стл).(тиоСТР + стл) 22,5 5

(СТР - стл):(СТР + стл) 11 000 417

(ТиоСТР - стл).(тиоСТР + стл) 200 17

(СТР - стл).(июСТР + стлХдвойиое ингибир.) 250 000 2 000

В

Субстрат Стл Кратность Мп27Мк2*

СТР - 0,5

СТР + 13

тиоСТР 5

тиоСТР + 60

в присутствии стрептолидигина реакция замедлялась всего в 125 раз. Таким образом, ингибирующий эффект стрептолидигина уменьшается в присутствии ионов марганца и при использовании тио-аналога нуклеозидтрифосфата в качестве субстрата (Табл.1). Это указывает на различие свойств элонгационных комплексов медленной и быстрой фракций и подтверждает гипотезу о том, что РНКП, связанная со стрептолидигином, активна Причины различий в свойствах элонгационных комплексов медленной и быстрой фракций мы рассмотрим ниже.

РНКП обладает способностью расщеплять фосфодиэфирную связь в транскрипте при движении назад (процессе бэктрэкинга) Мы проверили способность стрептолидигина подавлять эту реакцию. Оказалось, что стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление, при этом также наблюдается разделение на медленную и

быструю фракции (рис 6) Также как и для элонгации, для внутреннего расщепления была показана активация медленной фракции в присутствии ионов марганца, тогда как они практически не оказывали влияния на расщепление в отсутствие стрептолидигина Интересно отметить, что концентрация полуингибирования стрептолидигином внутреннего расщепления была в 5 раз ниже таковой в случае элонгации и составляла

ipilM. мин

Рис.6. Стрептолидигин ингибирум внутреннее расщепление. Приведен радиоавтограф теля (слева), в которой разделялись продукты реахции внутреннего расщепления 13-мера РНК до 11-мера в отсутствие н в присутствии стрептолидигина Реакцию проводили в присутствии 10 mM MgCl2 Справа приведены графики кинетик расщепления в разных концентрациях стрептолидигина Роыбы- без Стл, прямоугольники - Стл 5 мкг/мл, треугольники - Стл 100 мкг/мл

1,7мкг/мл. По-видимому, это свидетельствует о разных конформациях активного центра в сдвинутом назад (бэктрэкинг) и активном комплексах (см. ниже)

Таким образом, наши данные показывают, что стрептолидигин ингибирует РНКП по необычному механизму, когда РНКП, связанная со стрептолидигином, остается активной, но скорость реакций, осуществляемых РНКП, сильно снижена. Это первый пример описанного ингибитора РНКП, действующего таким образом, а не полностью инактивирующего РНКП при связывании с ней.

Замедление реакции элонгации может объясняться увеличением К„ для входящего нуклеотида. Мы измерили Км для входящего нуклеозидгрифосфата (СТР) в отсутствие и в присутствии стрептолидигина Измерения К„ со стрептолидигином проводили при высокой концентрации ингибитора (100 мкг/мл, 150 мкМ), при которой доля быстрой фракции была пренебрежимо мала, что дало возможность избежать возможных ошибок, связанных с присутствием быстрой фракции. При этой же концентрации стрептолидигина проводили и другие эксперименты по изучению свойств медленной фракции элонгационных комплексов Кажущаяся Кы для входящего нуклеозидгрифосфата в отсутствие стрептолидигина оказалась равной 68 мкМ, что согласуется с литературными данными (Foster et al., 2001), а в присутствии 100 мкг/мл стрептолидигина, когда доля быстрой фракции составляет менее 1%, К„

для входящего нуклеотида практически не менялась, составляя 61 мкМ (рис.7). Таким образом, ингибирование стрегтголидигином не связано с изменением сродства РНКГТ к субстрату.

Тио-аналог нуклеозидтрифосфата цитидин-5'-0-(1 -тиотрифосфат) замедляет скорость синтеза фосфодиэфирной связи Этот эффект ранее был исследован на ДНК-полимеразах (Роквку е1а!., 1992; КашЫк е1 а!, 1996), для которых тио-аналог не

0.14 П-" 3000

0.12 2500

01 / 2000

0.0в / 'г

/ 1 1500

0.06 0.04 / « / * 1000

0.02 у 500

0.0001 0.001

0.0001 0.001 0.01 0.1 СТР. ыкМ

Рис.7. Графики зависимости К* (кажущейся константы скорости реакции одношаговой элонгации) от концентрации СТР в логарифмических координатах. А) в присутствии 100 мкг/мл стрсгттоледигина (медленная фракция) и Б) в отсутствие стрептолндигина. Полученные значения К« 61 мкМ - в присутствии стреггголидигина, в отсутствие стре!ттолнаигина - 68 мкМ

приводил к замедлению элонгации Это было объяснено тем, что лимитирующей стадией в синтезе, осуществляемом ДНК-полимеразой, является конформационный переход, предшествующий синтезу фосфодиэфирной связи. Сильное замедление элонгации РНКП в присутствии тио-аналога (в 1250 раз), по-видимому, указывает на то, что синтез фосфодиэфирной связи является лимитирующей стадией, или, по крайней мере, не сильно отличающейся по скорости от других возможных стадий элонгации. Гораздо меньший эффект тио-аналога на элонгацию РНКП, связанной со стрептолидигином (замедление в 125 раз) (табл 1), свидетельствует в пользу того, что стрептолидигин замедляет какую-то стадию, предшествующую синтезу фосфодиэфирной связи, делая эту стадию лимитирующей Это является первым свидетельством существования некой стадии, предшествующей синтезу фосфодиэфирной связи.

Таким образом, ингибирование стрептолидигином не определяется связыванием субстрата (т.к. значение Км не меняется) и синтезом фосфодиэфирной связи как таковым, а происходит на этапе, находящемся между этими двумя стадиями

Для дальнейшего понимания механизма действия стрептолидигина на РНКП в сотрудничестве с лабораторией Д Васильева нами была получена кристаллическая структура РНКП Thermus thermophilic со связанным с ней стрептолидигином (Vassylyev et al, submitted).

На кристаллической структуре с разрешением в 2,4 А видно, что сайт связывания молекулы стрептолидигина находится на расстоянии 20 А от активного центра (места синтеза фосфодиэфирной связи) Стрептолидигин связывается вдоль F-спирали (bridging helix), которая находится между местом расхождения двойной иепи ДНК и местом образования ДНК-РНК гибрида. Связанная молекула стрептолидигина также изменяет обычное положение G-петли.

Из сравнения структур РНК-полимераз видно, что F-спираль может принимать 2 конформации - согнутую и прямую (Zhang et al, 1999; Vassylyev et al., 2002). Биохимические данные свидетельствуют о важности в функционировании РНКП движения системы G-петля - F-спираль (Vassylyev et al., 2002; Bar-Nahum et al., 2005; Epshtein et al., 2002), однако механизм этого не ясен. В структуре РНКП со стрептолидигином F-спираль находится в прямой конформации, и стрептолидигин может блокировать движение F-спирапи и приводить к ингибированию РНКП. Так как наши данные указывают на то, что стрептолидигин ингибирует некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи, можно предположить, что именно изгибание F-спирали и является этой стадией Из наших данных также следует, что это конформационное изменение необходимо и для эффективного осуществления реакции внутреннего расщепления. Наши данные по активации синтеза и расщепления в присутствии ионов марганца свидетельствуют в пользу того, что в комплексе РНКП-стрептолидигин а-фосфат входящего нуклеозидтрифосфата, а также фосфодиэфирная связь РНК при сдвиге назад (процессе бэктрэкинга), находятся в неблагоприятном положении относительно каталитического иона магния для эффективного осуществления реакции. Так как ион марганца обладает более сильными координационными связями по сравнению с ионами магния, его связывание в активном центре может физически притягивать необходимые химические группы к активному центру, тем самым переводя их в реакционноспособное состояние. Таким образом, на основе полученных нами данных мы предполагаем, что изменение

ю

конформации Р-спирали переводит связанный нуклеозидтрифосфат или нуклесггид РНК, находящийся в активном центре при сдвиге назад (бэктрэкинге) в активное состояние, когда может осуществляться синтез или расщепление фосфодиэфирной связи. В недавно опубликованной кристаллической структуре элонгационного комплекса эукариотической РНКП с входящим нуклеозидгрифосфатом (Kettenbergeг е1 а1., 2004) видно, что нуклеозидтрифосфат находится в конформации, при которой

*

невозможно осуществление каталитического синтеза фосфодиэфирной связи. В этой конформации нуклеозидтрифосфат спарен с основанием дезоксирибонуклеотида ' матричной цепи и располагается вдоль Р-спирали, которая в этой структуре находится

в выпрямленной конформации. Авторы статьи предполагают, что это состояние нукпеозидгрифосфата является так называемым прединсерционном (предвставочным), и необходима подвижка этого нуклеозидтрифосфата в инсерционное (вставочное) состояние для осуществления акта катализа, т.е образования фосфодиэфирной связи РНК.

Принимая в рассмотрение полученные нами данные, мы предполагаем, что именно изменение конформации Р-спирали из прямой в согнутую и переводит нуклеозидтрифосфат из прединсерционного в инсерционное положение. Таким образом, по этой гипотезе стрептолидигин, связываясь с Р-спиралью и блокируя ее

движение, препятствует передвижению нуклеозидтрифосфата из

прединсерционного в инсерционное состояние (рис.8). С помощью этой модели можно объяснить, почему стрептолидигин не полностью ингибирует РНКП, а лишь замедляет ее активность Так как изменение конформации Р-спирапи, по-видимому, приводит к понижению энергетического барьера

Рис.8. Модель функционирования активного центра РНКП и механизм действия стрепголидигина. В активном центре показам ион К^3* НМ-ДНК и М-ДНК- нематричная и матричная цепи ДНК соответственно

перехода нуклеозидгрифосфата из прединсерционного в инсерционное состояние, блокирование этого процесса приводит лишь к уменьшению вероятности преодоления энергетического барьера, и как следствие, к замедлению скорости

Полученные в настоящей работе данные позволяют построить модель функционирования активного центра РНКП (рис.8). При выпрямленной конформации И-спирали входящий нуклеозидтрифосфат, комплементарный следующему за 3' концом РНК основанию матричной цепи ДНК, образует водородные «Уотсон-Криковские» связи с этим основанием в регистре (п) и связывается в прединсерционном сайте РНКП. При этом З'-конец РНК находится в регистре (п-1) (постгранслокационное состояние). Наличие прединсерционного сайта увеличивает точность синтеза, так как увеличивает время для отбора правильного нуклеозидгрифосфата. Изгибание Р-спирали «толкает» нуклеозидтрифосфат из прединсерционного сайта в инсерционный В инсерционном сайте трифосфатная группировка нуклеозидгрифосфата распололагается таким образом, что возможно осуществление нуклеофильной атаки З'-ОН группой нуклеотида транскрипта альфа-фосфатной группы входящего нуклеозидгрифосфата Происходит образование фосфодиэфирной связи, после чего спаренный с основанием ДНК З'-конец РНК находится в регистре (п) (претранслокационное состояние) Затем происходит акт транслокации, который возвращает З'-конец РНК в постгранслокационное состояние.

При сдвиге назад (бэктрэкинге), при согнутом состоянии Е-спирали нуклеотид РНК занимает инсерционный сайт, в котором фосфодиэфирная связь расположена должным образом для эффективного осуществления внутреннего расщепления. При прямой же конформации Р-спирали, как в комплексе РНКП со стрептолидигином, нуклеотид РНК занимает прединсерционное положение или близкое к нему. В этом состоянии фосфодиэфирная связь удалена от иона магния активного центра, что приводит к невозможности осуществления внутреннего расщепления.

Таким образом, изучение механизма ингибирования РНКП стрептолигидином доказало существование прединсерционного сайта связывания нуклеотида, и привело нас к построению модели функционирования активного центра РНКП.

2. Изучение роли триады остатков аспарагииовых кислот в двуметаллическом каталитическом механизме РНКП.

Двуметаплнческий механизм катализа постулирован для всех клеточных РНК-полимераз (Sosunov et al, 2003). При этом один из ионов Mg2* прочно связан в активном центре фермента, а другой приносится в активный центр вместе с субстратом. Предполагается, что консервативная триада остатков аспарагиновой кислоты участвует в каталитическом механизме многосубъединичной клеточной РНКП (Sosunov et al, 2003) Аспартаты содержатся в инвариантном мотиве DFDGD в большей ((?') субъединице РНКП. Исходно определяющая роль триады в координации каталитического Mg2+ предполагалась на основании данных, полученных при исследовании мутанта с тройной заменой аспартатов на аланин (Zaychikov et al., 1996) РНКП с этими мутациями образует стабильные открытые промоторные комплексы, которые, однако, каталитически неактивны (Zaychikov et al., 1996) В кристаллической структуре мотив DFDGD является частью гибкой петли, которая прикреплена к жесткому домену р-складки (Рис. 9) Петля проникает в активный центр РНКП и в соответствии с биохимическими данными хелирует двухвалентный ион металла (Ме2+) (Zhang et al, 1999; Gnatt et al, 2001) Как ожидалось, РНКП, имеющая тройную замену на аланин была неспособна к удержанию Ме2+ в активном центре (Zaychikov et al, 1996), что объясняет потерю каталитической активности

В целях представления структурной модели полимеризации РНК многосубъединичными РНКП (Sosunov at al., 2003) использовалось молекулярное моделирование. В этой модели три остатка аспарагиновой кислоты из мотива DFDGD принимают участие в координации двух ионов Mg2* (Рис. 9 Б). Два карбоксилата (Asp440 и Asp462 .нумерация по E.coli) связывают оба иона, в то время как третий (Asp464) взаимодействует только с одним ионом Mg2+ I. Этот ион дополнительно координируется З'-гидроксилом З'-концевого нуклеотида РНК и кислородом а-фосфата нуклеозидтрифосфата (НТР), который обеспечивает атаку по линии 3'-гидроксильной группы на а-фосфате. Второй ион магния, Mg2+ II, контактирует с тремя кислородами трифосфатной группы субстрата, таким образом стабилизируя пентакоординированный интермедиат и нейтрализуя развивающийся отрицательный заряд на оставшейся пирофосфатной группе Предсказанные положения двух ионов Mg2* в дрожжевой РНКП II были недавно подтверждены структурным анализом высокого разрешения (Westover et al., 2004).

В тройном элонгационном комплексе (ТЭК) в дополнение к прямой реакции полимеризации многосубъединичная РНКП осуществляет обратную реакцию пирофосфоролиза, а именно 3'-5' гидролиз зарождающейся РНК и внутреннее расщепление РНК, которое стимулируется специальными факторами (названными Gre факторами в эубактериях, (Borukhov et al., 2001, Opalka et al., 2003; Kettenberger et al, 2004; Kettenberger et al., 2003). В нашей модели все эти реакции осуществляются в одном активном центре с участием двух ионов Mg2* (Sosunov et al., 2003). В этом исследовании мы задались целью проверить основные постулаты модели путем

изучения эффектов индивидуальных замен остатков Asp в мотиве DFDGD РНКП E.coh.

Рис.9. Активный центр многоеубмдиничной РНКП А. Архитектура активного центра РНКП. Изображен кор-фермент Taq РНКП вместе с увеличенным доменом активного центра (в воде ленты) Показаны главные структурные черты РНКП.

Б. Два иона Mg2* координированы тремя остатками Asp

(пронумерованы для Р' субъединицы РНКП E.coll). Стрелками показано

направление переноса электронной плотности при реакции полимеризации [1]. В. Линия схематически представляет Р' субъедитп^ длиной 1407 аминокислот в E.coh. Бухвенные

прямоугольники показывают эволюционно консервативнее регионы последовательности. Фрагмент эволюционно консервативного сегмента D первичной последовательности (в однобуквенном коде) расширяется внизу и выравнен по гомологичным последовательностям из T.aquaticus (Taq) и дрожжевой РНКП I, II и III (Ypl, Yp2 и Yp3 соответственно) Три точечные замены, анализируемые в этой работе, D460N, D462N и D464N, показаны над последовательностью ЕсоИ Последовательность тройной алакнновой замены, изученной ранее (Zaychikov et al, 1996), показана под выравниванием.

Для исследования роли индивидуальных остатков Asp в мотиве DFDGD были сделаны точечные мутации, заменяющие остатки аспарагиновой кислоты Asp460, Asp442 и Asp444 на остатки аспарагина (Asn) (Рис.9 В). Выбор замен был продиктован

нашим желанием уменьшить способность связывания металла, в то же время сохраняя общую геометрию остатков. Мутантная РНКП была реконструирована из индивидуальных суперэкспрессированных субъединиц и очищена по опубликованной процедуре (Borukhov and Goldfarb, 1993). Мутантные ферменты были совершенно неактивны в реакции абортивной инициации, равно как и в реакции синтеза полноразмерной РНК на промоторе Т7А1 в условиях, когда контрольный фермент дикого типа (ДТ) был высокоактивным (Рис.10). Эксперименты по замедлению в геле и пробированию с помощью КМпС>4 выявили, что мутантные ферменты в состоянии распознавать, связываться и открывать промотор Т7А1 так же эффективно, как это делает ДТ РНКП. Мы сделали вывод, что каждый их трех Asp остатков в мотиве

DFDGD необходим для промотор-

Рис. 1 о. In vitro транскрипции с участием дикого типа (ДТ) РНКП и мутантов РНКП. На представленной радиоавтографе геля • результаты транскрипции in vitro (абортивного синтеза) ДТ и мутантных РНКП с фрагмента ДНК, содержащего промотор Т7А1. В случае фермента ДГ наблюдается образование трннуклеотма CpApU при добавлении к открытому комплексу РНКП радиоактивно-меченого UTP и динуклеотнда Ср А (полосы 2-4); при добавлении смеси четырех ШТ, содержащих радиоактивно меченый UTP наблюдаете» образование полноразмерного продукта (RO (runoff), полоса 5) В случае мутантных ферментов активность отсутствует (полосы 6-24)

зависимой транскрипции холо-ферментом РНКП Е coli. Для проверки влияния индивидуальных замен Asp на связывание двухвалентных металлов в активном центре мы использовали метод Ре3*-опосредованного расщепления белка. Этот подход использует способность ионов Fe2* связываться в активном центре вместо Mg2* с расщеплением близлежащих сайтов в белке генерируемыми радикалами гидроксил аниона (Zaychikov et al., 1996). Инкубация ДТ РНКП в присутствии 20 мкМ Fe2* вызывала появление полипептидов -115 и ~45 кДа (Рис.11, полоса 2), которые являются продуктами расщепления ß'-субьединицы в мотиве DFDGD (Zaychikov et al., 1996). Как и ожидалось, расщепление происходило только в присутствии DTT (Рис. 11,полоса 3), то есть зависело от гидроксил анион радикалов. Когда мутантные

ферменты находились в условиях, оптимальных для Ре2* - зависимого расщепления, даже в

Рис. 11. Fe**-onocp<naMHHoe аффинное расщепление ДТ я мутянтных РНКП. РНКП была подвержена Fe2'-олосредованному аффинному расщеплению в присутствии различных концентраций FeJ* дли указанных промежутков времени. Реакционные продукты были разделены в SDS ПААГ и выявлены окраской Кумасси Синим.

присутствии 70 мкМ Fe2+ расщепления не наблюдалось (Рис 11, полосы б, 9 и 12) Из этого мы сделали вывод, что замена любого из трех остатков Asp в мотиве DFDGD влияет на связывание Ме2+ со свободной РНКП. Таким образом, РНКП, несущая одиночную замену аспартата в мотиве DFDGD, ведет себя схожим образом с ранее описанной РНКП, несущей тройную замену Asp-Ala в мотиве (Zaychikov et al., 1996).

Так как в мутантных РНКП полностью отсутствовали активности в стандартных промотор-зависимых условиях, мы использовали искусственные транскрипционные комплексы, собранные на синтетических нуклеиново-кислотных остовах (скаффолдах), которые воспроизводят архитектуру нуклеиновых кислот в элонгационном комплексе (рис.2) (Sidorenkov et al., 1998; Korzheva et al., 1998) Данная система позволяет прямо исследовать реакции, характерные для ТЭК, минуя сложные реакции, вовлеченные в инициацию транскрипции ДНК - компонент скаффолда, используемый в наших экспериментах, базировался на последовательности промотора Т7А1. Мы специально выбрали этот скаффолд, так как соответствующий природный ТЭК особенно склонен к реакциям внутреннего расщепления и пирофосфоролиза.

РНКП, образующая комплекс с нуклеиново-кислотным скаффолдом, обладает каталитической активностью, типичной для природного ТЭК (Рис. 12 А). Как можно видеть, начальный РНК - продукт 13А (полоса 1) был удлинен до 14С в присутствии СТР (полоса 3) и до более длинных продуктов в присутствии всех четырех НТР (полоса 4).

РНКП | ДТ D460N D462N D464N

)р*мя, »•» 80' 80* Ю

Fe**. им 20 ИЕЗЕЗИИИЕЭЕЗЕа

DTT, ЮшМ I -1 * - + - ♦ -I +

м*- 115 kD — а -»■> 43*0— а — 1 1 ill

к йкЯк w ; Мя: V: н 11К к в

Добавление пирофосфата вызывало процессивную деградацию 13А РНК (полоса 5) Инкубация в отсутствие НТР в присутствии Mg2* приводила к укорочению 13А РНК до 11А вследствие внутренней активности эндонуклеотического расщепления каталитического центра РНКП (полоса 2), причем эта активность была стимулирована белковыми факторами расщепления транскрипта, GreA и GreB (полосы б и 7)

Надо отметить, что фактор-зависимое расщепление в скаффолдовых комплексах требовало стехиометрических количеств факторов расщепления. Это не согласуется с данными, полученными на природных элонгационных комплексах, где требовались большие количества Gre (Borukhov et al, 1993). Причина этого различия на данный момент неизвестна, но она может быть вызвана более сильным связыванием факторов Gre с искусственно собранными ТЭК.

Все три мутанта с Asp/Asn заменами были проверены на их способность удлинять 13А РНК на скаффолде и результаты этой проверки представлены на Рис 12 Б. Как можно видеть, все три мутанта были способны к полимеризации РНК в этой

Эоемя. мин 1 &

CTR + »

» ♦ -

т - + -

Оя - А|в

1 2 Э 4 В в 7

К т

В

РНКП ДТ AM

Время, мин О ! 0 1 |l20 < рас

4 НТР 1 мМ - + - + •

13А -¥■ 14 4 4 5 в 7 в

1 :

НИ1 ДТ I (Mta Ыю1 04UN

твс 21 H W 1»

Время. MW 0 6 15 0 5 |l5 51 15 0 «he 51 15 0 5 f15 5 | 15

4НГРММ - ai 1 - 11 i • »i 1 - ai 1

13А-» S t 7 it <0 11 Iiiii4l5l4l7 ЛМЯЯЯ

Рис.12. Активность ДТ и мутаитных РНКП и* искусственно собранных нукленново-кяслфтных скяффолдах. А 13 А скаффоля с 5'-тсрминальнии ИР-меченым компонентом РНК в комбинации с РНКП дикого типа Продукты реакции идентифицированы по их размеру скаффолд-комплексы были собраны, используя ДТ РНКП или мутантные РНКП, несущие одиночные замены Азр-Аш н (числа) и природе 3'-концевого иуклеотида (буквы) Б 13А инкубировались в присутствии указанных концентраций НТР в течение разных промежутков времени В Как и в Б, за исключением того, что для сборки скаффолд-комплскса был использован тройной Asp-Ala мутант

системе. Мутант 0462Ы был самым активным (полосы 11-16). Активность полимеризации РНК мутантными ферментами увеличивалась по мере возрастания

концентрации НТР и при повышении температуры (сравним, например, полосы 13 и 15 и полосы 15 и 16 соответственно). Однако даже при 37°С и в присутствии 1 мМ НТР ни один из мутантов не был в состоянии полностью удлинить 13А РНК до полноразмерного продукта. Напротив, РНКП дикого типа (ДГ) быстро удлиняла 13А РНК до полноразмерного продукта в присутствии 100 мкМ НТР при 21°С (сравним полосы 1 и 2). Активность мутантных РНКП не могла быть объяснена наличием загрязнения от ДГ РНКП, так как загрязняющий фермент должен был полностью удлинять 13А транскрипт. Поэтому мы сделали вывод, что мутантный фермент может удлинять РНК в нуклеиново-кислотном скаффолде. По сравнению с ДТ РНКП, элонгация мутантным ферментом происходит очень медленно.

Используя нуклеиново-кислотные скаффолды, была также проверена активность ранее описанного тройного Asp-Ala мутанта (Рис. 12 В). В отличие от мутанта с одиночной заменой, тройной мутант был полностью неактивен даже при инкубации в течение нескольких часов (Рис. 37 В, полоса 8).

Мы не можем сделать каких-либо выводов о природе сильного дефекта, наблюдаемого в мутантах с одиночными заменами в проведении прямой реакции синтеза РНК, на основании экспериментов, представленных на Рис. 12 В, так как фермент дикого типа осуществляет реакцию крайне быстро (при 37°С в присутствии 1 мМ НТР, то есть в условиях, при которых мутантные ферменты не полностью удлиняли 13А РНК даже после 15 мин инкубации, фермент дикого типа завершал реакцию за несколько секунд). Более того, элонгация 13А РНК мутангными ферментами приводит к появлению множественных продуктов элонгации, делая трудным количественный анализ. Для преодоления этих проблем мы изучали элонгацию 13А РНК в присутствии СТР, который позволяет продвинуться лишь на один шаг. Медленная реакция добавления нуклеотида мутантным ферментом изучалась вручную; быстрая реакция ДТ РНКП изучалась в реальном времени, методом быстроостановленной реакции с использованием быстрого смесителя.

Для определения констант скоростей и значений кажущихся К„ (для СТР как субстрата), переход 13А в 14С был исследован как функция времени и концентрации СТР (последняя варьировала в пределах от 1мкМ до 2мМ). Кажущиеся константы скорости для ДТ РНКП и трех мутантов при насыщающих (2мМ) концентрациях СТР представлены в Табл. 2. Как можно видеть, замены в мотиве DFDGD приводили к сильному уменьшению скорости присоединения нуклеотидов. Построение зависимости скоростей реакции от концентрации СТР позволило получить значения кажущейся Км.

Замена в мотиве DFDGD незначительно меняет значения кажущейся К„, которые колебались в пределах от 25 мкМ (D460N) до 200 мкМ (D464N), при этом в ДТ РНКП наблюдалось промежуточное значение (100 мкМ) Ясно, что эти незначительные различия не могут объяснить сильного различия в скоростях реакции между мутантными ферментами и ферментом дикого типа

Возникло предположение, что сильные каталитические дефекты, проявляемые в мутантных ферментах вызваны их неспособностью связывать каталитический Mg2* Для проверки этой идеи мы определили влияние разных концентраций Mg2* на реакцию одношагового удлинения 13А РНК Для того, чтобы избежать хелирования Mg2+ нуклеозидгрифосфатом, эксперимент был выполнен при низкой концентрации СТР Результаты показывают, что выше 5 мМ Mg2* не наблюдалось значительной стимуляции и что в относительных терминах, мутантные и ферменты дикого типа сходно отвечали на изменение концентрации Mg2* (Рис 13).

Результат указывает на то, что в нуклеиново-кислотном скаффолде замена Asp -Asn приводит к небольшому (<5 раз) эффекту на связывание Mg2*, кроме того стандартный реакционный буфер содержал ЮмМ Mg2*, поэтому сильный каталитический дефект, наблюдаемый в мутантных ферментах не может быть вызван ослаблением связывания Mg2*.

Известно, что Мп2+ может замещать Mg2* при транскрипции (Rhodes et al., 1974). Анализ ДНК полимераз с мутациями в активном центре показывает, что активность некоторых мутантов может быть восстановлена заменой иона Mg2* в реакционном буфере на Mn2+ (Copeland and Wang, 1993; Saturno et al., 1998; Pritchard et al., 1998), по-видимому, вследствие того, что большего размера ион Мп2* лучше удерживается в активном центре или того, что ориентацию иона Мл2* сложнее изменить с помощью мутации в активном центре. Поэтому мы проверили влияние Мп2+ на превращение

комплекса 13А в 14С.

Рис.13. Скорость элонгации мутантных и ДТ РНКП при различных концентрациях Mj1*, Реакция одношаговой элонгации била выполнена а присутствии 1 мкМ СТР и указанных концентраций Mg". Для каждого фермента скорость элонгации 13А РНК а присутствии 10 иМ Mg2* была взята равной 100%

Замена Mg2+ на Мп2+ имеет слабый эффект на ДТ РНКП, но сильно стимулирует мутантные ферменты (Табл.2). Однако, даже в присутствии насыщающих концентраций Мп2* каталитическая активность мутантных РНКП была существенно ниже по сравнению с активностью ДТ РНКП. Поэтому мы делаем вывод, что насыщающие концентрации ионов Mg2* и Мп2+ не в состоянии восстановить ферментативную активность мутанта.

Так как мутантные ферменты образуют активные комплексы с нуклеиново-кислотным скаффолдом, мы исследовали влияние замены Asp на скорость пирофосфоролиза (оцененного по скорости накопления множественных продуктов пирофосфоролиза, см. Рис. 12 А, полоса S), внутреннее расщепление РНК (оцененное по скорости накопления полосы 11 А, см Рис. 12 А, полоса 2) и фактор Gre-зависимое расщепление (оцененное из скорости накопления полосы 11 А, Рис. 12 А, полосы 6 и 7). Так как реакции расщепления, выполняемые ферментом дикого типа, относительно медленные, характеристические константы скоростей могут быть определены из экспериментов по временной зависимости вручную. Результаты, которые суммированы в Табл. 2, показывают, что деградация РНК сильно уменьшается при всех трех заменах. Однако каждая замена приводит к различной степени остаточной деградационной активности. Например, замена Asp444 уменьшает внутреннее расщепление ниже порога чувствительности метода, в то время как замены в Asp460 и Asp4*2 дают измеряемые уровни расщепления. Любопытно, что хотя Мп2+ стимулировал прямую реакцию мутантных ферментов больше чем для ДТ РНКП, обратное наблюдалось для внутренней реакции расщепления, что в относительных терминах означает, что дефект мутантного фермента увеличивался в присутствии Мп2+ (Табл.2). Что касается Gre фактор-зависимого расщепления зарождающейся РНК, только мутант Asp464, в котором не представлялось возможным детектировать активность внутреннего расщепления, стимулировался GreA (Табл 2). Однако даже в присутствии фактора скорость расщепления транскрипта мутантным ферментом все же остается более медленной по сравнению с ДТ РНКП Из этих данных мы делаем вывод, что замены в мотиве DFDGD влияют не только на прямую реакцию синтеза РНК, но и на обратную реакцию пирофосфоролиза и внутреннюю реакцию эндонуклеотического расщепления. Этот результат находится в согласии с моделью, которая постулирует, что все виды известных каталитических активностей РНКП определяются ионами Mg2*, связанными в одном и том же каталитическом центре (Sosunov et al., 2003).

Табл.2. Константы скоростей реакций, катализируемых ДТ и мутантнымн РНКП.

РНКП^ РНКПоит< рнкп»мн РНКП™""

1. Элонгация

(2 тоМ СТР, 10 шМ МВ2*) 3500 0.06 1.4 0.7

ДТ/мутапт 58,000 2,500 5.000

1.25 75 20 50

2. Пирофоефоролиз

(1 шМ РР1, 10 шМ М82*) 0.8 7хЮ~* вхШ-1 W*

ДТ'Мутант 1100 1000 8000

Э. Внутреннее расщепление (ЮшММЕ")

0 14 7x10"* 2x10-1 10"1"

ДТ мутант Мп'ТМв2* 200 700 1400

12 6 6 <3

4. СкА расщепление 0 93 2x10'' 2x10"* 3 7x10-'

ДТ'мутант 460 4,600 250

(ЗгеА/внутр расщепление 66 29 1 37

5. СгеВ расщепление 06 10'» 0.2х10"3 0.2x10"'

ДТ мутант 600 3,000 3.000

СгеВ/внутр. расщепление 4 3 1.4 1 2

Данные приведены в кыи, (мин"1) Скорости элонгации РНК были измерены при 21 °С, а скорости расщепления РНК при 37 "С Измерено при 1дМ СТР Предел измерения в этом методе определяется фактом, что инкубация дольше 30 мин приводит к появлению продуктов неэнзиматической дегаршшшн РНК.

Принципиальное наблюдение второй части настоящей работы состоит в том, что каждая из трех замен Asp/Asn в металл-связывающем центре РНКП вызывает сильное уменьшение всех видов каталитической активности РНКП (суммировано в Табл.2). Для каждой мутантной РНКП падение каталитической активности было сравнимым с наблюдаемым в односубъединичных полимеразах (таких как ДНК полимераза (ДНКП) I, ДНКП р, HIV обратная транскриптаза и др), несущих замены в каталитических аминокислотных остатках. Из этого мы делаем вывод, что в многосубьединичных РНКП, каждый член Asp триады напрямую участвует в каталитическом акте. Каждая из замен вызывала значительное ослабление связывания MeJ+ в свободной РНКП, как это свидетельствовало из неспособности мутантов поддерживать Fe2+ - опосредованное белковое расщепление и из неспособности повышенных концентраций FeJ+ компенсировать дефект. Результаты находятся в согласии с моделью, в которой в свободном ферменте каждый из трех аспартатов напрямую координируется с Mg2* I (Рис. 9 Б). На основании интенсивности окраски Кумасси, использованной для выявления продуктов расщепления, вызванных Fe2+, мы установили, что в свободной РНКП индивидуальные замены уменьшают сродство к Fe2+ по крайней мере в 20 раз. Это находится в хорошем согласии с ~30-кратным эффектом, ожидаемым от потери одной координационной связи, как следует из сравнений констант диссоциации Mg2* и

ионов цитрата (Си3') и оксалата (Ох2' ) (Ю-4 М и ЗхЮ'3 М соответственно (Лурье, 1989)) Интересно, что эти значения близки к ранее определенным константам диссоциации для свободной ДГ РНКП (Мш1аеу е1 а1., 1997). В тройном элонгационном комплексе кажущаяся потеря сродства к М^, вызванная Азр-Аэп заменой, была менее чем 10-кратной. Это может указывать на то, что взаимодействия, осуществляемые в свободной РНКП и в ТЭК, не эквивалентны Очевидно, что фосфаты входящих НТР и/или 3'- гидроксильные остатки РНК вносят свой вклад в связывание М^* в ТЭК и компенсируют дефект, наблюдаемый в свободной РНКП (Рис. 9 Б) В дополнение к этому, общее уменьшение свободной энергии при образовании элонгационного комплекса может также иметь стабилизирующий эффект.

Ясно, что наблюдаемые уменьшения сродства к ионам Ме2+ у мутантных ферментов количественно не могут отвечать за наблюдаемое сильное падение каталитической активности (Табл.2). Действительно, увеличение концентрации не восстанавливает каталитические функции мутантов. Другими словами, даже в условиях насыщения мутантного фермента М^* его активный центр функционирует неправильно Каждая из замен вызывает лишь небольшие изменения в кажущийся Км для входящего СТР, которые не могут быть ответственными за наблюдаемые падения каталитической активности. Эти наблюдения показывают, что изученные замены должны влиять на химию образования фосфодиэфирной связи, наиболее вероятно через изменение ориентации каталитических ионов в активном центре.

выводы

1. Впервые детально изучен механизм ингибирования РНК-полимсразы стрептолидигином. Доказано, что стрептолидигин ингибирует РНК-полимеразу по необычному механизму, при котором антибиотик, связываясь с элонгационным комплексом, приводит не к полной инактивации, а к сильному замедлению активности РНК-полимеразы.

2. Показано, что стрептолидигин ингибирует стадию рабочего цикла РНК-полимеразы, предшествующую образованию фосфодиэфирной связи в активном центре, при этом не влияя на связывание субстрата. Эта стадия видимо представляет собой опосредованный изгибанием Р-спирали перенос находящегося в активном центре нукпеотида в оптимальное положение для катализа.

3 . На основании структурных и биохимических данных по ингибированию РНК-полимеразы стрептолидигином была предложена новая модель функционирования активного центра РНК-полимеразы, в которой нуклеотид образует связь с комплементарным основанием ДНК в так называемом "прединсерционном" сайге, а затем переносится в "инсерционный" сайт, где происходит синтез фосфодиэфирной связи.

4. Подтвержден универсальный механизм синтеза и расщепления фосфодиэфирной связи в активном центре клеточной РНК-полимеразы с участием двух ионов двухвалентных металлов. Показано, что каждый из трех консервативных остатков аспарагиновой кислоты в активном центре фермента участвует в акте катализа.

5 . Показано, что нуклеиновые кислоты вносят ощутимый вклад в связывание иона металла в активном центре элонгационного комплекса РНК-полимеразы, компенсируя отсутствие любого из трех участвующих в образовании координационных связей остатков аспарагиновой кислоты.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. V.Sosunov, S.Zorov, E.Sosunova, A.Nikolaev, I.Zakeeva, I.Bass, A.GoIdfarb, V.Nikiforov, K.Severinov, A.Mustaev. The Role of the Aspartate Triad in Catalytic Activities of Multisubunit RNA Polymerase. 12lh Biannual Meeting on Post-Initiation Activities of RNA Polymerases. Mountain Lake, VA. November, 4-7, 2004. Proceedings. p.4.

2. S.D.Zorov, N.S. Zenkin, K.V. Severinov, V.G.Nikoforov. The study of streptolydigin effects on the bacterial RNA-polymerase activities Russian Bioenergetics. From Molecules to cells. Moscow. February, 21-23,2005, p.69.

3. С.Д.Зоров, И.Р.Закеева, Е.В.Сосунова, В.В.Сосунов. Изучение даумегалличенского механизма катализа многосубъединичной РНК-полимеразы // Депон. в ВИНИТИ 19.04.2005,6, №534-В2005.

4. С.Д.Зоров, Н.С.Зенкин. Изучение механимза ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином.// Депон. в ВИНИТИ 19.04.2005, 6, №535-В2005.

»-9627

РНБ Русский фонд

2006-4 25587

Подписано в печать 12 мая 2005 г. Заказ 460. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зоров, Савва Дмитриевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.стр.

ВВЕДЕНИЕ.стр.

Актуальность проблемы.стр.

Цель работы и задачи исследования.стр.

Научная новизна.стр.

Практическое значение работы.стр.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . стр.

1.1. Общие сведения о РНК-полимеразе и

Транскрипционном цикле.стр.

1.2. Структурные особенности РНК-полимеразы.стр.

1.3. Структурно-функциональная модель активного центра РНК-полимеразы.стр.

1.3.1. Двуметаллический механизм катализа.стр.

1.3.2. Механизм катализа многосубъединичной РНКП.стр.

1.3.3. Характеристика реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления.стр.

1.3.4. Влияние мутационных замен в (З-субъединице РНКП

Е. coli на 3'-5'-экзонуклеазную активность.стр.

1.3.5. Молекулярное моделирование активного центра РНКП Е. Coli.стр.

1.4. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики.стр.

1.4.1. Рифампицин.стр.

1.4.2. Тагетитоксин.стр.

1.4.3. Альфа-аманитин.стр.

1.4.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина.стр.

1.4.5. Стрептолидигин.стр.

1.4.6. Липиармицин.стр.

1.4.7. Микроцин J25.стр.

1.4.8. Ингибиторы серии CBR703.стр.

1.4.9. Дауномицин и марселломицин.стр.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.стр.

2.2. Полимеразы.стр.

2.3. Приготовление РНК-полимеразы из клеток.стр.

2.3.1. Выделение РНК-полимеразы E.coli.стр.

2.3.2. Выделение РНК-полимеразы Thermus aquaticus.стр.

2.4. Бактериальные среды.стр.

2.5. Электрофорез.стр.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).стр.

2.7. Метод Ре2+-индуцированного расщепления белка.стр.

2.8. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов.стр.

2.9. Транскрипция с Т7А1 промотора, абортивный синтез.стр.

2.10. Транскрипция на искуственных транскрипционных комплексах (нуклеиновокислотных скаффолдах).стр.

2.11. Эндонуклеотическое и экзонуклеотическое расщепление, пирофосфоролиз.стр.

2.12. Измерение быстрых кинетик реакции элонгации.стр.

2.13. Определение скоростей реакций (Kobs ,Vmax) и константы Михаэлиса (Km).стр.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.стр.

3.1. Исследование механизма ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином.стр.

3.1.1. Стрептолидигин ингибирует присоединение нуклеотида, разделяя злонгационноые комплексы на медленную и быструю фракции.стр.

3.1.2. Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина.стр.

3.1.3. Стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление РНК, при этом также разделяя комплексы на медленную и быструю фракции.стр.

3.1.4. Присутствие стрептолидигина не изменяет значение

Км для входящего нуклеозидтрифосфата.стр.

3.1.5. Стрептолидигин замедляет некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи.стр.

3.1.6. Кристаллическая структура РНКП со связанным с ней стрептолидигином. Модель ингибирования РНКП стрептолидигином и функционирования активного центра РНКП.стр.

3.2. Изучение роли триады остатков аспарагиновой кислоты в двуметаллическом механизме катализа в активном центре РНК-полимеразы.стр.

3.2.1. Замены остатков Asp в активном центре РНКП делают невозможной промотор-зависимую транскрипцию.стр.

3.2.2. Замены каталитических остатков Asp влияют на связывание Ме2+ со свободной РНКП.стр.

3.2.3. Мутантные РНКП частично активны в элонгационном комплексе.стр.

3.2.4. Замены Asp лишь умеренно уменьшают кажущееся сродство каталитического центра к Ме2+ в транскрипционных комплексах.стр.

3.2.5. Расщепление транскрипта мутантными РНКП.стр.

ВЫВОДЫ.стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы"

Актуальность проблемы.

ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП) осуществляют процесс транскрипции, т.е. создание РНК-копии генов для последующей трансляции. Выделяют три стадии транскрипционного цикла: инициацию, элонгацию и терминацию, при этом непосредственно реакция полимеризации происходит на стадии элонгации. Ключевым этапом процесса элонгации является образование фосфодиэфирной связи между входящим субстратом (нуклеозидтрифосфатом) и З'-концевым нуклеотидом цепи РНК в активном центре РНКП. Несмотря на множество биохимических и структурных данных, механизм функционирования активного центра РНКП в целом остается не полностью изученным.

Недавно была предложена универсальная модель, по которой реакция образования фосфодиэфирной связи в активном центре РНКП, также как и другие виды активностей, такие как расщепление РНК, пирофосфоролиз, происходит при участии двух ионов магния, находящихся в активном центре РНКП (Sosunov et al, 2003). Однако необходима дальнейшая исследовательская работа по проверке и совершенствованию этой модели.

Кроме того, не изучены другие процессы в активном центре, предшествующие образованию фосфодиэфирной связи, и в этом направлении остается огромное поле для деятельности.

Понимание всех этих этапов в работе РНКП необходимо для выяснения механизма функционирования активного центра РНКП в целом.

Помимо чисто научного, понимание функционирования активного центра РНКП несет в себе и практический интерес, особенно в случае бактериальной РНКП, поскольку его можно применить в разработке новых антибиотиков.

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение структурно-функциональной организации активного центра бактериальной РНКП. В задачи данного исследования входило:

1. Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином, действующим на уровне активного центра.

2. На основе структурных и биохимических данных по ингибированию РНКП стрептолидигином предложить общую схему функционирования активного центра РНКП.

3. Произвести проверку универсальной модели двуметаллического механизма катализа в активном центре РНКП.

Научная новизна.

В работе исследован механизм действия антибиотика стрептолидигина на бактериальную РНК-полимеразу. Несмотря на то, что этот антибиотик известен уже очень давно (Siddhikol et al.,1969), до настоящего времени исследования механизма его действия детально не проводились. При этом известно, что ингибирование РНКП стрептолидигином непосредственно связано с активным центром РНКП (Severinov et al., 1995), поэтому исследование механизма ингибирования РНКП стрептолидигином представляло существенный интерес в понимании функционирования активного центра РНКП.

В настоящей работе впервые, с помощью структурных и биохимических данных, был детально изучен механизм действия стрептолидигина. Было показано, что стрептолидигин ингибирует РНКП по необычному механизму, когда РНКП, связанная со стрептолидигином остается активной, но скорость реакций, осуществляемых РНКП, сильно снижена. Это первый пример описанного ингибитора РНКП, действующего таким образом, а не полностью инактивирующим РНКП при связывании с ней.

Кроме того, с помощью стрептолидигина впервые было получено свидетельство существования некой стадии процесса элонгации, предшествующей синтезу фосфодиэфирной связи.

На основе результатов данной работы была предложена новая модель функционирования активного центра РНКП.

Также, в данной работе, при помощи мутагенеза была проверена и подтверждена недавно предложенная модель двуметаллического катализа образования фосфодиэфирной связи в активном центре. В этой модели два иона магния координированы в активном центре тремя консервативными остатками аспарагиновой кислоты. В настоящей работе показано, что каждый из трех остатков аспарагиновой кислоты участвует в акте катализа, а также впервые экспериментально показано, что нуклеиновые кислоты принимают серьезное участие в связывании Мд2+ в активном центре. Практическое значение работы.

Понимание каталитического механизма бактериальной РНКП расширяет горизонты для различных стратегий антибактериальной защиты. В частности, изучение стрептолидигина представляет большой интерес, так как этот антибиотик или его производные в перспективе могут найти применение в клинической практике вообще и в борьбе с устойчивыми штаммами бактерий в частности.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зоров, Савва Дмитриевич

выводы

1. Впервые детально изучен механизм ингибирования РНК-полимеразы стрептолидигином. Доказано, что стрептолидигин ингибирует РНК-полимеразу по необычному механизму, при котором антибиотик, связываясь с элонгационным комплексом, приводит не к полной инактивации, а к сильному замедлению активности РНК-полимеразы.

2. Показано, что стрептолидигин ингибирует стадию рабочего цикла РНК-полимеразы, предшествующую образованию фосфодиэфирной связи в активном центре, при этом не влияя на связывание субстрата. Эта стадия видимо представляет собой опосредованный изгибанием F-спирали перенос находящегося в активном центре нуклеотида в оптимальное положение для катализа.

3. На основании структурных и биохимических данных по ингибированию РНК-полимеразы стрептолидигином была предложена новая модель функционирования активного центра РНК-полимеразы, в которой нукпеотид образует связь с комплементарным основанием ДНК в так называемом "прединсерционном" сайте, а затем переносится в "инсерционный" сайт, где происходит синтез фосфодиэфирной связи.

4. Подтвержден универсальный механизм синтеза и расщепления фосфодиэфирной связи в активном центре клеточной РНК-полимеразы с участием двух ионов двухвалентных металлов. Показано, что каждый из трех консервативных остатков аспарагиновой кислоты в активном центре фермента участвует в акте катализа.

5. Показано, что нуклеиновые кислоты вносят ощутимый вклад в связывание иона металла в активном центре элонгационного комплекса РНК-полимеразы, компенсируя отсутствие любого из трех участвующих в образовании координационных связей остатков аспарагиновой кислоты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зоров, Савва Дмитриевич, Москва

1. Лисицин Н.А., Свердлов Е.Д., Моисеева Е.П., Никифоров В.Г. (1985) Локализация мутации, приводящей к устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотику стрептолидигину, в гене гроВ, кодирующем ст-субъединицу фермента. Биоорган. Химия 11:132-134

2. Лурье Ю. (1989) Руководство по аналитической химии. Химия. Москва

3. Николаев А.В. (1999) Дипломная работа, Институт Молекулярной генетики РАН, Москва

4. Archambault J, Friesen JD (1993) Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III. Microbiol Rev. 57(3):703-724

5. Artsimovitch I, Chu C, Lynch AS, Landick R. (2003) A new class of bacterial RNA polymerase inhibitor affects nucleotide addition. Science 302(5645):650-654

6. Axen A, Carlsson A, Engstrom A, Bennich H. (1997) Gloverin, an antibacterial protein from the immune hemolymph of Hyalophora pupae. Eur J Biochem. 247(2):614-619

7. Bar-Nahum G, Epshtein V, Ruckenstein AE, Rafikov R, Mustaev A, Nudler E. (2005) A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell 120(2):183-193.

8. Baroudy BM, Moss В (1980) Purification and characterization of a DNA-dependent RNA polymerase from vaccinia virions. J Biol Chem. 255(9):4372-4380

9. Bartolomei MS, Corden JL (1987) Localization of an alpha-amanitin resistance mutation in the gene encoding the largest subunit of mouse RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 7(2):586-594

10. Bartolomei MS, Corden JL (1995) Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem. 270(32):19114-19119

11. Bateman A, Singh A, Congote LF, Solomon S. (1991) The effect of HP-1 and related neutrophil granule peptides on DNA synthesis in HL60 cells. Regul Pept. 35(2): 135-143

12. Beese LS, Steitz ТА. (1991) Structural basis for the 3-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBO J., 10:25-33

13. Bellamy W, Takase M, Wakabayashi H, Kawase K, Tomita M. (1992) Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin. J Appl Bacteriol. 73(6):472-479

14. Boman HG, Agerberth B, Boman A. (1993) Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine. Infect Immun. 61(7):2978-2984

15. Bonner G, Patra D, Lafer E, Sousa R (1992) Mutations in T7 RNA polymerase that support the proposal for a common polymerase active site structure. EMBO J. 11: 3767-3775

16. Borukhov S, Goldfarb A (1993) Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr. Purif. 4: 503-511

17. Borukhov S, Sagitov V, Goldfarb A (1993) Transcript cleavage factors from E. coli. Cell 72: 459-466

18. Borukhov S, Laptenko O, Lee J (2001) Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB: functions and mechanisms of action. Methods Enzymol. 342: 64-76

19. Broyles SS, Moss В (1986) Homology between RNA polymerases of poxviruses, prokaryotes, and eukaryotes: nucleotide sequence and transcriptional analysis of vaccinia virus genes encoding 147-kDa and 22-kDa subunits. Proc Natl Acad Sci USA 83(10):3141-3145

20. Bushnell DA, Cramer P, Kornberg RD (2001) Selenomethionine incorporation in Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II. Structure (Camb). 9(1):R11-14

21. Campbell EA, Korzheva N, Mustaev A, Murakami K, Nair S, Goldfarb A, Darst SA (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell 104(6):901-912

22. Cassani G, Burgess RR, Goodman HM, Gold L. (1971) Inhibition of RNA polymerase by streptolydigin. Nat New Biol. 230(15): 197-200

23. Cermakian N, Ikeda TM, Miramontes P, Lang BF, Gray MW, Cedergren R. (1997) On the evolution of the single-subunit RNA polymerases. J Mot Evoi 45(6):671-681

24. Chafin DR, Guo H, Price DH. (1995) Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem. 270(32):19114-19119

25. Cochet-Meilhac M, Chambon P (1974) Animal DNA-dependent RNA polymerases. 11. Mechanism of the inhibition of RNA polymerases В by amatoxins. Biochim Biophys Acta. 353(2):160-184

26. Copeland WC, Wang TS (1993) Mutational analysis of the human DNA polymerase alpha. The most conserved region in alpha-like DNA polymerasesis involved in metal-specific catalysis. J Biol Chem. 268: 11028-11040

27. Coppola JA, Luse DS (1984) Purification and characterization of ternary complexes containing accurately initiated RNA polymerase II and less than 20 nucleotides of RNA. J Mot Biol. 178(2):415-437

28. Coronelli C, White RJ, Lancini GC, Parenti F. (1975) Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes. II. Isolation, chemical, biological and biochemical characterization. JAntibiot (Tokyo) 28(4):253-259

29. Couto MA, Harwig SS, Lehrer Rl (1993) Selective inhibition of microbial serine proteases by eNAP-2, an antimicrobial peptide from equine neutrophils. Infect Immun. 61(7):2991-2994

30. Cramer P, Bushnell DA, Fu J, Gnatt AL, Maier-Davis B, Thompson NE, Burgess RR, Edwards AM, David PR, Kornberg RD (2000) Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science, 288; 640-649

31. Cramer P, Bushnell DA, Kornberg RD (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science, 292: 1863-1876

32. Date T, Yamamoto S, Tanihara K, Nishimoto Y, Matsukage A (1991) Aspartic acid residues at positions 190 and 192 of rat DNA polymerase beta are involved in primer binding. Biochemistry 30: 5286-5292

33. Delgado MA, Rintoul MR, Farias RN, Salomon RA (2001) Escherichia coli RNA polymerase is the target of the cyclopeptide antibiotic microcin J25. J Bacteriol. 183(15):4543-4550

34. Ebright RH. (2000) RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol. 304: 687-98

35. Epand RM, Vogel HJ. (1999) Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462(1-2):11-28

36. Epshtein V, Mustaev A, Markovtsov V, Bereshchenko O, Nikiforov V, Goldfarb A. (2002) Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell 10: 623-634

37. Foster JE, Holmes SF, Erie DA. (2001) Allosteric binding of nucleoside triphosphates to RNA polymerase regulates transcription elongation. Cell 106(2):243-52.

38. Geiduschek EP, Tocchini-Valentini GP (1988) Transcription by RNA polymerase III. Annu Rev В/осЛет.57:873-914

39. Gnatt AL, Cramer P, Fu J, Bushnell DA, Kornberg RD (2001) Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 292(5523): 1876-1882

40. Gnatt AL. (2002) Elongation by RNA polymerase II: structure-function relationship. Biochim Biophys Acta, 1577(2):175-190

41. Greenleaf AL (1983) Amanitin-resistant RNA polymerase II mutations are in the enzyme's largest subunit. J Biol Chem. 258(22): 13403-13406

42. Gross C.A., Chan C., Dombroski A., Gruber Т., Sharp M., Tupy J., Young B. (1998) The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 63:141-155

43. Gu W, Powell W, Mote J Jr, Reines D (1993) Nascent RNA cleavage by arrested RNA polymerase II does not require upstream translocation of the elongation complex on DNA. J Biol Chem. 268(34):25604-25616.

44. Handschin JC, Wehrli W. (1976) On the kinetics of the rifampicin-RNA-polymerase complex. Differences between crude and purified enzyme fractions. Eur J Biochem. 66(2):309-317

45. Hajdukiewicz PT, Allison LA, Maliga P (1997) The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the pJastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids. EMBO J. 16(13):4041-4048

46. Hedtke B, Borner T, Weihe A (1997) Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis. Science 277(5327):809-811

47. Heil A, Zillig W (1970) Reconstitute of bacterial DNA-dependent RNA-polymerase from isolated subunits as a tool for the elucidation of the role of the subunits in transcription. FEBS Lett. 11(3):165-168

48. Heisler LM, Suzuki H, Landick R, Gross CA (1993) Four contiguous amino acids define the target for streptolydigin resistance in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268(34):25369-25375

49. Hess WR, Borner T. (1999) Organellar RNA polymerases of higher plants. Int RevCytol. 190:1-59

50. Hinkle DC, Mangel WF, Chamberlin MJ. (1972) Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. IV. The effect of rifampicin on binding and on RNA chain initiation. J Mol Biol. 70(2):209-220.

51. Holmes SF, Erie DA. (2003). Downstream DNA sequence effects on transcription elongation. Allosteric binding of nucleoside triphosphates facilitates translocation via a ratchet motion. J Biol Chem. 278(37):35597-35608.

52. Huang H, Chopra R, Verdine GL, Harrison SC (1998) Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science, 282; 1669-1675

53. Jin DJ, Gross CA. (1988) Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J Mol Biol. 202(1 ):45-58

54. Kanyshkova TG, Semenov DV, Buneva VN, Nevinsky GA. (1999) Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. FEBS Lett. 451(3):235-237

55. Kapoor S, Sugiura M. (1999) Identification of two essential sequence elements in the nonconsensus type II PatpB-290 plastid promoter by using plastid transcription extracts from cultured tobacco BY-2 cells. Plant Cell 11(9): 17991810

56. Kashlev M, Nudler E, Severinov K, Borukhov S, Komissarova N, Goldfarb A (1998) Histidine-tagged RNA polymerase of Escherichia coli and transcription in solid phase. Methods Enzymol. 274: 326-334

57. Kaushik N, Rege N, Yadav PN, Sarafianos SG, Modak MJ, Pandey VN (1996) Biochemical analysis of catalytically crucial aspartate mutants of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Biochemistry 35:1153611546

58. Kettenberger H, Armache KJ, Cramer P (2003) Architecture of the RNA polymerase ll-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage. Cell. 114: 347-357

59. Kettenberger H, Armache K.J., Cramer P. (2004) Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol Cell 16(6):955-965.

60. Kim HS, Yoon H, Minn I, Park CB, Lee WT, Zasloff M, Kim SC. (2000) Pepsin-mediated processing of the cytoplasmic histone H2A to strong antimicrobial peptide buforin I. J Immunol. 165(6):3268-3274.

61. Kobayashi Y, Dokiya Y, Kumazawa Y, Sugita M. (2002) Non-AUG translation initiation of mRNA encoding plastid-targeted phage-type RNA polymerase in Nicotiana sylvestris. Biochem Biophys Res Commun. 299(1 ):57-61

62. Kobayashi Y, Dokiya Y, Sugita M. (2001) Dual targeting of phage-type RNA polymerase to both mitochondria and plastids is due to alternative translation initiation in single transcripts. Biochem Biophys Res Commun. 289(5): 11061113

63. Kock J, Cornelissen AW (1991) Characterization of the RNA polymerases of Crithidia fasciculata. Mol Microbiol. 5(4):835-842

64. Korzheva N, Mustaev A, Nudler E, Nikiforov V, Goldfarb A (1998) Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63: 337-345

65. Korzheva N, Mustaev A, Kozlov M, Malhotra A, Nikiforov V, Goldfarb A, Darst SA. (2000) A structural model of transcription elongation. Science 289(5479):619-625

66. Kragol G, Lovas S, Varadi G, Condie BA, Hoffmann R, Otvos L Jr. (2001) The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding. Biochemistry 40(10):3016-3026

67. Kriebardis T, Meng D, Aktipis S. (1987) Inhibition of the RNA polymerase-catalyzed synthesis of RNA by daunomycin. Effect of the inhibitor on the late steps of RNA chain initiation. J Biol Chem. 262(26): 12632-12640

68. Mathews DE, Durbin RD (1990) Tagetitoxin inhibits RNA synthesis directed by RNA polymerases from chloroplasts and Escherichia coli. J Biol Chem. 265(1 ):493-498

69. McClure WR (1985) Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem. 54: 171-204

70. McClure WR (1980) On the mechanism of streptolydigin inhibition of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 255: 1610-1616

71. McClure WR, Cech CL. (1978) On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. J Biol Chem. 253(24):8949-8956

72. Mosteller RD, Yanofsky C. (1970) Transcription of the tryptophan operon in Escherichia coli: rifampicin as an inhibitor of initiation. J Mol Biol. 48(3):525-531

73. Mukhopadhyay J, Sineva E, Knight J, Levy RM, Ebright RH (2004) Antibacterialpeptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel. Mol Cell. 14: 739-751

74. Murakami KS, Masuda S, Campbell EA, Muzzin O, Darst SA. (2002a) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science 296:1285-1290

75. Murakami KS, Masuda S, Darst SA. (2002b) Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science 296:12801284

76. Mustaev A, Zaychikov E, Severinov K, Kashlev M, Polyakov A, Nikiforov V, Goldfarb A (1994) Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds. Proc Natl Acad Sci USA. 91(25): 12036-12040

77. Mustaev A, Kozlov M, Markovtsov V, Zaychikov E, Denissova L, Goldfarb A (1997) Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6641-6645

78. Naryshkina T, Mustaev A, Darst SA, Severinov К (2001) The beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase is not required for interaction with initiating nucleotide but is necessary for interaction with rifampicin. J Biol Chem. 276(16):13308-13313

79. Navarro JA, Vera A, Flores R (2000) A chloroplastic RNA polymerase resistant to tagetitoxin is involved in replication of avocado sunblotch viroid. Virology 268(1):218-225

80. Nedea EC, Markov D, Naryshkina T, Severinov К (1999) Localization of Escherichia coli rpoC mutations that affect RNA polymerase assembly and activity at high temperature. J Bacteriol. 181: 2663-2665

81. Nedialkov YA, Gong XQ, Hovde SL, Yamaguchi Y, Handa H, Geiger JH, Yan H Burton ZF (2003). NTP-driven translocation by human RNA polymerase II. J Biol Chem. 278: 18303-18312

82. Nishikata M, Kanehira T, Oh H, Tani H, Tazaki M, Kuboki Y (1991) Salivary histatin as an inhibitor of a protease produced by the oral bacterium Bacteroides gingivalis. Biochem Biophys Res Commun. 174(2):625-630

83. Opalka N, Chlenov M, Chacon P, Rice WJ, Wriggers W, Darst SA (2003) Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 114: 335-345

84. Park CB, Kim HS, Kim SC. (1998) Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochem Biophys Res Commun. 244(1 ):253-257

85. Pelletier H, Sawaya MR, Wolfle W, Wilson SH, Kraut J. (1996) Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with DNA: implications for catalytic mechanism, processivity, and fidelity. Biochemistry, 35: 1274212761

86. Polesky, A.H., Dahlberg, M.E., Benkovic, S.J., Grindley, N.D., and Joyce, C.M. Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli (1992) J Biol Chem 267: 8417-8428

87. Pritchard AE, McHenry CS (1999) Identification of the acidic residues in the active site of DNA polymerase III. J Mol Biol. 285: 1067-1080

88. Putsep К, Normark S, Boman HG. (1999)The origin of cecropins; implications from synthetic peptides derived from ribosomal protein L1. FEBS Lett. 451(3):249-252

89. Quan S, Imai T, Mikami Y, Yazawa K, Dabbs ER, Morisaki N, Iwasaki S, Hashimoto Y, Furihata K. (1999) ADP-ribosylation as an intermediate step in inactivation of rifampin by a mycobacterial gene. Antimicrob Agents Chemother. (1):181-184

90. Rhodes G, Chamberlin MJ (1974) Ribonucleic acid chain elongation by Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. I. Isolation of ternary complexes and the kinetics of elongation. J Biol Chem. 249: 6675-6683

91. Rudd MD, Luse DS (1996) Amanitin greatly reduces the rate of transcription by RNA polymerase II ternary complexes but fails to inhibit some transcript cleavage modes. J Biol Chem. 271 (35):21549-21558

92. Rusconi A, Calendi E. (1966) Action of daunomycin on nucleic acid metabolism in HeLa cells. Biochim Biophys Acta. 119(2):413-415

93. Salomon RA, Farias RN (1992) Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichia coli. J Bacteriol. 174(22):7428-7435

94. Saturno J, Lazaro JM, Blanco L, Salas M (1998) Role of the first aspartate residue of the "YxDTDS" motif of phi29 DNA polymerase as a metal ligand during both TP-primed and DNA-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 283: 633642

95. Schleif R (1969) Isolation and characterization of streptolydigin resistant RNA polymerase. Nature 223(210):1068-1069

96. Sentenac A (1985) Eukaryotic RNA polymerases CRC Crit Rev Biochem. 18( 1 ):31 -90

97. Seshadri V, McArthur AG, Sogin ML, Adam RD. (2003) Giardia lamblia RNA polymerase II: amanitin-resistant transcription. J Biol Chem. 278(30):27804-27810

98. Severinov K, Soushko M, Goldfarb A, Nikiforov V. (1993) Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268(20): 1482014825

99. Severinov K, Soushko M, Goldfarb A, Nikiforov V. (1994) RifR mutations in the beginning of the Escherichia coli rpoB gene. Mol Gen Genet. 244(2):120-126

100. Severinov K, Markov D, Severinova E, Nikiforov V, Landick R, Darst SA, Goldfarb A. (1995) Streptolydigin-resistant mutants in an evolutionarily conserved region of the beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 270(41 ):23926-23929

101. Siddhikol C, Erbstoeszer JW, Weisblum В (1969) Mode of action of streptolydigin. J Bacteriol. 99(1):151-155

102. Sidorenkov I, Komissarova N, Kashlev M (1998) Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription. Mol. Cell 2: 55-64

103. Simmaco M, Mignogna G, Barra D. (1998) Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us? Biopolymers. 47(6):435-450

104. Sollner-Webb B, Tower J. (1986) Transcription of cloned eukaryotic ribosomal RNA genes. Annu Rev Biochem.55:801-830

105. Sonenshein AL, Alexander HB. (1979) Initiation of transcription in vitro inhibited by lipiarmycin. J Mol Biol. 127(1):55-72.

106. Sosunov V, Sosunova E, Mustaev A, Bass I, Nikiforov V, Goldfarb A (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J.;22(9):2234-2244.

107. Sosunova E, Sosunov V, Kozlov M, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A (2003) Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA. 100:15469-15474

108. Svetlov V, Vassylyev DG, Artsimovitch I (2004) Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J Biol Chem. 279: 38087-38090

109. Steinberg TH, Burgess RR (1992) Tagetitoxin inhibition of RNA polymerase III transcription results from enhanced pausing at discrete sites and is template-dependent. J Biol Chem. 267(28):20204-20211

110. Steinberg TH, Mathews DE, Durbin RD, Burgess RR( 1990) Tagetitoxin: a new inhibitor of eukaryotic transcription by RNA polymerase III. J Biol Chem. 265(1):499-505

111. Steitz ТА (1998) A mechanism for all polymerases. Nature, 391; 231-232

112. Steitz ТА (1999) DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem. 274: 17395-17398

113. Tang YQ, Yuan J, Osapay G, Osapay K, Tran D, Miller CJ, Ouellette AJ, Selsted ME (1999) A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins. Science 286(5439):498-502

114. Tavormina PL, Reznikoff WS, Gross CA (1996) Identifying interacting regions in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol. 258(2):213-223

115. Tennyson CN, Klamut HJ, Worton RG (1995) The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is ^transcriptionally spliced. Nat Genet. 9: 184-190

116. Toulokhonov I, Artsimovitch I, Landick R (2001). Allosteric control of RNA polymerase by a site that contacts nascent RNA hairpins. Science 292: 730733

117. Vanacova S, Tachezy J, Ullu E, Tschudi С (2001) Unusual diversity in alpha-amanitin sensitivity of RNA polymerases in trichomonads. Mol Biochem Parasitol. 115(2):239-247

118. Vassylyev DG, Sekine S, Laptenko O, Lee J, Vassylyeva MN, Borukhov S, Yokoyama S (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417: 712-719

119. Velasco M, Diaz-Guerra MJ, Diaz-Achirica P, Andreu D, Rivas L, Bosca L. (1997) Macrophage triggering with cecropin A and melittin-derived peptides induces type II nitric oxide synthase expression. J Immunol. 158(9):4437-4443

120. Wehrli W, Knusel F, Schmid K, Staehelin M. (1968) Interaction of rifamycin with bacterial RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 61(2):667-673

121. Westover KD, Bushnell DA, Kornberg RD (2004) Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell, 119:481-489

122. Wu L, Pan J, Thoroddsen V, Wysong DR, Blackman RK, Bulawa CE, Gould AE, Ocain TD, Dick LR, Errada P, Dorr PK, Parkinson T, Wood T, Kornitzer D,

123. Weissman Z, Willis IM, McGovern K. (2003) Novel small-molecule inhibitors of RNA polymerase III. Eukaryot Cell 2(2):256-264

124. Yang, X., Price, С (1995) Streptolydigin resistance can be conferred by alterations to either the beta or beta' subunits of Bacillus subtilis RNA polymerase J. Biol. Chem. 270: 23930-23933

125. Yee D, Armstrong VW, Eckstein F. (1979) Mechanistic studies on deoxyribonucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase from Escherichia coli using phosphorothioate analogues. 1. Initiation and pyrophosphate reactions. Biochemistry 18: 4116-4120

126. Zakharova E, Wang J, Konigsberg W (2004) The activity of selected RB69 DNA polymerase mutants can be restored by manganese ions: the existence of alternative metal ion ligands used during the polymerization cycle. Biochemistry 43: 6587-6595

127. Zanotti G, Mohringer C, Wieland T (1987) Synthesis of analogues of amaninamide, an amatoxin from the white Amanita virosa mushroom. Int J Pept Protein Res. 30(4):450-459

128. Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415(6870):389-395

129. Zaychikov E, Martin E, Denissova L, Kozlov M, Markovtsov V, Kashlev M, Heumann H, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (1996) Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science 273: 107-109

130. Zhang G, Campbell EA, Minakhin L, Richter C, Severinov K, Darst SA. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Ce//98(6):811-824