Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация участка ДНК pYT плазмиды, ответственного за синтез фракции 1 чумного микроба

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация участка ДНК pYT плазмиды, ответственного за синтез фракции 1 чумного микроба"

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ УЧАСТКА ДНК рУТ ПЛАЗМИДЫ, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА СИНТЕЗ ФРАКЦИИ 1 ЧУМНОГО МИКРОБА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону - 1996

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители: кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник В. И. Марченков, кандидат медицинских наук, Е.К. Гончаров

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, старший

научный сотрудник И.Г. Дроздов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Сергеева

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследова'тельский

противочумный институт.

Защита состоится "_"_1996 г. в_часов на заседании диссертационного совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан "_" _ 1996г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

3.Л.Девдариани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение молекулярно-генетической организации факторов патогенности чумного микроба имеет большое теоретическое и практическое значение. К настоящему времени можно считать окончательно установленным, что такие факторы патогеннос-ти чумного микроба, как зависимость роста от ионов Са++ при температуре роста 37° С, V и W антигены, белки наружной мембраны, фракция 1 и "мышиный" токсин имеют плазмидную локализацию.

Клетки возбудителя чумы, как правило, обладают тремя плазми- . дани: pYP, pYV и pYT отличающимися как по своим размерам, так и по роли кодируемых продуктов в физиологии бактерий и развитии инфекционного процесса (Проценко O.A.с соавт., 1981,1983; Ben-Gurion R. et al.,1981; Ferber D.H. et al.,1981). В связи с молекуляр-но-генетическими особенностями и детерминируемыми факторами вирулентности основное внимание уделялось изучению pYP и pYV плазми-дам, а высокомолекулярная плазмида pYT оставалась изучена недостаточно. К моменту начала нашей работы было известно, что её молекулярная масса составляет 55-65 Md и что она детерминирует синтез "мышиного" токсина и капсульного антигена Fl (Проценко O.A. с соавт., 1983). Поэтому, исследования в данном направлении представляли значительный научный и практический интерес.

Цель работы. Изучение структурно-функциональной организации pYT плазмиды и участка ДНК, ответственного за синтез капсульного антигена Fl чумного микроба.

Основные задачи исследования.

1. Рестрикционный анализ pYT плазмиды чумного микроба.

2. Построение рестрикционной карты pYT плазмиды.

3. Молекулярное клонирование гена фракции 1 и его локализация на физической карте pYT плазмиды.

4. Изучение продукции фракции 1 в гетерологичных системах.

5. Конструирование ДНК-зонда на основе структурного гена фракции!..

' 6. Изучение pYT плазмид атипичных (Fra") штаммов чумного микроба.

Научная новизна.

1. Построена рестрикционная карта pYT плазмиды штамма Y. pestis EV-76 для эндонуклеаз: BamHI.Xhol.BstEII,Smal.EcoRI и Hindlll.

2. Локализован структурный ген фракции 1 на pYT плазмиде.

3. Создана серия рекомбинантных плазмид на основе векторных молекул pBR-322, pUC-128 и фрагмента плазмиды pYT детерминирующего синтез фракции 1.

• 4. Сконструированы рекомбинантные штаммы Y. pseudotuberculosis и Е. coli - продуценты капсульного антигена чумного микроба.

5. Получены данные об экспрессии генов Гга-оперона в гетерологичных системах.

6. Сконструирован ДНК-зонд на основе структурного гена фракции 1 чумного микроба.

7. Изучен состав и структурная организация плазмид из четырёх атипичных-штаммов чумного микроба.

Практическая значимость.

1. В результате выполнения работы сконструированы штаммы Y. pseudotuberculosis и Е.coll - продуценты фракции 1. Штаммы продуценты капсульного антигена F1 депонированы в музее живых культур РНИПЧИ "Микроб" под номерами КМ40 - Е. coli JM103 рМВ-15 и КМ4 - Y. pseudotuberculosis рМВ60-3

2. Сконструирован ДНК-зонд на основе структурного гена фракции 1.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Построена рестрикционная карта плазмиды pYT из штамма Y. pestis EV-76/3 с использованием эндонукпеаз BamHI, Xhol, BstEII, Smal, EcoRI и Hindlll, на которой локализован структурный ген

фракции 1 чумного микроба.

2. Получена серия рекомбинантных молекул рМВбО, рМВ60/3. рМВ60/4. рНВ60/9 и рНВ15 детерминирующих синтез фракции1.

3. Генетическая информация Гга-оперона по разному реализуется в клетках Б.coll. Y.pseudotuberculosis 1292 и Y.pestis PKR133.

4. Показано наличие в плазмиде pYT двух участков ДНК влияющих на репрессию и термозависимый характер синтеза фракции 1.

5. Сконструированный ДНК-зонд позволяет идентифицировать клетки чумного микроба, содержащие структурный ген фракции!.

6. Изученные атипичные Fra" штаммы чумного микроба содержат структурный ген фракции 1.

7. Клетки штамма Y.pestis М16 содержат в своём составе высокомолекулярный репликон длиной около 100 тыс. н.п. по своей структуре отличной от плазмид pYV и pYT клеток Y.pestis EV-76.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на научных конференциях РПЧИ (1989,19S0,1S92.1994г.}, на областной научной конференции молодых учёных "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" Ростов-на-Дону, 1989, научной конференции "Бактериальные плазмиды" Нальчик,1990, Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" Волгоград, 1992.

Публикации. Основное содержание работы отражено в четырёх опубликованных работах. Список публикаций приводится в конце автореферата.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописи, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, трёх глав собственных исследований, заключения, выводов. Текст иллюстрирован 7 таблица-

ми и 19 рисункаш. Список литературы включает работы 146 авторов.

СОДЕРЖАНИЕ Р/1Б0ТЫ 1.Материалы и методы

В работе были использованы 10 штаммов Y.pestis, 9 штаммов Y.pseudotuberculosis и 5 штаммов Е.coli.

Из бактериальных клеток плазмидную ДНК выделяли методом Birnboim, Doly (1979) с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цезия-бромистого этидия.(Маниатис, Фрич. 1984.). Для скрининга бактериальных штаммов использовали метод С. I.Kado (1981).

В ходе работ, связанных с рестрикцией плазмидной ДНК, клонированием, трансформацией бактерий, введением меченных згР-нуклео-зидтрифосфатов в ДНК, ДНК-ДНК гибридизацией пользовались общепринятыми методическими приёмами (Маниатис, Фрич, 1984).

Разделение фрагментов ДНК проводили с помощью электрофореза в 0,7%-1% гелях агарозы (Bio-Rad) и 5% полиакриламидном геле, в случае разделения низкомолекулярных фрагментов ДНК. Для эффективного разделения высокомолекулярных фрагментов ДНК использовали системы электрофореза в пульсирующем электрическом поле фирм LKB и H0EFER (США). Гибридизацию нуклеиновых кислот в агарозном геле проводили по методу представленному в работе Smiley G.S.(1983).

Для выявления фракции 1 использовали стандартные серологические реакции (РНГА,РТНГА), реакцию диффузионной преципитации (Oucliterlony 0., 1949).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле осуществляли методом диск-электрофореза (Laemeli,1970). Иммуноблотинг проводили по методу Towbin (1979).

- 7 -

2. Результаты и обсуждение.

В качестве изучаемого объекта была выбрана плазмида рУТ из штамма У.pestis EV-76/3 (рУТ*. pYV", рУР". Fra\ Тох+). На первом этапе работы, используя метод рестрикционного анализа, была определена чувствительность рУТ плазыиды к следующим эндонуклеазам рестрикции: BainHI. Xhol, BstEII, Sinai, EcoRI, Pstl, Hindlll, Clal и SalGI. Размер плазмиды, вычисленный по результатам определения количества и величины фрагментов ДНК, составил 96 тыс. н.п.. Дан-.< ные о фрагментах ДНК, образующихся при расщеплении плазмиды рУТ, каждой из указанных выше рестриктаз, представлены в таб.1.

Сравнение результатов определения количества и размеров фрагментов ДНК рУТ плазмиды штамма Y.pestis EV-76/3 и данных по гидролизу токсиновой плазмиды из штамма Y.pestis А1122, опубликованных Шишкиной'0.Г. с соавт.(1988) показало, что число рестрик-тов эндонуклеаз Sinai, EcoRI, Pstl и SalGI совпадает, незначительно различаясь в оценке величины фрагментов. В то же время, результаты по гидролизу плазмид рестриктазой HindiII имеют значительные отличия, как в количестве образовавшихся фрагментов, так и в их размерах. Проведённый анализ указывал как на схожесть, так и на различия в структурной организации рУТ плазмид в штаммах Y.pestis EV-76/3 и Y.pestis А1122. Более того анализируя гидроли-заты плазмиды рУТ, выделенной из штамма Y.pestis EV-76/3 в разное время, были выявлены изменения картины гидролиза по рестриктазе HindllI. Не исключено, что причиной таких изменений является транслокация в пределах репликона фрагмента ДНК, содержащего сайт расщепления Hindlll. Похожими свойствами обладает мигрирующий элемент IS—101 обнаруженный Филипповым с соавт. (1990) на плазми-де pYV чумного микроба.

После определения чувствительности pYT плазмиды к различным

Таблица 1.

Число и размер фрагментов ДНК (п.н.) образующихся при расщеплении плазмиды рУТ различными эндонуклеазаыи рестрикции.

BainHI Xhol BstEII Smal Hind* III EcoRI Clal Pst SalGI Hind* III

1 96000 45700 67500 47100 37450 58100 26000 18500 16500 37450

2 28100 19800 18000 15Î00 11100 11200 9700 14000 27600

3 22200 6500 18000 14100 9200 8000 8000 9700 13000

4 2200 6000 13400 8800 7300 6200 6400 9700

5 5000 9700 3400 5800 5300 6000 3000

6 1600 2400 1950 4900 4400 4600 2400

7 300 1600 1500 4400 4350 4500 1600

8 1150 1150 4100 4350 4100 1150

9 1100 800 3800 3700 3900 1100

10 3700 3700 3700

11 3600 3400 3700

12 3600 3200 3700

13 3000 2900 2800

14 2000 2700 2100

15 1700 2500 1500

16 1150 2400 1500

17 780 2300 1250

18 780 1900 1250

19 1800 1150

20 1650 1000

21 1000 1000

22 900 900

23 800

* HindiII гидролизаты pYT плазмиды выделенной в разное время из штамма Y.pestis EV - 76 (Fra*,Tox+).

эндонуклеазам рестрикции была построена её рестрикционная карта с использованием эндонуклеаэ: BamHI, Xliol, BstEII, Smal. EcoRI и Hindlll (рис.1).

Для решения вопроса о локализации гена фракции 1 на pYT плазмиде мы осуществили молекулярное клонирование данного антигена. В результате клонирования была получена рекомбинантная молекула рМВ-60, вызывающая синтез фракции1 в клетках Y. pseudotuberculosis (рис.2). Однако, полученная рекомбинантная плазмида рМВ-60 была нестабильна в клетках Y. pseudotuberculosis 1292 6а-2, так как из клонированного Pstl-PstI участка выщеплялись фрагменты ДНК различной величины.

Структурная нестабильность в клетках штамма Е.coli 803 ре-комбинантной плазмиды, содержащей гены фракции!, была показана в работе Маркулина И.В. с соавт.(1991). Инактивация гена фракции! в клетках E.coli 803 происходила в основном за счёт встраивания вставочных последовательностей. В клетках штаммов Y.pestis EV-76 (pYT~) и Y.pseudotuberculosis та же гибридная плазмида проявляла структурную и сегрегационную стабильность при многократных пересевах и хранении культуры.

Вероятно, стабильность рекомбинантных плазмид, детерминирующих синтез фракции1, зависит как от клетки хозяина, так и от структуры клонированного фрагмента.

Из образовавшихся делеционных вариантов исходной плазмиды рМВ-60 была отобрана плазмида рМВ-60/3. В клетках штамма Y. pseudotuberculosis 1292 6а-2 плазмида рМВ-60/3 стабильно наследовалась в процессе пассирования культуры без изменения её структуры и способности вызывать в клетке-хозяине синтез капсульного антигена. Клетки Y. pseudotuberculosis с плазмидой рМВ-60/3, продуцируют капсульный антиген при температуре выращивания культуры 28 и

- ю -

Рис. 1..Физическая карта плазмиды pYT штамма Y.pestis EV76/3

Xhol

HlndHI BstEII

EcoRI BstEII

BstEII

Xhol

BamHI HindlH

Smal _ EcoRI ——^

EcoRI

HindlH , EcoRI _ BstEII HindlH EcoRI

EcoRI

HindlH

EcoRI EcoRI

Smal HindlH

Smal

37 градусов.

Для локализации участка ДНК кодирующего фракцию1, были получены различные делеционные варианты плазмиды рМВ-60/3 (рис.2). Было установлено, что клетки Y.pseudotuberculosis 1292 6а-2 содержащие в своём составе плазмиды, лишённые одного или другого Xbal-Xbal фрагмента, фракцию1 не синтезировали. Из этого следовало, что на Xbal-Xbal фрагментах располагается участок ДНК детерминирующий синтез капсульного антигена, (рис.2).

На основании полученных результатов на физической карте pYT плазмиды был локализован участок ДНК детерминирующий синтез фракции! (рис.1).

Для синтеза фракции 1 в клетках кишечной палочки необходимо присутствие генов cafl, caflM, caflA, и caflR (Galyov Е.Е. et al., 1990, 1991; Karlishev А.V. etal., 1992). В случае нарушения генов caflR или саПМ, прекращается синтез фракции 1 в клетках Е.coll. В то же время, результаты приведенные Анисимовым А.П. с соавт. (1992) свидетельствуют о том, что плазмида с дефектным геном саПМ обеспечивает как в Y. pestis, так и в Е. coli синтез серологически атипичных вариантов капсульного антигена.

Анализ структуры рекомбинантных молекул рМВ-60/3, рМВ-60/4. и рМВ-60/9 показал, что они имели повреждённый ген caflR, а реком-бинантная плазмида рМВ15 имеет только гены cafl, caflА и частично делетированный ген caflM. Наличие этих плазмид позволило провести изучение экспрессии фракции 1 в гетерологичных системах и установить влияние отдельных генов fra-оперона на синтез капсульного антигена (табл. 2.).

В результате проведённой работы были получены экспериментальные данные свидетельствующие о различном влиянии генов caflR и caflM на экспрессию фракции 1 в гетерологичных системах. На мо-

р 1—

Рис. 2. Рестрикционные карты рекомбинантных молекул.

Бт В рМВбО.

Е / , Бт

_I_\иР

рВ1?322 1кЬ

8га Нр

Нр В Е Вё Bg

К Бй Е

1р В

X С/ С X (Н Тх |Вз I Е С/

5 Бт

ЛI у \

рВИ322

рМВбО/3 делеции

рМВбО/4 рМВбО/5 рМВбО/б рМВбО/7 рМВбО/8

1кь

12. 5кЬ

Во Bg

Bg Bg К

X X X Ве Bg к I

X X Bg Bg к к

X X Bg Bg к к

Бт Нр Нр В К /X С/ С X I Н I X | ВатН1 ? ^ / ! 1 ■Р

Нр В Е

рМВбО/9

рМВ15 1кЬ

Бт X Нр \А Нр В

Р | ЯУ / / , С О ■ В С\\ / Н I С Н №

, 1 Ч Г ( ( р^в

Ьа с!'

са!1

саИМ

Обозначения рестриктаз: В-ВатН1, Р-РбИ, Бт-Бта1, Х-ХЬа1, Нр-Нра1, С-С1а1, 0-0га1. А-Асс1,' Иу-ЕсоИу, К-Крп1. Бя-БаШ!,

вз-вз1ЕП, Вё-Веш, н-н1паш. '

дели клеток У.резЫэ РКН133 удалось показать влияние определённых фрагментов плазмидной ДНК на репрессию и термоиндукцию фракции 1.

Таблица 2. Особенности экспрессии Фракции 1 в гетерологичных системах, детерминируемой различными рекомбинантными молекулами.

Клетка хозяин рМВбО/3 рМВбО/4 рМВбО/9 pMBl 5

28° 37° 28° 37° 28° 37° 28° 37°

У.pseudotuberculosis 1292 + + + + + + X X

Y.pestis PKR133 - - - + + + + X

E.coli НВ101, JM103, DH5c( + X

х-синтез фракции 1 не происходит, клетки после первого пересева теряют плазмиду.

Рекомбинантная плазмида рМВ-60/3 с повреждённым геном саГШ, была не способна вызывать синтез фракции 1 в клетках штамма У.реБиэ РКЯ 133. Клетки У.резЦз РК[* 133 начинали синтезировать Фракцию 1 при температуре роста культуры 37 после передачи им рекомбинантной плазмиды рМВ-60/4 (рис.2). На основании этих результатов можно было говорить о наличии механизма репрессии синтеза фракции 1, в котором принимает участие Ве1III фрагмент плазмидной ДНК.

Дальнейший анализ зависимости синтеза фракции 1 от структуры рекомбинантной плазмиды позволил выявить фрагмент ДНК влияющий на термоиндуцибельный синтез капсульного антигена. Так, в результате делеции ЕсоИ1 - В£1П Фрагмента, приводящей к образованию рекомбинантной плазмиды рМВ60/9 клетки У. реэНэ РКИ133(рМВ60/9) приобретают способность синтезировать фракцию 1 при температуре роста 28° и 37°.

Выявленные особенности синтеза фракции 1 в клетках У.реаНБ РКИ133 свидетельствовали о наличии сложного механизма регуляции,

дальнейшее изучение которого представляет значительный интерес.

После изучения особенностей синтеза фракции 1 в гетерологич-ных системах была проведена работа по характеристике фракции 1 синтезируемой клетками Е.coli. Рекомбинантная плазмида рМВ15 с частично повреждённым геном caflM и не имеющая ген caflR вызывала синтез фракции 1 в клетках Е.coli DH5ü, НВ101, С600 и JM-103. Клетки штамма Е.colIDH5ot/pMB15 продуцировали наибольшее количество фракции1.

Капсульный антиген Fl, продуцируемый клетками Е.bol 1 DH5«/ рМВ15, детектировался в РДП и РПГА в титре 1:16400. Результаты электрофоретического разделения клеточных белков, свидетельствовали о том. что клетки рекомбинантного штамма штамма Е.со-liDH5tf/pMB-15 в отличии от контроля (Е.coli DH5c( pUC-128) синтезируют дополнительный белок. Его идентичность •субъединице кап-сульного антигена была подтверждена иммуноблотингом с антифракционной сывороткой. Процентное содержание фракции 1 в клетках бульонной культуры Е.coli DH5e( рМВ-15, вычисленное на основании ден-ситограмм, составляло около 2,4%, а в бульоне И % . В клетках же чумного микроба содержание фракции 1 достигает приблизительно 15%. Таким образом, количество фракции 1 синтезируемое клетками чумного микроба превышало содержание фракции 1 в клетках рекомбинантного штамма Е.coliDH5ü рМВ15.

Принимая во внимание более быстрое размножение клеток кишечной палочки и возможность получения бульонных культур с плотностью до 7x10° м.к./мл. полученный рекомбинантный штамм E.coll DH5ä/pMB15 можно использовать как продуцент фракции 1.

Полученные нами результаты и данные литературы свидетельствовали, что изменение в регуляторных генах ira оперона могут приводить к синтезу Фракции 1. которая не тестируется с помощью ком-

мерческих иммунодиагностикуыов в РДП и РПГА (Черепанов П.А. с со-авт.,1991; Анисимов А. П. с соавт.,1992) или же к полному прекращению синтеза капсульного. антигена F1 (Galyov Е.Е. et al.,1990, 1991; Karlishev A.V. et al.,1992). Исходя из этих фактов можно . было предполагать, что появление в природных очагах атипичных Fra" штаммов чумного микроба, а также штаммов чумного микроба со сниженной продукцией фракции1 связано с структурными перестройками области Гга оперона на pYT плазмиде.

Одним, из подходов позволяющим изучить структурные изменения изучаемой области pYT плазмиды, является ДНК гибридизация с зондами на основе генов fra оперона. Для этих целей был получен ДНК зонд на основе гена cafl. Полученный зонд представлял собой участок структурного гена cafl длиной 196 н.п..

ДНК - зонд на основе гена cafl гибридизовался с ДНК клеток ' Y.pestis EV 76 и Y.pestis 231. Препараты ДНК из pYT" штаммов Y.pestis 556 Otten, PKR133 и МКР с ДНК зондом не гибридизовапись, что указывало на отсутствие структурного гена cafl в геноме этих микроорганизмов. ДНК зонд также не гибридизовался с ДНК клеток Y.pseudotuberculosis (I.III. V сероваров), и с препаратом ДНК клеток Е.coli DH5a pUC-128. Следовательно, с помощью полученного ДНК зонда можно определять в геноме микроорганизмов наличие гена cafl, а также проводить дифференциацию клеток Y.pestis и Y. pseudotuberculosis I. Ill, V сероваров.

После получения ДНК зонда на основе гена cafl была проделана работа по изучению возможных причин отсутствия синтеза фракции 1 в атипичных Fra" штаммах чумного микроба. В музее были отобраны четыре штамма чумного микроба, которые содержали pYT и pYP плазмиды. Выбранные штаммы были выделены на территориально разобщённых природных очагах, в разное время и из различных объектов.

Отобранные штаммы также различались по способности синтезировать мышиный токсин, что свидетельствовало о различной степени структурных изменений в участках pYT плазмид, кодирующих эти признаки.

Информация о различиях в структуре высокомолекулярных репли-конов бала получена в результате сравнительного рестрикционного анализа плазмидных препаратов, с последующей гибридизацией с ДНК зондом на основе структурного гена cafl. Картина гидролиза высокомолекулярных плазмид из штаммов Y.pestis 16-К, С127, 213 и М16 очень сильно отличалась от плазмиды pYT Y.pestis EV-76. Эти отличия заключались в количестве и величине EcoRI-EcoRI фрагментов ДНК, образовавшихся в результате гидролиза. Так, плазмида pYT из штамма Y.pestis EV-76 образует девять EcoRI-EcoRI фрагментов, в то время как плазмиды из штаммов Y.pestis 16-К, С127, 213 и М16 расщепляются более чем на 20 фрагментов табл.3. Большинство Есо-RI-EcoRI фрагментов высокомолекулярных плазмид из штаммов Y.pes-tis 16-К, С127, 213 и М16 имели одинаковую электрофоретическую подвижность, что указывало на схожесть их структуры. Характер гидролиза плазмиды из штамма Y.pestis М16 свидетельствовал о наличии дополнительного высокомолекулярного репликона по своей структуре отличной от плазмид pYV и pYT из клеток Y.pestis EV/76.

Анализ EcoRI-EcoRI фрагментов образовавшихся в результате гидролиза изучаемых плазмидных препаратов, показал отсутствие в высокомолекулярных плазмидах из штаммов Y.pestis 16-К, С127 и 213 фрагмента EcoRI-EcoRI длиной 9200 п.н., на котором располагается fra оперон. Следовательно, прекращение синтеза фракции 1 в этих штаммах можно было связывать с отсутствием или структурными перестройками фрагмента ДНК, кодирующего генетическую информацию о фракции 1. Только в плазмидном препарате из штамма Y.pestis М16 содержался фрагмент EcoRI-EcoRI длиной 9200 п.н.. Его присутствие

Таблица 2. Число и размер (в п.н.) фрагментов ДНК в EcoRI гид-ролизатах суммарных плазмидных препаратов из штаммов Y.pest'is.

Y.pestis EV76 плазмиды pYP pYV pYT Y.pestis

EV76/3 16-K C127 213 1116(1179)

1 58000 58000 58000

2 23000 23000 23000 23000

3 16000 16000

4 14000 14000 14000 14000

5 12000 12000 12000 12000

6 11100 11100 11100 11100 11100 11100

7 10200 10200 10200 10200

8 9800 9800 9800 9800

9 9200 9200 9200

10 8800 8800 8800 8800 8800

11 7800 7800 7800 7800

12 7600 7600

13 6800 6800 ' 6800 6800 6800

14 5900 5900

15 5200 5200 5200 5200

16 5000 5000 5000 5000

17 4300 4300 4300 4300

18 4000 4000

19 3550 3550

20 3500 3500 3500 3500

21 3400 3400 3400 .

22 3300 3300

23 3000 3000

24 2800 2800 2800

25 2700 2700

26 2300 2300

27 2100 2100

28 2000 2000

29 1950 1950 1950

30 1500 1500 1500

31 1400 1400 1400 1400 1400

в клетках свидетельствовало о наличие рУТ плазмиды в клетках и определяло Гга" фенотип штамма У. резИэ М16.

ДНК гибридизация показала присутствие структурного гена са£1 в продуктах гидролиза плазмидных препаратов, так в случае штаммов У.резЧэ ЕУ-76, С127 и М16 ДНК-зонд гибридизовался с ЕсоИЬЕсоЫ фрагментом рУТ плазмиды величиной 9200 п.н.. а в гидролизатах плазмидных препаратов из клеток У.резШ 16-К, и 213 с ДНК-зондом гибридизовались ЕсоИ-ЕсоМ фрагменты величиной 9800 п.н.(16-К) и 23000 .п.н.(213). Выявленные различия в фрагментах, несущих генетическую информацию о синтезе фракции 1. могут являться причиной отсутствия капсульного антигена в клетках штаммов У.реБИБ 16-К, и У.резЦэ 213.

Эти выводы были сделаны на основании результатов, полученных с помощью методических приёмов позволяющих выявлять только некоторые структурные перестройки плазмид, что не исключает возможности существования и других изменений, приводящих к нарушению фенотипического проявления генетической информации расположенной на плазмидах чумного микроба. Тем не менее, полученные результаты дают представление о составе и структурной организации плазмид нескольких атипичных (Рга~) штаммов чумного микроба, а также в некоторой степени объясняют причины нарушения синтеза капсульного антигена П.

ВЫВОДЫ

1. Построена рестрикционная карта плазмиды pYT из шташа Y.pestis EV-76/3 с использованием эндонуклеаз BamHI. Xhol, BslEII, Sinai, EcoRI и Hindlll, на которой локализован структурный ген фракции 1 чумного микроба.

2. Отмечено изменение характера гидролиза pYT плазмиды штамма Y.pestis EV-76/3 для эндонуклеазы Hind III, что указывает на структурные перестройки данного репликона.

3. Получена рекомбинантная плазмида рМВ-60, которая обеспечивала синтез фракции 1 в клетках шташа Y.pseudotuberculosis 1232 6а-2. Создана серия рекомбинантных молекул рМВ60/3. рМВ60/4, рМВ60/9 и рМВ15 представляющих собой различные делеционные варианты исходной плазмиды рМВ-60.

4. Установлено, что в зависимости от клетки хозяина рекомбинант-ные молекулы рМВ60/3, рМВ60/4, рМВ60/9 и рМВ15 по разному реализуют генетическую информацию £га-оперона.

5. Рекомбинантные молекулы рМВ60/3, рМВ60/4 и рМВ60/9 имеющие повреждённый ген caflR сохраняли способность вызывать синтез фракции 1 в клетках У. pseudotuberculosis 1292 6а-2, в то время как клетки кишечной палочки содержащие аналогичные плазмиды. Фракцию 1 не синтезируют.

6. Показано наличие в плазмиде рУТ двух участков ДНК влияющих на экспрессию фракции 1. Один из них расположен в области Bglll-Bglll фрагмента и вызывает репрессию синтеза фракции 1. Другой участок регулирует термозависимый характер синтеза Фракции 1. Его удаление делает возможным синтез фракции! в клетках Y.pestis PKR133 при температуре роста 28°.

7. Сконструирована рекомбинантная плазмида рМВ15 придающая клет-

нам E.coli HB101, C600, JM103 и DH5ü способность синтезировать Фракцию 1 при температуре роста 28°. Наибольшим количеством синтезируемой фракции!, характеризовались клетки штамма E.coli DH5cí. Содержание фракции1 внутри клеток составляло 2,4%, а в бульоне eè количество доходило до 11%. Клетки рекомбинантного штамма не формировали капсулу, что вероятно связано с отсутствием гена caflR и частичным повреждением гена caflM.

8. На основе структурного гена cafl сконструирован ДНК-зонд.

9. Показано отсутствие в геноме клеток Y.pestis PKR133, Y.pestis МКР и Y.pestis 556 Otten структурного гена фракции 1. Установлено, что в плазмидных препаратах атипичных штаммов чумного микроба, проявляющих фенотип Frа", имеется ген саП. Отсутствие синтеза фракции1 в изученных штаммах связано с увеличением длины EcoRI-EcoRI фрагмента, содержащего ira оперон.

10.На примере штамма Y.pestis М16 показана возможность присутствия в клетках высокомолекулярного репликона длиной около 100 тыс. н.п. по своей структуре отличной от плазмид pYV и pYT клеток Y.pestis EV-76.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ 110 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Марченков В.И. Физическое картирование плазмиды pYT чумного микроба. // Эпидемиология,микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций: - Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону,1989. -С.144.

2.Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Марченков В.И. Локализация генов "мышиного" токсина и капсульного антигена Fl на плазмиде pYT чумного микроба. // Бактериальные плазмиды: - Тезисы докладов. -Нальчик, 19S0. - С. 41-43.

3. Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Марченков В.И. Изменение структуры плазмиды pYT штамма EV-76 чумного микроба.// Сб. Генетика и биохимия вирулентности возбудителей 00И. Материалы Российской научной конференции. Волгоград, 1S92.- С. 33.

4. Гончаров А.Ю., Гончаров Е.К., Алутин И.М., Марченков В.И. Локализация ответственного за синтез фракции 1 участка ДНК на плазмиде pYT чумного микроба.// Молекулярная генетика микробиология и вирусология.-1992.- N.11-12,- С.10-14.