Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация гипервариабельных участков ДНК и метилирование индивидуальных генов при онкогенезе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация гипервариабельных участков ДНК и метилирование индивидуальных генов при онкогенезе"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ

РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО

ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени

лп М.В.ЛОМОНОСОВА

,'1 О 1'Л

На правах рукописи

11 НОЯ 193о УДК 547.963.32

АЛЯБОВ ЮРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНЫХ УЧАС1 КОВ ДНК И МЕТИЛИРОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ГЕНОВ ПРИ

ОНКОГЕНЕЗЕ

(03.00.03 — Молекулярная биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1996 г.

Работа выполнена в межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории им. Белозерского МГУ и лаборатории молекулярной генетики мозга

Т ТТ ТПП Т~» А 1 1 Т Г

Пф Ю ГЛ1У1П.

Научные руководители:

доктор биол. наук, проф. ВАНЮШИН Б.Ф., канд. биол. наук, РОГАЕВ Е.Е., канд. биол. наук, АШАПКИН В.В.

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится "....."................. 1996 г.

в...............................................................................................

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ (Москва, Воробьевы торы, МГУ)

Автореферат разослан "....."................. 1996 г.

Ученый секретарь

^.аГра-ааи^ £

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Поиск генетических изменений, сопровождающих, а возможно, и являющихся причиной опухолевой трансформации, является одной из основных задач молекулярной биологии канцерогенеза. Решение этой задачи может помочь не только углубленному пониманию механизмов процесса малигнизации, но и указать путь к более эффективному воздействию на опухоль и ранней диагностике болезни, что имеет огромное практическое значение. Кроме того, опухолевые клетки являются удобной моделью для изучения некоторых биологических процессов, не столь выраженных в норме. Примером одного из таких процессов может быть изменение уровня метилирования ДНК и, как следствие этого, изменение уровня транскрипции ряда генов, что в свою очередь может приводить к проявлению опухолевого фенотипа.

В последнее время были получены данные, касающиеся метилирования ряда индивидуальных генов, и, в особенности, онкогенов, однако, слабо изученным остается вопрос о динамике злокачественного перерождения, что включает изучение как аденом (предопухо-левая стадия), так и метастазов (прогрессирующая стадия). Восполнить, хотя бы частично, этот пробел и призвана настоящая работа.

Кроме изучения уровня метилирования, весьма интересным представляется изучение на тех же модельных системах (аденома, опухоль, метастаз, нормальная ткань) модификаций генетического аппарата клетки с помощью зондов, гомологичных гипервариабельным, теломерным и околотеломерным семействам повторов ДНК человека. Первый из них, полученный в лаборатории молекулярной генетики мозга Научно-исследовательского центра психического здоровья АН России, является чрезвычайно информативным в силу высокого уровня гетерозиготности и успешно использовался ранее в криминалистических и популяционных исследованиях. Зонды, гомологичные теломерным повторам, также являются весьма информативными и могут отражать уровень модификации ДНК при различных заболеваниях и старении.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение генетических модифи

котшй mvmrvnA ottihy -act лгпг>пн<» TiAarTprviR трлпмрпныу и пьгплгутелп

---^----1 --I--------г-,---у------J [-------------I -- --------i-

мерных повторов, гипервариабельных минисателлитов, а такж на уровне отдельных генов.

Для достижения поставленной цели решали следующи задачи:

1. Создание банка ДНК и тканей онкологических больных i их родственников, пригодных для медико-генетических исследова ний на молекуляронм уровне. Банк включает коллекции ДНК i тканей опухолей различных стадий, аденом, метестазов, нормальны тканей, регионарных и отдаленных лимфоузлов и лейкоцито перифирической крови.

2. Рестрикция и блот-гибридизация ДНК с гипервариабель ным зондом red. 2 и оценка частоты возникающих соматически мутаций.

3. Рестрикция и блот-гибридизация препаратов ДНК с олигс нуклеотидами, гомологичными теломерным и оклотеломерньп повторам в геноме человека.

4. Рестрикция парой изошизомеров Hpall-Mspl, чувствителг ной к метилированию цитозина в сайте CCGG и блот-гибридизаци фильтров с участком онкогена c-Ha-ras.

Научная новизна

Показано, что при опухолевой трансформации наблюдаете изменение в гипервариабельном локусе в опухолевой ткани, по cpai нению со всеми остальными тканями. Однако, подобные изменени зафиксированы только в очень небольшом проценте случаев с общего числа. При этом в тканях, представляющих пред- и пост опухолевые изменения, не наблюдалось подобных модификации

Обнаружено, что при злокачественном перерождении ткане наблюдается редукция кластеров семейств теломерных и околс теломерных повторов ДНК, причем подобные изменения был

ярче выражены в опухолях эндометрия, чем в опухолях толстой кишки. Проведено сравнение степени редукции кластеров тело-мерных и околотеломерных повторов на разных стадиях опухолевого процесса.

Выявлен полиморфизм "внутренних семейств" теломерных повторов ДНК и мутации в некоторых из них.

Обнаружено, что степень метилирования НраП-фрагментов в непосредственной близости от УТЯ-области гена с-На-гав примерно одинакова как опухолевых, так-и для нормальных клеток. При этом не наблюдалось структурных перестроек этой области в процессе малигнизации.

Научно-практическое значение

Создан высокорепрезентативный банк ДНК и тканей онкологических больных и их родственников, пригодных для молекулярно-биологических и генетических исследований процессов., канцерогенеза. Банк включает ДНК и ткани опухолей толстого кишечника различных стадий, нормальной слизистой тех же индивидов, аденом, метастазов, регионарных лимфоузлов и лейкоцитов, а также аналогичные стадии опухолей эндометрия и желудка — всего около 700 человек, включая здоровых родственников.

Полученные в работе данные позволяют применять гипервариабельные и теломерные зонды для картирования некоторых участков ДНК при определенных формах патологий, а также и в диагностике злокачественных заболеваний.

Данные об уровне метилирования ДНК в опухолях толстой кишки и эндометрия могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли этого процесса в функционировании генома в нормальных и трансформированных тканях.

Апробация работы

Материалы работы были доложены на II Международной конференции по ДНК фингерпринтингу в Бело-Хоризоне (Бразилия) в 1992 году, на 1 Всероссийском съезде медицинских генетиков (г. Москва) в 1994 году, а также на совл!естном заседании кафедры

молекулярной биологии МГУ и отдела молекулярных основ онтогенеза межфакультетской ПНИА им. Белозерского. Диссертация апробирована на совместном заседании сотрудников лаборатории молекулярной генетики мозга Центра психического здоровья РАМН и отдела молекулярных основ онтогенеза межфакультетской ПНИЛ им. Белозерского МГУ в 1992 г.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 2 статьях и тезисах трех конференций.

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Список цитированной литературы включает 182 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований

В работе были использованы опухолевые ткани разных стадий развития больных раком толстого кишечника, раком тела матки, раком желудка, здоровые ткани тех же больных, регионарные и удаленные метастазы, аденомы, регионарные лимфоузлы и, в некоторых случаях, лейкоциты периферической крови как больных, так и их родственников. Здоровые ткани брались из того же органа, что й трансформированные ткани, но на значительном удалении от опухоли. Все ткани характеризовались гистологически и хранились до использования в жидком азоте. В ряде случаев были использованы ткани, полученные от умерших больных.

Выделение ДНК из белых клеток крови человека проводила методом, предложенным в лаборатории иммунологии Молдавской: института онкологии.

Выделение ДНК из тканей проводили по модифицированному методу Кирноса М. и др., 1981.

Электрофорез ДНК вели в горизонтальных гелях 0,5-1,5 % агарозы в трис-боратном буфере (ТВЕ): Меченйе ДНК проводили методом случайного праймера, а концевое меченйе осуществляли с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4.

Перенос рестриктных фрагментов ДНК из агарозных гелей осущесвляли по методу Саузерна с небольшими модификациями. Гибридизацию фильтров после переноса по Саузерну проводили, чаще всего используя в качестве зондов ДНК плазмидных вставок, из рассчета 0,5-1,0 мкКю на 1 см поверхности фильтра.

Гибридизацию вели 12-24 часа при 55-65°С. Фильтры отмывали в горячем (55-65°С) 1х растворе ББС (мягкая отмывка) или 0,1х растворе Б5С (жесткая отмывка), содержащими 0,1% БОБ 4 раза по 30 мин (по 500 мл раствора), высушивали на воздухе и проводили экспозицию с рентгеновской пленкой РМ-1 или РТ-1 с усиливающими экранами. Время экспозиции варьировало от 7 часов до 12 суток. Плазмидную ДНК из клеток Е.соИ выделяли методом щелочного лизиса.

Очистку ДНК проводили как описано у Маниатиса с соавт. (1984).

Приготовление компетентных клеток ЕхоН проводили согласно рекомендации фирмы "Ргоп^а ВкЛек".

Обработку плазмидной, фаговой и хромосомной ДНК осуществляли различными эндонуклеазами рестрикции в универсальных буферах:

10 мМ Тп5-НС1, рН 7,5

10 гаМ МЙС1

10 гаМ ЭТТ

без ЫаС1 или с содержанием ЫаС1 50 или 100 мМ, а также в некоторых специальных буферах, в любом случае в соответствии с рекомендациями той фирмы, от которой были получены ферменты.

Электрофорез ДНК вели в горизонтальных гелях 0,5-1,5% ага-розы в трис-боратном буфере (TBE) и трис-ацетатном (ТАЕ) буферах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полиморфизм длин теломерных и

околотеломерных повторов при некоторых

формах канцерогенеза

Картина, получающаяся в результате гидролиза, характеризуется наличием дискретных рестрикционных фрагментов на фоне длинного "шлейфа" по всем трекам (рис. 1). Этот шлейф не является продуктом неспецифической деградации ДНК, поскольку при гибридизации тех же фильтров с зондом red.2 — гипервариабельным участком, гомологичным вирусной последовательности HIV — наблюдались четкие дискретные зоны (рис.2), причем распределение рестрикционных фрагментов при гибридизации с red.2 носило индивидоспецифический характер.

Степень деградации ДНК при гидролизе BsuRI и гибридизации с (TTAGGG)n различалась у разных индивидов, судя по положению участков с максимально интенсивным сигналом на автографе относительно старта.

Кроме того, при гибридизации ДНК с олигонуклеотидом (TTAGGG)n наблюдалось не только появление шлейфов, но и четких дискретных рестрикционных фрагментов. Распределение этих фрагментов не носило тканеспецифического характера и большинство "профилей" у разных исследованных индивидов совпадало.

Особый интерес представляют вновь появившиеся полосы, не имеющие аналогов ни среди тканей других индивидов, ни среди тканей того же индивида. Такие зоны наблюдались у больных №№252, 87 и 54Б. Они, по-видимому, соответствуют соматическим мутациям, происходящим в клетках и затрагивающих теломерные участки или участки, прилегающие к ним.

Результаты гибридизации тех же фильтров с олигонуклеотидом (TTGGG)n приведены на рис.3. При сравнении рис.3 и рис.1

1,10 кЬ

4,50 кЬ 4,75 кЬ 5,10 кЬ

— 11,00 кЬ

130 А Б В Г Е 54 Л Б 119 А Б 153 А Б В 21 А 141107В Г Д 221Б 219 Б В Г

Рис.1. Блот-гибридизация по Саузерну теломерных повторов (ТТАССС)п ДНК нормальных и опухолевых тканей.

Опухоль (рак) толстой кишки — 30, ЗОВ, ЗОГ, 54, 119А, 53

Нормальная слизистая толстой кишки — ЗОА, 54А, 153А, 219В

Лейкоциты крови — 19В, 119, 153Б, 141, 221 Б, 219Б

Аденома - ЗОЕ, 107, 107В, 219

Лимфоузел — ЗОБ, 54Б, 119Б, 153В

Метастаз — 107Г

Неизмененный эндометрий — 21

Стенка кисты яичника — 21 А.

- 1,10 кЬ

4,50 кЬ 4,75 кЬ 5,10 кЬ

- 11,00 кЬ

19В 30 А Б В Г Е 54 А Б 119 А Б 153 А Б В 21 А 141107В ГД221Б 219 Б В Г

Рис.2. Полиморфизм рестршсционных Яес3.2 фрагментов ДНК опухолевых и нормальных тканей больных раком толстой кишки.

Опухоль (рак) толстой кишки. — 30, ЗОВ, ЗОГ, 54, 119А, 53

Нормальная слизистая толстой кишки — ЗОА, 54А, 153А, 219В

Лейкоциты крови - 19В, 119, 153Б, 141, 221 Б, 219Б

Аденома - ЗОЕ, 107, 107В, 219

Лимфоузел — ЗОБ, 54Б, 119Б, 153В

Метастаз — 107Г

Неизмененный эндометрий — 21

Стенка кисты яичника — 21 А.

1— 1,10 кЬ

• 4,50 кЬ ■ 4,75 кЬ - 5,10 кЬ

I- 11,00 кЬ

!30 А Б В Г Е 54 А В 119 А Б 153 А Б Б 21 А 141107В Г Д221Б219 Б В Г

Рис.3. Длина околотеломерных повторов (ССССС)п ДНК опухолевых и нормальных тканей.

Опухоль (рак) толстой кишки — 30, ЗОВ, ЗОГ, 54, 119А, 53

Нормальная слизистая толстой кишки — ЗОА, 54А, 153А, 219В

Лейкоциты кропи - 19В, 119, 153Б, 141, 221Б, 219Б

Аденома - ЗОЕ, 107, 107В, 219

Лимфоузел - ЗОБ, 54Б, 119Б, ИЗБ

Метастаз — 107Г

Неизмененный эндометрий — 21

Стенка кисты яичника — 21 А.

заметны различия в распределении профилей дискретных зон, соответствующих участкам, гомологичным двум семействам тело-тсрпых/скслстело.'лерных облягтей. Так. при гибридизации с зондом (ТТССС)п исчезает большая часть средне и высокомолекулярных зон, характерных для (ТГАССО)п, но появляются новые зоны, распределение которых практически не изменяется от индивида к индивиду. Ткзнеспецифических различий в распределении дискретных зон для зонда (ТГССО)п также не наблюдалось, хотя смещение шлейфа было аналогично смещениям для образцов с (7ТАССО) п в случае трансформированных тканей, по сравнению с нормальной слизистой, но только менее выражено. Очевидно, это явление может отражать характер распределения теломерных участков ДНК в геноме. При этом, сравнивая количество дискретных ресгрикционных фрагментов для обоих семейств зондов, можно предположить, что "внутренние кластеры" этих семейств по-разному организованы в геноме. (ТГАОСС)п имеет, по-видимому, большую распросраненность и его распределение по хромосоме гораздо более "гетерогенно", чем повторов (ТТССС)п. Роль подобных диссеминированных участков не совсем понятна. Возможно, такое распространение облегчает процессы рекомбинации и другие формы межхромосомного обмена, а возможно, это некий молекулярный "атавизм", отражающий ход эволюции молекулярных механизмов в клетке.

Модификации гипервариабельныхучастков ДНК

при некоторых формах канцерогенеза

Поскольку гетерозиготность вобранного зонда ге<1.2 чрезвычайно высока, "профиль" распределения рестрикционных фрагментов должен быть индивидоспецифичен. Из приведенного рисунка 2 видно, что распределение зон ресгрикционных фрагментов не зависело от типа исследуемой ткани. Для большинства индивидов наблюдался ряд общих зон — локусспецифических ресгрикционных фрагментов. При этом обращает на себя внимание значительное число совпадающих ресгрикционных фрагментов в случае больного и его родственников (№№30 и 54 — брат и сестра). Это подтверждает высокую репрезентативность зонда, который позволяет дифференцировать генотипы даже близких родственников.

и

Анализируя результаты, полученные для опухолевых, нормальных, метастатических тканей, аденом и лимфоузлов видно, что в подавляющем большинстве случаев "профили" распределения фрагментов были идентичны, за исключением двух случаев.

Так, у больной №34, с диагнозом рак тела матки, обнаруживалась дополнительная зона в опухолевой ткани, по сравнению с нормальным яичником, в области около б kb (рис 4). Гораздо более сложная картина наблюдалась у больной №38, у которой, наряду с раком прямой кишки была выявлена киста правого яичника и миома тела матки. Как видно из рисунка, все взятые для исследования ткани — опухоль кишечника, нормальная слизистая, метастатический лимфоузел брыжжешда и нормальный яичник — различались между собой по характеру распределения рестриктных фрагментов.

Интенсивность аналогичных рестрикционных фрагментов в разных препаратах одного и того же индивида также различалась. По-видимому, в этих случаях может происходить амплификация определенных последовательностей, особенно выраженная в опухоли. Подобная амплификация была описана для ряда последовательностей, происходящая во время злокачественной трансформации у человека.

Из приведенных данйых можно заключить, что количество мутаций, выявляемое зондом red.2 очень невелико (1%). Этому есть два возможных объяснения. Либо количество мутаций в исследованной ДНК вообще невелико, либо имеющиеся мутации не определяются зондом red.2. Какое из этих объяснений соответствует действительности выяснится после гибридизации тех же препаратов ДНК с другими гипервариабельными зондами, либо после их полного геномного секвенирования.

Модификация теломерных и околотеломерных

участков ДНК в опухолях и нормальных танях

Как известно, когда ДНК гидролизуется мелкощепящей рестриктазой, не имеющей сайта рестрикции внутри исследуемого повтора, а затем гибридизуется с соответствующим меченым олигонуклеотидом, это позволяет определить размеры концевых

к ** \ - - 0,50 кЬ

- 1,10 кЬ

- 4,50 кЬ

- 4,75 кЬ

- 5,10 кЬ

11,00 кЬ

32 32А 65 65А 65Б 34 34А 41 41А 415 41В - 41Е 41Ж 42 42А42Б 38 38АШ8Г 76 76А

Рис.4. Полиморфизм рестрикционных Иес1.2 фрагментов ДНК опухолевых и нормальных тканей больных раком толстой кишки.

Опухоль (рак) толстой кишки — 38, 42, 41, 41В, 65А, 32

Норлшльная слизистая толстой кишки — 76А, 38А, 42А, 41А, 65, 32А

Аденома - 76, 41Б, 41Е, 41Ж

Лимфоузел — 38Б, 42Б, 65Б

Неизмененный эндометрий — 34А

Опухоль (рак) тела матки — 34

повторов. На рис. 1 представлены результаты гибридизации с ДНК опухолевой и нормальной тканями. Из рисунка видно, что длина теломерных концевых повторов варьировала как среди образцов нормальной ткани у разных индивидов, так и среди препаратов трансформированной ткани. При этом, в большинстве случаев (86 %) наблюдалась редукция теломерных повторов, по сравнению с опухолью.

Помимо изучения длин теломерных повторов в злокачественных опухолях, мы применили вышеупомянутый подход и при изучении длин теломерных повторов в аденомах (доброкачественных опухолях, считающихся формой предрака) и метастазах (более прогрессирующая по злокачественности форма опухоли).

К сожалению, небольшой статистический материал в этих случаях не позволяет широко интерпретировать полученные данные, однако, распределение длин концевых повторов в аденомах очень напоминает опухоли. В ряде случаев имелись опухолевые, аденом-ные, метастазируЮ1 цие и нормальные ткани от одного и того же больного (№№128, 30, 96, 107, 38). В этих случаях видно, что аденома по подвижности занимает промежуточное положение между нормальной слизистой и опухолью (№128), а метастаз может быть как более, так и менее редуцирован по длине тело-мерных повторов, чем опухоль. Кроме случаев рака толстой кишки, нами была предпринята попытка оценки длины теломерных повторов в нормальном эндометрии и опухолевых тканях тела матки Полученная картина была весьма сходна с той, которая наблюдалась у больных раком толстой кишки. Однако, в трансформированных тканях тела матки, в отличие от РТК, не было ни одного случая, когда подвижность теломерных повторов в норме была бы выше, чем в опухоли. Тем не менее, аденомы тела матки, которые, наряду со злокачественными опухолями наблюдались в этой ткани, имелись в четырех случаях, проявляли подвижность, сходную больше с нормой, чем с опухолями. Результаты, полученные для всех видов тканей, суммированы на рис.5.

Полученные данные позволяют заключить, что в опухолях толстой кишки происходит редукция концевых теломерных повторов.

■ Р1К__1е11 ЛТКлеИ

■ МГ_И1

■ I Цмпичм отюистэд^еИ

(ТТАООС)п

(ТГССОС)п

Рис.5. Полиморфизм длин теломерных повторов (ТГАССС)п (вверху) и (ТГСХ}СС)п (внизу) в различных тканях больных раком толстой кишки.

Метилирование индивидуальных генов при

канцерогенезе на примере гена c-Ha-ras

Аномальное метилирование ДНК является характерной чертой иммортализованных и неопластических клеток. Важным аспектом таких аномалий является метилирование de novo CpG-богатых участков ДНК, т.н. CpG-островков, которые в нормальных клетках и тканях всегда поддерживаются в неметилированном состоянии.

Метилирование c-Ha-ras гена исследовали с помощью рес-триктаз Hpall и Mspl. Оба фермента узнают и расщепляют последовательность 5'-CCGG-3', но только Mspl расщепляет ее при метилировании внутреннего остатка цитозина. Вариабельные тандемные повторы (VTR) в 3" -фланкирующей области гена c-Ha-ras фланкированы несколькими Hpall/Mspl сайтами. Метилирование 5' -фланкирующей области мы не исследовали, так как она представляет собой CpG-островок, содержащий большое количество конститутивно неметилировалных CpG-сайтов. При расщеплении Hpall /Mspl эта область дает очень много коротких фрагментов ДНК, что делает анализ весьма затруднительным.

При расщеплении геномной ДНК нормальных — опухолевых клеток рестршсгазой Mspl образуется преимущественно два гетерогенных по длине VTR-содержащих фрагмента, очевидно, соответствующих двум аллелям c-Ha-ras гена в ДНК соответствующих индивидов. При гидролизе тех же препаратов ДНК рестриктазой Hpall образуется множество VTR-содержащих фрагментов, самые короткие из которых, идентичны Mspl-фрагментам. Следовательно, в исследуемой популяции молекул ДНК, некоторая, относительно небольшая часть, содержит неметилированные по VTR-фланкирую-щим Hpall/Mspl сайтам копии c-Ha-ras гена, в то время как в большей их части эти сайты метилированы (рис.6).

Ген c-Ha-ras расположен на хромосоме lip, для которой наблюдается региональное гиперметилирование ДНК в опухолевых клетках в случаях лейкемии и легочной карциномы, на фоне общего гипометилирования геномной ДНК. При гидролизе геномной ДНК Mspl область VTR обычно представлена одним-двумя фрагментами,

н м н м н м н м н м н м н м н м н м н м н м н м н м н м 50 50А ЗОБ 58 58Б 54 54А 54Б 30 ЗОА ЗОБ ЗОВ ЗОГ ЗОЕ

Рис.6. Блот-гибридизауия по Саузерну Нра11-М$р1 рестриктов с гипервариабельным участком гена с-На-газ.

Н - Нра11; М - Мзр1

Опухоль (рак) толстой кишки — 54, 30, ЗОВ, ЗОГ Нормальная слизистая толстой кишки — 54А, ЗОА Аденома — ЗОЕ Лимфоузел — 54В, ЗОБ

Неизмененный яичник — 50А (правый), 50Б (левый), 58Б Опухоль (рак) тела матки — 50, 58

соответственно аллелям гена. При гидролизе Hpall образуются такие же и несколько более длинных фрагментов. Это означает, что фланкирующие эту область Нра11-сайты частично метилированы по внутреннему остатку цитозина. При этом, достоверных различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми клетками не обнаруживается.

ВЫВОДЫ

1. Получен банк ДНК онкологических больных (около 200 человек) и их родственников, что позволяет проводить исследование наследуемости различных форм рака толстой кишки и при условии удачного подбора зондов и маркеров осуществлять раннюю диагностику заболевания и оценку различных групп риска при семейных формах рака.

2. Выявлены изменения в структуре гипервариабельных участков ДНК, возникающие у части больных при опухолевой трансформации на разных ее стадиях (аденомы, различные стадии рака, метастазы) и для опухолей разных органов (толстая кишка, тело матки, желудок).

3. Показано отсутствие органо и тканеспецифических различий при картировании ДНК, гидролизованной рестриктазой BsuRI при гибридизации с высокополиморфным зондом red.2.

4. Показана низкая информативность зонда red.2 при поиске гена-маркера предрасположенности к опухолям при семейных формах рака и детектировании мутаций в геноме в процессе малигнизации.

5. Показана высокая информативность зонда red.2 при сравнении индивидоспецифических различий генома.

6. Выявлена деградация теломерных повторов при опухолевой трансформации как дистальных, так и проксимальных по отношению к центромере. Показана зависимость этой деградации от опухолевой пргрессии и органоспецифичности, что делает тело-мерные зонды информативными в онкологической диагностике.

7. Показано, что распределение дискретных зон, соответствующих "внутренним семействам" при гибридизации с зондами, гомологичными тело-мерным и околотеломерным повторам, различалось у индивидов, не состоящих в родстве. При опухолевой гране формации в некоторых случаях были выявлены мутации в этих семействах.

8. Обнаружено, что степень метилирования Нра11/Мзр1 сайтов в непосредственной близости от УТК-области гена с-На-тая примерно одинакова для исследованных образцов ДНК нормальных и опухолевых тканей.

9. Частичное недометилирование Нра11 /Мзр1 сайтов затрагивает оба аллеля с-На-газ примерно в одинаковой степени. При этом ни в одном из исследованных случаев не наблюдалось каких-либо структурных перестроек в \ГГ11-области гена с-На-гаБ или изменения степени его гегерозиготности при сравнении нормальных и трансформированных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Samotyja Е., Belev N., Alyabov Yu., Ashapkin V., Staghy A, Vannjshin B. DNA methylation in tumor cells and blood leucocytes in colon cancer. Dvojnt. konferacyon of american and european Assocyations of cancer researche. Genuya, 6-9 november, 1991.

2. Самотыя E.E., Алябов Ю.А. Способ выделения ДНК из клеток крови. Рац. предложение №284 от 26-2-1991 г.

3. Shlensky A., Alyabov Yu., Lavrushina О., Rogaev Е. Human HIV-I minirepeat-like families of hypervariable elements in the human genome: individual DNA fingerprinting and monitoring of a germline and somatic mutation. DNA Fingerprinting. Second International Conference, Belo-Horizonte, 1992, p. 6.

4. Rogaev E.I., St. GeoTge-Hyslop P., Tupler R., Rogaeva E., Mortilla M., Vaula G., Korovaitseva G., Karpova N., Alyabov Y., Lukiw W. The utility of genomic variability for genetic analysis of complex inherited deseases. DNA Finger printing, Second International Conference, Belo-Horizonte, 1992, p. 13.

5. Ю.А.Алябов, Н.Ф.Белев, Е.Е.Самотыя, Р.Ф.Гарькавцева, Е.И.Рогаев. Полиморфизм "внутренних семейств" теломер ных участков ДНК и модификация теломерных и около теломерных участкоа ДНК в некоторых опухолях человека. "I (III) российский съезд медицинских генетиков". Тез. докл. ч.Н, с. 219, Москва, 14-16 декабря.

6. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Гейхман Б.Д., Казубская Т.П., Алябов Ю.А., Кудина Е.Н., Гарькавцева Р.Ф. Медико-генетический подход к скринингу групп риска в семьях больных раком толстой кишки. "Вестн. ОНЦ РАМН", 1994, приложение, с. 88-90.