Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное состояние плазматической мембраны энтероцитов тонкого кишечника после действия ионизирующей радиации

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное состояние плазматической мембраны энтероцитов тонкого кишечника после действия ионизирующей радиации"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ імені Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

іГ) р На правах рукопису

ВАЩЕНКО ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

СТРУКТУРНО- ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ЕНТЕРОЦИТІВ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ПІСЛЯДІЇ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ

03.00.08 - радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1997

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор В.М. Войціцький

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Ю.В. Бездробний

доктор біологічних наук В.А. Тугай Провідна установа - Київський державний медичний університет

ім. О.О. Богомольця

Захист відбудеться “ 'ҐЗ ” 1997р. о _ годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.83.01 в Інституті

експериментально! патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (252022 м. Київ-22, вул. Васильківська,45)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий “_______”__________________1997р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

Г.Й. Лавренчук

Актуальність роботи. Важливе значення в механізмі дії іонізуючого опромінення відводиться структурним змінам клітинної поверхні, і серед них порушенням ліпідних, вуглеводних і білкових компонентів плазматичних мембран опромінених клітин .

Провідна роль в здійсненні основних функцій тонкого кишечника, який є одним з радіочутливих органів, належить плазматичній мембрані клітин кишкового епітелію, а саме ентероцитів. Складовими частинами плазматичної мембрани ентероциту є апікальна (АМ) (повернена в порожнину кишечника) та базолатеральна (БМ) мембрани, які містять різноманітні транспортні системи і конролюють трансклітинне і трансмембранне перенесення іонів та поживних речовин з порожнини тонкої кишки в кров і лімфу [Уголев, 1986; Морозов, і988].

Недостатність комплексних даних шодо післярадіаційних фізичних і хімічних змін плазматичної мембрани клітин тонкої кишки не дозволяє оцінити роль мембранної структури в формуванні наслідків дії радіації, в тому числі в дозах, значно нижчих від тих, шо викликають кишкову форму променевої хвороби.

З’ясування особливостей порушення топографії АМ та БМ ентероцитів після впливу іонізуючої радіації може сприяти більш глибокому вивченню механізмів післярадіаційного порушення функціональних систем плазматичної мембрани ентероцитів тонкої кишки.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було вивчення структурного стану плазматичної мембрани ентероцитів ( а саме ії апікальної та базолатеральної складових частіш) тонкого кишечника щурів після дії одноразового тотального рентгенівського опромінення в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр через 1 добу після опромінення. Досягнення зазначеної мети передбачає вирішення наступних завдань: 1. Оцінити структурний стан поверхневого шару АМ та БМ ентероцитів тонкого кишечника щурів після одноразового рентгенівського опромінення в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр. 2.Вивчити в цих умовах мікров’язкість ліпідної компоненти плазматичної мембрани ентероцитів тонкого кишечника щурів. 3.Визначити конформаційні зміни білкових молекул

АМ та БМ в результаті впливу досліджуваних доз іонізуючої радіації. 4.Дослідити просторову організацію білково-ліпідних комплексів плазматичної мембрани ентероцитів. 5.0цінити можливість взаємозв’язку радіаційноіндукованих змін стукгурного стану плазматичної мембрани ентероцитів та ії Са2+- транспортуючої здатності.

Наукова новизна та практична значимість роботи.

В даній роботі вперше проведено систематичні дослідження основних структурних змін апікальної та базолатеральної складових частин плазматичної мембрани ентероцитів при дії іонізуючої радіації в дозах від 0,5 до 3,0 Гр.

За допомогою флуоресцентного зонду АНС встановлено зміни поверхневого шару плазматичної мембрани, про що свідчать зміни спектральних характеристик та параметрів зв’язування даного зонду з мембраною, а також більш від’ємний поверхневий потенціал мембранних препаратів, отриманих із опромінених тварин.

Використання різних гасників флуоресценції триптофану дозволило оцінити конформаційний стан і внутрішню молекулярну просторову перебудову білків АМ, які містять триптофаніли різної локалізації та виявити переміщення поверхневих білків в глибину ліпідної фази після дії іонізуючої радіації.

За допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) виявлені порушення просторової організації білково-ліпідних комплексів в результаті опромінення (переміщення центру білкової маси мембран у напрямку від границі позподілу фаз ліпід/вода) та зменшення товщини плазматичної мембрани, що вказує на можливість утворення агрегатів білкових молекул.

Відмічено підвищення мікров’язкості ангулярних ліпідів у порівнянні з рештою ліпідної маси в препаратах АМ та БМ. Показано, шо опромінення викликає зменшення мікров’язкості ангулярних ліпідів АМ та БМ, в той час як для бішарових ліпідів цей показник майже не змінюється. Вперше за допомогою методу ІРПЕ було вивчено структурний стан плазматичної мембрани ентероцитів тонкої кишки в контрольних препаратах та після дії іонізуючої радіації. Проведено порівняльну характеристику окремих складових частин плазматичної мембрани ентероцитів (АМ та БМ). Спостерігались більш виражені структурні зміни АМ у порівнянні з БМ після дії досліджуваних доз іонізуючої радіації.

Виявлені післярадіаційні порушення транспорту Са2+ АМ та БМ, які полягають в збільшенні проникності цих мембран для Са2+,

з

підвищення Са2+-зв’язуючої здатності AM, пригнічення АТФ-залежного накопичення Са2+ БМ обумовлюють підвищення внутрішньоклітинної концентрації даного іону.

Одержані результати розширюють існуючі уявлення про первинні механізми дії іонізуючої радіації в діапазоні доз від 0,5 до 3,0 Гр на структурно-функціональні властивості тонкого кишечника. Вони можуть бути передумовою для науково обгрунтованого пошуку лікарських препаратів та розробки засобів зменшення негативного впливу іонізуючої радіації на структурно-функціональні властивості тонкого кишечника.

Положення, шо виносяться на захист. 1.Рентгенівське опромінення в дозах 0.5; 1.0; 2.0 та 3.0 Гр приводить до змін структурного стану апікальної та базолатеральної складових частин плазматичної мембрани ентероцитів. а саме їх поверхневих ділянок та області жлрнокислотних ланцюгів фосфоліпідів. 2.В результаті впливу іонізуючої радіації виявлено зміни фізичних властивостей плазматичної мембрани ентероцитів: конформаційна модифікпція мембранних білків,

зменшення мікров’язкості ангулярних ліпідів, а також зміни просторової організації білково-ліпідних комплексів. 3.Виявлені порушення Са2+-транспортуючої здатності AM та БМ ентероцитів в результаті опромінення в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 Гр пов’язані з радіаційно-індукованими структурними перебудовами плазматичної мембрани. 4.Спостережені ефекти дії іонізуючої радіації підсилюються із збільшенням дози опромінення від 0,5 до 3,0 Гр.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на 1-му з’їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), Радіобіологічному з’їзді (Дніпропетровськ, 1995), наукових конференціях професорсько-викладацького складу Київського університету ім. Тараса Шевченка (Київ, 1994-1996), Міжнародному симпозиумі “Biological mobility” (Москва 1994).

Впровадження. Матеріали дисертаційної роботи використовуються в курсах лекцій “Радіобіологія” та “ Радіаційна екологія” Київського університету імені Тараса Шевченка.

Об’єм роботи. Дисертація складається з вступу , огляду літератури (З розділи), матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення (5 розділів) , заключення, висновків, переліку використаної літератури ( 172 джерела ). Робота викладена на 122 сторінках машинопису, містить 23 рисунки і 4 таблиці. Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на щурах-самцях вагою 180-220 г , яких одноразово тотально опромінювали в

дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр на апараті РУМ-17 з тубусом при наступних умовах: потужність дози в повітрі 2x10-4 А/кг, фільтри 0,5мм Си, 1мм А1, сила струму ЮмА , напруга 200 кВ, шкірофокусна відстань - 50 см. Тварин декапітували через 1 добу добу після опромінення . Цей термін вибрано з декількох причин . По-перше, повне оновлення ентероцитів тонкої кишки відбувається через 3-6 діб [ Морозов, 1988]. Подруге, більш виражений вплив іонізуючої радіації на функціонування тонкокишкового епітелію проявляється саме через 1 добу [Степанов, 1993; Хижняк, 1995], оскільки вже через 3 доби при дії доз менше 10 Гр спостерігається відновлення структурно - функціональних

властивостей [ Бродский, 1987].

Отримання суспензії епітеліальних клітин тонкої кишки проводили згідно з рекомендаціями наведенеми в роботах [Watford,1979; Усатюк,1990,1994] з деякими модифікаціями. Везикульовані препарати AM та БМ ентероцитів отримували згідно методик [Hopfer, 1973; Miller,

1981]. Чистоту отримуваних препаратів плазматичної мембрани оцінювали за активністю маркерних ферментів даних мембран: AM - за активністю лужної фосфатази та у-глутамінтрансферази згідно [Ghijsen, 1980], БМ - На+К+-АТФази [Ghijsen, 1982], а також методом електронномікроскопічного аналізу в умовах негативного контрастування [Lewis,1977]. Вміст білку в об’єктах дослідження визначали за методом [Lowry et al., 1951], а кількість клітин в пробі -забарвлюючи трипановим синім, згідно [Evans, 1971], використовуючи камеру Горяєва.

При вивченні структурного стану AM та БМ ентероцитів тонкої кишки використовували від’ємно заряджений флуоресцентний зонд АНС. Параметри зв’язування зонду з мембранами розраховували за методом [Владимиров, Добрецов, 1980, ]. Дослідження мікров’язкості AM та БМ ентероцитів проводили з використанням флуоресцентного зонду пірену згідно з [Литвинов, 1982, Окунь,1986]. Просторове взаємовідношення між білками та ліпідами в плазматичній мембрані оцінювали методом ІРПЕ [ Добрецов, 1981, Фоменко, 1985] з донора (триптофанові залишки мембранних білків) на акцептор (пірен). При вивченні гасіння флуоресценції білків AM використовували гасники різних класів: гідрофільний (акриламід) та гідрофобний (MgC^) . Визначення кількості місць та константи зв’язування іонів кальцію з плазматичною мембраною ентероцитів проводили з використанням Са2+

- чутливого флуоресцентного зонду хлортетрацикліну згідно з [Добрецов, 1989].

Концентрацію цитозольного Са2+ в енгероцитах визначали за допомогою флуоресцентного зонду INDO-1/AM [Grinkiewicz, 1984]. Вивчення накопичення 45Са2+ везикульованими препаратами AM проводили радіоізотопним методом згідно [Miller, 1981, Miller, Tung,

1982] в розчині (об’єм 0,3 мл), який містив ЮмМ HEPES-Tpic (pH 7,5 при 25°С), ЮОмМ Д-сорбітол, ІмМ 45СаСІ2 (0,3 мкКи/мл). Накопичення 45Са2+ препаратами БМ ентероцитів визначали згідно [Ghijsen, 1982] у розчині (об’ємом 0,5 мл), який містив 20мМ HEPES-Tpic (pH 7,4), ЮОмМ MgCl2, , 0,01 мМ 45Са2+ (0,15 мкКи/мл) з (або без) ЗмМ АТФ Реакцію ініціювали внесенням 0,05 мг білку в пробу, а зупиняли шляхом швидкого фільтрування через мембранні фільтри. Радіоактивність препаратів визначали за допомогою рідинно-сцинтиляційного лічильника SL-4000 фірми “Intertechnique” (Франція). Статистична обробка даних проводилась загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Плохинский, 1980].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

1. Оцінка структурного стану плазматичної мембрани ентероцитів після опромінення.

В дослідах з флуоресцентним зондом АНС встановлені порушення поверхневої структури плазматичної мембрани ентероцитів, про що свідчать виявлені зміни спектральних характеристик цього зонду та параметрів його зв’язування з апікальною та базолатеральною частинами цієї мембрани.

Зменшення флуоресценції АНС, зв’язаного з АМ та БМ ентероцитів із опромінених тварин приблизно на 5%, 8%, 18% і 25% відповідно при опроміненні в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр, напевно, обумовлено зниженням квантового виходу флуоресценції, який

зменшувався приблизно на 9%, 14%, 19% та 27% відповідно при

опроміненні у вказаних дозах в препаратах як АМ так і БМ.

Аналіз результатів свідчить, що при опроміненні спостерігається різнонаправленість в характері змін константи та кількості місць зв’язування зонду АНС з мембранами. Із збільшенням дози опромінення константа зв’язування зменшується на 9%, 15%, 59%

та 80% відповідно при опроміненні в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр.

Таблиця 1. Вплив іонізуючого опромінення на спектральні характеристики та параметри зв'язування флуоресцентного зонду АНС в дослідах з апікальною (АМ) та базолатеральною (БМ) мембранами ентероцитів тонкої кишки (М+т, п=4г5).

Умови досліду Показник

Інтенсивність флуоресценції АНС, відн.од. Квантовий вихід флуоресценції (О), відн.од. Зміна поверхневого потенціалу, <з Р , мВ Константа зв'язування, (Канс). мкМ-1 Кількість місць зв'язування, (^нс), нмоль/мг білку

Контроль АМ 1,00 1,00 0 5,81 ±0,14 8,31+0,12

БМ 1,00 1,00 0 5,0110,11 7,02±0,П

Доза опромінення,Гр 0,5 АМ 0,95±0,05 0,91 ±0,02 2,7 ї ±0,02 5,28+0,12 9,12±0,16*

БМ 0,88±0,01* 0,8410,04* 2,58±0,04 4,89±0,09 10,0710,21*

1,0 АМ 0,9210,03 0,86±0,06 3,6310,03* 4,93±0,16 9,82±0,08*

БМ 0,8310,02* 0,79±0,03* 3,4210,03* 4,5110,13* 12,2610,11*

2,0 АМ 0,8210,04* 0,81±0,02* 3,78±0,04* 2,38+0,08* 12,67+0,13*

БМ 0,79±0,06* 0,7610,02* 3,71±0,02* 3,9 7±0,17* 14,89+0,25*

3,0 АМ 0,75±0,03* 0,7310,01* 3,6810,03* 1,19+0,16* 13,42±0,22*

1,0 через 14 діб АМ 0,9810,02* 0,8910,02* 2,38±0,04 5,8410,15 8,3710,16

* - р< 0,05 по відношенню до контролю.

Примітка: , де 9* - поверхневий потенціал мембран в контрольних препаратах,

Я - П ППР.ПЯПЯТЯУ ПІГПЯ ОГТПГШІНЄННЯ.

Поряд з цим, кількість місць зв’язування зростає відповідно на 9%; 18%; 52% та 61 % у порівнянні з контролем (табл.1).

В препаратах БМ спостерігались якісно аналогічні результати. При збільшенні дози опромінення до 2 Гр в два рази збільшувалась кількість місць зв’язування зонду з мембранами. Відмічено зменшення константи зв'язування приблизно на 10% та 21% відповідно при опроміненні у дозах 1,0 та 2,0 Гр (табл.1).

Виявлена різнонаправленість впливу опромінення на число місць зв’язування та константу зв’язування зонду АНС з мембраною, очевидно, свідчить про наявність такої модифікації структури мембрани, яка може визначатись змінами як ліпідної компоненти в області полярних “голівок” та гліцеринових залишків фосфоліпідів, так і мембранних білків . Напевно, конформаційні зміни білкових та ліпідних компонентів мембрани призводять до появи додаткових ділянок зв’язування АНС, враховуючи, що флуоресценція змішаного бішару складним чином залежить від його складу.

Оскільки АНС несе одиничний від’ємний заряд, то логічно припустити, що дані зміни залежать від поверхневого потенціалу мембрани. Зміна поверхневого потенціалу (Аф) незалежно від дози опромінення складає 3,5 - 3,8 мВ в порівнянні з контролем, і вказує на більш від’ємний потенціал як АМ так і БМ, виділених із опромінених тварин.

Слід відмітити, що на 14 добу після опромінення в дозі 1 Гр спектральні характеристики зонду АНС та параметри його зв’язування з мембранами практично не відрізнялись від контроля. Це вказує на тимчасовий характер структурних змін плазматичної мембрани ентероцитів в результаті опромінення в досліджуваних дозах.

2. Вплив іониуючоїрадіації на структуру білкової компоненти апікальної та базолатеральної мембран ентероцитів тонкого кишечника.

З урахуванням того, що структурні зміни в мембранах можуть бути обумовлені конформаційними перебудовами мембранних білків, було досліджено вплив іонізуючої радіації на конформаиійнті стан білкових молекул АМ та БМ ентероцитів.

В значній мірі конформаційний стан білкової молекули характеризують такі спектральні характеристики її триптофанової флуоресценції, як положення максимума спектра флуоресценції, інтенсивність флуоресценції та ширина спектру [Демченко, 1988].

Аналіз отриманих результатів свідчить, що в результаті опромінення відбувається лише збільшення інтенсивності флуоресценції триптофанових залишків, в той час, як положення максимуму та ширина спектра флуоресценції залишались незмінними.

Підвищення інтенсивності флуоресценції білкових триптофанілів в препаратах АМ в середньому на 20% та БМ на 11% може бути зумовлено такими структурними перебудовами білкової молекули, які супроводжуються переходом триптофанових залишків в більш гідрофобну область [Демченко, 1988].

Комбіноване використання двох гасників триптофанової флуоресценції, один з яких визиває вибіркове гасіння флуоресценції поверхневих триптофанілів (MgCl2), а другий здатний гасити флуоресценцію триптофанілів в середині білкової матриці (акриламід) дозволило оцінити внутрішню молекулярну просторову перебудову білків апікальних мембран.

Виявлено збільшення ефективності гасіння флуоресценції триптофанілів АМ за рахунок підвищення константи Штерна-Фольмера (К^у), тобто в результаті збільшення флуктуації білкових молекул. Причому, у випадку гасіння акриламідом К5У збільшується в середньому на 11%, 34% і 38%, а у випадку гасіння М§СІ2 - на 23%, 53% і 73% у порівнянні з контролем, відповідно після опромінення в дозах 1,0; 2.0 та 3,0 Гр (табл.2). Більш суттєве збільшення Кл. при використанні М§С12 , можливо, пов'язано також із збільшенням вкладу статичного гасіння, специфічного чи неспецифічного зв'язування іонного гасника з білком та гетерогенністю білкових флуорофорів. Виявлене в даних умовах зниження кількості триптофанових залишків, які піддаються гасінню, можна пояснити зменшенням їх доступності як завдяки конформаційним змінам білкової молекули, так і в результаті занурювання триптофанових залишків поверхневих білків мембрани в глибину ліпідної фази , шо виявлено в дослідах з використанням МіСІ2.

3. Вплив іонізуючої радіації на фізичні властивості плазматичної мембрани ентероцитів тонкого кишечника.

В з’ясуванні механізмів функціонування мембранних систем важлива роль належить дослідженню взаємодії білків та ліпідів. Порушення просторової організації білково-ліпідних комплексів при дії іонізуючої радіації можуть обумовлювати функціональні зміни плазматичних мембран [Болдырев, 1985].

Таблиця 2. Вплив іонізуючої радіації на параметри гасіння флуоресценції триптофанових залишків апікальних мембран ентероцитів. І - гасіння акриламідом; II - гасіння іонами магнію (М±т,п=4г5).

Умови досліду І II

Кбу Ь К.<іу Ь

Контроль 4,25+0,03 0,90±0,09 38,3+0,02 0,81+0,07

Доза опромінення, Гр

1.0 4,71 ±0,06* 0,83±0,07 47,4+0,04* 0,71+0,11

2.0 5,71+0,04* 0,8010,06 58,7±0,03* 0,62+0,06*

3.0 5,88±0,05* 0,76±0,05* 66,7+0,05* 0,58+0,08*

* - р<0,05 по відношенню до контролю

Кяу - Константа Штерна-Фольмера, М'1

Ь - мастка триптофанових залишків, доступних гасінню

Для вивчення просторової організації білково-ліпідних комплексів використовували метод індуктивно-резонансного переносу енергії з триптофанових залишків мембранних білків на флуоресцентний зонд пірен, який локалізується в ліпідній фазі [Добрецов,1989].

Дані по гасінню піреном флуоресценції триптофанових залишків АМ та БМ в модифікованих координатах Штерна-Фольмера дозволяють визначити два геометричних параметри : Ь - частка флуоресценції

донорів, які приймають участь в переносі енергії, (якщо Ь=1, вважається, що всі донори приймають участь в переносі енергії), та X - середня відстань між поверхнею бішару та цими донорами [Фоменко, 1985] (табл.З).

В АМ частка флуоресценції триптофанових залишків, які приймають участь в переносі енергії, в контролі становить близько

0,71, а після опромінення в дозах 1,0; 2,0 та 3,0 Гр відповідно 0,70;

0,61 та 0,57. В контрольних препаратах БМ параметр Ь становить близько 0,90 і після опромінення в дозах 1,0; 2,0 та 3,0 Гр його

величина також зменшується і становить відповідно 0,83, 0,77 та 0,74.

Виявлено переміщення в результаті опромінення центру білкової маси мембран від границі розподілу ліпід/вода в глибину ліпідної фази. В препаратах АМ таке переміщення становило 0,16 нм; 1,76 нм та 2,32 нм після опромінення в дозах 1,0; 2,0 та 3,0 Гр, а в БМ відповідно - 0,08 нм; 0,14 нм та 0,28 нм.

Ліпіди являються основою структурної організації біологічних мембран, які забезпечують властивості напівпроникливості, транспорт органічних та неорганічних сполук, експресію рецепторів та інше. Тому, фізичний стан ліпідного бішару, а саме його в'язкість - фактор, який контролює активність мембранних ферментів і лежить в основі уявлень про унікальну регуляцію мембранозалежних процесів, опосередковану ліпідами [Болдырев, 1985] .

Використання методу визначення ступеню ексимеризації флуоресцентного зонду пірену при двох величинах довжини хвилі збудження дозволило оцінити зміни в’язкості вільних, які знаходяться на відстані більше ніж 3 нм від білкової молекули, та ангулярних ліпідів, які безпосередньо контактують з білковими молекулами (табл.З). Відмічена більш висока мікров'язкість ангулярних ліпідів, зв'язаних з білками, у порівнянні з рештою ліпідної маси в контрольних препаратах АМ та БМ, що узгоджується з існуючим уявленням про імобілізуючий вплив білків на вуглецеві залишки ліпідних молекул [Болдырев, 1985]. Показано, що опромінення викликає зменшення структурної впорядкованості ангулярних ліпідів АМ та БМ, в той час як

Таблиця 3. Вплив іонізуючої радіації на геометричні параметри та ступінь ексимеризації пірену в апікальній (АМ) та базолатеральній (БМ) мембранах ентероцитів тонкої кишки (М±пі, и=4г5).

Умови досліду X, нм Ь N335 N280

АМ БМ АМ БМ АМ БМ АМ БМ

Контроль +0,64+0,02 -1,75+0,03 0,71+0,05 0,90+0,03 0,47+0,02 0,44+0,04 0,21+0,05 0,22+0,03

Доза опромінення. Гр

1,0 +0,47±0,04* -1,83+0,02* 0,69-1:0,03 0.81+0,05* 0,46+0,03 0,41+0,05 0,28+0,02* 0,24±0,05

2,0 -1,І2±0,03* -І,89±0,03* 0,61+0.04* 0,76±0,02* 0,43+0,04 0,39±0,02 0,32+0,04* 0,25+0,02

3,0 -1,68+0,01* -2,03±0,0І* 0,57+0,02* 0,74±0,04* 0,42±0,03 0,39+0,03 0,33+0,02* 0,2510,04

*р<0,05 по відношенню до контролю

Примітка:розташування центру білкової маси в ліпідному бішарі "+" - над поверхнею ліпідного бішару N335 - ступінь ексимеризації пірену при Л зб.=335 нм N250 - ступінь ексимеризації пірену при Л зб.=280 нм.

мікров'язкість бішарових ліпідів майже не змінюється. Причому, більш виражені зміни мікров'язкості оточення прибілкових ліпідів спостерігаються в АМ у порівнянні з БМ при опроміненні в дозах 1,0;

2,0 та 3,0 Гр. Зниження в результаті опромінення мікров'язкості прибілкових ліпідів пов'язано, можливо, з порушенням гідрофобних взаємодій між ліпідними молекулами і білковою а-спіраллю, яка імобілізує велику кількість ліпідів.

Зменшення ефективності переносу енергії' з мембранних триптофанілів на пірен та зменшення доступності триптофанових залишків для гасників триптофанової флуоресценції може бути обумовлено утворенням аїрегатів білкових молекул в середині бішару, підтвердженням цьому є виявлене переміщення центру білкової маси в напрямку від границі розподілу фаз ліпід/вода.

Крім того встановлено зменшення товщини ліпідного бішару в перепаратах АМ після опромінення. В контролі товщина лпідного бішару становить 3,78±0,05 нм, а після опромінення в дозах 1,0 та 2,0 Гр відповідно 3,19±0,03 та 2,89±0,04 нм.

4. Радіаційноіндукована модифікація Са2+ - транспортуючої функції мембран ентероцитів тонкого кишечника.

Виявлені порушення взаємозв’язку між білками та ліпідами і зменшення мікров’язкості прибілкових ліпідів можуть свідчити про порушення функціональних властивостей мембран. Дослідження функціонального стану мембран ентероцитів оцінювали вивчаючи їх Са2+-транспортуючу здатність.

При дослідженні транспорту Са2+ АМ та БМ ентероцитів, отриманих із контрольних та опромінених тварин, враховували особливості його трансмембранного перенесення цими мембранами. Відомо, що одним з основних механізмів транспорту кальцію АМ є пасивне проходження іону за електрохімічним градієнтом, необхідною стадією якого є його зв’язування цими мембранами. Транспорт Са2+ БМ обумовлюється функціонуванням Са2+-АТРази [Уап О.?, 1987].

Аналіз наведених на рис.1 даних свідчить, що іонізуюча радіація викликає збільшення процесу накопичення Са2+ препаратами АМ, а через 14 діб після опромінення в дозі ІГр спостерігається майже повне повернення цього процесу до рівня контролю. Встановлено, що виявлені зміни відбуваються за рахунок збільшення в післярадіаційний період проникності мембран для даного іону та збільшення її Са2+

і, хв

Рис. 1* . Накопичення 45Са2+ препаратами апікальної мембрани в контролі та після опромінення.

*- Наведені типові результати.

Таблиця 4. Параметри зв'язування Са2+ з апікальними мембранами ентероцитів, Min, n=4f5.

Показник Контроль Доза опроміненя

1 Гр 2 Гр ЗГр

Константа зв’язування Кг„ Ю-3 М 2,96+0,17 3,07±0,19 5,02±0,13* 4,98±0,22*

Кількість місць зв’язування І^Са, мкмоль/мг білку 1,01±0,16 1,10±0,18 1,12+0,21 1,25+0,18

* р<0,05 відносно контролю

- зв’язуючої здатності, яку оцінювали за допомогою Са-чутливого флуоресцентного зонду хлортетрашкліну (ХГЦ).

Виявлено зміни параметрів зв'язування Са2+ з АМ, виділених із опромінених тварин, а саме: збільшення кількості місць зв'язування та константи зв'язування (табл.4). Причиною цього може бути збільшення від’ємного заряду на мембрані (на шо вказує підвищення в результаті опромінення поверхневого потенціалу мембран) та структурні перебудови, які відбуваються поблизу локалізованих на мембрані від'ємно заряджених центрів сорбції Са2+.

Крім того, виявлено зменшення в результаті опромінення АТР-залежного накопичення Са2+ препаратами БМ (рис.2), шо узгоджується з результатами по пригніченню їх Са2+-АТРазної активності в цей період [Хижняк, 1996]. Встановлено також, що пасивна проникність БМ для іонів кальцію підвищується із збільшенням дози опромінення. Отримані результати вказують на пошкодження Са2+-транспортуючої функції даної мембрани.

Виявлені радіаційно-індуковані порушення трансмембранного перенесення Са2+ в ентероцитах тонкої кишки можуть призвести до зміни внутрішньоклітинної концентрації іону, а отже і до порушення Са2+-гомеостазу.

Відомо, шо порушення збалансованості обміну клітинного Са2+ може бути однією з причин цитотоксичних ефектів, які спостерігаються в тканинах організму при дії різноманітних пошкоджуючих факторів [Хансон,1985].

Встановлено зростання концентрації вільного внутрішньоклітинного Са2+ приблизно на 32%, 62% та 63% відповідно при опроміненні в дозах 1,0; 2,0 та 3,0 Гр (рис.З), що може впливати на функціональну активність ентероцитів після опромінення.

Таким чином, аналіз одержаних результатів по вивченню фізичних власивостей плазматичної мембрани ентероиитів свідчить про те, що із збільшенням дози опромінення спостерігаються зміни структурних властивостей обох (апікальної та базолатеральної) складових частин плазматичної мембрани епітелію тонкої кишки, що може призвести до зміни їх функціональної активності, а саме, як встановлено, Са2+ -транспортуючої здатності.

І, хв

к

■ К

• 0,5 Гр Д1 Гр

♦ 2 Гр

Рис.2. АТР-залежне накопичення 45Са2+ препаратами базолатеральної мембрани в контролі та після опромінення.

Рис.З. Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са2+ в ентероцитах тонкої кишки в контролі та після опромінення.

Висновки

1. Одноразове рентгенівське опромінення в дозах 0,5; 1,0; 2,0 та 3,0 Гр через 1 добу викликає зміни спектральних характеристик та параметрів зв’язування флуоресцентного зонду АНС з апікальною та базолатеральною складовими частинами плазматичної мембрани ентерошітів тонкої кишки щурів, що вказує на зміни поверхневої структури даної мембрани. Через 14 діб після опромінення в дозі

1,0 Гр вимірювані показники стану плазматичної мембрани не відрізняються від контрольних значень.

2. За даних умов опромінення спостерігається збільшення інтенсивності триптофанової флуоресценції та зміни параметрів гасіння флуоресценції білкових триптофанілів апікальної і, в меншій мірі, базолатеральної

мембрани ентероцитів, обумовлені конформаційними змінами білкових молекул та переміщенням поверхневих білків в глибину ліпідної фази.

3. Іонізуюче опромінення у вказаних дозах викликає зменшення структурної впорядкованості ангулярних ліпідів апікальних та базолатеральних мембран, в той час як мікров’язкість бішарових ліпідів майже не змінюється.

4. Після опромінення спостерігаються порушення просторової організації білково-ліпідних комплексів в апікальній та базолатеральній мембранах ентероцитів тонкого кишечника, виявлені за допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергїї з мембранних триптофанілів на флуоресцентний зонд пірен.

5. Виявлені радіаційно-індуковані порушення трансмембранного перенесення Са2+ в ентєроцитах тонкої кишки за рахунок підвищення проникливості плазматичної мембрани для цього іону, збільшення Са2+ -зв’язуючої здатності апікальних мембран, а також пригнічення активного транспорту Са2+ базолатеральними мембранами обумовлюють зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальція із збільшенням дози опромінення.

6. Встановлені деструктивні зміни плазматичної мембрани ентероцитів тонкої кишки, які відбуваються за рахунок структурних перебудов мембранних компонентів та зміни взаємозв’язків між білками та ліпідами можуть обумовлювати порушення її транспортних властивостей при дії іонізуючої радіації.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Хижняк С.В., Коваленко І.Є., Нагнибедюк В.В., Вашенко І.В., Войшцъкий В.М. Транспорт Са2+ в ентероштгах тонкої кишки при дії сублетальних доз іонізуючої радіації. - Київ: “ВІПОЛ”, 1996. - 44с.

2. Хижняк С.В., Коваленко І.Є., Вашенко І.В., Войиіцький В.М. Вплив іонізуючої радіації на транспортні властивості мембрани щіткової кайми тонкого кишечника // Укр. біохім. журн. - 1995. - Т.67, №4. -С.53-56

3. Вашенко І.В., Хижняк С. В., Нагнибедюк В.В., Воціцьшій В.М. Структурні зміни апікальної мембрани ентероцитів в результаті впливу рентгенівського випромінювання //Укр. радіолог, журн.- 1996, №1. -С.11-15.

4. Hizhnyak S.V., Kovalenko I.E., Stepanov Y.V., Vashenko I.V., Voitsitsky V.M. Changes of calcium fluxes in small intestine induced by ionising radiation // Abstr. Inter. Symp. “Biological mobility”, Moscow, 1994,- P. 135.

5. Хижняк C.B., Степанова Л.І., Преображенская Т.Д., Ващенко І.В. Фізико-хімічний стан мембран щіткової кайми тонкого кишечника щурів в результаті дії іонізуючого випромінювання // Тези 1-го з’їзду Українського біофізичного товариства (20-24 червня 1994р.). - Київ: В-во Киів. у-ту. 1994. - С.244.

Аннотация.

Ващенко И.В. Сгруктурно-функцнональное состояние плазматической мембраны энтероцитов тонкого кишечника после воздействия ионизирующей радиации (рукопись).

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по спецальности 03.00.08 - радиобиология.

Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 1997.

Защищается диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук, основные положения которой изложены в 5 научных работах. В диссертации содержатся данные о воздействии ионизирующей радиации в дозах 0.5; 1,0; 2,0 и 3,0 Гр на структурнофункциональное состояние плазматической мембраны энтероцитов тонкого кишечника.

Установлено:

- изменение структуры поверхностного слоя плазматической мембраны с помощью флуоресцентного зонда АНС;

- структурные перестройки белковой компоненты и изменение пространственной организации белково-липидных комплексов плазматической мембраны энтероцитов тонкого кишечника;

- радиационно-индуцированные нарушения трансмембранного переноса Са2+ в энтероцитах тонкого кишечника за счет увеличения проницаемости плазматической мембраны для данного иона, повышение Са2+-связывающей способности апикальных мембран, а также угнетения активного транспорта базолатеральными мембранами приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+.

Summary.

Vashchenko I.V. Structural-functional state of plasma membranes enterocites of small intestine after ioni2ing radiation exposure (manuscript).

The tesis for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences (speciality 03.00.08 - radiobiology). Institute of experimental pathology, oncology and radiobiology of Ukraine NAS, Kiev, 1997.

The tesis for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences is defended. The results of this tesis are expose in 5 scientific publication. They have data on effect of ionizing radiation in doses 0,5; 1,0; 2,0 and 3,0 Gy on structural-functional state of plasma membranes enterocites of small intestine. Setting.

- the change of surfase of plasma membrane with help of fluorescent indicator ANS.

- the structural reconstructions of albumen component and change of space organisation albumen-lipid complexes of plasma membrane of enterocites of small intestine.

- the dictuibanse of transmembran Ca2+ - transfer in enterocites of small intestine by means of increase permeability plasma membrane for this ion, increase of Ca2+-binding ability of apical membrane, and oppression of active transport by basolateral membranes after ionizing radiation exposure. As a result is increase of intercellular concentration of Ca2+.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання, дози, ентероцит, апікальна та базолатеральна мембрани, флуоресцентні зонди, кальцій.